PT1979001E - Proteínas de ligação específicas para factores de crescimento insulínicos e suas aplicações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

«PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICAS PARA FACTORES DE CRESCIMENTO INSULÍNICOS E SUAS APLICAÇÕES»

REFERÊNCIAS TRANSVERSAIS A APLICAÇÕES RELACIONADAS

[0001] Esta aplicação reivindica prioridade sob o código 35 U.S.C. §119 ao Pedido Provisório de Patente U.S. 60/750,085, apresentado a 13 de Dezembro de 2005; Pedido Provisório de Patente U.S. 60/750,772, apresentado a 14 de Dezembro de 2005; Pedido Provisório de Patente U.S. 60/774,747, apresentado a 17 de Fevereiro de 2006 e ao Pedido Provisório de Patente U.S. 60/808,183, apresentado a 24 de Maio de 2006. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção [0002] A invenção refere-se a proteínas de ligação que se vinculam ao factor de crescimento insulínico 2 (IGF-II) com reactividade cruzada com o factor de crescimento insulínico 1 (IGF-I) e suas aplicações. Mais especificamente, a invenção refere-se a anticorpos monoclonais direccionados ao IGF-II com reactividade cruzada com o IGF-I e suas aplicações. Os aspectos da invenção também se referem a hibridomas ou outras linhas celulares que expressam tais anticorpos.

Descrição da arte relacionada [0003] Os factores de crescimento insulínicos IGF-I e IGF-II são pequenos polipéptidos envolvidos na regulação da proliferação, sobrevivência, diferenciação e transformação 3 celular. Os IGF exercem as suas diversas acções principalmente através da interacção com receptores específicos da superfície celular, com o receptor IGF-I (IGF-IR) e pela activação de diversas cascatas de sinalização intracelulares. A circulação sérica dos IGF ocorre, principalmente, em ligação a proteínas ligação ao IGF (IGFBP-1 a 6) . A interacção entre os IGF e o IGF-IR é regulada pelos IGFBP, a ligação dos IGF ao IGF-IR apenas pode ocorrer após a libertação dos IGFBP (principalmente através da proteólise dos IGFBP). 0 IGF-I pode também ligar-se a um receptor híbrido composto por IGF-IR e subunidades do receptor de insulina (IR) . Foi já demonstrado gue o IGF-II estabelece ligação à isoforma "A" do receptor de insulina.

[0004] A transformação maligna envolve o desequilíbrio de diversos processos, tais como os de crescimento, diferenciação, apoptose e transformação celular. Os factores IGF-I e IGF-II foram implicados na patofisiologia de uma grande variedade de condições, acreditando-se que desempenham um papel tumorogénese devido às propriedades mitogénicas e anti-apoptóticas mediadas pelo receptor IGF-IR: LeRoith & Roberts. Câncer Lett. 195:127-137 (2003).

[0005] Constatou-se que o IGF-I corresponde a um factor de crescimento produzido pelo fígado sob o controlo da hormona de crescimento pituitária, originalmente designado como somatomedina C. Salmon et al., J. Lab. Clin. Med. 49:825-826 (1957) . Tanto o IGF-I como o IGF-II são expressos de forma ubíqua e agem como factores de crescimento endócrino, parácrino e autócrino, através da sua interacção com o IGF-IR, uma tirosina cinase transmembranar estrutural e funcionalmente associada ao receptor de insulina (IR) . O IGF-I funciona 4 principalmente pela activação do IGF-IR, ao passo que o IGF-II pode agir através do IGF-IR ou da isoforma IR-A, LeRoith & Roberts, Câncer Lett. 195:127-137 (2003). Adicionalmente, a interacção dos IGF I e II com proteínas de ligação ao IGF pode afectar a sua semivida e biodisponibilidade, bem como, em alguns casos, a sua interacção directa com receptores, Rajaram et al., Endocr. Rev. 18:801-831 (1997).

[0006] 0 IGF-I tem um impacto a longo prazo na proliferação, diferenciação e apoptose celular. As experiências em culturas de células do osteossarcoma ou cancro da mama sugeriram que o IGF-I é um potente mitogénio e exerce a sua acção através do incremento da síntese de DNA e estimulação da expressão de ciclina Dl, acelerando a progressão do ciclo celular da fase Gi para a S. Furlanetto et al., Mol. Endocrinol. 8:510-517 (1994); Dufourny et al., J. Biol. Chem. 272:311663-31171 (1997) . A supressão da expressão de ciclina Dl em células pancreáticas cancerosas eliminou o efeito mitogénico do IGF-I. Kornmann el al., J. Clin. Invest. 101:344-352 (1998). Para além de estimular a progressão do estímulo celular, o IGF-I também inibe a apoptose. Foi demonstrado que o IGF-I estimula a expressão de proteínas Bcl e suprime a expressão de Bax, o que resulta num incremento da quantidade relativa do heterodímero Bcl/Bax, bloqueando, desse modo, a iniciação da evolução da apoptose, Minshall et al., J. Immunol. 159:1225-1232 (1997); Parrizas et al., Endocrinology 138:1355-1358 (1997); Wang et al., Endocrinology 139:1354-1360 (1998).

[0007] Tal como o IGF-I, o IGF-II também possui uma acção mitogénica, anti-apoptótica e reguladora da proliferação e diferenciação celular. Em contraste com o IGF-I, as concentrações séricas de IGF-II em circulação são elevadas. 5

Foram encontradas concentrações séricas elevadas de IGF-II em doentes com cancro colorrectal, existindo uma tendência de exponenciação em estados mais avançados da doença, Renehan et al., Br. J. Câncer 83:1344-1350. Além disso, a maioria dos tumores primários e linhas celulares transformadas sobrexpressam mRNA e proteína IGF-II, Werner & LeRoith Adv. Câncer Res. 68:183 -223 (1996). A sobrexpressão de IGF-II no cancro do cólon está associada a um fenótipo agressivo, podendo a perda de impressão (perda de expressão alelo- específica) do gene IGF-II ser importante na carcinogénese colorrectal, Michell et al., Br. J. Câncer 76:60-66 (1997); Takano et al., Oncology 59:210-216 (2000). As células cancerosas com uma forte tendência de metastatização apresentam níveis de expressão de IGF-II quatro vezes superiores aos apresentados por células com uma tendência de metastatização inferior, Guerra et al., Int. J. Câncer 65:812-820 (1996).

[0008] Foi realçado pela investigação e estudos clínicos o papel dos membros da família IGF no desenvolvimento, manutenção e progressão do cancro. Foi demonstrada por diversas células cancerosas uma sobrexpressão de IGF-IR e/ou ligantes IGF. Por exemplo, IGF-I e IGF-II são potentes mitogénios para uma diversidade de linhas celulares cancerígenas, incluindo o sarcoma, leucemia e os cancros da próstata, mama, pulmão, cólon, estômago, esófago, fígado, pâncreas, rim, tiróide, cérebro, ovário e útero, Macaulay et al., Br. J. Câncer 65:311-320 (1992); Oku et al., Anticancer Res. 11:1591-1595 (1991); LeRoith et al., Ann. Intern. Med. 122:54-59 (1995); Yaginuma et al., Oncology 54:502-507 (1997); Singh et al., Endocrinology 137:1764-1774 (1996); Frostad et al., Eur. J. Haematol 62:191-198 (1999). Nas circunstâncias em 6 que o IGF-I foi administrado a células cancerosas malignas do cólon, estas tornaram-se resistentes à apoptose induzida pela citocina, Remacle-Bonnet et al., Câncer Res. 60:2007-2017 (2000).

[0009] O papel dos IGF no cancro é também sustentado por estudos epidemiológicos, que demonstraram que os níveis elevados e reduzidos de IGF-I e IGFBP-3, respectivamente, se encontram associados a um aumento do risco de desenvolvimento de diversos cancros comuns (próstata, mama, colorrectal e pulmão), Mantzoros et al. , Br. J. Câncer 76:1115-1118 (1997); Hankinson et al., Lancet 351:1393-1396 (1998); Ma et al., J. Natl.Câncer Inst. 91:620-625 (1999); Karasik et al., J. Clin. Endocrinol Metab. 78:271-276 (1994). Estes resultados sugerem que IGF-I e IGF-II actuam como potentes sinalizadores mitogénicos e anti-apoptóticos. estando a sua sobrexpressão associada a um fraco prognóstico em doentes com diversos tipos de cancro.

[0010] Através da utilização de modelos murinos de gene inactivo, vários estudos estabeleceram ainda o papel dos IGF no crescimento tumoral. Com o desenvolvimento da tecnologia de deleção genética condicional, específica para tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de deficiência hepática de IGF-I (LID). A deleção hepática específica do gene igfl revogou a expressão do mRNA IGF-I e causou uma redução dramática dos níveis de IGF-I em circulação, Yakar et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:7324-7329 (1999). Nas circunstâncias em que foram induzidos tumores mamários no ratinho LID, a redução dos níveis de IGF-I em circulação resultou em minorações significativas do desenvolvimento, crescimento e metastatização cancerosa, estando o seu incremento associado 7 ao reforço do crescimento tumoral, Wu et ai., Câncer Res. 63 :4384-4388 (2003) .

[0011] Foi reportado em diversos artigos que a inibição da expressão e/ou sinalização de IGF-IR conduz à inibição do crescimento tumoral, tanto in vitro como in vivo. A inibição da sinalização IGF foi também associada ao incremento da susceptibilidade das células tumorais a agentes quimioterapêuticos. Foram desenvolvidas diversas estratégias (oligonucleótidos anti-senso, receptores solúveis, péptidos inibidores, receptores negativos dominantes mutantes, pequenas moléculas que inibem a actividade da cinase e anticorpos anti-hlGF-lR) para inibir a via de sinalização do IGF-IR em células tumorais. Uma das abordagens corresponde ao direccionamento da actividade da cinase do IGF-IR com inibidores de pequenas moléculas. Foram recentemente identificados dois compostos como dois inibidores de cinase de pequenas moléculas capazes de inibir de forma selectiva o IGF-IR, Garcia-Echeverria et al., Câncer Cell 5:231-239 (2004); Mitsiades et ai., Câncer

Cell 5:221-230 (2004). A inibição da actividade da cinase IGF-IR revogou a sobrevivência e formação de colónias mediada pelo IGF-I de células mamárias cancerosas humanas MCF-7 em ágar macio, Garcia-Echeverria et ai., Câncer Cell 5:231-239 (2004).

Nas circunstâncias em que foi administrado um inibidor da cinase IGF-IR a ratinhos portadores de xenoenxertos tumorais, ocorreu uma inibição da sinalização IGF-IR a nivel dos xenoenxertos e uma redução significativa dos fibrossarcomas impulsionados pelo IGF-IR, Garcia-Echeverria et ai., Câncer Cell 5:231-239 (2004). Foi observado um efeito semelhante em neoplasias hematológicas, especialmente no mieloma múltiplo. Em células do mieloma múltiplo, um inibidor da cinase IGF-IR de pequenas moléculas demonstrou uma potência reforçada em >16 8 vezes contra o IGF-1R quando comparado com o receptor de insulina e foi igualmente eficaz na inibição do crescimento e sobrevivência celular. Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004). O mesmo composto foi intraperitonialmente injectado em ratinhos e inibiu o crescimento das células do mieloma múltiplo, expandindo a sua sobrevivência. Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004). Quando combinada com doses subterapêuticas de outros agentes quimioterapêuticos, a inibição da actividade da cinase IGF-IR reduziu sinergeticamente a carga tumoral, Mitsiades et al., Câncer Cell 5:221-230 (2004) .

[0012] Outra das abordagens para a inibição da sinalização IGF correspondeu ao desenvolvimento de anticorpos direccionados contra o receptor IGF-IR. Foram desenvolvidos por vários grupos anticorpos para o IGF-IR que inibem auto-fosforilação estimulada pelo receptor do IGF-I, induzem a internalização e degradação do receptor e reduzem a proliferação e sobrevivência de diversas linhas celulares cancerígenas humanas, Hailey et al., Mol Câncer Ther. 1:1349-1353 (2002); Maloney et al., Câncer Res. 63:5073-5083 (2003); Benini et al., Clin. Câncer Res. 7:1790-1797 (2001); Burtrum et al., Câncer Res. 63:8912-8921 (2003). Adicionalmente, em modelos de xenoenxerto tumoral, o bloqueio do IGF-IR resultou numa inibição significativa, in vivo, de tumores mamários, renais e pancreáticos, Burtrum et al., Câncer Res. 63:8912-8921 (2003); Maloney et al., Câncer Res. 63:5073-5083 (2003). As experiências que aplicam anticorpos quiméricos IGF-IR humanizados produziram resultados similares, inibindo o crescimento das células mamárias cancerosas in vitro e em xenoenxertos tumorais, Sachdev et al., Câncer Res. 63:627-635 (2003). Os outros anticorpos IGF-IR humanizados bloquearam a 9 fosforilação da tirosina induzida pelo IGF-I e a inibição do crescimento em tumores mamários e pulmonares de células não-pequenas, assim como in vivo, Cohen et al., Clin. Câncer Res. 11:2063-2073 (2005); Goetsch et al., Int. J. Câncer 113:316-328 (2005) .

[0013] O aumento dos níveis de IGF-I foi também associado a diversas condições patológicas não oncológicas, incluindo a acromegalia e o gigantismo (Barkan. Cleveland Clin. J. Med. 65:343. 347-349. 1998), tendo a anomalia da função do receptor IGF-I/IGF-II sido implicada na psoríase (Wraight et al., Nat. Biotech. 18:521-526. 2000), aterosclerose e reestenose do

músculo vascular liso após a angioplastia (Bayes-Genis et al., Circ. Res. 86: 125-130. 2000). A elevação dos níveis de IGF-I foi implicada na diabetes ou complicações a ela associadas, tais como a proliferação microvascular (Smith et al., Nat. Med. 5:1390-1395. 1999).

[0014] Os anticorpos para IGF-I e IGF-II foram divulgados na área. Ver, por exemplo, Goya et al., Câncer Res. 64:6252-6258 (2004) ; Miyamoto et ai., Clin. Câncer Res. 11:3494-3502

(2005) . Ver, adicionalmente as patentes WO 05/18671, WO 05/28515 e WO 03/93317.

RESUMO

[0015] As modalidades da invenção referem-se a proteínas de ligação que se vinculam de forma específica aos factores de crescimento semelhantes à insulina e reduzem o crescimento tumoral. Numa modalidade, as proteínas de ligação são anticorpos monoclonais totalmente humanos ou fragmentos dos mesmos que se vinculam especificamente aos factores de crescimento semelhantes à insulina e reduzem o crescimento 10 tumoral. Os mecanismos pelos quais tal pode ser conseguido podem incluir, sem limitação, a inibição da ligação do IGF-I/II ao seu receptor IGF-IR, a inibição da sinalização IGF-IR induzida pelo IGF-I/II ou uma depuração acrescida do IGF-I/II, reduzindo, desse modo, a concentração efectiva do IGF-I/II.

[0016] Assim, algumas modalidades fornecem uma proteína de ligação específica isolada totalmente humana consonante com a reivindicação 1 aqui presente. Em certos aspectos, a vinculação da proteína de ligação ao IGF-II ocorre com uma afinidade, pelo menos, 2,5 vezes superior à correspondente ao IFG-I. Noutros aspectos, a vinculação da proteína de ligação ao IGF-II ocorre com uma afinidade, pelo menos, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 50, 60, 100 ou 150 vezes superior à correspondente ao IGF-I.

[0017] Em algumas modalidades, a proteína de ligaçao específica tem um EC50 máximo de 15 nM para a inibição da fosforilação do receptor IGF-I dependente do IGF-I em células NIH3T3 que expressam IGF-IR de forma ectópica. Em alguns aspectos, a proteína de ligação específica tem um EC50 máximo de 10 ou 8 nM para a inibição da fosforilação do receptor IGF-I dependente do IGF-I em células NIH3T3 que expressam IGF-IR de forma ectópica.

[0018] Em algumas modalidades, a proteína de ligaçao específica apresenta um EC50 máximo de 4 ou 3 nM para a inibição da fosforilação do receptor IGF-I dependente do IGF-I em células NIH3T3 que expressam IGF-IR de forma ectópica.

[0019] Noutras modalidades, a proteína de ligação específica inibe mais de 70% da proliferação mediada pelo IGF-II de 11 células NIH3T3 que expressam hIGF-IR recombinante com um EC50 máximo de 25, 20, 15 ou 10 nM.

[0020] Noutras modalidades, a proteína de ligação específica inibe mais de 70% da proliferação induzida pelo IGF-I de células NIH3T3 que expressam hIGF-IR recombinante com um EC50 inferior a 40, 30 ou 25 nM.

[0021] A proteína de ligaçao específica pode ser um anticorpo totalmente humano que se liga ao IGF-I com uma KD inferior a 500 picomolar (pM). De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 450 picomolar (pM) . De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 410 picomolar (pM) . De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 350 350 pM. Ainda com maior preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 300 pM. As medições de afinidade e/ou avidez podem ser concretizadas através de um BIACORE®, tal como aqui descrito.

[0022] A proteína de ligação específica pode ser um anticorpo monoclonal humano que se liga ao IGF-II com uma KD inferior a 175 picomolar (pM). De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 100 picomolar (pM) . De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 50 picomolar (pM) . De preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 5 picomolar (pM). Ainda com maior preferência, o anticorpo estabelece ligação com uma KD inferior a 2 pM.

[0023] Em determinadas modalidades, a proteína de ligação específica é um anticorpo monoclonal totalmente humano ou um fragmento de ligação de um anticorpo monoclonal totalmente 12 humano. Os fragmentos de ligaçao podem incluir fragmentos tais como Fab, Fab' ou F(ab')2 e Fv.

[0024] Uma modalidade da invenção incorpora anticorpos monoclonais totalmente humanos 7.159.2 (Número de Acesso ATCC PTA-7424) que se ligam de forma especifica ao IGF-I/II, tal como abaixo descrito em maior detalhe.

[0025] Em algumas modalidades a proteína de ligação específica que se vincula ao factor de crescimento insulínico II (IGF-II) com reactividade cruzada com o factor de crescimento insulínico I (IGF-I), ou fragmento de ligação da mesma, pode incluir um polipéptido de cadeia pesada com a SEQ. ID N.°: 6 e um polipéptido de cadeia leve com a SEQ. ID N.°: 8.

[0026] Em determinadas modalidades, a proteína de ligação específica pode encontrar-se misturada com um transportador farmacologicamente aceitável.

[0027] Outra modalidade inclui moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codificam qualquer uma das proteínas de ligação aqui descritas, vectores que contêm moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação específica ou uma célula hospedeira transformada por qualquer dessas moléculas e vectores de ácidos nucleicos.

[0028] Em certas modalidades a proteína de ligação específica que se vincula ao factor de crescimento insulínico II (IGF-II) com reactividade cruzada com o factor de crescimento insulínico I (IGF-I), ou fragmento de ligação do mesmo não se vincula de forma específica às proteínas IGF-II ou IGF-I quando estas se encontram ligadas a proteínas de ligação do factor de crescimento insulínico. 13 [0029] As modalidades adicionais incluem métodos de determinação dos níveis dos factores de crescimento insulínico II (IGF—II) e I (IGF-I) numa amostra do doente em consonância com a reivindicação 12 aqui presente. Estes métodos podem incluir o fornecimento de uma amostra de um doente; o contacto da amostra com uma proteína de ligação específica que se vincula ao factor de crescimento insulínico II (IGF-II) com reactividade cruzada com o factor de crescimento insulínico I (IGF-I), ou fragmento de ligação da mesma e a determinação dos níveis de IGF-I e IGF-II nessa mesma amostra. Em alguns aspectos, a amostra recolhida do paciente é sanguínea.

[0030] As modalidades adicionais incluem um conjugado consonante com a reivindicação 18 aqui presente. Em alguns aspectos, o agente terapêutico pode ser uma toxina, um radioisótopo ou uma composição farmacêutica.

[0031] Algumas modalidades fornecem a aplicação das proteínas de ligação específica aqui descritas na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor maligno. Em alguns aspectos, a proteína de ligação específica pode ser um anticorpo monoclonal totalmente humano. Em determinados aspectos, a proteína de ligação é o mAb 7.159.2 (Número de Acesso ATCC PTA-7424). Em alguns aspectos, o medicamento é combinado com um segundo agente anti-neoplásico seleccionado de entre um grupo composto por um anticorpo, um agente quimioterapêutico e um fármaco radioactivo. Em alguns aspectos, o medicamento é utilizado em conjunção ou após uma cirurgia convencional, transplante de células estaminais da medula óssea ou periféricas.

[0032] O tumor maligno pode corresponder, por exemplo, ao melanoma, cancro do pulmão de não-pequenas células, glioma, 14 hepatocarcinoma (fígado), cancro gástrico (estômago), cancro da próstata, cancro da mama, cancro ovárico, cancro da bexiga, cancro do pulmão, glioblastoma, cancro do endométrio, cancro renal, cancro do cólon, cancro pancreático e carcinoma epidermóide.

[0033] Deve notar-se que os especialistas de habilidade comum na área podem facilmente realizar determinações de CDR. Ver, por exemplo Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.

[0034] As modalidades da invenção aqui descritas referem-se a anticorpos monoclonais que se ligam ao IGF-I/II e afectam a sua função. Outras modalidades referem-se a anticorpos anti-IGF-I/II totalmente humanos e preparações de anticorpos anti-IGF-IIII com propriedades desejáveis a partir de uma perspectiva terapêutica, com inclusão da elevada afinidade de ligação para o IGF-I/II, a capacidade de neutralização in vitro e in vivo do IGF-I/II e a capacidade de inibição da proliferação celular induzida pelo IGF-IIII.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0035] A figura 1 é um gráfico que a apresenta a inibição do crescimento no xenoenxerto tumoral em ratos sem pêlo de células NIH3T3 que expressam IGF-II e IGF-IR (células do clone 32) com os mAb 7.159.2. 7.34.1 e 7.251.3, relativamente aos controlos de IgG2 e PBS. O volume tumoral médio é apresentado no eixo de y e o período pós-transplante no eixo de x.

[0036] A figura 2 é um gráfico que apresenta o peso corporal no clone do ratinho xenoenxertado 32 tratado com os mAb 7.159.2. 7.34.1 e 7.251.3, relativamente aos controlos de IgG2 15 e PBS. 0 peso corporal médio é apresentado no eixo de y e o período pós-transplante no eixo de x.

[0037] A figura 3 é um gráfico que a apresenta a inibição do crescimento no xenoenxerto tumoral em ratos sem pêlo de células NIH3T3 que expressam IGF-I e IGF-IR (células P12) com o mAb 7.159.2, relativamente ao controlo de PBS. O volume tumoral médio é apresentado no eixo de y e o período pós-transplante (indicado por data) no eixo de x.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0038] As modalidades da invenção aqui descritas referem-se a proteínas de ligação que se ligam de forma específica ao IGF-II com reactividade cruzada para o IGF-I (aqui referidas como "IGFI/II"). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos, que estabelecem ligação ao IGF-II com reactividade cruzada para o IGF-I e inibem a ligação entre estas proteínas e os seus receptores, IGF-IR. Outras modalidades da invenção incluem anticorpos neutralizadores anti-IGF-I/II totalmente humanos e preparações de anticorpos com utilidade terapêutica que estabelecem ligação com ambos os factores de crescimento semelhantes à insulina. Tais preparações de anticorpos anti-IGF-I/II possuem, preferencialmente, propriedades terapêuticas desejáveis, incluindo uma forte afinidade de ligação para o IGF-I/II, a capacidade de neutralizar, in vitro, o IGF-I/II e de inibir, in vivo, a proliferação celular induzida pelo IGF-I/IT. 16 [0039] As modalidades da invenção incluem também fragmentos de ligação isolados de anticorpos anti-IGF-I/II, preferencialmente, os fragmentos de ligação são derivados de anticorpos anti-IGF-I/II totalmente humanos. Os fragmentos exemplares incluem Fv, Fab' ou outros fragmentos de anticorpos bem conhecidos, tal como abaixo descrito em maior detalhe, As modalidades da invenção incluem também células que expressam anticorpos totalmente humanos contra IGF-I/II. Os exemplos de células incluem hibridomas ou células de origem recombinante, tais como as células do ovário de hamster chinês (CHO) que produzem anticorpos contra IGF-I/II.

[0040] Os anticorpos anti-IGF-I/II têm utilidade na prevenção da transdução de sinal mediada pelo IGF-I/II, inibindo, dessa forma, a proliferação celular. 0 mecanismo de acção desta inibição pode incluir a restrição da ligação de IGF-I/II ao seu receptor, inibição da sinalização IGF-IR induzida pelo IGF-I/II ou depuração reforçada de IGF-I/II reduzindo, dessa forma, a concentração disponível para ligação ao IGF-IR. As doenças tratáveis através deste mecanismo de inibição incluem, sem limitação, neoplasias, tais como o melanoma, cancro do pulmão de não-pequenas células, glioma, hepatocarcinoma (fígado), tumores ginecológicos, cancro da cabeça e pescoço, cancro esofágico, glioblastoma e cancros e tumores da tiróide, estômago, próstata, mama, ovários, bexiga, pulmão, útero, rim, cólon, pâncreas, glândula salivar e colorrectais.

[0041] Outras modalidades da invenção incluem ensaios de diagnóstico para determinar, de forma específica, a quantidade de IGF-I/II numa amostra biológica. 0 kit de ensaio pode incluir anticorpos anti-IGF-I/II acompanhados dos marcadores necessários à sua detecção. Estes ensaios de diagnóstico têm 17 utilidade no rastreio de doenças associadas ao factor de crescimento que incluem, sem limitação, melanoma, cancro do pulmão de não-pequenas células, glioma, hepatocarcinoma (figado) , tumores ginecológicos, cancro da cabeça e pescoço, cancro esofágico, glioblastoma e carcinoma da tiróide, estômago, próstata, mama, ovários, bexiga, pulmão, útero, rim, cólon, pâncreas, glândula salivar e colorrectal. Outras condições patológicas não neoplásicas podem incluir acromegalia e gigantismo, psoríase, osteoporose, aterosclerose, reestenose do músculo vascular liso, assim como a diabetes.

[0042] São, em seguida, fornecidas e descritas em maior detalhe modalidades, caracteristicas e similares adicionais com referência a anticorpos anti-IGF-I/II.

Listagem de sequências [0043] As modalidades da invenção incluem os anticorpos anti-IGF-I/II específicos abaixo enumerados na Tabela 1. Esta tabela indica o número de identificação de cada anticorpo anti-IGF-I/II, acompanhada pelo número de identificação da sequência (SEQ. ID N.°) dos genes de cadeia leve e pesada correspondente. São adicionalmente fornecidas na tabela 1 as sequências germinativas a partir das quais deriva cada cadeia pesada e leve.

[0044] Foi atribuído a cada anticorpo um número de identificação que inclui dois ou três números separados por um ou dois pontos decimais. Em alguns casos, foram preparados vários clones de um anticorpo. Embora os clones tenham 18 sequências idênticas de ácidos nucleicos e aminoácidos como suas precursoras, podem também ser listados separadamente, com indicação do número do clone à direita de um segundo ponto decimal. Assim, por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos do anticorpo 7.159.2 são idênticas às do 7.159.1.

[0045] Tal como pode ser observado através da comparaçao das sequências constantes na listagem, as SEQ. ID N.°: 1-20 diferem das SEQ. ID N.°: 39-58 uma vez que as SEQ. ID N.°: 39-58 incluem o péptido sinalizador não traduzido e as regiões de domínio para cada cadeia leve ou pesada sequenciada. TABELA 1 N. 2 ID do mAb: jSequência SEQ ID N. 2 | Sequência de nucleótidos que codifica a região 1 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 2 jvariável da cadeia pesada 7.158.1 | |Sequência de nucleótidos que codifica a região 3 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 4 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 5 jvariável da cadeia pesada 7.159.2 | jSequência de aminoácidos que codifica a região 6 jvariável da cadeia pesada ......................----................... 19 Ν. 2 ID do mAb: j Sequência SEQ ID j N. 2 | Sequência de nucleótidos que codifica a região 7 jvariável da cadeia leve |Sequência de aminoácidos que codifica a região 8 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 9 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 10 jvariável da cadeia pesada 7.34.1 | jSequência de nucleótidos que codifica a região 11 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 12 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 13 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 14 jvariável da cadeia pesada 7.251.3 | jSequência de nucleótidos que codifica a região 15 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 16 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 17 ivariável da cadeia pesada 7.234.1 j jSequência de aminoácidos que codifica a região 18 20 Ν. 2 ID do mAb: j Sequência SEQ ID j N. 2 jvariável da cadeia pesada |Sequência de nucleótidos que codifica a região 19 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 20 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 39 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 40 jvariável da cadeia pesada 7.158.1 | jSequência de nucleótidos que codifica a região 41 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 42 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 43 jvariável da cadeia pesada iSequência de aminoácidos que codifica a região 44 jvariável da cadeia pesada 7.159.2 | jSequência de nucleótidos que codifica a região 45 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 46 jvariável da cadeia leve SSequência de nucleótidos que codifica a reqião 7 34 1 í 47 jvariável da cadeia pesada 21 Ν. 2 ID do mAb: j Sequência SEQ ID j N. 2 |Sequência de aminoácidos que codifica a região 48 jvariável da cadeia pesada |Sequência de nucleótidos que codifica a região 49 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 50 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 51 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 52 jvariável da cadeia pesada 7.251.3 j jSequência de nucleótidos que codifica a região 53 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 54 jvariável da cadeia leve jSequência de nucleótidos que codifica a região 55 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 56 jvariável da cadeia pesada 7.234.1 j jSequência de nucleótidos que codifica a região 57 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 58 jvariável da cadeia leve Germinativo jSequência de nucleótidos que codifica a região 59 22 Ν.2 ID do mAb: I Sequência SEQ ID j N. “ (7.158.1) jvariável da cadeia pesada |Sequência de aminoácidos que codifica a região 60 jvariável da cadeia pesada jSequência de nucleótidos que codifica a região 61 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos jvariável da cadeia leve que codifica a região 62 jSequência de nucleótidos que codifica a região 63 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 64 Germinativo jvariável da cadeia pesada (7.159.1) jSequência de nucleótidos que codifica a região 65 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos jvariável da cadeia leve que codifica a região 66 iSequência de nucleótidos que codifica a região 67 jvariável da cadeia pesada jSequência de aminoácidos que codifica a região 68 Germinativo (7.34.1) jvariável da cadeia pesada jSequência de nucleótidos que codifica a região 69 jvariável da cadeia leve jSequência de aminoácidos que codifica a região 70 jvariável da cadeia leve 23 Ν.2 ID do mAb: j Sequência SEQ ID N. 2 a região;71 |Sequência de nucleótidos que codifica jvariável da cadeia pesada

Germinativo (7.251.3) |Sequência de aminoácidos que codifica jvariável da cadeia pesada iSequência de nucleótidos que codifica Ivariável da cadeia leve a região j72 região 73 |Sequência de aminoácidos que codifica a jvariável da cadeia leve regrao 74

Definições [0046] Excepto se definido em contrário, os termos técnicos e científicos aqui empregues devem assumir o significado que lhes é habitualmente conferido pelos especialistas na área. Adicionalmente, exceptuando se exigido pelo contexto, os termos no singular deverão incluir o plural e os termos no plural deverão incluir o singular. Normalmente, a nomenclatura aplicada ao contexto da cultura de células e tecidos e respectivas técnicas, em biologia molecular, química e hibridação de proteínas, oligo e polinucleótidos aqui descrita corresponde à de conhecimento e aplicação comum na área.

