PT1988163E - Péptido wt1 restrito para hla-a*3303 e composição farmacêutica compreendendo o mesmo - Google Patents

Péptido wt1 restrito para hla-a*3303 e composição farmacêutica compreendendo o mesmo Download PDF

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PT1988163E
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Description

DESCRIÇÃO
"PÉPTIDO WT1 RESTRITO PARA HLA-A*3303 E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O MESMO"
Campo Técnico A presente invenção refere-se a um péptido restrito para HLA-A*3303, especificamente um péptido compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, em que um aminoácido na posição 2 da sequência de aminoácidos é seleccionada do grupo consistindo em Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e um aminoácido na posição 9 é Arg. Além disso, a presente invenção refere-se a um polinucleótido que codifica o péptido, uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um cancro compreendendo o mesmo.
Antecedentes 0 gene WT1 (gene 1 do tumor de Wilms) foi identificado como um gene responsável pelo tumor de Wilms que é um cancro renal em crianças (Documentos 1 e 2 Não patentes) . A WT1 é um factor de transcrição possuindo uma estrutura de dedo de zinco. No início, o gene WT1 foi considerado como sendo um gene supressor de tumor. Contudo, os estudos subsequentes (Documentos 3, 4, 5 e 6 Não patentes) mostraram que o gene WT1 funciona ainda como um oncogene em tumores hematopoiéticos e cancros sólidos. 1 0 gene WT1 é expresso a níveis elevados em muitos tipos de tumores malignos. Foi pesquisado se o produto WT1 do gene sem mutações, que é uma proteína autóloga, possui ou não imunogenicidade num corpo vivo. Os resultados revelaram que a proteína derivada do gene WT1 que é expresso a níveis elevados em células de tumor é fragmentada através de processamento intracelular, os péptidos resultantes formam complexos com moléculas MHC de classe I, e os complexos são apresentados nas superfícies das células e que os CTL que reconhecem tais complexos podem ser induzidos por vacinação por péptidos (Documentos 7, 8 e 9 Não patentes) . Foi também mostrado que num murganho imunizado com um péptido de WT1 ou um ADNc de WT1, células de tumor transplantadas que expressam um gene WT1 são rejeitadas com uma elevada probabilidade (Documentos 7 e 10 Não patentes), enquanto os tecidos normais que expressam fisiologicamente o gene WT1 não são lesionados pelos CTL induzidos (Documento 7 Não patente). Foi mostrado em experiências in vitro utilizando células humanas que, quando o péptido Dbl26 ou o péptido WH187 (aminoácidos 187-195 de SEQ ID N°: 1, SLGEQQYSV) possuindo uma elevada capacidade para se ligar a uma molécula HLA-A*0201, que é uma das moléculas MHC de classe I humanas, é utilizado para estimular células mononucleares do sangue periférico humano possuindo HLA-A*0201, são induzidos CTL específicos para WT1, os CTL induzidos possuem uma actividade citotóxica específica para células de tumor que expressam endogenamente um gene WT1 a níveis elevados e a actividade citotóxica de tais CTL é restrita a HLA-A2 (Documento 11 Não patente). Foi mostrado, em experiências in vitro, em células humanas utilizando o péptido de WT1 que corresponde a HLA-A*2402 (que é mais frequentemente encontrado em pessoas
Japonesas entre os alelos de HLA-A) (WTI235; aminoácidos 235-243 2 de SEQ ID N°: 1, CMTWNQMNL) CTL específicos para WTl-(TAK-l) que são induzidos (Documento 12 Não patente) e os CTL induzidos não suprimem a actividade formadora de colónias de células estaminais hematopoiéticas normais que expressam parcialmente, fisiologicamente, um gene de WT1 (Documentos 13 e 14 Não patentes). Estes relatórios sugerem, fortemente, que não só em murganhos mas também em seres humanos, os CTL específicos para WT1 podem ser induzidos, tais CTL possuem uma actividade citotóxica contra células de tumor que expressam um gene WT1 a níveis elevados, mas não possuem uma actividade citotóxica contra células normais que expressam fisiologicamente um gene de WT1 (Documentos 7, 10, 11, 12, 13 e 14, Não patentes). O produto do gene de WT1 está presente como uma proteína nuclear e é processado por proteossomas no citoplasma para ser fragmentado em péptidos. Os péptidos fragmentados são transportados para o lúmen do retículo endoplasmático por moléculas de TAP (transportador associado com processamento de antigénio), formam complexos com moléculas MHC de classe I e são apresentados às superfícies das células. Os CTL específicos para WT1 são induzidos como resultado do reconhecimento dos complexos péptido de WTl-molécula MHC de classe I pelas células precursoras de CTL via TCR, exercendo, deste modo, um efeito citotóxico em células de tumor que apresentam um produto de gene de WT1 através de moléculas MHC de classe I (Documentos 7, 8 e 9 Não patentes) . Depois, é necessário que, pelo menos, um péptido de WT1 utilizado na imunoterapia do cancro direcionada para um produto do gene de WT1 esteja na forma em que se liga a uma molécula MHC de classe I num corpo vivo. Contudo, as moléculas MHC de classe I são diversas e as sequências de aminoácidos dos péptidos de WT1 que se ligam às respectivas moléculas MHC de classe I são diferentes umas das outras. Deste modo, é 3 necessário proporcionar um péptido que corresponde a cada subtipo de MHC de classe I. Contudo, apenas a molécula HLA-A*2402, a molécula HLA-A*0201 e a molécula HLA-A*2601 de péptidos digeridos são conhecidas como péptidos de WT1 digeridos para a molécula HLA até à data (Documento Patente 1,
Documento 11 Não patente e Documento de Patente 2, respectivamente). A HLA-A*3303 está presente na seguinte maior percentagem para HLA-A*2402 nos Japoneses. Deste modo, existe uma necessidade de encontrar um péptido de WT1 restrito para HLA-A*33 03.
