PT1675608E - Barras sólidas e pastas de fosfato de cálcio injectável para a libertação de proteínas osteogénicas. - Google Patents

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1 DESCRIÇÃO "BARRAS SÓLIDAS E PASTAS DE FOSFATO DE CÁLCIO INJECTÁVEL PARA A LIBERTAÇÃO DE PROTEÍNAS OSTEOGÉNICAS" O assunto da invenção refere-se ao campo de proteínas osteogénicas e às suas formulações farmacêuticas. A osteoporose idiopática é uma doença de etiologia desconhecida caracterizada pela perda progressiva de massa óssea e fragilidade aumentada, resultando num aumento marcado na susceptibilidade de fracturas. A osteoporose está entre a mais predominante de todas as desordens de músculo-esqueléticas, afligindo cinquenta seis por cento de mulheres acima dos 45 anos de idade. Praemer et al., "Musculoskeletal Conditions in the United States", Amer. Acad. of Orthopaedic Surgeons, Park Ridge, IL (1992). Porque a sua incidência aumenta com a idade e a percentagem de idosos na população está a aumentar, a osteoporose tornar-se-á mais comum com o tempo. A osteoporose é difícil de tratar localmente, e não há actualmente nenhuma cura conhecida. Finalmente, . e mais significativamente, a osteoporose é associada com uma morbidez e mortalidade substancial. A fractura mais séria que resulta da osteoporose é a do fémur de próximo na região da junção do quadril. Com uma incidência anual de mais de 300 000, as fracturas do quadril são actualmente a fractura mais comum no idoso. Uma em cada seis mulheres caucasianas terá uma fractura de quadril durante a sua vida (Cummings et al., Arch. Intern. Med., volume 149, páginas 2455-2458 (1989)), e para aquelas que alcançam a idade de 90, este número torna-se um em três. 2

Em adição a se tratar o osso osteoporótico, existe uma necessidade para métodos de tratamento ou de prevenção de fracturas relacionadas com a osteoporose, por exemplo, por administração local de proteínas osteogénicas. As proteínas osteogénicas são as proteínas capazes de induzir, ou ajudar na indução de, formação de osso e/ou de cartilagem. Muitos tais proteínas osteogénicas foram nos anos mais recentes isoladas e caracterizadas, e algumas foram produzidas por métodos recombinantes.

Além do mais, as várias formulações designadas para libertar proteínas osteogénicas a um local onde a indução da formação de osso é desejada foi desenvolvida.

Mas apesar dos esforços substanciais neste campo, permanece uma necessidade para um método eficiente de reparação e/ou de tratamento do osso osteoporótico e osteopénico e para minimizar ou reduzir a incidência ou gravidade das fracturas relacionadas com a osteoporose. A presente invenção é dirigida a composições para a libertação injectável de proteínas osteogénicas, isto é, composições osteogénicas. As composições podem tomar a forma de uma barra sólida, de um modo preferido uma barra sólida cilíndrica. As composições compreendem uma proteína osteogénica e um material de fosfato de cálcio.

Em certas formas de realização preferidas da presente invenção, a proteína osteogénica é um membro da família da proteína morfogenética de osso, de um modo mais preferido uma de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, e BMP-13, de um modo o mais preferido de BMP-2. A proteína osteogénica está de um modo 3 preferido presente numa quantidade que varia de cerca de 1 % a cerca de 90 %, de um modo mais preferido de cerca de 15 % a cerca de 40 %, em peso das barras sólidas da invenção.

Em certas formas de realização preferidas da presente invenção, o material de fosfato de cálcio compreende um material seleccionado de fosfato de cálcio apatítico amorfo, fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino, hydroxiapatite, fosfato de tricálcio, fluorapatite e as suas combinações. De um modo o mais preferido, o matexial de fosfato de cálcio é um fosfato de cálcio de apatítico pobremente cristalino. O material de fosfato de cálcio está de um modo preferido presente numa quantidade que varia de cerca de 10 % a cerca de 99 %, de um modo mais preferido de cerca de 40 % a cerca de 60 %, em peso da composição osteogénica em forma de barra.

As formas de realização adicionais da presente invenção são dirigidas a composições osteogénicas as quais também compreendem um inibidor de reabsorção de osso. O inibidor da reabsorção de osso é de um modo preferido um bifosfonato seleccionado a partir de alendronato, cimadronato, clodronato, EB 1053, etidronatos, ibandronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, risedronato, tiludronato, YH 529, zoledronato, e dos seus sais, ésteres, ácidos, e misturas farmaceuticamente aceitáveis.

As formas de realização adicionais da presente invenção são dirigidas a composições osteogénicas as quais também compreendem um aditivo seleccionado a partir de sais farmaceuticamente aceitáveis, polissacáridos, péptidos, proteínas, amino ácidos, polímeros sintéticos, polímeros naturais, agentes tensioactivos, e as suas combinações, de um modo mais preferido seleccionados a partir de carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelulose, 4 pololáctido, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, óxido de polooxietileno, polímero de carboxivinilo, álcool de polivinilo, sulfato de dextrano e as suas combinações. O aditivo está de um modo preferido presente numa quantidade que varia de cerca de 1 % a cerca de 90 %, de um modo mais preferido de cerca de 20 % a cerca de 40 %, em peso da composição osteogénica em forma de barra.

Quando a composição osteogénica da presente invenção toma a forma de uma barra cilíndrica sólida, o diâmetro da barra cilíndrica está de um modo preferido entre cerca de 0,1 mm e 3,0 mm, de um modo mais preferido de cerca de 1,0 mm, e o comprimento da barra cilíndrica está de um modo preferido entre cerca de 0,5 cm e 5,0 cm.

Uma forma de realização adicional da presente invenção é dirigida a um método para preparar uma composição em forma de barra para a libertação injectável de proteínas osteogénicas, compreendendo a referida composição uma proteína osteogénica e um material de fosfato de cálcio, que compreende os passos de(a) misturar uma forma seca da proteína osteogénica com uma forma seca do material de fosfato de cálcio para produzir uma mistura seca; (b) reconstituir a mistura seca por se adicionar um tampão aquoso para formar uma pasta; (C) moldar a pasta para formar uma composição em forma de barra; e (d) secar a composição em forma de barra do passo (c) para formar uma composição em forma de barra para a libertação injectável de proteínas osteogénicas. Em formas de realização preferidas, o tampão aquoso é seleccionado a partir de salina tamponada de fosfato, salina, tampões à base de ácido glutâmico e glicina e das suas combinações. O volume para a relação em peso (mL:g) de tampão aquoso para a mistura seca varia de cerca de 0,5:1 a cerca de 2:1. A moldagem é de um modo preferido acompanhada por 5 moldagem, extrusão, pressão ou as suas combinações. Em certas forma de realização preferidas, a composição em forma de barra é cortada antes de ou depois do passo (d).

Ainda as formas de realização adicionais da presente invenção são dirigidas a métodos para tratar um mamífero que tem um defeito de osso que compreende administrar ao local do defeito de osso uma quantidade eficiente de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas aqui reivindicadas. Ainda as formas de realização adicionais da presente invenção são dirigidas a métodos para tratar um mamífero que tem um defeito de osso que compreende os passos de (a) administrar ao local do defeito do osso uma quantidade eficiente de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas aqui reivindicadas e(b) administrar ao local do defeito do osso uma quantidade eficiente de um inibidor de reabsorção de osso. A administração de um inibidor de reabsorção de osso pode ser executada antes do passo (a), depois do passo (a) ou simultaneamente com o passo (a). A Figura 1 é um gráfico que mostra a cinética de libertação in vitro de rhBMP-2 de barras de α-BSM usando 1251-rhBMP-2 como um marcador. A Figura 2 é um gráfico que mostra a retenção local in vivo de rhBMP-2 de barras de α-BSM usando 1251-rhBMP-2 como um marcador.