[0047] São utilizadas técnicas padrão na síntese de oligonucleótidos de DNA recombinante e na cultura e transformação de tecidos (por exemplo, electroporação, lipofecção). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como habitualmente concretizadas na área ou de acordo com a 24 descrição aqui presente. As técnicas e procedimentos supracitados são, geralmente, realizados de acordo com os métodos convencionais bem conhecidos na área e conforme descrito em várias referências genéricas e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. N.Y. (2001)), aqui incorporado como referência. A nomenclatura, procedimentos laboratoriais e respectivas técnicas aqui descritas no contexto da química analítica, orgânica sintética, médica e farmacêutica são do conhecimento dos especialistas e de utilização comum na área. São utilizadas técnicas padronizadas para a síntese e análise química e para a preparação, formulação, entrega e tratamento farmacológico de pacientes.

[0048] Como empregues de acordo com a presente divulgação, os termos que se seguem, excepto indicação em contrário, devem ser compreendidos de acordo com os seguintes significados: [0049] O termo "IGF-I" refere-se à molécula do factor de crescimento insulínico I e o termo "IGF-II" à molécula do factor de crescimento insulínico II. O termo "IGF-I/II" refere-se a ambos os factores de crescimento insulínico I e II e à ligação preferencial do IGF-II com reactividade cruzada ao IGF-I. Assim, um anticorpo que se liga ao IGF-I/II irá, preferencialmente, vincular-se ao IGF-II e irá, contudo, apresentar reactividade cruzada com o IGF-I, ligando-se ao IGF-II com uma afinidade mais elevada do que ao IGF-I, por exemplo, o anticorpo pode ligar-se ao IGF-II com uma afinidade 2,5 vezes superior àquela com que se liga ao IGF-I. Em certas modalidades, o anticorpo pode ligar-se ao IGF-II com uma 25 afinidade, pelo menos, 5, 10, 25, 50 ou 150 vezes superior face àquela com se vincula ao IGF-I.

[0050] Quando aplicado a anticorpos, o termo "neutralizador refere-se à sua capacidade de eliminar ou reduzir substancialmente a actividade de um antigénio alvo. Como tal, um anticorpo anti-IGF-I/II "neutralizador" é capaz de eliminar ou reduzir substancialmente a actividade do IGF-I/II. Um anticorpo IGF-I/II neutralizador pode, por exemplo, actuar pelo bloqueio da vinculação do IGF-I/II ao seu receptor, IGF-IR. Através do bloqueio desta vinculação, a transdução de sinal mediada pelo IGF-IR é substancialmente, ou completamente, eliminada. Idealmente, um anticorpo neutralizador contra o IGF-I/II será inibidor da proliferação celular.

[0051] O termo "polinucleótido isolado", como aqui empregue, designa um anticorpo que tenha sido isolado do seu ambiente de ocorrência natural. Tais polinucleótidos podem ser genómicos, de DNA complementar (cDNA) ou sintéticos. Os polinucleótidos isolados não estão, preferivelmente, associados com todos ou parte dos polinucleótidos com que se associam na natureza. Os polinucleótidos isolados podem estar operacionalmente ligados a outro polinucleótido ao qual não se encontram ligados na natureza. Além disso, os polinucleótidos isolados não ocorrem, de preferência, naturalmente como parte de uma sequência maior.

[0052] O termo "proteína isolada", como aqui empregue, designa uma proteína que tenha sido isolada do seu ambiente de ocorrência natural. Tais proteínas podem derivar de DNA genómico, cDNA, DNA recombinante, RNA recombinante ou de origem sintética, ou algumas combinações dos mesmos, em que em 26 virtude da sua origem ou fonte de derivação (1) a "proteína isolada" não está associada a proteínas encontradas na natureza, (2) está isenta de outras proteínas com a mesma origem, por exemplo, proteínas murinas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.

[0053] 0 termo "polipéptido" é aqui empregue como um termo genérico para referência à proteína nativa, fragmentos ou análogos de uma sequência de polipéptidos. Por isso, proteína nativa, fragmentos e análogos são espécies do género polipéptido. Polipéptidos preferidos, de acordo com a invenção, compreendem as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve capa, assim como moléculas de anticorpo formadas por combinações que compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como moléculas de imunoglobulina de cadeia leve capa ou lambda, e vice-versa, assim como fragmentos e análogos das mesmas. Polipéptidos preferidos de acordo com a invenção podem também compreender apenas as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada ou fragmentos da mesma.

[0054] 0 termo "ocorrência natural" como aqui empregue aplicado a um objecto, refere-se ao facto desse objecto poder ser encontrado na natureza, por exemplo, uma sequência de polipéptidos ou polinucleótidos que está presente num organismo (incluindo os vírus) , que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo Homem, em laboratório ou de outra forma, é de ocorrência natural. 27 [0055] O termo "operacionalmente ligado", como aqui empregue, refere-se a posições dos componentes descritos que estão numa relação que lhes permite funcionar da forma pretendida, por exemplo, uma sequência de controlo "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora está ligada de modo a que a sequência codificadora seja alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo.

[0056] 0 termo "polinucleótido", como aqui referido, significa uma forma polimérica de nucleótidos de, pelo menos, 10 bases em comprimento, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido, ou heterodúplices RNA/DNA. 0 termo inclui DNA de cadeia simples e dupla.

[0057] 0 termo "oligonucleótido" aqui empregue, inclui nucleótidos de ocorrência natural e modificados, ligados uns aos outros através de ligações de ocorrência natural e sintética. Os oligonucleótidos são um subconjunto de polinucleótidos, que possui, geralmente, um comprimento de 200 bases ou menos. Preferivelmente, os oligonucleótidos têm de 10 a 60 bases de comprimento e, mais preferivelmente, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 bases de comprimento. Os oligonucleótidos são, normalmente, de cadeia simples, por exemplo, para sondas; embora possam ser de cadeia dupla, por exemplo, para utilização na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos podem ser oligonucleótidos senso ou anti-senso.

[0058] O termo "nucleótidos de ocorrência natural" aqui referido, inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. O termo "nucleótidos modificados" aqui referido, inclui 28 nucleótidos com grupos açúcar modificados ou substituídos e substâncias similares. 0 termo "ligações de oligonucleótidos" aqui empregue inclui ligações de oligonucleótidos como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilodiadato, fosforoaniladato, fosforoamidato ou similares. Ver, por exemplo, LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. pp. 87-108 (F. Eckstein. Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. Patente U.S. 5,151,510; Uhlmann & Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas referências se encontram aqui incorporadas como referência. Se desejado, um oligonucleótido pode incluir um marcador para detecção.

[0060] Duas sequências de aminoácidos são "homólogas" se existir uma identidade completa ou parcial entre as duas sequências, por exemplo, uma homologia de 85% significa que 85% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências estão alinhadas para emparelhamento máximo. São permitidas lacunas (em ambas as sequências que se encontram emparelhadas) na maximização do emparelhamento; são preferidas lacunas com um comprimento máximo de 5, sendo preferenciais as que apresentam um comprimento máximo de 2. Alternativa e preferivelmente, duas sequências de proteínas (ou sequências de polipéptidos derivadas delas com pelo menos 30 aminoácidos de comprimento) são homólogas, conforme aqui definido, se tiverem um resultado de alinhamento superior a 5 (em unidades de desvio padrão) utilizando a aplicação ALIGN com a matriz de dados de mutação e uma penalização de lacunas igual ou superior a 6. Ver, Dayhoff. M.O., em Atlas of Protein Sequence 29 and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) e o suplemento 2 deste volume, pp. 1-10. As duas sequências ou partes destas são, preferencialmente, homólogas se os seus aminoácidos forem pelo menos 50% idênticos quando alinhados optimamente utilizando a aplicação ALIGN. Deve notar-se que podem existir diferentes regiões de homologia entre duas sequências ortólogas, por exemplo, os locais funcionais de ortólogos murinos e humanos podem apresentar um grau de homologia mais elevado do que as regiões não funcionais.

[0063] Os termos que se seguem são empregues para descrição das relações sequenciais entre uma ou mais sequências de aminoácidos ou polinucleótidos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem identidade de sequência" e "identidade substancial". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida, utilizada como base para uma sequência de comparação. Uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, um segmento de um cDNA inteiro ou de uma sequência genética presente numa listagem de sequências ou pode compreender cDNA inteiro ou uma sequência genética inteira. Normalmente, uma sequência de referência tem um comprimento de, pelo menos, 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos, frequentemente de, pelo menos, 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos e, com frequência, de 48 nucleótidos ou 16 aminoácidos. Uma vez que as duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos podem (1) compreender uma sequência (por exemplo, uma parte da sequência de polinucleótidos ou aminoácidos completa) que é semelhante entre as duas moléculas, e (2) podem ainda compreender uma sequência que é divergente entre as duas sequências de 30 polinucleótidos ou aminoácidos, as comparações de sequências entre duas (ou mais) moléculas são realizadas, normalmente, através de sequências de comparação das duas moléculas numa "janela de comparação", para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como aqui empregue, refere-se a um segmento conceptual de pelo menos 18 posições de nucleótidos contíguos ou cerca de 6 aminoácidos em que a sequência de polinucleótidos ou aminoácidos é comparada a uma sequência de referência de pelo menos 18 nucleótidos contíguos ou 6 sequências de aminoácidos, e em que a parte da sequência de polinucleótidos na janela de comparação pode incluir adições, deleções, substituições e afins (lacunas, por exemplo) de 20% ou menos, quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento óptimo das duas sequências. Pode ser conduzido um alinhamento optimizado de sequências para conseguir uma janela de comparação através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), através do algoritmo de alinhamento homólogo de Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), através da implementação computorizada desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA nos pacotes de software Wisconsin Genetics, versão 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr. Madison, Wis.), GENEWORKS™ ou MACVECTOR®) ou através de inspecção, sendo seleccionado o melhor alinhamento (ou seja, aquele que resulta na maior percentagem de homologia sobre a janela de comparação) gerado a partir dos diversos métodos.

[0064] O termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de polipéptidos ou aminoácidos são idênticas (por 31 exemplo, numa base de nucleótido por nucleótido ou resíduo por resíduo) ao longo da mesma janela de comparação. A "percentagem de identidade sequencial" é calculada através da comparação de duas sequências optimamente alinhadas ao longo da janela de comparação, determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico idêntica (e.g., A, T, C, G, U ou I) ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições coincidentes, dividindo o número de posições coincidentes pelo número total de posições da janela de comparação (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando o resultado por cem para obter a percentagem de identidade sequencial. 0 termo "identidade substancial", como aqui empregue, refere-se a uma característica de uma sequência de polinucleótidos ou aminoácidos, onde o polinucleótido ou o aminoácido contém uma sequência que apresenta uma identidade sequencial de, pelo menos, 85%, preferencialmente entre, pelo menos, 90% e 95% e ainda com maior preferência de , pelo menos, 99% quando comparada com uma sequência de referência numa janela de comparação com, pelo menos, 18 posições de nucleótidos (6 aminoácidos), frequentemente numa janela de, pelo menos, 24-48 posições de nucleótidos (8-16 aminoácidos), onde a percentagem de identidade de sequência é calculada através da comparação da sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições que perfazem um total de 20% ou menos da sequência de referência ao longa da janela de comparação. A sequência de referência deve ser um subconjunto de uma sequência maior.

[0065] Como aqui empregue, os vinte aminoácidos essenciais e as suas abreviaturas sequem a utilização convencional. Ver, Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub & D.R. Gren. Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), aqui 32 incorporado como referência. Os estereoisómeros (por exemplo, aminoácidos D) dos 20 aminoácidos essenciais, aminoácidos não-naturais como os aminoácidos a, aminoácidos a-dissubstituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais podem, também, ser componentes adequados para os polipéptidos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetilisina, ε-Ν-acetil-lisina, 0-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica aqui utilizada, a direcção do método é a direcção amino-terminal e a direcção à direita é a carboxi-terminal, de acordo com o uso e convenções padrão.

[0066] De modo semelhante, salvo especificação em contrário, a extremidade esquerda das sequências de polinucleótidos de cadeia simples é a terminação 5'; a direcção à esquerda de sequências de polinucleótidos de cadeia dupla é designada como direcção 5', A direcção entre 5' e a adição 3' das transcrições de RNA a nascente é designada como direcção de transcrição; as regiões da sequência na cadeia de DNA que apresenta a mesma estrutura que o RNA e que se encontram entre 5' e a terminação 5' da transcrição de RNA são designadas como "sequências a montante"; as regiões da sequência na cadeia de DNA que têm a mesma sequência que o RNA e que se encontram entre 3' e a terminação 3' da transcrição de RNA são designadas como "sequências a jusante".

[0067] Quando aplicado a polipéptidos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências peptídicas, quando 33 alinhadas optimamente, como, por exemplo, através das aplicações GAP ou BESTFIT utilizando pesagens de lacunas padrão, partilham pelo menos 80%, preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferivelmente, pelo menos 95% e ainda com maior preferencia, pelo menos 99% de identidade sequencial, preferencialmente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem em substituições conservadoras de aminoácidos. As substituições conservadoras de aminoácidos referem-se à permutabilidade de resíduos que apresentam as mesmas cadeias laterais similares, por exemplo, um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais alifáticas é a glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais alifáticas com grupo hidroxilo é a serina e a treonina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais que contêm amidas é a asparagina e a glutamina; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais aromáticas é a fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais básicas é a lisina, a arginina e a histidina; e um grupo de aminoácidos que tem cadeias laterais com enxofre é a cisteína e a metionina. Os grupos de substituições de aminoácidos conservadoras preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutâmico-aspártico, asparagina e glutamina.

[0068] Como aqui discutido, variações menos significativas nas sequências de aminoácidos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são consideradas como englobadas pela presente invenção, desde que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, 90%, 95% e ainda com maior preferência 99% da identidade sequencial relativamente aos anticorpos ou moléculas de 34 imunoglobulina aqui descritos. Particularmente, são observadas substituições conservadoras de aminoácidos. As substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos com cadeias laterais relacionadas. Os aminoácidos geneticamente codificados são, normalmente, divididos em famílias: (1) acídicos=aspartato, glutamato; (2) básicos=lisina, arginina, histidina; (3) não polares=alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polares não carregados=glicina, asparagina, glutamina, cisteínas, serina, treonina, tirosina. As famílias preferidas são: serina e treonina que são uma família hidróxi-alifática; asparagina e glutamina, uma família que contém amida; alanina, valina, leucina e isoleucina, que são uma família alifática; fenilalanina, triptofano e tirosina, uma família aromática, por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, uma treonina por uma serina, ou substituições semelhantes de um aminoácido por um aminoácido de estruturalmente relacionado, não terá um efeito significativo na função de ligação ou propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um local da estrutura. É possível determinar prontamente se uma mudança de aminoácido resulta num péptido funcional, ensaiando a actividade específica do polipéptido derivado. Os ensaios são aqui descritos em detalhe. Os fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser facilmente preparados pelos especialistas na área. As terminações amino ou carboxi de fragmentos ou análogos preferidas ocorrem nas proximidades dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados através da comparação de 35 dados da sequência de nucleótidos e/ou aminoácidos com bases de dados de sequências, públicas ou privadas, preferencialmente, são utilizados métodos de comparação computadorizados na identificação de motivos de sequência ou domínios esperados de conformação proteica que ocorrem noutras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. São conhecidos métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram numa estrutura tridimensional, Bowie et al. Science 253:164 (1991) . Assim, os exemplos precedentes demonstram que os especialistas na área conseguem reconhecer motivos sequenciais e conformações estruturais que podem ser usadas na definição de domínios estruturais e funcionais consoantes com os anticorpos aqui descritos.

[0069] As substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos proteicos, (4) alteram afinidades de ligação e (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos, Os análogos podem incluir várias proteínas mutantes de qualquer sequência, excepto da sequência de péptidos de ocorrência natural, por exemplo, podem ser efectuadas múltiplas substituições de aminoácidos (preferencialmente, substituições conservadoras de aminoácidos) na sequência de ocorrência natural, de preferência na secção do polipéptido que se encontra fora do(s) domínio(s) que formam contactos intermoleculares. Uma substituição de aminoácidos conservadora não deve alterar substancialmente as caracteristicas estruturais da sequência precursora (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na sequência precursora, nem perturbar outro 36 tipo de estrutura secundária que caracterize a sequência precursora). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias reconhecidas na arte são descritos em Proteins, structures and Molecular principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to protein structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991), aqui incorporados como referência.

[0070] 0 termo "fragmento de polipéptido", como aqui empregue, refere-se a um polipéptido que apresenta uma deleção amino e/ou carbóxi-terminal, mas onde a sequência de aminoácidos restante é idêntica à posição correspondente na sequência de ocorrência natural deduzida, por exemplo, de uma sequência de cDNA de comprimento total. Os fragmentos apresentam, normalmente, um comprimento de, pelo menos, 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos, preferencialmente, pelo menos 14 aminoácidos, mais preferencialmente, pelo menos 20 aminoácidos, geralmente de, pelo menos, 50 aminoácidos e ainda com maior preferência de, de pelo menos 70 aminoácidos. O termo "análogo", como aqui empregue, refere-se a polipéptidos que são compostos por um segmento de, pelo menos, 25 aminoácidos que apresentam uma identidade substancial relativamente a uma parte de uma sequência de aminoácidos deduzida e apresenta, pelo menos, uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica ao IGF-I /11, sob condições de ligação adequadas, (2) capacidade de bloquear a ligação adequada do IGF-I/II ou (3) capacidade de inibir a actividade do IGF-I/II. Normalmente, os análogos de polipéptidos contêm uma substituição conservadora de aminoácidos (adição ou deleção) em relação à sequência de ocorrência natural. Habitualmente, o comprimento dos análogos é de, pelo menos 20 aminoácidos, preferencialmente maior ou 37 igual a 50, podendo ser, frequentemente, tão compridos como um polipéptido de ocorrência natural. Habitualmente, o comprimento dos análogos é de, pelo menos 20 aminoácidos, preferencialmente maior ou igual a 50, podendo ser, frequentemente, tão compridos como um polipéptido de ocorrência natural.

[0071] Os análogos de péptidos são comummente utilizados na indústria farmacêutica como medicamentos não-peptídicos com propriedades análogas às do péptido modelo. Esses tipos de compostos não-peptidicos são chamados de "péptidos miméticos" ou "peptidomiméticos", Fauchere. J. Adv.Drug Res. 15:29 (1986); Veber & Freidinger TINS p.392 (1985); e Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), aqui incorporados como referências. Tais compostos são, frequentemente, desenvolvidos com o auxilio da modelagem molecular computadorizada. Os péptidos miméticos estruturalmente similares a péptidos com utilidade terapêutica podem ser utilizados na produção de um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido paradigma (ou seja, um polipéptido que tem uma propriedade bioquímica ou farmacológica), tal como um anticorpo humano, mas que apresenta uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por uma ligação seleccionada entre um grupo composto por: —CH2NH—, —CH2S —, —CH2-CH2 —, —CH=CH—(cis e trans),-COCH2—, —CH(0H)CH2— e -CH2SO—, através de métodos conhecidos na área. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consensual com um aminoácido D do mesmo tipo (por exemplo, D-lisina em vez de L-lisina) pode ser utilizada para gerar mais péptidos estáveis. Em adição, os péptidos constrangidos que compreendem uma sequência consensual ou variação de uma sequência consensual 38 substancialmente idêntica podem ser gerados através de métodos conhecidos na área (Rizo & Glerasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), aqui incorporado como referência); por exemplo, através de uma adição interna de resíduos de cisteína capaz de formar pontes de dissulfureto que ciclizam o péptido.

[0072] Como aqui empregue, o termo "anticorpo" refere-se a um polipéptido ou grupo de polipéptidos que é composto por, pelo menos, um domínio de ligação formado a partir da dobragem de cadeias polipeptídicas com espaços de ligação tridimensional com formas de superfície interna e distribuições de carga complementares às características de um determinante antigénico de um antigénio. Um anticorpo tem normalmente uma forma tetramérica que compreende dois pares idênticos de cadeias de polipéptidos, cada par com uma cadeia "leve" e uma cadeia "pesada". As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam um local de ligação do anticorpo.

[0073] Os "fragmentos de ligação" de um anticorpo são produzidos através de técnicas de DNA recombinante ou da clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv e anticorpos de cadeia única. Um anticorpo que não seja "bi-especifico" ou "bi-funcional" tem todos os seus locais de ligação idênticos. Um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um receptor a um contra-receptor quando um excesso de anticorpos reduz a quantidade de receptor ligado ao contra-receptor em, pelo menos 20%, 40%, 60% ou 80% ou, frequentemente, mais de cerca de 85% (conforme medido num ensaio de ligação competitiva in vitro).

[0074] Como aqui empregue, uma "proteína de ligaçao" ou uma "proteína de ligação específica" são proteínas que se ligam de 39 forma específica a uma molécula-alvo. Os anticorpos e os fragmentos de ligação de anticorpos são proteínas de ligação.

[0075] O termo "epítopo" inclui qualquer proteína capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Os epítopos ou determinantes antigénicos consistem, habitualmente em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente activa, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e podem, mas não sempre, ter características estruturais tridimensionais, assim como características de carga específicas. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando a constante de dissociação é ^1 μΜ, preferencialmente, ^ 100 nM e, com maior preferência, ^ 10 nM.

[0076] O termo "agente" é aqui empregue para designar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto feito a partir de materiais biológicos.

[0077] No que concerne a um IGF-I/II, "activo" ou "actividade" referem-se a uma secção do polipéptido do IGF-I/II que apresenta uma actividade bio ou imunológica de um polipéptido nativo do IGF-I/II. "Biológico", quando aqui empregue, refere-se a uma função biológica que resulta da actividade do polipéptido nativo do IGF-I/II. Uma actividade biológica preferida do IGF-I/II inclui, por exemplo, a proliferação celular por ele induzida.

[0078] 0 termo "mamífero", quando aqui empregue, refere-se a qualquer animal que seja considerado um mamífero. O mamífero é, preferencialmente, humano. 40 [0079] A digestão de anticorpos com a enzima papaina tem como resultado dois fragmentos de ligação a antigénios idênticos, também conhecidos como fragmentos "Fab" e um fragmento "Fc" sem actividade de ligação a antigénios que detém, contudo, a capacidade de os cristalizar. A digestão de anticorpos com a enzima pepsina resulta no fragmento F(ab')2, no qual os dois braços da molécula do anticorpo permanecem ligados e compreende dois locais de ligação ao antigénio. 0 fragmento F(ab')2 tem a capacidade de se vincular de forma cruzada ao antigénio.

[0080] "Fv", quando aqui empregue, refere-se ao fragmento mínimo de um anticorpo que conserva os locais de reconhecimento e ligação ao antigénio.

[0081] "Fab", quando aqui empregue, refere-se a um fragmento de um anticorpo que contém o domínio constante da cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

[0082] 0 termo "mAb" refere-se ao anticorpo monoclonal.

[0083] "Lipossoma", quando aqui empregue, refere-se a uma pequena vesícula que pode ter utilidade no fornecimento de fármacos, que podem incluir o polipéptido IGF-I/II da invenção ou anticorpos contra o mesmo, a um mamífero.

[0084] "Marcar" ou "marcado", como aqui empregues, referem-se à adição de uma fracção detectável a um polipéptido, por exemplo, um radiomarcador, um marcador fluorescente, enzimático, quimioluminescente ou um grupo biotinilo. Os radioisótopos ou radionucleót idos podem incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 311In, 125I, 131I, os marcadores fluorescentes podem incluir rodamina, lantanídeos fosforosos ou FITC e os 41 marcadores enzimáticos podem incluir peroxidase de rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase e fosfatase alcalina.

[0085] O termo "agente farmacêutico ou medicamento", como aqui empregue, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado, quando administrado apropriadamente a um doente. Outros termos químicos aqui empregues são utilizados de acordo com o uso convencional na área, conforme exemplificado pelo The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker. S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985) ) , (aqui incorporado como referência) .

[0086] Como aqui empregue, "substancialmente puro" indica que uma determinada espécie é a predominante (ou seja, numa base molar, é mais abundante na composição que qualquer outra espécie individual) e uma fracção substancialmente purificada é, preferencialmente, uma composição em que a espécie em questão contém, pelo menos, 50% (numa base molar) de todas as espécies presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80% de todas as espécies macrocelulares presentes, preferencialmente, mais de cerca de 85%, 90%, 95% ou 99%. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80% de todas as espécies macrocelulares presentes, preferencialmente, mais de cerca de 85%, 90%, 95% ou 99%.

[0087] 0 termo "doente" inclui sujeitos humanos e veterinários. 42

Anticorpos humanos e humanização de anticorpos [0088] Os anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados a anticorpos que possuem regiões constantes e/ou variáveis murinas ou de rato. A presença dessas proteínas de derivação murina ou de rato pode levar a uma rápida depuração dos anticorpos ou à produção de uma resposta imunitária do doente contra o anticorpo. Para evitar a utilização de anticorpos de derivação murina ou de rato, podem ser gerados anticorpos totalmente humanos através da introdução de loci de anticorpos humanos funcionais num roedor ou outro mamífero ou animal, para que este produza anticorpos totalmente humanos.

[0089] Um dos métodos de produção de anticorpos totalmente humanos consiste na utilização de estirpes de ratinhos XenoMouse® concebidas para conter fragmentos germinativos configurados do locus das cadeias humanas pesada e κ leve, com uma dimensão inferior a 1000 kb. Ver, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) e Green & Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). As estirpes XenoMouse® são disponibilizadas pela Abgenix. Inc. (Fremont, CA).

[0090] A produção de estirpes de ratinhos XenoMouse® é adicionalmente discutida e delineada nos Pedidos Provisórios de Patentes U.S. com os números de série 07/466,008, apresentada a 12 de Janeiro de 1990; 07/610,515, apresentada a 8 de Novembro de 1990; 07/919, 297, apresentada a 24 de Julho de 1992; 07/922,649, apresentada a 30 de Julho de 1992; 08/031,801, apresentada a 15 de Março de 1993; 08/112,848, apresentada a 27 de Agosto de 1993; 08/234,145, apresentada a 28 de Abril de 1994; 08/376,279, apresentada a 20 de Janeiro de 1995; 08/430,938, apresentada a 27 de Abril de 1995; 08/464,584, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/464,582, 43 apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/463,191, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/462,837, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/486, 853, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/486,857, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/486,859, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/462,513, apresentada a 5 de Junho de 1995; 08/724,752, apresentada a 2 de Outubro de 1996; 08/759,620, apresentada a 3 de Dezembro de 1996;

Publicação U.S. 2003/0093820, apresentada a 30 de Novembro de 2001, Patentes U.S. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181 e 5, 939, 598 e nas Patentes Japonesas 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 e 3 068 507 B2. Ver, também, as Patentes Europeias EP 0 463 151 Bl, concessão de publicação de 12 de Junho de 1996 e os Pedidos de Patente Internacional N.° WO 94/02602, publicado a 3 de Fevereiro de 1994, WO 96/34096, publicado a 31 de Outubro de 1996, WO 98/24893, publicado a 11 de Junho de 1998, WO 00/76310, publicado a 21 de Dezembro de 2000. As divulgações de cada uma das patentes, aplicações e referências supracitadas são aqui incorporadas, na integra, como referência.

