PT1951760T - Anticorpo monoclonal humano cd134 (ox40) e métodos para o fabricar e utilizar - Google Patents

Anticorpo monoclonal humano cd134 (ox40) e métodos para o fabricar e utilizar Download PDF

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Soloff Nugent Rachel
Kato Shinichiro
Yoshida Hitoshi
Croft Michael
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Description

"ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO CD134 (0X40) E MÉTODOS PARA O FABRICAR E UTILIZAR"
Introdução 0 sistema imunológico é constituído por múltiplos tipos de células que funcionam de modo a proteger o corpo contra doenças infecciosas. Isto depende do reconhecimento de antigénios estranhos e da capacidade de distinguir o que é próprio do que é alheio. Em alguns casos a barreira entre o próprio e o alheio é quebrada, levando à destruição de tecidos pelo sistema imunológico do próprio. Estas reacções autoimunes podem levar a doenças debilitantes tais como a diabetes, a esclerose múltipla, e a doença inflamatória dos intestinos. Um dos principais mediadores destas reacções autoimunes é o linfócito T ou célula T. Normalmente, as células T são tolerantes em relação aos antigénicos próprios, mas em muitas doenças autoimunes esta tolerância perde-se e as células T montam reacções imunológicas contra tecidos saudáveis. A remoção das células T ou o bloqueio da sua activação ou a sua sobrevivência melhora os sintomas da doença. No entanto, esta diminuição genérica de células T ou a prevenção contra a sua activação leva à imunossupressão em que os doentes se tornam fortemente susceptiveis a agentes infecciosos. Novas terapias são necessárias que alvejam especificamente as células T efectivadoras e diminuem apenas as células T auto-reactivas.
Descrição Resumida da Invenção A invenção presente proporciona: [1] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo é produzido por uma linha de células de hibridoma denotada como 112V8, depositada na ATCC N2 PTA-7219, ou 112Y131, depositada na ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55, depositada na ATCC N2 PTA-7220, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadeia singela (scFv), ou Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[2] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua: (a) a sequência reacional da região variável da cadeia pesada madura tal como se ilustra na SEQ ID NO: 9 e a da região variável da cadeia leve madura tal como se ilustra na SEQ ID NO:10, ou (b) a região variável da cadeia pesada madura tal como se ilustra na SEQ ID NO: 44 e a região variável da cadeia leve madura tal como se ilustra na SEQ ID NO:45; ou (c) a região variável da cadeia pesada madura tal como se ilustra na SEQ ID NO: 46 e a região variável da cadeia leve madura tal como se ilustra na SEQ ID NO:47. ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2f Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[3] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua uma região variável de uma cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos a partir da posição 20 da SEQ ID NO: 9 e até ao aminoácido na posição 141 da SEQ ID NO: 9 e uma região variável da cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 10 e até ao aminoácido na posição 129 da SEQ ID NO: 10, ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[4] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua uma região variável de uma cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos a partir da posição 20 da SEQ ID NO: 44 e até ao aminoácido na posição 136 da SEQ ID NO: 44 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 45 e até ao aminoácido na posição 127 da SEQ ID NO: 45, ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[5] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua uma região variável de uma cadeia pesada contendo uma sequência de aminoácidos a partir da posição 21 da SEQ ID NO: 46 e até ao aminoácido na posição 136 da SEQ ID NO: 46 e uma cadeia leve de região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 47 e até ao aminoácido na posição 127 da SEQ ID NO: 47, ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[6] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua um anticorpo humano, humanizado ou quimérico e em que o anticorpo tenha uma actividade antagonista de 0X40, e em que o anticorpo compita com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112V8, depositada como ATCC N2 PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55 depositada como ATCC N2 PTA-7220, para a ligação a 0X40, ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[7] Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos de um domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo se ligue ao epitopo de uma sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 ao qual se liga o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112V8, depositada como ATCC N2 PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55 depositada como ATCC N2 PTA-7220, ou um seu fragmento seleccionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
[8] Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo de qualquer uma de [1] — [7] , e um veículo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.
[9] Um ácido nucleico isolado que codifica para uma região variável de uma cadeia pesada madura tal como ilustrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 9, 44 ou 46 e para uma região variável de uma cadeia leve madura tal como ilustrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 10, 45 ou 47, em que as sequências compreendam: (a) a SEQ ID NO: 5 e a SEQ ID NO: 6, um uma sua sequência degenerada, ou (b) a SEQ ID NO: 38 e a SEQ ID NO: 39, um uma sua sequência degenerada, ou (c) a SEQ ID NO: 40 e a SEQ ID NO:41, um uma sua sequência degenerada.
[10] Um ácido nucleico isolado que codifique para o anticorpo ou fragmento de qualquer uma de [1 ]-[7] .
[11] O ácido nucleico isolado de [10], em que o ácido nucleico codifique para uma sequência variável da cadeia pesada madura ou uma sequência variável da cadeia leve madura tal como se ilustra e qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 ou 44-49.
[12] 0 ácido nucleico isolado de qualquer uma de [9]-[11], compreendendo adicionalmente uma sequência de controlo de expressão.
[13] Um vector compreendendo o ácido nucleico de qualquer uma de [9] — [12] .
[14] Uma célula hospedeira compreendendo os ácidos nucleicos de qualquer uma de [9] a [12] ou do vector da reivindicação 13.
[15] Um estojo compreendendo o anticorpo ou fragmento de qualquer uma de [1]—[7], e instruções para administrar o anticorpo a um sujeito que necessite de um tratamento com o anticorpo.
[16] Um método para produzir um anticorpo anti-0X40 utilizando a célula hospedeira de [14]. A invenção proporciona anticorpos isolados ou purificados que se ligam em particular a um epitopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 (por exemplo, a SEQ ID N0:51). Os anticorpos incluem anticorpos humanos, humanizados e quiméricos que se ligam a uma sequência de mamífero (por exemplo de primata ou humana) 0X40 (por exemplo a SEQ ID NO: 50) . Os anticorpos também incluem aqueles que têm actividade antagonista e 0X40. Os anticorpos incluem também os que têm actividade agonista de 0X40.
Um anticorpo descrito neste documento pode ter actividade antagonista de 0X40 e diminuir ou aumentar a produção de uma citoquina ou de um interferão, sobrevivência ou proliferação de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, a expressão de uma proteína anti-apoptótica ou pro-apoptótica. Em aspectos específicos e não limitativos, uma citoquina é seleccionada de entre IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-a, interferão γ, e GM-CSF; e uma proteína anti-apoptótica ou pro-apoptótica é seleccionada de entre Bcl-xL, Bcl-2, Bad e Bim.
Noutras concretizações específicas, os anticorpos 0X40 são produzidos por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32 (ATCC N2 PTA-7217; depositada a 17 de Novembro de 2005), 112V8 (ATCC N2 PTA-7219, depositada a 17 de Novembro de 2005), 112Y55 (ATCC N2 PTA-7220, depositada a 17 de Novembro de 2005), 112Y131 (ATCC N2 PTA-7218, depositada a 17 de Novembro de 2005) , e 112Z5 (ATCC N2 PTA-7216, depositada a 17 de Novembro de 2005) . Os anticorpos 0X40 descritos neste documento podem ligar-se a uma sequência de aminoácidos à qual se liga o anticorpo produzido por uma linha de células de hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; têm uma actividade de ligação a 0X40 adentro de 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; têm maior ou menor actividade de ligação a 0X40 do que um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; têm uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de cerca KD 10~6 M a cerca de KD 10~13 M de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; têm a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotado como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; competem com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 para a ligação a 0X40; inibem ou evitam a ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células de hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40, tal como se determina num ensaio ELISA (por exemplo, inibem pelo menos 50 % da ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40); ou liga-se ao mesmo epitopo que o de 112V8, 112Y55 e Y131, e inibe ou evita a ligação de 0X40 a ligandos de 0X40 (OX40L) (por exemplo, em 85 % ou mais).
Os anticorpos incluem adicionalmente aqueles que se ligam especificamente a 0X40 expresso em células. Em concretizações especificas, o anticorpo liga-se em particular a 0X40 expresso em células não T (por exemplo, células assassinas naturais, granulócitos, monócitos, células B) , ou linhas de células transfectadas com 0X40 (por exemplo células CHO, células L929 ou células HELA). Num aspecto específico, o anticorpo liga-se especificamente a células T humanas activadas, não a células T em repouso.
Incluem-se nos anticorpos sequências da região variável madura de cadeias leves ou pesadas, por exemplo, como se mostra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49. Os anticorpos também incluem formas modificadas e variantes tais como com substituições dentro ou fora de uma região constante, uma região determinante da complementaridade (CDR) ou uma região do quadro (FR) de um anticorpo contendo uma sequência da região variável de uma cadeia pesada ou leve, por exemplo, como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e SEQ ID NO: 44-49. As substituições incluem substituições conservadoras de aminoácidos. As substituições incluem substituições dos aminoácidos de 1-3, 3-5, 5-10 ou mis resíduos de aminoácidos. Um anticorpo pode ter 80 %-85 %, 85 %-90 %,90 %-95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou mais de identidade com uma sequência de uma região variável de uma cadeia pesada ou leve, como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49.
Os anticorpos também incluem subsequências de sequências da região variável de cadeias maduras pesadas ou leves, por exemplo, como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49. Em aspectos específicos, selecciona-se uma subsequência de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , os Fv ligados por dissulfureto (sdFv) e VL ou VH.
Os anticorpos também incluem domínios heterólogos. Em aspectos especiais, um domínio heterólogo inclui um marcador, um rótulo detectável ou um agente citotóxico...
Os anticorpos modificados e variantes tais como com substituições, subsequências e adições podem manter uma actividade detectável de um anticorpo 0X40 tal coo se descreve neste documento. Um anticorpo modificado pode manter uma actividade detectável de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Um anticorpo modificado pode modular a expansão ou a sobrevivência de células T, ou os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou diminuir as células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. Um anticorpo modificado pode inibir a sinalização de 0X40 ou diminuir ou eliminar algumas das células T auto-reactivas particulares para um auto-antigénico (por exemplo, um auto-antigénico tal como a proteína básica mielina, a glicoproteína oligodendrocítica mielina, a proteína proteolípido, colagéneo, antigénios dos tecidos sinoviais das articulações, insulina, ácido glutâmico descarboxilase, antigénicos intestinais, antigénicos da tiróide, proteínas histona, antigénicos do músculo e antigénicos da pele).
Os anticorpos também incluem os que competem com ou não competem com a ligação de um anticorpo L106 a 0X40.
Alguns anticorpos nao inibem nem evitam a ligação do anticorpo L106 a 0X40, tal como determinado num ensaio ELISA.
Os anticorpos incluem adicionalmente os que afectam uma função ou actividade de 0X40. Em concretizações específicas, um anticorpo pode inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40; inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas; modular a sinalização celular mediada por 0X40 (por exemplo, inibindo-a ou evitando-a); modular uma reacção celular mediada por 0X40; ou uma sinalização celular mediada por 0X40 (por exemplo, inibindo-a ou evitando-a). Em aspectos específicos, uma reacção celular mediada por 0X40 pode incluir a proliferação de linfócitos, a expressão de citoquinas, a sobrevivência de linfócitos, a activação de NF-kB, a manutenção da actividade de PKB (Akt), ou a regulação em alta da survivina. Em concretizações adicionais, um anticorpo pode induzir a lise de células humanas EL4 expressando 0X40 ou de células T humanas activadas mediada por células assassinas naturais, macrófagos ou neutrófilos, por exemplo, a percentagem (%) de lise celular específica induzida a 10 pg/mL de anticorpo é de cerca de 15 a 75 %, 25 a 65 %, ou 30 a 60 %, ou de 50-100 %.
Incluem-se adicionalmente nos anticorpos os que têm uma função ou actividade in vivo. Em concretizações específicas, um anticorpo pode reduzir, diminuir ou evitar um sintoma da doença de enxerto contra hospedeiro num modelo de doença de enxerto contra hospedeiro aguda, ou provocar uma remissão ou uma regressão da doença de xenoenxerto contra hospedeiro num modelo de doença de xenoenxerto contra hospedeiro aguda ou crónica (por exemplo, murganhos imunodeficientes (SCID) que receberam células mononucleares de sangue humano (PBMC) depois da administração de anticorpo anti-cadeia IL2Rbeta e uma dose inferior à mortal de irradiação). Em aspectos específicos, um sintoma da doença de enxerto contra hospedeiro pode ser a perda de cabelo, uma irritação da pele, hematúria, hidroperitoneu, e infiltrados de células inflamatórias no fígado, tracto intestinal, pulmão, pele, ou a morte.
Em concretizações adicionais, um anticorpo pode reduzir, diminuir ou evitar a inflamação do pulmão, pele, ou intestino, ou reduzir, ou diminuir ou evitar um sintoma de uma patologia autoimune. Em aspectos específicos, um anticorpo pode diminuir ou evitar um sintoma da artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, doença de Crohn, doença inflamatória dos intestinos, colite ulcerosa, doença celíaca, psoríase, nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, ou polimiosite.
Incluem-se nos anticorpos os anticorpos monoclonais policlonais, quaisquer seus isotipos ou subclasses. Em aspectos específicos, o anticorpo pode ser IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA, IgM, IgE, ou isotipo IgD.
Podem incluir-se os anticorpos em composições farmacêuticas. Numa concretização, um anticorpo inclui um veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.
Os anticorpos podem ser codificados por sequências de ácido nucleico. Numa concretização, um ácido nucleico codifica para uma sequência de uma região variável madura leve ou pesada, por exemplo, tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, ou uma sua subsequência. Em aspectos específicos, as sequências de ácido nucleico incluem as SEQ ID NO: 3-6 e as SEQ ID NO: 38-43, ou sequências degeneradas em relação às SEQ ID NO: 3-6 e SEQ ID NO: 38-43. Um ácido nucleico descrito neste documento pode codificar para uma sequência de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácido substituídos, adicionados ou eliminados das sequências da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustram nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49. Um ácido nucleico que codifique para uma sequência de aminoácidos contendo um ou mais resíduos substituídos, adicionados ou eliminados das sequências da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustram nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, pode ter uma actividade de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotadas como 112F32, 112V8, 112Y131; 112Y55, ou 112Z5 (por exemplo, tem afinidade de ligação para um epítopo do domínio extracelular de 0X40). Em aspectos específicos adicionais ainda, a sequência de ácido nucleico inclui uma sequência de controlo de expressão ou um vector.
Podem produzir-se anticorpos em células hospedeiras e em células isoladas. Em concretizações especificas, uma célula hospedeira ou isolada é uma célula hibridoma ou uma célula CHO. Numa concretização especifica adicional, uma célula isolada exprime um anticorpo com a especificidade de ligação tal como um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotado como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. A descrição proporciona estojos. Em especial concretizações, um estojo inclui um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotadas como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5, e instruções para administrar o anticorpo a um sujeito que necessite de tratamento com um anticorpo. A descrição proporciona métodos in vivo, incluindo os métodos de tratamento e terapêuticos. Um método para tratar uma doença ou patologia imune crónica ou aguda, ou um sintoma de uma doença ou patologia imune crónica ou aguda num sujeito que necessite do tratamento pode incluir administrar-se ao sujeito um anticorpo ou a composição farmacêutica eficaz para tratar a doença ou a patologia imune crónica ou aguda, ou um sintoma da doença ou patologia imune crónica ou aguda no sujeito. 0 tratamento proporciona um alivio ou uma melhoria de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas a uma doença ou patologia imune crónica ou aguda.
Um método para tratar a doença do enxerto em relação ao hospedeiro pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite do tratamento um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para tratar a doença do enxerto contra o hospedeiro. 0 tratamento pode reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou as consequências físicas associadas com a doença do enxerto em relação ao hospedeiro (por exemplo, perda de peso, queda de cabelo, inflamação cutânea, hematúria, hidroperitoneu, infiltrados inflamatórios no fígado, tracto intestinal, pulmão, ou morte), resultando numa remissão ou regressão da doença do enxerto contra a hospedeiro, ou resulta em impedir a doença do enxerto contra o hospedeiro. Em aspectos adicionais, um enxerto pode incluir medula óssea, células estaminais hematopoiéticas, células estaminais do sangue periférico ou células estaminais do cordão umbilical.
Um método para tratar a rejeição de transplantes pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de tratamento um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para tratar a rejeição de transplante. 0 tratamento pode reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade ou um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas à rejeição de transplantes (por exemplo, uma reacção imunológica contra o transplante ou a destruição das células ou tecido do transplante), resultando numa remissão ou regressão da rejeição do transplante, ou resultando em evitar a rejeição do transplante. Um transplante pode incluir células ou tecidos de rim, coração, pulmão, pele, fígado ou pâncreas, ou órgão.
Um método para reduzir, diminuir ou evitar a inflamação pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de um tratamento um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para reduzir, diminuir, ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade da inflamação. A inflamação pode estar presente no pulmão, articulação, músculo, pele, sistema nervoso central ou periférico, ou nos intestinos. Um tratamento pode resultar na diminuição do início, frequência, duração ou severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas à inflamação.
Um método para tratar uma patologia autoimune pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de tratamento um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um sintoma de uma patologia autoimune. A patologia autoimune pode incluir artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerosa, doença celíaca, psoríase, nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, ou polimiosite. Um tratamento pode resultar em reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas a uma patologia autoimune. Métodos adicionais que podem resultar num tratamento ou terapia, quando praticados in vivo, incluem modular a actividade de 0X40 ou a sua função, m método para inibir ou evitar uma resposta celular mediada por 0X40 pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de inibir ou de evitar uma reacção celular mediada por 0X40 um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para inibir ou evitar uma reacção celular mediada por 0X40 (por exemplo, proliferação de linfócitos, expressão de citoquinas, ou sobrevivência de linfócitos). Um método de inibir ou bloquear a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas inclui administrar-se a um sujeito que necessite de bloquear, inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas, um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas. Um método para inibir ou bloquear a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40 pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de bloquear, inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X4 0 a 0X4 0 um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40. Um método para modular a sinalização de células mediada por 0X40 pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de modular a sinalização celular mediada por 0X40 um anticorpo ou uma composição farmacêutica eficaz para modular a sinalização celular mediada por 0X40. Um método para diminuir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de menores números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras uma quantidade de anticorpo suficiente para diminuir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras.
Um método para diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão, ou pele num modelo de doença de xenoenxerto contra o hospedeiro aguda ou crónica pode incluir administrar-se uma quantidade de anticorpo no modelo de doença de xenoenxerto contra o hospedeiro aguda ou crónica que seja suficiente para diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão, ou na pele.
Um método para tratar uma doença ou patologia provocada por células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras pode incluir administrar-se a um sujeito uma quantidade de anticorpo suficiente para reduzir, diminuir ou evitar a progressão da doença ou da patologia provocada por células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou diminuir as células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. A doença ou patologia pode incluir doença de enxerto contra o hospedeiro, inflamação ou uma patologia autoimune.
Os sujeitos que se podem tratar tal como descrito neste documento incluem mamíferos (por exemplo, humanos). Um sujeito que é um candidato para ou tenha sido tratado de uma doença ou patologia imune crónica ou aguda; um sujeito que seja um candidato para ou tenha sido tratado da doença de enxerto contra o hospedeiro; um sujeito que seja um candidato para ou tenha sido tratado de rejeição de transplante; um sujeito que seja um candidato para ou tenha sido tratado de inflamação; ou um sujeito que seja um candidato para ou tenha sido tratado de uma patologia autoimune; um sujeito que seja um candidato para ou tenha sido tratado de uma reacção celular mediada por 0X40.
Os métodos descritos neste documento que incluem a administração ou entrega de anticorpos 0X40 podem ser praticados por qualquer método aceitável. Pode administrar-se um anticorpo 0X40 a um sujeito localmente, regionalmente ou sistemicamente. A invenção também proporciona métodos para produzir anticorpos 0X40 humanos que tem actividade antagonista de 0X40. Um método descrito neste documento inclui administrar-se um domínio extracelular humano de 0X40 conjugado com proteína Fc humana recombinante ou células T humanas activadas a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana (por exemplo, um murganho transgénico ou uma vaca transgénica); rastrear no animal a expressão do anticorpo humano 0X40; selecionar um animal que produza o anticorpo humano 0X40; isolar um anticorpo do animal seleccionado; e determinar se o anticorpo humano 0X40 tem actividade antagonista de 0X40. São descritos neste documento métodos para produzir anticorpos humanos 0X40 que inibem ou evitam a ligação de 0X40 a ligandos de 0X40 (OX40L) . Um método pode incluir administrar-se um domínio extracelular humano 0X40 conjugado com proteína humana Fc recombinante ou com células T activadas humanas a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana (por exemplo, um murganho transgénico ou uma vaca transgénica); rastrear no animal a expressão do anticorpo humano 0X40; selecionar um animal que produza o anticorpo humano 0X40; isolar um anticorpo do animal seleccionado; e determinar se o anticorpo humano 0X40 inibe ou evita a ligação de 0X40 a ligandos de 0X40 (OX40L). A descrição proporciona além disto, animais transgénicos não humanos que expressam um anticorpo 0X40. 0 anticorpo 0X40 expresso pode ser idêntico a um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y 131, 112Y55, ou 112Z5; liga-se a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 ao qual se liga um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; tem uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; tem uma afinidade de ligação a 0X4 0 adentro de entre cerca de KD 1CT6 M e cerca de KD 10~12 M da de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; tem a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5; ou compete com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 para a ligação a 0X40.
Descrições dos Desenhos
Figuras 1A-F: Análise por citometria de fluxo com anticorpos humanos anti 0X40 humano. A. Perfil de dispersão em frente em relação a dispersão lateral de células T CD4 humanas ao fim de três dias de estimulação com PHA e IL2. B-F. Células T humanas activadas marcadas com anticorpos humanos anti-OX40 humano ou controlos. A linha espessa representa contrastação nas células na porta activada, enguanto a linha fina representa células na porta em repouso. A marcação das células activadas pelos anticorpos IgG de controlo de isotipo é ilustrada pela linha tracejada nos histogramas. B. 112F32, C. 112V8, D. 112Y55, E. 112Y131, e F. 112Z5.
Figura 2: Contrastação das células humanas T activadas por anticorpos humanos anti-OX40 humano. Os dados de média geométrica da intensidade de fluorescência apresentados são derivados de uma porta de células T activadas semelhante à representada na Figura IA. Estes dados foram utilizados para determinar o KD e o BMAX que se listam na Tabela 3.
Figuras 3A-B: Cinco anticorpos 0X40 competem para a ligação a 0X40. A. Percentagem de inibição de hOX40:mFc ligado a anticorpo revestido que se detectou com IgG-HRP anti-murganho. B. Percentagem de inibição de hOX40:hFc ligado a anticorpo de murganho detectada com IgG-HRP de carneiro anti-humano. Não se mostram os números negativos.
Figuras 4A-B: Cinco anticorpos 0X40 competem para se ligarem a 0X40. A. Percentagem de inibição de células T activadas contrastadas com anticorpos de bloqueio e anticorpos anti-0X40 biotinilados detectados com SA-PE. B. Percentagem de inibição de células T humanas activadas marcadas com anticorpos de murganho anti-OC40 humano e anticorpos biotinilados anti-OX40 detectados com SA-PE. Não se mostram os números negativos.
Figura 5A-B: Bloqueio da ligação de 0X4OL a 0X40 por anticorpos monoclonais humanos anti-0X40 humano medidos por ELISA e por citometria de fluxo. A. Percentagem de inibição do ligando ligado foi detectada com anticorpo secundário anti-FLAG-HRP, por ELISA. B. Percentagem de inibição de OX40L ligado que foi detectada com anticorpo anti-FLAG-PE por citometria de fluxo.
Figuras 6A-C: Os Painéis A-C representam três estudos com três pares diferentes de doadores e mostram o efeito dos anticorpos anti-OX40 sobre a proliferação de células T.
Figuras 7A-C: Anticorpo 112V8G1 recombinante melhorado em doença aguda de xenoenxerto contra hospedeiro. A. Classificação total patológica em bruto. B. Suspensões de célula única dos baços analisadas por citometria de fluxo para detectar a presença de células T humanas. 0 número médio de células T e o desvio padrão de cada população em cada grupo de tratamento é mostrado. C. Mediu-se interferão gama humano no soro de murganhos. A quantidade média de interferão gama em pg/mL é representada para cada conjunto de murganhos acrescida do desvio padrão.
Figuras 8A-C: 0 anticorpo 112V8G1 melhora a doença crónica de xenoenxerto contra hospedeiro. A. Classificações totais patológicas individuais em bruto. B. Número médio de células T humanas nos baços de murganhos, mais desvio padrão tal como determinado por citometria de fluxo. C. Número médio de células T humanas nos nodos periféricos de linfa de murganhos SCID no dia guarenta e oito após a transferência de células T CD4 .
Figuras 9A-C: 0 anticorpo 112V8G4PE melhora a doença aguda de xenoenxerto contra hospedeiro quando é administrado nos dias 0, 3, ou 6. A. Classificações patológicas totais em bruto de murganhos individuais tratados no dia 0. B. Número médio de células T humanas nos baços no dia 12, de murganhos tratados no dia 0, acrescidas do desvio padrão para o grupo. C. Classificações patológicas totais em bruto de murganhos individuais tratados no dia 3 ou no dia 6.
Figura 10: Percentagem de lise especifica por anticorpos IgGl humanos anti-OX40 humano. Os anticorpos IgGl humanos anti-OX40 humano mediam a ADCC dos alvos EL4-OC40 humanos.
Descrição Pormenorizada A invenção baseia-se pelo menos em parte em anticorpos que se ligam especificamente a 0X40 (CD 134) , que, por exemplo, se podem referir como anticorpos 0X40, anti-OX40 ou anticorpos anti-OX40. Os anticorpos que se ligam especificamente a 0X40 incluem os anticorpos de mamífero (humanos, de primatas, etc.), humanizados e quiméricos anti-OX40. Os anticorpos da invenção e as subsequências de anticorpo (fragmentos) que se ligam especificamente a 0X40 incluem anticorpos purificados e isolados, bem como as suas formulações farmacêuticas. A 0X40 é uma glicoproteína com 50 kilo Dalton (KDa) e um membro da superfamília dos receptores do factor de necrose tumoral (TNFRSF), o ligando para 0X40, OX40L (também referido como TNFSF4, CD252), tem sido reportado como estando expresso em células endoteliais, células activadas apresentando antigénicos incluindo macrófagos, células dendrítica, células B e células assassinas naturais. Embora não se pretenda nenhuma ligação a nenhuma teoria, a ligação entre CD40 em células apresentando antigénicos aumenta a expressão de OX40L, tal como o lipopolissacárido (LPS). A expressão de 0X40 em células T pode ser induzida por sinalização através do receptor antigénico das células T. Por exemplo, a 0X40 está expressa em células T recentemente activadas no local da inflamação. As células T CD 4 e CD8 podem regular em alta a 0X40 em condições inflamatórias.
Também se refere 0X40 como CD134, TNFRSF4, ACT35 e TXGP1L. 0X40 inclui formas de mamíferos (por exemplo, primatas, humanos) de 0X40. Os anticorpos 0X40 da invenção incluem, portanto, anticorpos que se ligam especificamente a sequências 0X40 de mamíferos, tais como 0X40 humana. As sequências de 0X40, tais como 0X40 humana, incluem variantes polimórficas. Um exemplo não limitativo de uma 0X40 de comprimento inteiro é uma sequência descrita como:
MCVGARRLGRGPCAALLLLOLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNG
MVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVC
RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSD
AICEDRDPPATQPQETQGPPARP1TVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGL
GLVLGL,LGPLAI3JLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQIDNO:50)
Os anticorpos 0X40, anti-OX40 e anticorpos anti-0X40 referem-se a anticorpos que se ligam especificamente a 0X40. A ligação específica é aquela que é selectiva para um epítopo presente em 0X40. Pode distinguir-se entre a ligação específica e a ligação não específica recorrendo a ensaios conhecidos na técnica (por exemplo, imunoprecipitação, ELISA, citometria de fluxo, transferência Western).
Os anticorpos OX 40 podem ligar-se a diferentes proteínas quando a totalidade ou uma parte de qualquer epítopo antigénico ao qual o anticorpo se liga especificamente estiver presente numa proteína diferente. Deste modo, dependendo da extensão de sequência ou da homologia estrutural do epítopo de 0X40, um anticorpo 0X40 pode ligar-se especificamente a outra proteína que tenha uma homologia sequencial ou estrutural elevada com o epítopo de 0X40. Deste modo, os anticorpos 0X40 podem ligar-se a diferentes proteínas quando estiver presente um epítopo com epítopo com homologia suficiente, sequencial ou estrutural, numa proteína diferente.
Os anticorpos 0X40 da invenção incluem anticorpos isolados e purificados. Os anticorpos da invenção, incluindo anticorpos 0X40 isolados ou purificados não incluem, portanto, seres humanos. 0 termo "isolado" utilizado para modificar uma composição significa que a composição é feita pela mão do homem ou que é separada de uma ou mais outras componentes num ambiente que ocorre naturalmente in vivo, tipicamente através de um ou mais passos ou processos manipulativos. Em geral, as composições que deste modo se separam são substancialmente isentas de um ou mais materiais com os quais se associam normalmente na natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, membranas celulares. Deste modo, uma composição isolada está separada de outras componentes biológicas na célula do organismo no qual a composição corre naturalmente, ou do meio artificial no qual se produz (por exemplo, sinteticamente ou por cultura de células). Por exemplo, um anticorpo 0X40 isolado pode ser obtido de um animal no qual o anticorpo seja produzido (por exemplo, um mamífero não transgénico ou um mamífero transgénico, tal como um roedor (murganho) ou um animal ungulado (bovino)) e é separado dos outros polipéptidos e de ácido nucleico. Assim, o soro contendo o anticorpo obtido do animal é considerado isolado. 0 termo "isolado" não exclui formas físicas alternativas, por exemplo, um anticorpo isolado poderia incluir subsequências do anticorpo, quimeras, multímeros, ou formas derivatizadas. 0 termo "purificado", utilizado para modificar uma composição, refere-se a uma composição isenta da maior parte ou de substancialmente todos os materiais com os quais e associa tipicamente na natureza. Os anticorpos purificados são tipicamente removidos das componentes normalmente presentes no meio do anticorpo. Assim, um sobrenadante de anticorpo separado da cultura de células hibridoma que produz o anticorpo é considerado purificado. Purificado não obriga, portanto, a uma pureza absoluta, e é específico do contexto. Adicionalmente, uma composição "purificada" pode ser combinada com uma ou mais outras moléculas. Assim, o termo "purificado" não exclui combinações de composições. Pode determinar-se a pureza por qualquer método apropriado, incluindo, por exemplo, espectroscopia no UV, cromatografia (por exemplo, HPLC, em fase gasosa), electroforese sobre gel (por exemplo, contrastação com prata ou de Coomassie) e análise de sequências (péptidos e ácido nucleico).
