KR100829452B1

KR100829452B1 - 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100829452B1
Application number: KR1020060052960A
Authority: KR
Inventors: 김향; 김현민; 장주웅; 이광일; 심영복
Original assignee: (주)코리아 본 뱅크; 김향; 이환모; 문성환; 심영복; 안현정; 김다영
Priority date: 2006-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2008-05-15
Also published as: WO2007145393A1; US20100028430A1; EP1916966A1; EP1916966A4; KR20070118798A

Abstract

본 발명은 근골격 대체재료로 사용되는 표면개질을 위한 생리 활성형 단백질-인산칼슘 복합체와 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인산칼슘 수용액과 단백질을 혼합하고, 위 혼합된 수용액 중에서 인산칼슘과 단백질을 함침하여 금속, 세라믹, 고분자 등 기판에 공침함에 있어서, 상기 기판을 패턴화하고, 패턴화된 영역 중 적어도 두 영역 이상의 영역에 서로 다른 단백질이 함침되어 있는 것을 특징으로 하는 생리 활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법을 제공한다.

생리활성, 생체활성, 패턴화, 단백질, 인산칼슘, 복합체, 공침

Description

생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조 방법{Bioactive Protein-Calcium Phosphate Composite and the Manufacturing Method of the same}

도 1은 본 발명에 의한 생리활성형 단백질과 생체활성 인산칼슘 세라믹스의 나노복합체의 형성 및 동 복합체를 코팅으로 형성시킨 기판 표면에 대한 모식도.

도 2는 본 발명에 의한 생리활성형 단백질과 생체활성 인산칼슘 세라믹스의 나노복합체 형성을 위한 표준군, 대조군 및 실험군을 각각 나타낸 모식도.

도 3은 5mm×4mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 5ml의 생리식염수, CaP 용액, CaP 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하여 침적시킨 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 (CaP) 나노복합체의 전자현미경 사진.

도 4는 7mm×7mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 18ml의 생리식염수, CaP 용액, CaP 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하여 침적시킨 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체의 TF-XRD 측정도.

도 5는 도 4의 나노복합체에 대한 FT-IRRS 측정도.

도 6은 5mm×4mm (두께 0.3mm)의 기판을 각 군 별로 5ml의 CaP 용액, CaP 용액 + 1㎍/ml 재조합 인간 BMP2, 및 CaP 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하여 침적시킨 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체에 대하여 인간 BMP2에 대한 항체를 적용한 후 관찰한 BMP2 -CaP 나노복합체 기판 표면에 대한 분포도.

도 7은 BMP2-CaP 나노복합체 기판에 MC3T3-E1 세포를 흡착하고, 이에 대한 조골인자 유전자(Osteogenic marker gene)의 발현 경향을 조사하기 위하여 4시간 경과 후에 RT-PCR을 통해 광학농도를 측정한 후 비교한 비교도(Osteogenic marker gene expression at 4hr after seeding of MC3T3-E1).

도 8은 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체 기판에 MC3T3-E1 세포를 2×104 세포 (/5mm×4mm)의 비율로 흡착하고, 3일을 추가배양한 후, 세포 흡착능과 분화형태를 관찰한 전자현미경 사진.

본 발명은 근골격 대체재료로 사용되는 표면개질을 위한 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체와 그 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인산칼슘 수용액과 단백질을 혼합하고, 위 혼합된 수용액 중에서 인산칼슘과 단백질을 함침하여 기판에 공침함에 있어서, 상기 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체를 기판표면에 패턴화하고, 패턴화된 영역 중 적어도 두 영역 이상의 영역에 서로 다른 단백질이 함침되어 있는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법을 제공한다.

일반적으로 인체의 기관이나 조직 또는 골격계가 손상되는 경우 그 치료에 많은 경비가 소요되며, 이러한 문제는 의료보장제도가 충분히 이루어지지 않고 있는 현대 사회에서 심각 문제로 대두되고 있다.

이와 같이 기관이나 조직 또는 골격계가 손상되는 경우, 타인으로부터 기증되는 기관이나 조직 또는 골격을 이용하여 환자에게 이식하거나 인공적으로 제작된 장기 또는 인공뼈 등을 환자에게 이식함으로써 위 손상된 부위를 치료하고 있다.