[0091] Numa abordagem alternativa, outros, incluindo GenPharm International, Inc., utilizaram uma abordagem "minilocus". Nesta abordagem, é imitado um locus exógeno de Ig através da inclusão de secções (genes individuais) do locus da IG. Portanto, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH, uma região constante mu e, habitualmente, uma segunda região constante (de preferência uma região constante gama) formam um constructo para inserção num animal. Esta abordagem é descrita nas Patentes U.S. 5,545,807 de Surani et al. e 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; 5,814,318; 5,877,397; 5,874,299 e 6,255,458 de Lonberg & Kay, 5,591,669 e 6,023,010 de 44

Krimpenfort & Berns, 5,612,205; 5,721,367 e 5,789,215 de Berns et al., 5, 643,763 de Choi & Dunn e nos Pedidos Provisórios de Patente U.S. da GenPharm International N.° 07/574,748 apresentado a 29 de Agosto de 1990; 07/575,962, apresentado a 31 de Agosto de 1990; 07/810,279, apresentado a 17 de Dezembro de 1991; 07/853,408, apresentado a 18 de Março de 1992; 07/904,068, apresentado a 23 de Junho de 1992; 07/990,860, apresentado a 16 de Dezembro de 1992; 08/053,131, apresentado a 26 de Abril de 1993; 08/096,762, apresentado a 22 de Julho de 1993; 08/155,301, apresentado a 18 de Novembro de 1993; 08/161,739, apresentado a 3 de Dezembro de 1993; 08/165,699, apresentado a 10 de Dezembro de 1993 e 08/209,741, apresentado a 9 de Março de 1994, cujas divulgações se encontram aqui

incorporadas como referência. Ver, também, a Patente Europeia N.° 546 073 Bl, os Pedidos de Patente Internacional N.° WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 e WO 98/24884 e a Patentes U.S. N.° 5,981,175, cujas divulgações são aqui incorporadas, na integra, como referência. Ver, ainda Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), Tuaillon et al. (1995) e Fishwild et al. (1996), cujas divulgações se encontram aqui incorporadas, na íntegra, como referência.

[0092] Kirin demonstrou também que a produção de anticorpos humanos a partir de ratos em que tenham sido introduzidas, através de fusão de microcélulas, secções cromossómicas de grandes dimensões ou cromossomas inteiros. Ver os Pedidos de

Patente Europeia N.° 773 288 e 843 961, cujas divulgações estão aqui incorporadas como referência. Foram, adicionalmente, gerados ratinhos KM™, que são o resultado do 45 cruzamento dos ratinhos Tc da Kirin com os ratos minilocus da Medarex (Humab). Estes ratinhos possuem o transcromossoma (cromossoma translocado) da IgH humana do ratinho da Kirin e a cadeia transgénica κ do ratinho da Grenpharm (Ishida et al., Cloning Stern Cells, (2002) 4:91-102).

[0093] Os anticorpos humanos podem também derivar de métodos in vitro. Os exemplos adequados incluem, sem limitação, as técnicas de Phage display (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antigo Proliferon) (CAT), Ribosome display, Yeast display e similares.

Preparação de Anticorpos [0094] Os anticorpos, tal como aqui descritos, foram preparados através da utilização de tecnologia XenoMouse®, de acordo com a seguinte explicitação. Tais ratos são, então, capazes de produzir moléculas e anticorpos de imunoglobulina humana, sendo deficitários na produção de moléculas e anticorpos de imunoglobulina murina. As tecnologias utilizadas para tal são divulgadas nas patentes, aplicações e referências apresentadas na secção antecedente. Em particular, contudo, é apresentada uma modalidade preferida para a produção de ratinhos e seus anticorpos no Pedido de Patente U.S. com o N.° de série 08/759,620, apresentada a 3 de Dezembro de 1996 e nos Pedidos de Patente Internacional WO 98/24893, publicado a 11 de Junho de 1998 e WO 00/76310, publicado a 21 de Dezembro de 2000, cujas divulgações se encontram aqui incorporadas como referência. Ver, também, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) , cuja divulgação é aqui incorporada como referência. 46 [0095] Através do uso de tal tecnologia, foram produzidos anticorpos monoclonais totalmente humanos para vários antigénios. Essencialmente, as linhas de ratinhos XenoMouse® são imunizadas com um antigénio de interesse (por exemplo, IGF—I/II), as células linfáticas (tais como células B) são recuperadas a partir dos ratinhos hiper-imunizados, sendo os linfócitos recuperados fundidos com uma linha celular mielóide para preparar linhas celulares imortalizadas de hibridomas. Essas linhas celulares de hibridomas são rastreadas e seleccionadas para identificação das que produzem anticorpos específicos para o antigénio de interesse. São aqui fornecidos métodos para a produção de múltiplas linhas celulares de hibridomas que produzem anticorpos específicos para o IGF-I/11 · Também é aqui fornecida a caracterização dos anticorpos produzidos por essas linhas celulares, incluindo análises de sequências de nucleótidos e aminoácidos das cadeias leve e pesada de tais anticorpos.

[0096] Alternativamente, em vez de serem fundidas com células do mieloma para gerar hibridomas, as células B podem ser directamente ensaiadas, por exemplo, pode permitir-se que as células CD19+ B isoladas a partir de ratinhos XenoMouse® hiper-imunes proliferem e se diferenciem em células plasmáticas secretoras de anticorpos. Os anticorpos de sobrenadantes celulares são então rastreados por ELISA quanto à reactividade contra o imunogénio IGF-I/II. Os sobrenadantes podem também ser monitorizados para avaliar a imunoreactividade contra os fragmentos IGF-I/II, para então, mapear os diferentes anticorpos para se ligarem a domínios de interesse funcional em IGF-I/II. Os anticorpos podem também ser monitorizados contra outras quimiocinas humanas e contra a ratazana, ratinho e primatas não-humanos, tais como os macacos 47 cinomolgos, ortólogos do IGF-I/II, correspondendo o último à monitorização da reactividade cruzada das espécies. As células B de poços que contêm anticorpos de interesse podem ser imortalizadas através de vários métodos, incluindo a fusão, para produzir hibridomas, seja através de poços individuais ou agrupados, ou ainda por infecção com BEV ou transfecção através de genes imortalizantes conhecidos, sendo, então, plaqueadas num meio adequado. Em alternativa, as células plasmáticas simples secretoras de anticorpos com as especificidades desejadas são, então, isoladas através de um ensaio de placas hemolítico especifico para o IGF-I/II (Babcook et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-48 (1996)). As células marcadas para lise são preferivelmente hemácias de carneiro revestidas com o antigénio IGF-I/II.

[0097] Na presença de uma cultura de células B que contém células plasmáticas que segregam a imunoglobulina e o complemento de interesse, a formação de uma placa é indicativa da lise especifica mediada pelo IGF-I/II das hemácias de carneiro que rodeiam a célula plasmática de interesse. A célula plasmática simples especifica para o antigénio presente no centro da placa pode ser isolada, sendo a informação genética que codifica a especificidade do anticorpo isolada a partir da célula plasmática simples, 0 DNA que codifica as regiões variáveis de cadeias leve e pesada do anticorpo pode ser clonado através da utilização de transcrição reversa, seguida por PCR (RT-PCR). Tal DNA clonado pode, então, ser inserido num vector de expressão adequado, preferencialmente, uma cassete ou vector, mais preferencialmente, um vector pcDNA que contenha os domínios constantes das cadeias leves e pesadas da imunoglobulina. 0 vector gerado pode, então, ser transformado em células hospedeiras, por exemplo células 48 ΗΕΚ293 ou células CHO e cultivado com um meio nutriente convencional modificado, conforme adequado, para introdução da transcrição, pela selecção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

[0098] No geral, os anticorpos produzidos através de hibridomas fundidos eram cadeias pesadas de IgG2 humana com cadeias leves κ ou λ totalmente humanas. Os anticorpos aqui descritos possuem cadeias pesadas de IgG4 humana, assim como cadeias pesadas de IgG2. Os anticorpos podem também ser de outros isótopos humanos, incluindo a IgGl. Os anticorpos possuem elevadas afinidades, tipicamente, apresentando uma KD de cerca de 1CT6 até cerca de 1CT12 M, ou menos, quando avaliada através de técnicas de fase sólida ou liquida. Os anticorpos que possuem uma KD de, pelo menos, 1CT11 M são os preferidos para inibir a actividade do IGF-I/II.

[0099] Conforme será apreciado, os anticorpos anti-IGF-I/II podem ser expressos em linhas celulares que não as correspondentes aos hibridomas. As sequências que codificam determinados anticorpos podem ser aplicadas à transformação da célula hospedeira mamífera adequada. A transformação pode concretizar-se através de qualquer método conhecido para a introdução de polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo, a compactação do polinucleótido num vírus (ou vector virai) e a transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vector) ou através de procedimentos de transfecção conhecidos na área, tal como exemplificado pelas Patentes U.S. N.° 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 e 4,959,455 (aqui incorporadas como referência). 0 procedimento de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos de introdução de polinucleótidos 49 heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidas na área e incluem a transfecção mediada pelo dextrano, precipitação de fosfato cálcico, transfecção mediada pelo polibreno, fusão protoplástica, electroporação, encapsulamento de polinucleótido(s) em lipossomas e micro-injecção directa de DNA em núcleos.

[0100] As linhas celulares mamíferas disponíveis como hospedeiras para expressão são bem conhecidas na área e incluem muitas linhas celulares imortalizadas da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, sem limitação, células ováricas de hamster Chinês (CHO), células HeLa, células renais de hamster bebé (BHK), células renais de macaco (COS), células humanas do hepatocarcinoma (por exemplo, Hep G2), células renais epiteliais humanas 293 e várias outras linhas celulares. As linhas celulares com uma preferencia particular são seleccionadas a partir da determinação daquelas que apresentam elevados níveis de expressão e produzem anticorpos com propriedades de ligação constitutivas ao IGF-I/II.

[0101] Os anticorpos anti-IGF-I/II são úteis na detecção do IGF-I/II em amostras de doentes e, como tal, têm utilidade no diagnóstico de estados patológicos, tal como aqui descrito. Além disso, com base na sua capacidade de neutralizar significativamente a actividade do IGF-I/II (tal como em seguida demonstrado através dos Exemplos), os anticorpos anti-IGF-I/II têm efeitos terapêuticos no tratamento de sintomas e condições associadas à expressão do IGF-I/II. Em modalidades especificas, as modalidades e métodos aqui presentes estão relacionados com o tratamento de sintomas associados à proliferação celular induzida pelo IGF-I/II. As modalidades adicionais envolvem a utilização dos anticorpos e modalidades 50 aqui descritas para o tratamento de doenças neoplásicas, tais como o melanoma, cancro pulmonar de células não-pequenas, glioma, hepatocarcinoma (figado), tumor da tiróide, cancro gástrico (estômago), cancro da próstata, cancro da mama, cancro ovárico, cancro da bexiga, cancro do pulmão, glioblastoma, cancro endométrico, cancro renal, cancro do cólon, tumores ginecológicos, cancro da cabeça e pescoço, cancro esofágico e cancro pancreático. Outras condições patológicas não neoplásicas podem incluir acromegalia e gigantismo, psoriase, osteoporose, aterosclerose, reestenose do músculo vascular liso, assim como a diabetes.

Administração terapêutica e formulações [0102] As modalidades da invenção incluem formulações farmacêuticas estéreis de anticorpos anti-IGF-I/II com utilidade enquanto tratamento de doenças. Tais formulações inibiram a ligação do IGF-I/II ao seu receptor IGF-IR tratando, desse modo, condições patológicas em que, por exemplo, o IGF-I/II sérico ou tecidual é anormalmente elevado. Os anticorpos anti-IGF-I/II possuem, preferencialmente, uma afinidade adequada à potencial neutralização do IGF-I/II e, preferencialmente, uma duração de acção adequada à administração não frequente em humanos. Uma duração prolongada da acção permitirá a aplicação de esquemas de doseamento menos frequente e mais conveniente, pelas vias parentéricas permutáveis, tal como a injecção subcutânea ou intramuscular.

[0103] As formulações estéreis podem ser preparadas, por exemplo, pela filtração através membranas estéreis, antes ou após a reconstituição do anticorpo. 0 anticorpo será, 51 habitualmente, armazenado sob a forma liofilizada ou em solução. As composições terapêuticas de anticorpos são colocadas, geralmente, num recipiente com um orificio de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com um adaptador que permita a recuperação da formulação, tal como uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

[0104] A via de administração dos anticorpos é coerente com os métodos conhecidos, por exemplo, injecção ou infusão através das vias intravenosa, intraperitonial, intracerebral, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intratraqueal, pelas vias inalatória ou intralesional ou, ainda, através de sistemas de libertação prolongada, como referido em seguida, O anticorpo é, preferivelmente, administrado por infusão continua ou injecção em bólus.

[0105] A quantidade eficaz de anticorpos a ser terapeuticamente empregue irá depender, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, via de administração e estado clinico do doente. Portanto, é preferível que o clínico titule a dose e modifique a via de administração, conforme necessário, para obter um efeito terapêutico óptimo. Normalmente, o clínico administrará anticorpos até ser atingida uma dosagem com o efeito pretendido. 0 progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por ensaios convencionais ou dos ensaios aqui descritos.

[0106] Os anticorpos, de acordo com a presente descrição, podem ser preparados numa mistura com um transportador farmacologicamente aceitável. Esta composição terapêutica pode ser administrada pelas vias intravenosa, nasal ou pulmonar, preferencialmente, na forma de um líquido ou aerossol 52 (liofilizado). A composição pode também ser administrada pela via parentérica ou subcutânea, se desejado. Quando administrada de forma sistémica, a composição terapêutica deve encontrar-se estéril, livre de pirogénios e numa solução parentericamente aceitável, tendo em conta o pH, a isotonicidade e a estabilidade. Estas condições são conhecidas pelos especialistas na área. Em suma, as formas farmacêuticas dos compostos aqui descritos são preparadas para armazenamento ou administração através da mistura do composto, no grau de pureza pretendido, com transportadores, excipientes e estabilizadores fisiologicamente aceitáveis. Estes materiais não são tóxicos para os doentes nas doses e concentrações empregues e incluem tampões como o TRIS HC1, fosfatos, citratos, acetatos e outros sais orgânicos; antioxidantes como o ácido ascórbico; péptidos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos), proteínas como a albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como a polivinilpirolidona; aminoácidos como a glicina, ácido ácido glutâmico, aspártico ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo a celulose ou os seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como o EDTA; alcoóis de açúcar como o manitol ou sorbitol; contra-iões como o sódio e/ou surfactantes não-iónicos como o TWEEN, PLURONICS ou o polietilenoglicol.

[0107] As composições injectáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com as práticas farmacêuticas convencionais, tal como descrito por Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed. Lippincott Williams & Wilkens Publishers (2003)), por exemplo, pode ser desejada a dissolução ou suspensão do composto activo num veículo como a 53 água ou óleo vegetal de ocorrência natural, como o óleo de sésamo, amendoim ou de semente de algodão, ou um veículo gordo sintético como o oleato de etilo, ou similar. Podem ser incorporados tampões, conservantes, antioxidantes e similares de acordo com as práticas farmacêutica aceites.

[0108] Os exemplos adeguados de preparações de libertação prolongada incluem as matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contêm o polipéptido, encontrando-se tais matrizes na forma de corpos moldados, películas ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) , de acordo com a descrição de Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 e Langer. Chem. Tech., (1982) 12:98-105, ou álcool polivinílico), polilactidas (Patente U.S. N.° 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato gama (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556); acetato etilvinílico não degradável (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico como o LUPRON Depot™ (microsferas injectáveis compostas por copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico (EP 133, 988).

[0109] Enquanto os polímeros como o acetato etilvinílico e ácido láctico/ácido glicólico activam a libertação de moléculas durante períodos superiores a 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos mais reduzidos, Quando encapsuladas, as proteínas permanecem no corpo durante muito tempo; podem desnaturar-se ou agregar-se em resultado da exposição à humidade a 37°C, resultando numa perda de actividade biológica e possíveis mudanças a nível da 54 imunogenicidade. Podem ser traçadas estratégias racionais para a estabilização de proteínas, de acordo com o mecanismo envolvido, por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação corresponde ao de ligação intermolecular S-S, por troca de dissulfuretos, a estabilização pode ser alcançada através da modificação de resíduos de sulfidrilo, liofilização de soluções acídicas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições matriciais de polímeros específicos.

[0110] As composições de libertação prolongada também incluem preparações de cristais de anticorpos suspensos em formulações adequadas, capazes de os manter em suspensão. Quando injectadas pela via subcutânea ou intraperitonial, estas preparações podem produzir um efeito de libertação prolongada. Outras composições podem também incluir anticorpos aprisionados por lipossomas. Os lipossomas que contêm tais anticorpos são preparados de acordo com métodos conhecidos, per se: Patente U.S. N.° DE 3,218,121; Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1985) 82:3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Patentes U.S. 4,485,045 e 4,544,545; e EP 102,324.

[0111] A dosagem das formulações de anticorpos apropriada para um determinado doente será determinada pelo médico assistente, tendo em consideração vários factores conhecidos como modificadores da acção farmacológica que incluem a severidade e tipo de doença, peso corporal, sexo, dieta, período e via de administração. outras medicações e factores com relevância 55 clínica. As dosagens com eficácia terapêutica podem ser determinadas através de métodos in vitro ou in vivo.

[0112] A quantidade eficaz dos anticorpos aqui descritos a ser terapeuticamente empregue dependerá, por exemplo, dos objectivos terapêuticos, via de administração e estado do doente. Portanto, é preferível que o terapeuta titule a dosagem e modifique a sua via de administração de acordo com os requerimentos necessários à obtenção do efeito terapêutico desejado. Uma dose diária típica poderá variar entre cerca de 0,001mg/kg, lOOmg/kg ou mais, dependendo dos factores supramencionados. 0 clínico irá, normalmente, administrar o anticorpo terapêutico até que seja atingida uma dose que alcance o efeito pretendido. 0 progresso desta terapêutica é facilmente monitorizado por ensaios convencionais ou através dos ensaios aqui descritos.

[0113] É de referir que a administração de agentes terapêuticos em conformidade com as composições e métodos aqui descritos será efectuada com o auxílio de transportadores, excipientes e outros agentes adequados, que são incorporados nas formulações para melhorar a transferência, entrega do agente, tolerância ou similares. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lípidos, vesículas (catiónicas e aniónicas) que contenham lípidos (tais como o Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorção anídrica, emulsões de óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões de carbowax (glicóis de polietileno de variados pesos moleculares), géis semi-sólidos e misturas semi-sólidas que contêm carbowax. Qualquer uma das misturas anteriores pode ser apropriada em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, desde que o ingrediente activo na formulação não 56 seja inactivado pela formulação e a formulação seja fisiologicamente tolerável e compatível com a via de administração. Ver, também, Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance," Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts," J Pharm Sei. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sei Technol, 52:238-311 (1998) e respectivas citações para obtenção de informações adicionais relativamente a formulações, excipientes e transportadores bem conhecidos dos químicos farmacêuticos.

Concepção e produção de outras terapêuticas [0114] De acordo com a presente invenção e com base na actividade dos anticorpos aqui produzidos e caracterizados em função do IGF-I/II, a concepção de outras modalidades terapêuticas será facilitada e divulgada aos especialistas na área. Tais modalidades incluem, sem limitação, terapêuticas avançadas de anticorpos, tais como os anticorpos biespecíficos, imunotoxinas, anticorpos terapêuticos radiomarcados e de domínio V único, agentes de ligação similares a anticorpos com base em outros suportes que não o da região V, terapêutica de produção peptídica, terapias genéticas, particularmente de intracorpos, terapêuticas anti-senso e de pequenas moléculas. 57 [0115] Em relação à produção de outras terapêuticas avançadas de anticorpos, onde a fixação do complemento é um atributo desejável, pode ser possível contornar a dependência no complemento para a eliminação celular através da utilização de biespecíficos, imunotoxinas ou radiomarcadores, por exemplo, [0116] Por exemplo, podem ser gerados anticorpos biespecíficos que contém (i) dois anticorpos conjugados, sendo um deles específico para o IGF-I/II e o outro para uma segunda molécula, (ii) um anticorpo singular que apresenta uma cadeia específica para o IGF-I/II e uma segunda cadeia específica para uma segunda molécula ou (iii) um anticorpo de cadeia única cuja especificidade se direcciona ao IGF-I/II e à outra molécula. Tais anticorpos biespecíficos podem ser gerados através de técnicas bem conhecidas; por exemplo, em conexão com (i) e (ii), ver, por exemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) e Wright & Harris. supra., e em conexão com (iii), ver, por exemplo, Traunecker et al. Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992). A segunda especificidade pode, em cada um dos casos, ser definida de acordo com o desejado, por exemplo, a segunda especificidade pode ser configurada para os receptores de activação da cadeia pesada, incluindo, sem limitação, CD16 ou CD64 (ver, por exemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) ou CD89 (ver, por exemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)) .

[0117] Os anticorpos podem ser modificados para actuar como imunitoxinas através de técnicas bem conhecidas na área. Ver, por exemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver, também, a Patente U.S. 5,194,594. Em relação à preparação de anticorpos radiomarcados, tais anticorpos modificados podem também ser facilmente preparados através de técnicas bem 58 conhecidas na área. Ver, por exemplo, Junghans et al., em Câncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver, também, as Patentes U.S. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 e 5,697,902. Cada uma das imunotoxinas e moléculas radiomarcadas irá, potencialmente, eliminar as células que expressam a subunidade enzimática multimérica do domínio de oligomerização. Em algumas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficiente do anticorpo associada a um transportador ou diluente farmacologicamente aceitável.

[0118] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-IGF-I/II é ligado a um agente (por exemplo, radioisótopo, composição farmacêutica ou toxina). Tais anticorpos podem, preferencialmente, ser utilizados para o tratamento de doenças, tais como as associadas a células que expressam IGF-I/II ou sobrexpressam IGF-VII, por exemplo, contempla-se que a propriedade farmacêutica do fármaco seja seleccionada entre um grupo composto pelos agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabólitos, antiangiogénicos, apoptóticos, COX-2, antibióticos e combinações dos mesmos. 0 fármaco pode ser seleccionado de entre um grupo composto por mostardas de nitrogénio, derivados da etilenimina, sulfonatos de alquilo, nitrosureias, triazenos, análogos do ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inibidores da COX-2, análogos da pirimidina, análogos da purina, antimetabólitos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, complexos de coordenação platínicos, alcaloides da vinca, ureias substituídas, derivados da metilhidrazina, supressores adrenocorticais, antagonistas, endostatinas, taxóides, camptotecinas, 59 oxaliplatinas, doxorrubicinas e respectivos análogos e por uma combinação dos mesmos.

[0119] Os exemplos de toxinas incluem ainda a gelonina, pseudomonas exotoxina (PE), PE40, PE38, toxina diftérica, ricina, abrina, toxina a, saporina, ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina estafilocóccica A, proteína anti-viral da fitolaca, assim como os seus derivados, combinações e modificações.

[0120] Os exemplos de radioisótopos incluem emissores gama, emissores de positrões e emissores de raios-X que possam ser utilizados na localização e/ou terapia e emissores beta e alfa que possam ser terapeuticamente utilizados. Os radioisótopos previamente descritos são úteis no diagnóstico, prognóstico e estadiamento. Os exemplos não limitativos de agentes anti-neoplásicos ou anti-leucémicos incluem antraciclinas como a doxorrubicina (adriamicina), daunorrubicina (daunomicina), idarrubicina, detorrubicina, carminomicina, epirrubicina, esorrubicina e morfolino, assim como derivados substituídos, combinações e modificações dos mesmos. Os agentes farmacêuticos exemplares incluem cisplatina, taxol, caliqueamicina, vincristina, citarabina (Ara-C), ciclofosfamida, prednisona, daunorrubicina, idarrubicina, fludarabina, clorambucil, interferão alfa, hidroxiureia, temozolomida, talidomida e bleomicina, assim como derivados, combinações e modificações dos mesmos, preferencialmente, o agente anti-neoplásico ou anti-leucémico é doxorrubicina, morfolinodoxorrubicina ou morfolinodaunorrubicina.

[0121] Como será entendido por um especialista na área, nas modalidades precedentes, apesar de os valores de afinidade serem de grande relevância, existem outros factores que podem 60 ser tão ou mais importantes, dependendo da função do anticorpo, por exemplo, para uma imunotoxina (toxina associada a um anticorpo) , a acção de ligação do anticorpo ao alvo pode ser útil, contudo, em algumas modalidades, é a sua internalização na célula que corresponde ao resultado desejado. Como tal, os anticorpos com uma percentagem de internalização elevadas podem ser desejáveis nestas circunstâncias. Como tal, numa modalidade, são contemplados os anticorpos com uma elevada eficácia a nivel da internalização. Uma eficácia de internalização elevada pode ser calculada através da percentagem de anticorpos internalizados e encontrar-se entre um valor reduzido e 100%, por exemplo, nas diferentes modalidades, uma eficácia de 0,1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99 e 99-100% pode ser elevada. Tal como será reconhecido por um especialista na área, a eficácia desejável pode variar entre as diferentes modalidades de acordo com, por exemplo, a quantidade de anticorpos que pode ser administrada numa área, os efeitos secundários do complexo anticorpo-agente, o tipo (por exemplo, tipo de cancro) e a severidade do problema a ser tratado.

[0122] Noutras modalidades, os anticorpos aqui divulgados fornecem um kit de ensaio para a detecção da expressão de IGF-I/II em tecidos ou células de origem mamífera com o intuito de identificar uma doença ou perturbação que possa estar associada à sua alteração. O kit é composto por um anticorpo que se liga ao IGF-I/II e por meios de indicação da reacção entre o anticorpo e o antigénio, caso presente.

[0123] Em algumas modalidades, é fornecido um artigo de produção composto por um recipiente com uma composição que 61 contém um anticorpo anti-IGF-I/II e um folheto informativo ou rótulo com indicação de que a composição pode ser usada no tratamento de doenças mediadas pela expressão de IGF-I/II, 0 anticorpo anti-IGF-I/Il é, preferencialmente, administrado a um mamífero e, ainda com maior preferência, a um humano.

Combinações [0124] A terapêutica de anticorpos anti-IGF-I/II aqui definida pode ser aplicada enquanto terapêutica isolada ou envolver, para além do composto da invenção, cirurgia convencional, radioterapia ou quimioterapia. Tal quimioterapia pode incluir uma ou mais das seguintes categorias de agentes anti-tumorais: (i) fármacos antiproliferativos/antineoplásicos e combinações dos mesmos, tal como utilizados na área da oncologia humana, tais como agentes alquilantes (por exemplo, cis-platina, carboplatina, ciclofosfamida, mostarda de nitrogénio, melfalano, clorambucil, bussulfano e nitrosureias); antimetabólitos (por exemplo, antifolatos como as fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracil e tegafur, raltitrexed, metotrexato, citosina arabinosídeo e hidroxiureia); antibióticos anti-tumorais (por exemplo, antraciclinas, tais como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina e mitramicina); agentes antimitóticos (por exemplo, alcaloides da vinca como a vincristina, vimblastina, vindesina e a vinorelbina e taxóides como o taxol e o taxótero) e inibidores da topoisomerase (por exemplo, epipodofilotoxinas tais como 62 etoposido e teniposido, amsacrina, topotecan e camptotecina); (ii) agentes citostáticos tais como anti-estrogénios (por exemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno e iodoxifeno)reguladores da diminuição de receptores de estrogénio (por exemplo, Fulvestrant), anti-androgénios (por exemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida e acetato de ciproterona), antagonistas LHRH ou agonistas LHRH (por exemplo, goserelina, buserelina e leuprorrelina), progestogénios (por exemplo, acetato de megestrol), inibidores da aromatase (por exemplo, anastrozol, letrozol, vorozole e exemestano) e inibidores da 5-alfa-reductase (finasterida); (iii) agentes gue inibem a invasão de células cancerosas (por exemplo, inibidores da metaloproteinase como o marimastat e inibidores funcionais da activação do receptor do plasminogénio do tipo uroquinase); (iv) inibidores funcionais do factor de crescimento, por exemplo, aqueles que incluem anticorpos do do factor de crescimento, anticorpos do receptor do factor de crescimento (por exemplo, os anticorpos anti-erbb2 trastuzumab [Herceptin™] e anti-erbbl cetuximab [C225]), inibidores da farnesil transferase, inibidores MEK, inibidores da tirosina cinase e inibidores da serina/treonina cinase, por exemplo, os inibidores da família de factores de crescimento epidérmico (por exemplo, inibidores da tirosina cinase da família EGFR como a N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3- morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N- (3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina 63 (erlotinib, OSI-774) e a 6-acrilamida-N (3-cloro-4-fluorofenil) -7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por exemplo, inibidores da família de factores de crescimento de origem plaquetária e, por exemplo, inibidores da família de factores de crescimento de hepatócitos. (v) agentes anti-angiogénicos como os que inibem os efeitos do factor de crescimento endotelial vascular (por exemplo, o anticorpo do factor de crescimento celular endotelial anti-vascular bevacizumab [Avastin™], compostos como os descritos nos Pedidos de Patente Internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 e WO 98/13354) e compostos que funcionam através de outros mecanismos (por exemplo, linomida, inibidores da função ανβ3 da integrina, angiostatina e inibidores da acção de angiopoietinas, por exemplo, angiopoietina 1 e 2); (vi) agentes de danificação vascular como a combretastatina A4 e os compostos divulgados nos Pedidos de Patente Internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 e WO 02/08213; (vii) terapias anti-senso, por exemplo, as direccionadas aos alvos acima enumerados, tais como ISIS 2503, um anti-ras anti-senso); (viii) abordagens terapêuticas genéticas incluindo, por exemplo, abordagens para a substituição de genes aberrantes como o p53, BRCA1 ou BRCA2 aberrantes, abordagens GDEPT (terapêutica pró-farmacológica enzimática direccionada ao gene) como as que utilizam citosina deaminase, timidina quinase ou uma enzima bacteriana nitrorreductase e 64 abordagens para aumentar a tolerância do doente à quimioterapia ou radioterapia, como uma terapia genética de resistência a múltiplos fármacos; (ix) abordagens imunoterapêuticas incluindo, por exemplo, as abordagens ex vivo e in vivo para aumentar a imunogenicidade das células tumorais do doente como a transfecção de citocinas como a interleucina 2, interleucina 4 ou o factor de estimulação de colónias de granulócitos macrófagos, abordagens para diminuir a energia das células T, abordagens que aplicam células imunitárias como as dendriticas transfectadas com citocina, abordagens que aplicam linhas celulares tumorais transfectadas com citocina e abordagens que aplicam anticorpos anti-idiotípicos; (x) inibidores do ciclo celular, incluindo, por exemplo, inibidores da CDK (por exemplo, flavopiridol) e outros pontos de controlo do ciclo celular (por exemplo, o ponto de controlo de cinase); os inibidores da cinase aurora e outras cinases envolvidas no controlo da mitose e citocinese (por exemplo, cinesinas mitóticas) e inibidores da histona deacetilase; (xi) antagonistas da endotelina, incluindo os antagonistas da endotelina A, antagonistas da endotelina B e antagonistas das endotelinas A e B; por exemplo ZD4054 e ZD1611 (WO 96 40681), atrasentan e YM598; e (xii) abordagens bioterapêuticas como a utilização de péptidos e proteínas (tais como anticorpos ou construções solúveis do domínio externo do receptor) que retém os ligantes do receptor, bloqueiam a vinculação dos ligantes 65 ao receptor ou reduzem a sua sinalização (e.g., devido ao reforço da degradação do receptor ou a níveis de expressão reduzidos).