As proteínas "purificadas" bem como ácido nucleico purificado incluem proteínas e ácidos nucleicos produzidos por métodos de purificação padrão. 0 termo também inclui proteínas e ácidos nucleicos produzidos por expressão recombinante numa célula hospedeira bem como por síntese química. "Purificada" também pode referir-se a uma composição na qual o nível de contaminantes seja inferior a um nível que seja aceitável para uma aqência requladora condicionando a administração a seres humanos ou a animais não humanos, por exemplo, a Food and Drug Administration (FDA) .
Os anticorpos 0X40 da invenção incluem anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular 0X40. Em concretizações especiais, anticorpos 0X40 exemplificativos ligam-se especif icamente a três "epítopos" em 0X40, tal como se determina por um ensaio de bloqueio cruzado. Uma sequência exemplificativa e não limitativa de uma sequência do domínio extracelular de 0X40 humana é descrita como: MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPS (SEQ ID NO:51).
Os epítopos peptídicos são tipicamente sequências curtas de aminoácidos, por exemplo entre cerca de cinco e 15 aminoácidos de comprimento. São conhecidas metodologias de identificar epítopos na técnica e estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. N2 4.708.871. Em suma, pode sintetizar-se um conjunto de oligopéptidos com sobreposição, derivados do polipéptido 0X40, e ligar-se a um conjunto de alfinetes em fase sólida, com um oligopéptido único bem determinado ligado a cada alfinete. 0 conjunto de alfinetes pode incluir uma placa de microtitulação com 96 poços, permitindo ensaiarem-se em simultâneo 96 oligopéptidos. Podem identificar-se de um modo semelhante os epítopos descontínuos utilizando rastreios com péptidos altamente sobrepostos, mas com comprimentos diferentes (por exemplo, com entre 6 e 15 resíduos de aminoácido) imobilizados a alta densidade sobre um suporte membranar. Utilizam-se concentrações elevadas de anticorpo e detecta-se a ligação por imunodetecção indirecta. Caso se identifiquem sequências com ligações múltiplas, elas são identificadas e separadas com sequências intervenientes e quando os péptidos individuais não são reconhecidos, identificou-se um epítopo descontínuo. Esperar-se-ia que as sequências separadas formem uma área contínua à superfície da proteína alvo e representem um epítopo conformacional (Reineke, et ai., Protein Sei. 7: 951 (1998). Em alternativa, estão disponíveis comercialmente estojos de apresentação de bibliotecas de péptidos em fagos (New England BioLabs) para se mapearem epítopos. Podem utilizar-se estes e outros métodos para se determinar a afinidade de ligação para qualquer subconjunto possível de aminoácidos consecutivos, para se identificar o epítopo a que um determinado anticorpo se liga. Podem também identificar-se os epitopos por inferência quando se utilizam sequências peptidicas com o comprimento de epitopos para imunizar animais dos quais são obtidos os anticorpos que se ligam à sequência peptídica. Podem também prever-se epitopos contínuos utilizando programas computacionais tais como o BEPITOPE (Odorico et al., J. Mol. Recognit. 16: 20 (2003)).
Os anticorpos da invenção são moléculas de imunoglobulina monoclonal ou policlonal que pertencem a qualquer das classes de anticorpo, tais como IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, e a qualquer sua subclasse. São exemplos de subclasses de IgG, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Um anticorpo "monoclonal" refere-se a um anticorpo que se basei em, é obtido de ou derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou de fago. Um anticorpo "monoclonal" é, portanto, definido estruturalmente, e não o método pelo qual ele é produzido. São exemplos de anticorpos específicos que se ligam particularmente a 0X40 os que se denotam como 112F32 (ATCC N2 PTA-7217, depositado a 17 de Novembro de 2005), 112V8 (ATCC N2 PTA-7219, depositado a 17 de Novembro de 2005), 112Y55 (ATCC N2 PTA-7220, depositado a 17 de
Novembro de 2005), 112Y131 (ATCC Na PTA-7218, depositado a 17 de Novembro de 2005), e 112Z5 (ATCC N2 PTA-721-6, depositado a 17 de Novembro de 2005), que são anticorpos humanos monoclonais anti-OX40 humana (anticorpos humanos que se ligam a 0X40 humana) . Os anticorpos 0X40 exemplificativos da invenção 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131, e 112Z5 têm sequências maduras da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustram nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49. A designação de 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131, e 112Z5 pode referir-se quer ao anticorpo, quer a uma linha de células (por exemplo; hibridoma, célula CHO ou outra célula hospedeira) que produza o anticorpo 0X40.
Produzem-se exemplos de anticorpos humanos anti-0X40 humana utilizando murganhos trans-cromossómicos (murganhos KM™) (WO 02/43.478, WO 02/092.812, e Ishida, et. ai., IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Resumo (2000)) imunizados com diversas formas de 0X40 solúvel recombinante humano (OX40-hIgGl), proteina de fusão (hOX40:hFc) ou células T humanas activadas que expressam 0X40. Identificaram-se os anticorpos exemplificativos que marcavam especificamente células T humanas activadas e não células T em repouso. Os anticorpos exemplificativos contrastavam de modo detectável linhas de células humanas tranfectadas de forma estável com 0X40, EL4-OX40 e CHO-0X40, e linhas de células de origem não transformadas, indicando que os anticorpos se ligam especificamente a 0X40 humana. Os anticorpos exemplificativos também se ligam a 0X40 de macaco Rhesus e a 0X40 de macaco cinomolgo, mas não se ligam detectavelmente a 0X40 murino.
Os anticorpos da invenção podem ter sequências da cadeia leve kapa ou lambda, quer de comprimento inteiro tal como em anticorpos com ocorrência natural, misturas delas (isto é, fusões de sequências de cadeia kapa e lambda), e as suas subsequências/fragmentos. s moléculas de anticorpo com ocorrência natural contêm duas cadeias leves kapa ou duas lambda.
Os anticorpos 0X40 descritos neste documento também incluem, por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente a uma sequência de aminoácidos à qual se liga o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32 (ATCC N2 PTA-7217, depositada a 17 de Novembro de 2005) , 112V8 (ATCC N2 PTA-7219, depositada a 17 de Novembro de 2005), 112Y131 (ATCC N° PTA-7218, depositada a 17 de Novembro de 2005), 112Y55 (ATCC N2 PTA-7220, depositada a 17 de Novembro de 2005), ou 112Z5 (ATCC N2 PTA-7216, depositada a 17 de Novembro de 2005) . Os anticorpos 0X40 descritos neste documento incluem adicionalmente, por exemplo, anticorpos que se ligam especificamente a um domínio extracelular de 0X40 ao qual se liga um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Os anticorpos 0X40 descritos neste documento incluem adicionalmente, por exemplo, anticorpos que têm a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Estes anticorpos 0X40 exibem tipicamente um bloqueio parcial ou completo, uma redução ou uma inibição da ligação de anticorpos 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40.
Os anticorpos 0X40 que se ligam especificamente a uma sequência de aminoácidos à qual se liga o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5, e anticorpos cuja especificidade de ligação de anticorpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 pode ser identificada utilizando ensaios de competição na ligação. Podem selecionar-se os anticorpos com base na capacidade de competir pela ligação com anticorpos 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40. A capacidade de um anticorpo para competir para a ligação de um anticorpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5 a 0X40, ou para inibir, reduzir, diminuir, evitar ou bloquear a ligação de anticorpo 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40, pode ser determinada por diversos ensaios conhecidos na técnica, incluindo ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Um anticorpo descrito neste documento pode inibir ou evitar a ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotado como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40, tal como determinado num ensaio ELISA. Um anticorpo descrito neste documento pode inibir pelo menos 50 % da ligação a um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotado como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, ou 112Z5 a 0X40, tal como determinado num ensaio ELISA.
Os anticorpos 0X40 descritos neste documento também incluem anticorpos que se ligam especificamente a 0X40 e que não impedem nem bloqueiam a ligação do anticorpo de murganho anti-OX40 humana L106 (Becton Dickinson, número de catálogo 340420) a 0X40. Incluem-se adicionalmente anticorpos 0X40 gue se ligam especificamente a 0X40 mas não inibem, reduzem ou diminuem a ligação do anticorpo L106 a 0X40. Descreveu-se o anticorpo L106, por exemplo, na patente U.S. N2 6,277.962, em WO 95/12.673 e em Schlossman et al.r editores (Leukocyte Typing V: White Cell
Diferentiation Antigens, Oxford: Oxford University Press (1995) págs. 1157-60)
Os anticorpos 0X40 descritos neste documento incluem anticorpos que se ligam especificamente a 0X40 e que tenham afinidade maior ou menor para 0X40 do que os anticorpos produzidos por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Por exemplo, são proporcionados anticorpos com uma afinidade de ligação para 0X40 adentro de cerca de 1-10.000 vezes (por exemplo, afinidades 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 ou 1000- 10,000 vezes maior ou menor do que, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes valores) um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Os anticorpos 0X40 descritos neste documento incluem também, portanto, anticorpos com maior ou menor afinidade de ligação para 0X40 do que o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Um anticorpo 0X40 pode ter uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de entre cerca KD 10~6 M e cerca de KD 10 M, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes valores, de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5.
Pode determinar-se a afinidade de ligação pelas velocidades de associação (Ka) e dissociação (Kd) . A constante de equilíbrio da afinidade, KD, é a razão Ka/Kd. A associação (Ka) e a dissociação (Kd) são velocidades que se podem determinar utilizando ressonância do plasmão superficial (SPR) (Rich e Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 11: 54 (2000); Englebienne, Analyst. 123: 1599 (1998)). São conhecidas a instrumentação e as metodologias para detecção e monitorização em tempo real das velocidades de ligação, e encontram-se comercialmente disponíveis (BiaCore 2000, Biacore AB, Upsala, Suécia; e Malmqvist, Biochem. Soc. Trans. 27: 335 (1999)) : os valores de KD podem ser definidos como a concentração do anticorpo 0X40 necessária para saturar metade (50 %) dos locais de ligação na 0X40.
Os anticorpos 0X40 da invenção incluem anticorpos capazes de se ligarem ao 0X40 presente numa ou mais células in vivo, em isolados de células primárias, em células após a passagem, em células de cultura e em células imortalizadas. Os tipos específicos não limitativos de células que podem expressar 0X40 incluem células T activadas e outras células T (por exemplo, células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras) e células não T. Incluem-se nos exemplos de células não T tais como células assassinas naturais (NK), granulócitos (neutrófilos), monócitos e células B. As células que não expressam naturalmente 0X40 podem ser levadas a expressar 0X40, por exemplo, transfectando ou transformando células com um ácido nucleico codificando para 0X40. Os anticorpos 0X40 capazes de se ligar a 0X40 podem ligar-se a uma ou mais células transfectadas ou transformadas que expressam ou produzem 0X40.
Os anticorpos descritos neste documento incluem anticorpos que se ligam a 0X40 e que modulam uma função ou uma actividade de 0X40 in vivo ou in vitro (por exemplo num sujeito) . Tal como se utiliza neste documento, o termo "modular" e as suas variações gramaticais, quando utilizadas em referência a uma actividade ou função de 0X40, significam que a actividade ou função de 0X40 é detectavelmente afectada, alterada ou modificada. Deste modo, um anticorpo 0X40 que modula uma actividade ou uma função de 0X40 é um anticorpo que detectavelmente afecta, altera ou modifica uma ou mais actividades ou funções de 0X40, que podem incluir, por exemplo, a ligação de 0X40 a um ligando de 0X40, a sinalização mediada por 0X40 ou uma reacção celular mediada por 0X40 ou modulável por 0X40, ou outra actividade ou função de 0X40 tal como as descritas neste documento ou que sejam de outra forma conhecidas ou o possam ser.
Incluem-se nas diversas actividades e funções não limitativas de 0X40 que podem ser moduladas, por exemplo, a sinalização mediada por 0X40 ou uma reacção celular mediada por 0X40 ou modulável por 0X40, ou uma proliferação ou expansão celular (por exemplo, linfócitos tais como células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras), sobrevivência celular ou apoptose (por exemplo, linfócitos tais como células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras), citoquinas (por exemplo, Thl, Th2 e citoquinas não Thl/Th2) e expressão ou produção de interferão, produção ou expressão de proteína anti-apoptótica ou pro-apoptótica, e tratamento, prevenção ou melhoria de patologias, doenças, condições fisiológicas, e os seus sintomas. As citoquinas específicas que se modulam incluem mas não se limitam a IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-a, interferão γ, e GM-CSF {in vivo ou in vitro) . Incluem-se nas proteínas a expressar anti-apoptóticas ou pro-apoptóticas mas não se limitam a Bcl-xL, Bcl-2, Bad e Bim. Outras actividades e funções não limitativas de 0X40 que se podem modular incluem, por exemplo, a activação de NF-kB, a manutenção da actividade de PKB (Akt) , e a regulação em alta da survivina (Ambrosini et al., Nat. Med. 3: 917 (1997); e Song et al., Immunity 22: 621 (2005)).
Os exemplos de anticorpos constantes deste documento incluem, portanto, anticorpos que modulam uma ou mais de entre a sinalização mediada por 0X40 ou uma reacção celular mediada por 0X40, proliferação celular (por exemplo, células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras) , de sobrevivência celular ou apoptose (por exemplo, células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras), citoquinas (por exemplo, Thl, Th2 e outras citoquinas não Thl/Th2, por exemplo, IL-17, IL-23 e IL-26) e expressão ou produção de interferão tal como Thl, Th2, não Thl/Th2, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-14, IL-16, IL-17, IL-23, IL-26, TNF-a, interferão γ, e GM-CSF (in vivo ou in vitro) , expressão de proteínas anti-apoptóticas ou pro-apoptóticas (por exemplo, Bcl-xL, Bcl-2, Bad ou Bim), e tratamento, prevenção ou melhoria de patologias, doenças, e seus sintomas. Em aspectos especiais, os anticorpos da invenção modulam a expansão ou a sobrevivência de células T, modulam os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou eliminam células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. Em aspectos específicos adicionais, os anticorpos da invenção reduzem ou eliminam diversas células T auto-reactivas específicas para um auto-antigénico (por exemplo, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína de oligodendrócitos de mielina(MOG), proteína de proteolípidos (PLP), colagéneo, antigénicos de tecido sinovial das articulações, insulina, ácido glutâmico descarboxilase, antigénicos intestinais, antigénicos da tiróide, proteínas histona, antigénicos do músculo ou antigénicos da pele. 0 termo "antagonista" e as suas variações gramaticais utilizadas em referência a um anticorpo 0X40, significam um anticorpo 0X40 que reduz, diminui, inibe, retarda, evita ou bloqueia a ligação de 0X40 a ligandos de 0X40, ou reduz, diminui, inibe, retarda, evita ou bloqueia uma actividade ou função de 0X40 0 termo "agonista" e as suas variações gramaticais utilizadas em referência a um anticorpo 0X40, significam um anticorpo 0X40 que estimula, aumenta, incrementa, promove ou induz a ligação de 0X40 a ligandos de 0X40, ou estimula, aumenta, incrementa, promove ou induz uma actividade ou função induzida por 0X40. Os anticorpos 0X40 tal como descritos neste documento incluem, portanto, anticorpos antagonistas e agonistas.
Os anticorpos antagonistas de 0X40 descritos neste documento, bloqueiam, reduzem, diminuem, inibem ou evitam uma ou mais actividades ou funções de 0X40 in vitro ou in vivo, por exemplo. São proporcionados anticorpos 0X40 descritos neste documento que podem bloquear, reduzir, diminuir, inibir ou evitar a ligação de ligandos de 0X40 (OX40L) a 0X40 (CD134) sob forma solúvel ou a 0X40 expresso à superfície de células T activadas. Um anticorpo 0X40 descrito neste documento pode induzir a lise de células EL4-humanas expressão 0X40 ou de células T activadas humanas na presença de células líticas efectivadoras (por exemplo, células assassinas naturais, macrófagos ou neutrófilos). Em aspectos específicos, a percentagem (%) de lise celular específica induzida a 10 pg/mL de anticorpo é de entre cerca de 15 a 75 %, 25 a 65 %, ou 30 a 60 %, e pode ser tão elevada como 100 %, dependendo dos níveis de base nos estudos. Além disto, a incubação de anticorpos 0X40 exemplificativos com células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) co-cultivadas com PBMC de um doador alogénico reduz a proliferação celular por inibir células T CD4 e/ou T CD8 alo-reactivas.
Os anticorpos 0X40 descritos neste documento incluem formas modificadas, tais como com substituições (por exemplo, substituições de aminoácidos) , adições e eliminações (por exemplo, subsequências ou fragmentos), que se podem referir como "variantes". Estas formas modificadas e variantes de anticorpos mantêm pelo menos uma função ou actividade parcial em relação a um anticorpo de referência 0X40, por exemplo, um anticorpo 0X40 denotado como 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 e 112Z5, tais como a ligação a 0X40, ou a modulação de uma actividade ou função de 0X40 (por exemplo, sinalização de 0X40) . Deste modo, um anticorpo 0X40 modificado pode manter por exemplo pelo menos uma ligação parcial a 0X40 o a capacidade de modular uma ou mais funções ou actividades de 0X40 (por exemplo, sinalização, uma reacção celular, etc.).
Tal como se utiliza neste documento, o termo "modificar" e as suas variações gramaticais, significa que a composição se desvia de uma composição de referência. As proteínas, ácidos nucleicos e outras composições modificadas podem ter uma actividade maior ou menor do que ou uma função distinta de uma proteína, um ácido nucleico ou outra composição não modificada, de referência.
Os anticorpos modificados descritos neste documento podem manter uma ou mais de entre uma capacidade de modular a expansão ou a sobrevivência de células T, modular os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou eliminar células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. Os anticorpos modificados descritos neste documento podem manter uma ou mais de entre uma capacidade de reduzir ou eliminar números de células T auto-reactivas especificas para um auto-antigénico ou células B produzindo anticorpos específicos para um auto-antigénico (por exemplo, uma proteína básica de mielina (MBP), lipoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG), proteína proteolipídica (PLP), colagéneo, antigénicos de tecido sinovial de articulações, insulina, ácido glutâmico descarboxilase, antigénicos intestinais, antigénicos da tiróide, proteínas histona, antigénicos do músculo ou antigénicos da pele).
As sequências maduras da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustram nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49 podem ter uma ou mais substituições de aminoácidos adentro ou fora da região constante, de uma região determinante da complementaridade (CDR) ou de uma região do quadro (FR). Uma substituição de um aminoácido pode ser uma substituição conservadora adentro ou fora de uma região constante, uma região determinante da complementaridade (CDR) ou uma região do quadro (FR) . Os anticorpos descritos neste documento podem ser 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou mais idênticos, ou idênticos em um valor ou gama de valores numéricos qualquer adentro ou incluindo estes valores de percentagem, a uma sequência de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, SEQ ID NO: 7-10 ou SEQ ID NO: 44-49. Os números típicos de resíduos em que ocorrem substituições incluem 1-3, 3-5, 5-10 resíduos de aminoácido, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes valores, ou mais resíduos de aminoácidos.
Estes anticorpos que incluem substituições de aminoácidos podem ser codificados por um ácido nucleico. Consequentemente, também se proporcionam sequências de ácidos nucleicos codificando para anticorpos incluindo substituições de aminoácidos.
Os termos "identidade" ou "idêntico" significam que duas ou mais entidades referenciadas são as mesmas. Deste modo, quando duas sequências proteicas (por exemplo, anticorpos 0X40) são idênticas, elas têm a mesma sequência de aminoácidos, pelo menos adentro da região ou porção referenciada. Uma "área de identidade" refere-se a uma porção de duas ou mais entidades referenciadas, que sejam a mesma. Deste modo, quando duas sequências proteicas são idênticas ao longo de uma ou mais regiões das sequências, elas partilham a sua identidade naquelas regiões. "Identidade substancial" significa que uma molécula é estruturalmente ou funcionalmente conservada de tal modo que tem ou se prevê que tenha pelo menos uma função ou actividade parcial de uma ou mais das funções ou actividades da molécula de referência, ou da região ou porção relevante/correspondente da molécula de referência com a qual partilha a identidade. Assim, um polipéptido (por exemplo, um anticorpo 0X40) com identidade substancial tem ou prevê-se que tenha pelo menos uma actividade ou função parcial do polipéptido de referência (por exemplo, um anticorpo 0X40). Por exemplo, numa concretização especifica, um anticorpo 0X40 contendo uma ou mais modificações (por exemplo, substituições, eliminações ou adições de aminoácidos) , que mantém pelo menos uma actividade ou função parcial de anticorpo 0X40 não modificado, é considerado como tendo identidade substancial ao anticorpo 0X40 de referência.
Devido a uma variação entre proteínas estruturalmente e funcionalmente relacionadas, a quantidade de identidade de sequência que é necessária para se manter uma função ou actividade depende da proteína, da região e da função ou actividade dessa região. Embora possa existir tão pouco como 30 % de identidade da sequência de aminoácidos para que proteínas mantenham uma determinada actividade ou função, tipicamente existirá mais, por exemplo, 50 %, 60 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, de identidade em relação a uma sequência de referência. A extensão da identidade entre duas sequências pode ser avaliada utilizando um programa de computador e um algoritmo matemático conhecidos na técnica. Estes algoritmos que conseguem calcular percentagens de identidade entre sequências (homologia) levam em geral em conta espaços vazios das sequências e não sobreponibilidade ao longo da região de comparação. Por exemplo, um algoritmo de pesquisa BLAST (por exemplo, BLAST 2.0) (veja-se, por exemplo, Altschul et ai., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990), publicamente disponível através da NCBI) tem parâmetros de pesquisa exemplificativos como se seguem: Não sobreponibilidade -2; abertura de vazio 5; extensão do vazio 2. Para comparações entre sequências polipeptidicas, utiliza-se tipicamente um algoritmo BLASTP em combinação com uma matriz de classificações, tal como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Também se utilizam os programas de comparação de sequências FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH para quantificar a extensão da identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)). Também foram desenvolvidos programas para quantificar a similaridade estrutural entre proteínas recorrendo a um mapeamento topológico baseado em Delaunay (Bostick et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304: 320 (2003)).
Uma "substituição conservadora" é a substituição de um aminoácido por um resíduo semelhante biologicamente, quimicamente ou estruturalmente similar. Biologicamente similar significa que a substituição não destrói uma actividade biológica, por exemplo, a actividade de ligação de 0X40. Estruturalmente semelhante significa que os aminoácidos têm cadeias laterais com comprimento similar, tais como entre alanina, glicina e serina, ou uma dimensão similar. A similaridade química significa que os resíduos têm a mesma carga ou são ambos hidrofílicos ou hidrofóbicos. Incluem-se nos exemplos específicos a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina, por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, de ácido glutâmico por ácido aspártico, ou de glutamina por asparagina, de serina por treonina, e outras semelhantes.
Os anticorpos modificados também incluem os que tenham um ou mais D-aminoácidos a substituir L-aminoácidos (e suas misturas), análogos estruturais e funcionais, por exemplo, peptidomiméticos com aminoácidos sintéticos ou não naturais ou análogos de aminoácidos e formas derivatizadas. As modificações incluem estruturas cíclicas tais como uma ligação amida de topo a topo entre os terminais amino e carboxílico da molécula ou ligações dissulfureto intramolecular ou intermolecular.
Incluem-se nos exemplos não limitativos adicionais e particulares de modificações de aminoácidos as subsequências de 0X40 e os fragmentos. Os exemplos de subsequências e fragmentos de 0X40 incluem uma porção de uma sequência de 0X4 0 à qual se liga um exemplo de anticorpo 0X40 descrito neste documento. Também se incluem nas subsequências e fragmentos exemplificativos de 0X40 uma porção imunogénica, por exemplo, uma porção de 0X40 que inclua uma sequência à qual se ligue um anticorpo 0X40 exemplificativo descrito neste documento. São descritos neste documento anticorpos 0X40 e ácidos nucleicos codificando para subsequências de anticorpo 0X40 ou seus fragmentos, que mantêm, pelo menos em parte, uma função ou actividade de um anticorpo 0X40 não modificado ou de referência. Tal como se utiliza neste documento, o termo "subsequência" ou "fragmento" significa uma porção da molécula de comprimento inteiro. Uma subsequência de um anticorpo 0X40 codificando para um anticorpo 0X40 tem pelo menos um aminoácido a menos do que um 0X40 de comprimento inteiro (por exemplo, a eliminação de um ou mais aminoácidos internos ou terminais de qualquer um dos terminais, amino ou carboxilo). Uma subsequência de um anticorpo 0X4 0 tem pelo menos um aminoácido a menos do que um anticorpo 0X40 de comprimento inteiro. Uma subsequência de um ácido nucleico tem pelo menos um nucleótido a menos do que a sequência do ácido nucleico de comprimento inteiro utilizado para comparação. As subsequências podem, portanto, ter um comprimento qualquer até ao comprimento inteiro da 0X40 nativa.
As subsequências e fragmentos do anticorpo 0X40 da invenção incluem uma sequência da região variável madura da cadeia pesada ou leve tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49. As subsequências do anticorpo 0X40 e fragmentos da invenção também incluem Fab, Fab' e F(ab')2/ Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv), Fv ligados por dissulfureto (sdFv), fragmentos do domínio VL e VH.
As subsequências e fragmentos do anticorpo 0X40 podem ter a afinidade de ligação como o anticorpo de comprimento inteiro, a especificidade de ligação como o anticorpo de comprimento inteiro, ou uma ou mais actividades ou funções como o anticorpo de comprimento inteiro, por exemplo, uma função ou actividade de antagonista de 0X40 ou de anticorpo agonista. Os termos "subsequência funcional" e "fragmento funcional", quando se referem a um anticorpo, significam uma porção de anticorpo que mantém pelo menos uma parte de uma ou mais funções ou actividades como o anticorpo de comprimento inteiro de referência, por exemplo, uma função ou uma actividade do anticorpo 0X40. Por exemplo, uma subsequência ou um fragmento de anticorpo que se ligue a 0X40 ou a um fragmento de 0X40 é considerada uma subsequência funcional.
As subsequências e fragmentos de anticorpo podem ser combinados. Por exemplo, as subsequências VL ou VH podem ser ligadas por uma sequência de ligação formando deste modo uma quimera VL-VH. Uma combinação de subsequências de Fv de cadeia singela (scFv) pode ser ligada por uma sequência de ligação formando desse modo uma quimera scFv - scFv. As subsequências e fragmentos de anticorpo 0X40 incluem anticorpos de cadeia singela ou regiões variáveis por si sós ou em combinação com todas ou com uma porção de outras subsequências de anticorpos 0X40.
As subsequências e fragmentos de anticorpo podem ser preparados por hidrólise proteolítica de um anticorpo, por exemplo, por digestão com pepsina ou papaína de anticorpos inteiros. As subsequências e fragmentos de anticorpo produzidos por clivagem enzimática com pepsina proporcionam um fragmento 5S denotado F(ab')2· Este fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente redutor tiol para produzir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Em alternativa, uma clivagem enzimática utilizando pepsina origina directamente dois fragmentos monovalentes Fab' e o fragmento Fc (vejam-se, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.036.945 e 4.331.647; e Edelman et al., Methods Enzymol. 1: 422 (1967)) . Outros métodos de clivar anticorpos, tais como a separação das cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve-pesada, uma clivagem adicional dos fragmentos, ou outro enzima ou produto químico também podem ser utilizados.
As proteínas e os anticorpos, bem como suas subsequências e fragmentos, podem ser produzidos por metodologia genética. Incluem-se nas técnicas a expressão da totalidade ou de uma parte do gene codificando para a proteína ou anticorpo numa célula hospedeira tal como células Cos ou em E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam o comprimento inteiro ou uma subsequência, por exemplo, um scFv (veja-se, por exemplo, Whitlow et al., Em: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991), Bird et al., Science 242: 423 (1988); e a Patente U.S. N2 4.946.778). Podem produzir-se anticorpos de cadeia singela Fv e anticorpos tal como se descreve nas Patentes U.S. Nos 4.946.778 e 5.258.498;
Huston et al., Methods Enzymol. 203: 46 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995 (1993); e Skerra et al., Science 240: 1038 (1988).
As formas modificadas incluem sequências derivatizadas, por exemplo, aminoácidos nos quais os grupos amino livres formem cloridratos de amina, grupos p-toluenossulfonilo, grupos carbobenzoxilo; nos quais os grupos carboxilo formem sais, ésteres metilicos e etílicos; nos quais os grupos hidroxilo livres formem derivados 0-acilo ou 0-alquilo, bem como os derivados de aminoácidos com ocorrência natural, por exemplo, 4-hidroxiprolina em vez de prolina, 5-hidroxilisina em vez de lisina, homosserina em vez de serina, ornitina em vez de lisina, etc. Podem produzir-se modificações utilizando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, mutagénese baseada em PCR dirigida ao local, mutagénese por eliminação e por inserção, modificação química e mutagénese, ligações cruzadas, etc.).