Geralmente, os métodos e as composições da presente invenção referem-se à regeneração de tecido de osso e para o aumento concomitante da massa do osso, da densidade do osso, e da resistência do osso. Mais particularmente, o assunto da invenção envolve barras e pastas sólidas injectáveis que compreendem uma 6 proteína osteogénica, um portador de fosfato de cálcio e aditivos opcionais e agentes activos tais como um inibidor de reabsorção de osso, assim como a métodos para preparar tais composições osteogénicas e métodos de tratamento usando tais composições osteogénicas. As barras sólidas de fosfato de cálcio da presente invenção são convenientes para a libertação intraóssea de proteínas osteogénicas. Através da utilização dos presentes métodos e composições inventivos, a gravidade da osteoporose ou a incidência de lesões osteoporóticas podem ser vantajosamente diminuídas, diminuindo finalmente a incidência de fracturas de osso. Outros usos clínicos incluem a reparação da fractura, a reparação da cartilagem, a reparação do defeito de não união e a fusão espinal. As barras sólidas injectáveis da presente invenção também podem ser usadas para promover o crescimento de osso como necessário usando implantes de substituição em junções como descrito no pedido provisório norte americano No. 60/502 526, ("Promotion of Bone Ingrowth in Joint Replacement Implants Using Osteogenic Proteins"); 0 assunto desta aplicação provisória é aqui incorporado na sua totalidade por referência.

Uma primeira forma de realização da presente invenção é dirigida a uma composição em forma de barra para a libertação injectável de proteínas osteogénicas que compreendem uma proteína osteogénica e um material de fosfato de cálcio. Uma composição de acordo com esta primeira forma de realização da presente invenção pode opcionalmente incluir outros aditivos (ligantes, excipientes) e/ou agentes activos tais como um inibidor de reabsorção de osso.

Esta composição sólida em forma de barra é conveniente para a libertação intraóssea local e pode, portanto, ser injectada directamente num local osteoporótico ou osteopénico para induzir 7 eficientemente a formação e/ou a manutenção de osso. Adicionalmente, a composição em forma de barra injectável apresenta um perfil de libertação sustentada com referência à proteína osteogénica quando libertada desta maneira. De um modo preferido as barras sólidas da presente invenção são cilíndricas e têm um diâmetro que varia de cerca de 0,1 mm a cerca de 3,0 mm, de um modo mais preferido de cerca de 1,0 mm a fim de permitir a libertação através de uma agulha de medida 16. Além do mais, as barras sólidas têm de um modo preferido um comprimento que varia de cerca de 1,0 mm a cerca de 5,0 cm.

Ao contrário das formulações injectáveis existentes, a composição osteogénica desta primeira forma de realização da presente invenção é administrada numa forma sólida, evitando assim as deficiências inerentes em formulações líquidas ou viscosas. Por exemplo, usando formulações líquidas ou de gel, o agente osteogénico pode ser prematuramente diluído pelos fluidos de corpo antes do efeito de promoção do osso poder ser alcançado. A presente invenção obvia o efeito de diluição por se empregar um portador sólido o qual degrada lentamente in vivo, fornecendo assim a libertação sustentada, demorada do agente(s) activo. Além do mais, ao contrário das formulações líquidas ou viscosas que podem migrar do local de administração, as composições sólidas da presente invenção tornam-se alojadas e persistem no local de crescimento de osso desejado para efectuar a actividade promotora do crescimento de osso. Também permitem uma colocação injectável mais precisa de uma barra sólida em áreas de baixa massa de osso. Tipicamente, a composição deve persistir no local durante um período de cerca de 5 dias a cerca de 2 meses. Se a composição é dispersa prematuramente, o efeito de promoção de crescimento de osso desejado ou não vai ocorrer ou o osso formado não vai ter a resistência desejada. 8

Finalmente, embora a composição osteogénica forma de realização da presente invenção seja administrada como um sólido, é de um modo preferido formada como uma barra cilíndrica, sendo portanto conveniente para qualquer injecção ou implantação no corpo. Naturalmente, se desejado, outras formas de barra podiam ser usadas, por exemplo, formas de barra hexagonais, quadradas ou semicirculares. Além do mais, a complicação cirúrgica bem conhecida de induzir um embolismo durante um procedimento de injecção intraóssea é consideravelmente mitigado através da utilização de barras sólidas (vs. formas líquidas ou de gel). 0 deslocamento potencial de fragmentos de osso intraósseos, gordura ou um embolismo causados por uma injecção pressurizada de um grande volume de portador de líquido/gel é reduzido uma vez que o volume injectado de barra sólida altamente concentrada é muito menor do que o necessário se uma dose semelhante for dispensada numa forma líquida ou de gel. A composição pode ser aplicada ao local de crescimento de osso desejado de qualquer maneira conveniente, incluindo pela introdução através de uma seringa agulha ou hípodérmica convencional.

Uma segunda forma de realização da presente invenção é dirigida a um método para preparar a composição sólida em forma de barra para a libertação injectável de proteínas osteogénicas. No primeiro passo, uma forma seca da proteína osteogénica é misturada com uma forma seca do material de fosfato de cálcio para produzir uma mistura seca. Em outras palavras, as formas em pó ou secas de ambos a proteína osteogénica e o material de fosfato de cálcio são inicialmente empregues para formar uma mistura seca. Quando os aditivos e/ou os agentes activos adicionais são incluídos na composição, estes materiais também podem ser empregues numa forma seca ou em pó e incluídos na mistura seca. 9

No segundo passo, a mistura seca é reconstituída por se adicionar um tampão aquoso para formar uma pasta. Os tampões aquosos convenientes incluem, sem limitação, salina tamponada de fosfato, salina, tampões à base de glicina, e as suas combinações. Quando se utiliza BMP-2 como a proteína osteogénica, um tampão à base de glicina que tem um pH de cerca de 4,5 é preferido para a utilização; de um modo mais preferido, um tampão à base de glicina que tem uma composição de 5 mmol de ácido L-glutâmico, 2,5 % de glicina, 0,5 % de sacarose, 5 mmol de NaCl e 0,01 % de polissorbato 80 é usado.

Um volume de relação em peso (mL:g) de tampão aquoso para mistura seca varia de cerca de 0,5:1 a cerca de 2:1. No entanto, o limite mais baixo desta relação em peso é limitado só pelo interesse que o líquido suficiente seja adicionado à mistura seca a fim de ser suficiente para permitir a formação de uma pasta que pode ser formada através de injecção através de uma seringa ou algum outro método. Além do mais, o limite superior desta relação em peso é limitado só pelo interesse de que não tanto líquido seja adicionado à mistura seca que, depois de secagem subsequente, a geometria alcançada isto é a forma de barra, seja perturbada; em outras palavras, se demasiado líquido for usado, então a forma de barra formada no terceiro passo deste método estará comprometida depois da secagem do composto osteogénico.