[0125] Tal tratamento conjunto pode ser concretizado através do doseamento simultâneo, sequencial ou isolado dos componentes individuais do tratamento. Tais produtos de combinação empregam os compostos desta invenção, dentro do intervalo posológico anteriormente descrito e outros agentes farmacologicamente activos no intervalo posológico aprovado.

EXEMPLOS

[0126] Os seguintes exemplos, incluindo as experiências realizadas e os resultados conseguidos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados como limitativos dos ensinamentos aqui veiculados. EXEMPLO 1

Imunização e titulação Imunização [0127] Os IGF—I e IGF-II recombinantes humanos obtidos a partir da R&D Systems. Inc. (Minneapolis. Cat. MN N.° 291-G1 e 292-G2, respectivamente) foram usados como antigénios. Foram desenvolvidos anticorpos monoclonais contra o IGF-I/II por imunização sequencial de ratinhos XenoMouse® (estirpes XenoMouse XMG2 e XMG4 (estirpe 3C-1), Abgenix. Inc. Fremont. CA). Os animais XenoMouse® foram imunizados através da polpa dos dedos, para todas as injecções. O volume total de cada 66 injecção foi de 50 μΐ por ratinho, 25 μΐ em cada grupo. Cada injecção continha 10 pg, por ratinho, de IGF-I ou IGF-II isolado ou conjugado com o antigénio da hemocianina de Megathura crenulatade (KLH - Keyhole Limpet Hemocyanin) enquanto transportador, conforme descrito na Tabela 2. A primeira injecção foi preparada em PBS Dulbecco (DPBS) e misturada a 1:1 v/v com Titermax Gold Adjuvant (SIGMA Cat. N.° T2684, lote n.° K1599) . Foram, então, administrados um total de 8 a 11 reforços adicionais durante um período de 27 a 38 dias, misturados com 25 pg de Adju-Phos (gel de fosfato de alumínio, n.° de catálogo 1452-250, lote n.° 8937, HC1 Biosector) e 10 pg de CpG (15 pl de ImmunEasy Mouse Adjuvant. n.° de catálogo 303101; lote n.° 11553042; Qiagen), por ratinho, seguido por um reforço final de 10 pg de antigénio em DPBS sem pirógenios, nem adjuvante. No que concerne à imunização combinada (animais imunizados com IGF-I e IGF-II), o segundo antigénio foi administrado nos dois (2) últimos reforços.

TABELA 2. RESUMO DA IMUNIZAÇÃO

Grupo de Imunogénio j Imunogénio Conjugado i Isotipo dos Grupo de imunização inicial final j KLH j ratinhos fusão 1 IGF-I 1 IGF-1 ! - | IgG2-KÀ 1 3 IGF-1 j IGF-1 j - | IgG4-KÀ 1 5 IGF-1 j IGF-1 \ + S IgG2-KÀ 1 7 IGF-1 j IGF-1 j + | IgG4-KÀ 1 2 IGF-2 j IGF-2 j - | IgG2-KÀ 2 4 IGF-2 | IGF-2 \ - | IgG4-KÀ 2 6 IGF-2 j IGF-2 ! + | IgG2-KÀ 2 8 IGF-2 j IGF-2 j + | IgG4-KÀ 2 9 IGF-1 j IGF-2 j - | IgG2-KÀ 3 11 IGF-1 | IGF-2 | - | IgG4-KÀ 3 67

Grupo de imunização Imunogénio inicial Imunogénio final | Conjugado I KLH Isotipo dos ratinhos |Grupo de fusão 13 IGF-1 IGF-2 | + IgG2-KÀ 1 3 15 IGF-1 IGF-2 | + IgG4-KÀ j 3 10 IGF-2 IGF-1 | IgG2-KÀ 4 12 IGF-2 IGF-1 | IgG4-KÀ 4 14 IGF-2 IGF-1 | + IgG2-KÀ 1 4 16 IGF-2 IGF-1 | + IgG4-KÀ \ 4 EXEMPLO 2

RECUPERAÇÃO DE LINFÓCITOS, ISOLAMENTO DE CÉLULAS B, FUSÃO E PRODUÇÃO DE HIBRIDOMAS

[0128] Os ratinhos imunizados foram sacrificados por deslocação cervical e recolhidas e agrupadas as drenagens dos seus nódulos linfáticos. As células linfóides foram dissociadas por moagem em DMEM para libertar as células dos tecidos e as células foram novamente suspensas em DMEM. As células foram contadas e foram adicionados ao granulado celular 0,9 mL de DMEM por cada 100 milhões de linfócitos, para ressuspender as células, gentil e completamente, Usando 100 pL de CD90+ e esferas magnéticas, por cada 100 milhões de células, as células foram marcadas por incubação com as esferas magnéticas a 4 °C, durante 15 minutos. A suspensão de células magneticamente marcadas com até 108 células positivas (ou até 2xl09 células totais) foi carregada numa coluna LS+ e esta foi lavada com DMEM. O efluente total foi recolhido como a fracção negativa de CD90 (espera-se que a maioria destas células sejam células B). 68

[0129] A fusão foi realizada pela mistura de células B enriquecidas lavadas a partir da descrição acima e as células P3X63Ag8.653 de mieloma não secretoras compradas a partir de ATCC, cat. CRL n.° 1580 (Kearney et al. J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) numa razão de 1:1. A mistura celular foi gentilmente transformada em granulado por centrifugação a 800 x g. Após remoção completa do sobrenadante, as células foram tratadas com 2-4 mL de solução de Pronase (CalBiochem, cat. n.° 53702; 0,5 mg/mL em PBS) durante não mais do que 2 minutos. Depois, foram adicionados 3-5 mL de FBS para cessar a actividade enzimática e a suspensão foi ajustada para um volume total de 40 mL usando solução de fusão electro-celular. (ECFS, sacarose 0,3M, Sigma, Cat. n.° S7903, acetato de magnésio 0,lmM, Sigma, Cat. n.° M2545, acetato de cálcio 0,lmM, Sigma, Cat. n.° C4705). O sobrenadante foi removido após centrifugação e as células foram ressuspendidas em 40 mL de ECFS. Este passo de lavagem foi repetido e as células foram novamente suspensas em ECFS a uma concentração de 2xl06 células/mL.

[0130] A fusão electro-celular foi realizada usando um gerador de fusão (modelo ECM2001, Genetronic. Inc., San Diego, CA). A capacidade da câmara de fusão utilizada foi de 2,0 mL, usando os seguintes arranjos de instrumento: [0131] Condição de alinhamento: voltagem: 50 V, tempo: 50 s.

[0132] Ruptura da membrana a: voltagem: 3000 V, tempo: 30 ys.

[0133] Tempo de manutenção pós-fusão: 3 s.

[0134] Após a ECF, as suspensões celulares foram cuidadosamente removidas da câmara de fusão sob condições estéreis e transferidas para um tubo estéril com o mesmo 69

volume do meio de cultura de hibridomas (DMEM, JRH

Biosciences), FBS a 15% (Hyclone), suplementado com L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim) . As células foram incubadas durante 15-30 minutos a 37 °C e depois centrifugadas a 400 x g (1000 rpm) durante 5 minutos. As células foram gentilmente ressuspendidas num pequeno volume de meio de selecção de hibridomas (meio de cultura de hibridomas suplementado com 0,5x HA (Sigma, cat. n.° A9666) ) e o volume adequadamente ajustado com meio de selecção de hibridomas, com base num plaqueamento total final de 5xl06 células B por placa de 96 poços e 200 pL por poço. As células foram gentilmente misturadas e pipetadas para placas de 96 poços e deixadas a crescer. No dia 7 ou 10, foi removida metade do meio e as células re-alimentadas com meio de selecção de hibridomas. EXEMPLO 3

SELECÇÃO DE ANTICORPOS CANDIDATOS POR ELISA

[0135] Após 14 dias de cultura, os sobrenadantes do hibridoma foram rastreados quanto à presença de anticorpos monoclonais específicos IGF-I/II. As placas ELISA (Fisher, Cat. N.° 12- 565-136) foram revestidas com 50 pL/poço de IGF-I ou IGF-II humano (2 pg/mL) em tampão de revestimento (tampão carbonato 0,1 M, pH 9,6, 8,4 g/L de NaHC03) e depois incubadas a 4 °C, durante a noite. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (Tween 20 a 0,05% em PBS) . Foram adicionados 200 pL/poço de tampão de bloqueio (BSA a 0,5%, Tween 20 a 0,1%, Thimerosal a 0,01% em PBS lx) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, durante 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de 70 lavagem. Foram adicionados 50 pL/poço de sobrenadantes de hibridoma e controlos positivos e negativos e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, durante 2 horas.

[0136] Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem. Foram adicionados 100 pL/poço do anticorpo de detecção anti-huIgGFc-HRP de cabra (Caltag. Cat. n.° H10507) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente, durante 1 hora. Num rastreio secundário, os positivos da primeira análise foram rastreados em dois conjuntos, um para a detecção de IgG humana (cadeia pesada) e o outro para detecção da cadeia leve κ da Ig humana (k -HRP anti-hlg de cabra (Southern Biotechnology, Cat. N.° 2060-05) de modo a demonstrar a composição humana completa para os dois, IgG e IgK. Após incubação, as placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem. Foram adicionados 100 pL/poço de TMB (BioFX Lab. Cat. N.° TMSK-0100-01) e as placas deixadas a desenvolver durante cerca de 10 minutos (até que os poços de controlo negativo comecem a apresentar cor) . Foram então adicionados 50 pL/poço da solução stop (TMB Stop Solution, (BioFX Lab. Cat. N.° STPR-0100-01) e as placas lidas num leitor ELISA, a 450nm. Como indicado na Tabela 3, o total poços com anticorpos contra IGF-I e IGF-II foi de 1233.

[0137] Todos os anticorpos que se ligaram no ensaio ELISA foram contra-analisados quanto à ligação com a insulina, por ELISA, de modo a excluir aqueles que tiveram uma reacção cruzada com a insulina. As placas de ELISA (Fisher, Cat. N.° 12-565-136) foram revestidas com 50 pL/poço de insulina recombinante (concentração: 1 pg/mL; Sigma, n.° de catálogo 12643) em tampão de revestimento (tampão carbonato 0,1 M, pH 9,6, 8,4 g/L de NaHC03) e depois incubadas a 4 °C, durante a 71 noite. Como detalhado na Tabela 3, um total de 1122 dos 1233 anticorpos originais apresentou uma reacção cruzada com a insulina.

TABELA 3. RESUMO DO RASTREIO

Rastreio de confirmação n. a Fn Estirpe do ratinho Imunogénio Alvo com detecção de hG Alvo com detecção de hK+hL IGF-I(+) & IGF- II ( + ) | IGF-I( + ) & | IGF-II( + ) e |hu-Insulina 1(_) 1 G2 KL IGF-I-KLH IGF-II IGF-I 36 ! 28 2 G4 KL IGF-I-KLH IGF-II IGF-I 65 155 3 G2 KL IGF-II or IGF-II- IGF-I IGF-II 168 ! 150 KLH ! 4 G4 KL IGF-II ou IGF-II- IGF-I IGF-II 197 j 194 KLH 5 G2KL IGF-I/-II-KLH IGF-II IGF-II 54 150 6 G4 KL IGF-I/-II-KLH IGF-II IGF-II 101 186 7 G2 KL IGF-II/-I-KLH IGF-II IGF-II 294 ! 271 8 G4 KL IGF-II/-I ou IGF- IGF-II IGF-II 318 12 8 8 II/-I-KLH $ F1 para F4 Total 466 I 427 F5 para F8 Total 767 | 695 Total 1233 ] 1122 [0138] Finalmente, os anticorpos que foram seleccionados na contra-análise foram testados por ELISA para confirmar a ligação às proteínas de IGF-I e IGF-II de ratinho. Foi identificado um total de 683 linhas de hibridoma como tendo reactividade cruzada com o IGF-I/II de ratinho. Assim, os anticorpos expressos por estas linhas de hibridoma ligam-se ao IGF-I humano, IGF-II humano, IGF-I de ratinho e IGF-II de ratinho, mas não à insulina humana. 72 EXEMPLO 4

INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DE IGF-I E IGF-II AO IGF-IR

[0139] A intenção deste estudo foi rastrear os anticorpos IgG2 e IgG4 humanos anti-IGF-I/II 683 no estágio do sobrenadante do hibridoma para neutralizar a actividade, como determinado pela inibição da ligação de IGF-I e IGF-II ao receptor IGF-IR. Assim, foi realizado um ensaio de ligação receptor/ligando com células NIH3T3 que sobrexpressam o receptor IGF-IR humano, conforme descrito abaixo.

[0140] Resumidamente, placas com filtros de multi-rastreio (MultiScreen de 0,65 μΜ de 96 poços PVDF, Millipore, Cat. N.° MADV NOB 10) foram bloqueadas com tampão de bloqueio (PBS contendo BSA a 10% com NaN3 a 0,02%) num volume de 200 pL/poço durante a noite a 4 °C. O IGF marcado com [121] (Amersham Life Sciences Cat N.° IM172 (IGF-I) ou IM238 (IGF-II)) a 100 pCi/mL e 50 nM foi diluído para a concentração apropriada (70 pM final para IGF-I e 200 pM final para IGF-II) em tampão de ligação (PBS contendo BSA a 10% com NaN3 a 0,02%). A placa de filtro revestido com tampão de bloqueio foi lavada uma vez com 200 pL de PBS e 50pL dos sobrenadantes anti-IGF-I/II Ab (diluído em tampão ligação para 25% do volume final) foram pré-incubados com 25 pL de [125I]-IGF na placa MultiScreen durante 30-60 minutos em gelo. Os fibroblastos de ratinho NIH3T3 subconfluentes que expressam estavelmente hIGF-IR (obtidos a partir de AstraZeneca) foram colhidos com tripsina e novamente suspensos em tampão de ligação frio a 6xl06/mL e foram adicionados 25 pL de células à placa durante 2 horas de incubação, em gelo. A placa foi lavada 4 vezes com 200 pL de PBS frio e seca durante a noite. Foram adicionados 25 pL/poço de cintilante (cocktail SuperMix, Wallac/Perkin Elmer Cat N.° 73 1200-439) e as placas foram lidas usando um leitor Microbeta Trilux (Wallac) .

[0141] Os controlos seguintes foram usados por placa de rastreio: sem anticorpo (IGF ligado total), controlo que neutralização de mAb anti-IGF-I (n.° 05-172, Upstate) ou anti-IGF-II (n.° MAB292, R&D Systems) a 50 pg/mL (base não especifica) e 0, 075 a 0,5 pg/mL (valores de EC50 aproximadamente dos anticorpos de neutralização) e mAb IgG2 humano de controlo de isotipo coincidente (PK16.3.1, Abgenix, lote n.° 360-154) ou IgG4 (108.2.1, Abgenix, lote n.° 718-53A) numa concentração de 0,5 pg/mL (valor aproximado de EC50 dos anticorpos de neutralização). Foi adicionada uma titulação adicional dos anticorpos de neutralização de controlo e anticorpos humanos de controlo de isotípico coincidente a uma placa por ensaio de rastreio (diluição em série 1/10 a partir de 50 ug/mL (333,3 nM)). Todos os controlos, com ou sem anticorpos, foram preparados num tampão de ligação suplementado com sobrenadante esgotado de IgG2 ou IgG4 humano anti-KLH num volume final de 25%.

[0142] A percentagem de inibição foi determinada como se segue: % Inibição = ( [ (CPM médio total com ligação 125I-IGF) - (CPM médio total com ligação 125I-IGF na presença de anticorpo)] / [(CPM médio total com ligação 125I-IGF) - (CPM médio total com ligação 125I-IGF na presença de um excesso do anticorpo de neutralização*)])xlOO.

[0143] * A base nao específica foi determinada como CPM das células com um excesso de Ab anti-IGF de controlo de neutralização (50 ug/mL, 333,3 nM) , que descobriu-se ser equivalente a um excesso de IGF frio (inferior a ou igual a 10% do CPM total) 74 [0144] O rastreio do sobrenadante de anti-IGF-I/II foi dividido por isotipo com base nas publicações de ligandos radiomarcados. Como mostra a Tabela 4, os sobrenadantes dos anticorpos anti-IGF-I/Il com um isotipo IgG2 (total de 293) foram primeiro rastreados contra o IGF-I radiomarcado. Foi inicialmente aplicada a este rastreio uma interrupção de inibição a 40% (i.e., foram seleccionadas linhas de hibridoma cuja inibição é igual ou superior a 40%) e foram seleccionados 111 sucessos para um rastreio subsequente contra o IGF-II. Entre os 111 sucessos, descobriu-se que um total de 91 linhas inibe a ligação do IGF-II ao seu receptor com uma interrupção de 50%. Foi seleccionado um total de 71 sucessos finais através da toma dos sobrenadantes que neutralizaram 50% da actividade de IGF-I e IGF-II.

[0145] Todos os sobrenadantes que expressam isotipos de IgG4 (390 total) foram inicialmente rastreados contra o IGF-II radiomarcado e foram, subsequentemente, rastreados 232 sucessos com uma interrupção em 50% da inibição contra o IGF-I. Um total de 90 linhas foi capaz de inibir a ligação do IGF-I ao seu receptor com uma interrupção de 50%. Após a combinação dos sucessos para IgG2 (71) e IgG4 (90), foi obtido um total de 161 linhas que inibem o IGF-I e IGF-II em 50%, ou mais.

[0146] Em suma, dos 683 sobrenadantes originais, foram seleccionados 343 a partir do rastreio inicial (111 IgG2 e 232 IgG4, 50,2%) com IGF-I ou IGF-II. Foi obtido um total de 161 sucessos finais (23,6% das linhas originais), com capacidade de bloquear a ligação quer do IGF-I como do IGF-II ao IGF-IR com os critérios gerais de interrupção de 50% de inibição. 75 [χΐ p HP o un

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ENSAIOS ELISA DE ANTIGÉNIO ELEVADO E LIMITADO

[0147] De modo a determinar a afinidade relativa nas linhas de hibridoma 161 seleccionadas no exemplo 4, bem como a concentração de anticorpo nos sobrenadantes de cada linha, foram realizados ensaios ELISA de antigénio elevado (HA) e limitado (LA). No ensaio de quantificação do HA, a concentração de antigénio elevado e a incubação durante a noite limitam o efeito da afinidade do anticorpo, permitindo o cálculo da quantidade relativa de anticorpo-antigénio especifico presente em cada amostra. A baixa concentração de antigénio no ensaio LA limita o efeito da concentração de anticorpo e resulta numa classificação de anticorpos base na sua afinidade relativa.

Ensaio de quantificação do antigénio elevado [0148] Foram revestidas placas de ELISA com uma quantidade relativamente alta de cada antigénio IGF-I ou IGF-II (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. N.° 291-G1 e 292-G2, respectivamente) com 500 ng/ml (67nM). Os sobrenadantes do anticorpo que continham hibridomas foram titulados num intervalo de diluição de 1:50 a 1:12200. Foi utilizado um controlo de um anticorpo IGF especifico conhecido (R&D Systems. Inc., Minneapolis, MN Cat. N.° MAB291 e MAB292, respectivamente) para definir o intervalo linear do ensaio. Os dados dentro da gama linear foram então utilizados para determinar a concentração relativa do anticorpo especifico em cada amostra titulada. 77

Ensaio do antigénio limitado [0149] Foram revestidas placas de microtitulação com concentrações reduzidas do antigénio. Foram adicionados a cada poço cinquenta microlitros (50 pL) de IGF-I ou IGF-II a 64, 32, 16, 8, 4 e 2 ng/ml (cobrindo um espectro de 8,5 a 0,26 nM) em 1% de leite desnatado / IX PBS pH 7,4 / azida a 0,5%. A placa foi incubada durante 30 minutos.

[0150] As placas foram lavadas 4 vezes (4x) com água e foram adicionados aos poços 50 pL de sobrenadante de hibridoma contendo anticorpos de teste diluídos a 1:25 em 1% leite desnatado / IX PBS pH 7,4 / azida a 0,5%. As placas foram envolvidas firmemente em película de parafina, incubadas durante a noite e agitadas a temperatura ambiente [0151] No dia seguinte, todas as placas foram lavadas 5 vezes (5x) e foram adicionados a cada poço 50pL de anticorpo policlonal IgG Fc HRP anti-Humano de cabra a uma concentração de 0,5 ug/ml em 1% leite, IX PBS pH 7,4. As placas foram incubadas, durante 1 hora, à temperatura ambiente.

[0152] As Placas foram lavadas pelo menos cinco vezes (5x com água da rede. Foram adicionados cinquenta microlitros (50) pL de substrato HPR TMB a cada poço e as placas foram incubadas durante 30 minutos. A reacção HRP-TMB foi cessada pela adição de 50 pL de ácido fosfórico 1M a cada poço. Foi medida a densidade óptica (absorvância) a 450nm, para cada poço da placa.

Análise de dados [0153] Foi feita uma média dos valores de OD dos anticorpos testados e calculado o intervalo. Os anticorpos com o sinal 78 elevado e um desvio padrão baixo aceitável foram seleccionados como os anticorpos que apresentam uma maior afinidade para o antigénio face aos anticorpos de referência.

[0154] Foi efectuada uma análise para seleccionar os melhores anticorpos com base na neutralização (Exemplo 4) , potência (a baixa concentração de anticorpo foi determinada por ELISA HA e por inibição elevada da vinculação dos ligantes), afinidade (ELISA LA) ou em todos estes critérios. A partir desta análise, foi produzida uma lista de 25 anticorpos. Foi concretizada uma análise isolada com base na % média de inibição da ligação e afinidade do IGF-I e -II para IGF-I e IGF—II, produzindo uma segunda lista de 25 anticorpos. Dezasseis dos anticorpos eram comuns a ambas as listas, resultando numa lista final de 40 anticorpos. Os resultados de LA e HA destes 40 anticorpos foram resumidos na Tabela 5. Estas 40 linhas foram seleccionadas para clonagem, das quais 33 foram clonadas com sucesso.

TABELA 5. RESULTADO DO ENSAIO ELISA DE ANTIGÉNIO ELEVADO E LIMITADO PARA OS MELHORES 40 ANTICORPOS IGF1 HA IGF2 HA IGF1 LA jlGF2 LA IGF1 LA j IGF2 jliA ID da linha HA1 Médio (ug/ml) Ihai jDesvio |padrão HA2 média (ug/ml) |HA2 | Desvio 1 Padrão IGF1 2ng/ml j IGF2 j 2ng/ml IGF1 4ng/ml j IGF2 14ng/ml 4.121 1,16 jo, 16 3, 56 jl, 34 0,56 jo, 53 1,14 |0, 90 4.141 1, 99 I 0,22 1, 99 jo, 21 0,57 |0,79 1,25 jl, 52 4.142 4,70 | 0,21 3, 65 jo, 31 0,78 jl, 00 1,76 jl, 78 4.143 1,74 §0, 17 2,03 jo, 41 0,60 jo, 99 1,20 jl, 91 4.25 1,26 j 0,23 1,48 jO, 36 0,71 |0, 81 1,31 μ,54 4.69 7, 17 jl, 16 6,50 jo, 53 0,80 jo, 80 1,50 jl, 54 79 IGF1 j IGF2 IGF1 \ IGF2 IGF1 HA IGF2 HA LA LA LA LA HA1 Ihai HA2 SHA2 ; s ID da Médio jDesvio média íDesvio IGF1 | IGF2 IGF1 SIGF2 linha (ug/ml) | padrão (ug/ml) jPadrão 2ng/ml 12ng/ml 4ng/ml S 4ng/ml 4.90 1, 15 jo, 12 3, 68 jo, 77 0,58 j0,48 1, 04 j0, 89 7.118 10,34 11,2 6 10,32 jl, 90 0,81 j0, 85 1,56 jl, 44 7.123 13,4 | 3,2 12,0 j 2,8 1,0 j 1,7 1,66 j 2,58 7.127 7,28 jo, 44 6,59 jl, 55 1, 19 jl, 37 2,29 j 2,40 7.130 4,32 jo, 32 3,51 jl, 34 0, 64 j 1, 17 1,36 jl, 98 7.146 12,04 jO, 98 9, 63 jO, 6 0,2 jo, 86 0,29 jl, 58 7.158 9,29 jo, 49 7,1 jo, 56 1,71 j 1,42 3, 00 j 2,46 7.159 16,53 jl, 83 41,1 j 0,56 jl, 65 0,98 S2,47 7.160 4, 9 jo, 5 5, 1 jo, 2 1,7 j 2,2 3, 14 j 3,30 7.175 8,46 jo, 49 6,21 jl, 22 0,13 jo, 34 0, 14 jo, 62 7.202 11,94 jl, 98 15,24 jl, 72 1,11 jl, 68 2,28 j2,69 7.212 11,30 jl, 90 10,86 jl, 26 0,97 jo, 93 2,22 jl, 54 7.215 10,11 j 2,0 5 10, 94 jl, 39 1, 01 jl, 09 2,25 jl, 93 7.23 4,30 j 0,2 6 3, 99 j0,29 0,55 j 1,22 1,40 j 2, 17 7.234 4,7 l1'4 3,1 1 0,4 0,7 jl,4 1,79 j 2,44 7.251 3 jO, 41 1,93 j0, 17 1,09 jl, 02 1,31 jl, 53 7.252 8,25 jO, 51 5,55 jl, 68 1,22 j 1,2 3 2,53 j2, 09 7.268 7,58 jO, 42 5, 07 j0, 92 1,47 jl, 37 3, 06 j2,42 7.29 12,5 j 1,24 23,53 |4,7 0,18 j0,39 0,27 jo, 49 7.3 13, 18 j 2, 12 8,83 jO, 58 0,81 j 1,2 8 2,07 jl, 96 7.34 12,54 jl, 99 14,67 j3, 05 0,21 jl, 07 0,44 jl, 84 7.41 3, 69 jo, 19 4, 97 jo, 8 1,02 jl, 53 2,21 j 2,32 7.56 14, 6 j 2,0 21,7 [3,7 1,3 j 1,4 2,38 j2,46 7.58 17,52 jo, 01 27,54 j 6,22 0,21 jl, 15 0,47 jl, 82 7.66 6, 02 j0, 81 6, 18 jo, 71 0,49 j0, 97 1,42 jl, 53 7.77 8,42 j0, 18 7,25 jl, 12 0,64 jo, 46 1,50 jl, 00 7.85 22,67 jo, 68 23, 63 j0, 93 0,1 j0,33 0,16 j0,51 7.99 7,9 j 0,2 5,9 11, 6 0,9 j 1, o 1, 87 jl, 65 8.119 1,26 jo, 00 0,77 j0, 16 2,37 jo, 79 3,77 jl, 36 8.141 5, 96 jo, 50 4, 12 jo, 61 1,80 jo, 61 3, 02 jl, 08 80 IGF1 |lGF2 IGF1 llGF2 IGF1 HA IGF2 HA LA |la LA !la HA1 ÍHA1 HA2 ΪΗΑ2 ID da Médio Desvio média | Desvio IGF1 | IGF2 IGF1 | IGF2 linha (ug/ml) |padrão (ug/ml) | Padrão 2ng/ml 12ng/ml 4ng/ml 14ng/ml 8.146 4, 03 jo, 45 2,55 jo, 74 0,97 jl, 06 2, 13 jl, 98 8.287 4,8 I 0, 1 2, 8 jo, 8 2,2 11,6 3, 80 12, 91 8.8 2, 00 jo, 17 1,45 j 0,25 1,72 j 0, 77 3, 13 jl, 46 8.86 3, 15 0, 19 2,36 j 0,24 0,92 jl, 35 1,76 j 2, 18 EXEMPLO 6

Ligação dos anticorpos ao IGF-I e IGF-II ligados a IGFBP-3 [0155] IGF-I e IGF-II circulam no soro ligados maioritariamente às proteínas de ligação IGF (IGFBPs). Um objectivo é a identificação de anticorpos que não reconhecem um complexo de IGF com IGFBP, de modo a evitar a depleção in vivo dos anticorpos anti-IGF. O ensaio seguinte foi desenvolvido para a caracterização dos anticorpos que reconhecem o IGF-I ou IGF-II quando estes se encontram num complexo com o IGFBP-3. Especificamente, este ensaio testa a capacidade de ligação do IGF ao IGFBP-3 quando inserido no complexo anticorpo IGF/anti-IGF.

