PT1511496E

PT1511496E - Método para tratamento ou prevenção de doenças mediadas pelo sistema imunitário e formulação farmacológica para utilização nas mesmas

Info

Publication number: PT1511496E
Application number: PT03741634T
Authority: PT
Inventors: Evert Johannes Bunschoten; Herman Jan Tijmen Coelingh Bennink; Christian Franz Holinka
Original assignee: Pantarhei Bioscience Bv
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2003-06-11
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CY1105883T1; DE60308679D1; CA2489271A1; DK1511496T3; DE60308679T2; CN1691947A; ES2274252T3; ATE340579T1; US20050261209A1; AU2003274946A1; SI1511496T1; CN1691947B; EP1511496B1; EP1511496A1; US7923440B2; WO2003103684A1; CA2489271C

Description

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DESCRIÇÃO

MÉTODO PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS MEDIADAS

PELO SISTEMA IMUNITÁRIO E FORMULAÇÃO FARMACOLÓGICA PARA

UTILIZAÇÃO NAS MESMAS

ÂMBITO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um método para tratamento ou prevenção de doenças mediadas pelo sistema imunitário num mamífero, através da administração de uma quantidade eficaz de um componente estrogénico ao referido mamífero. O método é particularmente adequado para o tratamento ou prevenção de doenças mediadas pelos linfócitos T e/ou doenças inflamatórias crónicas, incluindo, mas não se limitando, às doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla, a artrite reumatóide, a osteoartrose, a diabetes insulino-dependente (diabetes tipo 1) , o lúpus erítematoso sistémico e a psoriase, patologias imunológicas induzidas por agentes infecciosos, como infecções helmínticas (e. g., leishmaniose) e certas infecções virais, incluindo o VIH, e infecções bacterianas, incluindo a doença de Lyme, a tuberculose e a lepra lepromatosa, a rejeição de transplantes, a doença do enxerto contra o hospedeiro e situações de atopia, como a asma e a alergia, incluindo a rinite alérgica, as alergias gastrointestinais, incluindo alergias alimentares, a eosínofilia, a conjuntivite e a glomerulonefrite.

Um outro aspecto da invenção está relacionado com uma formulação farmacológica para utilização no método supracitado, no qual a formulação compreende um componente estrogénico, um agente imunoterapêutico e um excipiente farmacologicamente aceitável. 2

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 papel das hormonas sexuais femininas em várias doenças mediadas pelo sistema imunitário tem sido objecto de várias publicações científicas. Descobríu-se que doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e a artrite reumatóide afectam preferencialmente as mulheres (Jansson et al., Inflamm. Res., Julho 1998, 47 (7): 290-301). Para além disso, descobriu-se que durante a gravidez, período durante o qual as hormonas sexuais femininas estão elevadas, são comuns as remissões clínicas de doenças auto-imunes mediadas por células são comuns, com exacerbação da doença frequentemente observada no puerpério, período durante o qual os níveis de hormonas sexuais estão baixos (Kím et al., Neurology, Abril 1999, 12, 52 (6): 1230-1238).

Descobriu-se ainda que uma fracção invulgarmente elevada de doentes com esclerose múltipla apresenta valores urinários baixos de gonadotrofinas e estrogénios (Poser et al., Geburtshi1fe Frauenheilkd, Maio 1981, 41(5): 353-358).

Ademais, estudos em ratinhos castrados demonstraram que a administração de estradiol e estriol em quantidades indutoras dos niveis séricos observados na última fase da gravidez atrasa o início da encefalomielite auto-imune experimental (EAE), uma doença auto-imune Thl-dependente utilizada como um modelo de esclerose múltipla (Jansson et al., Inflamm. Res. , Julho 1998, 47 (7) : 290-301) . Os resultados de uma avaliação do efeito do 17p-estradíol sobre a expressão genética na EAE, utilizando micromatrizes de ADN implicam um conjunto limitado, conhecido e previamente insuspeitado, de genes sensíveis ao estradiol que podem ser cruciais para a inibição da EAE e, potencialmente, da doença humana esclerose múltipla (Matejuk et al., Endocrinology, Janeiro 2002, 143(1): 313-319) . A patente WO 01/185154 diz respeito a um método de atenuação de uma doença imunológica mediada por linfócítos 3

Thl num mamífero, através da administração de uma dose baixa de estrogénios ao mamífero, em particular uma dose baixa de 17/3-estradiol, estriol ou estrona. As doses baixas destes estrogénios são consideradas necessárias para evitar os potenciais efeitos adversos de niveis elevados de estrogénio nos sistemas reprodutivo e circulatório e, também para prevenir efeitos colaterais indesejáveis em homens. A patente DE 19917930 descreve a utilização de esteróides com uma configuração 8α-Η, 9β-Η, 10α-Η, 13α-Η, 14β-Η em contextos farmacológicos.

Os estrogénios supracitados, 17/3-estradiol, estriol e estrona, têm em comum o facto de serem endógenos ao organismo feminino, i. e., serem estrogénios biogénicos. Estes estrogénios biogénicos apresentam défices farmacocinéticos graves. A sua biodisponibilidade oral é muito baixa e varia em larga medida de pessoa para pessoa, o que significa que não podem ser emitidas recomendações gerais de dosagem. A rápida eliminação destes estrogénios a partir do sangue é outro problema relacionado. Por exemplo, para o principal estrogénio biogénico humano, o 17/3-estradiol, a semivida é de cerca de 1 hora. Em resultado disso, entre episódios de administração diferentes (diários), os niveis séricos destes estrogénios biogénicos tendem a flutuar consideravelmente. Deste modo, pouco depois da administração, a concentração sérica é geralmente várias vezes superior à concentração óptima. Para além disso, caso o episódio de administração seguinte seja atrasado, as concentrações séricas irão rapidamente baixar para um nível em que os estrogénios já não são fisiologícamente activos.

Para além dos problemas farmacocinéticos, os estrogénios conhecidos também apresentam défices farmacodinâmicos. Depois da absorção a partir do lúmen intestinal, os ingredientes activos administrados oralmente entram no organismo através do figado. Este facto tem uma importância específica para os agentes estrogénicos, na medida em que o 4 fígado é um órgão-alvo para os estrogénios; a administração oral de estrogénios resulta em fortes efeitos estrogénicos sobre o fígado, A actividade de secreção que é controlada pelos estrogénios no fígado humano inclui o aumento da síntese das proteínas transportadoras CBG, SHBG, TBG, vários factores importantes para a fisiologia da hemostase, e lipoproteínas. Quando os estrogénios biogénicos são introduzidos no organismo feminino, ao mesmo tempo que se evita a sua passagem através do fígado (e, g., através de aplicação transdérmica), as funções hepáticas mencionadas permanecem maioritariamente inalteradas. Doses terapeuticamente equivalentes de estrogénios biogénicos vulgarmente conhecidos, quando administradas oralmente, resultam em respostas claras dos parâmetros hepáticos, como o aumento da SHBG, CBG, angiotensinogénio e HDL (lipoproteína de alta densidade).

Consequentemente, são precisas substâncias estrogénicas que: (a) sejam mais eficazes num método de tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário, como os estrogénios biogénicos supracitados, e/ou (b) tenham uma semivida significativamente maior do que os estrogénios biogénicos supracitados, e/ou (c) sejam administráveis oralmente sem causar efeitos hepáticos significativos, e/ou (d) produzam menos efeitos secundários indesejáveis do que os estrogénios biogénicos supracitados.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram, surpreendentemente, que estes 5 requisitos são reunidos pelas substâncias estrogénicas que são representadas pela seguinte fórmula

em que Ri, R2/ R3 e R4 da fórmula são, independentemente, um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; cada R5, R6, R7 é um grupo hidróxilo; e não mais do que 3 de entre Ri, Ra, R3 e R4 são átomos de hidrogénio; as referidas substâncias apresentam uma configuração 8β, 9α, 10α-Η, 13β, 14α.

Um conhecido representante deste grupo de substâncias estrogénicas é o 1,3,5(10}-estratrieno-3,15α,16a,17β-tetrol, também conhecido pelas designações «estetrol», e «15a-hidroxiestriol». 0 estetrol é um estrogénio que é produzido pelo figado fetal durante a gestação humana. Os níveis de estetrol não conjugado no plasma materno atingem um pico de cerca de 1,2 ng/mL no termo da gestação e são cerca de 12 vezes superiores no plasma fetal do que no materno (Tulchinsky et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1975, 40, 560-567}.