Documento de Patente 1: WO 2003/106682 Documento de Patente 2: WO 2005/095598
Documento 1 Não patente: Daniel A. Haber et al., Cell. 29 de Junho de 1990; 61(7):1257-69.
Documento 2 Não patente: Call KM et al., Cell. 9 de Fev de 1990; 60(3):509-20.
Documento 3 Não patente: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998; 181:151-212. Revisão.
Documento 4 Não patente: Yamagami T et al., Blood. 1 de
Abril de 1996; 87(7):2878-84.
Documento 5 Não patente: Inoue K et al., Blood. 15 de Abril de 1998; 91 (8) :2969-76.
Documento 6 Não patente: Tsuboi A et al., Leuk Res. Maio de 1999; 23 (5) : 499-505.
Documento 7 Não patente: Oka Y et al., J Immunol. 15 de
Fevereiro de 2000; 164(4):1873-80.
Documento 8 Não patente: Melief CJ et al., Immunol Rev.
Junho de 1995; 145:167-77.
Documento 9 Não patente: Ritz J, J Clin Oncol. Fev de 1994; 12(2):237-8. 4
Documento 10 Nao patente: Tsuboi A et al., J Clin Immunol. Maio de 2000; 20(3):195-202.
Documento 11 Não patente: Oka Y et al., Immunogenetics. Fev de 2000; 51(2) :99-107.
Documento 12 Não patente: Ohminami H et al., Blood. 1 de Jan de 2000; 95(1) :286-93.
Documento 13 Não patente: Gao L et al., Blood. 1 de Abril de 2000; 95 (7) :2198-203.
Documento 14 Não patente: Ohminami H et al., Blood. 1 de Jan de 2000; 95 (1) :286-93.
Divulgação da Invenção
Problemas a serem Resolvidos pela Invenção
Os problemas a serem resolvidos pela presente invenção são proporcionar um péptido de WT1 digeridos para HLA-A*3303 e um polinucleótido que codifica o mesmo, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento/prevenção de um cancro compreendendo o mesmo.
Meios para Resolver os Problemas
Como um resultado de estudos intensivos face à situação como descrita acima, a presente requerente verificou que um péptido compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WT1, em que um aminoácido na posição 2 da sequência de aminoácidos é seleccionado do grupo consistindo em Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e um aminoácido na posição 9 da sequência de 5 aminoácidos é Arg, pode induzir um CTL especifico para WTl com uma velocidade elevada. Deste modo, a presente invenção foi completada. A presente invenção proporciona: (1) um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4); (2) uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4); (3) utilização de um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4), para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303; (4) um polinucleótido que codifica o péptido de acordo com (D ; (5) um vector de expressão compreendendo o polinucleótido de acordo com (4); (6) uma composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo um polinucleótido que codifica um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg 6 (SEQ ID N°: 4) ou um vector compreendendo o referido polinucleótido; (7) utilização de um polinucleótido que codifica um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4) ou um vector compreendendo o referido polinucleótido para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303; (8) um CTL específico para WT1, que é indutível por um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4); (9) um método para a indução de um CTL específico para WT1, compreendendo cultura de uma célula mononuclear do sangue periférico na presença de um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) para induzir o CTL específico para WT1 a partir da célula mononuclear do sangue periférico; (10) um kit para a indução de um CTL específico para WT1 ou para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1, compreendendo, o referido kit, um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4) como um componente essencial; (11) uma célula apresentadora de antigénio apresentando um péptido de WT1, que é indutível por um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4); 7 (12) um método para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1, compreendendo a cultura de uma célula apresentadora de antigénio imatura na presença de um péptido consistindo numa sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) para induzir a célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 a partir da célula apresentadora de antigénio imatura; (13) um método para o diagnóstico de um cancro, compreendendo a utilização do CTL de acordo com (8) ou a célula apresentadora de antigénio de acordo com (11); (14) um método para a determinação da presença ou quantidade de um CTL especifico para WT1 num indivíduo positivo para HLA-A*33 03, compreendendo: (a) fazer reagir um complexo de um péptido de WT1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) e uma molécula HLA-A*3303 com uma amostra do indivíduo; e (b) determinar a presença ou quantidade de um CTL que reconhece o complexo contido na amostra; e (15) o método de acordo com (14), em que o complexo é uma forma de tetrâmero. 8
Efeitos da Invenção A presente invenção proporciona um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 e um polinucleótido que codifica o mesmo, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um cancro compreendendo o mesmo. Deste modo, é possível induzir in vivo e in vitro CTL específicos para WT1 em indivíduos possuindo HLA-A*3303. Porque cerca de 24% de pessoas Japonesas possuem, pelo menos, uma molécula HLA-A*3303, os CTL específicos para WT1 podem ser induzidos numa vasta gama de indivíduos.
Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI337. A Fig. 2 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI364 · A Fig. 3 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI367 · A Fig. 4 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI409 · A Fig. 5 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WT1364 contra a célula que expressa um gene WT1 endogenamente. 9
CTL dos A Fig. 6 representa a actividade citotóxica induzidos com WTI367 contra a célula que expressa um gene WT1 endogenamente.
A Fig. 7 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI409 contra a célula que expressa um gene WT1 endogenamente.
A Fig. 8 representa a actividade citotóxica dos CTL induzidos com WTI367 contra a célula que expressa um gene WT1.
Melhor Modo para Realizar a Invenção
Uma sequência de aminoácidos de uma proteína WT1 humana é mostrada na SEQ ID N° : 1. Um gene WTl é expresso na sua forma nativa a níveis elevados, por exemplo, em tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndroma mielodisplásico, mieloma múltiplo ou linfoma maligno e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical ou cancro do ovário. Além disso, um motivo âncora para HLA-A*3303 é caracterizado por um aminoácido na posição 2 ser qualquer um de Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp, e um aminoácido na posição 9 é Arg. Deste modo, num aspecto, a presente invenção refere-se a um péptido de WTl restrito para HLA-A*3303 compreendendo uma sequência de aminoácidos consistindo em 9 aminoácidos contíguos de uma proteína WTl, em que um aminoácido na posição 2 da sequência de aminoácidos é, de um modo preferido, seleccionado do grupo consistindo em Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp e um 10 aminoácido na posição 9 da sequência de aminoácidos é, de um modo preferido, Arg (daqui em diante referido como um péptido de WT1) . 0 péptido da invenção consistindo na sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) retém uma capacidade para se ligar a uma molécula HLA-A*33 03.
Como descrito acima, é um objectivo da presente invenção obter um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303. Deste modo, o péptido da presente invenção consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer da SEQ ID N°:4. Várias substâncias podem ser ligadas no terminal N e/ou terminal C do péptido da presente invenção. Por exemplo, pode ser ligado um aminoácido, um péptido ou um seu análogo. Se estas substâncias são ligadas ao péptido da presente invenção, estas podem ser processadas, por exemplo, por uma enzima num corpo vivo ou através de um processo, tal como processamento intracelular e finalmente o péptido da invenção pode ser produzido e apresentado como um complexo com uma molécula HLA-A*3303 à superfície de uma célula, resultando deste modo no efeito de indução de um CTL. Estas substâncias podem ser as que modulam a solubilidade dos péptidos da presente invenção ou aumentar a sua estabilidade (resistência a protease). Alternativamente, estas substâncias podem ser as que distribuem os péptidos da presente invenção especificamente, por exemplo, a um determinado tecido ou órgão, ou estes podem ter a acção de aumentar a eficiência de incorporação por uma célula apresentadora de antigénio. Estas substâncias podem ser as que aumentam a capacidade para induzir um CTL, tais como péptidos auxiliares. 11 0 péptido da presente invenção pode ser sintetizado por métodos geralmente utilizados na técnica ou suas modificações. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Peptide Synthesis, Interscience, Nova Iorque, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., Nova Iorque, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, Maruzen Co., Ltd., 1985; e Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, Peptideo-Gosei, Hirokawa - Book store, 1991. 0 péptido da presente invenção pode, também, ser preparado utilizando técnicas de engenharia genética com base na informação acerca da sequência de nucleótidos que codifica o péptido da presente invenção. Tais técnicas de engenharia genética são bem conhecidas por um especialista na técnica.