Bloqueio da mediação de anticorpos na captura de IGF pelo IGFBP-3 [0156] Foi desenvolvido um ensaio onde os complexos foram pré-formados entre IGF-I ou IGF-II e o anticorpo IGF específico, a partir dos exemplos anteriormente mencionados. A capacidade de ligação destes complexos ao IGFBP-3 foi testada através de um ensaio tecnológico AlphaScreen (PerkinElmer). No poço 384 da 81 placa, foram misturados 10 pL de sobrenadante de hibridoma diluído 1:20 com 10 pL de 3 nM biotinilado IGF-I ou IGF-II e incubados à temperatura ambiente, durante 2 horas. Foram adicionadas esferas dadoras de AlphaScreen revestidas de estreptividina e esferas aceitadoras de AlphaScreen acopladas ao IGFBP-3 (10 uL de uma mistura, para uma diluição final do sobrenadante hibridoma a 1/60) e a incubação continuou durante outra hora. As amostras foram então analisadas num leitor de placas Packard Fusion.

[0157] Três anticorpos monoclonais anti-IGF M23 comercialmente disponíveis (Cell Sciences 05-172 (Upstate) e MAB291 (R&D Systems) mostraram diferentes capacidades para inibir a ligação do IGF ao IGFBP com valores de classificação EC50 situados entre níveis reduzidos de ng/mL e 100 ng/mL. Não foi observada inibição da ligação do IGF-I ao IGFBP-3 com IGF irrelevante de ratinho e IgG humano até aos 10 pg/mL. sugerindo que o efeito anti-IGF-I é específico. Os anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis 05-166 (Upstate) e MAB292 (R&D) mostraram uma diferença significativa na interacção da afinidade de inibição do IGF-II/IGFBP-3. Estas experiencias mostram que os mAb anti-IGF podem bloquear a ligação do IGF ao IGFBP-3. produzindo um ensaio que pode ser usado para monitorizar a purificação de anticorpos pelas linhas de hibridoma. O passo seguinte foi a avaliação do efeito do meio saturado de hibridoma no sinal do ensaio.

[0158] As diluições seriadas de meio de hibridoma e sobrenadante saturado de hibridoma anti-KLH foram testadas no sistema do ensaio. Quando os sobrenadantes de hibridoma foram diluídos a 1:10 numa preparação de pré-incubação com IGFI/II (a diluição final no ensaio foi de 1:60) não houve quase 82 nenhum efeito do meio sobre os resultados do ensaio. Com base nestes dados os sobrenadantes de hibridoma foram diluídos para pré-incubação com IGF, fornecendo uma diluição preferencial de 1:60 na diluição final do ensaio.

[0159] Os sobrenadantes esgotados 683 positivos para a ligação IGF-I e IGF-II foram examinados para a sua capacidade de inibição do IGF relativamente ao IGFBP-3. Foram aplicadas as inibições anteriormente descritas de 50% e 60% para o IGF-I e IGF-II, respectivamente, como critérios de exclusão. O resumo dos resultados do rastreio com estes pontos de corte é mostrado na Tabela 6.

Tabela 6 NUMERO DE ACESSOS POSITIVOS IDENTIFICADOS NO RASTREIO V IGF-I jIGF-II 1 IGF—I/11 Amostras 376 | Inibição-> | (placas 1-4) >50% 48 I >60% jsi \19 307 | (placas 5-8) 39 | 78 ! 32 683 jTotal 87 112 9 | 5! [0160] 0 ensaio da competição IGFBP identificou 87 amostras inibidoras com o ensaio AlphaScreen da ligação do IGF-I ao IGFBP-3 e 129 amostras inibidoras da ligação do IGF-II ao IGFBP-3 entre os 683 sobrenadantes testados. Cinquenta e uma amostras demonstraram uma competição dupla de IGF-I e IGF-II. Contudo, de modo a reproduzir mais cautelosamente a função ou o comportamento dos anticorpos in vivo, onde o complexo IGF e IGFBP seria largamente pré-formado, foram efectuados ensaios adicionais, conforme descrito no exemplo 8. 83 EXEMPLO 7 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO ANTICORPO ANTI-IGFI e IGF-II USANDO UMA ANÁLISE BIACORE (RASTREIO DE BAIXA RESOLUÇÃO)

Rastreio de baixa resolução dos anticorpos monoclonais purificados 34 [0161] Foi utilizada a ressonância da superfície de plasmão não rotulado (SPR) ou Biacore, para medir a afinidade do anticorpo relativamente ao antigénio. Para este propósito, um anticorpo de superfície anti-humano de cabra de alta densidade foi preparado num chip CMS Biacore, usando um emparelhamento amina de rotina. Todos os mAb foram diluídos até aproximadamente 2 0 pg/ml num tampão de corrida HBS-P, contendo 100 pg/ml de BSA. Cada mAb foi capturado numa superfície separada usando um tempo de contacto de 30 segundos a 10 pL/min e lavado durante 5 minutos, para estabilização da linha de base mAb.

[0162] 0 IGF-I foi injectado a 335,3 nM em todas as superfícies a 23°C durante 120 segundos, seguindo-se uma dissociação por 5 minutos, usando uma taxa de fluxo de 100 pL/min. As amostras foram preparadas em tampão de corrida HBS-P como anteriormente descrito. As superfícies foram regeneradas após cada ciclo de captura/injecção com um pulso de 15 segundos a 146 nM de ácido fosfórico (pH 1,5). O mesmo ciclo de captura/injecção foi repetido para cada anticorpo com 114,7 nM de IGF-II. Foram preparados os dados de ligação de tendência corrigida para os 34 mAb através da subtracção do sinal de controlo da linha de tendência de base por um tampão imediatamente anterior a cada injecção de antigénio. Os dados foram ajustados a nível global num modelo de interacção 1:1 84 usando um CLAMP para determinar a ligação cinética (David G. Myszka & Thomas Morton (1998) "CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program", TIBS 23, 149-150. Foi usado um transportador de coeficiente de massa para ajustar os dados. Os resultados da análise cinética da ligação IGF-I e IGF-II a 25°C estão listados na Tabela 7. abaixo, Os mAb estão classificados por ordem decrescente de afinidade.

TABELA 7. RASTREIO DA RESOLUÇÃO BIACORE DOS 34 ANTICORPOS MONOCLONAIS IGF-I E IGF-II

\ IGF-I

SIGF-II AMOSTRAS (ka (M-1s-1) |KD (s x) |KD (pM) jk, (M-V1) §KD (s-1) (Κ,,(ρΜ) i 3, 5 X 106 I6,1 X 106 |9,3 X 106 (9, 3 X 10"4 (1,3 X 10"2 16,9 X 10 ' (216, 0 (3823,0 (1353,0 7.159.2 8.86.1 4.25.1 7.234.2 |6,4 X 106 |1,0 X 10~5 (2,4 X 10~4 14, 1 X 10~4 12,9 X 1(T4 {2,9 (39,3 144,1 (45, 3 (4,3 X 106 (3, 4 X 106 15, 1 X 10e (6,7 X 106 (2,2 X 10"3 (328,0 7.160.2 (4,6 X 106 (2,5 X 10"4 (54,3 (5, 6 X 1o6 |3, 3 X 10"3 (589,0 ( 7.146.3 (3,2 X 106 |l,8 X 10"4 (56, 2 (3, 8 X 1o6 (8,7 X 10"3 (2289,0 j 7.34.1 (3,0 X 106 (4,0 X 106 (l, 8 X 106 (4,9 X 106 (3:2 X 106 (2,4 X 106 (7,7 X 106 (l, 1 X 107 (3,5 X 10È (6, 9 X 106 (1,8 X 10"4 (3,4 X 10"4 (1,7 X 10"4 (4,7 X 10"4 (3,3 X 10" (2,5 X 10"4 (8,0 X 10"4 (1,2 X 10" (4,3 X 10"4 (9, 9 X 10"4 (5,2 (4,3 (1,2 ϋ * X 106 (615,0 (2093,0 7.123.1 7.202.3 4.141.1 7.215.2 8.287.2 8.146.2 4.143.2 (60,0 (85, 0 (94,4 (95, 9 (103,0 (104, (104,0 j109,0 (123,0 (143,0 X 106 x 106 (3,6 X 10e (7,7 x 105 (3,2 X 10"3 (9, 0 X 10"3 (5,4 X 10“3 (4500,0 j * Ϊ-2 (2,6 X 10" (1,3 X 10“3 (1,3 X 10“2 (1,9 X 10' (4,3 X 10“3 (4,8 X 10“3 (7222,0 (1688,0 (5417,0 (2969,0 ((935,0 (800,0 7.251.3 7.99.1 | 2,4 X 106 | 6,4 X 10E | 4,6 X 106 ( 6,0 X 106 4.142.2 (5,3 X 1o6 (8, 5 X 10"4 (160,0 | 8,5 X 1o6 (1,9 X 10“2 (2235,0 7.41.3 (3,2 X 1o6 (5, 5 X 10"4 (172,0 | 5,2 X 106 (2,9 X 10“3 (558,0 7.56.3 (3,3 X 106 1 6, 0 X IO"4 (182,0 ! 4, 8 X 106 ! 3, 1 X 10“3 :(64 6,0 7.127.1 (4,1 X 1o6 j7, 6 X 10"4 (185,0 | 4, 9 X 106 (3,5 X 10“3 (714,0 8.8.3 ! 4, 0 X 1o6 (7, 8 X 10"4 (195,0 | 3, 1 X 106 (8,2 X 10“4 (264,0 85 SIGF—II \IGF—I AMOSTRAS |ka (M^s-1) 1¾ (s_1) |K„ (pM) |k. (M_1S_1) 1¾ (S_1) KD(pM)

Dados da ligação IGF-I

[0163] As maiorias dos mAb ajustam-se a um modelo 1:1 de poço razoável. 0 mAb 4.90.2 e o 4.141.1 foram caracterizados por dados extremamente complexos. Esses mAb foram listados com asterisco na tabela 7. pois não pode ser estimada qualquer constante cinética significativa através de um modelo adequado 1:1. A fase não rotulada aparenta ser muito lenta para ambos os mAb (pelo menos 1 X IO”5 seg”1) . que pode por acaso fazer estes 2 mAb úteis como componentes terapêuticos.

Dados de ligação IGF-II [0164] As maiorias dos mAb ajustam-se a um modelo 1:1 de poço razoável. O desconto do mAb 7.159.2 foi mantido constante a 1 X 1CT5 seg-1 por existirem dados suficientes para estimar adequadamente a KD. 86 [0165] O estudo Biacore de baixa resolução foi, neste exemplo, desenhado como uma abordagem de classificação semiquantitativa. De modo a obter informação mais precisa acerca da taxa constante de caracteristicas e afinidade dos mAb individuais, foi realizado um estudo Biacore de alta resolução como descrito no Exemplo 8. EXEMPLO 8 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DOS ANTICORPOS ANTI-IGF-I E IGF-II USANDO UMA ANÁLISE BIACORE (RASTREIO DE ALTA RESOLUÇÃO) [0166] Foi concretizada uma análise de alta resolução Biacore para medir adicionalmente a afinidade do anticorpo relativamente ao antigénio. Os mAb 7.159.2, 7.234.2, 7.34.1, 7.251.3 e 7.160.2 foram capturados e os antigénios IGF-I e IGF-II injectados numa escala de concentrações. Os resultados das constantes de ligação encontram-se listados na Tabela 8.

TABELA 8. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO ANTICORPO ΑΝΤΙ-IGF ATRAVÉS DE ANÁLISE BIACORE DE BAIXA E ALTA RESOLUÇÃO mAb \Baixa resolução iAlta Resolução KD (pM) ίΚ„ (PM) | IGF-I IGF-II jIGF-I ! IGF-II 7.159.2 (216,0 2,9 ! 2 9 4,0 |l,9 7.234.2 132 8,0 45, 3 1 37 60,0 Í295,0 7.34.1 1615,0 60,0 1436,0 1164,0 I 1421,0 ! 162,0 7.251.3 1935,0 123, 0 ! 452,0 147,4 7.160.2 1589,0 54,3 j 2 8 0 0,0 |237,0

[0167] Desse modo as incorporaçoes da invenção podem incluir um anticorpo que vai preferencialmente ligar-se ao IGF-II, mas que estabelece reacção cruzada com IGF-I, ligando-se ao IGF-II 87 com uma afinidade mais elevada do que ao IGF-II, por exemplo, o anticorpo pode ligar-se a IGF-II com uma afinidade 2,5 vezes superior relativamente à com que se liga ao IGF-II. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ligar-se ao IGF-II como uma afinidade superior em, pelo menos, 5, 10, 25, 50 ou 150 superior relativamente ao IGF-I.

Triagem dos complexos IGF-l/GFBP-3 pré-formados [0168] O ensaio de competição IGFBP descrito no Exemplo 6 identificou 87 amostras que inibem a ligação IGF-II ao IGFBP-3 nos 683 sobrenadantes testados. Cinquenta e uma amostras demonstraram competição dupla do IGF-I e IGF-II. Contudo, de modo a reproduzir mais cautelosamente a função ou o comportamento dos anticorpos in vivo, onde o complexo de IGF-I e IGFBP poderá ser, em grande parte, pré-formado, foram realizados os seguintes ensaios Biacore nos anticorpos seleccionados.

[0169] Seis anticorpos seleccionados foram rastreados para determinar quando IGF-I ou IGF-II se liga ao complexo IGFBP. Todos os mAb seleccionados (7.159.2, 7.146.3, 7.34.1, 7.251.3, 7.58.3 e o anticorpo controlo não relacionado ABX-MA1) foram imobilizados de forma covalente para uma capacidade de superfície elevada (5,400-12,800 RUs) em 2 chips Biacore CM5 usando emparelhamento de amina de rotina, com um instrumento Biacore 2000. O fluxo celular de cada chip CM5 foi activado e bloqueado (sem mAb imobilizado) para ser usado como controlo de superfície.

[0170] De seguida, IGF-I e IGFBP-3 foram misturados num tampão salino Herpes, pH 7,4, P-20 a 0,005%, BSA a 100 pg/ml (HBS-P), para fazer uma solução final de 193 nM e 454 nM, 88 respectivamente, IGF-II e IGFBP-3 foram misturados para fazer uma solução final 192 nM e 455 nM, respectivamente, Sob estas condições, IGF-I e IGF-II foram complexados com o IGFBP-3 em 99,97%. Nestas condições o equilíbrio foi atingido em minutos, As soluções do complexo IGF-I/IGFBP-3 e IGF-II/IGFBP-3 foram seguidas através das várias superfícies mAb a 40 pL/min, a 23 °C, durante 180 segundos e a dissociação foi prosseguida durante 120 segundos, IGF-I e IGF-II não complexados foram, então, seguidos em cada superfície a 193 nM e 192 nM, respectivamente, e o IGFBP-3 foi seguido através de cada superfície a 454 nM. As superfícies foram regeneradas a um pulso de 20 segundos a 10 mM glicina, pH 2,0.

[0171] Os sensogramas foram processados usando um programa Scrubber pela subtracção do volume da mudança do índice refractário e algum sinal analítico de ligação não específico à superfície lisa pelo sinal de ligação de superfícies com mAb imobilizado, Após uma correcção da subtracção em branco, os sensogramas foram referenciados uma segunda vez pela subtracção de uma média de sensograma para injecção um tampão numa superfície celular de fluxo. Esta referência dupla corrige a ligação sensograma mAb para qualquer erro particular presente no fluxo celular [0172] IGF-I/IGFBP-3 e IGF-II/IFBP-3, complexados e não complexados e IGF-II/IFBP-3 ligam-se de forma débil aos anticorpos de ligação, com uma estimativa aproximada da interacção da ligação inespecífica a KD>1 μΜ para todos os mAb, incluindo o controlo negativo ABX-MAl (ver Tabela 9). Contudo, com ABX-MAl a ligação IGF-I/II foi fraca e indica que ocorreu uma interacção não específica da ligação de todas estas três substancias a analisar. Aparentemente, o complexo IGF/IGFBP-3 89 liga-se de forma ligeiramente mais forte a todos os mAb que o IGFBP-3 isolado. Contudo, porque ambos os IGF-I, IGF-II e IGFP-3, aparentemente, se ligam não especificamente a este mAb quando estão ligados, tal resulta num complexo de ligação proteica não especifico mais rigido, o que explica o sinal de ligação maior para o complexo. 0 complexo IGF-I/II/IGFBP-3 e o IGFBP-3 ligam-se significativamente à superfície do controlo o que também indica a não especificidade destas 2 proteínas. Contudo, no sensograma abaixo este fundo de ligação é subtraído para fora da primeira referência, durante o processamento dos dados, como descrito acima.

[0173] Esta experiência sugere que apesar de 51 destas amostras terem previamente mostrado que inibem a ligação do IGF-I/II ao IGFBP3 (Exemplo 6), os anticorpos podem também ligar-se ao complexo IGF/IGFBP in vitro. TABELA 9. RESUMO DA LIGAÇÃO DO IGF-I/IGFBP-3 E DA LIGAÇÃO IGF-II/IGFBP-3 A 6 MAB. mAb |complexo IGF-I/IGFBP- complexo IGF-II/IGFBP- IGFBP- IGF-I (or I3 3 3 II) 7.159.2 ! + + + +++ 7.146.3!+ ++ + +++ 7.34.1 |+ ++ + +++ 7.251.3 !++ ++ ++ +++ 7.58.3 !++ ++ ++ +++ ABX-MA1 ! + + + + +, ligação leve relativa a IGF- -I ou IGF-II ao mAb ++, ligação média relativa a IGF-I ou IGF-II ao mAb +++, ligação forte relativa a IGF-I ou IGF-II ao mAb *Estas classificações não indicam KD para estas interacções. 90 EXEMPLO 9 DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE DO ANTICORPO ΑΝΤΙ—INSULINA UTILIZANDO UMA ANALISE BIACORE (RASTREIO DE BAIXA RESOLUÇÃO) [0174] A reactividade cruzada dos anticorpos ao IGF-I/II foi investigada medindo a afinidade dos mAb à insulina humana. Os anticorpos IGF-I/II foram imobilizados pelo chip Biacore CM5 e a insulina da solução foi injectada para a determinação da taxa de ligação e não ligação. Foram testados nesta experiência 5 mAb, incluindo 7.234.2, 7.34.1, 7.159.2, 7.160.2 e 7.251.3. A insulina diluída a 502 nM no tampão de corrida foi injectada em todas as superfícies capturadas.

[0175] Não foi observado nenhuma ligação sem insulina nos mAb a 502 nM. Estes resultados sugerem que não há aparentemente nenhuma reactividade cruzada do mAb IGF-I/II com a insulina. EXEMPLO 10

LIGAÇÃO DE ANTICORPOS

[0176] 0 processo de categorizaçao (binning) de epítopos foi realizado para determinar quais dos anticorpos anti-IGF-I/II competiriam uns com os outros e, como tal, teriam maior probabilidade de se ligar ao mesmo epítopo no IGF-I/II. 0 processo de ligação é descrito no Pedido de Patente U.S. 20030175760 e também em Jia et al., J. Immunol. Methods. (2004) 288:91-98, aqui incorporados, na íntegra, como referência. Resumidamente, esferas Luminex foram acopladas com anti-huIgG de rato (Pharmingen n.° 555784) seguindo o protocolo de acoplamento de proteínas fornecido no website da Luminex. Esferas pré-acopladas foram preparadas para 91 acoplamento ao anticorpo primário desconhecido usando o procedimento que a seguir se descreve, protegendo as esferas da luz. Foram usados tubos individuais para cada sobrenadante desconhecido. 0 volume de sobrenadante necessário foi calculado usando a seguinte formula: nX2+10) x 50 μΐ (onde n = numero total de amostras). . Foi usada uma concentração de 0,1 pg/ml neste ensaio. A solução stock de esferas foi centrifugada lentamente e diluída em sobrenadante para uma concentração de 250 0 de cada esfera em 50 μΐ por poço ou 0,5X105 esferas/ml.

[0177] As amostras foram incubadas num agitador no escuro à temperatura ambiente durante a noite.

[0178] A placa filtragem foi pré-humedecida através da adiçao de 200 μΐ de tampão de lavagem, por poço, que foram depois aspirados. Foram adicionados 50 μΐ de cada esfera a cada poço da placa de filtragem. As amostras foram lavadas uma vez pela adição de 100 μΐ/poço de tampão de lavagem, seguidamente aspirados. Foram adicionados à placa de filtragem 50 μΐ/poço de antigénio e controlo. As placas foram cobertas, incubadas no escuro durante 1 hora, num agitador e depois lavadas 3 vezes. Um anticorpo secundário não conhecido foi então adicionado a uma concentração de 50 μΐ/poço. Foi usada uma concentração de 0,1 pg/ml para o anticorpo primário. A placa foi, então, incubada no escuro num agitador à temperatura ambiente durante 2 horas, em seguida, as amostras foram lavadas 3 vezes. Foram adicionados 50 μΐ/poço de IgG anti-humano biotinilado de ratinho (Pharmingen n.° 555785) diluído a 1:500 e as amostras foram incubadas no escuro, durante 1 hora, num agitador à temperatura ambiente. 92 [0179] As amostras foram lavadas 3 vezes. Foram adicionados 50 μΐ/poço de estreptavidina-PE a uma diluição de 1:1000 e as amostras foram incubadas no escuro, durante 15 minutos, num agitador à temperatura ambiente. Após o decurso de 2 ciclos de lavagem no LuminexlOO, as amostras foram lavadas 3 vezes, O conteúdo de cada poço foi novamente suspenso em 80 μΐ de tampão de bloqueio. As amostras foram mexidas cautelosamente por pipetagem, algumas vezes de modo a que as esferas fossem novamente suspensas. As amostram foram então analisadas no LuminexlOO. Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 10 .

TABELA 10. CATEGORIAS PARA OS MELHORES 34 ANTICORPOS IGF-I/II POSITIVOS NUM ENSAIO FUNCIONAL

IGF-I | jIGF-II j Cat. 1 iCat. 2 Cat. 3 S/Cat. | .Cat. 1 Icat. 2 Icat. 3 js/Cat. 7.3.3 ÍÍ7.58.3 |7.175.2 7.215.2 | 17.3.3 17.158.2 17.175.2Í7.215.2 7.23.3 Í8.287.2 Ϊ7.85.2 17.127.1 | 8.146.2 U.90.2 \ 7.66.1 j 14.90.2 17.99.1 Í7.252.1 U.141.1 | 7.56.3 í 14.141.1 17.123.1 18.86.1 Π.85.2 j 7.160.2 j j 7.146.3 17.212.1 | 17.251.3j 7.41.3 i 17.34.1 Í7.234.2 | |7.159.2j 4.121.1j 17.159.2 17.130.1 | 7.146.3j 8.146.2 j 17.251.3 |7.118.1 | I 7.34.1 | 7.252.1j Í8.287.2 | 7.123.1 | Í7.58.3 | 7.212.1j 17.66.1 | 7.234.2 | 17.41.3 | 7.99.1 | 17.56.3 | 7.127.1Ϊ | 7.160.2 | 4.25.1 | I7.202.3 | 8.8.3 | 18.8.3 | 7.158.2 | 14.25.1 | 7.2 02.3 1 7.23.3 I 93 IGF-I IGF-II 7.130.1 8.86.1 4.142.2 4.143.2 4.121.1 4.142.2 7.118.1 4.143.2 EXEMPLO 11

ANÁLISE ESTRUTURAL DOS ANTICORPOS ANTI-IGF-I/II

[0180] Foi sequenciada a variabilidade das cadeias pesadas e leves de alguns anticorpos para determinar as suas sequências de ADN. A informação das sequências completas para os anticorpos anti-IGF-I/II é providenciada numa listagem de sequências de nucleótidos e aminoácido para cada combinação de cadeia gama e k. Foram analisadas as variabilidades das sequências pesadas para determinar a família VH e as sequências da região D e J. As sequências foram, então, traduzidas para determinar a sequência primária do aminoácido e, então, comparadas com a linha germinativa da sequencia da região VH. D e J para aceder às hipermutações somáticas [0181] Está demonstrado nas tabelas seguintes o alinhamento dos genes das linhas germinais das sequências destes anticorpos. A Tabela 11 é uma tabela que compara as regiões de cadeia pesada do anticorpo com a respectiva região de cadeia pesada da linha germinativa cognata. A Tabela 12 é uma tabela que compara as regiões de cadeia leve κ do anticorpo com a respectiva região de cadeia leve da linha germinativa cognata. As mutações distantes da linha germinativa são apresentadas como novos aminoácidos. 94 [0182] A variabilidade das regiões (V) das cadeias de imunoglobulina é codificada por linhas germinativas múltiplas de segmentos de DNA, que são ligadas a regiões variáveis funcionais (VHDJH ou VKJK) durante a ontogenia das células B. A diversidade molecular e genética dos anticorpos responsáveis pelo IGF—I/II foi estudada em detalhe. Este ensaio revela muitos pontos específicos dos anticorpos anti-IGF-I/II.

[0183] A análise de 5 anticorpos individuais específicos para o IGF-I/II resultou numa determinação de que os anticorpos derivaram de 3 genes VH de linhas germinativas distintas, 4 deles da família VH4, com 2 anticorpos derivados do segmento genético VH4-39. As Tabelas 11 e 12 mostram os resultados desta análise.

[0184] Deverá ser apreciado que as sequências de aminoácidos entre os clones irmãos colectados de cada hibridoma são idênticas, por exemplo, as sequências de cadeia pesada e a cadeia leve para os mAb 7.159.2 são idênticas às sequências mostradas nas Tabelas 11 e 12 para o mAb 7.159.1.

[0185] As CDRls da cadeia pesada dos anticorpos da invenção têm uma sequência como a divulgada na Tabela 11. O CDR1 divulgados na Tabela 11 correspondem à definição Kabat. Alternativamente, o CDRls pode ser definido através uma definição alternativa para que inclua, pelo menos, 5 dos resíduos da sequência FR1, por exemplo, para o anticorpo 7.159.1 a sequência FR1 é QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ. ID N.°: 93) e a sequência CDR1 é GYTFTSYDIN (SEQ. ID N.°: 94); para anticorpo 7.158.1 a FR1 sequência é QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ. ID N.°: 95) e a sequência CDR1 é GGSIRSSSYYWG (SEQ. ID N.°: 96); para o anticorpo 7.234.1 a sequência FR1 é QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ. ID N.°: 97) e 95 a sequência CDR1 é GGSINSSSNYWG (SEQ. ID N.°: 98); para o

anticorpo 7.34.1 a sequência FR1 é QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ. ID N. 0 : 99) e a sequência CDR1 é GGSISSYYWS (SEQ. ID N.°: 100); e para o anticorpo 7.251.3 a sequência FR1 é QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID N.°: 101) e a sequência CDR1 é GGSISSYYWS (SEQ ID N.°: 102) [0186] Também deverá ser apreciado que quando um anticorpo particular difere da sua sequência germinativa respectiva a nível dos aminoácidos, a sequência do anticorpo pode ser mutada de volta para a sequência germinativa. Tais mutações correctivas podem ocorrer numa, duas, três ou mais posições, ou uma combinação de qualquer das posições mutadas, usando técnicas de biologia molecular padronizadas. No modo de exemplo não limitativo, a Tabela 12 mostra que a sequência da cadeia leve de mAb 7.34.1 (SEQ. ID N.°: 12) difere da sequência germinativa correspondente (SEQ ID N.°:80) através da mutação Pro para Ala (mutação 1) na região FR1 e de uma mutação de Phe para Leu (mutação 2) na região FR2. Assim, a sequência de aminoácidos ou nucleótidos que codifica a cadeia leve do mAb 7.34.1 pode ser modificada por variação da mutação 1 para produzir a sequência germinativa no local da mutação 1. Além disso, a sequência de aminoácidos ou nucleótidos que codifica a cadeia leve de mAb 7.34.1 pode ser modificada por variação da mutação 2 para produzir a sequência germinativa no local da mutação 2. Ainda assim, a sequência de aminoácidos ou nucleótidos que codifica a cadeia leve de mAb 7.34.1 pode ser modificada por variação de ambas a mutação 1 e a mutação 2 para produzir a sequência germinativa nos locais das duas mutações 1 e 2. 96 PS fe-1 O tò & ϊ» ^ 6 >^: <SÇ ^ «3 rs *λ <κ S* Sê ê

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U Ή X) í> 100 EXEMPLO 12 INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO INDUZIDA PELOS IGF-I II DO hIGF-IR EXPRESSO ECTOPICAMENTE EM CÉLULAS NIH3T3 [0187] Os ligandos de IGF exercem as suas funções de proliferação e anti-apoptose através da activação da actividade do receptor de tirosina cinase no receptor IGF-IR. De modo a avaliar os anticorpos anti-IGF-I/II quanto à sua capacidade em inibir fosforilação de IGF-IR induzida pelo IGF, foram usadas no ensaio seguinte as células NIH3T3 que expressam ectopicamente hIGF-IR.