근간에는 기존 생체조직과 이식체간의 작용성을 나타내지 않는 비활성 상태의 연구 패턴이 아닌 생체조직과 이식체간의 생체적 활성과 관련된 연구가 더욱 활발해졌는데, 이러한 생체활성을 위해서는 이식체로서 표면특성이 우수하고, 정교하게 디자인된 세라믹, 금속, 고분자 등의 재료를 사용하여야 하며, 이러한 재료들은 주위의 생체조직과 활발하게 반응하여, 이식체가 생체로서 대체작용을 원활히 하도록 역할한다.

이를 구현하기 위한 기술사례들로는 수산화아파타이트를 기지재료에 도포하여 인공고관절을 제작하는 기술, 알긴 및 콜라겐을 기지재료에 도포하여 인공혈관을 제작하는 기술 등이 있다.

그러나 최근에는 이보다 더 나아가서 조직공학을 응용한, 즉, 인체에서 추출된 조직세포와 기지재료가 동시에 사용되는 혼합형 인공생체기관에 관한 연구가 진행되고 있는데, 이러한 기술은 이전에 연구되었던 생체조직과 인공기관의 완전한 대체 개념이 아닌, 기 손상된 조직의 원상복구의 개념으로 이해되고 있다.

이러한 혼합형 인공생체기관에 관한 연구를 통하여, 기관의 특정기능을 담당 하는 세포 또는 단백질 등을 기지재료에 결합하고 배양하여 복구하고자 하는 조직 또는 기관의 재생이 가능하도록 하고 있다.

이와 관련하여, 일본특허공개공보 특원2003-187396호에서는 단백질, 특히 성장인자나 세포접착인자같은 단백질을 담지한 티탄 또는 티탄합금에 관한 발명이 개시되고 있다. 여기서, 단백질담지티탄 또는 티탄합금은 생체적합성이 요구되며, 생체조직 재구축을 촉진시키는 생체조직대체재료, 인공 뼈, 인공치근, 항혈전재료, 조직공학용 지지체로서 이용되고 있다.

위 공개된 발명에서는 생체조직의 재구축, 조직유도, 세포분화를 도모하기 위해서 성장인자, 세포접착인자, 기타의 단백, 린지질, 다당류, 호르몬 등의 생물학적 활성화 물질(biologically active substance)을 이용하게 된다는 점을 개시하면서, 이 경우 일정수준 이상의 기계적 강도가 요구되기 때문에 티탄이나 티탄합금이 주로 사용되어야 하며, 특히 위와 같은 티탄이나 티탄합금을 사용하여야 하는 하중부골주직, 인공심장, 인공치근을 제작하기 위해서는 필연적으로 티탄이나 티탄합금에 생물학적 활성화 물질을 담지하여 세포를 담지시키거나 조직재구축을 도모하여야 한다는 점을 개시하고 있다.

아울러 단순한 티탄금속 표면에 인산칼슘과 단백질을 공침시키는 방법으로서는 단백질의 담지량이 적은 결과가 되므로 티탄표면에 알카리처리를 함으로서 단백질 담지량을 증가시켜야 한다는 점을 강조하고 있다.

그러나, 상기 발명은 조직의 재구축을 하는 과정에서 하나의 기지재료(여기서는 티탄)에 하나의 조직을 성장시킬 수 밖 에 없어 조직 성장의 국지화가 불가하며, 따라서 성질이 다른 여러 성장인자를 한 번의 재구축 과정으로 조직화하여 이를 인체의 필요한 위치에 이식하기는 용이하지 아니한 점이 있다.

또한, 기지재료가 티탄과 같은 고가의 재료에만 한정됨으로써 이식시 발생되는 막대한 비용을 절감하고자 하는 취지가 몰각되고 있어, 기지재료의 다종화가 필요한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 생체조직의 재구축을 촉진하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법은 상온, 상압에 관계없이 단백질 고유의 생리활성을 나타내면서 기지재료의 재질, 구조, 외형에 관계없이 근골격계 내의 모든 조직을 재생시키도록 하는 것을 목적으로 한다.