Este passo é executado sob condições em que ocorre uma mistura substancialmente uniforme. A mistura combina os ingredientes e pode ser usada para regular a extensão de reacções inter-ingrediente. Enquanto todos os ingredientes desejados estão de um modo preferido contidos na mistura seca, é também possível adicionar um aditivo ou um agente activo adicional imediatamente antes da iniciação da 10 mistura ou antes da conclusão da mistura. Um tal aditivo ou agente activo adicional está de um modo preferido numa forma seca; no entanto, uma forma hidratada do aditivo ou do agente activo adicional também pode ser adicionada à pasta.

No terceiro passo do presente método inventivo, a pasta é moldada para formar uma composição em forma de barra. A moldagem ou a formação podem ser realizadas por se usar qualquer um de um número de técnicas conhecidas tais como a moldagem, extrusão, pressão, perfuração e/ou corte. Numa forma de realização preferida desta invenção, a pasta é embalada em e extrudida através da extremidade de cubo de uma seringa hipodérmica. Neste caso, o desentupidor da seringa é inserido e uma quantidade suficiente de pressão é aplicada para extrudir um comprimento contínuo de pasta sobre uma superfície seca. As secções são depois cortadas usando uma ferramenta de corte tal como uma navalha, escalpelo, faca ou semelhantes, para formar composições em forma de barra injectáveis. O corte também pode ter lugar depois do passo de secagem descrito a seguir. Alternativamente, a pasta pode ser embalada num tubo permeável ao molde cilíndrico, sonda, ar ou gás (por exemplo, silastico ou Teflon®/FEP) ou qualquer outro aparelho de tipo extrusão.

No passo final, a composição em forma de barra obtida no passo prévio é seca ou endurecida para formar a composição em forma de barra para a libertação injectável de proteínas osteogénicas da presente invenção (primeira forma de realização). A secagem pode ser realizada através de secagem a ar ou incubação a temperaturas elevadas, isto é, pelo menos a 37 °C. A temperatura de secagem é limitada só por um interesse para a degradação de proteína osteogénica, a qual tipicamente ocorre em algum lugar no intervalo 11 de 55 °C e 60 °C. Quando a secagem é realizada num forno de 37 °C, a secagem leva aproximadamente pelo menos uma hora, e de um modo preferido a secagem é levada a cabo durante a noite. A composição em forma de barra tem de um modo preferido um vapor residual de menos do que 10 %.

Os detalhes no que se refere ao agente activo, portador, aditivos e inibidores da reabsorção do osso convenientes para a utilização na presente invenção são dados a seguir.

AGENTE ACTIVO 0 agente activo presente nas composições osteogénicas da presente invenção é de um modo preferido seleccionado a partir da família de

proteínas conhecidas como a super família de beta factores de crescimento, de transformação (TGF-β) de proteínas. Esta família inclui as activinas, as inibinas e as proteínas morfogenéticas de osso (BMPs). Estes BMPs incluem as proteínas de BMP, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, e BMP-7, descritas, por exemplo, nas patentes norte americanas Nos. 5 108 922, 5 013 649, 5 116 738, 5 106 748, 5 187 076, e 5 141 905, BMP-8, divulgado no documento PCT WO 91/18098, BMP-9, divulgado no documento PCT WO 93/00432, BMP-10, divulgado no documento PCT WO 94/26893, BMP-11, divulgado no documento PCT WO 94/26892, BMP-12 e BMP-13, divulgados no documento PCT WO 95/16035, BMP-15, divulgado , na patente norte americana

No. 5 635 372, e BMP-16, divulgado na patente norte americana No. 6 331 612. Outras proteínas de TGF-β que podem ser úteis como o agente activo na presente invenção incluem Vgr 2, Jones et al., Mol. Endocrinol., volume 6, páginas 1961 1968 (1992), e qualquer um dos factores de diferenciação de crescimento (GDFs) incluindo os descritos nos documentos PCT WO 94/15965, WO 94/15949, WO 95/01801, 12 WO 95/01802, WO 94/21681, WO 94/15966, WO 95/10539, WO 96/01845, WO 96/02559 e outros. Também útil na presente invenção pode ser o BIP, divulgado em WO 94/01557, HP00269, divulgado em JP 7 250688, e MP52, divulgado em PCT WO 93/16099. As divulgações de todas as patentes acima, publicações de diários e aplicações internacionais publicadas são aqui incorporadas por referência.

De um modo preferido, o agente activo inclui pelo menos uma proteína seleccionada a partir da subclasse de proteínas conhecidas geralmente como BMPs, as quais têm sido divulgadas como tendo activídade osteogénica, e outras actividades de tipo de diferenciação e de crescimento. Um subconjunto de BMPs os quais são actualmente preferidos para utilização na presente invenção incluem BMP-2, BMP-4, BMP-.5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, e BMP-13, de um modo o mais preferido o BMP-2, a sequência do qual é divulgada na patente norte americana No. 5 013 649, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. O agente activo pode ser produzido de forma recombinante ou purificado a partir de uma composição de proteína. O agente activo, se um TGF-β tal como um BMP, ou outra proteína dimérica, pode ser homodimérico ou pode ser heterodimérico com outros BMPs (por exemplo um heterodímero composto de um monómero cada um de BMP-2 e BMP-6) ou com outros membros da super família de TGF-β, tais como as activinas, inibinas e TGF-βΙ (por exemplo um heterodímero composto de um monómero cada um de um BMP e um membro da super família de TGF-β relacionado. Os exemplos de tais proteínas heterodiméricas são descritos, por exemplo, no documento PCT WO 93/09229, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. O agente activo pode compreender o ADN que codifica para os BMPs e as células transduzidas ou transfectadas com genes que codificam as 13 proteínas de BMP. 0 agente activo pode compreender adicionalmente agentes adicionais tais como proteínas de Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus e Follistatin. Estas famílias de proteínas estão geralmente descritas em Sasai et al., Cell, volume 79, páginas 779-790 (1994) (Chordin); PCT WO 94/05800 (Noggin); e Fukui et al., Dev. Biol., volume 159, páginas 131-139 (1993) (Follistatin). As proteínas de Hedgehog estão descritas nos documentos PCT WO 96/16668, WO 96/17924, e WO 95/18856. A família de Frazzled de proteínas é uma família relativamente recentemente descoberta de proteínas com elevada homologia para o domínio da ligação extracelular da família da proteína de receptor conhecida como Frizzled. A família de Frizzled de genes e proteínas é descrita em Wang et al., J. Biol. Chem., volume 271, páginas 4468-4476 (1996). O agente activo também pode incluir outros receptores solúveis, tais como os receptores solúveis truncados descritos no documento PCT WO 95/07982. Do ensinamento do documento WO 95/07982, um especialista na técnica reconhecerá que os receptores solúveis truncados podem ser preparados para numerosas outras proteínas de receptor. Tal também seria incluído dentro da presente invenção. As publicações acima são por meio disto aqui incorporadas por referência. A quantidade de agente activo útil aqui é que a quantidade eficiente para estimular a actividade osteogénica aumentada do progenitor presente ou de infiltração (células precursoras de osteoblasto) ou de outras células (a partir daqui "quantidade eficiente") e vai depender do tamanho e da natureza do defeito a ser tratado, assim como a composição do portador de fosfato de cálcio a ser empregue. Geralmente, a quantidade de proteína 14 osteogénica presente numa composição osteogénica em forma de barra sólida da presente invenção varia de cerca de 1 % a cerca de 90 %, de um modo mais preferido de cerca de 15 % a cerca de 40 %, em peso da composição osteogénica. Geralmente, a quantia de presente de proteína osteogénica.