Em 1970, Fishman et al. («Fate of 15a-hydroxyestriol-3H in Adult Man», J. Clin. Endocrinol. Metab., 1970, 31, 436- 438), apresentaram os resultados de um estudo em que se administrou 5a-hidroxiestriol (estetrol) marcado com trítio por via intravenosa a duas mulheres adultas. Descobriu-se que o estetrol era rápida e completamente excretado na urina como glucosiduronato e que não ocorria praticamente nenhum metabolismo, à excepção da conjugação. 6

Entre 1975 e 1985, vários investigadores analisaram as propriedades do estetrol e referiram a sua potência estrogénica e actividade uterotrófica. Mencionam-se abaixo as publicações mais relevantes que foram editadas durante esse período: • Levine et al., 1984, «Oterine vascular effects of estetrol on nonpregnant ewes», in Am. J. Obstet. Gynecol., 148:73, 735-738: «O estetrol é 15 a 30 vezes menos potente do que o estriol e o 17p-estradiol na proliferação celular in vitro, quando é administrado intravenosamente em ovelhas não grávidas»; • Jozan et al., 1981, «Different effects of oestradiol, oestriol, and of oestrone on human breast câncer cells (MCF-7) in long term tissue culture», in Acta Endocrinologica, 98, 73-80: «A potência agonística do estetrol é 2% da observada para o 17p-estradiol na proliferação celular in vitro»; • Holinka et al., 1980, «Comparison of effects of estetrol and tamoxifen with those of estriol and estradiol on the immature rat uterus», in Biol. Reprod., 22, 913-926: «O estretol administrado subcutaneamente tem actividade uterotrófica muito fraca e é consideravelmente menos potente do que o 17p-estradiol e o estriol»; • Holinka et al., 1979, «In vivo effects os estetrol on the immature rat uterus», in Biol. Reprod., 20, 242-246: «O estetrol administrado subcutaneamente tem actividade uterotrófica muito fraca e é consideravelmente menos potente do que o 17B-estradiol e o estriol»; • Tseng et al., 1978, «Heterogeneity of sturable binding estradiol sites in nuclei of human endometrium», in Estetrol. Studies. J. Steroid Biochem., 9, 1145-1148: «A ligação relativa do estetrol aos receptores de estrogénio no endométrio humano é 1,5% do 17 β-estradiol»; 7 • Martucci et aJ., 1377, «Direction of estradiol metabolism as a control of its hormonal action-uterothrophic activity and is considarably less potent than 17p-estradiol and estriol», Endocrin., 101, 1709-1715: «A administração continua de estetrol a partir de um depot subcutâneo revela actividade uterotrófica muito fraca e consideravelmente menos potente do que o 17β-estradiol e o estriol»; • Tseng et al., 1976, «Competition of estetrol and ethynylestradiol with estradiol for nuclear binding in human endometrium», J. Steroid. Biochem, 7, 817-822: «A constante ligação relative da ligação do estetrol ao receptor de estrogénio no endométrio humano é de 6,2% comparado com o 173~estradiol (100%)»; • Martucci et al., 1976, «Uterine estrogen receptor bindingof catecholestrogens and of estetrol (1,3,5(10)-estratriene-3,lõalpha,16alpha,17beta-tetrol)», Steroids, 27, 325-333: «A afinidade de ligação relativa do estetrol ao receptor de estrogénio citosólico uterino de ratazanas é de 0,5% do 17 β-estradiol (100%). Ademais, afinidade de ligação relativa do estetrol ao receptor de estrogénio nuclear uterino de ratazanas é de 0,3% do 17β-estradiol (100%)».

Todas as publicações apresentadas acima têm em comum o facto de os autores terem investigado a potência estrogénica do estetrol. Todas, sem excepção, concluem que o estetrol é um estrogénio fraco. Em alguns dos artigos citados, descobriu-se que a potência estrogénica do estetrol é muito inferior à do estrogénio 17p-estradiol, largamente utilizado e relativamente fraco. Tendo em conta estas descobertas, não é surpreendente que o interesse no estetrol tenha decaído desde o início dos anos 80 e que não tenham sido desde então publicados artigos novos sobre as propriedades do estetrol. 8

Os inventores descobriram, surpreendentemente, que, apesar da sua baixa potência, o estetrol, assim como as substâncias estrogénicas relacionadas podem ser, vantajosamente, utilizados num método de tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário. Embora os inventores não desejem ficar restritos à teoria, acreditam que a eficácia inesperada das presentes substâncias semelhantes ao estetrol resulta da combinação das inesperadas propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas favoráveis destas substâncias, assim como da sua afinidade relativamente alta com o receptor a dos estrogénios (REa) quando comparado com o receptor β dos estrogénios (RE/3) . Esta última característica é um aspecto exclusivo das substâncias estrogénicas empregues no presente método.

No que diz respeito às propriedades farmacocinéticas das presentes substâncias estrogénicas, os inventores descobriram que a sua semi vida in vivo é consideravelmente mais longa que a dos outros estrogénios biogénicos. Deste modo, muito embora o estetrol e as substâncias semelhantes ao estetrol tenham uma potência estrogénica relativamente baixa, eles podem ser empregues eficazmente num método de tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário, na medida em que a sua baixa potência é compensada por uma estabilidade metabólica relativamente elevada, como é demonstrado pela sua semivida longa.

Acredita-se que a afinidade relativamente elevada das presentes substâncias estrogénicas com o receptor REa, ou, reciprocamente, a afinidade relativamente baixa com o receptor ΚΕβ, está, de algum modo, associada à elevada eficácia das presentes substâncias no tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário. No entanto, como se confirmará abaíx°/ os mecanismos que regem as vias de sinalização do RE que são responsáveis por esta eficácia são ainda pouco compreendidos, apesar dos consideráveis esforços científ i-cos que estão a decorrer nesta área. 9

Sabe-se que a maioria dos estrogénios se liga a ambos os RE, que, na presença de eo-activadores e/ou co-repressores específicos de tecido, se ligam a um elemento de resposta aos estrogénios na região reguladora dos genes ou a outros factores de transcrição. Dada a complexidade da sinalização dos RE, concomitantemente com a expressão específica de tecidos dos RE ar e RE/3 e seus co-factores, sabe-se actualmente que os ligandos dos RE podem actuar como agonistas dos estrogénios, ou mesmo como antagonistas dos estrogénios de uma forma especifica para cada tecido.

Sabe-se igualmente que os receptores REar e RE0 têm sequências de aminoácidos significativamente diferentes no domínio de ligação do ligando e nos domínios de transactivação carboxi-terminais (cerca de 56% de identidade de aminoácidos), e apenas 20% de homologia no seu domínio de transactivação amino-terminal. Isto explica o motivo pelo qual alguns ligandos têm uma afinidade mais elevada para um receptor do que para outro. Para além disso, a interacção com co-factores pode resultar em acções biológicas de um único ligando muito diferentes. Por outras palavras, um ligando que actue como agonista sobre o REar não é necessariamente também um agonista do REβ, e vice-versa.

Adicionalmente, sabe-se actualmente que os estrogénios modulam a farmacologia celular através da expressão génica, e que o efeito dos estrogénios é mediado pelos receptores de estrogénio. 0 efeito do receptor de estrogénio sobre a regulação génica pode ser mediado por uma ligação directa do RE ao elemento de resposta aos estrogénios, uma ligação do RE a outros factores de transcrição, como o NF-kB, C/EBP/3 e através de efeitos não genómicos envolvendo os receptores de canais iónicos. O progresso dos últimos anos demonstrou que o RE se associa com co-activadores (e. g., SRC-1, CBP e SRA) e co-repressores (e. g., SMRT e N-CoR) , que também modulam a actividade de transcrição do RE de uma 10 forma especifica de tecido e especifica de ligando. Para além disso, há provas que sugerem actualmente que a maioria dos genes regulados pelos estrogénios não possui um elemento clássico de resposta aos estrogénios. Nestes casos, o RE interage com os factores críticos de transcrição para a regulação destes genes. Entre os factores de transcrição que sabemos serem modulados na sua actividade pelo RE incluem-se, por exemplo, ΆΡ-1, NF-kB, C/EBP e Sp-1.

Dada a complexidade da sinalização dos RE, bem como dos vários tipos de tecidos que expressam os RE e os seus co-factores, acredita-se geralmente que os ligandos dos RE já não podem ser apenas classificados como antagonistas ou agonistas puros. Este ponto de vista é legitimado pelas descobertas de Paech et ai. (Science, 1997, 277, 1508- 1510), que deram conta de que o 17 β-estradiol activa um sítio AP-1 na presença do RE ar, mas inibe o mesmo sítio na presença de REjS. Em contraste, os ligandos de RE raloxifeno (Eli Lilly & Co.) e tamoxifeno e ICI-182,780 (Zeneca Pharmaceuticals) estimulam o sítio AP-1 através do RE0, mas inibem este sítio na presença do REcr.

Sabe-se que os REcr e RE/3 possuem distribuições tecidulares quer sobreponíveis, quer diferentes, tal como analisado predominantemente por PCR-RT ou hibridização in si tu. Os tecidos expressam muito f requent emente quer o RE ar quer o REp, mas os receptores estão localizados em tipos celulares diferentes. Para além disso, alguns tecidos, (como o rim) contêm exclusivamente RE a, enquanto outros tecidos (como o útero, a hipófise e o epidídimo) apresentam uma grande predominância de REcr (Couse et al., Endocrinology, 1997, 138, 4613-4621; Kuiper et al., Endocrinology, 1997, 138, 863-870}. O desenvolvimento de ratinhos knockout para REar (Korach, Science, 1994, 266, 1524-1527) e REj8 (Krege et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95, 15677-82) produziu mais provas de que os RE têm diferentes funções em diferentes tecidos. 11

Resumindo, embora os mecanismos pelos quais as presentes substâncias estrogénicas exerçam o seu efeito favorável ainda sejam desconhecidos, é evidente que essas substâncias diferem dos outros estrogénios biogénicos em pelo menos dois aspectos relevantes. Em primeiro lugar, as presentes substâncias estrogénicas apresentam uma semivida in vivo surpreendentemente longa; em segundo lugar, a afinidade dessas substâncias com o receptor REa em comparação com o receptor RE/3 é muito superior à observada para outros estrogénios (biogénicos).

Uma outra propriedade vantajosa das presentes substâncias estrogénicas reside no facto de a globulina transportadora das hormonas sexuais (SHBG) praticamente não se ligar a estas substâncias estrogénicas, o que significa que, ao invés da maioria dos estrogénios conhecidos, os níveis séricos são representativos da sua bioactividade e independentes dos níveis de SHBG.