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um cancro, compreendendo um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303. O gene WT1 é expresso em níveis elevados em tumores hematopoiéticos, tais como leucemia, síndroma mielodisplásico, mieloma múltiplo ou linfoma maligno e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical ou cancro do ovário. Deste modo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada para o tratamento ou prevenção de um cancro. Quando a composição farmacêutica da presente invenção é administrada a um indivíduo positivo para HLA-A*3303, os CTL específicos para WT1 são induzidos pelo péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 compreendido na composição farmacêutica e as células do cancro no indivíduo são lesionadas por tais CTL. 12 A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender, adicionalmente ao péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 como um ingrediente activo, por exemplo, um veiculo ou um excipiente. 0 péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 compreendido na composição farmacêutica da presente invenção induz um CTL especifico para WT1. Deste modo, a composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um adjuvante apropriado ou pode ser administrada em conjunto com um adjuvante apropriado de modo a melhorar a eficiência de indução. Exemplos de adjuvantes preferidos incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto e hidróxido de alumínio. 0 método de administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser apropriadamente seleccionado dependendo das condições, tais como o tipo de doença, o estado do indivíduo ou o sítio alvo. Exemplos de tais métodos incluem administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intravenosa, administração nasal e administração oral. A quantidade do péptido compreendido na composição farmacêutica da presente invenção, assim como a forma de dosagem, o número de vezes da administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser apropriadamente seleccionada dependendo das condições, tais como o tipo de doença, o estado do indivíduo ou o sítio alvo. A dose única do péptido é, normalmente, 0,0001 mg - 1000 mg, de um modo preferido, 0,001 mg - 10000 mg.
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento ou prevenção de um cancro, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica a um indivíduo positivo para HLA-A*3303. O cancro a 13 ser tratado ou evitado pode ser qualquer um e exemplos destes incluem tumores hematopoiéticos, tais como leucemia, síndroma mielodisplásico, mieloma múltiplo ou linfoma maligno e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical ou cancro do ovário.
Em outro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 para a preparação da composição farmacêutica.
Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a determinação da presença ou quantidade de um CTL específico para WT1 num indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo: (a) fazer reagir um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303 com uma amostra do indivíduo; e (b) determinar a presença ou quantidade de um CTL que reconhece o complexo contido na amostra. A amostra de um indivíduo pode ser qualquer uma desde que exista uma possibilidade de conter um linfócito. Os exemplos das amostras incluem fluido corporal, tal como sangue ou linfa e um tecido. 0 complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303 pode ser preparado, por exemplo, como um tetrâmero ou pentâmero utilizando um método conhecido de um especialista na técnica, tais como o método de biotina-estreptavidina. A presença ou quantidade dos CTL que reconhecem um tal complexo podem ser medidas por um método conhecido de um especialista na técnica. Neste aspecto da presente invenção, o complexo pode ser marcado. Uma marca 14 conhecida, tal como uma marca fluorescente ou uma marca radioactiva pode ser utilizada como um marcador. A marcação torna a determinação da presença ou a quantidade de um CTL fácil e rápido. 0 método deste aspecto da presente invenção pode ser utilizada para diagnosticar um cancro ou fazer o seu prognóstico.
Deste modo, a presente invenção também proporciona uma composição para a determinação da presença ou quantidade de um CTL especifico para WT1 num indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*33 03.
Além disso, a presente invenção proporciona um kit para a determinação da presença ou quantidade de um CTL específico para WT1 num indivíduo positivo para HLA-A*3303, compreendendo um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303.
Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um CTL específico para WT1 utilizando um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303, compreendendo: (a) fazer reagir o complexo com uma amostra; e (b) obter um CTL que reconhece o complexo contido na amostra. O complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLAA* 3303 é descrito acima. A amostra pode ser qualquer uma desde que exista a possibilidade de conter um linfócito. Os exemplos das amostras incluem uma amostra de um indivíduo, tal como sangue e uma cultura de células. O CTL que reconhece o complexo pode ser obtido utilizando um método conhecido de um especialista na 15 técnica, tal como FACS ou MACS. A presente invenção permite a cultura do CTL específico para WT1 obtido e a utilização para o tratamento ou prevenção de vários cancros.
Deste modo, a presente invenção também se refere um CTL específico para WT1 que é obtenível por um método para a produção de um CTL específico para WT1 utilizando um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303.