PORTADOR

De acordo com todas as formas de realização da presente invenção, um material de fosfato de cálcio é empregue como um portador. Como aqui usado, um "material de fosfato de cálcio" significa qualquer material substituto de osso sintético que compreende fosfato de cálcio como o componente primário, isto é, que tem pelo menos 90 % em peso atribuível ao cálcio e/ou ao fosfato. O material de fosfato de cálcio da presente invenção pode ser qualquer material de fosfato de cálcio biocompatível, conhecido na técnica. Os materiais de fosfato de cálcio convenientes podem ser produzidos por qualquer um de uma variedade de métodos e usando quaisquer componentes de partida convenientes ou podem estar comercialmente disponíveis.

Em certas formas de realização preferidas da presente invenção, o material de fosfato de cálcio está presente numa quantidade que varia de cerca de 10 % a cerca de 99%, de um modo mais preferido de cerca de 40 % a cerca de 60 %, em peso da composição osteogénica em forma de barra sólida da presente invenção. De um modo preferido, o material de fosfato de cálcio ou portador é usado em forma seca, isto é, em pó.

As formas de fosfato de cálcio convenientes para utilização nesta invenção incluem, sem limitação, fosfato de cálcio apatítico amorfo (ACP), fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino (PCA), 15 hidroxiapatite (HA), fosfato de tricálcio e fluorapatite. Numa forma de realização preferida, o material de fosfato de cálcio é um sólido de fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino que tem uma relação de cálcio a fosfato (Ca/P) comparável a minerais de osso que ocorrem naturalmente, de um modo mais preferido a uma relação de cálcio a fosfato menor do que cerca 1:1,5, de um modo o mais preferido de 1:1,4.

Os materiais de PCA convenientes podem ser identificados por se combinarem precursores de PCA, hidratação com uma quantidade limitada de água (de modo a que uma pasta ou betume seja formado), moldagem numa forma de barra cilíndrica, e deixar o material moldado a endurecer num material de PCA. Os precursores desejáveis são capazes de endurecimento num ambiente húmido, na ou ao redor da temperatura do corpo em menos de 5 horas e de um modo preferido num prazo de 10-30 minutos.

De acordo com a presente invenção, o portador de fosfato de cálcio pode compreender qualquer material substituto de osso o qual contém uma das formas acima de fosfato de cálcio como o seu componente primário, isto é que tem pelo menos 90 % em peso atribuível a cálcio e/ou fosfato. 0 material substituto de osso pode compreender unicamente uma das formas acima de fosfato de cálcio, com ou sem componentes adicionais; o substituto de osso pode compreender uma combinação das formas acima de fosfato de cálcio, com ou sem componentes adicionais. Além do mais, uma ou mais das formas acima mencionadas de fosfato de cálcio pode ser usada para preparar um material de fosfato de cálcio conveniente para utilização na presente invenção. Os métodos de fazer tais materiais são bem conhecidos na técnica. No entanto, qualquer método o qual resulta na obtenção de um material de fosfato de cálcio seco, isto é, em 16 pó, é apropriado.

Como aqui utilizado, "amorfo" significa um material com carácter amorfo significativo. 0 carácter amorfo significativo contempla um conteúdo amorfo maior do que 75 %, de um modo preferido um conteúdo amorfo maior do que 90 %, e é caracterizado por um padrão de refracção de Raio X sem sinais distintivos amplo.. "Fosfato de cálcio apatitico pobremente cristalino" "fosfato de cálcio de PCA" e "material de PCA," como esses termos são aqui usados, descrevem um fosfato de cálcio apatitico pobremente cristalino sintético. 0 material apatitico (PCA) pobremente cristalino não é necessariamente restringido a uma única fase de fosfato de cálcio uma vez que tem a caracteristica de difracção de Raios X (XRD) e o padrão (FTIR) infravermelho de transformação de fourier. Um fosfato de cálcio de PCA tem substancialmente o mesmo espectro de XRD como osso. O espectro de XRD é geralmente caracterizado só por dois picos amplos na região de 20-35E com um centrado em 2 6E e o outro centrado em 32E. O espectro de FTIR é caracterizado por picos a 563 cm"1, 1034 cm"1, 1638 cm’1 e 3432 cm’1, (± 2 cm’1) ; os ombros agudos são observados a 603 cm’1 e 875 cm’1, com um dipolo que tem o máximo a 1422 cm’1 e 1457 cm’1. Os materiais de PCA preferidos para utilização na presente invenção estão descritos nas patentes norte americanas Nos. 5 650 176, 5 683 461 e 6 214 368, cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Os materiais convenientes também são descritos num conjunto de aplicações relacionadas, intituladas "Delivery Vehicle" "Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Form a Novel Bioceramic, ""Orthopedic and Dental Ceramic Implants," e "Bioactive Ceramic Composites," cada uma das quais foi depositada no dia 16 de Outubro de 1997 e designada à Corporação de ETEX (Cambridge, MA) e é aqui 17 incorporada por referência. À luz da amplitude da divulgação em cada um destes documentos de patente acima notados, os detalhes da produção de materiais de PCA convenientes não serão aqui detalhados. Um resumo de caracteristicas de PCA será suficiente. 0 material de PCA é caracterizado pela sua capacidade de bioreabsorção e pela sua cristalinidade mínima. 0 seu carácter cristalino é substancialmente o mesmo como o osso natural. 0 material de PCA também é biocompatível e não prejudicial ao hospedeiro. A hidroxiapatite cristalina (HA) é descrita, por exemplo, nas Patentes Re. norte americanas Nos. 33 221 e 33 161, ambas as quais são aqui incorporadas por referência. Estas patentes ensinam a preparação de composições de remineralização de fosfato de cálcio e de um portador de hidroxiapatite de reabsorção gradual, não cerâmico, finamente cristalino, baseado na mesma composição de fosfato de cálcio. Um sistema de fosfato de cálcio semelhante, o qual consiste de fosfato de tetracálcio (TTCP) e fosfato de monocálcio (MCP) ou a sua forma de mono-hidrato (MCPM), é descrito nas patentes norte americanas Nos. 5 053 212 e 5 129 905, ambas as quais são aqui incorporados por referência. Os materiais de HA cristalinos adicionais (usualmente referidos como dalite) são descritos na patente norte americana No.. 5 962 028, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

ADITIVOS

Os aditivos podem ser úteis nas composições osteogénicas da presente invenção. Muitos de tais ligantes, os quais aumentam a coesão, e excipientes, os quais estabilizam e/ou modulam a libertação de ingredientes activos, são bem conhecidos na técnica 18 de formulação. Os aditivos convenientes incluem, sem limitação, sais farmaceuticamente aceitáveis, polissacáridos, péptidos, proteínas, amino ácidos, polímeros sintéticos, polímeros naturais, e/ou agentes tensioactivos. Os polímeros úteis incluem, por exemplo, os descritos na patente norte americana No. 5 171 579; a divulgação completa da qual é aqui incorporada por referência. Os aditivos preferidos incluem materiais celulósicos tais como carboximetilcelulose (CMC), hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), e metilcelulose (MC), polímeros sintéticos tais como poliláctidos e polietileno glicóis, por exemplo, poliláctido/polietileno glicol, polivinilpirrolidona (PVP), polietileno glicol (PEG), óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo e álcool de polivinilo (PVA), e sulfato de dextrano e as suas combinações. Outros aditivos úteis incluem, sem limitação, alginato de sódio, chitosano, colagénio, gelatina, hialuronano, e vários péptidos, proteínas, e amino ácidos. Os aditivos que têm um efeito efervescente não são presentemente pretendidos para utilização na presente invenção.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, é empregue um aditivo numa forma seca ou em pó, o qual é misturado com o agente (s) activo, portador e líquido aquoso com a finalidade de preparar a composição injectável da presente invenção. Em certas formas de realização preferidas da presente invenção, o aditivo(s) está presente numa quantidade que varia de cerca de 1 % a cerca de 90 %, de um modo mais preferido de cerca de 20 % a cerca de 40 %, em peso da composição osteogénica de barra sólida.

