PT1615656E - Produto imunomoduladot proveniente de uma cultura de ibifidomacterium e composições que o contenham - Google Patents

Description

ÍSJ*iOT^O MTO»OR PROVENIENTE DE t» «,« DE IBIFIDOMACTERIUM E COMPOSIÇÕES QUE O CONmíHMr A invenção presente diz respeito a um produto ímunomoduladcr cbtido a partir de uma cultura de Bifidobacterium, à sua utilização, nomeadamente a titulo de medicamento ou de ingrediente alimentar, bem como às composições farmacêuticas ou alimentares que o contenham. O género Bifidobacterium faz parte da família dos Actinomycetaceae; nele se incluem bacilos Gram positivos, anaeróbios estritos, fermentando a glucose pela via da fosfocetolase do β-fosfato de frutose. 0 pH óptimo para o seu crescimento está compreendido entre 6 e 7, e a temperatura óptima para o seu crescimento está compreendida entre 37 e 46°C.

As bifidobactérias fazem parte da flor intestinal humana normal, e atribuem-se-lhes numerosos efeitos benéficos para a saúde. Sabe-sê nomeadamente que os bebés alimentados m peito, que possuem uma flor intestinal na qual as bifidobactérias predominam, resistem melhor às infecções e apresentam uvtseedaKÍehf:® um risco de diarreia menor do que os bebés alimentados com as preparações lácteas industriais clâ&Mesiá·, 0 papel das bifidobactérias neste aumento da resistência a infecções ainda não foi completamente elucidado. Escudos diversos indicam que elas possuem uma capacidade imunomoduladora que implicaria substâncias polissacarídicas associadas a parede bacteriana, ou segregadas pelas bactérias no decurso da fermentação anaeróbica. Gomez et al., (FEMS Microbiol. Lett ., 1988, 56, 47-52) descrevem o efeito imunomodulador de fracções extracelulares ricas em polissacaridos produzidos por Bifdobacterium adolescentis; o pedido de patente FR 2.652.590 descreve um exopolimero imunopotenciador com natureza polissacaridica produzido por uma estirpe do continuo de Bifidobacterium infantis longum; Honoso et al. (Biosci. Biotech. Biochem., 1997, 61, 312-316 e Bioscience Microflora, 1998, 17, 97-104) descrevem polissacáridos imunopotenciadores produzidos por diversas espécies de Bifidobacterium. A acção imunomoduladora das bifidobactérias manifesta-se igualmente pela regulação da microflora intestinal, em especial prejudicando o desenvolvimento de espécies bacterianas patogénicas. Romond et al. (Anaerobe, 1997, 3, 137-143 e J. Dairy Sei., 1998, 81, 1229-1235) descrevem deste modo fracções ricas em glicoproteinas, produzidas por Bifidobacterium breve sob condições de fermentação anaeróbica, e induzem in vivo um efeito regulador da microflora intestinal.

Encontram-se portanto no mercado numerosos produtos fermentados por bifidobactérias, eventualmente associadas a outra bactérias lácticas, e cuja ingestão permite beneficiar dos efeitos imunomoduladores das bifidobactérias e dos seus produtos de fermentação.

No entanto, e no caso particular da alimentação infantil, estes produtos apresentam o inconveniente de serem ácidos demais e de apresentar, nomeadamente no caso dos produtos em pó, um aspecto não homogéneo após a sua reconstituição, por causa da coagulação das proteínas do leite por causa da acidez gerada durante a fermentação. Eles são portanto por vezes mal aceites por parte da criança e da mãe.

Para remediar estes inconvenientes, já foi proposto no pedido internacional WO 01/01785, um processo de preparação de um produto lácteo imunoestimulante por bioconversão, sem fermentação e portanto sem acidificação do produto final, de um substrato lácteo, utilizando bifidobactérias, e em especial da estirpe Bifidobacterium breve, depositada nos termos do Tratado de Budapeste, a 31 de Maio de 1999, sob o número 1-2219, junto da CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) mantida pelo Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, em Paris.

No entanto, o processo de preparação descrito neste pedido internacional não permite preparar produtos alimentares que não sejam produtos lácteos e necessita de condições operatórias que constituem constrangimentos de um ponto vista industrial, nomeadamente a manutenção de condições de cultura aeróbicas, a manutenção do meio de cultura com uma pressão osmótica que corresponda a uma actividade da água A ) de entre 0,93 e 0,97 (AW), ebou a manutenção do meio de cultura a uma temperatura compreendida entre 40 e 48°C.

Por outro lado, as bactérias do género Bacteroides fragilis representam cerca de 30 a 50 % da flora presente nos materiais fecais, no ser humano. A sua localização é maioritariamente ao nivel do cólon (1011 bactérias por grama de células). No entanto, no caso de uma proliferação anormal, as bactérias do género Bacteroides fragilis são responsáveis por 80 % das infecções bacterianas anaeróbicas, e são cada vez mais frequentes atenta a sua resistência crescente em relação aos tratamentos com antibióticos. A sua proliferação anormal no organismo pode levar a: uma formação de abcessos (abdominal, do cérebro, do fígado, pélvico, do pulmão, do - septicemias, diarreias, principalmente no caso de crianças jovens, endocardites - peritonites, - pneumonias, nomeadamente necrosantes.

Foi descrita uma taxa de mortalidade de 60 % no caso da ausência de tratamento das infecções com Bacteroides fragilis .

Pode ser portanto interessante poder dispor de um produto que permita controlar a proliferação do Bacteroides fragilis.

Foi portanto com a finalidade de se remediar o conjunto dos inconvenientes que os produtos descritos na técnica anterior apresentam, bem como de aceder a um produto imunomodulador que possa ser incorporado em qualquer tipo de produtos alimentares ou de ser utilizado para a preparação de composições farmacêuticas imunomoduladoras, que os Inventores levaram a cabo quanto consta do objecto desta Invenção.

Os Inventores também consideraram como objecto a disponibilização de uma composição alimentar ou farmacêutica possuindo um efeito regulador da microflora intestinal, em especial em prejuízo do desenvolvimento de espécies bacterianas patogénicas, nomeadamente Bacteroides fragilis. A invenção presente tem portanto como um primeiro objecto um produto imunomodulador caracterizado pelo facto de ser obtido de acordo com um processo de preparação que inclui os passos seguintes: - a sementeira e a incubação, sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, de preferência anaeróbicas, e a uma temperatura compreendida entre cerca de 30 e 40°C, de um Bifidobacterium que inclua pelo menos a estirpe Bifidobacterium breve 1-2219, num substrato aquoso que apresente um pH compreendido entre cerca de 6 e 8, e que contenha pelo menos os ingredientes seguintes: i) permeado de soro de leite, ii) um hidrolisado de proteínas de soro de leite, iii) lactose, - a eliminação das Bifidobacterium contidas no substrato aquoso; - a ultrafiltração do substrato aquoso através de membranas de filtração que possuam um limiar de corte compreendido entre 100 e 300 kDa, para se obter um retentado concentrado; - a desidratação do retentado concentrado, de preferência por liofilização; - a dissolução do retentado desidratado num tampão; - a cromatografia de exclusão sobre gel da solução do retentado utilizando uma coluna que possua um limiar de exclusão de cerca de 600 kDa; a recuperação da fracção excluída no processo cromatográfico, que constitui o produto imunomodulador. A fracção excluída que se obtem levando a cabo um processo de acordo com a Invenção apresenta propriedades imunomoduladoras; ela permite em especial estimular a proliferação das Bifidobacterium e diminuir a população de Bacteroides fragilis, na composição da flora intestinal.