As formas modificadas de proteína (por exemplo, anticorpo), de ácido nucleico, e de outras composições incluem adições e inserções. Por exemplo, uma adição pode ser a ligação covalente ou não covalente de qualquer tipo de molécula a uma proteína (por exemplo, anticorpo), um ácido nucleico ou outra composição. Tipicamente as adições e inserções proporcionam uma função ou actividade distinta.
As adições e inserções incluem fusões (quiméricas) de polipéptidos ou de sequências de ácido nucleico, obtendo-se uma sequência contendo uma ou mais moléculas não normalmente presentes numa sequência de referência nativa (de tipo selvagem), ligadas de modo covalente à sequência. Um exemplo especifico é uma sequência de aminoácidos de outra proteína (por exemplo, anticorpo), para se produzir uma proteína multifuncional (por exemplo, um anticorpo multiespecifico).
Os anticorpos descritos neste documento também incluem quimeras ou fusões com um ou mais domínios adicionais ligados de modo covalente para proporcionar uma função ou actividade distinta ou complementar. Incluem-se nos anticorpos quimeras ou fusões em que duas ou mais sequências de aminoácidos estão ligadas entre si, que não existem naturalmente na natureza.
De acordo com a invenção, proporcionam-se anticorpos 0X40 e ácido nucleico codificando para anticorpos, que incluem um domínio heterólogo. Os domínios heterólogos podem ser uma adição ou inserção de um aminoácido, mas não se restringem a resíduos de aminoácidos. Assim, um domínio heterólogo pode consistir em qualquer de entre uma série de diferentes tipos de espécies funcionais pequenas ou grandes. Incluem-se nestas espécies ácido nucleico, péptido, hidrato de carbono, lípido ou pequenos compostos orgânicos, tais como um fármaco, metais (ouro, prata), etc.
Incluem-se nos exemplos particulares não limitativos de dominios heterólogos, por exemplo, marcadores, rótulos detectáveis e agentes citotóxicos. Incluem-se nos exemplos particulares de marcadores e de rótulos detectáveis os marcadores T7-, His-, myc-, HA- e FLAG-; enzimas (peroxidase de raiz forte, urease, catalase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, cloranfenicol transferase) ; substratos de enzimas; ligandos (por exemplo, biotina); receptores (avidina); radionuclidos (por exemplo, C14, S35, P32, P33, Η3, I125 e I131) ; reagentes densos em electrões; moléculas de transferência de energia; rótulos paramagnéticos; fluoróforos (fluoresceina, rodamina, ficoeritrina); cromóforos; quimioluminescentes (imidazole, luciferase); e agentes bioluminescentes. Como exemplos particulares de agentes citotóxicos incluem-se toxina da difteria, toxina da cólera e rícino.
As sequências de ligação podem ser inseridas entre a proteína (por exemplo, anticorpo) , o ácido nucleico, ou outra composição, e a adição ou inserção (por exemplo, domínio heterólogo) de modo a que as duas entidades mantenham, pelo menos em parte, uma função ou actividade distinta. As sequências de ligação podem ter uma ou mais propriedades que incluem uma estrutura flexível, uma incapacidade de formar uma estrutura secundária ordenada ou um carácter hidrofóbico ou carregado, que poderia promover ou interactuar com qualquer dos domínios. Os aminoácidos que se encontram tipicamente nas regiões flexíveis das proteínas incluem glicina, asparagina e serina. Outros aminoácidos guase neutros, tais como treonina e alanina, também podem ser utilizados na sequência de ligação. 0 comprimento da sequência de ligação pode variar (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N2 6.087.329). Os agentes de ligação incluem adicionalmente ligações químicas cruzadas e agentes de conjugação, tais como derivados sulfossuccinimidilo (sulfo-SMCC, sulfo-SMPB), suberato de dissuccinimidilo (DSS), glutarato de dissuccinimidilo (DSG) e tartarato de dissuccinimidilo (DST) .
Incluem-se nos exemplos adicionais de adições a glicosilação, ácidos gordos, lipidos, a acetilação, a fosforilação, a amidação, a formilação, a ubiquitinação, e derivatização com grupos protectores ou bloqueantes, e qualquer uma de numerosas modificações químicas. Outras permutações e possibilidades serão facilmente aparentes aso indivíduos com conhecimentos médios da técnica, e são consideradas como integrando o âmbito da invenção.
Podem fabricar-se estas sequências modificadas utilizando tecnologia de ADN recombinante através da expressão nas células ou da tradução in vitro. Podem também fabricar-se sequências polipeptídicas e de ácido nucleico por síntese química utilizando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, num aparelho de síntese automática de péptidos (veja-se, por exemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Pode fabricar-se proteína 0X40 adequada para gerar anticorpos por qualquer uma de uma série de técnicas de purificação proteica habituais ou de expressão recombinante. Por exemplo, pode fabricar-se uma sequência de 0X40 por técnicas padrão de síntese peptídica, tais como a síntese em fase sólida. Uma parte da proteína pode conter uma sequência de aminoácidos tal como um marcador T7 ou uma sequência de polihistidina para facilitar a purificação da proteína expressa ou sintetizada. A proteína pode ser expressa numa célula e purificada. A proteína pode ser expressa fazendo parte de uma proteína maior (por exemplo, uma fusão ou quimera) por métodos recombinantes. São conhecidos na técnica métodos de produzir anticorpos policlonais e monoclonais. Por exemplo, 0X40 ou um seu fragmento imunogénico, opcionalmente conjugado com um veículo tal como hemocianina de Megathura crenulata (KLH) ou ovalbumina (por exemplo, BSA), ou misturado com um adjuvante tal como adjuvante de Freund completo ou incompleto; e utilizar-se para imunizar um animal. Utilizando tecnologia de hibridoma, as células do baço de animais imunizados que reagem a 0X40 podem ser isoladas e fundidas com células de mieloma. Os anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas podem ser rastreados para se detectar reactividade com 0X40 ou com um seu fragmento imunogénico.
Incluem-se nos animais que podem ser imunizados primatas, murganhos, ratos, coelhos, cabras, carneiros, vacas ou cobaias. A imunização inicial e qualquer imunização subsequente opcional podem ser feitas por via endovenosa, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea. Adicionalmente, para se aumentar a reacção imunológica, pode acoplar-se o antigénico com outra proteina tal como ovalbumina ou hemocianina de Megathura crenulata (KLH), tiroglobulina e toxóide do tétano, ou misturar-se com um adjuvante tal como o adjuvante de Freund completo ou incompleto. A imunização inicial e qualquer imunização opcional subsequente podem ser levadas a cabo por via intraperitoneal, intramuscular, intraocular ou subcutânea. As imunizações subsequentes podem ser levadas a cabo à mesma concentração ou a concentrações diferentes da preparação de 0X40, e podem ocorrer a intervalos regulares ou irregulares.
Incluem-se nos animais os geneticamente modificados para incluir locais de genes humanos, que se podem utilizar para produzir anticorpos humanos. São descritos animais transgénicos com um ou mais genes de imunoglobulina humana, por exemplo, na Patente U.S. N2 5.939.598, no WO 02/43.478, e no WO 02/092.812. Utilizando tecnologia convencional de hibridoma, as células do baço dos murganhos imunizados que reagem fortemente ao antigénico podem ser isoladas e fundidas com células de mieloma. Pode obter-se um anticorpo monoclonal que se liga a 0X40. São descritos métodos adicionais para produzir anticorpos policlonais humanos e anticorpos policlonais humanos (veja-se, por exemplo, Kuroiwa et al.r Nat. Biotechnol. 20: 889 (2002); WO 98/24.893; WO 92/01.047; WO 96/34.096; WO 96/33.735; Patentes U.S. Nos 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598). O termo "humano", quando utilizado em referência a um anticorpo, significa que a sequência de aminoácidos do anticorpo é completamente humana, isto é, regiões variáveis de cadeias humanas pesada e leve e de regiões constantes humanas. Assim, todos os aminoácidos são humanos ou existem num anticorpo humano. Um anticorpo que seja não humano pode ser tornado completamente humano substituindo os resíduos de aminoácido não humanos por resíduos de aminoácido humanos que existam num anticorpo humano. Os resíduos de aminoácido presentes em anticorpos humanos, mapas de regiões CDR e resíduos de consenso de anticorpos humanos são conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Edição, US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); Chothia e Lesk (1987). Uma sequência de consenso do Subgrupo III humano de VH, baseada num rastreio através de 22 sequências conhecidas de VH III humano, e uma sequência de consenso de subgrupo I humana da cadeia VL kapa, com base num rastreio de 30 sequências conhecidas humanas kapa I, está descrito por Padlan, Mol. Immunol. 31: 169 (1994); e por Padlan, Mol. Immunol. 28: 489 (1991) . Os anticorpos humanos incluem, portanto, anticorpos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido tenham sido substituídos por um ou mais aminoácidos presentes em qualquer outro anticorpo humano.
Os anticorpos 0X40 incluem anticorpos humanizados que se podem produzir utilizando metodologias conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxertos de CDR (EP 239.400; WO 91/09.967; Patentes U.S. Nos 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089), recobrimento ou substituindo a superfície (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunol. 28: 489 (1991); Studnicka et al., Protein
Engineering 7: 805 (1994); Roguska et al., Proc. Nat'1.
Acad. Sei. USA 91: 969 (1994)), e baralhando cadeias (Patente U.S. N2 5.565.332). As sequências de consenso humanas (Padlan, Mol. Immunol. 31: 169 (1994); e Padlan, Mol. Immunol. 28: 489 (1991)) já foram utilizadas para a produção de anticorpos humanizados (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4285 (1992); e Presta et al., J.
Immunol. 151: 2623 (1993)). O termo "humanizado", quando utilizado em referência a um anticorpo, significa que a sequência de aminoácidos do anticorpo tem resíduos de aminoácidos não humanos (por exemplo, de murganho, rato, cabra, coelho, etc.) ou que uma ou mais das regiões determinantes de complementaridade (CDR) que se ligam especificamente ao antigénico pretendido numa molécula aceitadora de imunoglobulina humana, e um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fv do quadro (FR) , que são resíduos de aminoácidos que flanqueiam as CDR. Os anticorpos referidos como "primatizados" estão incluídos no significado dos "humanizados" excepto que a molécula aceitadora de imunoglobulina humana e os resíduos de aminoácidos da região quadro podem ser resíduos de aminoácido de um primata qualquer (por exemplo, símio, gibão, gorila, chimpanzé, orangotango, macaco), para além de qualquer resíduo humano: os resíduos do FR humano podem estar substituídos pelos resíduos correspondentes não humanos. Os resíduos nas regiões CDR ou do quadro humano podem, portanto, ser substituídos por resíduos correspondentes de CDR ou da região-quadro non humanos de anticorpos de doador para alterar, em geral para melhorar, a afinidade do antigénio ou a especificidade, por exemplo. Um anticorpo humanizado pode incluir resíduos que se não encontram nem nas sequências do anticorpo humano, nem da CDR do doador ou no quadro. Por exemplo, uma substituição da FR numa posição específica que não se encontra num anticorpo humano ou o anticorpo não humano do doador podem prever-se como melhorando a afinidade de ligação ou a especificidade do anticorpo humano nessa posição: Substituições do quadro ou CDR do anticorpo baseadas em modelação molecular são bem conhecidas na técnica, por exemplo, modelando as interacção dos resíduos das CDR e do quadro para identificar resíduos do quadro importantes para a ligação de antigénicos e comparação de sequências para identificar resíduos não habituais do quadro em posições específicas (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.585.089; e Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)).
Os anticorpos 0X40 incluem anticorpos quiméricos. Tal como se utiliza neste documento, o termo "quimérico" e as suas variações gramaticais, quando utilizadas em referência a um anticorpo, significam que a sequência de aminoácidos do anticorpo contém uma ou mais porções que são derivadas, obtidas ou isoladas de, ou baseadas em duas ou mais espécies diferentes. Por exemplo, uma porção do anticorpo pode ser humana (por exemplo, uma região constante) e outra porção do anticorpo pode ser não humana (por exemplo, uma região variável de uma cadeia pesada ou leve de murino) . Assim, um exemplo de um anticorpo quimérico é um anticorpo do qual porções diferentes possuem origens em espécies diferentes. Ao contrário de um anticorpo humanizado ou primatizado, um anticorpo quimérico pode ter as sequências das diferentes espécies em qualquer região do anticorpo. São conhecidos na técnica métodos para produzir anticorpos quiméricos (por exemplo, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191 (1989); e patentes U.S. Nos 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397). Os anticorpos quiméricos nos quais um domínio variável de um anticorpo de uma espécie substitui o domínio variável de outra espécie estão descritos, por exemplo, em Munro, Nature 312: 597 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984); Sharon et al.; Nature 309: 364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643 (1984); Capon et al., Nature 337: 525 (1989); e em Traunecker et al., Nature 339: 68(1989).
Também se podem gerar anticorpos 0X40 utilizando tecnologias hibridoma, recombinante, e de apresentação em fagos, ou uma combinação delas (vejam-se as Patentes U.S. Nos 4.902.614, 4.543.439, e 4.411.993; veja-se, também Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, e Bechtol (editores), 1980, e Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edição 1988).
Inclui-se nas técnicas adequadas que se podem adicionalmente utilizar em métodos de anticorpos, a purificação por afinidade baseada em 0X40, purificação por gel não desnaturante, HPLC ou HPLC em fase reversa, exclusão de dimensões, purificação numa coluna de proteína A, ou qualquer combinação destas técnicas. Pode determinar-se o isotipo do anticorpo 0X40 utilizando um ensaio ELISA, por exemplo, pode identificar-se um Ig humano utilizando Ig anti-humano de murganho absorvido sobre Ig
Pode produzir-se 0X40 adequado para gerar anticorpos por qualquer de uma série de técnicas padrão de purificação de proteína ou de expressão recombinante conhecidas. Incluem-se nas formas de 0X40 adequadas para gerar uma reacção imune, subsequências de 0X40, tais como um fragmento imunogénico. Incluem-se nas formas adicionais de 0X40 células expressando 0X40, preparações contendo 0X40 ou extractos ou fracções de células, 0X40 parcialmente purificado. São descritas neste documento células isoladas ou purificadas que expressam anticorpos 0X40, suas subsequências e fragmentos, e ácidos nucleicos codificando para anticorpos 0X40, subsequências e fragmentos. Numa concretização, uma célula isolada expressa um anticorpo tendo as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo denotado como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Uma célula isolada pode expressar um anticorpo tendo as especificidades de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Uma célula isolada pode expressar um anticorpo que compete com um anticorpo produzido por uma linha de célula hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, para a ligação a 0X40. Uma célula isolada pode expressar um anticorpo que tem maior ou menor afinidade de ligação para 0X40 do que um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. A afinidade de ligação para 0X40 pode ser de 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. A afinidade de ligação para 0X40 pode estar entre cerca de KD 10~5 M e cerca de KD 10-13 M da de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. Um exemplo particular não limitativo de células isoladas ou purificadas que expressam anticorpos 0X40, das suas subsequências e fragmentos, e ácidos nucleicos codificando para anticorpos 0X40, suas subsequências e fragmentos, incluem células de baço, células hibridoma e células CHO. As células isoladas ou purificadas podem ser uma pluralidade ou uma população de células de um isolado primário de células (por exemplo, células de baço), um isolado de células secundário ou passadas, ou uma cultura de células estabelecidas ou imortalizadas (células hibridoma ou CHO).
Proporcionam-se adicionalmente neste documento de métodos de produzir anticorpos que se ligam especificamente a 0X40. Um método para produzir um anticorpo 0X40 pode incluir administrar-se um 0X40 humano, uma sua subsequência ou fragmento (por exemplo; um domínio extracelular de 0X40), opcionalmente conjugado com proteína Fc recombinante humana, a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana (por exemplo, um murganho transgénico ou uma vaca transgénica), despistar no animal a expressão do anticorpo 0X40 humano, e seleccionar um animal que produza um anticorpo 0X40 humano, isolando um anticorpo do animal seleccionado. 0 método pode determinar se o anticorpo 0X40 humano tem actividade antagonista ou agonista de 0X40.
Descrevem-se neste documento métodos de produzir anticorpos 0X40 humanos que inibem ou evitam a ligação de 0X40 a um ligando de 0X40 (OX40L). Um método para produzir um anticorpo 0X40 humano pode incluir administrar-se 0X40, uma sai subsequência ou fragmento (por exemplo, um domínio extracelular de 0X40), opcionalmente conjugado com proteína Fc recombinante humana a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana (por exemplo, um murganho transgénico ou uma vaca transgénica), despistar no animal a expressão do anticorpo 0X40 humano, seleccionar um animal que produza um anticorpo 0X40 humano, e isolar um anticorpo do animal seleccionado que produza o anticorpo 0X40 humano. 0 método pode determinar se o anticorpo 0X40 humano inibe ou evita a ligação de 0X40 a um ligando de 0X40 (OX40L).
Descrevem-se neste documento animais não humanos transgénicos que expressam um anticorpo 0X40 com uma ou mais das características seguintes: a) seja idêntico a um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 1112Z5; b) se ligue a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 ao qual se liga um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; c) tenha uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; d) tenha uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de cerca de KD 10”6 M a cerca de KD 10”12 M de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; e) tenha a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131; 112Y55 ou 112Z5; ou f) compita com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5 para a ligação a 0X40.
Proporciona-se também neste documento a descrição de ácidos nucleicos isolados ou purificados codificando para anticorpos 0X40, suas subsequências e fragmentos. Uma sequência de ácido nucleico pode codificar para uma sequência madura de região variável de cadeia pesada ou leve tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, ou numa sua subsequência. Uma sequência de ácido nucleico pode incluir qualquer uma das SEQ ID NO: 3-6 e das SEQ ID NO: 38-43, e suas subsequências. Uma sequência de ácido nucleico pode incluir uma sequência degenerada em relação a qualquer uma das SEQ ID NO: 3-6 e das SEQ ID NO: 38-43, e suas subsequências.
Os ácidos nucleicos podem ter diversos comprimentos. Os comprimentos dos ácidos nucleicos que codificam para anticorpos 0X40 descritos neste documento ou suas subsequências podem tipicamente ser de entre cerca de 100 nucleótidos e 600 nucleótidos, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes comprimentos, 100 a 150, 150 a 200, 200 a 250, 250 a 300, 300 a 350, 350 a 400, 400 a 450, 450 a 500, 500 a 550, ou cerca de 550 a 600 nucleótidos de comprimento, ou qualquer valor numérico ou gama ou valor adentro de ou incluindo estes comprimentos. Os comprimentos de ácidos nucleicos que se hibridizam especificamente a ácidos nucleicos codificando para anticorpos 0X40 descritos neste documento ou suas subsequências são tipicamente de entre cerca de 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-600 nucleótidos, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes comprimentos.
Os termos "ácido nucleico" e "polinucleótido" referem-se a pelo menos dois ou mais ácidos ribonucleicos ou desoxirribonucleicos cujos pares de bases (nucleótidos) estejam ligados por intermédio de uma ligação fosfoéster, ou equivalente. Os ácidos nucleicos incluem polinucleótidos e polinucleósidos. Os ácidos nucleicos incluem moléculas de cadeia singela, dupla ou triplex, circular ou linear. Incluem-se nos exemplos de ácidos nucleicos, mas não se limitam a estes: ARN, ADN, cADN, ácido nucleico genómico, ácido nucleico com e sem ocorrência na natureza, por exemplo, ácido nucleico sintético. Os ácidos nucleicos e polinucleótidos curtos (por exemplo, 10-20, 20-30, 30-50, 50-100 nucleótidos) são habitualmente referidos como "oligonucleótidos" ou "sondas" de ADN com cadeia simples ou dupla. São proporcionados ácidos nucleicos que codificam para uma sequência de aminoácidos contendo um ou mais resíduos de aminoácidos substituídos, adicionados ou eliminados das sequências da região variável da cadeia pesada ou leve tal como ilustradas em qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 e das SEQ ID NO: 44-49. Numa concretização, a sequência da cadeia variável pesada ou leve, substituída, adicionada ou eliminada, tem afinidade de ligação para um epítopo do domínio extracelular de 0X40. A sequência da região variável pesada ou leve substituída, adicionada ou eliminada pode ter a actividade de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, por exemplo, modular uma função ou actividade de 0X40.
Descrevem-se neste documento ácidos nucleicos que hibridizam a um ácido nucleico que codifica para a totalidade ou para uma subsequência de um anticorpo 0X40 produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, que seja pelo menos 80-90 % complementar ou homóloga da sequência de ácido nucleico que codifica para a totalidade ou para uma subsequência ou fragmento do anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. A sequência de ácido nucleico pode ter um comprimento de entre cerca de 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-600 nucleótidos, ou qualquer valor numérico ou gama adentro de ou incluindo estes comprimentos. A sequência de ácido nucleico pode hibridizar a uma sequência de região variável de uma cadeia pesada ou leve, ou uma sua porção (por exemplo, uma CDR, uma FR, etc.) de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. O termo "hibridiza" e as suas variações gramaticais referem-se à ligação entre sequências de ácido nucleico. As sequências hibridizantes terão em geral mais do que cerca de 50 % de homologia com um ácido nucleico que codifica que codifica para uma sequência de aminoácidos de uma sequência de referência (por exemplo, a sequência do anticorpo 0X40). A região de hibridização entre sequências é tipicamente de pelo menos 12-15 nucleótidos, 15-20 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100 a 200, 300 a 400 nucleótidos ou mais, ou qualquer valor numérico ou gama adentro ou incluindo estes comprimentos.
As sequências de ácido nucleico incluem, além disto, substituições, adições e eliminações de nucleótidos e de nucleósidos, bem como formas derivatizadas e sequências de fusão/quiméricas (por exemplo, codificando para o anticorpo 0X40 fundido a um dominio heterólogo). Por exemplo, devido à degenerescência do código genético, os ácidos nucleicos incluem sequências e subsequências degeneradas com respeito a ácidos nucleicos que codificam para o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 e 112Z5. Outros exemplos são ácidos nucleicos complementares a uma sequência que codifica para um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, suas subsequências e fragmentos.
Podem produzir-se ácidos nucleicos utilizando diversas técnicas padrão de clonagem e de síntese química. Incluem-se nestas técnicas, mas não se limitam a, amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo, reacção de polimerase em cadeia (PCR), com alvos genómicos de ADN ou de cADN utilizando iniciadores (por exemplo, uma mistura degenerada de iniciadores) capazes de se ligarem a uma sequência de codificação de anticorpos. Também se podem produzir ácidos nucleicos por síntese química (por exemplo, por síntese de fosforamidito em fase sólida) ou por transcrição a partir de um gene. Podem então traduzir-se as sequências produzidas in vitro, ou clonar-se num plasmídeo e propagar-se, e então expressar-se numa célula (por exemplo, uma célula hospedeira tal como uma levedura ou uma bactéria, um eucariota tal como uma célula animal ou de mamífero, ou numa planta).
De acordo com a invenção, são também proporcionadas sequências de ácido nucleico da invenção que incluem vectores. Um vector pode incluir uma sequência de ácido nucleico codificando para um anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou um fragmento. Em concretizações especificas, um vector inclui uma sequência de ácido nucleico codificando para qualquer anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 e 112Z5, uma sua subsequência ou fragmento.
Os vectores são veículos que podem ser manipulados por inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Os vectores incluem plasmídeos, virais, procarióticos (bacterianos) e eucarióticos (de plantas, fungos, de mamíferos). Podem utilizar-se os vectores para a expressão de ácidos nucleicos in vitro ou in vivo. Estes vectores, referidos como "vectores de expressão", são para introduzir ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos que codificam para anticorpos 0X40, suas subsequências e fragmentos, e expressar a proteína codificada in vitro (por exemplo, em solução ou em fase sólida) , em células ou num sujeito in vivo.
Também se podem utilizar vectores para manipulação de ácidos nucleicos. Para manipulação genética podem empregar-se "vectores de clonagem", e para transcrever ou traduzir o ácido nucleico inserido, in vitro (por exemplo, em solução ou em fase sólida) , em células, ou num sujeito in vivo.
Um vector contém em geral uma origem de replicação para propagação de uma célula in vitro ou in vivo. Podem incluir-se elementos de controlo, incluindo elementos de controlo de expressão, presentes adentro de um vector para facilitar a transcrição e a tradução, consoante seja apropriado.
Os vectores podem incluir um marcador de selecção. Um "marcador de selecção" é um gene que permite a selecção de células contendo o gene. "Selecção positiva" refere-se a um processo de selecionar células que contenham o marcador de selecção aquando da exposição à selecção positiva. A resistência a fármacos é um exemplo de marcador de selecção positiva - as células contendo o marcador sobreviverão num meio de cultura contendo o fármaco, e as células que não tenham o marcador morrerão. Os marcadores de selecção incluem genes de resistência a fármacos, tais como o neo, que confere resistência a G418; o hygr, que confere resistência à higromicina; e o puro, que confere resistência à puromicina. Outros genes marcadores de selecção positiva incluem genes que permitem a identificação ou o despiste de células contendo o marcador. Estes genes incluem genes para proteínas fluorescentes (GFP e cromóforos como o GFP, luciferase) , o gene lacZ, o gene da fosfatase alcalina, e marcadores superficiais tais como CD 8, entre outros. "Selecção negativa" refere-se a um processo no qual as células contendo um marcador de selecção negativa são mortas quando são expostas a um agente apropriado de selecção negativa. Por exemplo, as células que contêm o gene da timidina quinase do virus herpes simplex (HSV-tk) (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)) são sensíveis ao fármaco gancyclovir (GANC). De forma semelhante, o gene gpt torna as células sensíveis a 6-tioxantina.
Os vectores virais incluem os baseados em retrovirais (lentivírus para infectar células em divisão bem como as que não se dividam), vírus espumosos (Patentes U.S. Nos 5.624.820, 5.693.508, 5.665.577, 6.013.516 e 5.674.703; WO 92/05.266 e WO 92/14.829), adenovirus (Patentes U.S. Nos 5.700.470, 5.731.172 e 5.928.944); vírus adeno-associados (AAV) (Patente U.S. N- 5.604.090), vectores de vírus herpes simplex (Patente U.S. N2 5.501.979), vectores baseados em citomegalovírus (CMV) (e U.S. N2 5.561.063), reovírus, genomas de rotavirus, vírus símino 40 (SV40) ou vírus papiloma (Cone et ai., Proc:
Natl. Acad. Sei. USA 81: 6349 (1984); Vectores Virais Eucarióticos, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman editor, 1982; Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1: 486 (1981); Patente U.S. N2 5.719.054). 0 adenovirus infecta eficientemente células que se replicam devagar e/ou células terminalmente diferenciadas, e podem ser utilizados para alvejar células que se replicam devagar e/ou terminalmente diferenciadas. Incluem-se nos vectores virais adicionais úteis para expressão o parvovirus, o vírus Norwalk, coronavírus, paramixovírus e rabdovírus, togavírus (por exemplo, vírus sindbis e vírus semLiki florestal) e vírus vesicular da estomatite (VSV).
Podem expressar-se vectores incluindo um ácido nucleico quando o ácido nucleico estiver operativamente ligado a um elemento de controlo de expressão. 0 termo "operativamente ligado" refere-se a uma relação física ou funcional entre os elementos referidos que lhes permite operar do modo para o qual existem. Deste modo, um ácido nucleico "operativamente ligado" a um elemento de controlo de expressão significa que o elemento de controlo modula a transcrição do ácido nucleico e consoante seja apropriado, a tradução da transcrição.
Um "elemento de controlo de expressão" ou "uma sequência de controlo de expressão" é um polinucleótido que influencia a expressão de um ácido nucleico operativamente ligado. Os promotores e os incrementadores são exemplos específicos não limitativos dos elementos de controlo de expressão e das sequências. Um "promotor" é uma região reguladora de ADN actuando de modo cis que é capaz de iniciar a transcrição a jusante (direcção 3') de uma sequência de ácido nucleico. A sequência do promotor inclui nucleótidos que facilitam a iniciação da transcrição. Os incrementadores também regulam a expressão do ácido nucleico, mas podem funcionar a uma distância do local de início da transcrição do ácido nucleico ao qual estiver operativamente ligados. Os incrementadores funcionam quando estão localizados tanto nos terminais 5' como 3' do ácido nucleico, bem como adentro do ácido nucleico (por exemplo, intrões ou sequências de codificação). Incluem-se nos elementos adicionais de controlo de expressão as sequências lider e as sequências dos parceiros de fusão, elementos locais internos de ligação de ribossoma (IRES) para a criação de mensagens multigénicas, ou policistrónicas, emendas de sinal para intrões, manutenção do quadro e leitura correcto do gene para permitir a tradução no quadro do mARN, sinal de poliadenilação para proporcionar uma poliadenilação adequada do transcrito de interesse, e codões de paragem.
Os elementos de controlo de expressão incluem elementos "constitutivos" em que a transcrição de um ácido nucleico operativamente ligado ocorre sem a presença de um sinal ou de estímulos. Os elementos de controlo de expressão conferem expressão em reacção a um sinal ou a estímulos, que quer aumentam, quer diminuem a expressão de ácido nucleico operativamente ligado, são "reguláveis". Um elemento regulável que aumente a expressão de ácido nucleico operativamente em reacção a um sinal ou estímulos é referido como um "elemento induzível". Um elemento regulável que diminui a expressão do ácido nucleico operativamente ligado em reação a um sinal ou a estímulos é referido como um "elemento repressível" (i.e., o sinal diminui a expressão; quando o sinal é removido ou está ausente, a expressão aumenta).
Para expressão bacteriana, inclui-se nos parâmetros constitutivos T7, bem como promotores induziveis tais como pL do bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac). Em sistemas de células de insecto, podem utilizar-se promotores constitutivos ou induziveis (por exemplo, ecdisona). Na levedura, incluem-se nos promotores constitutivos, por exemplo, ADH ou LEU2 e promotores induziveis tais como GAL (vejam-se, por exemplo, Ausubel et al., EM: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Cap. 13, editor, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al., Em: Methods in Enzymology, 153: 516-544 (1987), editores Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y.; Glover, DNA Cloning, Vol. II, Cap. 3, IRL Press, Wash., D.C., 1986; Bitter, Em: Methods in Enzymology, 152: 673-684 (1987), eds. Burger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; e Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, editores Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II (1982)).