AGENTES ACTIVOS ADICIONAIS

As composições osteogénicas injectáveis da presente invenção também podem incluir um agente activo adicional ou agentes activos 19 adicionais. Tais agentes activos adicionais podem ser misturados, de um modo preferido em forma seca embora as formas hidratadas sejam também convenientes para utilização, com o agente activo, o portador e o liquido aquoso com a finalidade de preparar as composições osteogénicas injectáveis da presente invenção. Alternativamente, tais agentes activos adicionais podem ser co-administrados com as composições osteogénicas da presente invenção, quer em alguma maneira subsequente ou simultaneamente (a partir daqui "esquema de co-administração") . Os agentes activos adicionais podem ser empregues aqui com a finalidade de alcançar efeitos desejados adicionais ou, em alguns casos, podem ser empregues para opor efeitos indesejáveis potenciais, tal como infecção, inflamação e reabsorção transitória.

Por exemplo, embora muito seja conhecido sobre o potencial osteogénico de proteínas TGF-β, relatórios recentes mostram que a administração local de certos agentes osteo-inductores, tais como o BMP-2, estimulam a actividade osteoclástica transitória (áreas locais de reabsorção de osso) no local de administração. Esta reacção, a qual ocasionalmente precede a nova formação de osso induzida pelo BMP, foi denominada "fenómeno de reabsorção transitório". Os agentes conhecidos para a inibição da reabsorção de osso podem, por conseguinte, ter um papel importante no atraso ou na redução da reabsorção de osso inicial associada com a administração de BMP local, sem a subsequente inibição da formação de osso.

Assim, em formas de realização preferidas da presente invenção, um inibidor de reabsorção de osso é empregue como um agente activo adicional presente na composição osteogénica injectável ou é co-administrado com a composição osteogénica injectável com a 20 finalidade de prevenir ou minimizar a reabsorção de osso inicial associada com a libertação intraóssea de um agente activo tal como o BMP. Como aqui utilizado, o termo "inibição da reabsorção de osso" refere-se à prevenção de perda de osso, especialmente a inibição da remoção de osso existente através de alteração directa ou indirecta da formação ou actividade de osteoclasto. Assim, o termo "inibidor de reabsorção de osso" como aqui utilizado refere-se a agentes que previnem ou inibem a perda de osso através da alteração directa ou indirecta da formação de ou actividade osteoclasto.

Em certas formas,de realização preferidas, o inibidor de reabsorção de osso é um bifosfonato. Como aqui utilizado, o termo "bifosfonato" refere-se aos ácidos e sais bisfosfónicos relacionados, e a várias formas amorfas cristalinas de bifosfonato. Clinicamente, a terapia de bifosfonato tem sido mostrada como reduzindo dramaticamente os índices de renovação de osso, a densidade mineral do aumento de osso, e, em mulheres osteopénicas, a redução do risco de fractura do quadril e da espinha (ver, por exemplo, H. Fleisch, Bisphosphonates in Bone Disease, do Laboratory to the Patient, 3a edição, Parthenon Publishing (1997), o qual é aqui incorporado por referência).

Os bifosfonato s convenientes para utilização na presente invenção incluem, sem limitação, o alendronato, cimadronato, clodronato, EB 1053, etidronatos, ibandronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, risedronato, tiludronato, YH 529, zoledronato, e is seus sais, ésteres, ácidos, e misturas farmaceuticamente aceitáveis. A quantidade de bifosfonato, e de facto a quantidade de qualquer inibidor de reabsorção de osso, útil é a quantidade eficiente para prevenir ou inibir a perda de osso transitória 21 ocasionalmente associada com a administração local de uma proteína osteogénica tal como o BMP (a partir daqui "quantidade eficiente"), pela alteração directa ou indirecta da formação ou actividade de osteoclasto. A dosagem precisa necessária vai depender sobre o tamanho e a natureza do defeito da osso a ser tratado, assim como a quantidade de agente osteogénico a ser libertado. Geralmente, a quantidade de bifosfonato a ser libertada está de um modo preferido num intervalo de cerca de 0,1 a cerca de 3000 mg, de um modo mais preferido de cerca de 10 a cerca de 1000 mg, e de um modo o mais preferido de cerca de 10 a cerca de 500 mg por centímetro cúbico de material.

Quando o esquema de co-administração da presente invenção é empregue, o inibidor de reabsorção de osso é tipicamente libertado num portador conveniente. 0 portador pode ser qualquer portador farmaceuticamente aceitável, uma larga variedade dos quais são bem conhecidos e rapidamente disponíveis na técnica (ver, por exemplo, Martin, E.W., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., (edição actual), os quais são aqui incorporados por referência). Os portadores actualmente preferidos são formados em barras ou pastas sólidas, como descrito aqui em outra parte.

No esquema de co-administração, o inibidor de reabsorção de osso pode ser administrado subsequentemente, quer antes ou depois, ou simultaneamente com as composições de barra sólida injectáveis ou da presente invenção. Além do mais, o inibidor de reabsorção de osso pode ser aplicado localmente (intraósseo), mas pode ser aplicado a outros locais parentéricos tais como intramuscularmente ou subcutaneamente ou enjeridos oralmente ou intravenosamente injectados para libertação sistémica. De um modo preferido o inibidor de reabsorção de osso, por exemplo um bisfosfonato, é 22 libertado sistemicamente, isto é, oralmente ou intravenosamente, quer antes ou simultaneamente com a composição de barra sólida injectável da presente invenção. Adicionalmente, o inibidor de reabsorção de osso pode ser implantado no local a ser tratado por implantação cirúrgica. Deve ser notado, no entanto, que apesar do seu beneficio terapêutico, os bisfosfonatos são pobremente absorvidos no tracto gastrointestinal quando tomados oralmente. Para superar este caso de pobre biodisponibilidade, a administração intravenosa tem sido usada; no entanto, esta modalidade é vista como dispendiosa e inconveniente devido à duração e à frequência da dosagem. A presente invenção, por conseguinte, pode superar esta deficiência através da incorporação do bisfosfonato dentro das composições osteogénicas injectáveis da presente invenção e da sua libertação localmente directamente ao local de acção desejada. A descrição acima relacionada à administração de um inibidor de reabsorção de osso refere-se geralmente à administração de qualquer agente activo adicional. Outros agentes activos, adicionais convenientes incluem, sem limitação, outras proteínas osteogénicas, antibióticos, agentes anti-inflamatórios, factores de crescimento, péptidos, proteínas, citoquinas, oligonucleótidos, oligonucleótidos de anti-sentido, ADN e polímeros. Estes compostos podem ser adicionados, de um modo preferido em forma seca, por se misturá-los para formar a pasta nos métodos de preparação da presente invenção.