Além disso, um presente invenção refere-se a um kit para a produção de um CTL específico para WT1, compreendendo um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um polinucleótido que codifica o péptido de WT1 restrito para HLA-A*33 03 (daqui em diante referida como um polinucleótido WT1). O polinucleótido da presente invenção pode ser ADN ou ARN. A sequência de bases do polinucleótido da presente invenção pode ser determinada na sequência de aminoácidos de um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303. O polinucleótido pode ser preparado, por exemplo, por um método para a síntese de ADN ou ARN, método de PCR ou semelhante.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um vector de expressão compreendendo o polinucleótido (daqui em diante referido como um vector de expressão de WT1) . O tipo de vector de expressão, a sequência compreendida para além da sequência do polinucleótido pode ser apropriadamente seleccionada dependendo do tipo de um hospedeiro em que o vector de expressão da presente invenção é introduzido ou o propósito da utilização. É possível tratar ou evitar tumores hematopoiéticos ou cancros sólidos através da administração do vector de expressão da 16 presente invenção a um indivíduo positivo para HLA-A*3303 para produzir um péptido de WT1 num corpo vivo e induzir um CTL específico para WT1 e lesionar as células de tumor hematopoiético ou células de cancro sólido no indivíduo.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um cancro, compreendendo o polinucleótido WT1 ou o vector de expressão WT1. A composição, o método de administração e semelhante da composição farmacêutica da presente invenção neste aspecto são descritos acima.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização da composição farmacêutica compreendendo o péptido de WT1 ou o vector de expressão WT1 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303. Os exemplos de cancros a ser tratados ou evitados incluem tumores hematopoiéticos, tais como leucemia, síndroma mielodisplásico, mieloma múltiplo ou linfoma maligno e cancros sólidos, tais como cancro gástrico, cancro do cólon, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro das células germinais, cancro hepático, cancro da pele, cancro da bexiga, cancro da próstata, cancro uterino, cancro cervical ou cancro do ovário.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um polinucleótido WT1 ou um vector de expressão WT1 para a preparação da composição farmacêutica compreendendo o polinucleótido WT1 ou o vector de expressão WT1.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula compreendendo o vector de expressão. A célula da presente invenção pode ser preparada, por exemplo, por transformação de 17 uma célula hospedeira, tal como E. coli, levedura, célula de insecto ou célula animal com o vector de expressão. O método para a introdução do vector de expressão numa célula hospedeira pode ser apropriadamente seleccionada de vários métodos. Através da cultura da célula transformada, e recuperando e purificando o péptido de WT1 produzido, o péptido da presente invenção pode ser preparado.
Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um CTL especifico para WT1, que é induzido pelo péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303. 0 CTL da presente invenção reconhece um complexo de um péptido de WT1 e uma molécula HLA-A*3303. Deste modo, o CTL da presente invenção pode ser utilizado para lesionar especificamente uma célula de tumor positiva para HLA-A* 3303 e que expressa WT1 num nível elevado.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização de um CTL específico para WT1 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303. O modo de administração do CTL específico para WT1 pode ser apropriadamente seleccionado dependendo de condições, tais como o tipo de doença, o estado do indivíduo ou o sítio alvo. Os exemplos destes métodos incluem a administração intravenosa, administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração nasal e administração oral.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a indução de um CTL específico para WT1, compreendendo a cultura de uma célula mononuclear do sangue periférico na presença de um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 para induzir o CTL específico para WT1 da célula mononuclear do 18 sangue periférico. 0 indivíduo do qual a célula mononuclear do sangue periférico é derivada pode ser qualquer desde que seja positiva para HLA—A*3303. Através da cultura das células mononucleares do sangue periférico na presença de um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303, os CTL específicos para WT1 são induzidos a partir das células precursoras de CTL contidas nas células mononucleares do sangue periféricos. É possível tratar ou evitar tumores hematopoiéticos ou cancros sólidos num indivíduo positivo para HLA-A*3303 através da administração ao indivíduo do CTL específico para WT1 obtido de acordo com a presente invenção.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para a indução de um CTL específico para WT1, compreendendo um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 como um componente essencial. De um modo preferido, o kit é utilizado no método para a indução de um CTL específico para WT1. 0 kit da presente invenção pode compreender, adicionalmente ao péptido de WT1 restrito para HLA-A*330, por exemplo, um meio de obtenção de uma célula mononuclear do sangue periférico, um adjuvante, um vaso de reacção ou semelhante. Em geral, é adicionado um manual de instruções ao kit. Utilizando o kit da presente invenção, os CTL específicos para WTl podem ser induzidos eficientemente.
Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma célula apresentadora de antigénio (tal como uma célula dendrítica) que apresenta um péptido de WTl através de uma molécula HLA-A*3303, que é induzida pelo péptido de WTl restrito para HLA-A*3303. Utilizando a célula apresentadora de antigénio da presente invenção, os CTL específicos para WTl são induzidos eficientemente. 19
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização da célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num indivíduo positivo para HLA-A*3303. 0 modo de administração da célula apresentadora de antigénio podem ser apropriadamente seleccionado dependendo de condições, tais como o tipo de doença, o estado do indivíduo ou o sítio alvo. Exemplos destes métodos incluem administração intravenosa, administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração nasal e administração oral.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303, compreendendo a cultura de uma célula apresentadora de antigénio imatura na presença de um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 para induzir a célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303 da célula apresentadora de antigénio imatura. A célula apresentadora de antigénio imatura refere-se a uma célula tal como uma célula dendrítica imatura, que pode ser maturada numa célula apresentadora de antigénio. O indivíduo a partir do qual a célula apresentadora de antigénio imatura é derivada pode ser qualquer um desde que seja positivo para HLA-A*3303. Porque as células apresentadoras de antigénio imaturas estão contidas, por exemplo, em células mononucleares do sangue periférico, estas células podem ser cultivadas na presença do péptido de WTl.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WTl através de uma molécula HLA-A*3303, 20 compreendendo um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 como um componente essencial. De um modo preferido, o kit é utilizado no método para a indução de uma célula apresentadora de antigénio. Outro componente a ser compreendido no kit da presente invenção e semelhantes são descritos acima. 0 kit da presente invenção pode ser utilizado para induzir eficientemente uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303.