De acordo com a invenção, o permeado de soro de leite que entra na composição do substrato aquoso pode encontrar-se sob a forma de um pó, obtido por ultrafiltração de soro de leite, depois de uma secagem (por atomização ou por qualquer outra técnica de secagem), da fraccão líquida, desmineralizada ou não, que passa através da membrana aquando da ultrafiltração do soro de leite.

Os hidrolisados de proteínas de soro de leite utilizáveis no quadro da invenção presente, podem ser obtidos pelos métodos habitualmente utilizados para a preparação dos hidrolisados de proteínas, nomeadamente por hidrólise enzimática das proteínas de soro de leite por intermédio de proteases tais como a tripsina, a quimotripsina, etc... São conhecidos por si próprios diversos concentrados ou isolados de proteínas do soro, bem como diversos hidrolisados de proteínas de soro de leite, que convêm para se levar a cabo a Invenção, e encontram-se comercialmente disponíveis.

Antes de ser utilizado, o substrato aquoso é de preferência filtrado através de membranas, por exemplo tais como membranas de polétersulfona, que tenham um limiar de corte compreendido entre 100 e 300 kDa, e em seguida o permeado é tratado num autoclave a uma temperatura de cerca de 120°C durante cerca de 30 minutos de modo a evitar qualquer tipo de contaminação bacteriana do meio de cultura.

Antes de ser utilizado, pode ajustar-se o pH do substrato aquoso ao valor pretendido por intermédio de qualquer agente alcalinizante habitualmente utilizado por um técnico, tal como por exemplo a soda cáustica ou a potassa cáustica.

Semeiam-se de preferência as Bifidobacterium no substrato aquoso, a uma razão de entre 1 x 104 e 4 x 109 unidades formadoras de colónia (UFC) por mL de substrato. Pode efectuar-se esta sementeira, por exemplo, por adição ao substrato aquoso, em proporções adequadãs, de um concentrado congelado de Bifidobacterium, ou de uma cultura prévia num meio que permita o crescimento das bifidobactérias.

De acordo com uma forma de realização preferida da Invenção, mantém-se o pH do substrato aquoso a um valor de entre cerca de 6 e 8 durante todo o período de incubação, e ainda mais preferencialmente entre 6,5 e 7,5. A manutenção do pH é levada a cabo de preferência por uma neutralização do substrato aquoso em contínuo, por intermédio de um agente alcalinizante tal como se descreveu acima ou com amónia diluída (de preferência a metade da concentração do reagente).

De acordo com uma forma preferida de realização da Invenção, mantém-se a temperatura do substrato a um valor de entre cerca de 37 e 40°C durante todo o período da incubação, em geral leva entre 10 e 20 horas.

De acordo com uma forma preferida de realização do processo consoante a Invenção, os ingredientes do substrato aquoso estão presentes nas seguintes quantidades: i) permeado de soro de leite: entre cerca de 3 e 80 g e ainda mais preferivelmente entre cerca de 40 a 60 g, ii) hidrolisado de proteínas de soro de leite: entre cerca de 2 e 80 g e ainda mais preferivelmente entre cerca de 5 e 15 g, iii) lactose: entre cerca de 5 e 50 g e ainda mais preferivelmente entre cerca de 10 e 30 g, sendo estas quantidades as presentes por litro do substrato aquoso referido.

De acordo com uma forma de concretização particular da Invenção, o substrato aquoso pode conter para além disto pelo mais um ingrediente seleccionado de entre os extractos de levedura, os sais tamponizantes e o cloridrato de cisteína.

Quando o substrato aquoso incluir um sal tamponizante, esse sal é seleccionado de preferência de entre o dihidrogenofosfato de sódio e o dihidrogenofosfato de potássio e representa neste caso de preferência entre cerca de 0,5 e 5 g, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 1,5 e 3 g, por litro de substrato aquoso.

Quando o substrato aquoso incluir um extracto de leveduras, este Ultimo representa então de preferência entre cerca de 0,5 e 5 g, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 1,5 e 3 g, por litro de substrato aquoso.

Quando o substrato aquoso incluir cloridrato de cisteína, este último representa então de preferência entre cerca de 100 e 500 mg, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 200 e 400 mg, por litro de substrato aquoso.

No final do período de incubação, pode levar-se a cabo a eliminação das Bifidobacterium do meio de cultura por exemplo por microfiltração ou por centrifugação do substrato aquoso. De acordo com uma forma preferida de realização da Invenção, leva-se a cabo a eliminação das Bifidobacterium do meio de cultura por centrifugação do substrato aquoso, por exemplo a uma velocidade de 3000 g durante cerca de 1 hora.

De acordo com uma forma preferida de realização da Invenção, o processo inclui para além disto, após o passo de eliminação das Bifidobacterium, um passo suplementar de destruição das actividades enzimáticas residuais contidas no substrato aquoso depois da incubação, por exemplo por um tratamento térmico deste substrato a uma temperatura de cerca de 75°C durante cerca de 3 minutos.

Leva-se de preferência a cabo o passo de ultrafiltração do substrato aquoso através de membranas em polétersulfona, a uma temperatura inferior a cerca de 60°C.

No final do passo de ultrafiltração, • lava-se 0 retentado concentrado que dessa forma se obteve, de preferência diversas vezes, por exemplo com água desionizada, antes de em último lugar se voltar a concentrar, por exemplo por liofilização. 0 tampão utilizado para dissolver o retentado desidratado e de preferência seleccionado de entre os tampões que asseguram um pH compreendido entre 6 e 8, tais como por exemplo o tampão Tris ajustado ao pH pretendido por adição de ácido clorídrico. A natureza dos geles utilizáveis para levar a cabo a cromatografia de exclusão não e crítica a partir do momento em que eles apresentem um limiar de exclusão de 600 kDa. A título de gel podem nomeadamente utilizar-se geles compostos por dextrano e agarose reticulados, tais como o produto vendido sob a designação comercial de Superdex® 200 pela sociedade Amersham Biosciences.

Quando se terminou a cromatografia, pode em seguida dialisar-se contra água destilada a fracção excluída que se recuperou, e em seguida diluir-se de modo a se obter de novo a concentração inicia da fracção excluída.

Por último, a fracção excluída que é o produto imunomodulador pode ser utilizada directamente ou congelada, ou liofilizada para se conservar e utilizar ulteriormente.

Esta fracção excluída e constituída essencialmente por um complexo de polissacáridos e de proteínas no qual a fracção glucídica representa entre cerca de 5 e 30 % em peso, a fracção proteica representando entre cerca de 70 e 95 % em peso, em relação ao peso total do complexo referido.

De acordo com a Invenção, a fracção glucidica da fracção excluída apresenta a seguinte composição em monossacáridos (expressa em razões molares em relação a ramnose): galactose : 5,5 a 8; manose : 0,8 a 1,3; glucose: 2,5 a 5; N-acetilgalactosamina: 0,3 a 1; N-acetilglucosamina: 0,07 a 0,3; ácido neuramínico 0 a 0,15, e ramnose: 1.

De acordo com a Invenção, a fracção proteica da fracção excluída pode incluir pelo menos um péptido, obtido por hidrólise com tripsina, que corresponda a pelo menos uma das seguintes sequências: - RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEQ ID n°l) - RVLYNPGQYXYVR (SEQ ID n°2) - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID n°3) A Invenção tem igualmente como objecto o produto imunomodulador obtido de acordo com o processo descrito anteriormente na qualidade de medicamento, e em especial a título de medicamento imunomoduiador.