ADMINISTRAÇÃO

De acordo com a presente invenção, os métodos e as composições são fornecidos para o tratamento de pacientes que apresentam defeitos ósseos. Como aqui utilizado, "defeitos ósseos" inclui o osso osteoporótico, o osso osteopénico, a fractura de osso, o defeito de 23 cartilagem, e qualquer outra condição relacionada com o osso ou a cartilagem a qual seria melhorada ou corrigida com crescimento estimulado de osso ou de cartilagem. Por conseguinte, uma quinta forma de realização da presente invenção é dirigida a uma utilização de uma proteína osteogénica para a preparação de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas de acordo com a quinta forma de realização descrita acima, em que a composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas é para tratar um mamífero que tem um defeito de osso e em que a composição para libertação injectável de proteínas osteogénicas é para ser administrada ao local do defeito do osso.

Uma sexta forma de realização relacionada da presente invenção é dirigida a uma utilização de uma proteína osteogénica para a preparação de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas de acordo com a quinta forma de realização descrita acima, em que a composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas é para tratar um mamífero que tem um defeito de osso e em que o tratamento compreende os passos de: (a) a administração ao local do defeito do osso de uma quantidade eficaz da composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas; e (b) a administração ao local do defeito do osso de uma quantidade eficaz de um inibidor de reabsorção de osso. 0 inibidor de reabsorção de osso também pode ser administrado ao local do defeito de osso, mas pode ser administrado por qualquer outra via, isto é, parentérica, implantação cirúrgica, oral ou intravenosa. Além do mais, a administração do inibidor de reabsorção de osso pode ocorrer antes de, simultaneamente com ou depois da administração da composição de barra injectável da 24 presente invenção.

Mais usualmente, os métodos e as composições da presente invenção são fornecidos para o tratamento de pacientes que apresentam sinais de condições de osteoporose ou osteopénicas, incluindo as lesões do osso osteoporótico. A identificação de tais pacientes pode ser realizada por procedimentos os quais são bem conhecidos na técnica. Tais procedimentos fornecem o clinico com informação sobre o local e a gravidade das lesões do osso osteoporótico ou osteopénico. Além de localizar a lesão (lesões) a serem tratadas, o clínico pode usar esta informação para seleccionar o modo apropriado de administração e a dose de agente osteo-inductor para o paciente. Os procedimentos de diagnóstico úteis incluem a medição da massa/densidade de osso usando a dupla energia de absortiometria de raio X (DEXA), Kilgus, et al., J. Bone & Joint Surgery, volume 75 B, páginas 279-287 (1992) ; Markel, et al., Acta Orthop. Scand., volume 61, páginas 487 498 (1990); e a tomografia computorizada quantitativa (QCT), Lavai Jeantet, et al., J. Comput. Assist. Tomogr., volume 17, pp. 915-921 (1993) ; Markel, Calcif. Tissue Int., vol. 49, páginas 427-432 (1991); absortiometria de fotão singular, Markel, et al. Calcif. Tissue Int., volume 48, páginas 392-399 (1991); velocidade de transmissão de ultra-som (UTV); Heaney, et al., JAMA, volume 261, páginas 2986-2990 (1989); Langton, et al., Clin. Phys. Physiol. Meas., volume 11, páginas 243-249 (1990); e avaliação radiográfica, Gluer, et al., J. Bone Min. Res., volume 9, páginas 671-677 (1994). Outros métodos de identificação de pacientes em risco de fractura de osso incluem a avaliação dos factores relacionados com a idade, tal como o conhecimento, assim como a ocorrência prévia de fracturas relacionadas com a osteoporose. Porter, et al., BMJ, volume 301, páginas 638-641 (1990); Hui, et al., J. Clin. Invest., volume 81, páginas 1804-1809 (1988). As publicações acima são por 25 esse meio aqui incorporados por referência.

Os regímenes de dosagem particulares serão determinados por indicação clínica sendo endereçados, assim como por várias variáveis de pacientes (por exemplo, o peso, a idade, o sexo) e a apresentação clínica (por exemplo por extensão da ferida, local de ferida, etc.) .

As composições osteogénicas injectáveis da presente invenção podem ser administradas de qualquer maneira clínica aceitável de injecção. Um número de seringas comercialmente disponíveis podem ser apropriadas para utilização na presente invenção, e para a administração das composições da presente invenção. Tais seringas incluem, sem limitação, a seringa de Calasept® (JS Dental Manufacturing, Ridgefield CT) ; a seringa de aspiração de Henke-Ject® e as seringas/agulhas dentais Hypo® (Smith & Nephew MPL, Franklin Park, IL); agulhas intraósseas de MPL, Inc., Chicago IL; e seringas de Luer-Lok® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Toda a seringa capaz de manter e libertar uma barra injectável e/ou de permitir a extrusão com um obturador é apropriada para utilização.

Numa forma de realização da invenção, as composições em forma de barra sólida são libertadas intraosseamente usando um tamanho e um tipo apropriado de agulha hipodérmica percutaneamente ou cirurgicamente pré-colocada na localização anatómica seleccionada. A colocação percutânea da agulha hipodérmica pode ser realizada usando a apalpação manual de marcos anatómicos conhecidos, com ou sem a utilização de fluoroscopia para visualizar a colocação. A fluoroscopia também pode ser usada em conjunto com a implantação cirúrgica antes e/ou simultaneamente com a colocação da agulha hipodérmica. 26

Numa forma de realização preferida, uma linha guia (geralmente referida como uma "linha k") é primeiramente introduzida percutaneamente na localização anatómica desejada para servir como uma guia para a agulha hipodérmica. A agulha hipodérmica é introduzida sobre a linha guia, a qual é subsequentemente removida deixando somente a agulha hipodérmica no lugar. A composição em forma de barra sólida é depois inserida na extremidade do furo da agulha hipodérmica. Depois do carregamento da composição, uma segunda linha guia é introduzida na agulha, a qual é usada para avançar a composição sólida para a ponta da agulha. A agulha é depois removida deixando a linha guia a ancorar a composição dentro do osso na localização desejada. Finalmente, a linha guia é removida deixando a composição sólida no lugar. Numa outra forma de realização, a composição em forma de barra sólida da invenção é pré-colocada dentro do cano da agulha. Após a colocação no local anatómico desejado, o percutor da seringa é avançado no cano da agulha enquanto o dispositivo é retirado, deixando a composição em forma de barra sólida na posição desejada.

As composições do assunto da invenção permitem que quantidades terapeuticamente eficazes de proteína osteogénica sejam libertadas a um local de ferimento em que a formação de cartilagem e/ou de osso seja desejada. As formulações podem ser usadas como um substituto para o enxerto de osso autólogo em fracturas recentes e de não união, em fusões espinais, e na reparação do defeito do osso no campo ortopédico, em reconstruções crânio/maxilofaciais, em osteomielites para a regeneração do osso, e no campo dental para o aumento do cume alveolar e dos defeitos peridentais e para a extracção de dentes bocais.

Os exemplos seguintes são ilustrativos da presente invenção e não 27 estão a limitá-la de nenhuma maneira. As modificações, as variações e os realces menores são contemplados e estão dentro do âmbito da presente invenção.