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo contra um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 ou um anticorpo contra um polinucleótido que codifica o péptido. 0 anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou anticorpo monoclonal.
Num aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para o diagnóstico de um cancro, compreendendo a utilização do CTL especifico para WT1, a célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303, ou o anticorpo contra um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 ou o anticorpo contra um polinucleótido que codifica o péptido. De um modo preferido, o CTL especifico para WT1 é utilizado no método para o diagnóstico da presente invenção. Por exemplo, é possível diagnosticar um cancro através da incubação do CTL, a célula apresentadora de antigénio ou o anticorpo com uma amostra de um indivíduo positivo para HLA-A*3303, ou pela sua administração a um indivíduo positivo para HLA-A*3303 e determinando, por exemplo, a sua posição, sítio ou quantidade. 0 CTL, a célula apresentadora de antigénio ou o anticorpo podem ser marcados. Ligando um marcador, o método para o diagnóstico da presente invenção pode ser realizado eficientemente. 21
Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para o diagnóstico de um cancro, compreendendo o CTL especifico para WT1, a célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 através de uma molécula HLA-A*3303 ou o anticorpo contra um péptido de WTl restrito para HLA-A*3303 ou o anticorpo contra um polinucleótido que codifica o péptido como um componente essencial.
Os exemplos que se seguem ilustram a presente invenção em mais detalhe. As formas de realização que não caem no âmbito das reivindicações foram mantidos para propósitos ilustrativos.
Exemplos
Exemplo 1
Selecção do péptido de WTl
Foi utilizado o Programa NetMHC2.0 (Universidade Técnica da Dinamarca) para seleccionar WT1337, WT1364, WT1367 e WT1409, que são péptidos hidrofílicos consistindo em 9 aminoácidos com o motivo âncora adequado para HLA-A*3303 (o segundo aminoácido do terminal N é qualquer um de Ala, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr, Ser e Asp e o aminoácido no terminal C é Arg) e espera-se ter um elevada afinidade de ligação para uma molécula HLA-A*3303 a partir de um péptido de WTl de uma proteína WTl (SEQ ID N°: 1) .
As sequências de aminoácidos e as afinidades de ligação a uma molécula HLA-A*3303 destes péptidos são apresentadas na
Tabela 1. 22 [Tabela 1] Péptido Número do aminoácido na SED ID N° 1 Sequência de aminoácidos Afinidade de ligação para a molécula HLA-A*3303 WT1 337 337-345 LSHLQMHSR 18,827 (SEQ ID N°: 2) WT1364 364-372 FSRSDQLKR 15,143 (SEQ ID N°: 3) WT1367 367-375 SDQLKRHQR 14,496 (SEQ ID N°: 4) WTI409 409-417 TSEKPFSCR 15,310 (SEQ ID N°: 5)
Preparaçao de células B-LCL
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas pelo método de centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque do sangue periférico que tinha sido recolhido de um dador saudável positivo para HLA-A*3303 (HLA-A*3303/0207). Os PBMC foram, então, semeados numa placa de cultura de células de 24 poços à densidade de cerca de 1 x 107 em meio RPMI 1640 contendo 10% de FCS e foram adicionados sobrenadantes de cultura de células B95-8 (células que produzem vírus EB) . Estas foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 durante cerca de 1 mês. As células B-LCL transformadas com vírus EB, que são células de tumor de células B, foram obtidas. Foi confirmado que as células B-LCL resultantes não expressam o gene WT1. As células B-LCL foram pulsadas por incubação com 20 pg/mL de WT1337, WT1364, WT1367 ou WTI409 durante 2 horas e irradiadas com 80 Gy de radiação. As células B-LCL resultantes (daqui em diante referidas como células B-LCL pulsadas com um péptido de WT1) foram utilizadas 23 como células apresentadoras de antigénio para as experiências seguintes.