또한, 기판표면에 동 복합체 코팅을 패턴화 하고, 패턴화된 기판위에 조직을 국지적으로 선택하여 선택된 위치에만 국지 배양할 수 있어, 국지적으로 활성화된 배양조직을 다양하게 생성할 수 있으며, 혈관 등 기타 조직이 공존된 복합조직을 생성하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산칼슘 수용액과 단백질을 혼합하고, 위 혼합된 수용액 중에서 인산칼슘과 단백질을 함침하여 기판에 공침함에 있어서, 상기 복합체의 코팅을 패턴화하고, 패턴화된 영역 중 적어도 두 영역 이상의 영역에 서로 다른 단백질이 함침되어 있는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는, 상기 인산칼슘 수용액은 NaCl 130~160mM, K₂HPO₄.3H₂O 1~3mM, CaCl₂ 2~5mM 포함하며, pH 7~8의 범위로 조정된 수용액으로부터 제조되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 단백질은 골형성단백질(BMP), 백시아나 바이러스 성장인자(VGF), 형질변환 성장인자(TGF), 탈염골기지(DBM) 중에서 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 인산칼슘 수용액 20~40ml에 상기 BMP 등 단백질 0.1~100g/ml의 농도로 혼합한 용액이 기판에 공침되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 단백질은 0.1~1000 ㎛의 두께로 공침되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 단백질-인산칼슘 복합체는 함침 후 20~30℃의 온도 범위 내에서 1~5일간 숙성되는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 인산칼슘 세라믹은 생체 경조직 내 무기물과 유사한 칼슘/인(Ca/P) 원자함유 비 1.0~2.0인 범위 내에서 칼슘과 인을 각각 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 기판에 패턴을 형성하는 단계와; 상기 기판의 노출된 영역에 중 적어도 일 영역 이상의 영역에 인산칼슘 수용액과 단백질의 혼합용액을 공침시키는 단계; 및 상기 공침된 기판에서 생체조직을 성장시키는 단계로 구성되는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 바람직하게는, 상기 공침단계 이후에 상기 공침된 영역 이외의 적어도 일 영역 이상의 영역에 인산칼슘 수용액과 단백질의 혼합용액을 공침시키는 단계; 를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 인산칼슘 수용액은 NaCl 130~160mM, K₂HPO₄.3H₂O 1~3mM, CaCl₂ 2~5mM을 포함하며, pH 7~8의 범위로 조정된 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 단백질은 골형성단백질(BMP), 백시아나 바이러스 성장인자(VGF), 형질변환 성장인자(TGF), 탈염골기지(DBM) 중에서 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 바람직하게는, 상기 인산칼슘 수용액 20~40ml를 상기 BMP 등 단백질 0.1~100g/ml의 농도로 혼합한 용액이 금속, 고분자, 세라믹 등 목적 기판에 공침되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 단백질이 0.1~1000 ㎛의 두께로 공침되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 단백질-인산칼슘 복합체는 함침 후 20~30℃의 온도 범위 내에서 1~5일간 숙성되는 것을 특징으로 한다.

또한 바람직하게는, 상기 인산칼슘 세라믹은 칼슘/인(Ca/P)가 원자함유 비 1.0~2.0인 범위내에서 칼슘과 인을 각각 함유하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 첨부된 도면 및 실시 예를 참고로 하여 보다 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명에 의한 생리활성형 단백질과 생체활성 인산칼슘 세라믹스의 나노복합체의 형성 및 동 복합체를 코팅으로 형성시킨 기판 표면에 대한 모식도이다.

도시된 바와 같이, 본 발명은 과포화된 인산칼슘 수용액(Supersaturated solution)에 재조합 인간 BMP-2를 혼합하고, 이를 기지재료인 기판(Substrate)에 침적하여 제조된 생리활성 단백질-인산칼슘 복합체(Bioreactive Protein-Ceramic Composite)에 관한 것으로, 이는 기지재료를 패턴화하는 경우에는(미도시), 국지적으로 동 패턴에 상당하는 단백질-세라믹 복합체를 형성하도록 할 수 있으며, 위 단백질 성분은 필요에 따라 골형성단백질(BMP), 백시아나 바이러스 성장인자(VGF, Vaccina virus growth factor), 형질변환 성장인자(TGF, Transforming growth factor), 탈염골기지(DBM, Demineralized bone matrix) 등 단백질 중에서 선택된 1종 또는 그 이상의 종을 혼합하여 침적한 후, 복합체를 제조할 수도 있다. 본 발명은 위와 같이 패턴화된 기판위에 국지적으로 생리활성기능을 가질 수 있도록 하는 것에 특징이 있다 할 것이다.

여기서, 위 단백질은 상기 열거한 종류에만 한정되는 것이 아니라, 수 많은 종의 단백질이 모두 적용될 수 있음은 당연하다 할 것이다.