Para expressão em mamíferos podem utilizar-se promotores constitutivos com origens virais ou outras. Por exemplo, CMV, SV40, ou repetições terminais virais longas (LTR) e outros semelhantes, ou promotores induziveis derivados do genoma de células de mamíferos (por exemplo, promotor de metalotioneína IIA; promotor de choque térmico, elementos de reacção esteróides/de hormona tiróide/ácido retinóico) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; vírus de tumor mamário de murganho LTR).
Incluem-se nos elementos de controlo de expressão elementos activos num tecido específico ou num tipo de célula específico, referidos como "elementos de controlo de expressão específicos para tecidos". Os elementos de controlo de expressão específicos de tecidos são tipicamente mais activos em tipos específicos de células ou de tecidos porque são reconhecidos por proteínas activantes transcricionais, ou outros reguladores da transcrição activos para o tipo de células ou de tecido. São exemplos específicos não limitativos destes elementos de controlo de expressão os promotores tais como a hexoquinase II, COX-2, alfa-fetoproteína, antigénico carcinoembriónico, DE3/MUC1, antigénico específico da próstata, C-erB2/neu, polipéptido insulinotrópico dependente da glucose (GIP), transcriptase reversa da telomerase e promotor reactivo à hipóxia.
De acordo com a invenção, proporcionam-se células hospedeiras transformadas ou transfectadas com ácido nucleico de 0X40 ou vector da invenção. Incluem-se nas células hospedeiras sem que se limitem a elas, células procarióticas e eucarióticas tais como bactérias, fungos (levedura), de plantas, insectos, e animais (por exemplo, de mamíferos, incluindo primatas e humanos). Incluem-se nos exemplos não limitantes de células transformadas as bactérias transformadas com ácido nucleico recombinante bacteriófago, ácido nucleico de plasmídeo ou vectores de expressão de ácido nucleico de cosmídeo; levedura transformada com vectores de expressão recombinantes de levedura; células de plantas infectadas com vectores de expressão recombinantes de vírus (por exemplo, vírus mosaico da couve-flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão recombinantes de plasmídeo (por exemplo, de plasmídeo Ti; células de insecto infectadas com vectores recombinantes de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus); e células animais infectadas com vectores recombinantes de expressão de vírus (por exemplo, retrovirus, adenovirus, vírus vaccinia), ou células animais transformadas geneticamente para uma expressão estável. Um exemplo não limitativo de uma célula hospedeira de mamífero que expressa anticorpos 0X40, suas subsequências e fragmentos inclui uma célula CHO. As células hospedeiras podem ser pluralidade ou uma população de células de um isolado de células primário, uma célula secundária ou passada isolada, ou uma cultura de células estabelecida ou imortalizada. 0 termo "transformada" ou "transfectada", quando utilizado em referência a uma célula (por exemplo, uma célula hospedeira) ou a um organismo, significa uma alteração genética numa célula a seguir à incorporação de uma molécula exógena, por exemplo, uma proteína ou um ácido nucleico (por exemplo, um transgene) para dentro da célula. Deste modo, uma célula "transfectada" ou "transformada" é uma célula para dentro da qual, ou nas suas descendentes nas quais haja sido introduzida uma molécula exógena por iniciativa humana, por exemplo, por técnicas de ADN recombinante. 0 ácido nucleico ou a proteína podem ser transfectados ou transformados (expressos) de modo estável ou transiente na célula ou nos seus descendentes. Pode propagar-se a ou as células e expressar-se a proteína introduzida e expressa, ou o ácido nucleico transcrito. As descendentes de uma célula transfectada ou transformada podem ser não idênticas à célula de que descendem, uma vez que pode haver ocorrência de mutações durante a replicação.
Tipicamente, a transfecção ou a transformação recorre a um vector. Um vector pode estar incluído numa partícula virai ou numa vesícula e ser opcionalmente alvejado a tipos particulares de célula por inclusão de uma proteína na partícula ou à superfície da vesícula que se ligue a um ligando da célula alvo, ou receptor. Assim, a partícula viral ou a própria vesícula, ou uma proteína sobre a superfície virai pode ser levada a alvejar células para transfecção ou para transformação in vitro, ex vivo ou in vivo. Em consequência, estão incluídos um vector viral e não viral como meios de entregar a molécula a células, tecidos ou órgãos in vitro, in vivo e ex vivo. A introdução de ácido nucleico em células alvo (por exemplo, células hospedeiras) também pode ser levada a cabo por métodos conhecidos na técnica como choque osmótico (por exemplo, com fosfato de cálcio), electroporação, microinjecção, fusão celular, etc. A introdução de ácido nucleico e de polipéptido in vitro, ex vivo e in vivo pode também ser conseguida utilizando outras técnicas. Por exemplo, uma substância polimérica, tal como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, polivinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina, ou copolímeros lactido/glicolido, copolimeros polilactido/glicolido, ou copolímeros de ethileno com acetato de vinilo. Um ácido nucleico pode ser microencapsulado em microcápsulas preparadas por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, usando microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina, ou microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, ou num sistema coloidal. Incluem-se nos sistemas de dispersão coloidais complexos de macromoléculas, nano-cápsulas, microesferas, pérolas, e sistemas baseados em lípido, incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas, e lipossomas. São conhecidos na técnica os lipossomas para a introdução de diversas composições em células e neles se incluem, por exemplo, os de fosfatidilcolina, fosfatidilserina, lipofectina e DOTAP (por exemplo, Patentes U.S. Nos 4.844,904, 5.000.959, 4.863.740, e 4.975.282; e GIBCO-BRL, Gaithersburg, Md). Também são conhecidos lípidos catiónicos anfifílicos baseados em piperazina, úteis em terapia genética (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.861.397). São também conhecidos sistemas catiónicos lipídicos (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.459.127). Referem-se colectivamente as substâncias poliméricas, as microcápsulas e os sistemas de dispersão coloidal tais como lipossomas, neste documento, como "vesículas".
Os anticorpos 0X40 da invenção são úteis no tratamento, em aplicações terapêuticas e de diagnóstico, incluindo métodos clínicos e diagnósticos. Por exemplo, num modelo em murganho da doença aguda e crónica do enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD) em que se transferem PBMC humanas para murganhos irradiados com imunodeficiência severa combinada (SCID), os anticorpos humanos anti-OX40 humano antagonistas reduziram os números de células T humanas e a patologia da doença quando foram administrados antes ou depois do início da doença. Deste modo, os anticorpos 0X40 da invenção são capazes de reduzir, diminuir ou evitar um sintoma da doença de enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD) num modelo da doença, aguda ou crónica, de xenoenxerto em relação ao hospedeiro; provocando uma remissão ou regressão da doença, aguda ou crónica, de xenoenxerto em relação ao hospedeiro (por exemplo, num murganho imunodeficiente (SCID)). Os anticorpos da invenção também eram capazes de induzir a lise de células expressando 0X40 por células assassinas naturais. Embora não se pretenda uma ligação a nenhuma teoria, a lise de células expressando 0X40 pode ser devida a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC).
Os anticorpos 0X40 da invenção são, portanto, úteis no tratamento ou terapia de patologias e doenças que podem ser capazes de ou podem reagir favoravelmente na modulação de uma actividade ou função de 0X40. Deste modo, um anticorpo antagonista de 0X40 pode ser utilizado para tratar patologias, doenças, estados fisiológicos, patologias e os seus sintomas, que sejam capazes de reagir ou provavelmente reajam favoravelmente a uma redução, diminuição, inibição, prevenção ou bloqueio da actividade ou função de 0X40, enquanto um anticorpo agonista de 0X40 possa ser utilizado para tratar patologias, doenças, estados fisiológicos, patologias e sintomas destas, que sejam capazes de reagir ou reajam provavelmente de um modo favorável à estimulação, aumento, incremento, promoção ou indução da actividade ou função de 0X40. São descritos neste documento métodos de tratar patologias, doenças, estados, disfunções e sintomas adversos ou anormalidades associadas a reacções imunológicas indesejáveis ou aberrantes. Tal como se utiliza neste documento, um "reacção imunológica indesejável" ou "uma reacção imunológica aberante" refere-se a qualquer reacção imunológica, actividade ou função que seja maior ou menor do que a pretendida ou a fisiologicamente normal. Uma reacção imunológica, função ou actividade indesejável pode ser uma reacção, função ou actividade normal. Deste modo, as reacções imunológicas normais, desde que sejam indesejáveis, mesmo que não sejam consideradas aberrante, estão incluídas no significado destes termos. Uma reacção imunológica, função ou actividade indesejável, pode também ser uma reacção imunológica função ou actividade anormal. Uma reacção imunológica função ou actividade anormal (aberrante) desvia-se da normal. As reacções imunológicas indesejáveis e aberrantes podem ser humorais, mediadas por células, ou uma combinação destas, crónica ou aguda.
Um exemplo de uma reacção imunológica indesejável ou aberrante é uma reacção imunológica que seja hiper-reactiva, tal como no caso e uma patologia ou doença autoimune (por exemplo, autoimunidade). Outro exemplo de uma reacção imunológica indesejável ou aberrante é quando uma reacção imunológica levar a uma inflamação aguda ou crónica de qualquer tecido ou órgão. Ainda outro exemplo de uma reacção imunológica indesejável ou aberrante é quando uma reacção imunológica levar à destruição de células, tecidos ou órgãos, Tal como a rejeição de um transplante, a doença do enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD), uma patologia ou doença autoimune, ou inflamação. Ainda outro exemplo de uma reacção imunológica indesejável ou aberrante é quando a reacção imunológica for hipo-reactiva, tal como quando a reacção a um antigénico for inferior à pretendida, por exemplo, quando haja ocorrido tolerância.
Incluem-se, portanto, nas reacções imunológicas indesejáveis e aberrantes patologias e doenças crónicas e agudas caracterizadas por estados fisiológicos, patologias e sintomas adversos ou anormalidades, dependendo da patologia ou da doença. Incluem-se nos exemplos específicos não limitantes de patologias e doenças imunológicas às quais a invenção se aplica a doença do enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD), a rejeição de transplante, as patologias autoimunes e a inflamação. São proporcionadas neste documento descrições de tratamento in vivo e de métodos terapêuticos baseados, pelo menos em parte, na capacidade dos anticorpos 0X40 para modular uma actividade ou função de 0X40. As patologias, doenças, condições fisiológicas, patologias e sintomas capazes de ser ou que possam reagir ao tratamento ou à terapia com os anticorpos 0X40 da invenção incluem, por exemplo, uma doença ou patologia crónica ou aguda. Em métodos adicionais de tratamento, as perturbações, doenças, estados fisiológicos, patologias e sintomas capazes de ser tratados ou sujeitos a uma terapia com os anticorpos 0X40 da invenção incluem, por exemplo, inflamação, rejeição de transplante, doença de enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD), uma perturbação ou doença autoimune, tal como a artrite reumatóide, a esclerose múltipla, a diabetes (por exemplo, diabete melitus dependente de insulina, IDDM, diabetes de tipo I) , doença de Crohn (CD) , doença inflamatória dos intestinos (IBD), colite ulcerosa (UC) , doença celíaca, psoríase, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, polimiosite, e uma reacção celular mediada por 0X40 que seja indesejável ou aberrante, por exemplo. São descritos neste documento métodos nos quais anticorpos 0X40, suas subsequências ou fragmentos são utilizados para reduzir, diminuir, inibir, evitar e bloquear uma doença ou perturbação imunológica crónica ou aguda, inflamação, rejeição de transplante, doença de enxerto em relação ao hospedeiro (GVHD), ou uma perturbação autoimune, tal como artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes (por exemplo, diabetes melitus dependente de insulina, IDDM, diabetes de tipo I), doença de Crohn (CD), doença inflamatória dos intestinos (IBD), colite ulcerosa (UC), doença celíaca, psoríase, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, polimiosite, ou uma reacção mediada por 0X40 que seja indesejável ou aberrante, tratando e reduzindo, diminuindo, inibindo, evitando e bloqueando a inflamação do pulmão em híper-reactividade das vias aéreas/hipersensibilidade (por exemplo, asma, asma alérgica) e em outros tecidos e órgãos. São sintomas particulares não limitativos de sintomas da doença de enxerto em relação ao hospedeiro que se pode tratar consoante a invenção a perda de peso, a queda de cabelo, irritação de pele, hematúria, hidroperitoneu, e infiltrações de células inflamatórias no fígado, tracto intestinal, pulmão, pele e morte.
Os anticorpos 0X40 também são úteis para reduzir, diminuir, inibir, evitar e bloquear a inflamação presente no pulmão, articulação, músculo, pele, sistema nervoso central ou periférico ou intestinos. Os anticorpos 0X40 são adicionalmente úteis para reduzir, diminui, inibir, evitar e bloquear a inflamação que resulta da reacção de um sujeito a agentes infeciosos (por exemplo, agentes infeciosos bacterianos, virais ou parasiticos) .
Incluem-se nos estados adicionais que podem vir a ser alvo de tratamento ou terapia com anticorpos 0X40, por exemplo, osteoartrite, artrite psoriática, encefalomielite, miastenia grave, tiroidite autoimune, dermatite atópica, dermatite eczematosa, psoríase, Síndrome de Sjõgren, úlcera aftosa, irite, conjuntivite, queratoconjuntivite, lúpus eritematoso cutâneo, escleroderma, vaginite, proctite, eritema nodoso leproso, uveite autoimune, encefalomielite alérgica, encefalopatia necrotizante hemorrágica aguda, surdez progressiva bilateral idiopática neurossensorial, anemia plásica, anemia pura de células vermelhas, trombocitopénia idiopática (ITP), policondrite, granulomatose de Wegener, heptite crónica activa, sindrome de Stevens-Johnson, espru idiopático, líquen plano, doença de Graves, sarcoidose, cirrose biliar primária, uveite posterior, fibrose pulmonar intersticial, tiroidite de Hashimoto, síndrome poliglandular autoimune, infertilidade imunologicamente mediada, doença de Addison autoimune, pênfigo vulgar, pênfigo folhoso, dermatite herpetiforme, alopecia autoimune, vitiligo, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopénica autoimune, anemia perniciosa, síndrome de Guillain-Barre, síndrome de Stiff-man, febre reumática aguda, oftalmia simpática, síndrome de Goodpasture, vasculite necrotizante sistémica, síndrome antifosfolípido, asma (por exemplo, asma alérgica) e alergias.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "transplante", "transplantação" e as suas variações gramaticais significam enxertar, implantar, ou transplantar uma célula, um tecido ou um órgão de uma parte do corpo noutra, ou de um indivíduo ou animal para outro indivíduo ou animal. A célula, tecido ou órgão transplantado podem, portanto, ser aloenxertos ou xenoenxertos. Incluem-se nos exemplos de células transplantadas as de medula óssea, células estaminais hematopoiéticas, células estaminais de sangue periférico ou células estaminais de sangue do cordão, células alogénicas ou não alogénicas, e células neurais. Incluem-se nos exemplos de tecidos transplantados pele, vasos sanguíneos, olho e medula óssea. Incluem-se nos exemplos de órgãos transplantados rim, coração, pulmão, pâncreas e fígado. 0 termo também inclui células, tecidos e órgãos geneticamente modificados, por exemplo, por terapia genética ex vivo na qual as células, tecidos e órgãos transformados sejam obtidos ou derivados de um sujeito (por exemplo, humano ou animais) que então recebe o transplante proveniente de um sujeito diferente (por exemplo, humano ou animal) .
Pode tratar-se a inflamação consoante a invenção incluindo reacções inflamatórias mediadas por 0X40 ou que se possam vir a tratar com o anticorpo 0X40 devido à modulação de 0X40, que por sua vez pode modular uma ou mais de entre a proliferação celular, a sobrevivência, a morte, ou a actividade de linfócitos (por exemplo, células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras), etc. Os métodos (por exemplo, o tratamento) podem resultar numa redução da ocorrência, frequência, severidade, progressão, ou duração da inflamação. Incluem-se nos sintomas exemplificativos da inflamação um ou mais de entre inchaço, dor, irritação, cefaleia, febre, náusea, rigidez articular esquelética, ou lesões em tecidos ou células. A inflamação pode provocar, directa ou indirectamente, lesões celulares, dos tecidos ou órgãos, quer a múltiplas células, tecidos ou órgãos, quer a um único tipo de célula, tipo de tecido ou órgão. Incluem-se nos exemplos de tecidos e de órgãos que exibem lesões os tecidos da epiderme ou mucosas, das vísceras, intestino, pâncreas, timo, fígado, rim, baço, pele, ou de uma articulação esquelética (por exemplo, joelho, tornozelo, anca, ombro, punho, dedo, dedo do pé, ou cotovelo) . 0 tratamento consoante a invenção pode resultar na redução, inibição ou prevenção da progressão ou de piorarem as lesões tecidulares, ou levar a uma regeneração de um órgão ou tecido lesionado, por exemplo, pele, mucosa, fígado.
Tal como se utilizam neste documento, os termos "tratar", "tratando", "tratamento" e as suas variações gramaticais significam um protocolo, regime, processo ou remediação levados a cabo num sujeito individual ou doente, quando se pretenda obter um efeito fisiológico ou resultado nesse doente. Os métodos descritos neste documento incluem, portanto, entre outras coisas, o tratamento e os métodos terapêuticos que proporcionam uma melhoria mensurável ou efeitos benéficos sobre uma perturbação, doença, estado fisiológico, patologia ou um sintoma, num determinado sujeito. Uma melhoria ou efeito benéfico mensuráveis é qualquer melhoria objectiva ou subjectiva, transiente, temporária, ou a longo termo, da perturbação, doença, estado fisiológico, patologia ou sintoma, ou uma redução no inicio, severidade, duração ou frequência de um sintoma adverso associado a ou provocado pela perturbação, doença, estado fisiológico, patologia ou estado. Um método descrito neste documento não necessita ter um efeito imediato, podendo haver algum atraso, mas ao longo do tempo uma melhoria eventual ou um efeito beneficiai uma estabilização ou uma melhoria de um determinado sujeito irá ocorrer.
Um ponto final clinicamente satisfatório para um método de tratamento tal como descrito neste documento é atingido, por exemplo, quando existir uma maior ainda que parcial diminuição ou redução na severidade, duração ou frequência de uma ou mais patologias, sintomas adversos ou complicações, associados com a perturbação, doença, patologia ou estado, ou uma inibição, redução, prevenção ou inversão de uma ou mais manifestações bioquímicas ou celulares ou características fisiológicas, patológicas da perturbação, doença, estado fisiológico, patologia ou estado (por exemplo, uma perturbação ou doença imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, ou uma perturbação autoimune). Uma melhoria ou benefício terapêutico podem, mas não necessitam, portanto, de ser uma cura, ou uma ablação da maioria de todas as patologias, sintomas adversos ou complicações associadas com ou provocadas pela perturbação, doença, estado fisiológico, patologia ou sintoma (por exemplo, uma doença ou perturbação imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, ou uma perturbação autoimune). Deste modo, uma melhoria ou beneficio terapêutico não necessita de resultar numa cura completa de qualquer uma ou todas as patologias, sintomas adversos ou complicações associadas a, ou provocados pela perturbação, doença, estado fisiológico, ou patologia (por exemplo, uma doença ou perturbação imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, ou uma perturbação autoimune). Por exemplo, uma redução ou diminuição parcial, ou uma inibição parcial, ou uma estabilização, ou uma progressão ou piora tornada mais lenta de uma patologia, sintoma adverso ou complicação associada a ou provocada pela perturbação, doença, estado fisiológico ou patologia (por exemplo, uma doença ou perturbação imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, ou uma patologia autoimune), mesmo apenas por uns dias, semanas ou meses, ou mesmo que se mantenham algumas das patologias, sintomas adversos ou complicações associadas a ou causadas pela doença, perturbação, patologia ou estado (por exemplo, uma doença ou perturbação imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, ou uma perturbação autoimune), se trate de um resultado clinico satisfatório.
Em diversas concretizações especificas, os métodos de tratamento incluem aliviar ou melhorar um ou mais sintomas adversos (físicos) ou consequências associadas a uma patologia ou doença crónica ou aguda. Em diversas concretizações específicas adicionais, os métodos de tratamento incluem reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas a doença de enxerto em relação ao hospedeiro (por exemplo, perda de peso, queda do cabelo, irritação da pele, hematúria, hidroperitoneu, infiltrados de células inflamatórias no fígado, tracto intestinal, pulmão e morte), ou resulta numa remissão ou regressão da doença de enxerto em relação ao hospedeiro, ou resulta em evitar a doença de enxerto em relação ao hospedeiro. E, várias concretizações específicas adicionais, os métodos de tratamento incluem reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas a rejeição de transplante ou enxerto (por exemplo, uma reacção imune contra o transplante ou enxerto, ou a destruição do transplante ou das células enxertadas), ou resultar numa remissão ou regressão da rejeição do transplante ou enxerto, ou resultar na prevenção da rejeição do transplante ou do enxerto. Em diversas concretizações adicionais, incluem-se nos métodos de tratamento, reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas à artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes (por exemplo, diabetes melitus dependente de insulina, IDDM, diabetes de tipo I), doença de Crohn (CD), doença inflamatória do intestino (IBD), colite ulcerosa (UC), doença celíaca, psoríase, lúpus eritematoso sistémico (SLE), nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, polimiosite, ou uma reacção celular mediada por 0X40 que seja indesejável ou aberrante. Noutras concretizações específicas, incluem-se nos métodos de tratamento reduzir os números ou a proliferação de células auto-reactivas ou de células produzindo anticorpos anti-proteína própria, inibindo ou evitando um aumento dos números, uma proliferação ou a sobrevivência de células auto-reactivas ou de células produzindo anticorpos anti-proteína própria.
No caso de uma perturbação ou uma doença imune, inclui-se nos efeitos mensuráveis de melhoria ou beneficiais a modulação dos números, da proliferação ou de uma actividade dos linfócitos (por exemplo, células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras) em relação a níveis de linha de base normais é considerada como um resultado bem-sucedido do tratamento. Um exemplo adicional de uma melhoria quantificável ou de um efeito beneficiai sobre uma perturbação imune ou uma doença imune é uma melhoria da alteração histopatológica provocada por ou associada à perturbação ou doença imune. Por exemplo, evitar mis ou reduzir a infiltração nas articulações esqueléticas ou a destruição dos tecidos, ou do pâncreas, timo, rim, fígado, baço, tecido epidérmico (pele) ou de mucosa, infiltração nas vísceras ou intestinos ou destruição do tecido. São descritos neste documento métodos de bloquear, inibir, evitar, reduzir, ou de diminuir a ligação de um ligando de 0X40 (OX40L) a células T activadas, in vitro ou in vivo. Numa concretização, um método inclui proporcionar-se um contacto de células T activadas com um anticorpo 0X40 eficaz na inibição ou na prevenção da ligação de um ligando de 0X40 de células T activadas. Noutra concretização, o método inclui proporcionar-se um contacto de 0X40 com um anticorpo 0X40 eficaz para inibir ou evitar a ligação de um ligando 0X40 a 0X40. Em aspectos particulares, leva-se a cabo um método num sujeito que precise de bloquear, reduzir, diminuir, inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 (OX40L) a células T activadas, opcionalmente com uma composição farmacêutica. São descritos neste documento métodos de modular a sinalização celular mediada por 0X40, in vitro ou in vivo. Um método pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de modular a sinalização celular mediada por 0X40 a um anticorpo 0X40 eficaz para modular a sinalização mediada por 0X40. São descritos neste documento métodos de reduzir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, in vitro ou in vivo. Um método pode incluir administrar-se a um sujeito que necessite de número reduzidos de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras uma quantidade de anticorpo 0X40 suficiente para reduzir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. São descritos neste documento métodos de tratar uma doença ou uma perturbação provocada por células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. Um método pode incluir administrar-se a um sujeito uma quantidade de um anticorpo 0X40 suficiente para reduzir, diminuir ou evitar a progressão da doença ou da perturbação provocada por células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou eliminar as células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. A doença ou perturbação pode incluir: doença do enxerto em relação ao hospedeiro, inflamação ou uma patologia autoimune. São descritos neste documento métodos de diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão, ou pele, num sujeito. Um método pode incluir administrar-se ao sujeito uma quantidade de anticorpo 0X40 suficiente para diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão ou pele. Um método de diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão ou pele pode estar incluído num modelo de doença de exenoenxerto em relação ao hospedeiro, aguda ou crónica.
Podem combinar-se as composições e os métodos descritos neste documento com qualquer outro tratamento ou terapia que proporcione um efeito pretendido. Em especial, são aplicáveis os tratamentos, e as terapias que hajam sido caracterizadas como tendo um efeito complementar ou de sinergia. Incluem-se nestes tratamentos e terapias exemplificativos os agentes ou fármacos supressores imunológicos. Estes tratamentos e terapias supressores imunológicos podem ser levados a cabo antes de, substancialmente ao mesmo tempo do que quaisquer outros métodos descritos neste documento, por exemplo, um tratamento ou terapia. São descritos neste documento métodos de combinação em que os métodos da descrição presente são utilizados numa combinação com qualquer regime terapêutico, protocolo ou composição de tratamento, tal como um protocolo, agente ou fármaco para suprimir a imunidade, listado neste documento ou conhecido na técnica. Um método pode incluir administrar-se um anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou fragmento, e um tratamento, fármaco ou agente supressor da imunidade. Pode administrar-se o tratamento, agente ou fármaco supressor da imunidade antes de, substancialmente ao mesmo tempo com ou a seguir à administração do anticorpo de 0X40, uma sua subsequência ou fragmento a um sujeito.
Tal como se utiliza neste documento, o termo "imunossupressor" ou as suas variações gramaticais, quando utilizado em referência a um tratamento, terapia, agente ou fármaco, significa que o tratamento, terapia, agente ou fármaco proporciona uma diminuição, redução, inibição ou prevenção de uma reacção imune, humoral ou mediada pelas células. Estas terapias conseguem suprimir a reacção imunológica em genal ou sistemicamente, ou suprimem a reacção imune numa região ou localização especifica.
As classes não limitativas especificas de agentes e fármacos supressores da imunidade incluem agentes alquilantes, anti-metabolitos, extractos de plantas, alcaloides de plantas, nitroso-ureias, hormonas (esteróides tais como os glucocorticóides), análogos de nucleósidos e de nucleótidos. Incluem-se nos exemplos específicos de fármacos supressores da imunidade a ciclofosfamida, a azatioprina, a ciclosporina A, o tacrolimo (FK506), a rapamicina, o metotrexato, FTY720, inibidores de Cox-2 e interleuquinas (por exemplo, IL-12).
Os anticorpos policlonais e monoclonais são um exemplo especifico de um tratamento ou terapia supressora da imunidade. Incluem-se nos anticorpos supressores da imunidade, por exemplo, infliximab (Remicade®) , Rituxan®, Atgam®, e Timoglobulina®, Xenapax®, Simulect®, Humira®, Raptiva®, Tisabri®, e Ortoclone® (0KT3).
Os métodos da descrição presente também incluem, entre outros, métodos que originam uma necessidade reduzida de outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico, processo ou remédio. Por exemplo, para a inflamação, GVHD ou uma perturbação autoimune, um método da descrição presente tem um beneficio terapêutico se resultar num dado sujeito uma dose menos frequente ou mais reduzida, ou a eliminação de um tratamento ou terapia imunossupressiva.
Deste modo, são descritos e proporcionados neste documento métodos de reduzir a necessidade ou a utilização de um tratamento ou terapia imunosupressivos. Um método pode incluir administrar-se um anticorpo 0X40, um seu fragmento ou subsequência a um sujeito que esteja a sofrer ou tenha sofrido uma terapia imunossuppressiva. Um método pode incluir administrar-se um anticorpo 0X40, um seu fragmento ou subsequência numa quantidade eficaz para diminuir a dosagem, a frequência ou a duração ou para eliminar a necessidade de um tratamento ou terapia imunossupressivo da inflamação, GVHD ou de uma patologia autoimune. Podem levar-se a cabo os métodos, antes, substancialmente de modo contemporâneo com, ou depois da administração de um tratamento ou terapia imunossuppressivo.
As doses da "quantidade eficaz" ou "quantidade suficiente" num método de tratamento ou de terapia em que se pretenda conseguir um benefício terapêutico ou uma melhoria incluem, por exemplo, qualquer objectivo ou alívio ou melhoria subjectivos de uma, diversas, ou todas as patologias, sintomas adversos ou complicações associadas a ou provocadas pela doença, perturbação, patologia alvo ou um sintoma adverso ou complicação, numa extensão mensurável ou detectável. Evitar, inibir ou atrasar a progressão ou piora da doença, perturbação, patologia alvo, ou um sintoma adverso ou complicação é também um resultado satisfatório. Uma quantidade suficiente ou eficaz significa suficiência ou eficácia num sujeito especifico, não num conjunto de sujeitos ou na população em geral. Deste modo, a "quantidade eficaz" ou a "quantidade suficiente" bastará para proporcionar um beneficio terapêutico a um determinado sujeito.
Uma quantidade suficiente ou eficaz pode mas não necessita de ser proporcionada por uma única administração por si só, ou em combinação com outro tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser proporcionalmente aumentada tal como indicado pelas necessidades do sujeito, pelo estado da patologia, doença ou estado tratados ou pelos efeitos colaterais do tratamento. Além disto, uma quantidade suficiente ou uma quantidade eficaz não necessita de ser suficiente nem eficaz quando administrada numa única ou em múltiplas doses sem um segundo tratamento, protocolo ou regime terapêutico, uma vez que doses adicionais, quantidades ou durações acima ou para além de tais doses, ou tratamentos adicionais, protocolos ou regimes terapêuticos podem ser incluídos de modo a serem eficazes ou suficientes para um determinado sujeito. As quantidades consideradas eficazes ou suficientes também incluem quantidades que originem uma redução da utilização de outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo.