Indução de WT1 específicos para CTL
Foram cultivados 3 x 106 PBMC (HLA-A*3303/1101) numa placa de cultura de células de 24 poços em meio completo (45% de RPMI, 45% de meio AMI-V e 10% de soro AB humano) contendo 20 pg/mL de WTI337, WH364 , WTI367 ou WTI409 a 37 °C, com 5% de CO2 durante 1 semana para obter células responsivas. 2 x 106 das células responsivas resultantes foram co-cultivadas com 1 x 106 de células B-LCL pulsadas com o mesmo péptido de WT1 em meio completo durante 1 semana (primeira estimulação). Os PBMC foram co-cultivados com as células B-LCL pulsadas com o péptido de WT1 mais três vezes (segunda a quarta estimulação) sob as condições em que 20 IU/mL (concentração final) de IL-2 foi adicionada como se segue: segunda estimulação: duas vezes em cada dia a partir de 3 dias após a iniciação da estimulação; terceira e quarta estimulações: três vezes em intervalos de um dia a partir do dia após a iniciação da estimulação. As células resultantes foram concentradas utilizando Negative Selection Columns Gravity Feed Kit (StemSp) de modo a que a proporção de células T positivas para CD8 ficou em cerca de 80% e co-cultivadas com as células B-LCL pulsadas com o péptido de WT1 (quinta estimulação) . As células T positivas para CD8 (CTL) obtidas 5 dias após da estimulação final foram utilizadas para medição da actividade citotóxica. 24
Actividade citotóxica de CTL A actividade citotóxica de CTL foi medida utilizando o ensaio de libertação de 51Cr. As células CTL (daqui em diante referidas como células efectoras) foram misturadas na proporção (proporção E/T) de 1:1, 5:1 ou 10:1 em 200 pL de meio com células alvo em que 51Cr foi incorporado e cultivadas numa placa de cultura de células de 96 poços, a 37 °C, com 5% de CO2 durante 4 horas. As células B-LCL pulsadas com o mesmo péptido de WT1 como as utilizadas para indução de CTL (BLCL-P) , e as células B-LCL sem pulso com um péptido de WT1 (BLCL-NP) foram utilizadas como células alvo. Após a cultura, os sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação. As quantidades de 51Cr libertado nos sobrenadantes foram medidas utilizando um contador de liquido de cintilações. A actividade citotóxica (%) foi determinada utilizando a seguinte fórmula: (libertação de 51Cr no sobrenadante da amostra - Libertação espontânea de 51Cr)/(Libertação máxima de 51Cr - Libertação espontânea de 51Cr) x 100 em que a Libertação espontânea de 51Cr é a libertação de 51Cr observada quando as células alvo nas quais o 51Cr foi incorporado foram cultivadas isoladas sob a mesma condição e a Libertação máxima de 51Cr é a libertação de 51Cr observada quando as células alvo nas quais o 51Cr foi incorporado foram completamente lisadas utilizando 1% de Triton X-100. Os resultados são mostrados nas Figs. 1-4. Nas figuras, os eixos longitudinais representam a lise especifica (%) e os eixos horizontais representam as proporções E/T. As BLCL-P são representadas utilizando linhas a cheio e as BLCL-NP são representadas utilizando linhas ponteadas. Foi confirmado que os CTL induzidos com WT1337, WT1364, 25 WT1367 ou WTI409 lesionam, especificamente, BLCL-P que apresentam o péptido de WT1 como um complexo com uma molécula HLA-A*3303 em comparação com as BLCL-NP. Os CTL induzidos com WTI364/· WT1367 ou WTI409 foram utilizados para experiências posteriores a seguir.
Actividade citotóxica de CTL contra células que expressam o gene WT1 endogenamente A actividade citotóxica de CTL induzidos com WTI364, WTI367 ou WTI409 contra células TF-1 que são células de tumor que expressam um gene WT1 (positivas para HLA-A*3303) foi determinada utilizando o método como descrito acima. Como um controlo, foram utilizadas as células K562 que expressam um gene WT1 e são negativas para HLA-A*3303. Os resultados são mostrados nas Figs. 5-7. Nas figuras, os eixos longitudinais representam a lise especifica (%) e os eixos horizontais representam as proporções E/T. A TF-1 é representada utilizando linhas a cheio, e K562 é representada utilizando linhas a cheio. Foi confirmado que os CTL induzidos com WT1364, WT1367 ou WT 1 409 também têm uma actividade citotóxica contra a célula que expressa um gene WT1 exogenamente. A actividade citotóxica de CTL induzidos com WT1367 contra células B-LCL que expressam WT1 foi determinada utilizando o método como descrito acima. A B-LCL que expressa WT1 (B-LCL-WT1) refere-se a células B-LCL nas quais é introduzido um gene WT1 humano e que expressam uma proteína WT1 na célula e apresentam um péptido consistindo em cerca de 9 aminoácidos resultante do processamento numa molécula HLA-A*3303. Como um controlo, foi utilizada a célula B-LCL (B-LCL-CV) na qual é introduzido um gene controlo excepto um gene WT1. Os resultados são mostrados 26 na Fig. 8. Nas figuras, os eixos longitudinais representam lise específica (%) e os eixos horizontais representam as proporções E/T. A B-LCL-WT1 é representada utilizando linhas a cheio e a B-LCL-CV é representada utilizando linhas ponteadas. Foi confirmado que os CTL induzidos com WT1367 lesionam apenas uma célula que é positiva para HLAA* 3303 e expressa WT1.