아울러 본 발명에서는 세라믹 중 특히 인산칼슘 세라믹 사용하여 이를 단백질과 합성한 결과, 실험적으로 특정 성질을 갖는 기판에서뿐만 아니라 기판의 종류 에 상관 없이 단백질-인산칼슘 세라믹 나노복합체가 성장할 수 있도록 한다는 점에 대한 것을 밝힌 것에 특징이 있다.

(실시예) - 인산칼슘 과포화용액속에서 골형성 단백질과 인산칼슘을 공침함으로써 단백질을 표면에 담지 시킨 인산칼슘 세라믹 코팅방법.

1. 단백질 침전을 위한 인산칼슘(Calcium phosphate, 인산칼슘) 용액 제조공정

NaCl (142mM), K₂HPO₄3H₂O (1.50mM), CaCl₂ (3.75mM, 초순수에 용해시킴), Buffer TRIS (50mM) 와 1M HCl (모든 시약은 Nacalai Tesque Co., Japan)을 사용하여 인산칼슘용액을 pH 7.4로 조정하였으며, 용액의 제조온도는 25℃으로 하였다.

2. 복합체 코팅을 위한 기판 및 제조공정

본 발명에 의하면 기지 또는 미지의 생체적합성 금속, 세라믹, 고분자 등 다양한 재료를 복합체 코팅을 위한 기판으로 사용할 수 있다. 또한 복합체 코팅의 용이한 형성을 위하여 기판표면을 물리적 또는 화학적으로 표면처리할 수 있으나. 이러한 표면처리를 코팅형성의 필수 조건으로 하지는 않는다. 실시 예에서는 전형적인 생체적합성 결정화 유리 A-W를 사용하였다.

3. 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 복합체의 침전 및 결정화 유리 A-W 기판에의 표면 코팅공정

도 2는 본 발명에 의한 생리활성형 단백질과 생체활성 인산칼슘 세라믹스의 나노복합체 형성을 위한 표준군, 대조군 및 실험군을 각각 나타낸 모식도이며, 도 3은 5mm× 4mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 5ml의 생리식염수, CaP 용액, CaP 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하여 침적시킨 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체의 전자현미경 사진이다.

도 2에서 도시된 바와 같이, 기판을 일정한 크기의 절편으로 절개하여, 절개면적 1cm²당 30ml의 인산칼슘 용액에 함침 하도록 계획하였다. 표준군은 기판을 생리식염수에, 대조군은 인산칼슘 용액에, 그리고 실험군은 인산칼슘 용액에 최종농도가 0.1~100㎍/ml이 되도록 재조합한 후 인간 BMP2를 섞어 기판에 여기에 각각 함침하였다. 기판을 함침한 용액은 25℃의 항온기에 소정기간 보존(여기서는 약 3일)하여 위 기판에 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체가 침적되도록 유도하였다.

위와 같이 침적된 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체의 표면을 관찰하기 위하여, SEM, TF-XRD, FT-IRRS로 기판 표면을 측정, 분석하였다. 또한 기판에 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체에 따른 생물학적 거동을 확인하고자 마우스 조골아세포인 MC3T3-E1 세포를 이용하여 조골세포 분화능을 분석하였다.

3-1. 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체의 전자현미경(SEM) 촬영 및 분석

도 3에 도시된 바와 같이, 5mm×4mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 5ml의 생리식염수, 인산칼슘용액, 인산칼슘 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하였으며, 위와 같이 기판을 함침한 용액을 25℃의 항온기에 3일간 보존하여 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체를 침적시킨 후, 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM)으로 기판 표면을 촬영하여 그 결과를 분석하였다.

주사전자현미경 촬영하고 대조군과 실험군을 표준군과 비교하여 분석한 결과, 대조군에서는 기판 표면에 엽상의 인산칼슘 입자가 고르게 코팅되어 있음을 알 수 있었으며, 실험군인 재조합 인간 BMP2와 혼합한 예에서는 단백질을 중심으로 핵생성 및 성장(Nucleation and Growth)이 이루어져 기판 표면에 코팅되어 있음을 관찰할 수 있었다.

3-2. 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체에 대한 TF-XRD와 FT-IRRS 분석

도 4에서는 7mm×7mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 18ml의 생리식염수, CaP 용액, CaP 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 함침한 후, 이를 25℃의 항온기에 3일간 보존하여 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체를 침적시키고 위 복합체를 분석한 TF-XRD 측정도를, 도 5에서는 도 4의 나노복합체에 대한 FT-IRRS 측정도를 각각 나타내었다.