Um outro objecto da Invenção é uma composição farmacêutica caracterizada pelo facto de incluir, a titulo de principio activo, pelo menos um produto imunomodulador obtido de acordo com o processo descrito anteriormente, e pelo menos um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico. A expressão aceitável do ponto de vista farmacêutico inclui qualquer suporte que, embora conserve o produto imunomodulador obtido de acordo com o processo da Invenção, apresenta propriedades, e em especial as duas propriedades de imunomodulação, permita veicular o produto referido. A composição farmacêutica de acordo com a Invenção pode apresentar-se sob qualquer forma galénica pretendida para uma administração pela via oral a seres humanos ou a animais, como por exemplo sob uma forma liquida para um xarope ou uma solução, um aerossol, ou sob uma forma sólida como por exemplo um pó, um comprimido, uma gélula, uma cápsula, um pó capaz de ser nebulizado, nas suas deveras formas, para libertação imediata ou programada, uma goma, uma pasta, granulados, ou sob qualquer outra forma adaptada a administração por via oral.

Pode igualmente incorporar-se o produto imunomodulador obtido de acordo com c processo de acordo com a Invenção, a titule de ingrediente, em composições alimentares. A Invenção tem portanto também igualmente como objecto uma composição alimentar caracterizada por incluir, a titulo de ingrediente, pelo menos um produto imunomodulador obtido de acordo com o processo da Invenção.

As composições alimentares deste tipo podem destinar-se a alimentação humana ou animal e podem nomeadamente apresentar-se sob a forma de uma preparação, láctea ou não, fermentada ou não, com origem animal ou vegetal, incluindo nomeadamente as formulações infantis ou para adulto e para a terceira idade, e em particular sob a forma de uma preparação láctea infantil, a partir de leite liquido ou em pó, de produtos frescos, de cereais, de biscoitos (aperitivos), de pequenos potes, de sobremesas, etc, ou ainda sob a forma de produtos alimentares ou dietéticos para adultos, incluindo os produtos para administração em hospitais, ou de complementos nutricionais. A invenção presente será mais bem compreendida por intermédio de um complemento da descrição que se seguirá, e que assume a forma de exemplos de preparação do produto imunomodulador de acordo com a Invenção, bem como nas figuras anexas, nas quais: - a figura 1 representa o cromatograma obtido depois de se injectar sobre uma coluna contendo um gel de Superdex© 200, de um meio de cultura fermentado durante 15 horas pela estirpe Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 (absorvância em milivolt, e, função do período decorrido em minutos); - a figura 2 compara os cromatogramas obtidos depois de se injectar sobre uma coluna de um gel de Superdex® 200 um meio de cultura fermentado pela estirpe Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 ou pela estirpe B. breve CFPL (Colecção da Faculdade de Farmácia de Lille) C7 (absorvância em milivolt em função do período decorrido em minutos); a figura 3 representa uma ampliação da figura 2.

EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO

IMUNOMODUIADOR OBTIDO POR CULTURA DE BIFIDOBACTERIUM

Prepara-se um meio de cultura contendo os seguintes ingredientes: - 50 g/L de permeado de soro de leite, - 10 g/L de hidrolisado de proteínas de soro de leite, - 20 g/L de lactose, - 2 g/L de extracto de levedura, - 2,5 g/L de dihidrogenofosfato de potássio, - 0,3 g/L de cloridrato de cisteína.

Submete-se o meio de cultura a uma ultrafiltração sobre cassettes Centramate ® vendidas pela sociedade PALL, munidas de membranas em poliétersulfona que tinha um limiar de corte de 200 kDa e submete-se o permeado a um tratamento em autoclave durante 30 minutos a 120°C.

Ajusta-se então o pH do meio de cultura um valor de 6,5 por intermédio de uma solução de amoníaco diluída a 25 %.

Semeiam-se então as bifidobactérias no meio de cultura, a razão de 6 s/óo (em volume) de um concentrado congelado da estirpe de Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 contendo 5 x IO10 UFC de bif idobactérias por mL de concentrado congelado. A população inicial de bactérias é de 3 x 108 UFC de bifidobactérias por mL de meio de cultura. Cultivam-se as bifidobactérias sob anaerobiose, a uma temperatura compreendida entre 37 e 40°C. Durante a cultura, regula-se o pH do meio de cultura a 6,5 por intermédio de uma solução de amoníaco diluída a 25 %. O período de cultura e de 15 horas, e a população de Bifidobacterium no final da cultura é de cerca de 2 x 107 UFC por mL de meio de cultura.

No final da cultura, as bactérias são eliminadas do meio de cultura fermentado por uma centrifugação durante 1 hora a 3000 g. As actividades enzimáticas residuais contidas no sobrenadante da centrifugação são destruídas por um tratamento térmico durante 3 minutos a 75°C.

Ultrafiltra-se o sobrenadante sobre cassettes Centramate ® vendidas pela sociedade PALL, munidas de membranas em poliétersulfona e possuindo um limiar de corte de 300 kDa a uma temperatura cerca de 40°C. Ele é desta forma concentrado três vezes, e em seguida é lavado três vezes com água desionizada. Durante a última lavagem, leva-se a cabo uma concentração de 7 vezes na parte retida pela membrana. Obtém-se desta forma um concentrado que se denomina retentado. O retentado e desidratado por liofílização, e em seguida retomado num tampão de Tris-NaCl com pH S. 1) Estudo da composição do retentado obtido

Estuda-se a composição do retentado por cromatografia de exclusão.

Para este efeito, injectam-se 25 μΕ de retentado, a um caudal de 0,6 mL por minuto, sobre uma coluna de gel Superdex® 200 vendida pela sociedade Amersham Biosciences e apresentando um limiar de exclusão de 600 kDa, acoplada a um detector de UV com um conjunto de díodos (200-300 nm) . Leva-se a cabo a integração do sinal por intermédio do programa KromaSystem® 2000 vendido pela sociedade Kontron Instruments. Separam-se desta forma duas fracções: uma fracção excluída do gel que é eluída passados 12,5 minutos a seguir a injecção, e uma fracção filtrada que elui entre 16 e 32 minutos a partir da injecção.

Os resultados obtidos com o retentado passadas 15 horas de fermentação são descritos na figura 1 anexa na qual se representa a adsorvância (em milivolt) em função do período de tempo decorrido (em minutos) a seguir a injecção do retentado sobre a coluna.

Estes resultados representam um cromatograma típico mostrando a fracção excluída e a fracção filtrada do retentado que dessa forma se analisou.

As figuras 2 e 3 representam os cromatogramas obtidos após uma análise de um retentado proveniente de uma cultura levada a cabo tal como se descreveu anteriormente e de um retentado proveniente de uma cultura levada a cabo nas mesmas condições mas com uma estirpe diferente de bifidobactérias (B. breve CFPL Cl). A figura 2 representa a absorvância (em milivolt) em função do período de tempo decorrido (em minutos) a partir da injecção sobre a coluna dos retentados correspondentes às duas culturas levadas a cabo, respectivamente, com a estirpe B. breve CNCM 1-2219 e com a estirpe B. breve CFPL C7. Estes resultados mostram que, ao contrário do retentado da cultura levada a cabo com a estirpe de B. breve CNCMI- 2219, o cromatograma do retentado proveniente da cultura levada a cabo com a estirpe de B. breve CFPL C7 não apresenta nenhum pico que corresponda a fracção excluída e a fracção filtrada do retentado. Pelo contrário, a figura 3 que representa uma ampliação da figura 2, mostra que é necessário aumentar consideravelmente a escala de absorvância da figura 2 para que apareçam a fracção excluída e a fracção filtrada do retentado correspondendo a cultura levada a cabo com a estirpe de B. breve CFPL C7. Estes resultados demonstram deste modo que e estirpe B. breve CFPL C7 não apresenta o potencial de produção de princípios activos que é apresentado pela estirpe B. breve CNCMI-2219. 2) Preparação da fracção excluída do retentado

Concentra-se o retentado, previamente retomado num tampão Tris-NaCl com pH 8, e submete-se a uma cromatografia preparativa. Leva-se a cabo a separação por cromatografia sobre uma coluna de gel Superdex ® 200 vendida pela sociedade Amersham Siosciences, com um diâmetro de 50 mm e com uma altura de 100 cm, alimentada com um caudal de 5 mL por minuto e possuindo um limiar de exclusão de 600 kDa. Recolhem-se fracções de 10 mL e mede-se a sua absorvância a 280 nanómetros.