As quantidades exemplificativas a titulo de eficácia (doses) são de entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 100 mg/kg, e qualquer valor numérico ou gama ou valor adentro destas gamas. Podem ser administradas quantidades maiores ou menores (doses), por exemplo, 0,01-500 mg/kg, e qualquer valor numérico ou gama ou valor adentro destas gamas. Gamas adicionais exemplificativas e não limitativas de quantidades (doses) são de entre cerca de 0,5-50 mg/kg, 1,0-25 mg/kg, 1,0-10 mg/kg, e qualquer valor numérico ou gama ou valor adentro destas gamas.
Os métodos descritos neste documento podem ser praticados em qualquer modo de administração ou entrega, ou por qualquer via; administração ou deposição sistémica, regional e local. Incluem-se nos exemplos de vias de administração e entrega a endovenosa, intra-arterial, intradérmica, intramuscular, subcutânea, intra-pleural, transdérmica (tópica), transmucosal, intra-craniana, intra-espinal, intra-ocular, rectal, oral (alimentar) e mucosal.
Os métodos descritos neste documento podem ser praticados uma ou mais vezes (por exemplo, 1-10, 1-5 ou 1-3 vezes) ao dia, semana, mês ou ano. O especialista saberá quando será necessário interromper ou terminar a administração. Um calendário de dosagem possível inclui 1-7 vezes por semana, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais semanas, e qualquer valor numérico ou gama adentro destes períodos.
Claro que, como é típico para qualquer tratamento ou terapia, diferentes sujeitos exibirão diferentes reacções ao tratamento e alguns podem não reagir ou produzir uma reacção inadequada a um tratamento por um protocolo, regime ou processo específico. As quantidades eficazes ou suficientes dependerão, portanto, pelo menos em parte da doença, disfunção, patologia tratada (por exemplo, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, ou uma perturbação autoimune, e de se está avançada, em estado tardio ou precoce), o efeito terapêutico pretendido, nem como do sujeito individual (por exemplo, a biodisponibilidade adentro do sujeito, o género, a idade, etc.) e se a reacção do sujeito ao tratamento ou à terapia que será baseada, em parte, na variabilidade genética e epigenética (por exemplo, farmacogenómica). Além disto, uma vez que cada sujeito tratado ou doente pode não reagir a um tratamento ou método específico determinado, ou a um protocolo, regime, processo ou remédio, o tratamento ou os métodos terapêuticos não precisam de conseguir uma melhoria específica ou efeito beneficiai, e o ponto final clínico ou resultado pretendido em cada um e todos os sujeitos ou doentes, ou numa população determinada que desse modo seja tratada. Deste modo, um determinado sujeito ou doente, ou população, pode falhar em reagir, pode reagir de modo inadequado ou pode exibir reacções indesejáveis, tais como um efeito colateral, a um tratamento ou a um método terapêutico descrito neste documento.
Os termos "sujeito" e "doente" são utilizados intercambiavelmente neste documento e referem-se a animais, tipicamente mamíferos, tais como seres humanos, primatas não humanos (gorila, chimpanzé, orangotango, macaco, gibão), animais domésticos (cão e gato), animais de quinta (cavalo, vaca, cabra, ovelha, porco), animais de laboratório e experimentais (murganho, rato, coelho, cobaia). Os sujeitos incluem animais de modelo da doença (por exemplo, tal como murganhos, ratos e primatas não humanos) para estudar in vivo a eficácia (por exemplo, num modelo em animal da GVHD). Incluem-se nos sujeitos humanos crianças, por exemplo, recém-nascidos, bebés, jovens e adolescentes, entre as idades de 1 e 5, 5 e 10 e 10 e 18 anos, adultos com idades entre 18 e 60 anos, e os idosos, por exemplo, com idades de entre 60 e 65, 65 e 70 e 70 a 100 anos.
Incluem-se nos sujeitos mamíferos (por exemplo, humanos) que necessitem de tratamento, isto é, tendo uma doença, perturbação, patologia ou um sintoma delas que seja possível vir a tratar por ou que possa reagir a, um tratamento ou uma terapia com um anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou um fragmento. Incluem-se nos sujeitos os que sejam portadores ou estejam em risco de vir a ter uma perturbação ou doença imune, crónica ou aguda, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune ou uma reacção celular mediada por 0X40. Também se incluem nos sujeitos aqueles que sejam candidatos a ou tenham sido tratados de uma ou mais de entre: uma patologia ou doença imune crónica ou aguda, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune ou uma reacção celular mediada por 0X40. Deste modo, um sujeito que seja um candidato a ou tenha recebido células, tecido ou órgãos por transplante ou enxerto, tal como um rim, coração, pulmão, pele, vasos sanguíneos oculares, fígado ou pâncreas, ou medula óssea; células estaminais hematopoiéticas, células estaminais de sangue periférico ou células estaminais do cordão, quer alogénicas, células quer não alogénicas, células nervosas, é um candidato para tratamento com um anticorpo 0X40.
Incluem-se também sujeitos que necessitem de um tratamento ou uma terapia de supressão da imunidade devido a um diagnóstico laboratorial ou clínico que recomende um tal tratamento, os sujeitos que estejam já sob tratamento ou terapia imunossupressiva (por exemplo, devido a um transplante), e os sujeitos a quem haja sido administrado um tratamento ou uma terapia imunossupressiva, e que estejam em risco de recaída. Incluem-se nos sujeitos em risco aqueles que tenham um historial familiar de, uma predisposição genética para, ou que hajam previamente sofrido de uma doença ou perturbação imune, crónica ou aguda, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, au de uma doença autoimune ou de uma reacção celular mediada por 0X40. Estes sujeitos em risco podem ser identificados utilizando despistes, tais como com células T auto-reactivas ou anticorpos anti-proteina própria. Por exemplo, os sujeitos que expressem factor reumatóide estão em risco de artrite reumatóide. Os sujeitos que expressem anticorpos contra MBP, MOG ou PLP estão em risco de esclerose múltipla.
Os sujeitos em risco podem ser, portanto, tratados para inibir ou reduzir a probabilidade de desenvolverem uma doença ou patologia imune crónica ou aguda, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune, ou uma reacção celular mediada por 0X40, ou sofrendo de uma recaída ou recorrência de uma doença imune crónica ou aguda, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune, ou uma reacção celular mediada por 0X40. 0 resultado de um tal tratamento pode destinar-se a reduzir o risco de desenvolver uma doença ou patologia imune crónica ou aguda ou uma disfunção, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune, ou uma reacção celular mediada por 0X40.
Os anticorpos, ácidos nucleicos, e outras composições e métodos descritos neste documento podem ser incluídos em ou utilizar composições farmacêuticas. Estas formulações farmacêuticas são úteis para o tratamento de, ou para a administração ou entrega a, um sujeito in vivo localmente, regionalmente ou sistemicamente, ou ex vivo.
As formulações farmacêuticas incluem veículos, diluentes ou excipientes "aceitáveis do ponto de vista farmacêutico" e "fisiologicamente aceitáveis". Os termos "aceitável do ponto de vista farmacêutico" e "fisiologicamente aceitável" incluem solventes (aquosos ou não aquosos), soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, agentes isotónicos e promotores ou de atraso de absorção, compatíveis com uma administração farmacêutica. Estas formulações podem estar contidas num líquido; emulsão, suspensão, xarope ou elixir, ou ter forma sólida; comprimidos (revestidos ou não revestidos, com libertação imediata, a termo, contínua, ou pulsada), cápsula (dura ou mole, com libertação imediata, a termo, contínua, ou pulsada), pó, grânulo, cristal, ou micropérola. Podem também incorporar-se compostos suplementares (por exemplo agentes conservantes, antibacterianos, antivirais e antifúngicos) nas formulações.
Também se podem tornar as formulações farmacêuticas compatíveis com uma via particular de administração ou entrega, local, regional ou sistémica. Deste modo, as formulações farmacêuticas incluem veículos, diluentes, ou excipientes adequados para administração por vias particulares. São exemplos particulares não limitativos de vias de administração para composições da invenção a via parenteral, por exemplo, endovenosa, intraarterial, intradérmica, intramuscular, subcutânea, intra- pleural, transdérmica (tópica), transmucosal, intracraniana, intra-espinal, intra-ocular, rectal, oral (alimentar), administração pelas mucosas, e muitas outras formulações apropriadas para os métodos de tratamento ou protocolos de administração.
As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica podem incluir: um diluente estéril tal como água para injecção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzilico ou metilparabeno; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajustar a tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. Pode ajustar-se o pH com ácidos ou com bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.
Incluem-se nas formulações farmacêuticas para injecção soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injectáveis. Para administração endovenosa, incluem-se nos veículos adequados soro salino fisiológico, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou soro salino tamponizado do fosfato (PBS). 0 veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e outros semelhantes), e as suas misturas adequadas. Pode manter-se a fluidez, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção da dimensão de partícula indispensável no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. Incluem-se nos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal. Podem incluir-se na composição agentes de isotonicidade, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. Incluindo um agente que atrase a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina que podem prolongar a absorção de composições injectáveis.
Podem preparar-se formulações estéreis injectáveis incorporando a quantidade necessária da composição activa num solvente apropriado, com um ou com uma combinação dos ingredientes acima. Em geral, preparam-se as dispersões incorporando a composição activa num veículo estéril contendo um meio de dispersão de base, bem como qualquer outro ingrediente. No casa de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, incluem-se nos métodos de preparação, por exemplo; secagem em vazio e liofilização de que resulta um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional pretendido, a partir de uma sua solução anteriormente preparada.
Para administração transmucosal ou transdérmica, utilizam-se agentes penetrantes apropriados para a barreira que se pretende permear na formulação. Estes penetrantes são conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para uma administração transmucosal, detergentes, sais de ácidos biliares, e derivados de ácido fusídico. Pode conseguir-se uma administração transmucosal através da utilização de aspersões nasais, dispositivos de inalação (por exemplo, aspiradores) ou supositórios. Para a administração transdérmica, formulam-se os compostos activos em unguentos, salvas, geles, cremes ou pachos.
Podem preparar-se as formulações farmacêuticas com veículos que protegem contra a eliminação rápida do corpo, tais como uma formulação para libertação controlada ou um material para atraso temporal tal como nonoestearato de glicerilo ou estearato de glicerilo. Também se podem entregar as formulações utilizando árticos fabricados tais como implantes e sistemas microencapsulados de libertação para conseguir a entrega local, regional ou sistémica ou controlada ou uma libertação prolongada.
Podem utilizar-se polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como de etileno-acetato de vinilo, polianidridos, poli(ácido glicólico(, colagéneo, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação destas formulações são conhecidos dos especialistas da técnica. Também se podem obter comercialmente os materiais junto da Alza Corporation (Paio Alto, CA) . Podem também utilizar-se suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas alvejando células ou tecidos utilizando anticorpos ou proteínas da manta viral) como veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Estes podem ser preparados seguindo métodos conhecidos, por exemplo, tal como os descritos na Patente U.S. N2 4.522.811. São conhecidas na técnica formulações farmacêuticas adicionais apropriadas para administração (veja-se, por exemplo, Gennaro (editor), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, Lippincott, Williams & Wilkins (2000); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Ί- edição, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999); Kibbe (editor), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a edição (2000); e o Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms de Remington, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)).
As composições utilizadas tal como descrito neste documento, incluindo anticorpos 0X40, ácidos nucleicos, tratamentos, terapias, agentes, fármacos e formulações farmacêuticas podem ser embalados em formas de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade da dosagem. "Forma de unidade de dosagem", tal como se utiliza neste documento, refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas para um tratamento com unidades de dosagem; cada unidade contém uma quantidade da composição em associação com o veículo, excipiente ou diluente que é calculada para assegurar o tratamento ou a terapêutica que se pretenda (por exemplo, um efeito beneficial). As formas de unidade de dosagem dependerão de uma série de factores incluindo, mas não se limitando necessariamente a, a composição especificamente utilizada, o efeito a ser conseguido, e a farmacodinâmica e a farmacogenómica do sujeito a tratar. A descrição proporciona adicionalmente estojos, incluindo anticorpos 0X40, ácidos nucleicos, agentes, fármacos e formulações farmacêuticas, embalados em material de embalagem adequado, opcionalmente em combinação com instruções para se utilizarem as componentes do estojo, por exemplo, instruções para levar a cabo um método descrito neste documento. Um estojo pode incluir um anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou fragmento, e instruções para detectar 0X40. Um estojo pode incluir um anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou fragmento e instruções para tratar um sujeito que necessite de tratamento (por exemplo, um sujeito que sofra de uma doença, perturbação, patologia, ou estado que se possa vir a conseguir tratar ou que reaja ao tratamento ou à terapia) com o anticorpo 0X40, sua subsequência ou fragmento. As instruções podem ser para tratar uma doença ou perturbação imune crónica ou aguda, inflamação, GVHD, rejeição de transplante, inflamação, uma doença autoimune ou uma reacção celular mediada por 0X40. Um estojo pode incluir um tratamento ou uma terapia imunossupressivos, ou os seus agentes. 0 termo "material de embalagem" refere-se a estruturas físicas alojando as componentes do estojo. 0 material de embalagem pode manter as componentes estéreis, e ele pode ser construído em material habitualmente utilizado para esse tipo de propósito (por exemplo, papel, cartão canelado, vidro, plástico, folha, ampolas, etc.). 0 rótulo ou dispositivo de inclusão pode incluir instruções escritas apropriadas, por exemplo, um método diagnóstico ou de tratamento da invenção. As instruções podem, portanto, conter instruções para praticar qualquer dos métodos descritos neste documento. Deste modo, em diversas concretizações, um estojo inclui um rótulo ou um dispositivo para inserção incluindo instruções para praticar um método descrito neste documento em solução, in vitro, in vivo, ou ex vivo. Num aspecto, as instruções incluem administrar-se ou entregar-se o anticorpo 0X40, uma sua subsequência ou fragmento a um sujeito, localmente, regionalmente ou sistemicamente, por um método de tratamento ou terapêutico da invenção.
As instruções podem incluir adicionalmente indicações de um ponto terminal clinicamente satisfatório ou de sintomas adversos ou complicações que podem ocorrer. As instruções podem além disto incluir informação acerca da armazenagem, prazo de validade, ou qualquer informação necessária para as agências reguladoras tal como a Food and Drug Administration, para utilização num sujeito humano.
As instruções podem ser "material impresso" por exemplo, em papel ou cartolina dentro do estojo, num rótulo sobre o estojo ou material de embalagem, ou ligados a um frasco ou tubo contendo uma componente do estojo. As instruções podem incluir meios áudio ou vídeo e adicionalmente estar incluídas num meio que se possa ler num computador, tal como um disco (uma disquete ou um disco duro) , um CD óptico tal como CD-ROM ou DVD-ROM/RAM, fita magnética, meios de armazenagem eléctricos tais como RAM e ROM e híbridos destes tais como meios de armazenagem magnética/óptica.
Os estojos da invenção podem adicionalmente incluir um agente tamponizante, um conservante, ou um agente estabilizante. 0 estojo também pode incluir componentes de controlo para ensaiar a actividade, por exemplo, uma amostra de controlo ou um padrão. Cada componente do estojo pode estar incluída dentro de um contentor individual ou não, e todos os diversos contentores podem encontrar-se numa mesma embalagem única ou em diversas embalagens. São descritos neste documento métodos de despistar, detectar e identificar 0X40, isentos de células fpor exemplo, em solução, em fase sólida) e baseados em células (por exemplo, in vitro ou in vivo) . Podem levar-se a cabo os métodos em solução, in vitro, utilizando um material ou uma amostra biológica, e in vivo, por exemplo, utilizando uma amostra de células (por exemplo, linfócitos) de um animal. Um método pode incluir proporcionar-se um contacto entre um material biológico ou amostra, e um anticorpo que se ligue a 0X40 em condições que permitam a ligação ao anticorpo 0X40; e ensaiar-se a ligação do anticorpo a 0X40. A ligação do anticorpo a 0X40 detecta a presença de 0X40. Num aspecto, 0X40 está presente numa célula ou num tecido. Noutro aspecto, o material biológico ou amostra é obtido de um sujeito mamífero. 0 termo "proporcionar um contacto", quando utilizado em referência a uma composição tal como uma proteína (por exemplo, anticorpo 0X40), material, amostra, ou tratamento, significa uma interacção directa ou indirecta entre a composição (por exemplo, anticorpo 0X40) e a outra entidade referida. Um exemplo particular da interacção directa é a ligação. Um exemplo particular de uma interacção indirecta é quando a composição actua sobre uma molécula intermediária, que por seu lado actua sobre a entidade referida. Deste modo, por exemplo, proporcionar um contacto entre uma célula (por exemplo, um linfócito) e um anticorpo 0X40 inclui permitir ao anticorpo que se ligue à célula (por exemplo, través da ligação a 0X40), ou permitir que o anticorpo actue sobre um intermediário que por sua vez actue sobre a célula.
Os termos "avaliar" e "quantificar" e as suas variações gramaticais são utilizados a titulo intercambiável neste documento e referem-se a determinações, tanto qualitativas como quantitativas, ou tanto qualitativas como quantitativas. Quando os termos são utilizados em relação a uma liqação, quaisquer meios de avaliar a quantidade relativa, afinidade ou especificidade relativas estão incluídos, incluindo os diversos métodos descritos neste documento e conhecidos na técnica. Por exemplo, a ligação de um anticorpo 0X40 a 0X40 pode ser avaliada ou quantificada num ensaio ELISA. A não ser aonde se especifique algo em contrário, todos os termos científicos e técnicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é habitualmente entendido por indivíduos com conhecimentos médios da técnica com a qual esta invenção se relaciona. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser utilizados na prática da invenção ou para a testar, são descritos neste documento métodos e materiais adequados.
Todas as publicações, patentes, números de acessão ao Genbank e outras referências citadas neste documento são incorporadas por citação, integralmente. Em caso de conflito, a especificação presente, incluindo as definições, controlará.
Tal como se utiliza neste documento, as formas singulares "um/a", "e" e "o/a" incluem as formas plurais a não ser quando o contexto claramente indicar de outro modo. Assim, por exemplo, uma referência a "um anticorpo" inclui uma pluralidade de anticorpos e referência a "um tratamento ou terapia" pode incluir múltiplos tratamentos ou terapias, sequenciais ou em simultâneo, e assim por diante.
Tal como se utilizam neste documento, todos os valores numéricos ou gamas numéricas incluem inteiros adentro ou incluídos nas gamas referidas e fracções dos valores ou dos inteiros adentro das e incluindo as gamas, a não ser que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a uma gama de 90-100 %, inclui 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 95 %, 97 %, etc., bem como 91,1 %, 91,2 %, 91,3 %, 91,4 %, 91,5 %, etc., 92,1 %, 92,2 %, 92,3 %, 92,4 %, 92,5 %, etc., e assim por diante. Noutro exemplo, uma referência a uma gama de 1-5.000 vezes inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 vezes, etc., bem como 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 vezes, etc., 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 vezes, etc., e assim por diante. A invenção é descrita em geral neste documento utilizando linguagem afirmativa para descrever as numerosas concretizações.
Um número de concretizações da invenção foram descritas. Os exemplos seguintes pretendem ilustrar, mas não limitam o âmbito da invenção, o qual está descrito nas reivindicações.
Exemplos
Exemplo 1
Este exemplo descreve diversos materiais e métodos.
Preparação de antigénicos: Isolou-se ARN de células mononucleares de sangue periférico humano activadas durante dois dias com fitohemaglutinina (PHA, Remei, Lenexa, KS) utilizando o Tri Reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Amplificou-se a codificação da sequência do domínio extracelular de 0X40 humano por reacção de polimerase em cadeia de transcrição reversa. Sequenciou-se o produto amplificado e confirmou-se que era idêntico à sequência publicada de 0X40 humano (WO 95/12.673, SEQ N0:1) . Subclonou-se o produto no quadro no plasmídeo doador de baculovírus pfastbac-hFc. Gerou-se este vector a partir do plasmídeo pfastbac (Invitrogen Corp.) e da porção Fc de IgGl humano ("hlgGl"). Recortou-se a sequência de hlgGl do vector pV11392.fc. Geraram-se baculovírus recombinantes que codificavam para a proteína de fusão humana de OX40:hIgGl, (hOX40:hFc). Infectaram-se células do insecto Trichoplusia ni High-Five BTI-TN-5bl-4 ("Tn5") (Invitrogen Corp.) com a hOX40:hFc do baculovírus recombinante para produção de proteína. Amplificou-se a sequência de comprimento inteiro de 0X40 e clonou-se no vector pCDNA3.1 (Invitrogen Corp.) para expressão em células eucarióticas. Transfectaram-se células EL-4 (ATCC TIB-39) e CH0-K1 (ATCC CCL-61) utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen Corp.) e seleccionaram-se transfectantes estáveis utilizando higromicina B (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) oi geneticina (Invitrogen Corp.), respectivamente. Conjugou-se a hOX40:hFc com a ovalbumina por acoplamento com glutaraldeido. Misturou-se urn mg de hOX40:hFc com 0,5 mg de ovalbumina (Pierce, Rockford, IL) em 1 mL de soro salino tamponizado com fosfato (PBS). Adicionaram-se lentamente 50 pL de glutaraldeido de grau 1 % EM (Sigma, St. Louis, MO) e agitou-se suavemente durante cinco minutos para misturar a solução. Passadas três horas à temperatura ambiente, adicionou-se 50 pL de etanolamina 1 M (pH 7) e incubou-se a solução durante mais duas horas, permutando-se o tampão numa coluna NAP10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) com soro salino tamponizado com fosfato.
Sequência nucleotidica da proteína de fusão humana de OX40:IgGl humano a partir do códão de iniciação (ATG) através do domínio extracelular humano de 0X40 até ao final da sequência de Fc humana (sublinhado) SEQ ID NO:l ATGTGCOTGQ GOOCTCGGCG OCTGOQCCGC GGGCCGTGTG CGOCTCTGCT CCTCCTGGGC . 60 CTGGGOCTGÃ GCACCGTGAÇ GGOGCTCCAC TGTGTCGGGG ACACCTAGCC CAGCAACCAC 120 CGGTGCTGCC ACGAGTGCAG GCCAOGCAAC GGOATGGTGA GCCGCTGCAG CCGCTCCCAG 180 A'ACACGGTGT GCCGTCCGTG CGGGÇCGGGC TTCTACAACG ACGTGGTCAG CTCCAAGCCG 240 TGCAAGCCCT GCACGTGGTG TAACCTCAGA AGTGCGACTG AGCGGAAGCA GCTGTGCACO 300 GCCACACAGG ÀCACAGTCTG CCGCTOCCGG GGGGGCACCC AGCCCCTGGA CAGCTACAAG 360 CCTGGAGTTG ACTGTGCCCC CTGCCCTCCA GGGCACTTCT CCCCAGGCGA CAACCAGGCC 420 TGCAAGCCCT GG ACCAACTG CACCTTGGCT GGGAAGCACA CCCTGCAGCC GGCCAGCAAT 480 AGCTCGGACG CAATCTGTOA GGACAGGGAC CCCCCAG'CCA OGCAGCCCÇA OOAGACCCAO 540 GGCCCCCCGO CCAGGCCCAT CACTOTCCAG CCCACTGA AO CCTOOCCCAG AACCTCACAG 600 GOACCCTCCA OATCTTGTGA CAAAACTCAC ACATGCGGAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC ' 660 CTOCGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC 720 CGGACCCCTG AGGTCACATC CCTGGTGGTG GACGTOAGCC ACGAAGACCC TOAGGTCAAO 780 TTCAACTGGT ACGTQGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG · 840 CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC GTCCTCACCG TCCTGCACCA GC.ACTGGCTG 900 AATGGCAAGG AGTACAACTG CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCACGCCC CATCOAGAAA 960 ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA CAACCACACG TGIACACCCT GCCCCCÀTCC· 1020 CGGGATOAGC TGACCAAGAA CCAGOTCAGC CTGACCTGCC TGQTCAAAGG CTtGTATCCC . 1080 AGCGACATdO CCGTOOAGTG QGAGAOCAAT GCGCAGCCGG Ap AACAACTA C^AGACCACO' 1140 CCTCCCGTOC TG GACTCCGA CQGCTCCTTC TTCCTCTACA GCAAGCTCAC COTQGACAAG · 1200 AGCAGGTGGC AGCAGGOGAA CGTCTTCTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTOCACAAC 1260 CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT ccgggtA A at GA 1320
Sequência de aminoácidos do domínio extracelular humano de OX40-fundido com a porção Fc de IgGl humano (sublinhado) SEQ ID N0:2 MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ 60 NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPÇTWCNLR SGSERKQLÇT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK 120 PGVDCAPCPP OHFSPGDNQA CKPWTNÇTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ . 180 GPPARPITVO PTEAWPRTSO OPSRSCDKTH TCPPCPAPEL LOGPSVFLFP PKPKDTLMIS 240 BTPEVTCVVV DVSHEDPEyK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE OYNSTYRVVS VLTVLHODWL· 300 NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKOOPR EPQVVTLPPS RDBLTKNOVS LTCLVKGFYP 360 SDIAVEWESN GOPENNYKTT PPVLDSDCSF FLYSKLTVPK SRWOOGNVFS CSVMHEALHK 420 HYTOHSLSLS POK . .433
Murganhos: Obtiveram-se murganhos trans- cromossómicos humanos KM ™ (WO 02/43.478, WO 02/092.812, Ishida, et al., IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Resumo (2000); Kataoka, S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Resumo (2002)) contendo fragmentos de cromossomas humanos codificando para a região das imunoglobulinas humanas, junto da Kirin Brewery Co., Ltd., Japão, e alojaram-se nas instalações para animais no La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Uma revisão da tecnologia para produzir anticorpos humanos foi feita por Lonberg (Lonberg, et al., Int. ver. Immunol. 13(1): 65-93 (1995)). São descritos animais transgénicos com um ou mais genes de imunoglobulina humana (kapa ou lambda) que não expressam imunoglobulinas endógenas, por exemplo na Patente U.S. N2 5.939.598. Estão descritos métodos adicionais para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos (vejam-se, por exemplo, WO 98/24.893; WO 92/01.047; WO 96/34.096; WO 96/33.735; Patentes U.S. Nos 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806;
5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598). O desenvolvimento de bovinos transportando genes de imunoglobulina humana, vacas TC, está descrito em (Kuroiwa, et al. , Nat. Biotechnol. 20(9): 889-94 (2002); Kuroiwa, et al., Nat. Genet. 36(7): 775-80 (2004)).
Imunização: Misturou-se proteína recombinante hOX40:hFc com igual volume de adjuvante completo de Freund (CFA, Sigma) e preparou-se uma emulsão. Imunizaram-se murganhos com 10 a 25 pg de proteína por via intraperitoneal e reforçou-se por via intraperitoneal com 5 a 10 pg de proteína emulsionada em adjuvante de Freund incompleto (IFA, Sigma) a intervalos de duas semanas, num total de 2 a 4 reforços. Administra-se-lhes uma injecção final intraperitoneal de 5 a 10 pg de hOX40:hFc solúvel, sem adjuvante, cinco dias antes da fusão. Imunizou-se outro conjunto de murganhos com hOX40:hFc termicamente desnaturada por incubação a 80°C durante dez minutos em PBS e depois misturada a 1:1 com adjuvante RIBI (Sigma). Imunizaram-se os murganhos como se descreveu acima. Imunizou-se um terceiro conjunto de murganhos com hOX40:hFc conjugada com ovalbumina. Iniciaram-se os murganhos quer com 30 pg de hOX40:hFc-OVA por si só, ou com uma mistura de hOX40:hFc, respectivamente a 10 pg e a 20 pg, em RIBI. Os primeiros receberam um reforço de 30 pg de hOX40:hFc-OVA em RIBI, seguido por 10 pg de hOX40:hFc em RIBI a intervalos de duas semanas. Um reforço final de 20-pg de hOX40:hFc-OVA em PBS foi administrado cinco semanas depois. Os dois reforços deste último eram constituídos por 5 pg de hOX40:hFc-OVA + 10 pg hOX40:hFc em RIBI a intervalos de duas semanas, com um reforço final de 10 pg de hOX40:hFc em PBS. Todas as injecções foram intraperitoneais. Um último conjunto de morganhos foi imunizado com células T CD4+ humanas que haviam sido estimuladas durante dois dias com PHA (1 pg/mL) e interleuquina 2 recombinante humana (IL2, 10 ng/mL, BD Pharmingen, San Diego, CA) . Antes da injecção irradiaram-se as células com 25 Gy provenientes de uma fonte de césio e diluiram-se a 1:1 em adjuvante RIBI.
Produção de hibridomas: Seleccionaram-se os murganhos com titulo mais elevado em anticorpos anti-OX40 específicos para IgG no seu soro para a produção de anticorpos monoclonais. Recolheram-se os baços e fundiram-se suspensões de células simples com uma linha de células de mieloma (SP2/0-Agl4) (ATCC, Rockville, MD) a uma razão de 3:1 em polietilenoglicol a 50 % (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Plaquearam-se as fusões em placas com 96 poços de fundo plano, a uma densidade óptima e cultivaram-se em meio DMEM-10 completo (Meio Eagle Modificado da Dulbecco com 10 % de soro fetal de bovino (FBS, Invitrogen Corp.)), 1 % de aminoácidos não essenciais, L-glutamina 2 mM, com 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de sulfato de estreptomicina (todos da BioWhittaker, Walkersville, MD), com suplemento HAT (Sigma), e 10 % de Factor de Clonagem de Hibridoma (HCF, Biovaris, San Diego, CA) sob 10 % de CO2, a 37°C, numa incubadora. Rastrearam-se cerca de 4.000 poços de quatro fusões por ELISA para kapa humano contendo anticorpos específicos para 0X40. Os anticorpos IgG anti-0X40 humanos foram confirmados por análise em citometria de fluxo. Expandiram-se os poços positivos e submeteram-se a entre três e quatro clonagens em diluição limitativa para se obterem anticorpos monoclonais.