EXEMPLOS

Todos os materiais utilizados nestes exemplos são da classe farmacêutica. 0 material de fosfato de cálcio foi o material substituto do osso comercialmente disponível (a partir daqui "a- BSM") comercializado sob a marca registada CEREDEX® pela firma Etex Corporation, 38 Sydney Street, Cambridge, MA 02139 e descrito em detalhe nas patentes norte americanas Nos. 5 683 461, 6 117 456 e 6 214 368 e no documento PCT WO 98/16209. A proteína osteogénica utilizada como um agente activo foi a proteína-2 morfogenética de osso humano recombinante (rhBMP-2). A produção e a caracterização de rhBMP-2 é bem conhecida. Wang, et al.r Proc. Nat'l Acad. Sei. U.S.A., volume 87, páginas 2220-2224 (1990).

Exemplo 1 - Formulação Várias barras injectáveis sólidas (A-E) de α-BSM, rhBMP-2, e uma de carboximetilcelulose (CMC), polivinilpirrolidona (PVP) e sulfato de dextrano foram preparados. Os pós secos de cada componente foram combinados num bulbo de mistura estéril e reconstituídos numa pasta densa através da adição de um tampão aquoso baseado em glicina que tem um pH de cerca de 4 5 e que compreende 5 mmol de ácido L-glutâmico, 2,5 % de glicina, 0,5 % de sacarose, 5 mmol de NaCl e 0,01 % de polissorbato 80 a uma relação (UP) especificada de líquido (mL) a pó (g) e amassados durante 1 minuto para formar uma pasta. As quantidades de cada ingrediente, assim como as relações de L/P particulares empregues, foram como determinadas na tabela 1 28 a seguir.

Tabela 1 ROD A-BSM (% em peso) RhBMP-2 (% em peso) Proporção de L/P CMC (% em peso) A 68 17 15 1,0 B 56 29 15 1,2 C 45 40 15 1,5 PVP (% em peso) D 45 40 15 0, 6 SULFATO DE DEXTRANO (% em peso) E 45 15 0, 6

Cada pasta foi carregada numa seringa e extrudida para formar barras cilíndricas que têm um diâmetro de cerca de 1 mm e um comprimento de cerca de 5 cm. Estas barras de 5 cm foram depois cortadas em comprimentos desejados para testar a seguir.

Depois do molde, as barras foram endurecidas numa massa sólida em condições in vivo simuladas, isto é, incubadas a 37 °, durante a noite. 0 processo de endurecimento podia ser atrasado por diversas horas por se armazenarem as barras a uma temperatura mais fresca, isto é, a cerca de 4 °C. A dose de rhBMP-2 teórico de cada uma das barras de A-E foi de 150 microgramas de rhBMP-2 por miligrama de barra. Todas as barras apareceram como sendo lisas, densas, coesivas e não quebradiças e foram injectáveis através de uma agulha de medida 16.

Exemplo 2 - Caracterização In Vitro 29

Uma correlação foi observada entre o conteúdo do aditivo e a formação de partícula. Depois da submersão no tampão aquoso baseado em glicina descrito no Exemplo 1 durante 14 dias, as barras que contêm uma % de aditivo mais elevada (40 % de CMC, 40 % de PVP, ou 40 % de sulfato de dextrano, isto é, barras de C-E, respectivamente) dispersaram em partículas menores mais rapidamente, isto é, no prazo de 1 dia, do que as com conteúdos de aditivo médios (29 % de CMC, isto é, a barra B) e baixos (17 % de CMC baixo, isto é, a barra A) . As barras que contêm conteúdos de aditivo baixos (17 % de CMC, isto é, a barra A) mantiveram a sua estrutura semelhante a barra muito mais tempo, isto é, na ordem de dias a semanas, do que as suas contra-partes de CMC mais elevadas.

Além do mais, a cinética de libertação in vitro de rhBMP-2 de barras de α-BSM que contêm quer 17 % (barra A), 29 % (barra B), ou 40 % (barra C) de CMC foi executada por se utilizar 1251-rhBMP-2 como um marcador. Semelhante às observações incluídas, as barras que continham uma % de CMC mais elevada libertaram rhBMP-2 mais rápido do que as com uma % de CMC mais baixa como se mostra na Figura 1.

Exemplo 3 - Biocompatibilidade no Rato e Estudos de Eficácia

As composições à base de fosfato de cálcio em forma de barra injectáveis (preparadas como descrito no Exemplo 1) foram avaliadas para a biocompatibilidade e eficácia, tanto intraosseamente como ectopicamente, num modelo de rato.

Os defeitos do núcleo intraósseo foram cirurgicamente estabelecidos nos fémures distais de seis ratos CD machos. Os ratos foram divididos em dois grupos (A e B) de três. Um membro de cada rato 30 recebeu uma barra de teste de 2 mm de segmento (fosfato de cálcio/rhBMP-2/excipiente), enquanto o membro contralateral recebeu uma barra de controlo de 2 de mm segmento (fosfato de cálcio/excipiente). Os ratos do Grupo A receberam a barra A (% de 68/17/15 (p/p) de ACP/CMC/rhBMP-2) do Exemplo 1 como a barra de teste, enquanto os ratos do Grupo B receberam a barra B (% de 56/29/15 (p/p) de ACP/CMC/rhBMP-2) do Exemplo 1 como a barra de teste. Além do mais, uma barra de 10 mm foi implantada subcutaneamente lateral à linha média da região do tórax ventral, com um lado a receber uma barra de teste e o outro lado a receber uma barra de controlo. Aqui mais uma vez, os ratos do Grupo A receberam a barra A (% de 68/17/15 (p/p) de ACP/CMC/rhBMP-2) do Exemplo 1 como a barra de teste, enquanto os ratos do Grupo B receberam a barra B (% de 56/29/15 (p/p) de ACP/CMC/rhBMP-2) do Exemplo 1 como a barra de teste.

Os animais foram sacrificados em 2 semanas para as avaliações de resultados que consistem em radiografias de faxitrão e histomorfometria. As radiografias e a histologia dos explantes do fémur distai com 2 semanas indicaram uma formação de calo de osso total aumentada no lado tratado com rhBMP-2 comparado com o placebo. Em particular, as barras (B) que continham CMC mais elevado formaram calos de osso médios a grandes comparados com as barras (A) que continham CMC mais baixo as quais formaram calos de tamanho pequeno a médio. As radiografias e a histologia dos implantes subcutâneos também indicaram a formação de osso no lado tratado com rhBMP-2 comparado com o placebo. Em particular, as barras (B) que contêm o CMC mais elevado formaram uma resposta de osso ectópico mais robusta comparada com as barras (A) que contêm o CMC mais baixo. A boa biocompatibilidade foi observada em todos os grupos com nenhuma resposta inflamatória ao implante. 31

Exemplo 4 - Estudo da Biodistribuição Local Intraóssea do Coelho

As A-D do Exemplo 1 foram injectadas percutaneamente em espaços intraósseos do fémur distai do coelho (n = a 4 locais por grupo) usando uma sonda de medida 14 com uma agulha de medida 16) . Em particular, as barras A-D de 10 mm que contêm aproximadamente 1251-rhBMP-2 de pCi foram empregues.A quantidade de radioactividade nas barras sintéticas foi medida antes da injecção usando um calibrador de dose Capintec. A retenção de RhBMP-2 local foi controlada mais de 4 semanas usando cintigrafia de gama. Os dados de biodistribuição in vivo local sugeriram uma libertação sustentada de rhBMP-2 das barras e que as barras que contêm uma % mais elevada de aditivo apresentaram uma libertação in vivo mais rápida do que as suas contra-partes de aditivo de %mais baixa como se mostra na Figura 2.