Um outro importante benefício das presentes substâncias estrogénicas deriva da sua relativa insensibilidade às interacções com outros fármacos (interacções fármaco-fármaco). É por demais sabido que certos fármacos, como o etinilestradiol, podem diminuir a eficácia dos estrogénios e outros fármacos podem amplificar a sua actividade, resultando num possível aumento dos efeitos secundários. Do mesmo modo, os estrogénios podem interferir com o metabolismo de outros fármacos- Em geral, o efeito de outros fármacos sobre os estrogénios deve-se à interferência com a absorção, o metabolismo ou a excreção desses estrogénios, enquanto o efeito dos estrogénios sobre outros fármacos se deve à competição por vias metabólicas. 0 grupo clinícamente mais significativo de interacções estrogénios-fármaco ocorre com fármacos que podem induzir as enzimas microssomais hepáticas, que podem diminuir os níveis plasmáticos dos estrogénios abaixo do nível 12 terapêutico (por exemplo, agentes anticon vulsivantes, como a fenitoina, a primidona, os barbitúricos, a carbamazepina, a etosuximida, e a metosuximida; fármacos tuberculostáticos, como a rifampicina; e fármacos antifúngicos, como a griseofulvina). As presentes substâncias estrogénicas são menos dependentes da regulação crescente e decrescente das enzimas microssomais hepáticas (e. g., do P450) e também são menos sensíveis à competição com outros substratos do P450. Do mesmo modo, as substâncias não interferem significativamente com o metabolismo de outros fármacos.

Os conjugados da maioria dos estrogénios, como formados no fígado, são excretados na bílis e podem ser degradados pelas bactérias intestinais no cólon para libertar a hormona activa, que pode ser reabsorvida (recirculação entero-hepática). Existem relatórios clínicos que provam que a recirculação entero-hepática dos estrogénios diminui nas mulheres que estejam a tomar antibióticos, como a ampicilina, tetraciclina, etc. As formas conjugadas das presentes substâncias estrogénicas não são praticamente excretadas na bílis, o que significa que são substancialmente insensíveis aos fármacos que efectivamente influenciam a recirculação entero-hepática de outros estrogénios.

As observações acima servem para explicar o motivo pelo qual as substâncias estrogénicas da invenção não sofrem praticamente interacções fármaco-fármaco e produzem assim um impacto muito consistente, i. e., previsível.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção diz respeito a um método de tratamento ou prevenção de uma doença mediada pelo sistema imunitário num mamífero, sendo o dito método a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de 13 um componente estrogénico ao mamífero, sendo o componente estrogénico seleccionado a partir do grupo que consiste em: substâncias representadas pela seguinte fórmula

na qual os Ri, R2, R3 e R4 da fórmula são, independentemente, um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; exibindo as referidas substâncias uma configuração 8β, 9α, 10α-Η, 13β, 14α; cada R5, Re e R7 é um grupo hidróxilo; não ma is do que 3 de entre Ri, R2, R3 e R4 são átomos de hidrogénio; precursores com a capacidade de libertar uma substância de acordo com a fórmula supracitada quando utilizados no presente método; e misturas de uma ou mais das substâncias supracitadas e/ou dos precursores.

As substâncias estrogénicas são distintas quer dos estrogénios sintéticos, quer dos biogénicos que são vulgarmente aplicados em formulações farmacológicas no facto de conterem pelo menos 4 grupos hidróxilo. As presentes substâncias são particularmente especiais pelo facto de o anel de 5 membros no esqueleto esteróide compreender 3 substituintes hidróxilo em vez de 0 a 2. Exemplos de estrogénios disponíveis comercialmente que contenham pelo menos 4 grupos hidróxilo e os seus precursores são: Éter 1,3, 5 (10) -estratrieno-2, 3,15a, 16a, 17/3-pentol 2- metílíco 14 Éter 1,3,5(10)-estratrieno-2,3,150,16α, 17/3-pentol 2- metílico 1,3,5 (10) -estratrieno-2,3,16a, 17/3-tetrol Éter 1,3, 5 (10) -estratríeno-3, 4,16a, 17/3-tetrol 4-metílico 1, 3, 5 (10) -estratrieno-3,15a, 16a, 17j8-tetrol

Tetra acetato de 1,3,5(10) -estratrieno-3,15a, 16a, 17/3-tetrol

Tetra acetato de 1,3,5 (10) -estratrieno-3,15/3,16/3,17/3-tetrol

Preferencialmente, o componente estrogénico aplicado como componente activo na presente composição é um chamado estrogénio biogénico, i. e., um estrogénio que ocorre naturalmente no organismo humano, um precursor de um estrogénio biogénico ou uma mistura derivada destes. Uma vez que os estrogénios biogénicos estão naturalmente presentes nos organismos fetal e feminino, não se espera que ocorram efeitos secundários, particularmente se os níveis séricos resultantes da administração exógena destes estrogénios não excederem substancialmente as concentrações que ocorrem naturalmente. Os componentes estrogénicos que ocorrem naturalmente apresentam geralmente uma configuração 8β, 9α, 13/3, 14a do esqueleto esteróide.

Num modo de realização preferencial da presente invenção, a substância estrogénica contém 4 grupos hidróxilo. Adicionalmente, na fórmula supracitada, Ri representa preferencialmente um átomo de hidrogénio. Na referida fórmula, preferencialmente pelo menos 2 e com maior preferência pelo menos 3 dos grupos Rx, R2, R3 e R4 representam um átomo de hidrogénio.

As substâncias estrogénicas de acordo com a fórmula compreendem vários enantiómeros, visto que os átomos de 15 carbono que têm os substituintes hidróxilo R5, Rg e R? são quiralmente activos. Num modo de realização preferencial, a presente substância estrogénica é um ISa-hidróxi-substituído. Num outro modo de realização preferencial, a substância é um 16a-hidróxi-substituido. Ainda num outro modo de realização preferencial, a substância é um 17β-hidróxi-substituído. As substâncias estrogénicas mais preferidas são 15a,16a,17β-tri-hidróxi-substituídos.

Num modo de realização preferencial da presente invenção, Ra representa um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi. Num outro modo de realização preferencial, os grupos Ri, R2 e R4 representam átomos de hidrogénio, em cujo caso, se R3, R5, Re e R7 forem grupos hidróxilo, a substância é o 1,3,5(10)-estratrieno-3,15,16,17-tetrol. Um isómero preferencial desta última substância é o 1,3,5 (10)-estratrieno-3, 15a,16a,17p-tetrol (estetrol). A invenção também compreende a utilização de precursores das substâncias estrogénicas que constituem o componente activo no presente método. Estes precursores têm a capacidade de libertar as substâncias estrogénicas supracitadas, quando utilizados no presente método, e. g. , como resultado de conversão metabólica, e são selecclonados a partir do grupo de derivados das presentes substâncias estrogénicas, em que o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo foi substituído por um radical acílo de um hidrocarboneto carboxílico, ácido sulfónico ou ácido sulfâmico de 1 a 25 átomos de carbono; tetra-hidrofuranilo; tetra-hidropiranilo; ou um resíduo glicosídico de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 20 unidades glicosídícas por resíduo. Exemplos típicos de precursores que podem ser adequadamente utilizados de acordo com a invenção são os ésteres que podem ser obtidos através da reacção dos grupos hidróxilo das substâncias estrogénicas com substâncias que contenham um ou mais grupos carbóxi (MT~00C~), nos quais representa um hidrogénio ou um catíão de metal alcalino. Deste modo, num modo de realização particularmente 16 preferencial, os precursores são derivados das substâncias estrogénicas, nas quais o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxílo na referida fórmula foi substituído por -CO-R, em que R é um radical de hidrocarboneto compreendendo de 1 a 25 átomos de carbono. R é, preferencialmente, hidrogénio, ou um radical alquilo, alcenilo ou arilo compreendendo de 1 a 20 átomos de carbono. 0 presente método é particularmente eficaz quando utilizado no tratamento ou prevenção de doenças crónicas mediadas pelo· sistema imunitário. Consequentemente, num modo de realização preferenciai, o método compreende a administração ininterrupta do componente estrogénico durante um período de pelo menos cinco dias, preferencialmente de pelo menos 30 dias. 0 presente método pode empregar adequadamente a administração entérica ou parentérica do componente estrogénico. A expressão «administração parentérica», tal como utilizada aqui, compreende a administração transdérmica, intravenosa, intranasal, intravaginal, pulmonar, bucal, subcutânea, intramuscular e íntra-uterina. A expressão· «administração entérica» inclui a administração oral, assim como a rectal.

Preferencialmente, o modo de administração é seleccionado a partir do grupo que consiste na administração transdérmica, intravenosa, intranasal, intravaginal, pulmonar, rectal, bucal, subcutânea, intramuscular ou intra-uterina. Com maior preferência, o modo de administração é seleccionado a partir do grupo que consiste na administração oral, transdérmica, intravenosa, subcutânea, intranasal, pulmonar e vaginal. Num modo de realização particularmente preferencial, o presente método utiliza a administração oral, transdérmica, intranasal ou subcutânea. Com ainda maior preferência, o presente método utiliza a administração oral ou subcutânea. 17

As administrações orai, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal, rectal, bucal e pulmonar são idealmente adequadas para {pelo menos) uma administração diária. A administração transdérmica é vantaj osamente aplicada em frequências entre uma vez por dia e uma vez por mês. As administrações intravaginal e intra-uterina são vantajosamente utilizadas em frequências de administração entre uma. vez por semana e uma vez por mês. As administrações subcutânea e intramuscular são também adequadamente realizadas sob a forma de injecções depot em intervalos de uma semana a seis meses, preferencialmente em intervalos de quatro semanas a três meses.

Por razões de conveniência, o presente método utiliza preferencialmente intervalos de administração de um dia, uma semana ou um mês. Os regimes que empregam as administrações oral, subcutânea, intravenosa ou intranasal uma vez por dia, a administração transdérmica semanal, ou a administração intravaginal ou subcutânea mensal são particularmente preferidos.

Independentemente do modo de administração, o componente estrogénico é preferencialmente administrado numa quantidade eficaz para atingir uma concentração sérica de pelo menos 5 nanogramas por litro, com maior preferência de pelo menos 50 nanogramas por litro, e a preferida acima de todas é de pelo menos 500 nanogramas por litro. Geralmente a concentração sérica do componente estrogénico resultante não excede os 200 pg por litro, preferencialmente não excederá os 10 pg por litro, com maior preferência não excederá os 50 pg por litro.