[0188] As células NIH3T3 que expressam ectopicamente o IGF-IR humano foram cultivadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 10000 células por poço e incubadas durante a noite num meio de inanição (carvão a 1% privado de FBS) . No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram gentilmente lavados duas vezes com PBS e foram adicionados 100 pL de meio sem soro (0% de FBS) para sujeitar as células a inanição. Após 1-2 horas, foram incubados 100 pL de meio sem soro com BSA 0,05% contendo IGF-I (10 nM) e IGF-II (10 nM) , durante 60 minutos a 37 °C, com várias concentrações de anticorpo, que foram adicionadas às células em triplicado. Foi deixada a ocorrer a estimulação durante 10 minutos a 37 °C, após a mesma, o meio foi removido e foram adicionados 100 uL de formaldeido a 3,7% em PBS/BSA a 3% a cada poço procedeu-se a uma nova incubação à TA durante 20 min. As células foram então lavadas 2X com PBS e adicionados 100 uL de tampão de permeabilização (Triton-X a 0,1% em BSA a 3%/PBS) a cada poço. Este foi deixado incubar à TA durante 10 minutos, descartado e foram adicionados 100 uL de peróxido de hidrogénio a 0,6% em 101 PBS/BSA a 3% para inactivar qualquer actividade da peroxidase endógena. Após uma incubação de 20min à TA, as células foram lavadas 3X com PBS/Tween-20 a 0,1% e bloqueadas através da adição de 100 uL de FBS a 10% em PBS/Tween-20 a 0,1% à TA durante 1 h. O tampão de bloqueio foi então removido e foram adicionados 50 uL do anticorpo anti-fosfo-IGFIR a 1 ug/mL (cat n.° 44-804, BioSource) a cada poço em FBS a 10%/PBS-T. Após uma incubação de 2 h à TA as células foram lavadas 3X com encharcamento com PBST durante 5 minutos entre cada lavagem. Após as lavagens foram adicionados 50 uL/poço de um anticorpo secundário de cabra anti-IgGFc-HRP de coelho diluído de 1:250 em tampão de bloqueio a cada poço. Após uma incubação de 1 hora à TA as células foram lavadas 3X durante 5 minutos com PBST como anteriormente e vedadas após a secagem. Foram então adicionados 50 uL de reagente ECL (DuoLux) e os RLU foram lidos imediatamente.

[0189] Foram rastreadas 32 linhas de anticorpos e realizados dois ensaios independentes para cada antigénio. Os resultados para os 10 primeiros anticorpos estão resumidos na Tabela 13 abaixo. TABELA 13. RESUMO DA INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO DE IGF-IR IGF DEPENDENTE EM CÉLULAS NIH3T3 |Resultados pTYR IGF-I (n=2) \Resultados pTYR IGF-II (n=2)

Activação MAX. % EC50 (nM) * \Activação MAX. % EC50 (nM) * ID mAb Média SD Média | SD \Média SD Média SD 7.159.2 16,5% 6,6% 7,4 1 0, 8 12 8,6% 5,4% 1 3, 1 — 0,2 7.34.1 14,2% 1, 8% 9,4 1 0, 8 |21,5% 3, 9% §2,5 0,1 7.146.3 19,5% 3,9% 19, 0 j 5,7 |23,6% 2,1% | 3, 6 0,2 102

Resultados pTYR IGF-I (n=2)

Resultados pTYR IGF-IX (n=2)

Activação MAX. % EC50 (nM) * 1Activação MAX. % EC50 (nM) * ID mAb Média SD Média SD !Média SD Média SD 7.251.3 16, 9% 5,4% 14,5 0,7 115,9% 1,5% 3, 0 0,9 7.234.2 21, 1% 3,0% 24,3 1,0 \21r1% 0,1% | 7,7 0,1 7.160.2 33, 6% 6,4% 22, 9 0,1 121,5% 0,6% 4,7 0,2 7.158.2 22,7% 0,9% 28,3 0,5 |33,7% 2,4% 11,3 3,2 7.56.3 31,3% 2,2% 25, 1 4,3 |21,2% 0,2% 6, 3 0,5 7.118.1 24,1% 5,2% 40, 8 2, 6 121,8% 3,2% 13, 9 5, 3 7.41.3 33,1% 6,1% 47, 1 7,0 129,5% 4,4% 3, 5 4,0 * Estes ensaios podem ser realizados sob condições limitantes de antigénio em função do mAb KD para IGF-I e IGF-II. EXEMPLO 13

INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO INDUZIDA PELO IGF-I E II DE CÉLULAS NIH3T3 TRANSFECTADAS COM HIGF-IR

[0190] Como discutido acima, um dos critérios para a neutralização de anticorpos IGF-I/II é a inibição da proliferação induzida pelo IGF. De modo a avaliar os anticorpos para a sua capacidade de inibição proliferação induzida pelo IGF foram usadas, no ensaio seguinte, células NIH3T3 que expressam ectopicamente hIGF-IR.

[0191] As células NIH3T3 que expressam ectopicamente hIGF-IR foram cultivadas numa placa de 96 poços numa densidade de 5000 células por poço e postas em cultura durante a noite em meio de inanição (carvão a 1% privado de FBS) . No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram lavados 103 gentilmente 2 vezes em meio sem soro e foram adicionados 100 pL deste meio para sujeitar as células à inanição. Foram adicionados às células 100 pL de meio de inanição que contém 15 ng/mL de IGFI ou 50 ng/mL de IGFII pré-incubado durante 30 minutos a 37 °C, com várias concentrações de anticorpo em duplicado ou triplicado. A seguir a 20 h de incubação as células são pulsadas com BrdU durante 2 h e o grau de incorporação (proliferação) foi quantificado usando o kit ELISA de Proliferação Celular da Roche (Roche, Cat n.° 1 647 229) .

[0192] Foi rastreado um total de 32 linhas de anticorpo e realizados dois ou três ensaios independentes para cada antigénio. Os resultados para os primeiros 10 anticorpos estão resumidos na Tabela 14, abaixo.

TABELA 14. RESUMO DA INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DEPENDENTE DE IGF DE CÉLULAS NIH3T3/hIGF-IR (Ensaio de Proliferação de IGF- Ensaio de Proliferação de IGF—I (II Inibição % EC50 (nM)* (Inibição % EC50 (nM)* .............. Média —--------- Média (Média ..................... Média ID mAb (n=3) SD (n=3) | SD |(n=2) (SD (n=2) SD 7.159.2 77,0% 9, 6% 24,1 15, 9 i 99,3% (0,6% 7,6 2,5 7.34.1 72, 6% 5, 6% 23, 4 1 8,1 i 73,6% (11,8% 16, 3 0,4 7.146.3 65,3% 5, 5% 37,2 [4,5 (82,0% (6, 9% 15, 9 3,4 7.251.3 72,4% 15,3% 38,9 1 4,3 (79,2% (7,8% 22, 0 3,7 7.234.2 67,3% 6, 9% 40,6 | 4,6 (62,1% (17,2% 24,3 2,4 7.160.2 62,8% 5, 7% 47,6 110,7 145,9% (0,8% 24,7 2,8 7.158.2 57,4% 19,5% 42,8 11,7 (54,6% (6, 6% 36, 0 4,2 7.56.3 50,2% 7, 8% 65, 7 {31,9 (48,0% (10,9% 38,3 7,5 104

Ensaio de Proliferação de IGF-I Ensaio de II Proliferação de IGF- Inibição % EC50 (nM) * Inibição % EC50 (nM)* ID mAb Média (n=3) SD Média (n=3) 1 SD Média (n=2) SD Média (n=2) SD 7.118.1 59,4% 14,5% 1626,6 1 2714,5 68,3% 0,8% 49, 9 3, 8 7.41.3 29,5% 14,7% 76,3 135, 9 51,9% 13,7% 61,9 23,7 * Estes ensaios podem ser realizados sob condições limitantes de antigénio em função do mAb KD para IGF-I e IGF-II. EXEMPLO 14 INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO INDUZIDA PELO IGF-I E IGF-II DE hlGF-IR EXPRESSO EM CÉLULAS DE TUMOR PANCREÁTICO HUMANO BxPC3 [0193] Os IGF-III exercem as suas funções de proliferação e anti-apoptose através activação da actividade do receptor de tirosina cinase no receptor IGF-IR. De modo a avaliar os anticorpos quanto à sua capacidade em inibir fosforilação de IGF-IR induzida pelo IGF foram usadas, no ensaio seguinte, células do tumor pancreático humano BxPC3, que expressam hlGF-IR endógeno.

[0194] As células BxPC3 foram cultivadas numa placa de 96 poços numa densidade de 55000 células por poço e incubadas durante a noite num meio de crescimento regular. No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram lavados gentilmente 2 vezes em meio sem soro e foram adicionados 1000 pL deste meio para sujeitar as células à 105 carência nutritiva. Após 24 horas, o meio foi descartado e as células foram lavadas gentilmente 1 vez em meio sem soro. 0 meio sem soro com BSA 0,05% que contém quer IGF-I (20 ng/mL) quer IGF-II (75 ng/mL) foi pré-incubado durante 30 minutos a 37 °C, com várias concentrações e depois foram adicionados 100 pL às células, em triplicado. As placas foram incubadas durante 15 minutos a 37 °C e foram subsequentemente enxaguadas com PBS frio. Foram adicionados 100 pL de tampão de lise aos poços e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 4 °C. Os lisados foram centrifugados a 2000 rpm durante 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi recolhido. A fosforilação de IGF-IR foi quantificada usando o kit ELISA Duoset human phosphor-IGF-IR (R&D Systems, Cat. N.° DYC1770).

[0195] Foram rastreadas 10 linhas de anticorpo e realizados dois ensaios independentes para cada antigénio. Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 15, abaixo.

TABELA 15. RESUMO DA INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO DE IGF-IR DEPENDENTE DO IGF |Resultados pTYR IGF-I (n=2) jResultados pTYR. IGF-II (n=2) \n=l n=2 n=l n=2 \Inibição Inibição Inibição Inibição 5 EC50 EC50 EC50 SEC50 mAb ID SMax % Max % Max % Max % : (nM) (nM) (nM) | (nM) \ (333,3 nM) (333,3 nM) (333,3 nM) (333,3 nM) | 7.159.2 jlOO, 0 3, 3 100,0 1,6 100,0 1,6 91,2 11,7 7.34.1 1100,0 5, 9 98,5 3, 8 100,0 2,0 89,7 11,9 7.146.3 |96,4 16, 1 94,2 10,7 100,0 2,0 87,9 12,0 7.251.3 |95,7 7,5 95,2 5, 3 100,0 N,D, 91,3 12,6 7.234.2 197,3 5, 1 91,5 2,9 98,5 1, 9 77,3 12,3 7.160.2 | 93,4 5, 3 89,2 3,1 88,6 1,7 73,2 12,5 106 SResultados pTYR IGF-I (n=2)

Resultados pTYR IGF-II (n=2) jn=l n=2 n=l n=2 jInibição mAb ID |Max % |(333,3 nM) EC50 (nM) Inibição Max % (333,3 nM) EC50 (nM) Inibição Max % (333,3 nM) EC50 (nM) Inibição | |EC50 Max % s \ (nM) (333,3 nM) \ 7.158.2|92,9 4,5 89,4 3, 6 92,4 N, D, 74,0 | 4,2 7.56.3 |84,9 N,D, 88,7 6,5 91,4 10,1 66,2 | 5,1 7.118.1|90,5 13, 1 90,6 11, 8 95,7 17, 9 78,0 §13,1 7.41.3 | 8 8,6 6, 5 86,5 6,5 88,6 4,5 70,6 | 3,1 *333 nM para os últimos 3 anticorpos. N.D.: Não determinado EXEMPLO 15 INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO INDUZIDA PELO IGF-I E II DAS CÉLULAS DO TUMOR PANCREÁTICO HUMANO BxPC3 [0196] Como discutido acima, um dos critérios para a neutralização de anticorpos IGF é a capacidade de inibir a proliferação induzida por IGF. De modo a avaliar os anticorpos quanto à sua capacidade para inibir a proliferação induzida pelo IGF foram usadas, no ensaio seguinte, células do tumor pancreático humano BxPC3, que expressam hIGF-IR endógeno.

[0197] As células BxPC3 foram cultivadas numa placa de 96 poços numa densidade de 2000 células por poço e postas em cultura durante a noite num meio de crescimento regular. No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram gentilmente lavados 2 vezes em meio sem soro e foram adicionados 100 pL de meio sem soro com 10 pg/mL de 107 transferrina e BSA a 0,1% (meio de ensaio) às células sem nutrientes. Após 24 horas, o meio foi descartado, as células foram gentilmente lavadas 1 vez em meio sem soro e foram adicionados às células 100 pL de meio de ensaio que contém 20 ng/mL de IGF pré-incubados durante 30 min a 37 °C com várias concentrações de anticorpo, em duplicado ou triplicado. As placas foram incubadas durante 3 dias e a proliferação foi quantificada usando o reagente CellTiter-Glo (Promega).

[0198] Foram rastreadas 10 linhas de anticorpos e realizados 2 ou 3 ensaios independentes para cada antigénio. Os resultados estão resumidos na Tabela 16, abaixo. Com base nos dados funcionais abaixo fornecidos e nos dados obtidos a partir do Exemplo 14, foram seleccionados os 4 melhores anticorpos. Os dados do ensaio proliferação induzida pelo IGF-I foram excluídos dos critérios de escolha devido à elevada variabilidade de ensaio observada. TABELA 16. RESUMO DA INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃO DEPENDENTE DO IGF DAS CÉLULAS DE TUMOR PANCREÁTICO HUMANO BxPC3 \Resultados da Proliferação de IGF- -II (n=2) jn=l n=2 1 Inibição Max ID MAb 1 % (333,3 EC50 Inibição Max % (333,3 EC50 |M) ΐ (M) M) (nM) 7.159.2 1120,0 jo, 8 118,3 0,9 7.34.1 1117,0 jo, 5 109, 0 6,7 7.146.3 1128,7 13, 0 119,5 7,3 7.2513 112 8,5 jo, 5 105,3 4,4 7.234.2 1111,7 jc 200,7 2,6 7.160.2 179,7 jl,l 155,7 N.D. 7.158.2 | 86,3 jo,0013 148,3 N.D. 108 IResultados da Proliferação de IGF-II (n=2) !n=l n=2 ;Inibição Max % ID MAb j jM) (333,3|eC50 | (M) Inibição M) Max % (333,3 |eC50 (nM) 7.56.3 j 87,0 |n.d. 112,3 -----------------™ 1102,0 7.118.1 1114,0 | 34,0 137,0 1 54,7 7.41.3 1102,0 |n.d. 73, 0 ÍN.D. *333 nM para os 3 últimos anticorpos N.D.: Não determinado ID MAb EXEMPLO 16

DETERMINAÇÃO DA REACTIVIDADE CRUZADA COM IGF-1. IGF-II E INSULINA DE RATINHO

[0199] Um objectivo foi o de desenvolver anticorpos específicos para o IGF-I II sem reactividade cruzada com a insulina. De modo a realizar experiências adicionais em animais, os anticorpos também devem ter reacção cruzada com IGF—I/II murino mas não com insulina murina. Desse modo, foram concretizados os ensaios ELISA para determinar se os anticorpos seleccionados eram capazes de ter uma reacção cruzada com os IGF ou insulina de murino.

[0200] Como apresentado na Tabela 17, 5 dos primeiros 10 anticorpos foram testados para a reactividade cruzada com insulina de ratinho ou rato por ELISA. Os ELISA mostraram que estes anticorpos não tinham reactividade cruzada com insulina de ratinho ou rato, quando comparado com o anticorpo de 109 controlo negativo PK16.3.1, em contraste com o anticorpo anti-insulina de rato de controlo positivo.

TABELA 17. REACTIVIDADE CRUZADA COM INSULINA DE RATINHO OD 450 com Ag diferentes

Anticorpos Insulina de ratinho Insulina de rato íSem Ag 7.159.2 0,52 0,52 | 0,56 7.160.2 0,60 0,57 |θ, 62 7.34.1 O co 0,47 1 0,55 7.251.3 0,55 0,53 jjO, 56 7.234.2 0,51 0,49 jjO, 66 Soro 1,28 1,23 |l, 34 Anti-Insulina de Rato 2,52 3, 06 |0,10 PK16.3.1 0,58 0,58 |θ, 62 EXEMPLO 17 INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO INDUZIDA POR IGF-I E IGF-II DE RATINHO DE IGF-IR HUMANO ECTOPICAMENTE EXPRESSO EM CÉLULAS NIH3T3 [0201] Os anticorpos monoclonais com reactividade cruzada com IGF-I e IGF-II de ratinho foram ainda testados de modo a determinar a extensão da sua inibição da fosforilação induzida por IGF de IGF-IR. Este ensaio foi realizado como descrito anteriormente usando células NIH3T3 que expressam ectopicamente o receptor hIGF-IR. Os resultados deste ensaio estão resumidos na Tabela 18.

[0202] As células NIH3T3 que expressam ectopicamente o IGF-IR humano foram cultivadas numa placa de 96 poços numa densidade 110

de 10000 células por poço e incubadas durante a noite num meio de inanição (carvão a 1% privado de FBS) . No dia seguinte, o meio de crescimento foi descartado, os poços foram gentilmente lavadas 2 vezes com PBS e foram adicionados 100 pL de meio sem soro (FBS a 0%) para sujeitar as células à inanição. Após 1-2 horas, foram adicionados às células 100 uL de meio sem soro com BSA a 0,05% que contém IGF-I (10 nM) e IGF-II (10 nM) de ratinho (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN Cat. N.° 791-MG e 792-MG respectivamente) que foi pré-incubado durante 60 minutos a 37 °C com várias concentrações de anticorpo, em triplicado. A estimulação foi deixada a ocorrer durante 10 minutos a 37 °C e, após a estimulação, o meio foi removido e foram adicionados 100 uL de formaldeído a 3,7% em PBS/BSA a 3% a cada poço e incubados à TA durante 20 min. As células foram então lavadas 2X com PBS e foram adicionados 100 uL de tampão de permeabilização (Triton-X 0,1% em BSA a 3%/PBS) a cada poço. Este meio foi deixado a incubar à TA durante 10 min, descartado e foram adicionados 100 uL de peróxido de hidrogénio a 0,6% em PBS/BSA a 3% para inactivar qualquer actividade da peroxidase endógena. Após uma incubação de 20 minutos à TA, as células foram lavadas 3X com PBS/Tween-20 a 0,1% e bloqueadas através da adição de 100 uL de FBS a 10% em PBS/Tween-20 a 0,1% à TA durante 1 h. O tampão de bloqueio foi então removido e foram adicionados 50 uL do anticorpo anti-f os f o-IGF IR a 1 ug/mL (cat n.° 44-804, BioSource) a cada poço em FBSa a 10%/PBS-T. Após uma incubação de 2 h à TA, as células foram lavadas 3X com PBST e ensopadas durante 5 minutos entre cada lavagem. Após as lavagens foram adicionados 50 uL/poço de um anticorpo secundário de cabra anti-IgGFc-HRP de coelho diluído de 1:250 em tampão de bloqueio a cada poço. Após uma incubação de 1 hora à TA as células foram lavadas 3X 111 durante 5 minutos com PBST como anteriormente e vedadas após a secagem. Foram, então, adicionados 50 uL de reagente ECL (DuoLux) e as RLU foram lidas imediatamente.

TABELA 18. INIBIÇÃO DA FOSFORILAÇÃO DE hIGF-IR INDUZIDA PELO IGF DE RATINHO SEC50 de IGF-I Ratinho (nM) |EC50 de IGF-I Ratinho (nM) ID mAb \n=l jn=2 jn=l n=2 7.159.2 |2,8 | 5, 7 13,1 5, 0 734.1 16, 0 110,2 i 4,0 9,7 7.251.3 16, 7 110,6 |5,4 8,7 7.234.2 14 6, 0 5 i 36, 1 7.160.2 14 9, 5 5 i 225,2 EXEMPLO 18

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DAS CÉLULAS NIH3T3 QUE EXPRESSAM IGF-II E IGF-1R IN VIVO EM RATINHOS SEM PÊLO

[0203] De modo a avaliar os anticorpos para a sua capacidade em inibir a proliferação induzida por IGF-II in vivo, foram realizadas as seguintes experiências.

[0204] Os ratinhos sem pêlo fêmea de 6-8 semanas (fornecidos por Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) foram implantados subcutaneamente com 5xl06 células do Clone 32 (células NIH3T3 que sobrexpressam ectopicamente IGF-II humano e IGF-1R humano). As células foram suspensas em PBS num volume de inoculo total de 330 pL. Os tumores foram deixados a crescer para 100-200 mm3 antes do tratamento com anticorpos monoclonais 7.159.2, 7.34.1 e 7.251.3. Os anticorpos ou o 112 anticorpo de controlo do isotipo de IgG2 suspensos em PBS foram administrados intraperitonialmente semanalmente a grupos aleatórios de 9 ou 12 ratinhos durante 4 semanas a 5 ou 50 mg/kg, a partir do dia 22. Foi administrado PBS semanalmente como um veiculo de controlo a um grupo adicional de 11 ratinhos durante 4 semanas, a partir do dia 22. O tamanho do tumor e o peso corporal foram medidos 2-3 vezes por semana. Os resultados encontram-se resumidos nas Figuras 1 e 2.

[0205] Foi observada uma considerável inibição do crescimento tumoral (ver a Figura 1) sem uma perda de peso significativa em qualquer dos grupos (ver a Figura 2). Os anticorpos 7.159.2, 7.34.1 e 7.251.3 inibiram significativamente o crescimento de tumores do Clone 32 a 5 e 50 mg/kg/semana (ver Figura 1). EXEMPLO 19

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE CÉLULAS NIH3T3 QUE EXPRESSAM IGF-I E IGF—IR IN VIVO EM RATINHOS SEM PÊLO

[0206] No exemplo anterior, os anticorpos mostraram inibir a proliferação induzida por IGF-II in vivo. De modo a avaliar os anticorpos quanto à sua capacidade para inibir a proliferação induzida por IGF-I in vivo, foram realizadas as seguintes experiências.

[0207] Os ratinhos sem pêlo fêmea (estirpe Alderley Park derivada da estirpe de ratinhos sem pêlo/sem pêlo Swiss, fornecidos pela AstraZeneca) foram implantados com 5xl06 células P12 viáveis [células NIH3T3 que sobrexpressam ectopicamente IGF-I humano e IGF-1R humano (Pietrzkowski et al., Cell Growth & Differentiation, 3, 199-205, 1992) 113 subcutaneamente no flanco esquerdo. As células foram suspensas em PBS num volume de inoculo total de 0,1 mL. Dois grupos de animais (cada n=10) foram doseados duas vezes por semana a partir do dia de implante das células NIH3T3, quer com mAb 7.159.2 a 1,0 mg por ratinho quer com um volume equivalente do veiculo PBS (0,3 mL) com a mesma programação. Todas as doses foram dadas por via intraperitoneal (i.p.). Os pesos corporais dos animais foram medidos diariamente e, uma vez estabelecidos, as medições de tumor foram tomadas duas vezes por semana utilizando calibradores. Foi calculado o volume para todos os tumores mensuráveis a partir das medições do calibrador, assumindo uma forma ovoide. Os resultados estão resumidos na Figura 3.

[0208] Como mostra a Figura 3, foi observada uma a inibição considerável do crescimento do tumor com o mAb 7.159.2 após a administração i.p. bissemanal de 1,0 mg de anticorpo/ratinho. Não foi observada uma perda significativa de peso corporal em qualquer dos grupos de animais. EXEMPLO 20

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR DO TUMOR EM PACIENTES HUMANOS

[0209] Um grupo de doentes oncológicos humanos diagnosticados com cancro pancreático foi dividido em grupos de tratamento de forma aleatória. Cada grupo de pacientes é tratado semanalmente com injecções intravenosas dos mAb 7.159.2, 7.34.1 ou 7.251.3 aqui descritos. Cada doente é doseado com uma quantidade eficaz do anticorpo num intervalo de 50 mg/kg a 2250 mg/kg, durante 4-8 semanas. A um grupo de controlo foi dado apenas um regime quimioterapêutico padrão. 114 [0210] Em intervalos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga tumoral é avaliada por imagiologia de ressonância magnética (IRM). Descobriu-se que os pacientes que receberam semanalmente o tratamento com os anticorpos mAb 7.159.2, 7.34.1 ou 7.251.3 apresentaram reduções consideráveis a nivel da dimensão tumoral, quando comparados com os pacientes que não receberam o tratamento com o anticorpo. Em alguns pacientes tratados, os tumores não eram detectáveis. Pelo contrário, o tamanho do tumor aumentou ou permaneceu substancialmente o mesmo no grupo de controlo. EXEMPLO 21

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR TUMORAL EM DOENTES HUMANOS

[0211] Um doente humano é diagnosticado com um tumor maligno. 0 doente é tratado semanalmente com injecções intravenosas de mAb 7.159.2. durante 8 semanas. Em intervalos periódicos, durante e após o regime de tratamento, a carga tumoral é avaliada por imagiologia de ressonância magnética (IRM). Foram constatadas reduções significativas no tamanho tumoral. EXEMPLO 22

TRATAMENTO DA ACROMEGALIA NUM PACIENTE HUMANO

[0212] Um adulto do sexo masculino é diagnosticado com acromegalia. 0 paciente é tratado bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.34.1. durante um periodo de 2 anos. Como resultado, o doente experimenta uma redução significativa nos sintomas da acromegalia. EXEMPLO 23 115

TRATAMENTO DA PSORÍASE NUM DOENTE HUMANO

[0213] Um adulto do sexo feminino é diagnosticado com psoriase severa. A doente é tratada bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.251.3. durante um período de 3 semanas. Como resultado, a doente experimenta uma redução significativa nos sintomas da psoriase. EXEMPLO 24

TRATAMENTO DA OSTEOPOROSE NUM DOENTE HUMANO

[0214] Um adulto do sexo feminino é diagnosticado com osteoporose. A doente é tratada bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.159.2, durante um período de 1 ano. Como resultado, a doente experimenta uma redução significativa na perda da densidade óssea. EXEMPLO 25

TRATAMENTO DA ATEROSCLEROSE NUM DOENTE HUMANO

[0215] Um adulto do sexo masculino é diagnosticado com aterosclerose. O doente é tratado bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.34.1, durante um período de 1 ano. Como resultado, o doente experimenta uma redução significativa nos sintomas da aterosclerose, como a angina de peito. EXEMPLO 26

TRATAMENTO DA REESTENOSE NUM DOENTE HUMANO 116 [0216] Um adulto do sexo masculino recebe uma angioplastia para libertar uma artéria bloqueada. Após o procedimento de angioplastia. 0 paciente é tratado bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.251.3, durante um período de 1 ano. Como resultado, o doente não é afectado pela reestenose da artéria tratada. EXEMPLO 27

TRATAMENTO DA DIABETES NUM DOENTE HUMANO

[0217] Um adulto do sexo feminino é diagnosticado com diabetes. A doente é tratada bissemanalmente com injecções intravenosas do mAb 7.159.2. durante um período de 1 ano. Como resultado, os sintomas da diabetes são reduzidos.

SEQUÊNCIAS

[0218] Os hibridomas sub-clonados foram sequenciados para determinar a sua estrutura primária, tanto ao nível dos nucleótidos como ao nível dos aminoácidos para os dois genes das cadeias variáveis pesada e leve. As sequências de nucleótidos e polipéptidos das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais contra o IGF-I e IGF-II, conforme mencionado na Tabela 1, são fornecidos na Listagem de Sequências.