Exemplo 5 - Formulação (Exemplo de Referência)

As pastas endurecíveis que contêm quer 1 mg de rhBMP-2 por mL de pasta ou 4,5 mg de rhBMP-2 por mL de pasta foram formuladas por se adicionarem 2 mL de soluções apropriadamente concentradas de rhBMP-2 no tampão aquoso à base de glicina do Exemplo 1 a 2,5 g de α-BSM. As misturas foram amassadas em bulbos estéreis durante 1 minuto para formar a pasta endurecivel.

Exemplo 6 - Macaco Cinomólogo - Injecção Intraóssea de Pasta O 1 mg por mL e 4,5 mg por mL de pastas endurecíveis do Exemplo 5 foram extraídos dos bulbos estéreis usando uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha de medida 18 e depois injectados sob controlo fluoroscópico em vários locais intraósseos de macacos 32 cinomólogos. Os locais incluíram o fémur distai, o fémur proximal, o raio de distai, a tíbia proximal. Depois de 1 mês, novo osso significativo foi observado nos locais de localização em que o rhBMP-2 foi injectado.

Enquanto a invenção foi descrita em termos de formas de realização preferidas e de exemplos específicos, os especialistas na técnica vão reconhecer por experimentação de rotina que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem se partir do espírito e do âmbito da invenção. Assim, a invenção deve ser entendida como não sendo limitada pela descrição detalhada precedente, mas como sendo definida pelas reivindicações anexas e pelos seus equivalentes.

Lisboa, 15 de Maio de 2007

Claims (35)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas que compreende: uma proteína osteogénica; e um material de fosfato de cálcio, em que a referida composição está na forma de uma barra sólida.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína osteogénica é seleccionada a partir do grupo que consiste de membros da família da proteína morfogenética do osso (BMP).

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína osteogénica é seleccionada a partir do grupo que consiste de BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12, BMP-13, e MP52.

4.

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína osteogénica é o BMP-2. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a.proteína osteogénica é o BMP-12.

6. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína osteogénica é o BMP-13.

7. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína osteogénica é o BMP-52. 2

8. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que a proteína osteogénica está presente numa quantidade que varia de cerca de 1 % a cerca de 90 % em peso da composição.

9. A composição de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína osteogénica está presente numa quantidade que varia de cerca de 15 % a cerca de 40 % em peso da composição.

10. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, que compreende adicionalmente um inibidor de reabsorção de osso.

11. A composição de acordo com a reivindicação 10, em que o inibidor de reabsorção de osso é um bisfosfonato.

12. A composição de acordo com a reivindicação 11, em que o bisfosfonato é seleccionado a partir do grupo que consiste de alendronato, cimadronato, clodronato, EB 1053, etidronatos, ibandronato, neridronato, olpadronato, pamidronato, risedronato, tiludronato, YH 529, zoledronato, e dos seus sais, ésteres, ácidos e misturas farmaceuticamente aceitáveis.

13. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o material de fosfato de cálcio compreende um material seleccionado a partir do grupo que consiste de fosfato de cálcio apatítico amorfo, fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino, hidroxiapatite, fosfato de tricálcio, fluorapatite e das suas combinações.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o material 3 de fosfato de cálcio compreende o fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino.

15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que o fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino tem uma proporção de cálcio para fosfato de menos de 1:1,5.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que o fosfato de cálcio apatítico pobremente cristalino tem uma proporção de cálcio para fosfato de menos de 1:1,4.

17. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o material de fosfato de cálcio está presente numa quantidade que varia de cerca de 10 % a cerca de 99 % em peso da composição.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17, em que o material de fosfato de cálcio está presente numa quantidade que varia de cerca de 40 % a cerca de 60 % em peso da composição.

19. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes que compreende adicionalmente um aditivo seleccionado a partir do grupo que consiste de sais farmaceuticamente aceitáveis, polissacáridos, péptidos, proteínas, amino ácidos, polímeros sintéticos, polímeros naturais, agentes tensioactivos, e as suas combinações.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que o aditivo é seleccionado a partir do grupo que consiste de carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metil-celulose, poliláctido, polietileno glicol, 4 polivinilpirrolidona, óxido de polioxietileno, polímero de carboxivinilo, álcool de polivinilo, sulfato de dextrano e as suas combinações.

21. Composição de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que o aditivo está presente numa quantidade que varia de cerca de 1 % a cerca de 90 % em peso da composição.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21, em que o aditivo está presente numa quantidade que varia de cerca de 20 % a cerca de 40 % em peso da composição.

23. Composição de acordo com qualquer das reivindicações precedentes em que a referida barra é cilíndrica e um diâmetro da referida barra cilíndrica está entre cerca de 0,1 mm e 3,0 mm.

.24. Composição de acordo com a reivindicação 1 a 22, em que o comprimento da referida barra está entre cerca de 1,0 mm e 5,0 cm.

25. Método para preparar uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 24, em que o método compreende os passos de: (a) misturar uma forma seca da proteína osteogénica com uma forma seca do material de fosfato de cálcio para produzir uma mistura seca; (b) reconstituir a mistUra seca por se adicionar um tampão aquoso para formar uma pasta; (c) moldar a pasta para formar uma composição em forma de 5 barra; e (d) secar a composição em forma de barra do passo (c) para formar uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o tampão aquoso é seleccionado a partir do grupo que consiste de salina tamponada de fosfato, salina, tampões baseados em glicina e as suas combinações.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, em que a proporção de tampão aquoso para a mistura seca, varia de cerca de 0,5:1 a cerca de 2:1.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, em que a moldagem é realizada por se utilizar um método seleccionado a partir do grupo que consiste de moldagem, extrusão, pressão, perfuração e das suas combinações.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, que compreende adicionalmente o passo de cortar a composição em forma de barra antes ou depois do passo (d).

30. Utilização de uma proteína osteogénica para a preparação de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas como definido em qualquer das reivindicações 1 a 24, em que a composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas é para o tratamento de um mamífero que tem um defeito de osso e em que a composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas é para ser administrada ao local do defeito do osso. 6

31. Utilização de acordo com a reivindicação 30, em que o defeito do osso é o osso osteoporótico.

32. Utilização de uma proteína osteogénica para a preparação de uma composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas como definido em qualquer das reivindicações 1 a 24, em que a composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas é para o tratamento de um mamífero que tem um defeito de osso e em que o tratamento compreende os passos de: (a) administrar ao local do defeito de osso uma quantidade eficaz da composição para a libertação injectável de proteínas osteogénicas; e (b) administrar ao local do defeito de osso uma quantidade eficaz de um inibidor de reabsorção de osso.

33. Utilização de acordo com a reivindicação 32, em que o passo (a) é executado antes do passo (b).

34. Utilização de acordo com a reivindicação 32, em que o passo (b) é executado antes do passo (a).

35. Utilização de acordo com a reivindicação 32, em que o passo(a) e que o passo (b) são executados simultaneamente. Lisboa, 15 de Maio de 2007