Separam-se por este processo duas fracções: - uma fracção excluída do gel, com massa molecular superior a 600 kDa (período de retenção de entre 130 e 180 minutos +/-10 %), - uma fracção filtrada com uma massa molecular compreendida entre 200 e 600 kDa (período de retenção de entre 187 e 370 minutos +/-10 %).

Dialisa-se contra água destilada a fracção excluída ou parte activa e depois dilui-se de modo a voltar a obter a concentração inicial do retentado. Pode-se em seguida conservar sob uma forma congelada ou liofilizada. A fracção filtrada pode igualmente ser conservada do mesmo modo.

EXEMPLO 2 : ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO GLUCÍDICA E

PROTEICA DA PARTE ACTIVA (FRACÇÃO EXCLUÍDA) PREPARADA A PARTIR DE UMA CULTURA DE BIFIDOBACTERIUM 1) Análise da composição glucídica da parte activa

Retoma-se o pó liofilizado da fracção excluída tal como se preparou acima neste documento no exemplo 1 (10 mg) com hidrazinã anidra pura (200-300 microlitros). Incuba-se a mistura de um dia para o outro a 110°C, seca-se sob uma corrente de azoto e retoma-se em 1 mL de água. Em seguida fracciona-se a solução por permeação de gel sobre uma coluna Fractogel TSK, vendida sob a referência HW40 pela sociedade Merck, e leva-se a cabo a eluição em água. Pesquisa-se a presença de açúcares nas diversas fracções recolhidas pelo método com orcinol e por cromatografia em camada fina. Os resultados obtidos (não representados) mostram que a maioria dos açúcares está na fracção não retida sobre o gel ( > 10 kDa) e migra pouco depois em cromatografia em camada fina. A parte glucídica da fracção excluída constitui portanto um polissacárido com massa molecular superior a 10 kDa. A parte glucídica da fracção excluída representa cerca de 15 a 20 %, em massa, desta fracção. A composição molar da fracção glucídica da parte activa é determinada por cromatografia em fase gasosa após uma metanólise por intermédio de uma mistura de ácido clorídrico 0,5 M com metanol, durante 24 horas a 80°C.

Analisam-se duas amostras da fracção excluída (Amostras i e 2 de CNCM 1-2219: respectivamente EI e E2), provenientes de dois ensaios diferentes levados a cabo de acordo com o exemplo 1. A título de comparação, levaram-se a cabo as mesmas analises sobre uma amostra em que a estirpe Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 havia sido substituída pela estirpe Bifdobacterium breve CFPL C7 (Amostra C7), cultivada nas mesmas condições, bem como sobre uma amostra em que a estirpe Bifidobacterium breve CNCMI-2219 havia sido cultivada num meio de lactose diferente do meio da Invenção (Amostra em meio de lactose: ML) e que tinha a composição sequinte: - 60 g/L de lactose, - 2 g/L de extracto de levedura, - 0,3 g/L de cloridrato de cisteína.

Os passos seguintes de extracção e de purificação foram comparáveis sob todos os aspectos aos que se descreveram acima.

As razões molares de determinados monossacáridos (expressas em relação a ramnose) obtidas para as fracções excluídas provenientes destas diversas amostras encontram-se listadas na Tabela I que se segue:

TABELA I EI E2 C7* ML* Galactose 6,50 7,60 2,00 3/80 Manose 0,92 1,10 2,70 6,20 Glucose 3,20 4,30 3,50 2,70 N-acetil-galactosamina 0, 80 0,47 1,00 0,10 N-acetil-glucosamina 0, 17 0,10 0,38 0,10 Ácido neuramínico 0, 08 0,49 Ramnose 1, 00 1,00 0 1, 00 . amostra comparativa que não faz parte da invenção

Pode notar-se a ausência de ramnose na amostra C7 na qual se substituiu a estirpe Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 pela estirpe Bifidobacterium breve CFPL C7. pode igualmente constatar-se que os açúcares se repartem entre as amostras EI e E2 de um modo diferente do evidenciado pela amostra ML que corresponde a estirpe Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 cultivada num meio de lactose não conforme com a Invenção. Em especial, as amostras EI e E2 contêm mais galactose e mais N-acetilgalactosamina do que a amostra ML, e menos manose que a amostra ML. 2) Análise da composição proteica da parte activa A fracção proteica da parte activa representa entre 80 e 85 %, em massa, desta última.

Leva-se a cabo a sequenciação da parte proteica da parte activa depois de um passo de proteólise com uma solução de tripsina a 1 % num tampão de Tris 0,1 M a pH 8,5, tal como se descreveu no artigo de Rosenfeld J. et al., Analytical Biochemistry, 1992, 203, 173-179.

Purificam-se os péptidos por HPLC em fase reversa, sobre uma coluna Ultrasphere© ODS (octadecilsilano) com um diâmetro de 2 mm e um comprimento de 200 mm, vendida pela sociedade Beckmann. A eluição é levada a cabo por um gradiente linear de acetonitrilo numa solução aquosa de ácido trifluoroacético a 0,1 %.

Sequenciam-se os péptidos isolados (pelo método descrito no artigo de Rosenfeld J. et ai., citado acima) utilizando um aparelho de referência Procise 492 vendido pela sociedade Perkin-Elmer.

Comparam-se em seguida as sequências com as que existem nas seguintes bases de dados: GenBank CDS translation, PDB (Protein Data Bank), SwissProt, PIR (Protein Information Resource), PRF (Protein Research Foundation), utilizando o programa BLAST 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool) do NCBI (National Center for Biotechnology Information).

Esta análise permitiu demonstrar que a fraeção proteica da parte activa é constituída maioritariamente por peptidos do meio lácteo (lactoferrina, Beta-lactoglobulina, Albumina do soro...), no que toca a uma parte que apresenta uma boa homologia (um mínimo de 60 %) com uma sequência de proteína de Bifidobacterium longum (RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (SEQ ID n° 1;).* e no que toca a uma parte relativamente a qual não foi possível determinar nenhuma homologia significativa com sequências conhecidas e que possui as sequências seguintes: - RVLYNPGQYXYVR (SEQ ID n° 2) - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID n° 3)

EXEMPLO 3: ESTUDO DA ACTIVIDADE IMUNOMODULADORA DA FRACÇÃO EXCLUÍDA DO RETENTADO 1) Efeito da fracção excluída sobre a flora intestinal dos murganhos

Foi estudado o efeito da fracção excluída (parte activa), obtida de acordo com o processo descrito no exemplo 1, sobre a evolução da flora intestinal dos murganhos. 0 teste foi levado a cabo sobre murganhos macho C3H que são murganhos de segunda geração de uma linhagem de animais axénicos, nos quais é implantada uma flora intestinal humana adulta (proveniente do CDTA, Centre de Distribution, Typage & Archivage animal, CNRS, Orleães, França)

Mantêm-se os murganhos em isoladores para evitar qualquer modificação da sua nova flora intestinal. Quando são adquiridos, os murganhos têm idades de 8-10 semanas. Decorre um período de adaptação dos murganhos após a sua chegada de pelo menos 2 semanas, para evitar qualquer tensão devida ao seu transporte e para que se aclimatem ao seu novo ambiente.

Durante todo este período de adaptação e até ao final da experiência, é facultado aos murganhos acesso livre a água estéril, a título de bebida.