Purificação de anticorpos e proteínas: Para a purificação de anticorpos, cultivaram-se os hibridomas em frascos cilíndricos de 2 litros, a entre 350 mililitros e 1 litro/frasco, num sistema Integra de 1 litro (INTEGRA Bioscience, Inc. Ijamsville, MD) com meio de hibridoma SFM (Invitrogen Corp.) com suplemento de soro fetal de bovino ultra baixo em IgG (Invitrogen Corp.). Gerou-se proteína recombinante humana 0X40:hFc infectando 1 litro de células Tn5 durante 4 dias. Purificaram-se anticorpos monoclonais humanos e 0X40:hFc a partir de meios de cultura utilizando um gel de Proteína A-Sepharose recombinante de Fluxo Rápido (Amersham Biosciences). O meio acondicionado gerado nos frascos cilíndricos foi e primeiro lugar concentrado utilizando um sistema de caudal tangencial Ultrasette (Pali Corp., East Hills, NY) . Filtrou-se o meio acondicionado passando-o por uma unidade de filtração em vazio de 0,22 (Millipore, Bedford, MA) e carregou-se sobre uma coluna de Proteína A-Sepharose recombinante de Caudal Rápido (Amersham Biosciences) com dimensão apropriada para a quantidade de anticorpo humano no meio. Lavou-se muito bem a coluna com 20 volumes de coluna de PBS e eluiu-se o anticorpo com 0,1 M Gly-HCl, a pH 3,6, 0,15 M em NaCl, e neutralizou-se com Tris 1 M HC1, a pH 8,0. Analisaram-se as fracções por SDS-PAGE e juntaram-se as fracções positivas e concentrou-se num concentrador centrífugo (Vivaspin, 50.000 MWCO: Sartorius, Gettingen, Alemanha). Utilizaram-se colunas de dessalga Sephadex G-25, (NAP, Amersham Biosciences), para permuta de tampões com PBS, pH 7,4. Por último, esterilizou-se o anticorpo por filtração utilizando filtros seringa com diâmetro de poro de 0,22 μπι e determinou-se a concentração em anticorpo pelo método de Lowry. Determinou-se o conteúdo em pirogénicos utilizando o ensaio de Lisado de Limulo de Amebócito ("LAL") (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA) . Os limites de detecção deste ensaio são de 0,06 UE/mg. Caso o teste fosse negativo, consideravam-se as amostras isentas de endotoxina. ELISA para Quantificação de IgG Humano: Para se determinar a quantidade de anticorpo humano presente nos sobrenadantes e nas reservas purificadas, utilizou-se o seguinte protocolo. Revestiram-se placas de 96 poços (Nunc, Dinamarca) com anticorpo de cabra especifico anti-Fcy humano (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove; PA) em tampão de carbonato, a 0,5 pg/poço durante uma hora a 37°C. Bloquearam-se então as placas com Superblock (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos, seguindo-se a adição das amostras às placas. Geraram-se curvas padrão utilizando IgG humano total (Sigma) ou IgGl humano purificado ou TgG4 (Kirin Brewery Co., Ltd). Incubaram-se as placas durante uma hora a 37°C, lavou-se com PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween 20 (Sigma), detectando-se o anticorpo ligado com anticorpo específico de cabra anti-Fcy humano conjugado com peroxidase de raiz forte (HRP, Jackson Immunoresearch) durante uma hora a 37°C. O substrato TMB (Sigma) foi adicionado durante 10 minutos e parou-se a reacção com H2S04 (LabChem Inc., Pittsburgh, PA) . Mediu-se a densidade óptica (DO) a 450 nm num leitor de microplacas. ELISA para Detecção Específica de Anticorpo 0X40: Os títulos em anticorpos, a especificidade, e a produção por hibridomas foram determinados por ELISA. Em suma, revestiram-se placas de 96 poços de fundo plano com 50 pL de hOX40:hFc a 5 pg/mL em tampão carbonato (pH 9,4) de um dia para o outro a 4°C ou a 37°C durante uma hora. Depois de os lavar por duas vezes com PBS/0,1 % de Tween 20, bloquearam-se as placas com PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween 20 a 37°C durante uma hora: diluiu-se o soro, o sobrenadante, ou o anticorpo purificado em tampão de bloqueio, adicionou-se aos poços, e incubaram-se as placas durante uma hora a 37°C. Lavaram-se as placas quatro vezes com PBS/0,1 % de Tween 20 e adicionou-se o anticorpo de ovelha conjugado com peroxidase anti-kapa humana (The Binding Site, Birmigham, Reino Unido) a uma taxa de diluição de 1:2.000. A seguir a uma incubação durante uma hora a 37°C, lavaram-se as placas e adicionou-se o substrato TMB (Sigma) e incubou-se à temperatura ambiente durante dez a trinta minutos. Parou-se a reacção com H2S04 (LabChem) e mediu-se a densidade óptica a 450 nm com um leitor de microplacas.
Citometria de Fluxo: Os títulos em anticorpo, a especificidade, e as afinidades de ligação relativas foram determinados por análise de citometria de fluxo utilizando transfectantes CHO-KI estáveis humanos 0X40 de PHA de três dias + IL2 de PBMC activado humano. Lavaram-se as células uma vez em tampão de contraste: PBS + 2 % de FBS + 0,1 % de NaN3 + EDTA 10 mM, e voltaram a suspender-se em soro, sobrenadante, ou anticorpos purificados num volume de 50 pL. Incubaram-se as células com os anticorpos sobre gelo durante vinte minutos, lavaram-se por duas vezes em tampão de contraste, e voltaram a suspender-se em anticorpo secundário anti-IgG humano marcado com ficoeritrina. Utilizaram-se dois anticorpos diferentes: (1) IgG de cabra anti-humano (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) ou (2) IgG de murganho anti-humano (BD Pharmingen, San Diego, CA). Passados vinte minutos de incubação sobre gelo, lavaram-se as células uma vez e fixaram-se durante dez minutos com 1 % de paraformaldeído. Após uma lavagem final voltaram a suspender-se as células em tampão de contraste e adquiriram-se as células utilizando citómetros de fluxo FACScan ou FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA), e analisaram-se os dados utilizando os programas Cellquest (Becton Dickinson Biosciences) ou Flow Jo (TreeStar, Inc., San Carlos, CA). Também se contrastaram as células T activadas com anticorpo de murganho anti-OX40 humano L106 (Becton Dickinson), que se conjugou directamente com ficoeritrina ou cuja ligação foi detectada com IgG-ΡΕ anti-murganho (Southern Biotechnology Associates).
Ensaios de Bloqueio de OX4QL: Para determinar se os anticorpos anti-OX40 humano conseguiam bloquear a ligação de OX40L a 0X40 solúvel, utilizaram-se protocolos de ELISA e de citometria de fluxo. No ELISA revestiram-se placas de 96 poços Nunc de fundo plano com hOX40:hFc recombinante solúvel a 2 pg/mL em tampão de carbonato (pH 9,4) durante uma hora a 37°C. Lavaram-se as placas com PBS/0,1 % de Tween 20, e adicionou-se Superblock (Pierce) aos poços para bloquear a ligação não especifica. Diluíram-se os anticorpos em teste a 1 pg/mL em PBS/Tween e adicionaram-se às placas. Passada uma hora de incubação a 37°C, adicionou-se OX40L recombinante solúvel humano marcado com FLAG (Alexis Biochemicals, San Diego, CA) aos poços adequados sem se retirarem por lavagem os anticorpos anti-OX40. Passada uma hora de incubação, lavaram-se as placas com anticorpo conjugado anti-FLAG-peroxidase (Sigma) durante uma hora a 37°C. Adicionou-se o substrato TMB, ao fim de dez minutos parou-se a reacção com H2S04, e leram-se os resultados a 450 nm utilizando um leitor de microplacas. No ensaio de citometria de fluxo, purificaram-se células T humanas CD4+ e activaram-se com PHA + IL2 durante dois dias. Lavaram-se as células e voltaram a suspender-se em tampão de contraste e depois incubaram-se com quantidades crescentes de anticorpos humanos anti-OX40 humano durante vinte minutos sobre gelo, a entre 0.005 - 50 pg/mL. Adicionou-se então às células OX40L-FLAG recombinante solúvel. Lavaram-se as células e incubaram-se com anti-FLAG conjugado com PE (Sigma) . Depois de mais uma lavagem, fixaram-se as células com 1 % de paraformaldeído e analisaram-se num FACScan ou FACScalibur. A percentagem de inibição foi determinada utilizando a DO ou a percentagem de positivos na fórmula seguinte: % inibição =100- ((amostra/ligação máxima)* 100) .
Ensaios de Bloqueio Cruzado de Anticorpos Anti-0X40: Para se determinar se os anticorpos se ligam ao mesmo "epítopo" de 0X40 humano, utilizou-se um protocolo ELISA. Revestiram-se placas de ELISA de 96 poços com fundo plano Nunc com os anticorpos humanos anti-OX40 humano em tampão carbonato a 2 pg/mL durante uma hora a 37°C. Lavaram-se as placas e depois bloquearam-se com PBS/1 % de BSA/Tween 20. Fez-se uma incubação prévia de dois a 20 pg/mL dos anticorpos humanos anti-OX40 humano e dos anticorpos de murganho anti-OX40 humano L106 (BD Biosciences, San Jose, CA) , clone 315 (Nichirei Biosciences, Tóquio, Japão), ou ACT35 (BD Pharmingen) , com 2 pg/mL de proteína de fusão recombinante humana 0X40:mFc (Alexis Corporation, San Diego, CA) durante trinta minutos à temperatura ambiente. As combinações de anticorpo-OX40:proteína mFc foram adicionadas à placa e incubadas durante uma hora a 37°C. Depois de três lavagens, detectou-se a 0X40:mFc ligada com Ig de ovelha anti-murganho conjugada com peroxidase (Amersham Biosciences). Completou-se o ELISA tal como se descreveu acima. Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a DO de cada amostra na seguinte fórmula: % de inibição = 100-((amostra/ligação máxima)* 100).
Para se determinar se estes anticorpos humanos anti-OX40 humano boqueiam os anticorpos de murganho anti- 0X40 humana levou-se a cabo uma variante deste ELISA. 0 método foi o mesmo excepto que os anticorpos de murganho anti-OX40 humano foram revestidos sobre as placas e os 112V8, 112F32, 112Y131 e 112Z5 foram pré-incubados com a 0X40:proteina hFc humana. A ligação da proteina 0X40 aos anticorpos revestidos foi detectada com um anticorpo secundário de ovelha anti-IgG humano raiz forte (Amersham Bisociences). Também se utilizou um ensaio por citometria de fluxo para se determinar se os anticorpos se bloqueiam em cruzado uns aos outros. Purificaram-se células T CD4 humanas das células mononucleares de sangue periférico tal como se descreve adiante e activaram-se com 1 pg/mL de fitohemaglutinina (Remei, Lenexa, KS) e com 10 ng/mL de interleuquina 2 recombinante humana (BD Pharmingen) durante dois a três dias. Lavaram-se as células e marcaram-se com 10 pg/mL dos anticorpos em teste durante trinta minutos sobre gelo em PBS com um suplemento de 2 % de soro fetal de vitelo, e 0,1 % de azida de sódio. Sem se lavarem, adicionaram-se versões biotiniladas dos mesmos anticorpos aos poços a 10 pg/mL e incubaram-se as células durante mais trinta minutos sobre gelo. Lavaram-se então as células por adição do tampão e centrifugação a 1.200 RPM durante três minutos a 4°C. Detectou-se a ligação dos anticorpos biotinilados por incubação com estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE, BD Pharmingen) durante vinte minutos seguida por uma outra lavagem como se descreveu. Fixaram-se as células durante dez minutos em formaldeido a 1 %. Depois de uma lavagem final voltaram a suspender-se em tampão de contraste e adquiriram-se as amostras utilizando um citómetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson
Biosciences, Palo Alto, CA) . Analisaram-se os dados utilizando o programa Cellquest (Becton Dickinson
Biosciences) ou o Flow Jo (TreeStar, Inc., San Carlos, CA). Os anticorpos testados incluíam 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131, 112Z5, anti-DNP (controlo negativo de IgGl humano), anticorpos de murganho anti-OX40 humano, clone L106, clone 315, e clone ACT35. Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a seguinte fórmula: 100-(Média geométrica do anticorpo em teste/Máximo da média Geométrica)*100
Testaram-se os anticorpos quanto à inibição da ligação deles próprios, bem como de uns em relação aos outros.
Purificação de PBMC humanas a partir de sangue inteiro: Recolheram-se amostras de sangue inteiro de doadores saudáveis com idades de entre 18 e 50 anos no programa normal de doadores de sangue do Scripps Green Hospital (La Jolla, CA) . Adicionou-se heparina para evitar a coagulação. Não se especificava raça, etnicidade, nem género. Diluiu-se o sangue em PBS e colocou-se sobre Ficoll-Plaque Plus (Amersham Biosciences). Separaram-se as células mononucleares do soro e das plaquetas por centrifugação a 1.800 RPM sem o travão. Separou-se a interface contendo as PBMC e lavou-se por duas vezes com PUBS.
Purificação de Células T CD4+: Purificaram-se células T CD4+ humanas utilizando um estojo de isolamento negativo da Miltenyi Biotec. (Auburn, CA) . Marcaram-se as PBMC uma mistura de anticorpos especifica para CD8, CDllb, CD16, CD19, CD36, e CD56 conjugados com hapten durante quinze minutos a 4°C em PBS/0,5 % de BSA/EDTA 2mM. Depois de se lavarem por duas vezes, suspenderam-se de novo as células nas pérolas magnéticas anti-hapten (pérolas MACS) e incubaram-se as células durante 4°C quinze minutos. Lavaram-se então as células e aplicaram-se sobre uma coluna LS/VS+ que havia sido previamente lavada e inserida no magneto. Lavou-se a coluna por três vezes com tampão. As células "não tocadas" CD4+ estavam contidas no caudal que saia através da coluna. Confirmou-se a pureza numa análise por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para CD3 humana e para CDh humana, ambas directamente conjugadas com fluorocromos (BD Pharmingen). Em alternativa, seleccionaram-se positivamente as células CD4+ com micropérolas CD4 (Miltenyi Biotec): 0 processo era semelhante ao descrito acima, excepto que as células que aderiam à coluna foram eluídas removendo a coluna do magneto e forçando a passagem de 5 mL de tampão através da coluna com um êmbolo.
Ensaio de Reacção de Linfócitos Mistos: Purificaram-se PBMC de dois doadores e adicionaram-se 1 x 105 células de cada doador a uma placa ou de 96 poços na presença ou na ausência de anticorpos humanos anti-OX40 humano ou de controlo negativo de IgG4 humano (anti- albumina de soro humano, Kirin Brewery Co., Ltd.) (Ukyo, et al., Immunology 109(2): 226 (2003)). Testaram-se os anticorpos de 0,005 a 100 pg/mL, dependendo do estudo. Testaram-se múltiplos pares de doadores. O meio utilizado foi RPMI-1640 com suplemento de 10 % de soro ΆΒ humano (MP Biomedical, Irvine, CA), penicilina/estreptomicina, L-glutamina, e 2-mercaptoetanol. No dia seis adicionou-se a cada poço 1 pCi de timidina tritiada (3HTdR) durante as últimas dezoito horas de cultura. Lisaram-se as células e transferiram-se para esteiras filtrantes em vidro, que se contaram utilizando um contador de cintilação (Wallac, Turku, Finlândia).
Modelo de Doença Aguda do Enxerto em Relação ao Hospedeiro In Vivo: Injectaram-se murganhos macho com imunodeficiência combinada severa (SCID) e cinco a dez semanas de idade, com 20 pg de anticorpo de rato anticadeia β de receptor de IL2 de murganho (ΤΜβΙ, Tanaka, et al., J. Exp. Med. 178 (3): 1103-7 (1993)) para eliminar as células assassinas naturais endógenas. No dia seguinte irradiaram-se os murganhos com 2,5 Gy provenientes de uma fonte de césio. Quatro horas mais tarde administraram-se a cada murganho, por injecção intraperitoneal, 10 milhões de PBMC totais humanas em PBS, e em seguida por injecção endovenosa, anticorpo humano anti-OX40 humano ou controlo negativo de hlgG 1 (anti-di-nitro-fenol (anti-DNP), Kirin Brewery Co. Ltd.) a 2, 20, 100, ou 200 pg em 100 pL de PBS. Em alternativa, o tratamento com anticorpos foi atrasado para o dia três ou o dia seis, para testar o potencial terapêutico dos anticorpos anti-OX40. Os murganhos foram pesados a cada três ou quatro dias e receberam o anticorpo anti-IL2R3 semanalmente. No dia doze sacrificaram-se os animais e avaliou-se a sua patologia geral. Removeram-se os baços para análise por citometria de fluxo, os figados e os intestinos para histologia, e recolheu-se soro para análise de citoquinas humanas e de anticorpos (Watanabe, et al., Clin. Immunol. 120: 247 (2006)).
Modelo In Vivo de Doença Crónica do Enxerto em Relação ao Hospedeiro : Adaptou-se um modelo de GVHD crónica a partir do modelo de GVHD aguda xenogénica (Watanabe, et al., Clin. Immunol. 120: 247 (2006)). Induziu-se a doença pela transferência de células CD4 humanas positivamente seleccionadas para murganhos SCID que haviam sido preparados do mesmo modo que se descreveu acima. Os murganhos receberam cada um deles um milhão de células CD4 humanas positivamente seleccionadas por injecção intraperitoncal no dia 0, e 2, 20, ou 100 yg de anticorpos anti-OX40 ou de controlo por injecção endovenosa semanal, a partir do dia 0. A doença era evidente a partir do dia trinta e avaliaram-se os murganhos no dia quarenta e oito. Removeram-se os baços e os nodos linfáticos para citometria de fluxo, a pele e o pulmão para histologia, e o soro para análise de citoquinas humanas.
Análise de Citoquinas Humanas: Quantificou-se um painel de oito citoquina humanas em soro de murganho utilizando tecnologia multiplex e seguindo as instruções do fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Purificação de Células Assassinas Naturais Humanas: Purificaram-se células assassinas humanas naturais ("NK") utilizando um estojo de isolamento negativo da Miltenyi Biotec. (Auburn, CA) . Marcaram-se PBMC com a mistura de anticorpos especifica para células T, células B, células estaminais, células dendriticas, monócitos, granulócito e células eritroides conjugados com biotina, durante quinze minutos a 4°C em PBS/0,5 % de BSA/EDTA 2 mM. Em seguida adicionaram-se pérolas magnéticas anti-biotina ("pérolas MACS"). Incubaram-se as células a 4°C durante quinze minutos e depois lavaram-se a aplicaram-sobre uma coluna LS/VS+ que havia sido previamente lavada e inserida no magneto. Lavou-se a coluna por três vezes com tampão. As células "intactas" CD56+ NK estavam contidas no caudal que passou através da coluna. Confirmou-se a pureza por análise de citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos para CD56 humanas e para CD3 humanas, directamente conjugados com fluorocomos (BD Pharmingen.)
Ensaio de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos (ADCC): Purificaram-se células NK a partir de PBMC humanas e cultivaram-se durante quarenta e oito horas com 20 ng/mL de interleuquina 2 recombinante humana 2 (BD Pharmingen) em RPMI-1640 com suplementos de 10 % de soro AB humano (MP Biomedical, Irvine, CA), penicilina/estreptomicina, L-glutamina, e 2-mercaptoetanol.
Utilizaram-se estas células como células efectivadoras no ensaio Cytotox 96 não radioactivo (Promega Corp., Madison, WI) . As células alvo eram células EL-4 humanas de progenitores humanos transfectadas com 0X40. Incubaram-se cinco mil células alvo com 0,005 - 10 pg/mL dos anticorpos anti-OX40 humanos ou com anticorpos de controlo, durante trinta minutos sobre gelo numa placa de cultura de tecidos com 96 poços com fundo. Adicionaram-se vinte vezes mais células NK efectivadoras aos poços, num volume final de 100 pL e centrifugaram-se as placas a 200 x g durante três minutos antes da incubação a 37 °C sob 5 % de C02 durante quatro horas. Centrifugaram-se as placas a 250 x g durante cinco minutos e transferiram-se 50 pL dos sobrenadantes para placas de ELISA. Adicionou-se aos poços das placas o tampão de num volume de 5 0 pL. Depois de uma incubação durante trinta minutos à temperatura ambiente, adicionaram-se 50 pL da solução de paragem aos poços e determinou-se a absorvância a 490 nm. Os controlos necessários incluíram células alvo por si cós (espontâneas), células alvo por si sós tratadas com tampão de lise durante os últimos quarenta e cinco minutos da incubação (máximo) , células efectivadoras por si sós, poços contendo apenas meio, com (correcção de volume) e sem a adição do tampão de lise. Determinou-se a percentagem de lise específica utilizando a fórmula seguinte, depois de se subtrair a todos os poços o sinal de fundo devido ao meio, e subtraiu-se a correcção de volume do valor máximo do alvo.
Percentagem de Citotoxicidade = ((experimental - efectivadora espontânea - alvo espontânea)/(máximo do alvo - alvo espontâneo))* 100.
Isolamento de Genes de Anticorpo Anti-QX40 Humanos: Separaram-se por centrifugação células hibridoma de cultura (112V8 (ATCC N2 PTA-7219, depositada a 17 de Novembro de 2005)), que produzem o anticorpo 112V8 (IgG4). Purificou-se o ARN total destas células utilizando o estojo RNeasy (QIAGEN Inc., Valencia, CA) e seguindo as instruções do fabricante. Utilizou-se um estojo para amplificação do cADN "SMART RACE™ cDNA Amplification Kit" (Clontech Co., Ltd., Paio Alto, CA) para clonar o cADN que codifica para a região variável dos genes de imunoglobulina do ARN da célula hibridoma total. Em suma, preparou-se a primeira cadeia de cADN com transcriptase reversa a partir de dois microgramas de ARN. Utilizou-se este cADN como forma para a reacção de polimerase em cadeia ("PCR"), para amplificar a região variável e uma parte da região constante das cadeias pesada e leve (respectivamente "HV" e "LV") . As sequências amplificadas também continham as sequências líder. A reacção foi como se segue: 2,5 ou Pfu Ultra ADN polimerase (Stratagene, La Jolla, CA); 0,2 μΜ de Iniciador 3' (para a cadeia Pesada: IgGlp, para a cadeia Leve: hk5, Tabela 1); IX de Mistura A de Iniciador Universal para o terminal 5' (Mistura A de iniciador UMP incluída no estojo SMART RACE); 200 μΜ de mistura de dNTP; 1 mM MgCl2; Pfu Ultra Tampão (a concentração final é lx); e a forma do cADN. 0 programa de termociclagem era constituído por cinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos. Cinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 70°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos. Vinte cinco ciclos de: 94°C x 30 segundos, 68°C x 30 segundos, 72°C x 3 minutos seguidos por uma extensão a 72°C x 7 minutos. Recolheram-se os fragmentos de ADN amplificados por electroforese sobre gel de agarose, e purificaram-se com o Estojo de Extracção sobre Gel QIAquick (Qiagen Co., Ltd., Alemanha).
Integraram-se os fragmentos de ADN purificados de HV e de LV num vector pCR4 Blunt- TOPO utilizando o Estojo de Clonagem "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Invitrogen Corp.), e transformou-se cada plasmideo construído em E. coll, e depois clonou-se. Analisaram-se as sequências de cada inserção (HV e LV) nos plasmídeos construídos utilizando iniciadores específicos (M13F, M13R, Tabela 1) . Com base na sequência obtida a partir de HV e de LV, conceberam-se iniciadores oligonucleotídicos para amplificar VH (V8H38, V8H39) e VL (V8L42, V8LA3). (Tabela 1) .
Clonaram-se VH e VL de 112V8 no vector de expressão de IgGl. Em suma, conceberam-se oligonucleotidos iniciadores, contendo os locais de reconhecimento dos
enzimas de restrição 5'-Sail e 3'-NheI, para amplificar a região variável e HV por PCR. Levou-se a cabo a PCR utilizando como forma o ADN de pTopoV8VH miniprep , V8H38 e V8H39 como iniciadores (Tabela 1) com polimerase de ADN Pfu Ultra. Depois da digestão do produto de PCR com Nhel e com
Sail, subclonou-se um fragmento de 410 pb no vector de expressão de IgGl (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, N5KG1-Val Lark (um vector modificado a partir de N5KG1, Patente U.S. N2 6.001.358)) que fora previamente digerido com Nhel e Sail (fragmento de ADN com 8,9 kilobases) . A existência de uma região variável da HV foi analisada por digestão de restrição.
No segundo passo, inseriu-se a LV no vector N5KG1-Val Lark=VH como se segue: digeriu-se o vector de ADN com dois enzimas de restrição de ADN, BglII e BsiWI. Isolou-se o fragmento de ADN com 9,1 kb. De modo semelhante ao que se fez para a construção da cadeia Pesada, concebeu-se um conjunto de iniciadores para a PCR da LV de modo a conter os locais de reconhecimento para 5'BglI e 3'BsiWi. Estes iniciadores, V8L42 e V8L43, foram utilizados para amplificar a VL do ADN plasmídico pTopoV8VL miniprep. Digeriu-se o produto da PCR com BglII e com BsiWI e isolou-se por electroforese sobre gel de agarose e purificação do gel. Este fragmento, contendo V8VL, foi ligado ao vector de 9,1 kb com T4 ADN ligase e utilizado para transformar as células ToplO (Invitrogen Corp.). Seleccionaram-se os transformantes positivos em E. coli. Purificou-se este vector de expressão, pGlK112V8, e confirmou-se a presença de ambas as regiões 112V8LV e 112V8HV por análise de restrição.
Isolaram-se as regiões variáveis HV e LV de 112Y55 (ATCC N2 PTA-7220, depositada a 17 de Novembro de 2005), 112Y131 (ATCC N2 PTA-7218, depositada a 17 de Novembro de 2005), e de 112Z5 (ATCC N2 PTA-7216, depositada a 17 de Novembro de 2005) e sequenciaram-se utilizando o mesmo protocolo. Os iniciadores utilizados para a amplificação das HV e LV especificas estão listados na Tabela 1. A subclasse de um anticorpo determina em parte as funções efectivadoras secundárias, tais como activação do complemento ou ligação ao receptor de Fc (FcR) e a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) (Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971); Brunhouse, et al., Mol. Immunol. 16(11): 907-17 (1979)). Quando se identifica o tipo óptimo de anticorpo para uma aplicação particular, as funções efectivadoras dos anticorpos podem ser levadas em conta. Por exemplo, os anticorpos hlgGl têm uma vida média relativamente longa, eles são muito eficazes para fixar o complemento, e ligam-se tanto a FcRI como a FcRII. Em contraste, os anticorpos IgG4 humanos possuem uma vida média mais curta, não fixam complemento e têm uma menor afinidade para FcR. Substituindo-se a serina 228 por uma prolina (S228P) na região Fc do IgG4 diminui a heterogeneidade observada com hIgG4 e aumenta a vida média no soro (Rabat, et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5â Edição (1991).; Angal, et al., Mol. Immunol. 30(1): 105-8 (1993)). Uma segunda mutação em que se substitua a leucina 235 por ácido glutâmico (L235E) elimina as actividades residuais de ligação a FcR e ao complemento (Alegre, et al., J. Immunol. 148(11) : 3461-8 (1992)). 0 anticorpo resultante com ambas as mutações é referido como IgG4PE. A nomeação dos aminoácidos hIgG4 foi derivada de Rabat (Rabat, et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a Edição (1991)).
Gerou-se urn vector expressando 112V8 IgG4PE recombinante digerindo pGlR112V8 com Nhel e Bglll para libertar o fragmento contendo 112V8VH e 112V8VL. Este foi ligado ao vector de expressão de IgG4PE (pN5RG4PE-Lark, IDEC -Pharmaceuticals, Patente U.S. N2 6.001.358), cortado com os mesmos enzimas. O plasmideo resultante, pG4PEK112V8, foi confirmado por digestão de restrição.
Utilizou-se o ARN do hibridoma 112F32 (ATCC N2 PTA-7217, data de depósito 12 de Novembro de 2005) para gerar vectores para produzir anticorpos recombinantes 112F32G1 e 112F32G4, da mesma maneira, sendo respectivamente os iniciadores 3' utilizados para amplificação dos genes das cadeias Pesada e leve nas reacções com RACE, HH-2 e HK-2. A amplificação de 112F32HV foi levada a cabo utilizando H725' e M2H3'. Os iniciadores da amplificação de 112F32LV foram F32R5' e K52D3' (Tabela 1) . Obteve-se o vector de expressão de IgG4, pN5KG4, junto da IDEC Pharmaceuticals (Patente U.S. N2 6.001.358). Os vectores resultantes, pKLGl/F32K3H e pRLG4/F32K3H, foram confirmados por digestão com enzima de restrição, e sequenciação.