De acordo com o presente método, o componente estrogénico é geralmente administrado numa quantidade de menos de 2 mg por kg de peso corporal por dia, preferencialmente de menos de 0,8 mg por kg de peso corporal por dia. Para atingir um impacto significativo da administração do componente 18 estrogénico, é aconselhável a sua administraçao numa quantidade de pelo menos 5 pg por kg de peso corporal por dia. Preferencialmente, a quantidade administrada é de pelo menos 25 pg por kg de peso corporal por dia. A administração oral do componente activo é preferencialmente realizada numa quantidade de menos de 800 pg por kg de peso corporal por dia, preferencialmente de menos de 400 pg por kg de peso corporal por dia. Para atingir um impacto significativo da administração do componente activo, é aconselhável a sua administração oral numa quantidade de pelo menos 10 pg por kg de peso corporal por dia. Preferencialmente, a quantidade administrada oralmente é de pelo menos 25 pg por kg de peso corporal por dia. No presente método, particularmente quando utilizado em humanos, o componente estrogénico é geralmente administrado numa dosagem média de pelo menos 0,25 mg por dia, preferencialmente de pelo menos 0,5 mg por dia. A dosagem máxima é normalmente mantida abaixo dos 80 mg por dia, preferencialmente abaixo dos 40 mg por dia. 0 presente método de tratamento compreende preferencialmente a administração de uma quantidade eficaz do componente estrogénico a uma pessoa que necessite de uma terapêutica deste tipo. As quantidades necessárias para serem eficazes irão diferir de indivíduo para indivíduo e são determinadas por factores, como o nível de deficiência em estrogénios desse indivíduo, o peso corporal, a via de administração e a eficácia da substância estrogénica particular utilizada.

No presente método, particularmente quando utilizado em humanos, o componente estrogénico é geralmente administrado oralmente numa dosagem média entre 0,05 e 40 mg por dia, preferencialmente entre 0,25 e 20 mg por dia. Do mesmo modo, as dosagens parentéricas são preferencialmente de pelo menos 0,25, preferencialmente de pelo menos 0,5 mg por dia. A dosagem parentérica média máxima é normalmente 19 mantida abaixo dos 80 mg por dia, preferencialmente abaixo dos 40 mg por dia.

Num modo de realização particularmente preferencial da invenção, o método emprega a administração oral do componente activo estrogénico. A expressão «administração oral», tal como utilizada aqui, também compreende a administração por gavagem oral. Os inventores descobriram, surpreendentemente, que, apesar da sua baixa potência, o estetrol e as substâncias estrogénicas relacionadas podem ser vantaj osamente administrados oralmente. Embora os inventores não desejem ficar restringidos pela teoria, pensa-se que a eficácia inesperada das substâncias semelhantes ao estetrol administradas oralmente resulta da combinação de propriedades farmacocinéticas (ADME) e farmacodinâmicas especiais destas substâncias.

Os inventores descobriram que a biodisponibi1idade oral das substâncias semelhantes ao estetrol é surpreendentemente elevada e que a sua semivida in vivo é consideravelmente mais longa do que a os estrogénios biogénicos vulgarmente utilizados. Deste modo, muito embora tenham uma potência estrogénica relativamente baixa, o estetrol e as substâncias semelhantes ao estetrol podem ser eficazmente administrados oralmente.

Uma outra importante vantagem da administração oral do estetrol e das substâncias semelhantes ao estetrol reside no facto de os efeitos hepáticos destas substâncias serem considerados mínimos, visto que elas praticamente não são metabolizadas durante a chamada «primeira passagem». O efeito de primeira passagem dos fármacos administrados oralmente refere-se ao processo da degradação do fármaco pelo fígado durante uma transição do fármaco a partir da ingestão inicial até à circulação na corrente sanguínea. Após a absorção a partir do lúmen intestinal, os ingredientes activos administrados oralmente entram no organismo através do fígado. Este facto é especialmente 20 importante para os agentes estrogénicos, uma vez que o figado é um órgão-alvo para os estrogénios; a administração oral de estrogénios resulta em fortes efeitos estrogénicos no figado. Doses terapeuticamente equivalentes de estrogénios biogénicos vulgarmente utilizados, quando administradas oralmente, resultam em respostas claras dos parâmetros hepáticos, como o aumento da SHBG, CBG, do angiotensinogénio e da HDL (lipoproteína de alta densidade). 0 presente método pode ser convenientemente utilizado no tratamento (profiláctico) de uma vasta gama de doenças mediadas pelo sistema imunitário. A expressão «doença mediada pelo sistema imunitário», tal como é utilizada aqui, refere-se a qualquer reacção ou doença imunológica indesejável mediada, ou parcialmente mediada, por uma célula da linhagem linfóide (incluindo os linfócitos T e os linfócitos B) ou da linhagem mielóide (incluindo os granulócitos, macrófagos e monócitos) e que seja prejudicial para o mamífero em que ocorre. Estas reacções ou doenças imunológicas indesejáveis podem ser mediadas por linfócitos T ou multifactoriais, e. g., doenças inflamatórias crónicas, incluindo doenças auto-imunes, doenças imunológicas induzidas por agentes infecciosos, reacções imunológicas induzidas por ou contra enxertos, respostas atópicas, reacções alérgicas e doenças imunoproliferativas. 0 presente método é particularmente adequado para o tratamento de doenças mediadas pelos linfócitos T e/ou doenças inflamatórias crónicas, incluindo, mas não se limitando a, doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla, a artrite reumatóide, a osteoartrose, a diabetes insulíno-dependente (diabetes tipo I), o lúpus eritematoso sistémico e a psoríase, doenças imunológicas induzidas por agentes infecciosos, como infecções helmínticas (e. g., leishmaníase) e certas infecções virais, incluindo o VIH, e infecções bacterianas, incluindo a doença de Lyme, a 22 doenças auto-imunes e respostas inflamatórias crónicas. Exemplos de doenças auto-imunes que podem ser eficazmente tratadas incluem a esclerose múltipla (células nervosas), a artrite reumatóide (cartilagem, revestimento articular), osteoartrose (cartilagem), diabetes tipo I (pâncreas), lúpus eritematoso sistémico (múltiplos tecidos), psoriase (peie), doença de Alzheimer (sistema nervoso central), miastenia gravis (j unção neuromuscular), doença de Crohn (intestino), epididimite (epidídimo), glomerulonefrite (rins), doença de Graves (tiroideia), síndrome de Guillain-Barré (células nervosas), tiroidite de Hashimoto (tiroideia), anemia hemolitica (eritrócitos), pênfigo (primariamente a pele), febre reumática (coração e articulações), sarcoidose (múltiplos tecidos e órgãos), dermatomiosite (múltiplos tecidos e órgãos) esclerodermia (pele e tecidos conjuntivos), síndrome de Sjõgren (glândulas exócrinas e outros tecidos), espondilartropatias (esqueleto axial e outros tecidos), tiroidite (tiroideia), vasculite (vasos sanguíneos), vitiligo (pele), doença de Addison (glândula supra-renal). Exemplos de respostas inflamatórias crónicas que podem ser adequadamente tratadas com o presente método incluem respostas inflamatórias associadas a doenças cardiovasculares, doença coronária, cirrose, artrites, colestase, tuberculose, lepra, sífilis, periodontite, fíbrose, glomerulonefrite e certos cancros, ássim como respostas inflamatórias crónicas a agentes infecciosos, como bactérias, vírus, fungos, protozoários, helmintas e príões. 0 método da invenção é considerado particularmente adequado para o tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário que resultam em doenças neurológicas, e, g., esclerose múltipla, doença de Alzheimer, miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, esclerose lateral amiotrófica. 0 presente método é também considerado muito adequado para o tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunitário que resultam em doenças do foro musculo-esquelético, e. g. 23 ,artrite reumatóide, osteoartrose, e doenças articulares inflamatórias relacionadas, compreendendo a gota, espondiloartropatias, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artropatia psoriásica, espondilite enteropática, artropatia juvenil ou espondilite anquilosante juvenil, artropatia reactiva, artrite infecciosa ou pós-infecciosa, artrite gonocócica, artrite tuberculosa, artrite virai, artrite fúngica, artrite sifilitica, doença de Lyme, artrite associada a «síndromes vasculiticas», poliarterite nodosa, vasculite de hipersensibilidade, granulomatose de Luegenec, polimialgia reumática, arterite de células gigantes, artropatias por deposição de cristais de cálcio, pseudogota, reumatismo não articular, bursite, tenosinovite, epicondilite, síndrome do canal cárpico, lesão por uso repetitivo, formas miscelâneas de artrite, doença articular neuropática (articulação de Charcot), hemartrose (hemartrósica), Púrpura de Henoch-Schõnlein, osteoartropatia hipertrófica, reticulo-histiocitose multicêntrica, artrite associada a certas doenças, como escoliose, hemocromatose, drepanoc i t o s e e outras hemoglobinopatias, hiperlipoproteinémia, hipogamaglobulinémia, hiperparatiroidismo, acromegália, febre mediterrânea familiar, doença de Behçet, lúpus eritematoso sistémico, ou policondrite recorrente. 0 método da invenção é considerado particularmente vantajoso quando utilizado no tratamento (profiláctico) de uma doença mediada pelo sistema imunitário seleccíonada a partir do grupo constituído por esclerose múltipla, artrite reumatóide, osteoartrose, diabetes insulino-dependente (diabetes tipo I), lúpus eritematoso sistémico e psoríase. 0 presente método é empregue com maior vantagem no tratamento da esclerose múltipla, artrite reumatóide ou osteoartrose.

Por forma a reforçar a acção do componente estrogénico, pode ser vantajosa a co-administração de um agente imunoterapêutico, que tenha a capacidade de inibir profiláctica ou terapeuticamente uma resposta imunológica 24 e/ou atenuar uma doença imunológica. Estes agentes são conhecidos na arte e compreendem agentes imunossupressores, imunomoduladores, imunobloqueantes e/ou anti-inflamatórios e podem ser administrados em combinação com o componente estrogénico, i. e., numa única forma dosagem unitária, ou, em alternativa, administrados em separado, especialmente se os modos de administração forem diferentes.