EQUIVALENTES

[0219] A especificação precedente é considerada como sendo suficiente para permitir a um especialista na área praticar a invenção. A descrição e exemplos precedentes detalham 117 determinadas modalidades preferidas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Deverá ser apreciado, no entanto, que independentemente de quão detalhado esteja o texto precedente, a invenção pode ser praticada de várias formas e deve ser construida de acordo com as reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0220] <110> Raeber, Olivia Gazit-Bornstein, Gadi Yang, Xiaodong Cartlidge, Susan Ann Tonge, David William

<120> PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO ESPECÍFICAS PARA FACTORES DE CRESCIMENTO INSULÍNICO E SUAS APLICAÇÕES

<130> ABXAZ.004VPC <160> 102 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0 <210> 1 <211> 372 <212> DNA <213> Humano 118 <400> 1 cttcggagac cctgtccctc 60 actactgggg ctggatccgc 120 attatagtgg gagcacctac 180 acacgtccaa gaaccagttic 240 tgtattactg tgcgagacaa 300 gccgtggcac cctggtcact 360 cagctgcagc tgcaggagtc acctgcactg rctctggtgg cagcccccag ggaaggggct tacaacccgt ctctcaagag tccctgaagc tgagctccgt aggggrcata gcagtggctg gtctcctcag cc gggcccagga ctggtgaagc ctccatcagg agtagtagtr ggagtggatt gggggtatct rcgagtcacc atgtccgtag gaccgccgca gacacggctg gtggtacttc gatctctggg <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Humano <400> 2

Gin Leu Gin Leu Gin e Glu ser Gly Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val 20 Gly Ile Ser Tyr Tyr ÓC Trp Trp Arg 40 Trp lie rn 3 3 Gly Gly lie Tyr Tyr Ser Leu SU Lys Ser Arg Vai Thr Met Ser 65 70 ser Leu Lys Leu Ser Ser Vai Thr 85 Gly cys Ala Arg Gin Arg Hi s ser 100 Thr Trp cly Arg Gly Thr Leu val 115 120

Pro Gly Leu val Lys pro Ser Gl u 10 15 Ser Gly Gly ser ile Arg ser Ser 25 30 Gin Pro pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Ser Thr W Tyr Asn Pro Ser val Asp Thr Ser Lys Asn Gin phe 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala val Tyr Tyr 90 95 ser inc Gly Trp Trp Tyr phe 110 Asp Leu Val Ser 5er Ala Α.ΧΛ/ <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Humano <400> 3 gacatccaga tgacccagtc nccatcttcc atcacttgrc gggcgagtca gggtat-tagc gggaaagccc ctaaactcct gatctargct aggttcagcg gcaatggatc tgggacagat gtgrctgcat ctgtaggaga cagtgtcacc 60 agcracttag cctggtatca gcagaaacca 120 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gggaccaaag tggatatcaa acga gctaacaatt tcccattcac tttcggccct 300324 <210> 4 <211> 108 119 <212> PRT <213> Humano <400> 4

Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser val Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 ile 15 ASP ser vai Thr Xle Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ser Ser Tyr 20 25 30 ile Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 phe Gly Tyr Ala Ala ser ser Leu Gin ser Gly Val pro Ser Arg Ser 50 55 60 Gin Asn Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leit Pro 65 70 75 Phe 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gl n Gin Ala Asn Asn pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly pro Gly Thr Lys val ASP lie Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 363 <212> DNA <213> Humano <400> 5 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 120 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagxggtaa cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accaggaaca cctccataag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaccct 300 tactactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 gcc <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Humano 120 <4Ο0> 6

Gin val 1 Gin Leu val 5 Gin Ser dy Ser Val Lys Val 20 Trp Ser cys Lys Ala ASP He Asn 35 val Arg Gin Ala 40 Gly Trp 50 Met Asn pro Asn Ser 55 Gly Gin Gly Arg 65 val Thr Met 70 Thr Arg Met Glu Leu ser Ser 85 Tyr Leu Arg Ser Ala Arg A5p Pro 100 val Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr 115 Thr Val ser Ser 120

Ala Glu 10 val Lys Lys Pro Gly 15 Ala Ser 25 Gly Tyr Thr phe Thr 30 Ser Tyr Thr Gly Gin Gly Leu 45 Ala Glu Trp Met Asn Thr Gly Tyr 60 lie Gin Lys Phe Asn Thr Ser 75 Ser Thr Ala Tyr 80 Glu ASp 90 Thr Ala val Tyr Tyr 95 Cys Tyr 105 Ala Gly Met ASp val Trp 110 Gly Gin <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Humano gccctcagtc tctgcggccc caacattgag aataatcatg cctcatttat gacaataata gtctggcacg tcagccaccc ttactgcgaa acatgggata gctgaccgtc ctaggt <400> 7 cagtctgtgt tgacgcagcc tcctgctctg gaagcagctc ccaggaacag cccccaaact gaccgattct ctggctccaa actggggacg aggccgatta gtattcggcg gagggaccaa caggacagaa ggtcaccatc 60 tàtcctggta ccagcagctc 120 agcgaccctc agggattcct 160 tgggcatcac cggactccag 240 ccagcctgag tgctggccgg 300 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <400> 8

Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser vai ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 5 1° ·*>

Lys VaT Thr xle Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn He Glu Asn Asn 20 25 í'»

His val ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40

Xle Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro ser Gly Xle Pro Asp Arg Phe ser

Gly ser Lys ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin

Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr cys Glu Thr Trp Asp Thr ser Leu

Ser Ala Gly Arg val Phe Gly Gly Thr Lys Leu Thr val Leu Gly 121 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Humano <400> 9 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaggg gactggagtg gattggctat ttcttttaca gtgggtacac caactacaac 180 ccctccctca agagtcgcgt caccatgtca gttgacacgt ccaagaacca gttctctctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgtg tataactgga 300 acgacgaagg ggggtatgga egtctggggc caaggggcca cggtcaccgt ctcctcagcc 360 <210> 10 <211> 120 <212> PRT <213> Humano <400> 10

Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly ΡΓΟ Gly Leu val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 Ile 15 Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val ser Gly Gly ser ser ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp ser 3 C Trp He Arg Gin ΡΓΟ ao Pro Gly Arg Gly Leu 45 Glu Trp ile Gly Tyr 3 3 Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 Thr 60 Gl n Ser Arg vai Thr Met Ser val Asp Ser Lys Asn Phe Ser Leu 65 70 75 Val 80 Lys Leu ser ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Tyr Tyr Cys Ala 85 Gly 90 95 cys Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly 100 Ala 105 110 Ala Thr val Thr val ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 336 <212> DNA <213> Humano <400> 11 cagtctgtgc tgacgcaggc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagaagttc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120 tttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat caetgggete 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagtct gagtggttcg 300 gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336 122 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 12

Gin ser vai Leu Thr Gin Ala Pro 1 5

Arg vai Thr rle ser cys Thr Gly 20

Tyr Asp vai His Trp Tyr Gin Gin 35 40-

Leu lie Tyr Gly Asn ser Asn Arg 50 55

Ser Gly Ser Lys ser Gly Thr ser 65 70

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 85

Leu Ser Gly ser vai Phe Gly Gly 100 ser vai ser Gly Ala Pro Gly Gin 10

Arg ser ser Asn lie Gly Ala Gly 25 30

Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 45 pro ser Gly vai Pro Asp Arg Phe

Ala ser Leu Ala He Thr Gly Leu 75 80

Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp ser Ser 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly 105 HO <210> 13 <211> 360 <212> DNA <213> Humano <400> 13 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga acctgcactg rcrctggtgg ctccatcagt ccagggaagg gactggagtg gattgggtat ccctccctca agagtcgagc caccatatca aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg acgacgaagg ggggtatgga cgtctggggc ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 agttactacT ggagctggat ccggcagccc 120 ttcttttaca gtgggtaeac caactacaac 180 gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 gccgtgtatt actgtgcgtg tataactgga 300 caagggacca cggtcaccgt ctcctcagcc 360 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Humano 123 <400> 14

Gin val Gin Leu Gin Glu 1 5 Thr Leu Ser Leu Thr Cys 20 ile Tyr Trp Ser 35 Phe Trp Arg Gly Tyr 50 Arg Phe Tyr Ser ser val Thr Ile Ser 65 val 70 Lys Leu Ser Ser Thr 85 Cys Ile Thr Gly Thr Thr

Ser Gly pro Gly 10 Gly Leu Val Thr val Ser Gly ser 25 Gly Gin Pro pro Gly Lys 40 Gly Tyr 55 Thr Asn Tyr Asn 60 val Asp Thr ser Lys 75 Ala Asn Ala Ala Asp Thr val 90 val Lys Gly Gly Met ASp

Lys Pro Ser Glu ISIle ser ser Tyr 30 Leu Glu Trp ile 45 Pro Ser Leu Lys Gin phe ser Leu 80 Tyr Tyr cys Ala 95 Trp Gly Gin Gly 110 100 105

Thr Thr Vai Thr vai Ser Ser Ala 115 120 <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Humano <4 0 0> 15 cagtctgtac tgacgcagcc gccctcagtg tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg cttccaggaa cagcccccaa gctcctcatc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc caggctgatg atgaggctga ttattactgc gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 gcaggrtatg atgtacactg gtaccagcag 120 tatggtaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180 acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 cagtccrttg acagcagtct gagtggttcg 300 ctaggt 336 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 16

Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro 1.5 Arg vai Thr Ile Ser Cys Thr Gly 20

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin 35 40

Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg 50 55 ser Gly ser Lys ser Gly Thr ser 65 70

Gin Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr 85

Leu ser Gly ser val Phe Gly Gly 100

Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 10 15

Ser ser ser Asn ile Gly Ala Gly 25 30

Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 45

Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 60

Ala ser Leu Ala ile Thr Gly Leu 75 80

Tyr cys Gin ser Phe Asp Ser Ser 90 95

Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 124 <210> 17 <211> 372 <212> DNA <213> Humano <400> 17 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga acctgcactg tctctggtgg ctccatcaac cagcccccag ggaagggact ggcgrggatt tacaacccgt ccctcaggag tcgagtcacc tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca aggggtcaca gcagtggctg gtggtacttc gtctcctcag cc ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 agtagtagta actactgggg ctggatccgc 120 gggggcatcr attatagtgg gagcacctac 180 atgtccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 gacacggctg tatattactg tgcgagacaa 300 gatctctggg gccgtggcac cctggtcact 360 <210> 18 <211> 124 <212> PRT <213> Humano <400> 18 Gln Leu 1 Gin Leu Gl n S Glu . Ser Gly Pro Gly 10 Leu val Lys pro ser 15 Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly ser ile Asn Ser Ser Ser Asn Tir 20 Trp Gly Trp Ile Arg 40 2S Gin pro Pro Gly Lys 45 30 Gly Leu Ala Trp xle 50 Gly Gly ile Tyr Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg vai Thr Met ser val ASp Thr ser Lys Asn Gin Phe 63 70 75 Ala val 80 Ser Leu Lys Leu ser Ser vai Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Tyr 85 90 Phe 110 95 Leu Cys Ala Arg Gin 100 Arg Gly His ser Ser 105 Gly Trp Trp Tyr ASp Trp Gly Arg Gly Thr Leu vai Thr Val Ser ser Ala 113 120 <210> 19 <211> 324 <212> DNA <213> Humano 125 <4 Ο 0> 19 gacaiccaga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcactrgtc gggcgagtcg gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagagacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatact gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagat-c-ttg caacttacta ftgtcaacag gcxaacagtt tcccattcac tfccggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa acga 324 <210> 20 <211> 108

<212> PRT <213> Humano <400> 20

Ser vai ser Ala ser vai Gly 10 15 Ser Arg Gly Ile Ser Ser Trp 30 Lys Ala pro Lys Leu Leu Ile 45 vai pro ser Arg phe ser Gly 60 Thr Ile ser ser Leu Gin pro 75 80 Gin Ala Asn Ser Phe Pro Phe 90 95 ile Lys Arg

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5

Asp Arg vai Thr He Thr Cys Arg Ala 20 25

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly 35 40

Tyr Thr Ala ser Ser Leu Gin ser Gly 50 55

Ser Gly Ser Gly Thr Asp phe Thr Leu 65 70

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin 85

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys vai Asp 100 io§ <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <400> 21

Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Humano <400> 22

Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 126 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <400> 23

Ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp Vai 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Humano <400> 24

Thr Gly Ser ser ser Asn He Gly Ala Gly Tyr Asp vai His 15 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <400> 25

Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <400> 26

Gin Ser Phe Asp Ser Ser Leu ser Gly ser vai 15 10 <210> 27 127 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <400> 27

Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Humano <400> 28

Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <400> 29 lie Thr Gly Thr Thr Lys Gly Gly Met Asp vai 15 10 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Humano <400> 30

Thr Gly Arg Ser ser Asn ile Gly Ala Gly Tyr Asp vai His 15 10 128 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <400> 31

Gly Asn Ser Asn Arg pro ser 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <400> 32

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Vai X 5 10 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <400> 33

Ser Tyr Asp lie Asn 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Humano <400> 34

Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 S 10 15

Gly 129 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 35 ASp ΡΓΟ ι Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp vai 1 5 10 <210 > 36 <211> 13 <212> PRT <213> Humano <400> 36 Ser Gly Ser ser ser Asn ile Glu Asn Asn Hi 5 vai 1 5 10 <210 > 37 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 37 Asp Asn 1 Asn Lys Arg ΡΓΟ Ser <210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Humano 130 <400> 38 vai

Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu ser Ala Gly Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 594 <212> DNA <213> Humano <400> 39 ctcccagatg ggtcctgtcc 60 cttcggagac cctgtccctc 120 actactgggg ctggatccgc 180 attatagxgg gagcaccxac 240 acacgtccaa gaaccagttc 300 tgtattactg tgcgagacaa 360 gccgtggcac cctggxcact 420 tggcgccctg ctccaggagc 480 actacttccc cgaaccggtg 540 acaccttccc agct 594 accatgaaac atctgtggtt cttcctcctg ctggtggcgg cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagg agtagtagtr cagcccccag ggaaggggcr ggagtggart gggggtatct tacaacccgt ctctcaagag tcgagtcacc atgtccgtag tccctgaagc tgagctccgt gaccgccgca gacacggctg aggggtcata gcagtggctg gtggtacttc gatctctggg gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggteaagg acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc <210> 40 <211> 198 <212> PRT <213> Humano <400> 40

Thr Met Lys His Leu Trp phe Phe Leu Leu Leu 1 5 10 Trp val Leu Ser Gin Leu Gin Leu Gin Gl u ser 20 25 Thr Lys pro ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr cys 35 40 Ile Ile Arg 50 Gly Ser Ser Ser Tyr Tyr 55 Gly Trp Gly Trp Lys 65 Tyr Leu GlU Trp Ile 70 Lys Gly ile Tyr Kr Asn pro Ser Leu ser Arg val Thr Met 85 90 val Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser 100 105 Gly His Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gin Arg 115 120 val Tyr phe Asp Leu Trp Gly Ãrg Gly Thr Leu 130 135 Ala 155 Ser 145 Thr Lys Gly Pro ser 150 val Phe Pro Leu Thr Ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu 165 170

Val Ala Ala pro 15 Arg Gly Pro Gly 30 Gly Leu val val ser 45 Gly ser Arg 60 Ser Gin pro Pro Gly Gly Ser Thr llr Ser val Asp Thr 95 Asp ser Thr Ala Ala 110 Thr Ser Ser 125 Gly Trp Trp Thr 140 val ser Ser Ala pro Cys Ser Arg Ser 160 phe Val Lys ASp Tyr 175

Pro Glu Pro val Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly 180 185 190

Val His Thr Phe pro Ala 195 131 <210> 41 <211> 419 <212> DNA <213> Humano <400> 41 atgagggtcc ctgctcágct ccxggggctc gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc atcacttgtc gggcgagxca gggtattagc gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct aggttcagcg gcaatggatc tgggacagat gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg ctgctgctct ggttcccagg ttccagatgc 60 gtgtctgcat ctgtaggaga cagtgtcacc 120 agctacttag cctggtatca gcagaaacca 180 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gctaacaatt tcccattcac tttcggccct 360 gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcc 419 <210> 42 <211> 139 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 42 Met 1 Arg Vai Pro Ala 5 Gin Leu Leu Gly ser Arg ÍF Gly ASp 11 e Gin Met Ala Ser vai 35 Asp ser vai Thr 40 rle Ser 50 Ser Tyr Leu Ala Trp 55 Tyr Lys 65 Leu Leu lie Tyr Ala 70 Ala ser Arg Phe Ser Gly Asn Gly fZQ Ser Gly ser Leu Gin Pro 100 Glu Asp phe Ala Asn phe Pro 115 Phe Thr Phe Gly Pro 120 Thr vai 130 Ala Ala Pro Ser vai 135 Phe

Gly Leu 10 Leu Leu Leu Trp Phe 15 Pro Thr 25 Gin Ser Pro Ser ser 30 vai Ser Ile Thr Cys Arg Ala 45 Gly Ser Gin Gly Gin Gin Lys Pro 60 Lys Ala Pro Ser Leu Gin 75 Ser Gly vai Pro ser 80 Thr Asp 90 phe Thr Leu Thr Ile 95 Ser Thr 105 Gly Ile Tyr Tyr Cys Gin Gin 110 Ala Asn Thr Phe Lys Pro vai ASP 125 Ile Lys Arg <210> 43 <211> 437 <212> DNA <213> Humano 132 <4Ο0> 43 accatggact ggacctggag gatcctcttc caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag tcctgcaagg cttctggata caccttcacc actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg atggagctga gcagcctgag atctgaggac tactactact actacggtat ggacgtctgg gcctccacca agggccc ttggtggcag cagctacaag tgcccactcc 60 gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120 agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 180 atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 240 accaggaaca cctccataag cacagcctac 300 acggccgtrgt attactgtgc gagagaccct 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 437 <210> 44 <211> 145 <212> PRT <213> Humano <400> 44

Thr Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Vai Ala Ala Ala Thr 1 Al a Hi S 5 10 15 Ser ser 20 Gin vai Gl n Leu val 25 Gin ser Gly Ala Glu 30 val Lys Lys Pro Gly 35 Ala ser vai Lys vai 40 ser cys Lys Ala Ser 45 Gly Tyr Thr Phe Thr 50 ser Tyr Asp ile Asn 55 Met Trp Val Arg Gin Al a 60 Gly Thr Gly Gin Gly Leu 65 Ala Glu Trp Met Gly Trp 70 Gly Asn Pro Asn ser 75 Thr Asn Thr Gly Tyr 80 Ile Gin Lys Phe Gin 85 Arg vai Thr Met 90 Arg Asn Thr Ser 95 Ser Thr Ala Tyr 100 Met Glu Leu Ser Ser 105 Leu Arg Ser Glu Asp 110 Thr Ala vai Tyr Tyr 115 cys Ala Arg Asp pro 120 Tyr Tyr Tyr Tyr 125 Gly Met Asp Vai Gly 145 Trp 130 Gly Gin Gly Thr Thr 135 val Thr val ser ser 140 Al a Ser Thr Lys <210> 45 <211> 460 <212> DNA <213> Humano <400> 45 atggcctggt tctgtgttga tgctctggaa ggaacagccc cgattctctg ggggacgagg ttcggcggag ctgttcccac etcetcrtcct cctcaccett ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag 60 cgcagccgcc ctcagtctct gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120 gcagctccaa cattgagaat aatcatgtat cctggtacca gcagctccca 180 ccaaactcct catttatgac aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240 gctccaagtc tggcacgtca gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300 ccgattatta ctgcgaaaca tgggatacca gcctgagtgc tggccgggta 360 ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 420 cctcctctga ggagctccaa gccaacaagg 460 133 <210> 46 <211> 153 <212> PRT <213> Humano <400> 46 ctcccagatg ggtcctgtcc 60 cttcggagac cctgtccctc 120 ggagctggat ccggcagccc 1B0 gtgggtacac caactacaac 240 ccaagaacca gttctctctg 300 actgtgcgtg tataactgga 360 cggtcaccgt ctcctcagcc 420 ccaggagcac ctccgagagc 480 aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 ctgtcctaca gtcctcagga 600 accatgaaac atctgtggtt caggtgcagc tgcaggagtc acctgcactg Tctctggtgg ccagggaggg gactggagtg ccctccctca agagtcgcgt aagctgagct ctgtgaccgc acgacgaagg ggggtatgga tccaccaagg gcccatcggt acagcggccc tgggctgcct aactcaggcg ctctgaccag ctctactccc xca cttccttctc ctggtggcag gggcccagga ctggtgaagc ctccatcagt agttactact gattggctat ttcttttaca caccatgtca gttgacacgt tgcggacacg gccgtgtatt cgtctggggc caaggggcca cttccccctg gcgccctgct ggtcaaggac tacttccccg cggcgtgcac accttcccag

Met 1 Ala Trp Ser pro 5 Leu Leu Leu Thr Leu 10 Leu Π e HiS cys Thr 15 Gly Ser Trp Ala Gin 20 ser val Leu Thr Gin 25 pro Pro Ser val Ser 30 Ala Ala ΡΓΟ Gly Gin 35 Lys Val Thr ile ser 40 cys ser Gly Ser ser 45 Ser Asn xle Glu Asn 50 Asn His vai Ser Trp 55 Tyr Gl n Gin Leu Pro 60 Gly Thr Ala Pro Lys 65 Leu Leu ile Tyr ASp 70 Asn Asn Lys Arg Pro 75 Ser Giy Xle Pro Asp 80 Arg Phe Ser Gly Ser 85 Lys ser Gly Thr ser 90 Ala Thr Leu Gly xle 95 Thr Gly Leu Gin Thr 100 Gly ASp Glu Ala Asp 105 Tyr Tyr Cys Glu Thr 110 Trp Asp Thr ser Leu 115 Ser Ala Gly Arg val 120 Phe Gly Gly Gly Thr 125 Lys Leu Thr Vai ser 145 Leu Gly 130 Ser Glu Gin Glu pro Leu Lys Gin 150 Ala 135 Ala Ala Asn pro Lys ser val Thr 140 Leu phe Pro Pro <2 Λ O \—1 47 <2 11> 613 <2 12> DNA <2 13> Humano <4 Λ O O 47 <210> 48 <211> 204 <212> PRT <213> Humano 134 <400> 48 gggcccag-tc tgtgctgacg 60 ccatctcctg cactgggaga 120 agcagtttcc aggaacagcc 180 gggtccctga ccgattctct 240 ggctceaggc tgaggatgag B00 gttcggtatt cggcggaggg 360 cggtcactct gttcccgccc 420 cctctgctrc tcactctcct caggcgccct cagtgtctgg agttccaaca tcggggcagg cccaaactcc tcatctatgg ggctccaagt ctggcacctc gctgattatt actgccagtc accaagctga ccgtcctagg tcctctgagg ag

Cgctcactgc acagggtcct ggccccaggg cagagggtca ttatgatgta cactggtacc taacagcaat cggccctcag agcctccctg gccatcactg ctatgacagc agtctgagtg tcagcccaag gctgccccct

Thr Met Lys Hi S Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu val Ala Ala Pro Arg 1 5 10 15 Trp Vai Leu Ser Gin vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly pro Gly Leu val 20 25 30 Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr val Ser Gly Gly ser 35 40 45 ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Π e Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly 50 SS 60 Leu Glu Trp ile Gly Tyr Phe Phe Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 ΡΓΟ Ser Leu Lys Ser Arg val Thr Met ser val Asp Thr Ser Lys Asn 85 90 95 Gin phe ser Leu Lys Leu Ser Ser val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr cys Ala Cys ile Thr Gly Thr Thr Lys Gly Ϊ2Ϊ Met Asp val 115 120 Trp Gly Gin Gly Ai a Thr val Thr val Ser ser Ala ser Thr Lys Gly 130 135 140 Glu Pro Ser Vai phe Pro Leu Ala Pro cys Ser Arg ser Thr ser ser 145 150 155 Glu 160 Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Pro Val 165 170 175 Thr vai ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr ser Gly val His Thr Phe 180 185 190 pro Ala vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu 195 200 <210> 49 <211> 432 <212> DNA <213> Humano <400> 49 <210> 50 <211> 144 <212> PRT <213> Humano 135 <4Ο0> 50 ΡΓΟ 1 Leu Leu Leu Thr 5 Leu Leu Ala Hi s Cys 10 Thr Gly Ser Trp Ala 15 Gin Ser Vai Leu Thr 20 Gin Ala pro ser vai 25 ser Gly Ala Pro Gly 30 Gin Arg vai Thr lie 35 Ser Cys Thr Gly Arg 40 ser ser Asn Ile Gly 45 Ala Gly Tyr Asp Vai 50 His Trp Tyr Gin Gin 55 Phe Pro Gly Thr Ala 60 Pro Lys Leu Leu ile 65 ryr Gly Asn ser Asn 70 Arg pro Ser Gly Vai 75 Pro Asp Arg Phe Ser 80 Gly ser Lys Ser Gly 85 Thr Ser Ala Ser Leu 90 Ala Ile Thr Gly Leu 95 Gin Ala Glu Asp Glu 1QO Ala Asp Tyr Tyr Cys 105 Gin Ser Tyr ASP ser 110 Ser Leu Ser Gly ser 115 Vai Phe Gly Gly Gly Thr 120 Lys Leu Thr vai 125 Leu Gly Gin Pro Lys 130 Ala Ala pro ser vai 135 Thr Leu phe pro Pro 140 Ser Ser GlU Glu <210> 51 <211> 543 <212> DNA <213> Humano <400> 51 tca <210> 52 <211> 181 <212> PRT <213> Humano atgaagcatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaàgcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagtagt tactactgga gctggatccg gcagccccca 180 gggaagggac tggagtggat tgggtatttc ttttacagtg ggtacaccaa ctacaacccc 240 Tccctcaaga gtcgagtcac caratcagta gacacgrcca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagctctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgtgtat aactggaacg 360 acgaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 136 <400> 52

Leu Leu 10 vai Ala Glu 25 ser Gly pro cys Thr vai Ser Arg Gin Pro Pro 60 Ser Gly Tyr 75 ASp Thr ser vai 90 Ala Thr Thr 105 Ala Asp Thr Lys Gly Gly Ser Ser Ala ser 140 Ser Arg Ser 155 Phe Thr ASp Tyr 170 ΡΓΟ

Ala pro Arg 15 Vai Trp Gly Leu 30 Lys Gly 45 Gly Ser lie Gly Lys Gly Leu Asn Tyr Asn Pro 80 Gin ser Lys Asn 95 Thr Ala 110 Vai Tyr Met 125 Thr Asp vai Trp Lys Gly Pro ser Glu Ser Thr 160 Glu Pro Val 175 Thr

Met 1 Lys HÍS Leu Trp phe Phe Leu val Leu ser Gin 20 vai Gin Leu Gin ΡΓΟ ser Glu 35 Thr Leu Ser Leu Thr 40 ser Ser 50 Tyr Tyr Trp Ser Trp 55 He Glu 65 Trp lie Gly Tyr Phe 70 Phe Tyr ser Leu Lys Ser Arg 85 Leu Vai Thr lie Phe ser Leu Lys 100 Ser ser vai Tyr cys Ai a 115 cys lie Thr Gly Thr 120 Gly Gin 130 Gly Thr Thr vai Thr 135 vai Ser 145 vai Phe Pro Leu Ala 150 Pro cys Ala vai Ala ser Leu Trp Gly Asn 180 cys 165 Ser Leu vai Lys <210> 53 <211> 451 <212> DNA <213> Humano <400> 53 tcctctgctc ctcactctcc tcgctcactg gcagccgccc tcagtgtctg gggccccagg cagctccaac atcggggcag gttargangt ccccaagctc ctcatctatg gtaacaacaa tggctccaag txtggcacct cagcctccct ggctgattat taccgccagt ectttgacag gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ctcctctgag gagctccaag ccaacaagga cacagggtcc tgggcccagt ctgtactgac 60 gcagagggtc accatctcct gcactgggag 120 acactggtac cagcagcttc caggaacagc 180 tcggccctca ggggtccctg accgattctc 240 ggccatcact gggctccagg ctgatganga 300 cagtetgagt ggtccggtat Lcggcggagg 360 ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc 420 a 451 <210> 54 <211> 145 <212> PRT <213> Humano 137 <400> 54

Pro Leu 1 Ser Vai vai Thr Asp Vai 50 xle Tyr 65 Gly Ser Ala Asp ser Gly Pro Lys 130 LÊU 145

Leu Leu ile 35 His Gly Lys ASp ser 115 Ala

Leu Thr r fD C Leu Ala His cys 5 10 Thr Gin Pro pro Ser vai ser 20 Gly 25 ser cys Thr ser Ser ser Trp Tyr Gin Gin 55 Leu Pro Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly 70 ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu 85 90 GlU Ala ASp Tyr Tyr Cys Gin 100 Gly Gly 105 vai Phe Gly 1 7Λ Thr Lys Ala pro ser vai ±£\J Thr Leu Phe 135

Thr Gly ser Gly Ala Pro Asn ile Gly 45 Thr Ala Pro 60 vai Pro Asp 75 Ala Ile Thr ser Phe asp Leu Thr vai 125 Pro Pro Ser 140 rrp Ala 15

Gly Gin 30 , Ala Gly Lys Leu Arg Phe Gly Leu 95 ser ser 110

Leu Gly ser Glu

Gin Arg Tyr Leu ser 80 Gin Leu Gin Glu <210> 55 <211> 559 <212> DNA <213> Humano <400> 55 accatgaaac cagctgcagc acctgcactg cagcccccag tacaacccgt tccctgaagc aggggtcata gtctcctcag acctccgaga acggtgtcgt atctgtggtt tgcaggagtc Tctctggtgg ggaagggact ccctcaggag tgagctctgt gcagtggctg cctccaccaa gcacagcggc ggaactcag cttcctcctg gggcccagga ctccatcaac ggcgtggatt tcgagtcacc gaccgccgca gtggtacttc gggcccatcg cctgggctgc <210> 56 <211> 186 <212> PRT <213> Humano ctggtggcgg ctcccagatg ggtcctgtcc 60 ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 120 agtagtagta actactgggg ctggatccgc 180 gggggcatct attatagtgg gagcacctac 240 atgtccgtag acacgtccaa gaaccagttc 300 gacacggctg tatattactg tgcgagacaa 360 gatctctggg gccgtggcac cctggtcact 420 gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 559 138 <400> 56