Sequência nucleotídica do cADN de 112F32.HV (a partir do códão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) SEQ ID NO:3 ATGGAGTGGG GGCCGTGCTG GGTTTTCCTT GTTGTTATTf TAGAAGGTGT CCAGTGTGGG 60 GTGCAGCTOG TGGAGTCJOO OGGAOGCTTO GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC 120 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGC TATAGCATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 180 GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATT AGTAGTAGTA GTAGTACCAT ATACTATGCA 240 GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATG CCAAGAACTC ACTGTATCTG 4 300 CAAATGAACA GCCTGAGAGA CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG AGGAGTGTAT 360 CACAATGGCT GGTCCTTCTT TGACTACTGG GGCCAGGGAA CCCTACTCAC CGTCTCCTCA 420
Sequência nucleotídica do cADN de 112F32 LV (a partir do códão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) SEQ ID NO:4 ATGGACÀTGA GGGTCCTCOC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGTTT CCCAGGTGCC ‘60 . AOATOTGÀCA TCCAGATOAC CCAGTCCCCA TCCTCACTGT CTGCATCTGT AGGAAACAGA 120. GTCACCATTA CTTGTCGGGC GAGTCAGGAT ATTAGCAGCT GGTTAGCCTG GTATCAGCAG, 180 AAACCAGAGA A AG CCCCTAA GTCCCTÇATC TATGCTGCAT CCAGTTTGCA AAGTGGGGTC 240 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGOATCTGOO ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 300 CAGCdTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGC CAACAGTATA ATAGTTAÇCC CCTCACCTTC 360
Jj.GCÇAAGGjDA CAÇOAC-XOG A GATTAAACGA. 390
Sequência nucleotídica do cADN de 112V8 HV (a partir do códão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) SEQ ID NO:5 ATOGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG 60 ATCACCTTGA AGG AGTCTGG TCCTACGCTA GTGAAGCCCA AACAOACCCT CACGCTGACC ' 120 TCCACCTTCT CTGGATTCTC ACTCAGCACT AGTGGAATGG GTGTGGGCTG OATCCGTCAG 180 CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA GTGGCTTGCA GTCATTTATT GGGATGATCA TCAACTCTAC 240 ACTCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ÀCCAAGG AC A CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC 300 CTTACAATGA CCAACATGGA CCCTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACACAGACGA 360 GGGGCCTTCC AGCACTOOGO CCAGGOCACC CTGGTCACCG TCTCCTCAGC TTCCACCAA 419 GGGC 423
Sequência nucleotidica do cADN de 112V8 LV (a partir do códão de iniciação (ATG) e até ao fim da região variável) SEQ ID NO:6 ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCACGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AACAGCCACC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA 180 CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA 240 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTÇTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300 CÇTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGATA GÇTCOCTCÂC TTTCGGCGGA 360 GGGÀCCÀAGG TGGAGATCAA ACGAACT 387
Sequência de aminoácidos do cADN de 112F32 HV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO:7 MEWGPCWVFL WILECVQCG VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS VSMNWVRQAP 60 GKGLEWVSYISSSSSTIYYA DSVKGRFHS RDNAKNSLYL QMNSLRDEDT AVYYCARGVY 120 HNGWSFFDYW GQGTLLTVSS 140
Sequência de aminoácidos do cADN de 112F32 LV kapa (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 8 MDMRVLAQLL GLLLLCFPGA RCDIQMTQSP SSLSASVGNR VTTTCRASQDISSWLAWYQQ 60 KPEKAPKSU YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQYNSYPLTF 120 GQGTRLEIKR 130
Sequência de aminoácidos do cADN de 112V8 HV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO:9 MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQITLKBSGPTL VKPKQTLTLT CTFSGFSLST SGMGVGWIRQ 60 PPG KALE WL A V1YWDDHQLY SPSLKSRLTITKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCAHRR 120 GAFQHWGQGT LVTVSSASTK G 141
Sequência de aminoácidos do cADN de 112V8 LV (sequência lider (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 10 METPAQIXFL LLLWLPDTTG E1VLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK 60 PGQAPRLHY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFÀVYYCQ QYDSSLTFGG , - 120 GTKVEIKRT ' 129
Tabela 1: Iniciadores de ADN sintetizados (SEQ ID NO:11-37)
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Y55 HV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID NO:38 ATOGACACAC TTTGCTCCAC GCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGGGT CTTGTCCCAG 60 ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTG GTGAAACCCA CACAGACCCTCACGCTGTCC 120
• TGCACCTTCT CTGGGTTCTC ACTCAGCACT AGTGGAGTGG GTGTGGGCTG GATQCGTCAG 180 CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA ATGGCTTGCÀ CTCATTCATT GGGATGATGC TGAGCGCTAC 240 ACTCCATCTC TGAAGAGCAG.GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTGGTC 300 . CTTÃCAATGA CCAACATGGA CCTTGTGOAC ACAOCCACAT ATTACTGTGC ACACACCCGG 360 ‘ GGGGCTTTTO ATATGTGGGG CCAAGGGACA ATGGTCACCG TCTCITCA 408
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Y55 LV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID NO:39 ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCOCAGA TACCACCGOA 60 GAAATTGTGT TG ACGCAGTC tccaggcacc CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCATC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGfCA GAGTGTTAGC AGCAGCTTCT TAGCCTGGTA CCAACAGAAA 180 CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCÁTTTA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA 240 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300 . CCTGAACATT TTGCAGTGTA .TTACTGTCAG CAGTATGATA GCTCACGGAC GTTCGGCCAG. 360 OGGACCAÁGG TOGAAATCAA A 381
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Y131 HV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID NO:40 ATGGACACAC TITGCTCCAC CCTCCTGCTG CTGACCATCC CTTCATGOGT CTTGTCCCAG .60- . . ATCACCTTGA AGGAGTCTGG TCCTACGCTG GTGAAACCCA CACAOACCCT CACOCTGACÇ 120 TGCACCTTCT CTGGATTCTC ACTCAGCACT AGTG GAGTGG GTGTGGGCTG GATCCGTCAG 180 . CCCCCAGGAA AGGCCCTGGA GTGGCTTGCA CTCATTTATT GGGATGATCA fAGCCCCTAC 240 AGCCCATCTC TGAAGAGCAG GCTCACCATC ACCAAGGACA CCTCCAAAAA CCAGGTOGTC 300 ; . CTTACAATGA CCA AC ATGG A CCCTGTGGAC ACAGCCACAT ATTACTGTGC ACGCACCCGG 360 GGGGCTTTTG ATATCTGGGG ΟΟΑΑϋσσΑΟΑ ATGGTCACCG TCTCTTCA 408
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Y131 LV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID N0:41 ATGGAAGCCC CAGCGCAOCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60. GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTÇCAGGGGA AAGAGCCACC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GGGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA GCAGAAACCT 180 GGCÇAGGCTC CCAGGCTÇCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC 240 · AGGTTCAGTG GCAGTGGGCC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT âoo ' · GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCATCCGAC GTTCGGCCAA 360 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGAACTGTG GCTGCACCAT C 381 1
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Z5 HV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID NO:42 ATCÀCCATGA TTACGCCAAG cttggtaccg agctcggatc cactagtaac ggçcgccagt .60' QTGCTGGAAT TCGCCCTTCT AATACGACTC ACTATAGGOC AAGCAGTGGT ATCAACGCAG 120 AGTACGGGGG· GAGGCTTGGT ACAGCCTGGC AGGTCCCTGA GACTCTCCTGIGCAGCCTCT 180 GGATTCACCC TTGATGATTA TGGCATOCAC TGGGTCCGGC AAGCTCCAGO GAAOOGCCTG 240 gaotggGtct caggtattag ttgg aatagt g atagtatag gctatgtgga ctctoto aag 300 GGCCGATTCA CCATCTCCAG AGACAAÇGCC AAG AACTCCC TGTATCTGCA AATGAACAGT 360 CTOAGAGTTG AGGACACOGC CTTGTATTAC TGTGTAAAAG ATATTAGTGG CTGGTACAGC ' 420 TTTGACTACT GGGGCCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCT CA 462
Sequência de nucleótidos do cADN de 112Y131 LV (desde o códão de iniciação (ATG) até ao fim da região variável) SEQ ID NO:43
ATGGAAÇ3CCC CAGCTCAGÇT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAOCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA.AAGAGCCACC. 120 ’ CTCTCCTGCA GG GCC'AGTC A .GAGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA ACAGAAACCT 180 GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCeCAGCC 240 i . ' AGGTTCAGTG GCAOTOOGTC TOGGACAGAC ttcactçtca CCATCAGCAg cctagagcct 300 gaagattitg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgatcac cítcggccaa •360
GGG ACACG AC TGG AGATTAA A 381' · .
Sequência de aminoácidos do cADN de 112Y55 HV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 44 MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQITLKESGPTL VKPTQTLTLS CTFSGFSLST SGVGVGWIRQ 60 PPGKALEWLA LIHWDDAERY SPSLKSRLTI f KDTSKNQVV LTMTNMDLVD TATYYCAHTR 120 . . - GAFDIWGQGT MVTVSS 136
Sequências de aminoácidos do cADN de 112Y55 LV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 45 MÉTPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAILSCRASQSVS SSFLAWYQQK 60 PGQAPRLLIY GAFSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYDSSRTFGQ 120
GTKVEIK 127
Sequência de aminoácidos do cADN de 112Y33 HV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 46 MDTLCSTLLL LTIPSWVLSQ ITLKESGPTL VKPTQTLTLT CTFSGFSLST SOVOVGWIRQ 60 PPGKALEWLA LIYWDDHSPY SPSLKSRLTI TKDTSKNQVV LTMTNMDPVD TATYYCARTR 120 · ' GAFDIWGQGT MVTVSS 136 ·
Sequência de aminoácidos do cADN de 112Y131 LV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ id NO: 47 ΜEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPCERAT LSCRASQGVS SYLAWYQQKP 60 ' GQAÍPRLUYD ASNRATGIPA RFSGSGPGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWHPTFÚQ 120
GTKVEIK 1-27
Sequência de aminoácidos do cADN de 112Y131 HV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 48 MTMITPSLVP .SSDPLVTA AS VLEFALLIRL TIGQAVVSTQ STGGGLVQPG RSLRLSCA AS 6°. GFTLDDYGMH WVRQAPGKGL EWVSG1SWNS. DSIGYVDSVK GRFTISRDNA KNSLYLQMNS 120 LRVEDTALYY c vkdisgwys fdywgqgtlv tvss 154
Sequência de aminoácidos do cADN de 112Z5 LV (sequência líder (a negrito) e região variável) SEQ ID NO: 49 MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP 60 GQAPRLUYD ASNRATGIPA RFSOSGSGTD FTLT1SSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ 120
GTRLEIK 127
Produção de anticorpo recombinante humano anti-0X40 de células CHO: Para a produção de anticorpo recombinante, electroporaram-se vectores individuais de anticorpo contendo o anticorpo anti-OX40 para dentro de uma célula hospedeira de uma estirpe com defeito dhfr de Ovário de Hamster Chinês (células CHO, ATCC #CRL-9096) e isolou-se o anticorpo recombinante a partir do sobrenadante das células transfectadas. Em suma, linearizaram-se dez microgramas De vector de expressão de ADN purificado com um enzima de restrição de ADN, NruI, e transfectou-se o ADN para 3 x 106 células CHO utilizando um electroporador Bio Rad (0,8 kV, 25 pF) . Semearam-se as células transf ectadas em placas de cultura com 96 poços, em meio EX-CELL 325 PF CHO isento de soro com glutamina (JRH Bioscience, Lenexa, KS) , com suplemento de penicilina/estreptomicina (BioWhitaker), HT (Sigma), e Geneticina (Invitrogen Corp.) para seleccionar as células CHO contendo o vector de ADN. Depois da selecção de diversas linhas transfectantes estáveis, identificaram-se por ELISA os produtores de alta quantidade de IgG humano, e utilizaram-se para a produção do anticorpo recombinante.
Exemplo 2 O exemplo descreve diversas características de anticorpos monoclonais humanos contra 0X40 humano.
Imunizaram-se murganhos KM™ com hOX40:hFc recombinante solúvel em CFA/IFA, hOX40:hFC + hOX40:hFc-ova conjugado em REBI, hOX40:hFc mecanicamente desnaturado por RIBI, ou irradiado, células T humanas activadas em RIBI. Vários de entre os murganhos criaram anticorpos específicos anti-OX40 humano, com uma gama de títulos específicos para IgG humano 0X40. Fundiram-se células de baço dos que melhor reagiam com células de mieloma para gerar hibridomas humanos produtores de anti-OX40 humano. A produção de anticorpos anti-OX40 foi determinada tanto por ELISA como por citometria de fluxo utilizando hOX40:hFc recombinante solúvel e CHO-OX40 como transfectantes, respectivamente. Clonaram-se os hibridomas positivos por diluição limitativa para se obterem hibridomas monoclonais. (Tabela 2).
Tabela 2: Antigénicos Utilizados para Gerar Anticorpos
Caracterizaram-se melhor diversos anticorpos quanto à sua afinidade de ligação relativa a 0X40 humana, a capacidade de bloquear o ligando de 0X40 humana, por ligação in vitro, por bloqueio cruzado entre eles, de bloquear a proliferação in vitro, a capacidade de bloquear a inflamaçao in vivo, e a capacidade de mediar ADCC. (Tabela 3).
Todos os 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55, e 112Z5 se ligavam especificamente a células T activadas, mas não a células T humanas em repouso (Figura 1). Marcaram-se células T humanas activadas durante três dias com anticorpos humanos anti-OX40 humano a várias concentrações, e detectaram-se com anti-IgG-PE humano. A ligação destes anticorpos humanos anti-OX40 humana era saturável. A ligação máxima de cada anticorpo foi determinada titulando a quantidade de anticorpo necessária para marcar células T humanas activadas (Figura 2) . Obteve-se uma gama de afinidades de ligação relativas (KD e BmaX, Tabela 3) . A ligação de anticorpos de murganho purificados anti-OX40 humana, L106, foi também determinada e todos os 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 e 112Z5 apresentavam valores de Bmax maiores do que L106 em relação a células T activadas.
Tabela 3: Caracteristicas de Anticorpos Monoclonais Humanos
Anti-OX40 Humana
Os anticorpos 0X40 foram analisados por ELISA para determinar se competiam uns com os outros para a ligação a 0X40 solúvel. Revestiram-se os poços de uma placa de 96 poços com os diversos anticorpos humanos individuais. Pré-incubou-se hOX40:mFc com anticorpos anti-OX40 solúveis (anticorpos de bloqueio) e depois adicionou-se aos poços revestidos. A ligação de hOX40:mFc ao anticorpo no revestimento foi detectada com o anti-IgG de murganho-HRP.
Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a fórmula seguinte (100 - (DO da amostra/DO da amostra com ligação máxima)) * 100 (Figura 3A).
Adicionalmente, revestiram-se os poços de uma placa de 96 poços com anticorpos de murganho (L106, 315, ACT35 ou IgG de murganho) e pré-incubou-se hOX40:hFc com os anticorpos de bloqueio. Detectou-se a ligação a hOX40:hFc com anticorpo de coelho anti-IgG humano-HRP (Figura 3B).
Foram identificados três grupos de "epítopo" para estes anticorpos humanos anti-OX40 humana. Os 112V8, 112Y55, e 112Y131 bloqueiam-se uns aos outros em cruzado, enquanto 112F32 e 112Z5 apresentam locais de ligação específicos. Os 112V8, 112Y131, e 112Y55 reduzem parcialmente a ligação de 112Z5, mas o inverso não se verifica, ο 112Z5 só se bloqueia a si próprio. Isto sugere que ο 112Z5 reconhece um epítopo diferente do reconhecido por 112V8, 112Y55, e 112Y131 e qualquer redução da ligação pode ser devida a impedimento estereoquímico. Estes anticorpos humanos anti-OX40 não bloqueiam a ligação de L106, 315 ou ACT35 a 0X40 (Figuras 3A e 3B) , enquanto o LI 0 6 se bloqueia a si próprio e ACT35, apenas reduz a ligação de 112V8 e de 112Y131 em 10 % em comparação com anticorpos de controlo (linha a sólido), que não se ligam a 0X40. Isto indica que os anticorpos descritos neste documento reconhecem um epítopo diferente do que o que L106 reconhece. 0 clone 315 reduzia a ligação de 112V8 e de 112Y131, no entanto como estes anticorpos não bloqueavam a ligação de 315, devem ligar-se a epítopos diferentes.
Utilizou-se também um ensaio por citometria de fluxo para se avaliar a capacidade dos anticorpos para bloquearem a ligação a 0X40 expresso à superfície em células T humanas activadas. Contrastaram-se células T activadas com os anticorpos de bloqueio, seguindo-se a adição dos anticorpos anti-OX40 biotinilados.
Adicionalmente, marcaram-se células T humanas activadas com anticorpos de murganho anti-OX40 humana para bloquear a ligação a 0X40. Detectou-se a ligação dos anticorpos anti-0X40 biotinilados a estas células com SA-PE. Analisaram-se as células por citometria de fluxo. A média geométrica do contraste positivo com SA-PE foi utilizada para calcular a percentagem de inibição utilizando a mesma fórmula, isto é, (100 - (DO da amostra/DO da amostra com ligação máxima))* 100.
Estes dados (Figuras 4A e 4B) correlacionam-se com os da análise por ELISA.
Três epítopos são reconhecidos pelos anticorpos humanos anti-OX40 humana, um por 112F32, um segundo por 112Z5, e um terceiro por 112V8 e 112Y131. Tal como nos dados obtidos por ELISA, 112Z5 apenas se bloqueia a ele próprio, mas a sua ligação é reduzida por 112V8 e por 112Y131. 0 mesmo é verdade para o bloqueio por parte de L106 de 112V8 e de 112Y131. Quando L106 está ligado primeiro às células, 112V8 e 112Y131 ainda são capazes de se ligarem eficientemente a 0X40 humana. No entanto, 112V8 e 112Y131 inibem a ligação de L106. Estes dados tomados em conjunto sugerem que os anticorpos impedem estereoquimicamente a ligação de L106, mas não reconhecem o mesmo epítopo. Os 112F32 e 112Z5 não bloqueiam a ligação de L106. 0 ACT35 não inibe a ligação de 112F32, 112V8, 112Y131, nem de 112Z5, mas o clone 315 reduz a ligação de 112V8 e de 112Y131 em 50 %. A ligação e a detecção dos anticorpos a células vivas pode induzir internalização da molécula superficial e portanto o nivel de ligação de um anticorpo individual pode ser reduzido devido a uma menor expressão superficial, ao todo, de 0X40, e não a um bloqueio da ligação dos anticorpos. Anticorpos com uma maior afinidade podem provocar mais internalização do que anticorpos com menor afinidade. Isto pode explicar as diferenças entre os dados de ELISA e de citometria de fluxo bem como as diferenças de resultados dependendo de qual o anticorpo que se utiliza para o bloqueio. A capacidade dos 112FR 112V8, 112Y131, 112Y55 e 112Z5 para bloquear a ligação de hOX40L solúvel a proteína de fusão hOX40:hFc revestida foi testada utilizando um protocolo ELISA (Figura 5A, Tabela 3) . Revestiram-se as placas com hOX40:hFc e depois de se bloquearem os locais não específicos deixou-se que os anticorpos anti-OX40 se ligassem. Sem lavagem, adicionou-se OX40L-FLAG aos poços.
Detectou-se o ligando ligado com um anticorpo secundário anti-FLAG-HRP . Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a fórmula seguinte (100 - (Do da amostra/DO máximo para ligação a OX40L)) * 100.
Os 112V8, 112Y55 e 112Y131 evitaram 85 % da ligação de OX40L solúvel a hOX40:hFc. O 112F32 evitava cerca de 70 % da ligação de hOX40L solúvel a hOX40:hFc e o 112Z5 bloqueava 67 % da ligação máxima. Estes dados sugerem que estes anticorpos humanos anti-OX40 humana se ligam à porção de 0X40 que está envolvida na ligação ao ligando.
Obtiveram-se resultados ligeiramente diferentes quando um ensaio baseado em citometria de fluxo foi utilizado para monitorizar o bloqueio da ligação de OX40L solúvel a células T humanas activadas que expressam 0X40 (Figura 5B). Marcaram-se as células T humanas activadas com anticorpos anti-OX40 e em seguida com OX40L humano solúvel marcado com FLAG. Detectou-se a ligação de 0X40L com anticorpo anti-FLAG-PE. Determinou-se a percentagem de inibição utilizando a mesma fórmula, isto é (100 -(amostra/ligação máxima)) * 100.
Neste estudo, o 112F32 era incapaz de evitar a ligação de OX40L e o bloqueio por 112Z5 foi reduzido, enquanto os outros anticorpos, 112V8, 112Y55 e 112Y131,
continuavam a exibir capacidades de bloqueio semelhantes. A diferença dos resultados pode ter dependido da afinidade de 112F32 e 112Z5 para 0X40. Pode também ser devida a uma trimerização da proteína 0X40 à superfície da célula por oposição à dimerização da proteína de fusão solúvel 0X40:mFc.
Em alternativa, a 0X40 expressa à superfície de células T activadas pode estar num complexo com 4-1BB (Ma, et al., Blood 106(6): 2002-10 (2005)) ou uma molécula inibidora semelhante a BTLA (Cheung, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102(37): 13218-23 (2005); Compaan, et al., J. Biol. Chem. 280(47): 39533-6 (2005); Croft, Trends
Immunol. 26(6): 292-4 (2005); Gonzalez, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(4): 1116-21 (2005); Sedy, et al., Nat.
Immunol. 6(1): 90-8 (2005)) que evita 112F32; ou reduz a ligação de 112Z5 mas não bloqueia a ligação de OX40L a 0X40. As últimas três possibilidades podem apontar para o epítopo específico a que se ligam os anticorpos individuais. O epítopo reconhecido por L106, um anticorpo de murganho anti-OX40 humana, também depende da confirmação do ligando de 0X40 e de 0X40, uma vez que L106 bloqueia 95 % da ligação de OX40L à proteína recombinante 0X40, mas só 60 % da ligação a células T activadas. Estes dados indicam que existem múltiplos epítopos na 0X40, alguns dos quais interferem por completo com a ligação a OX40L, enquanto outros só bloqueiam parcialmente a interaeção. A ligação destes anticorpos aos diferentes epítopos pode ter ou não ter consequências funcionais únicas. 0 bloqueio da ligação ao ligando por qualquer dos métodos não dita necessariamente que a sinalização de 0X40 seja impedida por um determinado anticorpo. Para se determinar se os anticorpos humanos anti-OX40 humana conseguem impedir a sinalização por intermédio de 0X40, prepararam-se culturas de linfócitos misturadas nos dois sentidos utilizando PBMC totais de dois doadores alogénicos. Co-cultivaram-se as células mononucleares do sangue periférico de dois doadores alogénicos em placas com 96 poços com fundo em U durante sete dias na presença ou na ausência de diversas doses de anticorpos anti-OX40 ou de anticorpo de controlo, em triplicado. Adicionaram-se 1 x 105 células/doador a cada poço. Pulsaram-se as placas durante as últimas dezoito horas de cultura com 1 pCi/poço de 3HTdR. Colheram-se as células e contaram-se num contador de cintilação. Quantificou-se a proliferação na presença e na ausência de controlo ou de anticorpos anti-OX40 (Figura 6). 0 112V8 (Figura 6A), ο 112Y55 e ο 112Z5 (Figura 6B), e os 112Y55, 112Y131, e 112F32 (Figura 6C) eram todos capazes de reduzir a quantidade de proliferação induzida pelas células alogénicas, de um modo dependente da dose, enquanto o controlo negativo, hIgG4 albumina anti-soro humano, não exibia qualquer efeito sobre a proliferação (Figura 6A) . Levaram-se a cabo múltiplos estudos e a intensidade das reacções, o máximo de CPM incorporado, era dependente da combinação dos PBMC do doador que se utilizou para cada ensaio. Em culturas mistas de linfócitos, tanto as células T CD4 como CD8 T respondem aos antigénicos alogénicos. Uma redução da reacção proliferativa pelos anticorpos humanos anti-OX40 humana pode ser devida a uma inibição directa das células T, tanto CD4 como CD8.
Exemplo 3
Este exemplo descreve o mapeamento de epítopos dos anticorpos humanos anti-OX40 humana com péptidos lineares de 0X40 humana.
Seleccionaram-se três péptidos adentro do domínio extracelular de 0X40 humana (Tabela 4) para se iniciar o mapeamento do(s) epítopo(s) reconhecidos por 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 e 112Z5.
Tabela 4: Péptidos 0X40 Humanos
Geraram-se os péptidos por A & A Lab, LLC e conjugara-se a hemocianina de Megathura crenulata ("KLH") com um agente de ligação de maleimida, seguindo as instruções do fabricante (Pierce). Revestiram-se os péptidos a 10 pg/mL em tampão de carbonato a placas de 96 poços Maxisorp para ELISA (Nunc) a 4°C de um dia para o outro. Lavou-se a placa com PBS/0,1 % de Tween 20 e depois bloqueou-se com tampão de Caseína (Pierce) durante três horas à temperatura ambiente. Adicionaram-se os candidatos a anticorpos a 10 pg/mL diluídos em Caseína a 10 % em PBS/0,1 % de Tween 20. Levou-se a cabo o resto do ELISA tal como se descreveu para o ELISA de detecção de anticorpos específicos para 0X40.
Nenhum dos anticorpos humanos anti-OX40 humana reagiu detectavelmente com estes péptidos humanos 0X40, enquanto o soro de murganhos imunizados com os péptidos se ligava ao péptido apropriado. Estes resultados indicam que 112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 e 112Z5 não se ligam detectavelmente a estes epítopos lineares curtos da sequência extracelular humana de 0X40 nas condições de ensaio que se utilizaram. Estes dados não impedem que estas sequências sejam reconhecidas pelos anticorpos humanos anti-OX40 humana quando estiverem incluídas em sequências peptídicas mais longas.
Exemplo 4
Este exemplo descreve a análise funcional in vivo de anticorpos monoclonais humanos anti-OX40 humana.
Utilizou-se um modelo de doença do enxerto em relação ao hospedeiro aguda xenogénica (XGVHD) para testar o potencial terapêutico do anticorpo humano 112V8G1 anti-0X40 humana in vivo (Watanabe, et al., Clin. Immunol. 120: 247-259 (2006)). Neste modelo transferem-se células mononucleares de sangue periférico humano para murganhos com imunodeficiência severa combinada (SCID). Antes da transferência tratam-se os murganhos com um anticorpo anti-cadeia IL2F^ para eliminar as células assassinas naturais murinas endógenas, e depois irradiam-se a doses sub-letais para permitir a migração das células humanas para o tracto intestinal. As células T humanas expandem-se e induzem uma doença semelhante à do enxerto contra o hospedeiro, resultando em perda de peso, hematúria, hidroperitoneu, infiltrados de células inflamatórias no fígado e no tracto intestinal, e eventualmente a morte. A doença é sobretudo mediada por células T humanas uma vez que a transferência de células T purificadas induz sintomas semelhantes.
Trataram-se murganhos SCID tal como descrito acima e adicionalmente com quer 112V8G1, quer com anticorpos humanos recombinantes de isotipo IgGl para controlo (anti-DNP) no dia 0 para testar o potencial profilático do bloqueio de 0X40. Administraram-se aos murganhos 100, 20, ou 2 pg de anticorpo 112V8G1 ou 100 pg de anti-DNP por injecção endovenosa no dia 0. Determinou-se a massa corporal a cada três ou quatro dias. No dia doze, sacrificaram-se os murganhos e analisaram-se para detectar sintomas da doença e recolheram-se os baços para análise por citometria de fluxo. A patologia geral observada no dia doze foi classificada como se segue, diarreia (0-1), hemorragia intestinal e na cavidade peritoneal, e peritonite (cada uma 0-5), indicando o número mais elevado doença mais severa. A soma de todos os sintomas de doença foi utilizada para determinar a classificação total da patologia geral. Os murganhos que receberam o anticorpo de controlo apresentavam todos eles sintomas de XGVHD, com classificações de patologia geral mais elevadas do que os murganhos que haviam recebido 112V8G1. Todas as doses de 112V8G1 testadas reduziam ou evitavam estes sintomas (Figura 7A.)
As análises dos baços concordavam com esta observação. Analisaram-se por citometria de fluxo suspensões de células isoladas dos baços para detectar a presença de células T humanas. Estavam presentes células T humanas nos baços de murganhos tratados com os anticorpos de controlo, mas o número de células T humanas nos animais tratados com 112V8G1 eram significativamente inferiores aos números de células T nos animais de controlo (Figura 7B.) Além disto, quantificaram-se as citoquinas inflamatórias humanas (interferão gama, factor de necrose tumoral, e o factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos) no soro utilizando tecnologia multiplex. As citoquinas inflamatórias humanas estavam em número reduzido nos animais tratados com 112V8G em comparação com os controlos. 0 efeito mais notável foi sobre os níveis de interferão gama (Figura 7C) . 0 aparecimento de células T 0X40+ no sangue periférico de doentes com transplante de medula óssea alogénica já foi correlacionado com o início de GVHD crónica (Gadisseur, et al., Bone Marrow Transplant 23(10): 1013-7 (1999); Kotani, et al., Blood 98(10): 3162-4 (2001); Sanchez, et al., Br. J. Haemato. 126(S): 697-703 (2004)).
Para se avaliar a eficácia do bloqueio de 0X40 no tratamento de GVHD crónica, estabeleceu-se um sistema de modelo animal de GVHD crónica xenogénica. 0 modelo é semelhante ao modelo de GVHD aguda xenogénica excepto que se injectou um milhão de células CD4+ purificadas nos murganhos SCID em vez de PBMC total. A dose de irradiação também é diminuída para 2,12 Gy para diminuir o nivel dos danos intestinais, os primeiros dados da doença são a perda de peso e a queda de cabelo, e em seguida a morte, que é parcialmente devida a infiltração de células T nos pulmões. Os sintomas da doença tornam-se aparentes por volta do dia trinta. Trataram-se conjuntos de cinco murganhos cada um com anticorpo recombinante 112V8G1 a 100, 20, ou 2 pg semanalmente durante cinco semanas ou com o anticorpo anti-DNP, hlgGl de controlo a 100 pg semanalmente durante cinco semanas. Analisaram-se os murganhos sobreviventes na semana sete. Determinaram-se as classificações da patologia geral através da extensão de queda de pelo, hemorragia, e peritonite (cada uma 0-5) e diarreia (0-1). A patologia primária observada foi a queda de pelo, e todas as três doses de 112V8G1 reduziram este sintoma da doença em comparação com os murganhos tratados com o controlo (Figura 8A). Esta observação concordava com a redução de células T humanas nos baços de murganhos tratados com 112V8G1 no dia 48 após a transferência das células T CD4 (Figura 8B). Neste modelo as células T humanas migram para os nodos linfáticos que se detectam facilmente nos animais de controlo, mas estão significativamente reduzidas ou não são encontradas nos animais tratados com anti-OX40 (Figura 8C) . Nota-se, que não se encontraram nodos linfáticos nos animais tratados com 112V8G1 a 20 ou 100 pg.