도시된 바와 같이, TF-XRD 와 FT-IRRS 공히 CaP 용액 및 CaP + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2 용액에의 침적에 의하여 동일한 CaP 세라믹 코팅이 형성되었음을 알 수 있었다.

3-3. 재조합 인간 BMP2에 대한 항체형광염색 (Immunofluorescent staining)

도 6은 5mm×4mm (두께 0.3mm)의 기판을 각 군 별로 5ml의 인산칼슘 용액, 인산칼슘 용액 + 1㎍/ml 재조합 인간 BMP2 및 인산칼슘 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 함침하였으며, 위와 같이 기판이 함침된 용액을 25℃의 항온기에 3일간 보존하여 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체를 침적시킨 후, 인간 BMP2에 대한 항체를 이용하여 형광현미경을 사용하여 분석한 BMP2-인산칼슘 나노복합체의 기판 표면에 대한 분포도를 나타낸 것이다.

위 분포도를 얻기까지의 실험과정을 기술하면 다음과 같다.

우선, 위 각 용액에 기판을 함침하고, 3일간 보존한 후 나노복합체가 코팅된 기판을 인산완충용액과 생리식염수의 혼합용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 두 차례 세척하고, 3% 포름알데히드(formaldehyde) 용액에 침잠하여 4℃에서 20분간 고정하였다.

이후, PBS로 다시 2회 이상 세척한 후, 1% 보바인세럼 알부민(Bovine serum albumin, BSA)에 희석하여 제조한 인간 BMP2에 대한 1차 항체(goat polyclonal antibody, Santa Crus Biotech., Inc.)를 기판에 적용하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고, 이를 PBS를 이용하여 5분간 2회 이상 재세척하였다.

이후, 1% BSA에 희석하여 제조한 인간 BMP2에 대한 2차 항체(Fluorescent anti-goat IgG (Vector Lab., Inc.))를 기판에 적용하여 상온에서 45분간 반응시키고, 이를 PBS를 이용하여 5분간 2회 이상 재세척하였다.

위 과정을 수행한 후 위 기판에 형광현미경용 마운팅 매체(mounting media) 를 적용하고, 덮개용 유리(cover glass)로 덮어 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 미세구조(microstructure)를 관찰하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, BMP2의 농도가 증가됨에 따라 기판에 대한 BMP2-인산칼슘 나노복합체의 침적율이 증가하며, 인산칼슘만 침착된 기판에서는 BMP2에 대한 항체반응이 관찰되지 않았다.

3-4. 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체의 기판 표면 코팅에 의한 조골세포 분화유도

① 조골인자 유전자(Osteogenic marker gene) 의 발현 측정

도 7은 BMP2-CaP 나노복합체 기판에 MC3T3-E1 세포를 흡착하고, 이에 대한 조골인자 유전자(Osteogenic marker gene)의 발현 경향을 조사하기 위하여 RT-PCR을 통해 광학농도를 측정한 후 비교한 비교도를 나타낸 것이다.

이를 위하여 7mm×7mm (두께 1mm)의 기판을 각 군 별로 18ml의 생리식염수, 인산칼슘 용액, 인산칼슘 용액 + 10㎍/ml 재조합 인간 BMP2에 각각 함침하였으며, 위와 같이 기판이 함침된 용액을 25℃의 항온기에 3일간 보존하여 재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체를 침적시킨 후, 각각에 대하여 TF-XRD와 FT-IRRS 측정을 시행하였다.

재조합 인간 BMP2-인산칼슘 나노복합체를 침적한 기판에 마우스 조골아세포인 MC3T3-E1 세포를 2×10⁴ 세포 (/5mm×4mm)의 비율로 흡착한 후, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간 간격으로 RNA를 추출하여, 골분화 표지 유전자인 콜라겐 Ⅰ(collagen type I), 오스테오칼신(osteocalcin), 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등에 대하여 RT-PCR 분석을 행하였다. 각 PCR의 조건과 사용 프라이머(primer)의 시퀀스(sequence)는 아래의 표 1과 같다.