Num modo de realização especifico, o componente estrogénico da presente invenção é administrado em combinação com um ou mais fármacos imunoterapêuticos a um mamífero que sofra de ou que esteja susceptível à esclerose múltipla. A administração do componente estrogénico da presente invenção em combinação com um ou mais fármacos imunoterapêuticos pode amplificar a eficácia do tratamento. Adicionalmente, uma combinação deste género pode gerar menos efeitos secundários, ou menos pronunciados, e/ou pode tornar possível a administração de uma dose inferior do conhecido fármaco imunoterapêutico ou componente estrogénico, por forma a produzir o mesmo efeito que uma dose substancialmente superior de cada componente isolado. 0 fármaco imunoterapêutico para utilização no tratamento da esclerose múltipla pode ser adequadamente: (1) um agente antí-inflamatório esteróide, como o cortisol ou a dexametasona; (2) um agente anti-inflamatório não esteróide, como o ácido acetilsalicílico (aspirina), íbuprofeno, ou naproxeno; (3) D-pencilamina; (4) um agente 4-aminoquinolina, como a hidroxicloroquina; (5) a azatioprina; (6) o metotrexato; (7) a ciclosporina; (8) anticorpos monoclonais contra os linfócitos T; (9) anticorpos monoclonais contra moléculas de adesão; (10) anticorpos monoclonais contra cítoquinas e factores de crescimento; (11) IgG contra o receptor do factor de necrose tumoral (TNFR); (12) antagonistas do receptor da IL-1; (13) inibidores da ICE; (14) interferão beta e/ou (15) vitamina D, la,25-di-hidroxivitamina D3 e la,25-di-hidroxi vitamina D2, (16) agentes que se ligam especificamente a uma molécula seleccionada a partir do 25 grupo que consiste num receptor de células T, um antigénio e uma molécula HLA.

Num outro modo de realização especifico, o componente estrogénico da presente invenção é administrado em combinação com um ou mais fármacos imunoterapêuticos a um mamífero que sofra de ou que esteja susceptivel à artrite reumatóide. A administração do componente estrogénico da presente invenção em combinação com um ou mais fármacos imunoterapêuticos pode amplificar a eficácia do tratamento das doenças articulares, como a artrite reumatóide e a osteoartrose. Adicionalmente, uma combinação deste género pode proporcionar menos efeitos secundários, e/ou permitir a administração de uma dose inferior do fármaco imunoterapêutico ou do componente estrogénico, produzindo concomitantemente o mesmo efeito que uma dose substancialmente superior de cada componente isolado. O fármaco imunoterapêutico para utilização no tratamento da artrite reumatóide pode ser: (1) um agente anti- inflamatório esteróide, como o cortisol ou a dexametasona (2) um agente anti-inflamatório não esteróide, como o ácido acetilsalicílico (aspirina), ibuprofeno, ou naproxeno; (3) um derivado orgânico do ouro, como aurotiomalato de sódio, a aurotioglucose, ou a auranofina; (4) D-penci11amina; (5) um agente 4-aminoquinolina, tal como a hidroxicloroquina; (6) a azatioprina; (7) o metotrexato; (8) a ciclosporina; (9) um inibidor da angiogénese, como o AGM-1470 (Ingber et al., Nature, 1990, 348, 555); (10) anticorpos monoclonais contra os linfócitos T; (11) anticorpos monoclonais contra moléculas de adesão; (12) anticorpos monoclonais contra citoquinas e factores de crescimento; (13) IgG contra o receptor do factor de necrose tumoral (TNFR); (14) antagonistas do receptor da IL-1; (15) inibidores da ICE, e/ou (16) agentes que se ligam especif icamente a uma molécula seleccionada a partir do grupo que consiste num receptor de células T, um antigénio e uma molécula HLA. 26

Num outro modo de realização preferencial da invenção, o presente método compreende a co-administração de um progestagénio, particularmente caso o método seja empregue no tratamento de mamíferos fêmea. A administração de estrogénios foi associada com a proliferação do endométrio em mulheres, sendo hoje largamente aceite que a administração «não contraposta» de estrogénios durante um período de tempo prolongado {terapêutica estrogénica) aumenta substancialmente o risco de carcinoma do endométrio (Cushing et al., Obstet. Gynecol., 1998, 91, 35-39; Tavani et al., Drugs Aging, 1999, 14, 347-357). Existem também provas de um aumento significativo no carcinoma da mama com a utilização a longo prazo (10 a 15 anos) de terapêutica estrogénica (Tavani et al., Drugs Aging, 1999, 14, 347-357; Pike et al., Steroids, 2000, 65, 659-664).

Por forma a contrabalançar os efeitos negativos da utilização prolongada de terapêutica estrogénica não contraposta, o tratamento com progestagénio adjuvante é hoje em dia vulgarmente aplicado na terapêutica hormonal de substituição em mulheres peri- e pós-menopáusicas. Pensa-se que a administração regular de progestagénios inibe a estimulação continua do endométrio pelos estrogénios através de um efeito antiproliferativo e parece reduzir a incidência de carcinoma do endométrio em mulheres pós-menopáusicas em terapêutica estrogénica de substituição (Beral et al., J. Epidemiol. Biostat., 1999, 4, 191-210).

Por forma a contrabalançar quaisquer potenciais efeitos negativos da administração de estrogénios não contraposta, no presente método, particularmente no caso de administração contínua prolongada, é preferível a co-adminis tração de um componente progestagénico para inibir a estimulação estrogénica do endométrio ou administrar um componente progestagénico, pelo menos durante um período de dez dias, pelo menos a cada três meses.

Um outro aspecto da invenção diz respeito a uma formulação farmacológica que compreende o componente estrogénico e o 27 agente imunoterapêutíco, tal como definido anteriormente, e um excipiente farmacologicamente aceitável. A presente formulação farmacológica contém preferencialmente pelo menos 10 pg do componente estrogénico, com maior preferência pelo menos 25 pg do referido componente estrogénico. Com ainda maior preferência a quantidade do componente estrogénico presente na formulação é de pelo menos 50 pg, sendo o preferido acima de todos de pelo menos 150 pg. A quantidade do componente estrogénico presente na formulação não excederá normalmente os 1000 mg. Preferencialmente, a quantidade não excederá os 600 mg, e com maior preferência não excederá os 400 mg. O agente imunoterapêutico está convenientemente presente na formulação numa quantidade de pelo menos 1 pg, preferencialmente de pelo menos 10 pg. Geralmente a quantidade do agente imunoterapêutíco presente na formulação não excederá os 50 mg, preferencialmente não excederá os 25 mg. A formulação farmacêutica de acordo com a invenção pode ser adequadamente uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, como comprimidos, cápsulas, hóstias, microgranulados, pastilhas, pós e grânulos, bem como formas de dosagem fluidas, como soluções, emulsões, suspensões, pomadas, pastas, cremes, géis, geleias e espumas. A forma unitária de dosagem oral de acordo com a invenção é preferencialmente uma forma de dosagem sólida ou semi-sólida, como comprimidos, cápsulas, hóstias, microgranulados, pastilhas, pós e grânulos. a expressão «forma de dosagem sólida ou semi-sólida» também compreende cápsulas que contenham um líquido, e. g., um óleo, no qual o presente componente estrogénico está dissolvido ou disperso. Os comprimidos e as formas de dosagem sólida e semi-sólida equivalentes podem convenientemente conter materiais como aglomerantes (e. g. , hidroxipropilmetil" celulose, polivinilpirrolidina, outros materiais 28 celulósicos e amido), diluentes (e. g., lactose e outros glícidos, amido, fosfato dicálcico e materiais celulósicos), agentes desintegrantes (e. g., polímeros de amido e materiais celulósicos) e agentes lubrificantes (e. g. , estearatos e talco).

Os sistemas de administração transdérmica incluem adesivos, géis, pensos e cremes, e podem conter excipientes, como solubilizantes, facilitadores da permeabilidade (e. g. , ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos e aminoácidos), polímeros hidrofílicos (e. g., policarbofilo e polivinilpirrolidina) e adesivos e aglutinantes (e. g., poli-isobutilenos, adesivos baseados em silicone, acrilatos e polibuteno).

Os sistemas de administração transmucosa (sobretudo rectal e intravaginal) incluem adesivos, comprimidos, supositórios, pessários, géis, e cremes, e podem conter excipientes, como solubilizantes e facilitadores (e. g., propileno-glicol, saís biliares e aminoácidos), e outros excepientes (e. g., polietileno glicol, ésteres de ácidos gordos e derivados, e polímeros hidrofílicos, tais como a hidroxipropilmetil-celulose e o ácido hialurónico).

As preparações depot injectáveis ou implantáveis incluem fluidos injectáveis e comprimidos para implante. Os componentes fluídos transportadores adequados são diluentes fisiologicamente compatíveis, nos quais os agentes activos podem ser dissolvidos, suspensos. Um exemplo de um diluente é a água, com ou sem a adição de sais electrólitos ou espessantes. Deste modo, a formulação depot pode ser, por exemplo, uma suspensão aquosa microcristalina. Os óleos são particularmente adequados como diluentes, com ou sem a adição de um solubilizante, de um surfactante, ou de uma suspensão ou agente emulsionante. Exemplos de óleos adequados incluem óleo de aráquide, azeite, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de soja, óleo de rícino, e óleo de sésamo. Exemplos de solubilizantes 29 incluem o álcool benzilico e o benzoato de benzilo. As preparações depot proporcionam a vantagem de que uma única injecção ou um único implante são suficientes para um ou mais meses. A duração do efeito do depot depende da natureza do componente estrogénico (os precursores ésteres são preferidos, na medida em que apresentam uma libertação mais lenta) , a quantidade do componente estrogénico, bem como o tipo de substância transportadora que liberta o agente activo. Geralmente, a duração oscilará entre 10 a 30 dias, mas podem ser atingidos tempos mais curtos ou mais longos.