Além disto, e ao contrário do modelo agudo, as células positivas para podem ser facilmente detectadas nos baços e nos nodos linfáticos de murganhos tratados com controlo, e o número de células 0X40+ é reduzido nos animais tratados com 112V8G1 (Figuras 8B e 8C). Detectaram-citoquinas inflamatórias no soro de murganhos aos quais se haviam administrado células T CD4 humanas e a quantidade das citoquinas que se detectou era reduzida em murganhos tratados com 112V8G1 anti-OX40 humana, em comparação com os de controlo, a IgGl humana. As citoquinas produzidas neste modelo de doença incluem mas não se limitam a interleuquina 2, interleuquina 4, interleuquina 6, interleuquina 8, interleuquina 10, factor estimulante de colónias de granulócitos-macrófagos, interferão gama e factor alfa de necrose tumoral. As quantidades de todas as citoquinas excepto a interleuquina 6 estavam significativamente reduzidas aquando do tratamento com 112V8G1, demonstrando a actividade anti-inflamatória da inibição da sinalização com 0X40 por eliminação e/ou bloqueio.
Estudou-se o 112V8G4PE no modelo de XGVHD aguda utilizando um regime profilático. Este anticorpo não tem uma actividade de eliminação, devido à sua incapacidade de fixar complemento ou se ligar a receptores Fc e portanto a prevenção da doença deverá ser dependente do bloqueio da sinalização por 0X40 ou de uma modulação em baixa de 0X40. Uma única injecção de 112V8G4PE a 200, 20, ou 2 pg no dia 0 foi administrada a conjuntos de cinco murganhos. Aos murganhos do conjunto de tratado como controlo administraram-se 200 pg de anticorpo anti-DNP IgG4 humano no dia 0, 3, ou 6. Analisaram-se os murganhos no dia doze
obtendo a sua patologia geral e o número de células T humanas no baço (Figuras 9A e 9B, Tabela 5) . A patologia geral no dia doze foi classificada numa escala de 0-3 em termos de diarreia, hemorragia peritoneal ou ascites, e hemorragia intestinal, sendo 0 a ausência de patologia observada e representando 3 uma doença severa. Tanto 200 como 20 pg de 112V8G4PE evitavam o desenvolvimento de patologia observável, enquanto uma dose de 2 pg não era suficiente para evitar a doença. A quantidade da patologia geral correlacionava-se com o número de células T humanas no baço no dia doze. Quando comparados com os animais tratados com controlo, os conjuntos a 200 ou 20 pg de 112V8G4PE denotavam uma acumulação de células T humanas significativamente reduzida no baço, enquanto uma dose de 2 pg era ineficaz. As diferenças observadas nas titulações de 112V8G4PE (Figuras 9A e 9B) e 112V8G1 (Figura 7) podem ser atribuídas à falta de actividade de eliminação do anticorpo 112V8G4PE. A administração de 112V8G4PE foi atrasada até ao dia três ou ao dia seis para testar a eficácia terapêutica do bloqueio da sinalização por 0X40. Trataram-se os murganhos com 200 pg de 112V8G4PE ou anticorpo humano de controlo IgG4, quer no dia três, quer no dia seis a seguir à transferência de PBMC humanas. Avaliou-se a patologia geral no dia catorze. O bloqueio da sinalização por 0X40 melhorou a doença, quando se administrava o anticorpo 112V8G4PE anti-OX40 humana quer no dia três, quer no dia seis, em comparação com o nível de doença observado nos animais tratados com anticorpo de controlo (Figura 9C) . 0 número de células T humanas nos baços de murganhos tratados anti-OX40 também era significativamente menor quando comparado com o dos murganhos tratados com controlo. O 112V8G1 também reduzia a doença quando administrado no dia seis. Estes dados demonstram a eficácia do bloqueio da sinalização por 0X40 com anticorpos específicos para 0X40 como via terapêutica para reduzir a patologia da doença.
Tanto no modelo xenogénico da doença aguda do enxerto em relação ao hospedeiro, como no da crónica, o 112V8, um anticorpo humano anti-OX40 humana, reduzia significativamente a patologia da doença, a produção de citoquinas inflamatórias, o número de células T humanas nos baços e nos nodos linfáticos quando comparados com animais tratados com controlo. Estes dados demonstram que o alvejamento directo de células positivas para 0X40 é uma terapia adequada para a prevenção (profilática) e melhoria (terapêutica) de doenças mediadas por células T. Obtiveram-se resultados semelhantes num ou em ambos os modelos, com 112F32, 112Y55, 112Y131 e 112Z5 (Tabela 3).
No modelo de GVHD aguda, são necessárias células T humanas, tanto CD4 como CD8, para a doença. As células T CD4 são necessárias para a indução, enquanto as células T CD8 medeiam a maioria da patogénese. A prevenção e a melhoria da doença por administração de um dos anticorpos humanos anti-OX40 humana pode ser devida a antagonismo directo tanto em relação a células T CD4 como T CD8, ou pode ser devida ao bloqueio directo das células T CD4 com um efeito indirecto sobre as células T CD8 ao ser reduzida a ajuda das CD4. Além disto, os anticorpos de 0X40 podem promovera a geração ou aumentar os números de células T reguladoras. Embora não desejando uma limitação por ligação a uma qualquer teoria, é possível que um ou todos estes mecanismos possam mediar a melhoria da doença.
Embora não desejando uma limitação por ligação a uma qualquer teoria, um mecanismo potencial de acção destes anticorpos anti-OX40 humana é induzirem citotoxicidade dependente das células (ADCC) por células assassinas naturais ou células efectivadoras neutrófilas. Este processo depende da capacidade dos receptores Fc expressos pelas células efectivadoras em se ligarem aos anticorpos anti-OX40 ligados a 0X40 expressa em células T activadas. A capacidade das imunoglobulinas para se ligarem a receptores Fc é determinada pela subclasse do anticorpo e pelo tipo de receptor Fc. Os anticorpos IgGl humanos ligam-se a receptores Fc nas células assassinas naturais e nos neutrófilos enquanto os anticorpos IgG4 humanos não o fazem (Huber, et al., Nature 229(5284): 419-20 (1971); Brunhouse, et al.r Mol. Immunol. 16(11): 907-17 (1979)). os anticorpos humanos anti-OX40 humana 112F32 (IgGl), 112V8 (IgGl e
IgG4PE), 112Y55 (IgGl), 112Y131 (IgG4), e 112Z5 (IgGl), foram testados guanto à sua capacidade de mediar a ADCC de células alvo expressando 0X40 por células assassinas humanas naturais.
Utilizou-se um ensaio não radioactivo de citotoxicidade foi utilizado para determinar a percentagem de lise especifica das células alvo a seguir a uma incubação durante guatro horas com os anticorpos humanos anti-OX40 humana e células assassinas naturais humanas, a uma razão de vinte células efectivadoras por cada célula alvo (Figura 10) . Marcaram-se as células EL4-OX40 humana alvo com 0,001 - 10 pg/mL de anticorpos anti-OX40 ou de controlo negativo e depois incubaram-se com células humanas assassinas naturais. Determinou-se a lise das células alvo através da libertação de lactose desidrogenase num ensaio de citotoxicidade não radioactivo. Determinou-se a percentagem de lise especifica tal como se descreve nos métodos. Os anticorpos humanos IgGl anti-OX40 humana induziam a ADCC de células EL4-OX40 humana alvo de uma maneira dependente da dose. Os anticorpos humanos IgG4 anti-OX40 e m anticorpo humano IgGl de controlo não
induziam a lise especifica das células alvo. O nível da actividade de ADCC correlacionava-se com a afinidade de ligação relativa e com o grupo de epítopos, uma vez gue aqueles anticorpos que se ligavam ao grupo de epítopos B (112V8 e 112Y55) tinham ambos uma maior actividade de ADCC do que os anticorpos nos grupos A (112F32) e C (112Z5) .
Os resultados das análises descritas neste documento identifica anticorpos com uma gama de afinidades de ligação, três epítopos diferentes, e demonstração da sua eficácia no bloqueio da ligação a ligandos de 0X40, bem como na prevenção e melhoria de reacções inflamatórias mediadas por células T. A capacidade destes anticorpos humanos anti-OX40 humana (112F32, 112V8, 112Y55, 112Y131 e 112Z5) para reduzir a proliferação, a progressão da doença e a produção de citoquinas inflamatórias demonstra o potencial do bloqueio directo de 0X40 como via para o tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes mediadas por células T, incluindo mas não se limitando a artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoriase, doença de Crohn, doença do enxerto em relação ao hospedeiro, e rejeição de transplantações. A actividade de eliminação por parte dos anticorpos anti-OX40 não é necessária para a redução da proliferação ou para a melhoria da doença, podendo reduzir-se os efeitos adversos potenciais desvio a uma eliminação das células T.
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MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSKD RCCHECRPC GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLC ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTI GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPrrVQ PTEAWPRTSQ GPS (SEQ ID NO:51). 6. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua um anticorpo humano, humanizado ou quimérico que se ligue a uma sequência de aminoácidos à qual o anticorpo produzido pela linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 7. Um anticorpo isolado ou purificado com uma finidade de ligação a 0X40 adentro de 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 8. O anticorpo do item 7, em que o anticorpo tenha uma afinidade maior ou menor afinidade de ligação a 0X40 do que o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 9. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo tenha uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de KD 10~6 M e cerca de KD 10~13-M da de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 10. O anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo tenha a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; ou compita com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, para a ligação a 0X40. 11. 0 anticorpo do item 1, em que o anticorpo se ligue ao mesmo epítopo que 112V8, 112Y55 e Y131, e iniba ou evite a ligação de 0X40 a um ligando de 0X40 (OX40L) em 85 % ou mais. 12. 0 anticorpo do item 1, em que o anticorpo seja produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 13. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo iniba ou evite a ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5 a 0X40, tal como determinado num ensaio ELISA. 14. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo iniba pelo menos 50 % da ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32; 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5 a 0X40, tal como determinado num ensaio ELISA. 15. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo se ligue especificamente a 0X40 expresso em células não T, opcionalmente em que as referidas células não T sejam seleccionadas de entre células assassinas naturais, granulócitos, monócitos, células B ou uma linha de células não T transfectada com 0X40, opcionalmente em que a referida linha de células não T transfectada com 0X40 seja seleccionada de entre células CHO, células L929 e células HELA. 16. 0 anticorpo do item 1, em que o anticorpo inclua a sequência da região variável da cadeia pesada ou leve madura tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, ou uma subsequência da região variável da cadeia pesada ou leve madura tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO:44-49. 17. O anticorpo do item 16, em que a subsequência seja selecionada de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadeia singela (scFv), Fv ligados por dissulfureto (sdFv) e VL ou VH. 18. O anticorpo do item 16, em que a sequência da região variável da cadeia pesada ou leve madura tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49 apresente uma ou mais substituições de aminoácidos adentro ou fora de uma região constante, uma região determinante de complementaridade (CDR) ou uma região do quadro (FR). 19. O anticorpo do item 18, em que a substituição de aminoácido é uma substituição conservadora de aminoácido, adentro ou fora de uma região constante, uma região determinante de complementaridade (CDR) ou uma região quadro (FR) . 20. O anticorpo do item 18, em que a substituição do aminoácido inclua 1-3, 3-5, 5- 10 ou mais resíduos de aminoácido. 21. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7 ou 8, em que o anticorpo mantenha uma actividade detectável de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 22. 0 anticorpo do item 21, em que a actividade inclua modular-se a expansão ou a sobrevivência de células T, ou números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou eliminando células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. 23. 0 anticorpo do item 21, em que a actividade compreenda inibir a sinalização de 0X40. 24. O anticorpo do item 21, cuja actividade inclua reduzir ou eliminar parte das células T auto-reactivas especificas para um auto-antigénico, opcionalmente em que o auto-antigénico seja seleccionado de entre proteína básica de mielina, glicoproteína de oligodendrócito de mielina, proteína de proteolípido, colagéneo, antigénicos do tecido sinovial de articulações, insulina, ácido glutâmico descarboxilase, antigénicos intestinais, antigénicos da tiróide, proteínas histona, antigénicos do músculo e antigénicos da pele. 25. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo tenha 80 %-85 %, 85 %-90 %,90 %-95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou mais de identidade com uma sequência madura da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO:44-49. 26. O anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo se ligue especificamente a células T humanas activadas, não a células T em repouso. 27. 0 anticorpo do item 1, em que o anticorpo não iniba nem evite a ligação do anticorpo L106 a 0X40 tal como se determina num ensaio ELISA. 28. O anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo iniba a ligação de 0X40 ao ligando de 0X40. 29. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo iniba ou evite a ligação de ligando de 0X40 a células T activadas. 30. O anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo module a sinalização celular mediada por OX40ou module uma reacção celular mediada por 0X40. 31. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo iniba ou evite a sinalização celular mediada por 0X40. 32. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo iniba ou evite uma reacção celular mediada por 0X40. 33. 0 anticorpo do item 32, em que a reacção celular mediada por 0X40 inclua proliferação de linfócitos, expressão de citoquinas, sobrevivência de linfócitos, activação de NF-kB, manutenção da actividade de PKB (Akt), ou regulação em alta de survivina. 34. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo induza a lise das células EL4-humana expressando ou de células T activadas, mediada por células assassinas naturais, macrófagos ou neutrófilos, em que a percentagem (%) de lise especifica de células induzida a 10 pg/mL de anticorpo seja de entre cerca de 15 e 75 %, 25 a 65 %, ou 30 a 60 %, ou 50-100 %. 35. 0 anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo reduza, diminua ou evite um sintoma da doença de enxerto contra hospedeiro num modelo de doença aguda ou crónica de xenoenxerto em relação a hospedeiro, em que o anticorpo provoque uma remissão ou uma regressão da doença do enxerto contra o hospedeiro num modelo de doença aguda ou crónica de xenoenxerto em relação a hospedeiro. 36. 0 anticorpo do item 35, em que o modelo de xenoenxerto em relação a hospedeiro inclua murganhos imunodeficientes (SCID) que receberam células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) após a administração de anticorpo anti-IL2R-cadeia beta e de uma dose inferior à dose de irradiação mortal. 37. 0 anticorpo do item 35, em que o sintoma da doença de enxerto contra hospedeiro seja seleccionado de entre perda de peso, queda de cabelo, irritação da pele, hematúria, hidroperitoneu, e infiltrados de células inflamatórias no fígado, tracto intestinal, pulmão, pele e morte. 38. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo reduza, diminua ou evite a inflamação do pulmão, pele ou intestino. 39. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7; 8 ou 25, em que o anticorpo reduza, diminua ou evite um sintoma de uma doença autoimune. 40. O anticorpo do item 39, em que a doença autoimune seja seleccionada de entre: artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, doença de Crohn, doença inflamatória dos intestinos, colite ulcerosa, doença celíaca, psoríase, nefrite de lúpus proliferativo, miopatia granulomatosa, e polimiosite. 41. O anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o 0X40 seja humano. 42. O anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que 0X40 inclua uma sequência: MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGM VSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDT V CRCRAGTQPLDS Y KPG VDC A PCPPGH FSPGDN QACKPWTNÇTLAGKHTLQP ASNSSDA1CEDRDPPATQPQETQGPPARP1TVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGG RAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQ ADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 50) 43. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo seja monoclonal ou policlonal. 44. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo seja de um isotipo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4. IgA, IgM, IgE, IgD. 45. 0 anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, em que o anticorpo inclua adicionalmente um domínio heterólogo. 46. Uma composição farmacêutica incluindo o anticorpo de qualquer dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25, e um veículo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico. 47. Um ácido nucleico isolado que codifique para uma sequência de uma região variável madura da cadeia pesada ou da leve tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, ou uma sua subsequência. 48. O ácido nucleico isolado do item 47, cujas sequências incluam as SEQ ID NO: 3-6 e SEQ ID NO: 38-43, ou sequências que sejam degeneradas em relação às SEQ ID NO: 3-6 e SEQ ID NO: 38-43. 49. 0 ácido nucleico isolado do item 47, incluindo adicionalmente uma sequência de controlo de expressão. 50. O ácido nucleico isolado do item 47, incluindo adicionalmente um vector. 51. O ácido nucleico isolado do item 47, incluindo adicionalmente uma célula hospedeira. 52. Um ácido nucleico que codifique para uma sequência de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácido substituídos, adicionados ou eliminados com resíduos de aminoácido da sequência da região variável da cadeia leve ou pesada como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO: 44-49, em que a sequência de aminoácidos tenha uma afinidade de ligação para um epítopo do domínio extracelular de 0x40. 53. Um ácido nucleico que codifique para uma sequência de aminoácidos com um ou mais resíduos de aminoácido substituídos, adicionados ou eliminados da sequência da região variável da cadeia pesada ou leve tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 7-10 e nas SEQ ID NO:44-49, em que a sequência de aminoácidos tenha uma actividade de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 54. Um estojo incluindo um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, e instruções para administrar o anticorpo a um sujeito que necessite de tratamento com o anticorpo. 55. Uma célula isolada que expresse um anticorpo com a especificidade de ligação tal como o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5. 56. Um método para tratar uma patologia ou doença imune crónica ou aguda, ou um sintoma de uma patologia ou doença imune crónica ou aguda num sujeito que necessite de tratamento, que inclua administrar-se ao sujeito o anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica da reivindicação 46, eficaz para tratar a patologia ou doença imune crónica ou aguda, ou um sintoma da patologia ou doença imune crónica ou aguda no sujeito. 57. 0 método do item 56, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de uma patologia ou doença imune crónica ou aguda. 58. 0 método do item 56, em que o tratamento resulte no alivio ou na melhoria de um ou mais sintomas adversos ou das consequências físicas associadas a uma patologia ou doença imune crónica ou aguda. 59. Um método de tratar doença de enxerto em relação ao hospedeiro, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite do tratamento um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 47 eficaz para tratar doença de enxerto em relação ao hospedeiro. 60. O método do item 59, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de doença do enxerto contra o hospedeiro. 61. O método do item 59, em que o tratamento reduza, diminua ou evite o inicio, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou das consequências físicas associadas à doença do enxerto em relação ao hospedeiro, ou em que o tratamento resulte numa remissão ou regressão da doença de enxerto em relação ao hospedeiro, ou em que o tratamento resulte em evitar a doença do enxerto em relação ao hospedeiro. 62. 0 método do item 61, em que o sintoma da doença do enxerto em relação ao hospedeiro seja seleccionado de entre perda de peso, queda de cabelo, irritação da pele, hematúria, hidroperitoneu, infiltrados de células inflamatórias no fígado, tracto intestinal, pulmão e morte. 63. 0 método do item 59, em que o enxerto inclua medula óssea, células estaminais hematopoiéticas, células estaminais de sangue periférico ou células estaminais do cordão umbilical. 64. Um método de tratar rejeição de transplante, que inclua administrar a um sujeito que necessite de tratamento um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 4 6 eficaz para tratar rejeição de transplante. 65. 0 método do item 64, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de rejeição de transplante. 66. 0 método do item 64, em que o tratamento reduza, diminua ou evite o inicio, a frequência, a duração ou a severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas à rejeição de transplante, ou em que o tratamento resulte numa remissão ou numa regressão da rejeição do transplante, ou em que o tratamento resulte em evitar a rejeição do transplante. 67. 0 método do item 66, em que o sintoma da rejeição do transplante inclua uma reacção imunológica contra o transplante ou células do transplante ou destruição de tecido. 68. 0 método do item 64, em que o transplante inclua rim, coração, pulmão, pele, fígado ou pâncreas. 69. Um método de reduzir, diminuir ou evitar a inflamação incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de tratamento um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 4 6 eficaz para reduzir, diminuir, ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade da inflamação. 70. o método do item 69, em que a inflamação esteja presente no pulmão, articulação, músculo, pelo, sistema nervoso central ou periférico, ou no intestino. 71. O método do item 69, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de inflamação. 72. O método do item 69, em que o tratamento resulte na redução do inicio, da frequência, da duração ou da severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas à inflamação. 73. Um método de tratar uma patologia autoimune, que compreenda administrar-se a um sujeito que necessite de tratamento um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 46 eficaz para reduzir, diminuir ou evitar o início, a frequência, a duração ou a severidade de um sintoma de uma patologia autoimune. 74. O método do item 73, em que a patologia autoimune seja selecionada de entre: artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes, doença de Crohn, doença inflamatória dos intestinos, colite ulcerosa, doença celíaca, psoríase, nefrite de lúpus proliferativo, lúpus, miopatia granulomatosa, e polimiosite. 75. 0 método do item 73, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de uma patologia autoimune. 76. 0 método do item 73, em que o tratamento resulte na redução, diminuição ou prevenção do início, da frequência, da duração ou da severidade de um ou mais sintomas adversos ou consequências físicas associadas a uma patologia autoimune. 77. Um método de inibir ou de evitar uma reacção celular mediada por 0X40, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de inibir ou de evitar uma reacção celular mediada por 0X40 um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 46, eficaz para inibir ou evitar uma reacção celular mediada por 0X40. 78. 0 método do item 77, em que a reacção celular inclua proliferação de linfócitos, expressão de citoquinas, ou sobrevivência de linfócitos. 79. 0 método do item 77, em que o sujeito seja um candidato para ou tenha sido tratado de uma reacção celular mediada por 0X40. 80. Um método de inibir ou bloquear a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de bloquear, inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica da reivindicação 46 eficaz para inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a células T activadas. 81. Um método de inibir ou bloquear a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de bloquear, inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40, um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica do item 46 eficaz para inibir ou evitar a ligação de um ligando de 0X40 a 0X40. 82. Um método de modular uma sinalização celular mediada por 0X40, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de modular a sinalização mediada por 0X40 um anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ou a composição farmacêutica da reivindicação 46 eficaz para modular a sinalização celular mediada por 0X40. 83. Um método de diminuir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, incluindo administrar-se a um sujeito que necessite de números reduzidos de células T activadas, efetivadoras, de memória ou reguladoras uma quantidade de anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 suficiente para diminuir os números de células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. 84. Um método para tratar uma doença ou patologia provocada por células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, compreendendo administrar-se a um sujeito uma quantidade de anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 suficiente para reduzir, diminuir ou evitar a progressão da doença ou patologia provocada pelas células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras, ou para eliminar células T activadas, efectivadoras, de memória ou reguladoras. 85. 0 método do item 84, em que a doença ou patologia inclua: doença de enxerto em relação ao hospedeiro, inflamação ou uma patologia autoimune. 86. 0 método de qualquer um dos itens 56 a 85, em que o sujeito seja um mamífero. 87. 0 método de qualquer um dos itens a 56 a 85, em que o mamífero seja um ser humano. 88. 0 método de qualquer um dos itens a 56 a 85, em que se administre o anticorpo ao sujeito localmente, regionalmente ou sistemicamente.
89. Um método de diminuir o número de células T activadas no sangue, baço; nodos linfáticos, intestinos, fígado, pulmão, ou pele num modelo de doença aguda ou crónica de xenoenxerto em relação ao hospedeiro, incluindo administrar-se uma quantidade do anticorpo de qualquer um dos itens 1, 6, 7, 8 ou 25 ao modelo de doença aguda ou crónica de xenoenxerto em relação ao hospedeiro, que seja suficiente para diminuir o número de células T activadas no sangue, baço, nodos linfáticos, intestinos; fígado; pulmão, ou pele. 90. Um método de produzir um anticorpo humano 0X40 que possua uma actividade antagonista de 0X40, compreendendo: a) administrar-se um domínio extracelular de 0X40 humano conjugado com proteína recombinante Fc humana ou células T activadas humanas a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana; b) despistar no animal a expressão de anticorpo 0X40 humano; c) seleccionar um animal que produza um anticorpo 0X40 humano; d) isolar um anticorpo do animal seleccionado; e e) determinar se o anticorpo 0X40 humano tem actividade antagonista de 0X40. 91. Um método e produzir um anticorpo 0X40 humano que iniba ou evite a ligação de 0X4 0 a um ligando de 0X40 (OX40L), compreendendo: a) administrar-se um domínio extracelular de 0X40 humano conjugado com proteína Fc recombinante humana ou células T activadas humanas a um animal capaz de expressar imunoglobulina humana; b) despistar no animal a expressão do anticorpo 0X40 humano; c) seleccionar um animal que produza um anticorpo 0X40 humano; d) isolar um anticorpo do animal seleccionado; e e) determinar se o anticorpo 0X40 humano inibe ou evita a ligação de 0X40 a um ligando de 0X40 (0X4OL) . 92. 0 método de qualquer dos itens 90 ou 91, em que o animal capaz de expressar imunoglobulina humana compreenda um murganho transgénico ou uma vaca transgénica. 93. Um animal transgénico não humano que expresse um anticorpo que: a) seja idêntico a um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; b) se ligue a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 no qual um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 11225 se liga; c) tenha uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de cerca 1-5.000 vezes a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; d) tenha uma afinidade de ligação a 0X40 adentro de cerca de KD 10”6 M e cerca de KD 10 12 M a de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5; e) tenha a especificidade de ligação de um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, I12Y131, 112Y55 ou 112Z5; ou f) compita com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112F32, 112V8, 112Y131, 112Y55 ou 112Z5, para a ligação a 0X40.
Lisboa, 11 de Outubro de 2016.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo seja produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112V8, depositada como ATCC N2 PTA-7219, ou 112Y131, depositada como ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55, depositada como ATCC N2 PTA-7220, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou Fv ligdos por dissulfureto (sdFv).
  2. 2. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua: (a) a sequência madura da região variável da cadeia pesada tal como se ilustra na SEQ ID NO:9 e a sequência madura da região variável da cadeia leve tal como se ilustra na SEQ ID NO: 10, ou (b) a sequência madura da região variável da cadeia pesada tal como se ilustra na SEQ ID NO:44 e a sequência madura da região variável da cadeia leve tal como se ilustra na SEQ ID NO: 45, ou (c) a sequência madura da região variável da cadeia pesada tal como se ilustra na SEQ ID NO:46 e a sequência madura da região variável da cadeia leve tal como se ilustra na SEQ ID NO: 47, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  3. 3. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epítopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo compreenda uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido na posição 20 da SEQ ID NO: 9 e até ao aminoácido na posição 141 da SEQ ID NO: 9 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 10 até ao aminoácido na posição 129 da SEQ ID NO: 10, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  4. 4. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do dominio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido na posição 20 da SEQ ID NO: 44 e até ao aminoácido na posição 136 da SEQ ID NO: 44, e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos desde o aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 45 até ao aminoácido na posição 127 da SEQ ID NO: 45, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  5. 5. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do dominio extracelular de 0X40, em que o anticorpo compreenda uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 46 e até ao aminoácido na posição 136 da SEQ ID NO: 46 e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos a partir do aminoácido na posição 21 da SEQ ID NO: 47 e até ao aminoácido na posição 127 da SEQ ID NO: 47, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab' , F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  6. 6. Um anticorpo isolado ou purificado que se liga especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo inclua um anticorpo humano, humanizado ou quimérico e em que o anticorpo tenha actividade antagonista de 0X40, e em que o anticorpo compete com um anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112V8, depositada como ATCC N2 PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55 depositada como ATCC N2 PTA-7220, para a ligação a 0X40, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  7. 7. Um anticorpo isolado ou purificado que se ligue especificamente a um epitopo numa sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40, em que o anticorpo se liga ao epitopo da sequência de aminoácidos do domínio extracelular de 0X40 ao qual o anticorpo produzido por uma linha de células hibridoma denotada como 112V8, depositada como ATCC N2 PTA-7219, 112Y131, depositada como ATCC N2 PTA-7218, ou 112Y55 depositada como ATCC N2 PTA-7220, ou um seu fragmento selecionado de entre Fab, Fab', F(ab')2f Fv, Fd, os Fv de cadeia singela (scFv) , ou os Fv ligados por dissulfureto (sdFv).
  8. 8. Uma composição farmacêutica incluindo o anticorpo de qualquer uma das reivindicações anteriores, e um veiculo ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.
  9. 9. Um ácido nucleico isolado que codifique para uma sequência de uma região pesada de uma cadeia pesada madura tal como se ilustra nas SEQ ID NO: 9, 44 ou 46 e uma sequência de uma região pesada de uma cadeia leve madura tal como se ilustra em qualquer uma das SEQ ID NO: 10, 45 ou 47, em que as sequências incluem: (a) SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, ou uma sua sequência degenerada, ou (b) SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39, ou uma sua sequência degenerada, ou (c) SEQ ID NO: 40 e SEQ ID NO: 41, ou uma sua sequência degenerada.
  10. 10. Um ácido nucleico isolado que codifica para um anticorpo ou um fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-7. 11. 0 ácido nucleico isolado da reivindicação 10, em que o ácido nucleico codifique para uma sequência madura da região variável da cadeia pesada ou uma sequência madura da região variável da cadeia leve, tal como se denota em qualquer uma das SEQ ID NO: 7-10 ou 44-49.
  11. 12. O ácido nucleico isolado de qualquer uma das reivindicações 9-11, compreendendo também uma sequência de controlo de expressão.
  12. 13. Um vector compreendendo um ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 9-12.
  13. 14. Uma célula hospedeira compreendendo os ácidos nucleicos isolados de qualquer uma das reivindicações 9 a 12 ou o vector da reivindicação 13.
  14. 15. Um estojo compreendendo o anticorpo ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-7, e instruções para administrar o anticorpo a um sujeito que necessite de tratamento com o anticorpo.
  15. 16. Um método para produzir um anticorpo anti-0X40 utilizando a célula hospedeira da reivindicação 14.
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