Durante todo o período em que decorre a experiência, os alimentos utilizados como base alimentar são uma dieta padrão granulada R03, vendida pela sociedade UAR, esterilizada por irradiação, contendo 25 % de proteínas, 49,8 % de glúcidos, 5 % de lípidos e 4 % de celulose.

Durante os 21 dias do ensaio, substitui-se a água dos biberons por diversos produtos que se pretendem testar, isto é, pela fracção filtrada e pela fracção excluída, à razão de 6 mL por dia e por murganho. Leva-se a cabo uma permuta diárias dos biberons para evitar qualquer modificação da composição dos produtos a testar devida a proliferação de bactérias. Recolhem-se as fezes para análise, antes do tratamento (TO), depois aos dias 7, 15 e 21 durante a administração do produto (T7, T15 e T21) .

Cada produto é testado sobre um lote de pelo menos 6 murganhos e segue-se a evolução das bactérias Bifidobacterium e Bacteroides fragilis na flora intestinal dos murganhos. A recolha das fezes é feita em tubos de hemólise estéreis e elas são pesadas assepticamente e depois são diluídas com uma solução de Ringer previamente reduzida, diluída a 25 % e suplementada com cloridrato de cisteína (0,3 g/L), de modo a se obterem diluições a 1 para 10 correspondendo a valores entre 10_1 e 10"*, Deposita-se por último o conteúdo sobre placas com diversos meios de cultura, em placas de Petri, a razão de 100 pL por cada: - Meio de Beerens (Be) (composto por 35 g/L de base gelose Columbia, 5 g/L de glucose, 0,3 g/L·-de cioridrato de cisteina, 0,5 % de ácido propiónico, com o pH ajustado a 5) para a pesquisa e contagem de Bifidobacterium, depois de se plaquearem a diluições de entre 10”" e .·}·. v;! i

Meio Bacteróides Bile Esculine (BBE) (composto por 37 g/L de triptona, 32 g/L de Bile Esculin Agar (DIFCO), 0,5 g/L de esculina, 0,5 g/L de citrato de ferro amoniacal, 0,2 % de uma solução de hemina a 5 mg/mL, 0,25 % de uma solução de gentamicina a 40 mg/mL e 10 g/L de agar; com pH ajustado a 7 e esterilizado em autoclave durante 15 minutos a 120°C) para a pesquisa e contagem de quaisquer Bacteróides fragilis, depois de se plaquearem diluições na gama de 10'"' a 10""., O plaqueamento é levado a cabo por intermédio de esferas em vidro estéreis, sobre os meios indicados, e a leitura é levada a cabo passados 5 a 7 dias de incubação em anaerobiose e a 37°C. A identificação das bactérias é levada a cabo por um lado graças a uma descrição das colónias obtidas sobre cada um dos meios, e por outro lado recorrendo a uma contrastação de Gram.

Os resultados que dizem respeito a evolução dos números de Bifidobacterium e de Bacteroides fragilis nas fezes dos murganhos são apresentados respectivamente nas Tabelas II e III que se seguem:

TABELA II

Bifidobacterium

Fracção filtrada 3,8 I 0,5 (9) 4,3 ± 0,5 (11) 4,75 I 1,15 (9)* nd n = 18 n = 18 n = 18 Fracção excluída 4,02 ± 0,74 (8) 4,54 ± 1,0 (8) 4,56 ± 0,36 (12) 4,76 ± 0,27 (6)* n = 18 n = 18 η = 1 2 n = 6 nd : não determinado, *'. p < 0,025 ; ** : p < 0,05 TABELA III Bacteroides fragilis Fracção filtrada 4,4 + 0,7 (15) 4,3 ± 0,5 (11) 4,3 I 0,7 (12) 4,1 I 0,9 (7) n = 18 n = 18 n = 18 η = 1 2 Fracção excluída 4,28 ± 0,35 (18) 3,99 ± 0>37 (8) 3/74 ± 0,28 (9) 3,2 ± 0,16 (4)** I:í - IS í £ á ** S | n d : não determinado, *! p < 0,025 ; ** : p < 0,05

Nestas tabelas, exprimem-se os resultados obtidos sob a forma de médias e desvios padrão do iogaritmo do número de UFC por grama de fezes, e n é o número de murganhos utilizados em cada produto e número de dias do teste (comparação de ordem relativa pelo teste de Wilcoxon para amostras emparelhadas), os asteriscos indicam os resultados significarivos em relação ao período de tempo TO. Nestas tabelas, o número mencionado entre parênteses corresponde ao número de murganhos nos quais se encontra presente a bactéria em questão a concentrações superiores as do teor mínimo detectável. Os resultados correspondentes ao meio sem sementeira são semelhantes aos valores obtidos ao TO e permanecem constantes ao longo do decurso do tempo durante os 21 dias da experiência (resultados não representados nas tabelas).

Estes resultados mostram que a administração de qualquer uma das duas fracções (excluída ou filtrada) leva de facto a um aumento das Bifidobacterium mas que só a fracção excluída é eficaz para provocar uma diminuição da população de Bacteroides fragilis no seio da flora intestinal dos murganhos. 2) Efeito da fracção excluída sobre a regulação da translocação intestinal dos microrganismos A medição da translocação intestinal dos microrganismos no murganho é levada a cabo sobre murganhos macho da linhagem C3H em flora de humanos adultos (criados no CDTA-CNRS, Orleães, França). Durante todo o período de adaptação e até ao início da experiência, estes murganhos dispõem de água estéril como bebida.

Durante todo o período da experiência, estes murganhos são alimentados com granulados R03 esterilizados por irradiação.

Com idade de 10 a 12 semanas, no início da experiência, constituem-se três grupos, um grupo de 18 murganhos a quem é administrada todo ao longo da experiência a fracção excluída dos metabolitos de Bif idobacterium breve CNCM 1-2219 em vez de água nos biberons, a razão de 8-10 mL por dia e por murganho enquanto dois outros grupos, respectivamente com 12 e 23 murganhos, receberam a fracção filtrada e água estéril (grupo de controlo).

No dia 21, leva-se a cabo uma recolha de fezes tal como se descreveu acima e sacrificaram-se os murganhos para se levar a cabo um estudo bacteriológico. São obtidos dois tipos de dados a partir da análise dos murganhos que se sacrificaram: - a translocação por órgão alvo, ou seja a avaliação do número de murganhos cujo órgão alvo esteja contaminado, e da percentagem da população que apresenta uma contaminação do órgão alvo. - a disseminação bacteriana, isto é a intensidade da disseminação bacteriana representada pelo número de órgãos que se asseverarem positivos bem como pelo número de murganhos e pela percentagem da população que apresentar uma disseminação com uma determinada intensidade.

Para se obterem amostras dos órgãos a analisar, retira-se o animal do isolador, transfere-se sob condições assépticas numa hotte provida de fluxo laminar, e sacrificam-se por inalação de clorofórmio.

Descontamina-se a pele com álcool a 70 %, e depois retiram-se os órgãos de cada murganho em condições assépticas e pela seguinte ordem: sangue do coração, pulmão, fígado, baço e rim. Para avaliar o seu peso, coloca-se em suspensão de uma fracção de cada órgão em 9 mL de uma solução de Ringer (diluída a 25 %, suplementada com cloridrato de cisteína (0,3 g/L) e regenerada em água a ferver durante 15 minutes). Moem-se em seguida os órgãos utilizando uma pipeta de Pasteur estéril e não reutilizável, Pastette® vendida pela sociedade VWR, ou Liquipette® vendida pela sociedade Gosselin. Em seguida, plaqueiam-se 100 μΐ da suspensão de origem e de uma sua diluição a 1:10 utilizando esferas de vidro estéreis, sobre gelose Columbia (vendida pela sociedade Beckton-Dickinson), suplementada com glucose (5 g/L), com cloridrato de cisteína (0,3 g/L) e com sangue de cavalo (a 5 I em volume, vendido pela sociedade Eurobio). Depois de uma incubação sob anaerobiose durante 7 dias a 37,SC> leva-se a cabo uma contagem de cada tipo de colónias e depois determina-se a morfologia das bactérias após uma contrastação de Gram.