Outros sistemas de administração que podem ser utilizados para administrar a composição farmacológica da invenção incluem sistemas de administração intranasal e pulmonar, como sprays e micropartículas.

Um outro aspecto da presente invenção, particularmente preferido, diz respeito a uma forma de dosagem oral unitária compreendendo pelo menos 50 pg, preferencialmente pelo menos 250 pg do componente estrogénico, e pelo menos 1 pg de um agente imunoterapêutico, tal como definido anteriormente, e um excipiente farmacologicamente aceitável. A presente invenção é ulteriormente ilustrada através dos seguintes exemplos, que, no entanto, não devem ser considerados como limitativos. As caracteristicas apresentadas na descrição anterior, nos seguintes exemplos e nas reivindicações podem, quer separadamente, quer em qualquer combinação entre si, constituir material para a realização, em diversas formas, da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 30 A cornificação vaginal foi seleccíonada como um objectivo específico de tecido e sensível aos estrogénios para determinar a estrogenicidade do estetrol (E4), após a administração oral ou subcutânea, em ratazanas corri hipoestrogenismo. O 17cr-etinilestradiol (EE), o 17/3-estradíol (E2) e o excepiente (10% etanol/ óleo de sésamo) serviram como controlo nestes ensaios. 0 aumento da massa uterina na ratazana é normalmente mais utilizado para medir a estrogenicidade. No entanto, a massa uterina também responde à progesterona, testosterona, e a outros agentes nâo caracteristicamente considerados como estrogénios. No início dos anos 20 descobriu-se que o fluído folicular do ovário de porca continha um (uns.) factor(es) que causava(m) a cornifícação/queratinização do epitélio vaginal na ratazana (Allen e Doisy, JAMA, 1923, 81, 819-821; Allen e Doisy, Am. J. Physiol., 1924, 69, 577-588) . A chamada resposta de cornificação vaginal em ratazanas proporcionou subsequentemente um ensaio para o teste de estrogenicidade. A cornificação/queratinização do epitélio vaginal em ratazanas ooforectomizadas pode ser produzida apenas por compostos considerados como verdadeiros estrogénios (Jones et al., Fert. Steril., 1973, 24, 284-291). A cornificação/queratinização do epitélio vaginal representa, portanto, um objectivo altamente selectivo para determinar a potência dos estrogénios (Reel et al., Fund. Ãppli. Toxicol., 1996, 34, 288-305).

Ratazanas CD fêmeas adultas intactas foram ooforectomizadas para induzir uma deficiência em estrogénios. Foram feitas lavagens vaginais diárias durante sete dias para assegurar que as ratazanas apresentavam esfregaços vaginais de tipo castrado (predominância de leucócitos no esfregaço vaginal, e semelhantes em aparência a um esfregaço vaginal em diestro). Os esfregaços vaginais de tipo castrado indicam que a ooforectomia total foi atingida. O tratamento foi iniciado após terem decorrido 7 dias da realização do esfregaço (dia 0 = primeiro dia da dosagem) . Os animais 31 receberam as doses, uma vez por dia durante sete dias consecutivos. As lavagens vaginais diárias continuaram a ser realizadas durante sete dias após a administração das doses ter sido iniciada, por forma a detectar a cornificação vaginal, como indicador da resposta estrogénica. Foi colocada uma gota das lavagens vaginais numa lamina de vidro e examinada por microscopia óptica para detectar a presença ou ausência de células epitelíais cornifiçadas. As lavagens vaginais foram obtidas antes das doses nos dias 0-8 e e antes da necropsia no dia 7. A análise da cornificação vaginal foi realizada por forma a determinar o perfil estrogénico do E4 quando administrado por via subcutânea (sc) a ratazanas adultas ooforectomizadas. 0 E2 foi utilizado como controlo positivo. O excipiente (10% de etanol/óleo de sésamo) serviu como controlo negativo. Os esteróides foram dissolvidos em etanol absoluto e seguidamente levados até à concentração final com óleo de sésamo (10% de etanol em óleo de sésamo). Ocorreu uma resposta vaginal estrogénica em 8/8 ratazanas no dia 2 e persistiu até ao dia 7 nas ratazanas injectadas sc com 50 pg/kg/dia de E2 durante 7 dias (Tabela 1) . Os animais tratados com excipiente não apresentaram cornificação do epitélio vaginal (Tabela 1). O início da cornificação do epitélio vaginal foi dose- dependente em ratazanas injectadas sc com 0,1, 0,3, 1,0, e 3,0 mg/kg/dia com E4 e iniciou-se no mesmo dia de tratamento (Dia 2), como observado para ο E2 (Tabela 1) . Com 0,1 mg/kg/dia de E4 já 4/8 das ratazanas, e com 0,3 mg/kg/dia de E4, mesmo 7/8 ratazanas apresentaram uma resposta estrogénica vaginal no dia 7. Com 1,0 e 3,0 mg/kg/dia de E4 todas as ratazanas apresentaram uma resposta vaginal estrogénica no dia 7 (Tabela 1).

Tabela 1 - Resposta vaginal estrogénica em ratazanas oof orectomizadas tratadas com 17/3-estradiol (E2) ou estetrol (E4} por via subcutânea (sc). Os dados estão expressos como o número de ratazanas que apresentou 32 cornificação vaginal sobre o número de ratazanas tratadas (razão),

Grupo de tratamento Via de administração Número de ratazanas que apresentaram resposta estrogénica/ número de ratazanas tratadas Dia do estudo Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 0,05 mg/kg/dia de E2 SC 0/8 0/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 Excipiente de controlo SC 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 f\ Λ u, 1 mg/kg/dia de E4 SC 0/8 0/8 0/8 1/8 1/8 4/8 3/8 4/8 0,3 mg/kg/día de E4 SC 0/8 0/8 1/8 5/8 7/8 6/8 7/8 7/8 1,0 mg/kg/dia de E4 SC 0/8 0/8 1/8 6/8 8/8 7/8 8/8 8/8 3, 0 mg/kg/dia de E4 SC 0/8 0/8 3/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8

A análise da cornificação vaginal foi realizada por forma a determinar o perfil estrogénico do E4 quando administrado oralmente (po) a ratazanas adultas ooforectomizadas. O EE foi utilizado como controlo positivo. 0 excipiente (10% de etanol/ óleo de sésamo) foi utilizado como controlo negativo. Os esteróides foram dissolvidos em álcool absoluto e seguidamente levados até à concentração final com óleo de sésamo (10% de etanol em óleo de sésamo) . Ocorreu uma resposta vaginal estrogénica em todas as 33 ratazanas (8/8) às quais foram administrados 50 pg/kg/dia de EE po no dia 7 (Tabela 2). Do mesmo modo, a cornificação do epitélio vaginal foi observada em todas as ratazanas (8/8) tratadas po com quer 0,1, 0,3, 1.0, ou 3,0 mg/kg/dia de E4 no dia 7 (Tabela 2), enquanto os animais tratados com o excipiente não apresentaram cornificação do epitélio vaginal (0/8). Surpreendentemente, mesmo nas ratazanas às quais foram administradas doses relativamente baixas de E4 (e.g. 0,1 mg/kg/dia), o inicio da cornificação vaginal (definido como o número de animais que responderam nos dias 1-3 do estudo) foi mais rápido nos animais tratados po do que nos tratados por via sc, demonstrando as excelentes caracteristicas de biodisponibilídade do estetrol após a administração oral.

Tabela 2 - Resposta vaginal estrogénica em ratazanas ooforectomizadas tratadas com 17a-etinilestradiol (EE) ou estetrol (E4) por via oral (po). Os dados estão expressos como o número de ratazanas que apresentarou cornificação vaginal sobre o número de ratazanas tratadas (razão).

34 de E4 0,3 mg/kg/día de E4 po 0/8 0/8 1/8 7/8 8/8 8/8 8/8 8/8 1,0 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 4/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 3,0 mg/kg/dia de E4 po 0/8 0/8 6/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8

Exemplo 2

Para avaliar a biodisponibilidade oral (po) e subcutânea (sc) do estetrol (E4) e para determinar a semivida de eliminação, foram feitos estudos de dose única em ratazanas Sprague Dawley, seguidos por colheitas de sangue frequentes durante um intervalo de 24 horas.

Foi colocado um catéter cardiaco de silastic permanente nas ratazanas fêmea Sprague Dawley, tal como descrito por Kuipers et al. (Gastroenterology, 1985, 88, 403-411). Deixou-se as ratazanas recuperarem da cirurgia durante 5 dias e foram-lhes, depois, administrados 0,05, 0,5, ou 5 mg/kg de E4 em 0,5 mL de óleo de aráquide. Na administração sc, ο E4 foi injectado na região cervical, utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 20 g. Para a administração po do E4, as ratazanas foram levemente anestesiadas com halotano/N20/02 e ο E4 foi directamente administrado intragastricamente, utilizando uma sonda gástrica de plástico. As amostras de sangue foram subsequentemente colhidas através do catéter cardiaco em tubos heparinizados às 0,5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas. Os eritrócitos foram removidos por centrifugação a 5000 xg durante 10 minutos a 4 °C e o plasma sanguíneo foi armazenado a -20 °C. Após a fusão das amostras de plasma, foi empregue a extracção líquido-líquido (hexano e éter dietílico) para preparar o 35 plasma contendo E4 em amostras para análise por HPLC (Perkin Elmer 200) e espectrometria de massa em tandem utilizando um espectrómetro de massa em tandem PE Sciex 3000 e uma interface APCI. Foi registada uma curva de calibração com 6 calibradores em cada lote da amostra. A curva de calibração foi calculada utilizando uma regressão linear (coeficiente de correlação >0,98), que permitiu a quantificação das concentrações plasmáticas. Os dados foram registados para cada plasma de ratazana, amostrado em diferentes intervalos de tempo.