[표 1]

Group	primer name		5'->3'	product size(bp)	Rxn temp. (cycle)
1	mouse 18S rRNA	forward	ggt aca gtg aaa ctg cga at	168	50(28)
		reverse	ggg ttg gtt ttg atc tga ta
2	mouse type(I) collagen	forward	cct ggt aaa gat ggt gcc	222	58(28)
		reverse	cac cag gtt cac ctt tcg cac c
3	mouse osteocalcin	forward	cct cag tcc cca gcc cag atc c	219	58(28)
		reverse	cag ggc aga gag aga gga cag g
4	mouse ALP	forward	gcc ctc tcc aag aca tat a	372	55(35)
		reverse	cca tga tca cgt cga tat cc

RNA에 총량에 대한 내부조절인자(internal control)로는 18S rRNA 유전자를 이용하였고, PCR에 의한 산물(product)에 대해서는 2% 아가로제 겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동을 시행하였다. 또한 전기영동 후, TINA 프로그램을 이용하여 PCR 밴드(band)에 대한 광학농도를 측정하였다.

도시된 바와 같이, MC3T3-E1 세포를 흡착한 지 4시간 경과 후 관찰한 결과, 실험군인 BMP2-인산칼슘 나노복합체를 침적한 기판에 조골아세포를 흡착한 예에서 콜라겐 Ⅰ(collagen type I), 오스테오칼신(osteocalcin), 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase) 유전자의 발현이 표준군에 비하여 각각 1.48, 4.18, 5.87배 향상된 것을 확인할 수 있었으며, 대조군의 경우에 있어서도 조골세포 분화능이 탁월함을 확인할 수 있었다. 또한 세포 흡착 후, 24시간 이후에는 osteocalcin 유전자의 발현이 표준군과 대조군에서는 현저히 감소되는 반면, 실험군인 BMP2-인산칼슘 나노복합체가 침적된 군에서는 지속적으로 유전자 발현이 유지됨을 관찰하였다.

② 주사전자현미경(SEM) 관찰을 통한 BMP2-인산칼슘 나노복합체에서의 MC3T3-E1 세포형태분석

도 8은 재조합 인간 BMP2-CaP 나노복합체를 침적한 기판에 마우스 조골아세포인 MC3T3-E1 세포를 2×10⁴ 세포 (/5mm×4mm)의 비율로 흡착하고, 3일을 추가배양한 후, 세포 흡착능과 분화형태를 관찰한 전자현미경 사진이다.

도시된 바와 같이, 실험군 간에는 세포 흡착능의 차이가 뚜렷하게 관찰되지는 않았으나, 표준군과 비교하여 대조군과 실험군의 MC3T3-E1 세포가 보다 건강하고 활발한 활성을 보이고 있음을 알 수 있었다.

특히, 실험군의 경우, 세포 표면의 단백질 분비와 세포 수용체의 분포도가 월등히 높은 것을 관찰할 수 있었다. 또한 실험군에 흡착된 세포가 기판 표면에 코팅된 BMP2-인산칼슘 나노복합체 입자를 분해하고, 여기에서 성장하고 있는 모습을 관찰할 수 있었으며, 분해된 입자 주변에는 세포와 인접하여 신생 세포 기질이 생성되어 있음을 검증할 수 있었다.

위와 같은 CaP 용액에 2종 이상의 단백질을 함침하여 동 2종 이상의 단백질이 공침된 단백질-인산칼슘 복합체를 제조하여 2종 이상의 단백질에 의한 복합 생 리활성기능을 나타내는 나노복합체를 제조할 수 있다.

위와 같이 A-W와 같은 기판에 단백질을 포함하는 물질을 공침한 후 조직을 배양하는 기술을 조직배양 형태에 따라 하나의 기판을 패턴화하여 위 기판위에 다양한 조직을 국지적으로 배양할 수 있다. 아울러, 기판의 패턴화 공정으로서, 기판표면을 광감응성 고분자 막으로 차폐하여 제 1의 단백질을 함유한 복합체 코팅을 비차폐 표면에 코팅한 후, 차폐표면을 광노출에 의하여 분해 시킨 후 코팅표면을 차폐, 제 2의 단백질을 함유한 복합체 코팅을 형성시키고 재차 차폐표면의 고분자 막을 분해시키는 방법 또한 예로 들 수 있다.

기판표면에 패턴화된 차폐막 없이 제 1의 단백질을 함유한 복합체 코팅을 형성시킨 후 통 코팅을 기계적으로 제거하며 패턴화한 후, 패턴화 이외의 부위에 제 2의 단백질을 함유한 복합체 코팅을 형성함으로서 동일한 효과를 기대할 수도 있다.