Os resultados obtidos, relativos a análise da translocação por órgão alvo, estão listados na Tabela IV seguinte:

TABELA IV Órgão alvo Grupo de controlo Fracção filtrada Fracção excluída Rim li;s (52,2) b 8 (66,7) 7 NS Baço 13 (56,5) 9 (75,0) 3 (16,7)* p < 0,01 Fígado 10 (43,5) 8 v ^ ^ >v j R í 'V V: ΐ sJ ·. x·. > j; Ún·· NS Pulmão 11 (47,8) 7 (58,3) 2 (11,1)* p < 0,02 “ = número de murganhos cujo órgão alvo está contaminado, = % da população apresentando uma contaminação do órgão alvo, c = comparação dos grupos que consumiram um dos produtos, em relação ao grupo de controlo, usando o teste exacto de Fisher.

Marcou-se com um asterisco, *, o grupo que apresentava uma diferença significativa.

Os resultados que se obtiveram deste modo mostram que o baço e o pulmão estão contaminados com menor frequência na população para a qual a água de beber foi substituída pela fracçãc excluída do que na população de murganhos de controlo q que foi fornecida água a título de bebida.

Por outro lado, estes resultados tornam aparente que a fracção filtrada não tem efeito sobre a regulação da translocação bacteriana.

Os resultados obtidos relativamente a disseminação de bactérias estão listados na Tabela V que se segue:

TABELA V

Intensidade da disseminação Grupo de controlo Fracção filtrada Fracção excluída pd Fraca !* (35)c 3 (25) 12 (66,7)* p < 0,043 Média (2) 4 (17) 1 (8,3) 5 NS Forte (3-4) 11 (48) 8 m,l) 1 (5,5)* p < 0,04 * = intensidade da disseminação de bactérias representada (entre parênteses) pelo número de órgãos positivos, a = número de murganhos apresentando uma disseminação com uma intensidade determinada, c - % da população apresentando uma disseminação com uma intensidade determinada, = comparação dos grupos que consumiram um dos produtos, em relação ao grupo de controlo, usando o teste exacto de •ff '

Lisher. Marcou-se com um asterisco, , o grupo quej apresentava uma diferença significativa. 0 número de murganhos que apresentam pelo menos um órgão contaminado (intensidade fraca de disseminação) é maior na população para a qual a água de beber foi substituída pela fracção excluída do que na população de murganhos a que foi disponibilizada água como bebida.

Por outro lado, o número de murganhos que apresentam pelo menos três órgãos contaminados (forte intensidade de disseminação) é menor na população para a qual a água de beber foi substituída pela fracção excluída do que na população de murganhos a que foi disponibilizada água como bebida.

Constata-se portanto que a disseminação das bactérias é menos intensa nos murganhos para os quais a água de beber foi complementada com a fracção excluída. Nesse caso, a regulação da translocação bacteriana e mais eficaz. 3) Efeito da fracção excluída sobre a expressão das qalectinas 1 e 3.

Leva-se a cabo a quantificação da expressão das galectinas 1 e 3 em murganhos com flora de adultos humanos tal como se descreveram acima.

Com a idade de 12-14 semanas, no início da experiência, constituem-se dois grupos de murganhos, um grupo de murganhos a que depois foi atribuída durante toda a duração da experiência a fracção excluída contendo os metabolitos de Bifidobacterium breve CNCM 1-2219 em vez da água dos biberons, a razão de 10 mL por dia e por murganho, enquanto um outro grupo de murganho continuou a receber água (grupo de controlo) .

Nos dias 7, 15 e 21, sacrifica-se um lote de murganhos para se levar a cabo um estudo biológico acerca da expressão das galectinas 1 e 3, avaliada pela percentagem de ARN codificando para essas galectinas por PCR (Reacção da Polimerase, em Cadeia) quantitativa a TA. Os órgãos obtidos dos murganhos do grupo de controlo que se sacrificaram nos dias 7, 15 e 21 foram agrupados por órgão, para constituir uma população de base servindo de controlo durante toda a duração da experiência. A modificação da expressão das galectinas 1 e 3 nos órgãos testados constitui um indicador do efeito dos metabolitos produzidos pela estirpe de Bifidobacterium breve CNCM1-2219 que estão contidos na fracção excluída.

Doseiam-se as galectinas 1 e 3 no baço e nos pulmões de murganhos que foram sacrificados tal como se descreveu acima.

Para este efeito, retiram-se por procedimento estéril uma fracção de um pulmão (um lobo), e metade do baço, por esta ordem, de cada um dos murganhos. Depositam-se em seguida os fragmentos em placas de Petri previamente tratadas durante 24 horas com uma soiução estéril de água com DEPC (Pirocarbonato de dietilo, vendido pela sociedade

Sigma) a 1/1000. Levou-se em seguida a cabo uma primeira perfusão dos órgãos em tampão de PBS, por intermédio de uma seringa e de uma agulha estéreis, para se eliminar o sangue que continham. Transferem-se em seguida os órgãos para novas placas de Petri contendo 200 microlitros de PBS ao qual se adicionaram 50 unidades de inibidor de RNase (vendido pela sociedade Applied Biosystems) e perfusam-se de novo com esta solução. Cortam-se por último os órgãos em lâminas de dimensão inferior a 5 mm, as quais são depositadas em tubos Biopur ® (Eppendorf) contendo 0,5 mL de uma solução de estabilizaçãodo ARN, vendida sob a referência RNA-Later® pela sociedade Qiagen. Armazenam-se em seguida ou órgãos no congelador a -20°C até a sua análise. a) Extracção dos ARN totais dos órgãos excisados

Extrai-se o ARN total dos tecidos após uma lise celular de acordo com o protocolo de utilização do estojo de extracção RNeasyprotect® vendido soba referência 74126 pela sociedade Qiagen.

Para este efeito, retira-se a solução de estabilização e adiciona-se a cada órgão uma esfera de tungsténio tratada com DEPC bem como 600 microlitros de uma solução de líse (tampão RLT contido no estojo). Em seguida moem-se num moinho RETSCH MM2000, e depois centrifugam-se a 13.000 g durante 3 minutos a 4°C.

Coloca-se então o sobrenadante num tubo de 1,5 mL contendo 600 microlitros de etanol a 70 % e depois homogeneiza-se. Deposita-se em seguida uma parte desta solução (700 microlitros) sobre uma coluna de filtração que permite a ligação dos ARN, para se centrifugar a 8.000 g durante 1 minuto a 4°C. Depois de se ter esvaziado o tubo colector, colocam-se sobre a coluna 700 microlitros de um tampão de lavagem (tampão RW1 contido no estojo), a qual se submete a uma centrifugação a 8.000 g durante 1 minuto a 4°C. Esvazia-se mais uma vez o tubo colector e colocam-se sobre a coluna mais 500 microlitros de um segundo tampão de lavagem contendo etanol a 70 % (tampão RPE contido no estojo) para de novo se centrifugar a 8.000 g durante 1 minuto a 4°C. Repete-se este último passo levando a cabo uma centrifugação a 13.000 g durante 2 minutos a 4°C. Por último adicionam-se a coluna 30 microlitros de um tampão de eluição que permite romper a ligação dos ARN a coluna (tampão de RNase livre contido no estojo).