Os dados da concentração plasmática de E4 foram analisados com WinNonLin, edição 3.1, e envolveram parâmetros farmacocinéticos para Cmax, semivida e AUC 0-24. Especialmente quando foram utilizados os níveis de dose mais baixos e intermédios de 0,05, 0,5 mg/kg, ο E4 demonstrou uma biodisponibilidade oral igual à biodisponibilidade obtida com a administração sc (80-100%). Com a maior dose testada, 5,0 mg/kg de E4, a cinética de absorção originou uma biodisponibilidade oral de aproximadamente 30-60% do E4 administrado por via sc. Curiosamente, ο E4 demonstrou uma semivida relativamente longa de 2 a 3 horas, permitindo a detecção de níveis bioactivos de E4 não conjugado em todos os pontos de tempo num intervalo de 24 horas nas experiências de administração sc e po.

Exemplo 3

Para determinar a biodisponibilidade e semivida de eliminação do estetrol após a administração oral em humanos, foi realizado um estudo com uma dose única crescente em voluntárias saudáveis pós-menopáusicas. Administrou-se aleatoriamente 0,1, 1 ou 10 mg de estetrol às voluntárias (n = 6) e colheram-se amostras de sangue (18 por voluntária) durante um período de 72 horas. 36

Após a fusão das amostras de plasma, foi empregue uma extracção líquido-líquido (hexano e éter dietílico) para preparar as amostras de plasma contendo estetrol para análise por HPLC (Perlin Elmer 200) e espectroscopia de massa em tandem utilizando um espectrómetro de massa em tandem PE Sciex 4000 e uma interface APCI. Com cada lote de amostras, foi registada uma curva de calibração com 6 calibradores. A curva de calibração foi calculada utilizando uma regressão linear (coeficiente de correlação >0,98), que permitiu a quantificação das concentrações plasmáticas.

Foi observada uma boa tolerância quando a dose oral de estetrol foi aumentada de 0,1 para 1 e ulteriormente para 10 mg. Os valores da AUC demonstraram uma boa linearidade de dose, indicando que, ao longo de toda a gama de dosagem, o estetrol oralmente administrado foi bem absorvido. Curiosamente, o estetrol demonstrou uma longa semivida de eliminação de mais de 15 horas, i. e., 15 a 50 horas em sujeitos humanos pós-menopáusicos.

Exemplo 4

Foram utilizadas análises já conhecidas de ligação competitiva de esteróides para determinar a afinidade de ligação relativa do estetrol (E4), quando comparada com o 17cr-etinílestradiol (EE) e o 17^-estradiol (E2) , às formas a- e β- do receptor de estrogénios humano (ER).

0 método empregue foi adaptado a partir da literatura científica e detalhadamente descrito por Osbourn et al. (Biochemistry, 1993, 32, 6229-6236). As proteínas recombinantes humanas REa e ΚΕβ foram purificadas a partir de células Sf 9 transfectadas. As análises in vitro envolveram a utilização de ambas as proteínas REa e ΕΕβ e [3H]E2, a uma concentração fixa de 0,5 nM, como ligando marcado. As proteínas recombinantes humanas REa e ΕΕβ foram dissolvidas num tampão de ligação (10 mM de Tris-HCL, pH 37 7,5, 10% de glicerol, 1 mM de DTT, 1 mg/mL de BSA) e foram, depois, incubadas aliquotas duplicadas com [3H]E2 a uma concentração final de 0,5 nM, em conjunto com um excipiente de controlo (0,4% de DMSO), ou a mesma quantidade de excipiente contendo concentrações crescentes de ligandos de esteróides não marcados, como competidores. Após a incubação durante 2 h a 25 °C, os ligandos livres foram removidos e as quantidades de [3H]E2 ligadas às proteínas de REa ou ΚΕβ foram medidas. As quantidades médias de [3H]E2 ligadas às proteínas de REa ou ΚΕβ em cada concentração do competidor foram utilizadas para realizar as curvas de inibição. Os valores de IC50 foram subsequentemente determinados através de uma análise de regressão não linear, de quadrados mínimos. As constantes de inibição (Ki) foram calculadas utilizando a equação de Cheng e Prusoff (Cheng et ai., Biochem. Pharmacol., 1973, 22, 3099-3108), utilizando a IC50 medida dos compostos testados, a concentração do radioligando empregue na análise, e os valores históricos para o Kd do radioligando, que foram estabelecidos como 0,2 nM e 0,13 nM para o REa e ΚΕβ, respectivamente.

Os resultados da análise bioquímico para E4 estão apresentados como a percentagem de inibição da ligação específica em três experiências distintas (Tabela 3). Para comparação das afinidades de ligação de E4, EE e E2 às proteínas de REa e Κθβ humanas, os valores de Ki experimentalmente observados estão apresentados na Tabela 4. Quando comparado com EE e E2, ο E4 demonstra um perfil de ligação único, com uma forte preferência (400%) para a ligação à proteína REa (Tabela 4). Em contraste, os valores de Ki para a proteína ΚΕβ são mais pronunciados para os ligandos esteróides de EE e E2 (Tabela 4).

Tabela 3 - Percentagem de inibição da ligação especifica às proteínas REa e ΚΕβ utilizando E4 como o ligando esteróide não marcado e 0,5 nM de [3H] como o competidor marcado. São apresentados os resultados de três experiências distintas. 38

Concentração final de E4 Percentagem de inibição da ligação especifica na análise de ligação de esteróides ao REa análise de ligação de esteróides ao REp Teste 1 Teste2 Teste 3 Teste 1 Teste 2 Teste 3 1 μΜ 98 nd nd 87 90 95 0,3 μΜ 92 94 101 74 74 77 0,1 pM 83 85 86 56 54 50 0, 03 pM 64 66 63 19 25 30 10 nM 43 32 28 nd nd nd 3 nM 26 17 11 nd nd nd nd = não determinado

Tabela 4 - Constantes (Ki) de inibição determinadas experimentalmente para o estetrol (E4), 17a-etinilestradiol (EE) e 17/3-estradiol (E2), em relação às proteínas humanas REa e REp proteínas. A preferência relativa para a ligação à proteína REa é também apresentada.

Ligandos esteróides Ki REa (nM) Ki REP (nM) Preferência relativa pelo REa/ REp (%) EE 0,23 0,025 11 E2 0,21 0,015 7 E4 4,9 19 400

Exemplo 5

Foi utilizada uma análise já conhecida de ligação competitiva de esteróides (Hammond e Lahteenmaki, Clin. Chem. Acta, 1983, 132: 101-110) para determinar a afinidade relativa de ligação do estetrol (E4), 17a-etinilestradiol (EE2) , 17/3-estradiol (E2) , testosterona (T) e 5a-di-hídrotestosterona (DHT) à globulina transportadora das hormonas sexuais humana (SHBG). 39 A SHBG humana foi purificada a partir do soro de ratinhos transgénicos, tal como previamente descrito (Awakuiov G V et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 25920-25925) . A SHBG humana preparada desta forma foi aferida como >99% pura por electroforese em gel de poliacrilamida sob condições de desnaturação. As suas caracteristicas de ligação aos esteróides são impossíveis de distinguir da SHBG em soro humano (Avvakumov G. V. et al., J. Biol. Chem., 2000, 275: 25920-25925). A análise in vítro envolveu a utilização da SHBG humana purificada e de [3H] DHT ou [3H] estradiol como ligandos marcados. A SHBG humana foi tratada durante 30 minutos à temperatura ambiente com uma suspensão de carvão revestido por dextrano (DCC) em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para remover qualquer ligando esteróide. Após a centrifugação (a 2000 xg durante 10 minutos) para sedimentar o DCC, o sobrenadante contendo a SHBG humana foi diluído em PBS a uma concentração de 1 nM baseada na sua capacidade de ligação a esteróides.

Foram, depois, incubadas alíquotas duplicadas (100 pL) desta solução de SHBG humana com um volume igual de [3H]DHT ou de [3H]estradiol a 10 nM, em conjunto com 100 pL de PBS isolado ou a mesma quantidade de PBS contendo concentrações crescentes de ligandos esteróides não marcados como competidores, em tubos de ensaio de poliestireno. Após a incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as misturas de reacção foram colocadas num banho gelado durante mais 15 minutos. Foram, depois, adicionadas alíquotas (600 pL) de uma suspensão gelada de DCC a cada tubo, e após uma breve miscigenação de 2 segundos, cada tubo foi incubado num banho gelado durante 10 ou 5 minutos, dependendo se estava a ser utilizado [3H]DHT ou [3H]estradiol como ligando marcado, respectivamente. Os ligandos livres adsorvidos no DCC foram, depois, removidos por centrifugação (2000 xg durante 15 minutos a 4 °C), e a quantidade de ligandos marcados com [3H] ligados à SHBG foi medida em 2 mL de cocktail de cintilação ACS utilizando um 40 espectrofotómetro de cintilação liquida. As quantidades médias de ligandos marcados com [JH] ligados à SHBG em cada concentração do competidor (B) foram expressas como percentagem das quantidades médias de ligandos marcados com [3H] ligados à SHBG na ausência do competidor (BQ) , e foram registadas num gráfico versus a concentração do competidor em cada tubo de ensaio. Os resultados das análises de ligação competitiva estão apresentados na Figura 1.

Figura 1: Deslocação competitiva de [3H]DHT (painel A) e de [3H]estradiol (painel B) a partir do local de ligação da globulina transportadora de hormonas sexuais humana. Os ligandos esteróides não marcados, utilizados como competidores foram os seguintes: estetrol (E4), 17 θ'-et inilestradiol (EE2) , 17/3-estradiol (E2), testosterona (T) e 5a-di-hidrotestosterona (DHT).