위와 같은 과정에 의해 하나의 기판위에 서로 다른 생리적합성 단백질 세라믹 복합체를 국지적으로 코팅할 수 있으며, 복잡한 구조의 생체조직이 필요한 경우에도 단일한 기판에 의해 독립적인 생체조직을 성장시킴으로써 시술과정 및 제품의 제조공정을 단순화 할 수 있다.

이상에서와 같이, 본 발명에 의하면, 생체조직의 재구축을 촉진하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체 및 그 제조방법은 상온, 상압에 관계없이 단백질 고유의 생리활성을 나타내면서 기지재료의 재질, 구조, 외형에 관계없이 근골격계 내의 모든 조직을 재생시키는 효과가 있다.

또한, 기판을 패턴화 하고, 패턴화된 기판위에 조직을 국지적으로 선택하여 선택된 위치에만 국지 배양할 수 있어, 국지적으로 활성화된 배양조직을 다양하게 생성할 수 있는 효과가 있다.

또한, 위와 같은 CaP 용액에 골형성 단백질(BMP), VGF, TGF, DBM 등 단백질 중 2종 이상의 단백질을 함침하여 동 2종 이상의 단백질이 공침된 단백질-인산칼슘 나노복합체를 제조함으로써 하나의 공정을 통해 단일의 기판에 복합생리활성기능을 나타내도록 하는 효과가 있다.

Claims

인산칼슘 수용액과 단백질을 혼합하고, 위 혼합된 수용액 중에서 인산칼슘과 1종 또는 2종 이상의 단백질을 함침하여 금속, 세라믹 또는 고분자 재질의 기판에 공침함에 있어서,

상기 기판을 패턴화하고, 여기에 단백질이 함침되도록 하는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 인산칼슘 수용액은 NaCl 130~160mM, K₂HPO₄.3H₂O 1~3mM, CaCl₂ 2~5mM을 포함하며, pH 7~8의 범위로 조정된 수용액으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질은 골형성 단백질(BMP), 백시니아 바이러스 성장인자(VGF), 형질변환 성장인자(TGF), 탈염골기지(DBM) 중에서 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 3 항에 있어서,

상기 인산칼슘 수용액 20~40ml에 상기 단백질을 0.1~100g/ml의 농도로 혼합한 용액이 기판에 공침되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질은 0.1~1000 ㎛의 두께로 기판에 공침되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질-인산칼슘 복합체는 함침 후 20~30℃의 온도 범위 내에서 1~5일간 숙성되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
제 1 항에 있어서,

상기 세라믹은 칼슘/인(Ca/P)가 원자함유 비 1.0~2.0인 범위내에서 칼슘과 인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체.
금속, 세라믹 또는 고분자 재질의 기판에 패턴을 형성하는 단계와;

상기 기판의 패턴 중 노출된 적어도 일영역에 인산칼슘 수용액과 1종 또는 2종 이상의 단백질의 혼합용액을 공침시키는 단계; 및

상기 공침된 단백질 성분으로부터 생체조직을 배양하는 단계

로 구성되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항에 있어서,

상기 공침단계 이후에 적어도 기판의 공침된 영역을 제외하는 영역 중 노출된 일 영역 이상의 영역에 인산칼슘 수용액과 단백질의 혼합용액을 공침시키는 단계;

를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항에 있어서,

상기 인산칼슘 수용액은 NaCl 130~160mM, K₂HPO₄.3H₂O 1~3mM, CaCl₂ 2~5mM을 포함하며, pH 7~8의 범위로 조정된 것을 특징으로 하는 수용액으로부터 제조되는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항에 있어서,

상기 단백질은 골형성단백질(BMP), 백시니아 바이러스 성장인자(VGF), 형질변환 성장인자(TGF), 탈염골기지(DBM) 중에서 선택되는 적어도 1종 이상인 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 11 항에 있어서,

상기 인산칼슘 수용액 20~40ml에 상기 단백질을 0.1~100g/ml의 농도로 혼합한 용액이 기판에 공침되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질은 0.1~1000 ㎛의 두께로 기판에 공침되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질-인산칼슘 복합체는 함침 후 20~30℃의 온도 범위 내에서 1~5일간 숙성되는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.
제 8 항에 있어서,

상기 세라믹은 칼슘/인(Ca/P)이 원자함유 비 1.0~2.0의 범위 내에서 칼슘과 인을 각각 함유하는 것을 특징으로 하는 생리활성형 단백질-인산칼슘 복합체의 제조방법.