Centrifuga-se então o eluido a 8.000 g durante 1 minuto a 4°C depois de se incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Leva-se de novo a cabo o passo de eluição e congelam-se rapidamente as amostras a -80° C.

Adiciona-se a cada amostra uma unidade de DNase, vendida pela sociedade Boehringer, a cada uma das amostras, a qual e em seguida incubada em banho-maria a 37°C durante 15 minutos.

Depois de avaliar a quantidade total de ARN nas amostras, elas são diluídas a 1/8 em água estéril e colocam-se numa microcuveta que permite a leitura da adsorvância a 260 nm num espectrofotómetro UV de referência Genquant, vendido pela sociedade Pharmacia. Para se obter a concentração em ARN total nas amostras, multiplica-se o valor obtido desta forma (DO) pelo factor de diluição e por 40 (uma unidade de DO = 40 micrograma/mL de ARN) . b) PCR quantitativa a TA utilizando a metodologia

Leva-se a cabo uma PCR quantitativa a temperatura ambiente utilizando o estojo qPCI™ vendido pela sociedade Eurogentec, num termociclador de referência Abi Prism 7700 (Sequence Detection System, Applied Biosystems) vendido pela sociedade Perkin Elmer.

Prepara-se a mistura reaccional que se apresenta de forma resumida na Tabela VI seguinte:

TABELA VI

Reagentes Volume em Concentração gL/tubo final Tampão PCR (10 x)* 5 1 x ' ^ ·\ : V ^ ' * v 'N ϊ-v dNTP (2,5 mM)* 6 300 μΜ Iniciador de sentido 1 200 μΜ directo (10 pm) Iniciador de sentido 1 200 μΜ reverso (10 pM) Sonda (10 pM) 1 200 μΜ Inibidor de RNase (40 U* s.* 20 unidades unidades) Polimerase Hot Gold Star (5 0, 25 1,25 unidades unidades) MuLV (5 unidades) 0, 25 12,5 unidades ARN totais 10 100 ng/tubo Água pura Cfbp 5 0 μΧ; produto fornecido no estojo qPCR™ Core Kit

Submete-se a mistura reaccional ao seguinte programa de tratamento: 10 minutos a 65°C para eliminar as estruturas secundárias dos ARN, 30 minutos a 42 °C para activar a transcriptase inversa, 10 minutos a 95 °C para activar a polimerase, 15 segundos a 95°C para desnaturar os resíduos de ADN e 1 minuto a 61 °C para a hibridação e o elongamento a partir dos iniciadores. Levam-se a cabo quarenta ciclos para os dois últimos passos.

Avalia-se a expressão das galectinas 1 e 3 em relação a um gene de referência , tal como o que codifica para a β-actina e cuja expressão seja constante. A sondas e os iniciadores utilizados e seleccionados graças ao programa Primer Express® vendido pela sociedade Perkin Elmer são as seguintes:

Sentido directo: 5'-TCA ATC ATG GCC TGT GGT CTG-3' (SEQ ID n° 4)

Sentido reverso: 5'-AAG CTC TTG GCG TCC GAG G-3' (SEQ ID n° 5)

Sonda: 5'-TCG CCA GCA ACC TGA ATC AAC CTG-3' (SEQ ID n° 6)

Sentido directo: 5'-AAT GGC AGA CAG CTT TTC G-3' (SEQ ID n° 7)

Sentido reverso: 5'-GAT CAT GGC GTG GTT AGC-3' (SEQ ID n° 8)

Sonda: 5'-TTC CAC TTT AAC CCC CGC TTC AAT GAGAAC 3' (SEQ ID n° 9)

Sentido directo: 5'-TGG CGC TTT TGA CTC AGG ATT-3' (SEQ ID n° 10) Sentido reverso: 5'-GGG ATG TTT GCT CCA ACC AAC-3' l ;SEQ ID n° 11) Sonda : 5' -GCC GTC GCC TTC ACC GTT CCA GTT TTT-3' (SEQ ID n° 12)

Para validar cada microplaca submetida aos ciclos de PCR, prepara-se um calibrador a partir de órgãos de um lote de 6 murganhos C3H com flora humana submetidos a um regime alimentar padrão (água estéril e granulados R03) dos quais se haviam excisado os pulmões e o baço. Extraíram-se os ARN totais de cada órgão recorrendo ao protocolo descrito acima para os órgãos dos lotes de murganhos a testar. Em seguida juntam-se os diferentes extractos obtidos desta forma para cada órgão para constituir uma reserva de base que serve de calibrador para a duração total da análise.

Na altura da análise, depositam-se em duplicado as amostras a testar e prepara-se uma gama de amostras de referência a partir da amostra calibradora que se deposita em triplicado.

Calcula-se então uma média a partir de cada órgão obtido, e para a amostra calibradora.

Os resultados da expressão relativa a galectina-1 em relação a β-actina estão listados na Tabela VII seguinte:

TABELA VII

Alimentação i Controlo Fracção excluíd a 7 dias 15 dias 21 dias Baço n · 1? n ~ S η :: 1 π ,3 : sV ' V" í '1 >. &'’· W:: 1*1$ 1.,37). U « D teste bilateral ϋ « 7 ]>'' Av' v í v: j·; ^ .,v v. <;v bilateral 1¾ 51 13.,)74} (I ® o ! .V,, .,· ΛΛ'ΐ .JvV v ·- y >v"y <5., bilateral Pulmão n = 16 n = 6 n = 4 n = 6 1,145 (0,69- •v y ./ ·.· ^ 0,8 (0,56-1,08) U = 17,5 p < 0,05 teste bilateral i 1, 72 (1, 67-1,88) U - 5 p < 0,02 teste bilateral 1,465 (0,86-1,77) | que se

Os resultados da expressão relativa a galectine-3 em relação a β-actina estão listados na Tabela VIII segue:

TABELA VII

Alimentação Órgão Controlo Fracção excluída 7 dias 15 dias 21 dias Pulmão η = 16* n = 6 n = 3 n = 6 1, 259b (0,56- 1,04 (0, 86- 0,76 (0,41-1) U = 8 p < 0,05 teste unilateral 0, 91 (0,75-

Nas tabelas VII e VIII: - â = número de murganhos por lote; S: = mediana da expressão relativa da galectina; _ rV = resultados extremos de expressão relativa da galectina; - o valor designado pela letra U é o valor estatístico do teste U de Mann-Whitney - p indica o limiar da significância do método.

Estes resultados mostram igualmente que se observa uma diminuição da expressão da galectina 1 nos baços dos murganhos para os quais a água de beber foi substituída pela fracção excluída. A expressão da galectina 1 (indução da apoptose celular, em particular de linfócitos T activados) nos animais de controlo é duas vezes maior em relação à da actina, o que parece relacionar-se com a contaminação bacteriana do órgão (a expressão da galectina 1 é significativamente inferior na ausência de bactérias no baço - U = 15, p < 0,05 - e ela aumenta em função da taxa de contaminação bacteriana quando existem bactérias correlação r = 0,77, p < 0,05, teste de Sperman). A expressão da galectina 1 normaliza-se após 7 dias de administração da fracção excluída, e depois aumenta em seguida a entre 4 e 10 vezes, respectivamente aos 15 e aos 2 dias de administração (independentemente da contaminação bacteriana residual do órgão). Nos pulmões, a expressão relativa da galectina 1 é normal nos murganhos de controlo e a diminuição fraca mas significativa passados 7 dias de administração da fracção excluída é seguida por um aumento (transitoriamente significativo aos 15 dias de administração) e em seguida de uma normalização da galectina 1 ao fim de 21 dias de administração da fracção excluída.