Thr Met Lys HlS Leu Trp phe phe Leu Leu Leu val Ala Ala Pro Arg 1 5 10 15 Val Trp vai Leu ser Gin Leu Gl n Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu 20 25 30 Gly Lys Pro Ser Glu Thr Leu ser Leu Thr cys Thr Val Ser Gly ser 35 40 45 Gly lie Asn Ser ser Ser Asn Tyr Trp Gly Trp lie Arg Gin pro Pro 50 55 60 Lys Gly Leu Ala Trp xle Gly Gly xle Tyr Tyr Ser Gly ser Thr Tyr 65 70 75 Thr 80 Tyr Asn Pro ser Leu Arg Ser Arg val Thr Met ser val A5P ser 85 90 95 Thr Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu ser ser val Thr Al a Ala ASp 100 105 Gly His 110 Ala val Tyr Tyr cys Ala Arg Gin Arg Ser Ser Gly Trp Trp 115 120 val 125 Ala Tyr Phe ASp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Thr Val ser Ser 130 135 140 Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe pro Leu Ala Pro cys ser Arg Ser 145 150 155 160 Thr Ser Glu ser Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys ASp Tyr phe 165 170 175 pro Gl u pro vai Thr vai Ser Trp Asn ser 180 185 <210> 57 <211> 532 <212> DNA <213> Humano cctggggctc ctgctgctct tccatcttcc gtgtctgcat gggtattagc agctggttag gatctatact gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ttgtcaacag gctaacagtt acgaactgtg gctgcaccat tggaactgcc tctgttgtgt gtggaaggtg gataacgccc <400> 57 atgagggtcc ccgctcagct gacatccaga tgacccagtc atcacttgtc gggcgagtcg gggaaagccc ctaagctcct aggttcagcg gcagtggatc gaagattttg caacttacta gggaccaaag tggatatcaa tctgatgagc agttgaaatc cccagagagg ccaaagtaca ggttcccagg ttccagatgc 60 ctgtaggaga cagagtcacc 120 cctggtatca gcagagacca 180 tgcaãagtgg ggtcccatca 240 ccatcagcag cctgcagcct 300 tcccattcac tttcggccct 360 ctgtcttcat cttcccgcca 420 gcctgctgaa taacttctat 480 tccaatcggg ta 532 <210> 58 <211> 177 <212> PRT <213> Humano 139 <400> 58 20 100 Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Phe Pro 5 10 15 ASp xle Gin Met Thr Gin ser pro ser ser vai Ser 25 30 Asp Arg vai Thr ile Thr cys Arg Ala Ser Arg Gly 40 Gin 45 Leu Ala Trp Tyr Gin Arg Pro Gly Lys Ala Pro 55 60 Tyr Thr Ala ser ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser 70 75 80 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Gl u Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Alã Asn 105 110 Thr Phe Gly pro Gly Thr Lys vai Asp Ile Lys Arg 120 125 Pro ser vai Phe xle Phe Pro pro Ser Asp Glu Gin 135 140 Thr a1 a Ser vai vál cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 150 155 160

Met Arg 1 35

Gly Ser Ala Ser

Ile ser 50

Lys Leu 65

Arg Phe ser Leu ser phe 115

Thr Vai 130 Leu Lys 145 pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin ser 165 170 175

Gly <210> 59 <211> 594 <212> DNA <213> Humano <400> 59 accatgaaac atctgtggtt cttcctcctg cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt tacaacccgt ctctcaagag tcgagtcatc tccctgaagc tgagctccgt gaccgccgca aggggtcata gcagtggctg gtggtacttc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc ctggtggcgg ctcccagatg ggtcctgtcc 60 ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 120 agtagtagtt actactgggg ctggatccgc 180 gggggtatct attatagtgg gagcacctae 240 atgtccgtag acacgtccaa gaaccagttc 300 gacacggctg tgtattactg tgcgagacaa 360 gatctctggg gccgtggcac cctggtcact 420 gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 agcggcgtgc acaccttccc agct 594 <210> 60 <211> 198 <212> PRT <213> Humano 140 <4Ο0> 60

Thr Met lys His Leu Trp Phe Phe 1 5 Trp vai Leu ser 20 Gin Leu Gin Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu ser Leu 35 40 ile ser Ser Ser ser Tyr Tyr Trp 50 55 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly 65 70 Tyr Asn Pro Ser Leu 85 Ser Lys Ser Arg Lys Asn Gin Phe 100 Tyr Leu Lys Leu Ala Vai Tyr Cys Ala Arg Gin 115 120 Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 130 135 Ser Thr Lys Gly ΡΓΟ ser Val Phe 145 150 Thr Ser GlU ser Thr Ala Ala Leu 165 pro Glu Pro val Thr val Ser Trp 180 vai His Thr Phe Pro Ala 195

Leu Leu 10 Leu val Ala Ala Pro 15 Arg Gin 25 Glu ser Gly Pro Gl y 30 Leu val Thr Cys Thr val Ser 45 Gly Gly ser Gly Trp ile Arg 60 ser Gin pro Pro Gly Ile Tyr Tyr 75 Gl.y Ser Thr Tyr 80 Val Thr 90 Ile Ser Val ASp Thr 95 Ser Ser 105 Ser Val Thr Ala Ala 110 ASp Thr Arg Gly His Ser Ser 125 val Gly Trp Trp Thr Leu val Thr 140 Ser Ser Ala pro Leu Ala 155 pro Cys Ser Arg ser 160 Gly Cys 170 Ser Leu val Lys ASp Tyr 175 Ser Phe Asn 185 Gly Ala Leu Thr 190 Gly <210> 61 <211> 419 <212> DNA <213> Humano <4 0 0> 61 atgagggtcc ctgctcagct gacatccaga tgacccagtc atcacttgtc gggcgagtca gggaaagccc ctaaactcct aggttcagcg gcagtggatc cctggggctc tccatcttcc gggtattagc gatctatgct tgggacagat ctgctgctct ggttcccagg ttccagatgc 60 gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 agctacttag cctggtatca gcagaaacca 180 gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240 ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagatttrg caacttacta ttgtcaacag gctaacaatt tcccattcac tttcggccct 360 gggaccaaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcc 419 <210> 62 <211> 139 <212> PRT <213> Humano 141 <400> 62

Met 1 Gly Arg ser Vai Arg pro cys Ala 5 ASp Gin ile Leu Gin Leu Met Gly Thr Leu 10 Gin Leu Ser Leu Pro Leu Ser Trp Ser 30 phe 15 val Pro Ser Ala Ser Vai 20 Gly Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Arg Ala A C Ser Gin Gly Ile Ser 35 Ser Tyr Leu Ala Trp 40 Tyr Gin Gin Lys Pro 45 Gly Lys Ala Pro Lys 65 50 Leu Leu Ile Tyr Ala 70 55 Ala ser ser Leu Gin 75 60 Ser Gly val pro Ser 80 Arg Phe Ser Gly ser 85 Gly Ser Gly Thr Asp 90 Phe Thr Leu Thr Ile 95 Ser Ser Leu Gin pro Glu ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Ala Asn 100 105 110 Lys Arg Asn phe Pro phe Thr phe Gly Pro Gly Thr Lys val Ile 115 120 Phe 125 Thr Vai Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Pro 130 13 5 <210> 63 <211> 437 <212> DNA <213> Humano <400> 63 accatggact ggacctggag gatcctcttc ttggtggcag cagctacaag tgcccactcc 60 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc agttatgata tcaactgggt gcgacaggcc 180 actggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atgaacccta acagtggtaa cacaggctat 240 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg aecagggaca cctccaraag cacagcctac 300 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt artactgtgc gagagaccct 360 tactactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 gcctccacca agggccc 437 <210> 64 <211> 145 <212> PRT <213> Humano 142 <400> 64

Thr Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr 1 5 vai 10 15 ser Ala HÍS ser Gin Gin Leu vai Gin ser Gly Ala Glu val Lys 20 vai 25 30 Lys Pro Gly Ala Ser Lys Vai Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr 35 40 45 Phe Thr ser Tyr ASp lie Asn Trp vai Arg Gin Ala Thr Gly Gin Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn ser Gly Asn Thr Gly Tyr 65 70 Thr 75 80 Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg val Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile 85 90 95 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 100 105 110 vai Tyr Tyr 11 C cys Ala Arg Asp Pro 120 Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai Trp 11J Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140

Gly 145 <210> 65 <211> 460 <212> DNA <213> Humano <400> 65 atggcctggt ctcctctcct cctcaocctt tctgtgttga cgcagccgcc ctcagtctct tgctctggaa gcagctccaa cattgagaat ggaacagccc ccaaactcct catttatgac cgattctctg gctccaagtc tggcacgtca ggggacgagg ccgattatta ctgcgaaaca ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ctgttcccac cctcctctga ggagctccaa ctcattcact gcacagggtc ctgggcccag 60 gcggccccag gacagaaggt caccatctcc 120 aatcatgtat cctggtacca gcagctccca 180 aataataagc gaccctcagg gattcctgac 240 gccaccctgg gcatcaccgg actccagact 300 tgggatacca gcctgagtgc tggccgggta 360 ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 420 gccaacaagg 460 <210> 66 <211> 153 <212> PRT <213> Humano 143 <400> 66

Ser Pro Leu Leu Leu Thr Leu Leu lie His Cys Thr Gly 5 10 15 Ala Gin Ser val Leu Thr Gin Pro Pro Ser val Ser Ala 20 25 Gly 30 ile Lys val Thr lie Ser cys Ser Ser Ser ser Asn 40 45 Thr Ala HÍS val ser Trp Tyr Gin Gin Leu pro Gly Pro 55 60 ile xle Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Pro Asp 70 75 Gly 80 Gly Ser Lys Ser Gly Thr ser Ala Thr Leu lie Thr 85 90 Glu Thr 95 Thr Gly Asp Gl u Ala Asp Tyr Tyr cys Trp Asp 100 105 Gly 110 Thr Ser Ala Gly Arg val phe Gly Gly Thr Lys Leu 120 Val 125 Phe Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Thr Leu Pro Pro 135 140 Glu Leu Gin Ala Asn Lys 150

Met Ala Trp 1 ser Trp Ala

pro Gly Gin 3S

Glu Asn Asn so

Lys Leu Leu 65

Arg Phe ser

Gly Leu Gin

Thr Ser Leu 115 val Leu Gly 130 ser Ser Glu 145 <210> 67 <211> 613 <212> DNA <213> Humano <4 0 0> 67 accatgaaac atctgtggtt cttccttctc ctggtggcag ctcccagatg ggtcctgtcc 60 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtcccte 120 acctgcactg tctctggrgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 180 ccagggaagg gactggagtg gattggctat ttcttttaca gtgggtacac caactacaac 240 cccrccctca agagtcgcgt caccatctca gttgacacgt ccaagaacca gttctctctg 300 aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgcg tataactgga 360 acgacgaagg ggggtatgga cgtctggggc caagggacca cggrcaccgt ctcctcagcc 420 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttecccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tca 613 <210> 68 <211> 204 <212> PRT <213> Humano 144 <400> 68

Thr 1 Met' Lys ΗΪ S r Lnro c Trp phe Phe Trp vai Leu Ser 20 Gin Val Gl n Leu Lys pro Ser 35 Glu Thr Leu ser Leu 40 lie ser 50 Ser Tyr Tyr Trp Ser 55 Trp Leu 65 Glu Trp He Gly Tyr 70 Phe Phe ΡΓΟ Ser Leu Lys ser 85 Lys Arg val Thr Gin Phe ser Leu 100 Leu Ser Ser Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg ile Thr Gly 120 Trp Gly 130 Gin Gly Thr Thr Val 135 Thr pro 145 ser val Phe Pro Leu 150 Ala Pro Thr Ala Ala Leu Gly 165 cys Leu Val Thr vai Ser Trp 180 Asn ser Gly Ala pro Ala val 195 Leu Gin ser ser Gly 200

Leu Leu Leu Val Ala Al a pro Arg 10 15 Gin 25 Thr Glu ser Gly pro Gly 30 Gly Leu Val cys Thr val ser Gly ser 45 Ile Arg Gin pro Pro Gly Lys Gly 60 Thr Tyr Ser Gly Tyr Asn Tyr Asn 75 80 rle Ser val Asp Thr Ser Lys Asn 90 95 val val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 105 110 Thr Thr Lys Gly Gly 125 Ser Met ASp val val ser Ser Ala Thr Lys Gly 140 cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu ser 155 160 Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro Val 170 175 Leu Thr ser Gly val HÍS Thr Phe 185 190 Leu Tyr Ser Leu <210> 69 <211> 432 <212> DNA <213> Humano <400> 69 cctctgctcc tcactctcct cagccgccct cagtgtctgg agttccaaca tcggggcagg cccaaactcc tcatctatgg ggctccaagt ctggcacctc gctgattatt actgccagtc accaagctga ccgtcctagg tcctctgagg ag cgctcactgc acagggtcct ggccccaggg cagagggtca ttatgatgta cactggtacc taacagcaat cggccctcag agcctccctg gccatcactg ctatgacagc agtctgagtg tcagcccaag gctgccccct gggcccagtc tgtgctgacg ccatctcctg cactgggaga agcagttgcc aggaacagcc gggtccctga ccgattctct ggctccaggc tgaggatgag gttcggtatt cggcggaggg cggtcactct gttcccgccc 60 120 180 240 300 360 420 432 <210> 70 <211> 144 <212> PRT <213> Humano 145 <400> 70

Pro Leu 1 Ser Vai val Thr Asp vai 50 ile Tyr 65 Gly Ser Ala Glu ser Gly

Leu Leu Thr 5 Leu Thr Gin 20 lie ser cys 35 His Trp Tyr Gly Asn ser Lys Ser Gly 85 Asp Glu Ala 100 Ser vai Phe 115

Leu Leu Ala his pro pro Thr Gly

Gin Gin 55 Asn Arg 70 Thr ser Asp Tyr Gly Gly

Ser vai 25 Arg Ser 40 teu Pro

Pro Ser Ala SerTyr 31

Gly Thr 120 cys Thr 10 , ser Gly ser Asn Gly Thr Gly vai 75 Leu Ala 90 Gin Ser

Gly Ser Ala Pro lie Gly 45 Ala Pro 60 pro Asp lie Thr Tyr Asp lvs Leu Thr vai

Trp Ala Gin 15 Gly Gin Arg 30 Ala Gly Tyr Lys Leu Leu Arg Phe Ser 80 Gly Leu Gin 95 Ser ser Leu 110 Leu Gly Gin

Pro Lys Ala Ala Pro ser val Thr Leu Phe Pro Pro ser ser Glu Glu 130 135 140 <210> 71 <211> 543 <212> DNA <213> Humano <400> 71 atgaagcatc tgtggttctt ccttctcctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120 tgcactgtct ctggtggctc catcagtagt tactactgga gctggatccg gcagccccca 180 gggaagggac tggagtggat tgggtatttc ttttacagtg ggtacaccaa ctacaacccc 240 tccctcaaga gtcgagtcac catatcagta gacacgtcca agaaccagtt ctccctgaag 300 ctgagetctg tgaccgctgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgcgtat aactggaacg 360 acgaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc ctcagcctcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 tca <210> 72 <211> 181 <212> PRT <213> Humano gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 146 <400> 72

Ala Pro Arg 15 Trp Gly Leu 30 Gly vai Lys Gly 45 ser Ile Gly Lys Gly Leu Asn Tyr Asn pro 80 Ser Lys Asn 95 Gin Thr Ala 110 vai Tyr Met 125 Thr ASp Vai Trp Lys Gly Pro Ser Glu Ser Thr 160 Glu pro Vai 175 Thr

Met 1 Lys Hl S Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu 10 vai Ala vai Leu Ser Gin 20 vai Gin Leu Gin Glu Ser 25 Gly Pro Pro ser Glu 35 Thr Leu ser Leu Thr 40 cys Thr Vai ser Ser Ser 50 Tyr Tyr Trp Ser Trp 55 lie Arg Gin Pro Pro 60 Glu 65 Trp He Gly Tyr Phe 70 Phe Tyr Ser Gly 5Γ Thr ser Leu Lys Ser Arg 85 Leu Vai Thr lie ser Vai 90 ASP Thr Phe Ser teu Lys 100 Arg Ser Ser Vai Thr Ala 105 Thr Lys Ala Asp Tyr cys Ala 115 lie Thr Gly Thr 120 Gly Gly Gly Gin 130 Gly Thr Thr Vai Thr 135 Vai ser ser Ala Ser 140 ser 145 Vai Phe pro Leu Ala 150 Pro Cys Ser Arg Ser 1S5 Thr Ala vai Ala Ser Leu Trp Gly Asrt 180 Cys 165 Ser Leu Vai Lys Asp Tyr 170 phe pro <210> 73 <211> 451 <212> DNA <213> Humano tcgctcactg cacagggtcc gggccccagg gcagagggtc g-ttatgatgt acactggtac gtaacaacaa tcggccctca cagcctccct ggccatcact cctttgacag cagtctgagt gtcagcccaa ggctgccccc ccaacaagga a <400> 73 tcctctgctc ctcactctcc gcagccgccc tcagtgtctg cagctccaac atcggggcag ccccaagctc ctcatctatg tggctccaag tctggcacct ggctgattat tactgccagt gaccaagctg accgtcctag ctcctctgag gagctccaag tgggcccagt ctgtactgac 60 accatctcct gcactgggag X20 cagcagcttc caggaacagc 180 ggggtccctg accgattctc 240 gggctccagg ctgaagatga 300 ggttcggtat tcggcggagg 360 tcggtcactc tgttcccgcc 420 451 <210> 74 <211> 145 <212> PRT <213> Humano 147 <400> 74

Pro 1 Leu Leu Leu Thr 5 Leu Leu Ala HiS Cys 10 Thr ciy Ser Trp Ala 15 Gin Ser val Leu Thr 20 Gin Pro pro Ser val 25 Ser Gly Ala Pro Gly 30 Gin Arg Val Thr ile 35 ser cys Thr Gly Ser 40 Ser Ser Asn Ile Gly 45 Ala Gly Tyr Asp val 50 Tyr His Trp Tyr Gin Gin 55 Arg Leu Pro Gly Thr Ala 60 Pro pro Lys Leu Leu lie 65 Gly Asn Asn Asn 70 pro ser Gly val 75 Asp Arg Phe Ser 80 Gly Ser Lys Ser Gly 85 Thr ser Ala Ser Leu 90 Ala lie Thr Gly Leu 95 Gin Ala Glu Asp Glu 100 Ala Asp Tyr Tyr Cys 105 Gin Ser phe Asp ser 110 ser Leu Ser Gly Ser 115 Val Phe Gly Gly Gly 120 Thr Lys Leu Thr Val 12 S Leu Gly Gin pro Leu 53S Ala Ala pro ser val 135 Thr Leu Phe pro pro 140 ser ser Glu Glu 145 <210> 75 <211> 119 <212> PRT <213> Humano <400> 75 Gin Vai Glf 1 50 65 115 35 Leu Val 5 Gin val 20 Trp Ser Cys Val Arg Asn Pro Asn val Thr Met 70 Ser Ser 85 Leu Tyr 100 Tyr Tyr val Ser Ser ser Gly Lys Ala Gin Ala 40 Ser Gly 55 Thr Arg Arg Ser Tyr Gly Ala

Ala Glu 10 Ser Gly 25 Thr Gly Asn Thr Asn Thr Glu Asp 90 Met Asp 105 vai Lys Tyr Thr Gin Gly dy Tgr Ser ile 75 Thr Ala Vai Trp

Lys Pro Phe Thr 30 Leu Glu 45 Ala Gin Ser Thr Val Tyr Gly Gin 110

Gly Ala 15 Ser Tyr Trp Met Lys phe Ala Tyr 80 Tyr cys 95 Gly Thr <210> 76 <2ll> 110 <212> PRT <213> Humano 148 <400> 76

Gin ser vai Leu Thr Gin pro Pro Ser vai ser Ala Ala Pro Gly Gin LJs vai Thr He Ser Cys ser Gly S|r ser Ser Asn He Gly Asn Asn Tyr Vai ser T?p Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Xle Tyr Isp Asn Asn Lys Arg Pro ser Gly xle pro Asp Arg Phe Ser Gly Ur Lys ser Gly Thr Ur Ala Thr Leu Gly He Thr Gly Leu Gin -rhr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 9° 95 ser Ala vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly 100 105 110 <210> 77 <211> 118 <212> PRT <213> Humano <400> 77

Gin Leu 1 Thr Leu Ser Tyr Trp lie 50 Leu Lys 65 Ser Leu Cys Ala vai Thr

Gin Leu Gin 5 ser Leu Thr 20 Tyr Trp Gly 35 Gly Ser He Ser Arg vai Lys Leu Ser 85 Arg ser ser 100 Vai Ser ser

Glu Ser cys Thr Trp Ile Tyr Tyr 55 Thr ile 70 Ser vai Trp Tyr Ala

Gly vai Arg 40 Ser ser ThrPhe pro Gly 10 ser Gly 25 Gin Pro Gly ser vai Asp

Gly Ser Pro Gly Thr Tyr 60 Thr Ser 75 Asp Thr

Ala Ala 90 Asp Leu Trp Gly 105

Lys pro ile Ser 30 Lys Gly 45 Tyr Asn Lys Asn Ala vai Arg Gly 110 ser Glu 15 ser ser Leu Glu pro Ser Gin Phe 80 Tyr Tyr 95 Thr Leu 115 <210> 78 <211> 108 <212> PRT <213> Humano 149 <400> 78

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Vai ser Ala ser vai Gly

Asp Arg vai Thr lie Thr Cys Arg Ala ser Gin Gly ile ser ser Trp

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

Tyr Ala Ala ser ser Leu Gin Ser Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly

Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser ser Leu Gin Pro

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn ser Phe Pro Phe 85 90 33

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys vai Asp lie Lys Arg 100 105 <210> 79 <211> 117 <212> PRT <213> Humano <400> 79

Gin Vai Gin Leu 1 Thr Leu Ser Leu 20 Tyr Trp ser Trp 35 Gly Tyr lie Tyr 50 ser Arg vai Thr 65

Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro S|r Glu cys Thr vai ser Gly Gly ser He ser Ser Tyr Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys cpr lll asp Thr ser Lys Asn Gin Phe ser Leu

Thr vai Ser Ser Ala 115 <210> 80 <211> 112 <212> PRT <213> Humano 150 <4Ο0> 80

Gin ser vai Leu Thr Gin pro pro ser vai ser Gly Ala Pro Gly Gin 1 5 15

Arg vai Thr lie Ser cys Thr Gly Ser ser ser Asn ile Gly Ala Gly 20 25

Tyr Asp vai His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 3 r 40 3

Leu Tle Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe

ca >55 vU ser Gly ser Lys ser Gly Thr Ser Ala ser Leu Ala ile Thr Gly Leu

65 70 75 oU

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp ser Ser 8 5 90 9 5

Leu Ser Gly Ser vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr vai Leu Gly 100 105 110 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <400> 81

Ser ser ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 <210> 82 <211> 16 <212> PRT <213> Humano <400> 82

Gly rle Tyr Tyr ser Gly ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys ser 15 10 15 <210> 83 <211> 13 <212> PRT <213> Humano <400> 83

Gin Arg Gly His Ser ser Gly Trp Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 151 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 84 Arg Ale i Ser Gin Gly xle ser Ser Tyr 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <400> 85 Ala Ala Ser Ser Leu Gin ser 1 5 <210 > 86 <211> 9 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 86 Gin Gin Ala Asn Asn Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 87 Ser Ser Ser Asn Tyr Trp Gly 1 5 152 <210> 88 <211> 16 <212> PRT <213> Humano <400> 88

Gly Ile Tyr Tyr ser Gly ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 15 10 15 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Humano <400> 89

Gin Arg Gly His Ser ser Gly Trp Trp Tyr Pfie Asp Leu 15 10 <210> 90 <211> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <400> 90

Arg Ala Ser Arg Gly ile Ser ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <400> 91

Thr Ala ser Ser Leu Gin.ser 1 5 153 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 92 Gin Gin Ala Asn ser phe Pro Phe 1 5 <210> 93 <211> 25 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 93 Gin Vai Gin Leu vai Gin Ser Gly 1 5 Ser Vai Lys val Ser Cys t-ys Ala 20 <210> 94 <211> 10 <212> PRT <213> Humano <400> 94 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp 1 5 <210> 95 <211> 25 <212> PRT <213> Humano Thr lie Asn 10

Ala Glu vai Lys Uys Pro Gly Ala 10 15 ser 25 154 <4Ο0> 95

Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu ser Leu Thr Cys Thr vai ser 20 25 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Humano <400> 9 6

Gly Gly ser lie Arg ser Ser ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Humano <400> 97

Gin Leu Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr vai ser 20 25 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Humano <400> 98

Gly Gly Ser ile Asn Ser ser Ser Asn Tyr Trp Gly 15 10 <210> 99 <211> 25 155

<212> PRT <213> Humano <4 0 0> 99

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr cys Thr Vai ser 20 25 <210> 100 <211> 10 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 100

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 15 10 <210> 101 <211> 25 <212> PRT <213> Humano <400> 101

Gin val Gin Leu Gin Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu ser Leu Thr cys Thr val Ser 20 25 <210> 102 <211> 10 <212> PRT <213> Humano <4 0 0> 102

Gly Gly Ser ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 1 '5 10 156

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína de ligação específica isolada totalmente humana que se vincula preferencialmente ao factor de crescimento insulínico II (IGF-II) com reactividade cruzada com o factor de crescimento insulínico I (IGF-I) e neutraliza a actividade dos factores IGF-I e IGF-II, caracterizado por a proteína mencionada, ou fragmento de ligação da mesma, contém: uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos "Ser Tyr Asp Ile Asn" (SEQ. ID N.°: 33); uma região determinante de complementaridade 2(CDR2) de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos "Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly" (SEQ. ID N.0: 34); uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia pesada com a sequência de aminoácidos "Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai" (SEQ. ID N.°: 35); uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1) de cadeia leve com a sequência de aminoácidos "Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn His Vai Ser" (SEQ. ID N.°: 36) ; uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) de cadeia leve com a sequência de aminoácidos "Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser" (SEQ. ID N.°: 37); e uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3) de cadeia leve com a sequência de aminoácidos "Glu Thr Trp Asp Thr Ser Leu Ser Ala Gly Arg Vai" (SEQ. ID N.°: 38). 1
2. 2. A proteína de ligação específica da reivindicação 1, caracterizada por a proteína de ligação mencionada ser um anticorpo monoclonal 7.159.2 (Número de Acesso ATCC PTA-7424).
3. 3. A proteína de ligação específica da reivindicação 1, caracterizada por a proteína de ligação mencionada conter um polipéptido de cadeia pesada com a SEQ. ID N.°: 6 ou onde a proteína de ligação mencionada contém um polipéptido de cadeia leve com a SEQ. ID N.°: 8.
4. 4. A proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 ou 3, caracterizada por a proteína de ligação mencionada conter um polipéptido de cadeia pesada com a SEQ. ID N.°: 6; e onde a proteína de ligação mencionada contém um polipéptido de cadeia pesada com a SEQ. ID N.°: 8.
5. 5. A proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações precedentes, caracterizada por a proteína de ligação mencionada ser um anticorpo monoclonal totalmente humano ou um fragmento de ligação de um anticorpo monoclonal totalmente humano.
6. 6. A proteína de ligação específica da reivindicação 5, caracterizada por o fragmento de ligação mencionado é seleccionado de entre um grupo composto por Fab, Fab' ou F (ab')2 e Fv.
7. 7. A proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizada por estar numa mistura com um transportador farmacologicamente aceitável.
8. 8. Uma molécula de ácido nucleico caracterizada por codificar a proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 a 6. 2
9. 9. Um vector caracterizado por conter a molécula de ácido nucleico da reivindicação 8.
10. 10. Uma célula hospedeira caracterizada por conter o vector da reivindicação 9.
11. 11. A proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a proteína de ligação específica mencionada não se vincular especificamente às proteínas IGF-II ou IGF-I quando estas se encontram ligadas a proteínas de ligação do factor de crescimento insulínico.
12. 12. Um método de determinação do nível dos factores de crescimento insulínicos II (IGF-II) e I (IGF-I) numa amostra de um doente caracterizado por compreender: o contacto entre a amostra do doente com uma proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 a 6; e a determinação do nível de IGF-I e IGF-II na amostra mencionada.
13. 13. Utilização da proteína de ligação específica de qualquer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por ser usado na preparação de um medicamento para o tratamento de um tumor maligno.
14. 14. Utilização da reivindicação 13, caracterizado por o tumor maligno mencionado ser seleccionado de entre um grupo composto por: melanoma, cancro do pulmão de células não-pequenas, glioma, hepatocarcinoma (fígado), tumor da tiróide, cancro gástrico (estômago), cancro da próstata, cancro endométrico, 3 cancro renal, cancro do cólon, cancro pancreático e carcinoma epidermóide.
15. 15. Utilização das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por a utilização do medicamento mencionado ser combinada com um segundo agente anti-neoplásico seleccionado de entre um grupo composto por um anticorpo, agente guimioterapêutico e um fármaco radioactivo.
16. 16. A utilização das reivindicações 13 ou 14, caracterizado por o medicamento mencionado ser utilizado em conjunto ou após uma cirurgia convencional ou um transplante de células estaminais da medula óssea ou periféricas.
17. 17. Um conjugado caracterizado por compreender o anticorpo ou fragmento de ligação da reivindicação 5 e um agente terapêutico.
18. 18. 0 conjugado da reivindicação 17, caracterizado por o agente terapêutico ser uma toxina; um radioisótopo ou uma composição farmacêutica. 4