Aplicabilidade Industrial A presente invenção proporciona um péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303, um polinucleótido que codifica o péptido, uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo e semelhantes. Deste modo, a presente invenção pode ser utilizada nos campos da medicina e semelhantes, por exemplo, nos campos do desenvolvimento e preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de vários tumores hematopoiéticos e cancros sólidos que expressam o gene WT1 a níveis elevados.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> International Institute of Câncer Immunology, Inc. <120> Péptido de WT1 restrito para HLA-A*3303 e composição farmacêutica compreendendo o mesmo <130> 667343 <150> JP 2006-045287 <151> 2006-02-22 <160> 5 27 <170> Patentln versão 3.2 <210> 1 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Met Gly Ser Asp Vai Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Vai Pro 1 5 10 15 Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Vai Ser Gly Ala Ala 20 25 30 Gin Trp Ala Pro Vai Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr 35 40 45 Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro 50 55 60 Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gin Glu Pro Ser Trp Gly Gly 65 70 75 80 Ala Glu Pro His Glu Glu Gin Cys Leu Ser Ala Phe Thr Vai His Phe 85 90 95 Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe 100 105 110 Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gin Ala Ser Ser Gly Gin Ala Arg Met Phe 115 120 125 Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gin Pro Ala Ile 130 135 140 Arg Asn Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gin Phe Pro Asn His Ser Phe 165 170 175 Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gin Gin Gly Ser Leu Gly Glu Gin Gin 180 185 190 Tyr Ser Vai Pro Pro Pro Vai Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser 195 200 205 Cys Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp 28
Asn Leu Tyr Gin Met Thr Ser Gin Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gin 225 230 235 240 Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Vai Ala Ala Gly Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Vai Lys Trp Thr Glu Gly Gin Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu 260 265 270 Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gin Tyr Arg Ile 275 280 285 His Thr His Gly Vai Phe Arg Gly Ile Gin Asp Vai Arg Arg Vai Pro 290 295 300 Gly Vai Ala Pro Thr Leu Vai Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys 305 310 315 320 Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys 325 330 335 Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro 340 345 350 Tyr Gin Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp 355 360 365 Gin Leu Lys Arg His Gin Arg Arg His Thr Gly Vai Lys Pro Phe Gin 370 375 380 Cys Lys Thr Cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr 385 390 395 400 His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys 405 410 415 Arg Trp Pro Ser Cys Gin Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Vai 420 425 430 Arg His His Asn Met His Gin Arg Asn Met Thr Lys Leu Gin Leu Ala 435 440 445
Leu
<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens 29 <4Ο0> 2
Leu Ser His Leu Gin Met His Ser Arg 1 5
<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Phe Ser Arg Ser Asp Gin Leu Lys Arg 1 5
<210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg 1 5
<210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg 1 5
Lisboa, 21 de Agosto de 2012 30

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4).
  2. 2. Composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito positivo para HLA-A*3303, compreendendo um péptido consistindo na sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4).
  3. 3. Utilização de um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4), para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito positivo para HLA-A*3303.
  4. 4. Polinucleótido que codifica o péptido de acordo com a reivindicação 1.
  5. 5. Vector de expressão compreendendo o polinucleótido de acordo com a reivindicação 4.
  6. 6. Composição farmacêutica para utilização no tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito positivo para HLA-A*3303, compreendendo um polinucleótido que codifica um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4) ou um vector compreendendo o referido polinucleótido.
  7. 7. Utilização de um polinucleótido que codifica um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys 1 Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) ou um vector compreendendo o referido polinucleótido para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de um cancro num sujeito positivo para HLA-A*3303.
  8. 8. CTL especifico para WT1, que é indutivel por um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4).
  9. 9. Método para a indução de um CTL especifico para WT1, compreendendo a cultura de uma célula mononuclear do sangue periférico na presença de um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4) para induzir o CTL específico para WT1 a partir da célula mononuclear do sangue periférico.
  10. 10. Kit para a indução de um CTL específico para WT1 ou para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1, compreendendo, o referido kit um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4) como um componente essencial.
  11. 11. Célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1, que é indutivel por um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N°: 4).
  12. 12. Método para a indução de uma célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1, compreendendo a cultura de uma célula apresentadora de antigénio imatura na presença de um péptido consistindo da sequência de aminoácidos Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg 2 (SEQ ID N°: 4) para induzir a célula apresentadora de antigénio que apresenta um péptido de WT1 a partir da célula apresentadora de antigénio imatura.
  13. 13. Método para o diagnóstico de um cancro, compreendendo a utilização de CTL de acordo com a reivindicação 8 ou a célula apresentadora de antigénio de acordo com a reivindicação 11.
  14. 14. Método para a determinação da presença ou quantidade de um CTL especifico para WT1 num indivíduo positivo para HLA-A*33 03, compreendendo: (a) fazer reagir um complexo de um péptido de WTl compreendendo uma sequência de aminoácidos de Ser Asp Gin Leu Lys Arg His Gin Arg (SEQ ID N° : 4) e uma molécula HLA-A*3303 com uma amostra do indivíduo; e (b) determinar a presença ou quantidade de um CTL que reconhece o complexo contido na amostra.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o complexo é uma forma de tetrâmero. Lisboa, 21 de Agosto de 2012 3
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