Estes resultados mostram igualmente que uma diminuição da expressão da galectina 3 é observada nos pulmões dos murganhos para os quais a água de beber é substituída pela fracção excluída. O conjunto destes resultados demonstra que a fracção excluída !produto imunomodulador obtido seguindo o processo de acordo com a invenção) tem um efeito imunomodulador e permite aumentar a população de

Bifidobacterium e diminuir a população de Bacteroides fragilis.

SEQUENCE LISTING

<110> COMPAGNIE GERVAIS-DANONE PETAY, Valerie LECROIX, Francis PERRIN, Emmanuel GONTIER, Charles BLAREAU, Jean-Pierre ROMOND, Marie-Bénédicte

SiNGER, Elisabeth ODOU, Marie-Françoise DEMAILLY-MULLIE, Catherine PRODUITIMMUNOSTIMULANTOBTENUA PARTIR D'UNE CULTURE DE BIFIDOBACTERIUM ETCOM-POSITIONS LE CONTENANT <130> F191 EXT 189 •U50> FR0304746 *15115-2003-04-16 FR0403158 •si 51> 2004-03-26 <160> 12

Patentln version 3.1 <210> 1 <211 > 2L S3v PRT -..5 5 3;.- Bifidobacteriumbreve

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Artificial sequence <220> <223> PCR primer <ASft*4

tcaatcatgg cdgtggtct g 21 c210>5 c2l1> 19 2> DNA -.213'·· Artificial sequence <220> x:;S:3s.: PCR primer aagcfcttgg cgtccgagg 19 6 24

<212> DNA *£13> Artificial sequence <220> probe <4S?Q> 6 tcgccagcaa cctgaatcaa cctg 24 <210> 7 19

«SIS* DNA <213> Artificial sequence <220> PCR primer <400>7

aatggcagac agctntcg 19 <210> 8 <211 >18 <212> DMA

Artificialsequence <220> <223> PCR primer <40Q> 8 gatcatggcg tggttagc 18 <210>9 <211>30

c2122 DNA <£133. Artificial sequence <220> probe <400> 9 ttccacttta acccccgctt caatgagaac 30 <210>10 <211 >21

DNA <313> Artificial sequence <220> <22;*;·· PCR primer 10 tggcgctttt gactcaggat t 21

<:2;&· 11 <SH*21 *211* DNA <213> Artificial sequence <220> PCR primer •*«*11

gggatgtttg ctccaaccaac 21 <210> 12 ^11> 27 <212> DNA

Artificial sequence Λ <223> probe 12 gccstcgcct tcaccgttcc agttitt 27

Lisboa, 7 de Novembro de 2007

Claims (21)

1. Produto imunomodulador caracterizado por ser obtido de acordo com um processo de preparação que inclua os seguintes passos: - a sementeira e a incubação, sob condições aeróbicas ou anaeróbicas, de preferência anaeróbicas, e a uma temperatura compreendida entre cerca de 30 e 40°C, de um Bifidobacterium que inclua pelo menos a estirpe Bifidobacterium breve 1-2219, num substrato aquoso que apresente um pH compreendido entre cerca de 6 e 8, e que contenha pelo menos os ingredientes seguintes: i) permeado de soro de leite, ii) um hidrolisado de proteínas de soro de leite, iii) lactose, - a eliminação das Bifidobacterium contidas no substrato aquoso; - a ultrafiltração do substrato aquoso através de membranas de filtração que possuam um limiar de corte compreendido entre 100 e 300 kDa, para se obter um retentado concentrado; - a desidratação do retentado concentrado, de preferência por liofilização; - a dissolução do retentado desidratado num tampão; - a cromatografia de exclusão sobre gel da solução do retentado utilizando uma coluna que possua um limiar de exclusão de cerca de 600 kDa; a recuperação da fracção excluída no processo cromatográfico, que constitui o produto imunomodulador.

2. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as Bifidobacterium serem semeadas no substrato aquoso a razão de entre 1 x IO1 2 3 4 5 e 4 x 109 unidades formadoras de colónias por mL de substrato. 1 Produto imunomodulador de acordo com a 2 reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a 3 temperatura do substrato ser mantida a um valor 4 compreendido entre 37 e 40°C durante toda a duração da 5 incubação.

4. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de o pH do substrato aquoso ser mantido a um valor de entre 6 e 8 durante todo o período de incubação.

5. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o pH do substrato aquoso ser mantido a um valor de entre 6,5 e 7,5 durante todo o período de incubação.

6. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de os ingredientes do substrato aquoso estarem presentes nas seguintes quantidades: i) permeado de soro de leite: entre 3 e 80 g>· ii) hidrolisado de proteínas de soro de leite: entre 2 e 80 g, iii) lactose: entre 5 e 50 g sendo as quantidades acima relativas a um litro do substrato aquoso referido.

7. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de os ingredientes do substrato aquoso estarem presentes nas seguintes quantidades: i) permeado de soro de leite: entre 40 e 60 g, ii) hidrolisado de proteínas de soro de leite: entre 5 e 15 g, iii) lactose: entre 10 e 30 g sendo as quantidades acima relativas a um litro do substrato aquoso referido.

8. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o substrato aquoso incluir para alem disto pelo menos um ingrediente adicional seleccionado de entre os sais tamponizantes, os extractos de levedura e o cloridrato de cisteína.

9. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o substrato aquoso incluir um sal tamponizante seleccionado de entre dihidrogenofosfato de sódio e dihidrogenofosfato de potássio, que represente entre 0,5 e 5 g por litro de substrato aquoso.

10. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o extracto de levedura representar entre 0,5 e 5 g por litro de substrato aquoso.

11. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o cloridrato de cisteína representar entre 100 e 500 mg por litro de substrato aquoso.

12. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de a eliminação das Bifidobacterium do meio de cultura ser levada a cabo por microfiltração ou por centrifugação do substrato aquoso.

13. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de a eliminação das Bifidobacterium do meio de cultura ser levada a cabo por centrifugação ou por centrifugação do substrato aquoso.

14. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de o processo incluir para além de quanto se enumerou, depois do passo de eliminação das Bifidobacterium, um passo suplementar de destruição das actividades enzimáticas residuais contidas no substrato aquoso após a incubação.

15. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de a cromatografia de exclusão ser levada a cabo sobre um gel de dextrano e de agarcse reticulados.

16. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a fracção excluída ser essencialmente constituída por um complexo de polissacáridos e de proteínas no qual a fracção glucídica represente entre 5 e 30 % em peso e a fracção proteica represente entre 70 e 95 % em peso, em relação ao peso total com complexo referido.

17. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a fracção glucídica da fracção excluída apresenta a seguinte composição em monossacáridos (expressa em razões molares em relação a ramnose) : galactose : 5,5 a 8; manose : 0,8 a 1,3; glucose: 2,5 a 5; N-acetilgalactosamina: 0,3 a 1; N-acetilglucosamina: 0,07 a 0,3; ácido neuramínico 0 a 0,15, e ramnose: 1.

18. Produto imunomodulador de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a fracção proteica incluir pelo menos um péptido correspondente a uma das sequências seguintes: - RELGIGTPSFLHNGGQWYIYA (IfQ XD 1; - RVLYNPGQLXYVR (SEQ ID n° 2) - EQATANGQVSSGQQSTGGSAAP (SEQ ID n° 3) acordo com

19. Produto imunomodulador de qualquer uma das reivindicações anteriores, a titulo de medicamento.

20. Produto imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, a titulo de medicamento imunomodulador.

21. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de ela conter, a titulo de principio activo, pelo menos um produto imunomodulador obtido de acordo com o processo tal como se definiu numa qualquer das reivindicações 1 a 18, e pelo menos um suporte aceitável do ponto de vista farmacêutico.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo facto de ela se destinar a uma administração pela via oral, e pelo de se apresentar sob uma forma liquida ou sólida. Lisboa, 7 de Novembro de 2007