Tal como é evidente a partir destas análises de ligação competitiva, o estetrol não se liga de todo à SHBG humana quando testado com a [3H]DHT ou o [3HJ estradiol como ligandos marcados. Isto está em contraste evidente com os esteróides de referência etinilestradiol, 17/3-estradiol, testosterona e 5a-di-hidrotestosterona, os quais, por esta ordem, apresentam uma afinidade relativa de ligação aumentada com a SHBG humana. É importante notar que a ligação do estetrol à SHBG foi desprezável quando comparada com os outros estrogénios testados, etinilestradiol e 17/3-estradiol.

Exemplo 6 A encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é largamente utilizada como um modelo animal para a esclerose múltipla (MS), uma doença caracterizada por processos inflamatórios no sistema nervoso central. Para além do seu valor para identificar uma terapêutica para a esclerose múltipla, é útil como um modelo de inflamação em geral. A vantagem é que a resposta inflamatória está localizada no 41 sistema nervoso central, o que permite a apreciação adequada da magnitude da reacção inflamatória em relação com os sintomas clínicos. Mais ainda, a indução da doença é controlada de uma forma precisa porque é estabelecida pela imunização com uma proteina ou com um péptido sintético. A monitorização clínica dos animais é necessária durante um período não superior a 4 a 6 semanas e é, portanto, possível o rastreio rápido de potenciais compostos anti-inflamatórios. A esclerose múltipla caracteriza-se por uma incapacidade crescente, devido à disrupção da bainha de mielina que rodeia os axónios e pela perda subsequente da condutividade nervosa. As lesões Inflamatórias apresentam um envolvimento de linfócitos e macrófagos, que são responsáveis pela destruição tecidular através da secreção de uma variedade de mediadores inflamatórios. A EAE pode ser induzida em estirpes de animais susceptíveis através da imunização com mielina Intacta ou com proteinas e péptidos derivados da mielina. Nos ratinhos SJL/J a EAE pode ser reproduzivelmente induzida através da imunização subcutânea com um péptido derivado de uma proteina proteolipidica, i. e., PLP139_i51, com adjuvante de Freund completo. Após 3 dias, os ratinhos receberam 109 organismos de Bordetella pertussis (i.v.) destruídos pelo calor para aumentar a permeabilidade da barreira hemato-encefálica. Isto resulta numa actívação especifica de antigénio das células T, que secretam citoquinas pró-inflamatórias, como a linfotoxina e o interferão-γ. Sabe-se que o desenvolvimento da doença compreende dos seguintes acontecimentos: 1. Activação das células T por macrófagos e células dendriticas apresentadoras da PLPi3g_i5i; 2. Elevação da expressão de interleucina-12 em macrófagos e células dendriticas; 42 3. Diferenciação das células T em células efectoras que secretam células pró-inflamatórias e expressam receptores de quimiocinas exclusivos; 4. Aumento da permeabilidade da barreira hemato-encefálica; 5. Migração de células efectoras e monócitos para o parênquima encefálico contra um gradiente de quimiocinas; 6. (Re-)activação de células inflamatórias; 7. Libertação de mediadores da inflamação e destruição de oligodendrocitos e mielína.

Entre 70 e 90% dos ratinhos SJL/J tratados com excipiente desenvolvem geralmente um primeiro episódio de doença entre os dias 10 e 20 após a imunização com PLP139-151. Curiosamente, cerca de 50% dos animais afectados também desenvolvem um segundo episódio de EAE (recaida) entre os dias 28 e 42. O efeito do tratamento oral com estetrol sobre a EAE foi avaliado num desenho de estudo de 42 dias, utilizando a gravidade clinica da EAE (pontuação de incapacidade) como variável dependente. 0 sistema de pontuação clinica que foi desenvolvido por Kono et al. (J. Exp. Med., 1988, 168, 213-227) foi utilizado para monitorizar o grau de incapacidade no modelo de EAE em SJL/J: 0: sem doença; 0,5: parésia da cauda ou paralisia parcial; 1: paralisia completa da cauda; 2: paraparésia, fraqueza muscular de um membro e paralisia da cauda; 2,5: paralisia parcial de um membro; 3: paralisia completa dos membros anteriores ou posteriores; 3,5: paraplegia; 4: quadriplegia, moribundo; 5: morte devida à EAE. Os grupos, que consistiam em 9 a 10 ratinhos fêmea SJL/J, foram tratados uma vez por dia oralmente com quatro dosagens diferentes de estetrol de 3 mg/kg, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,1 mg/kg após a indução da doença por imunização 43 subcutânea com PLP139-151, continuando durante o periodo total de monitorização de 42 dias. Os grupos tratados com excipiente {Cavasol; Hidroxipropil-beta-ciclodextrina) serviram como controlo negativo.

Os ratinhos fêmea SJL/J de 7 semanas de idade foram obtidos em Harlan (France). Antes do inicio do estudo, os ratinhos foram manipulados e aclimatizados durante um periodo de duas semanas e distribuídos pelos grupos de tratamento. Os ratinhos foram imunizados através da injecção subcutânea de 50 pg de um péptido sintético da proteína proteolipídica, i. e., PLPi39_i5i (Isogen Bioscience B.V.), emulsifiçados em adjuvante completo de Freund (CFA, H37Ra Lot. 2116643, Difco Laboratories, USA). A emulsão foi distribuída por quatro sítios nos flancos. No dia 3, os ratinhos receberam uma injecção intravenosa de 109 bactérias de Bordetella pertussis (National Institute for Public Health, Bilthoven, Holanda) . A partir do dia 0 (após a imunização com PLPi39_ 151) em diante, até ao dia 42, os ratinhos foram tratados oralmente (por gavagem) com 0,2 xnL de solução de estetrol ou excipiente (hidroxipropil-beta-ciclodextrina numa solução aquosa a 20% p/vol) de acordo com o seguinte esquema: Grupo A: excipiente (n = 10); Grupo B: estetrol, 3 mg/kg/dia (n = 9); Grupo C: estetrol, 1 mg/kg/dia (n = 10); Grupo D: estetrol, 0,3 mg/kg/dia (n = 10) e Grupo E: estetrol, 0,1 mg/kg/dia (n = 10). Quando necessário, a dosagem foi ajustada ao peso dos animais, que foi determinado diariamente. Foi realizada diariamente a avaliação da incapacidade na EAE, individualmente para cada ratinho. No final do periodo de tratamento e monitorização, os ratinhos foram sacrificados.

As análises estatísticas foram realizadas por análise de variância (ANOVA) para testar o significado das diferenças entre a incapacidade como variável dependente nos grupos de tratamento e no grupo de excipiente. Cada parâmetro que apresentou uma diferença significativa na ANOVA foi subsequentemente testado por um teste post hoc DMS 44 (diferença mínima significativa) para determinar que grupos eram diferentes (P £ 0,05 indicava diferenças estatisticamente significativas; P > 0,05 foi considerado como não significativo). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa de software estatístico SPSS 11.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, 111., EUA). Não foram observados outros sintomas clínicos neste estudo, para além dos relacionados com a EAE, indicando que o estetrol não induziu nenhuns efeitos colaterais significativos. Os ratinhos foram considerados afectados pela EAE quando uma pontuação cumulativa de pelo menos 3 era atingida num período de três dias consecutivos. Em conformidade, 70% dos ratinhos tratados com excipiente desenvolveram EAE (Figura 2). O tratamento com estetrol a 3 mg/kg e 1 mg/kg reduziu a incidência de EAE e resultou em EAE em 40% e 33% dos ratinhos, respectivamente (Figura 2) . De entre os ratinhos tratados com estetrol a 0,3 e 0,1 mg/kg, 80% e 70% desenvolveram EAE, respectivamente. e te J2 te £ c te ® η 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

o σ

Figura 2: Efeito do tratamento com estetrol sobre a incidência de EAE em ratinhos SJL/J. 45

Os sintomas clínicos da EAE tornaram-se aparentes no dia 12 após a imunização nos ratinhos tratados com excipiente. Nos ratinhos tratados com as doses mais elevadas de estetrol (3 e 1 mg/kg) a média do dia de início foi atrasada em 15,7 e 14,7 dias, respectivamente. 0 tratamento com as duas dosagens mais baixas de estetrol (0,3 e 0,1 mg/kg) também apresentou uma tendência para atraso do início da doença, quando comparado com os ratinhos tratados com excipiente, mas não foi estatisticamente significativa.

Avaliou-se, para cada ratinho, a pontuação clínica máxima durante a totalidade do período de monitorização, após o que os dados individuais foram incluídos na média do grupo (Figura 3) . A média da pontuação máxima para os ratinhos tratados com excipiente foi de 1,8 ± 0,3. O tratamento com 3 e 1 mg/kg de estetrol reduziu a média da pontuação máxima de incapacidade e resultou em pontuações de 0,8 ± 0,3 e 0,9 ± 0,3, respectivamente. O tratamento com as duas dosagens mais baixas de estetrol (0,3 e 0,1 mg/kg) não apresentou diferenças estatisticamente significativas quando comparado com os ratinhos tratados com excipiente. Com base na comparação por ANOVA entre os grupos de tratamento e na análise post hoc LSD conclui-se, portanto, que o tratamento oral com estetrol resulta numa redução estatisticamente significativa da pontuação máxima de incapacidade na EAE de uma forma dose-dependente, quando comparada com os ratinhos tratados com excipiente (P = 0,011 e P = 0,021 para estetrol a 3 mg/kg e 1 mg/kg, respectivamente). 46

Figura 3: Efeito do tratamento com estetrol sobre a pontuação clínica máxima na EAE em ratinhos SJL/J. $ P=0,011 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,021 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com o excipiente. & P=0,016 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,029 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com estetrol a 0,3 mg/kg. 0 resultado clínico mais relevante do estudo, i. e., as pontuações cumulativas de incapacidade para os ratinhos individuais estão apresentadas como médias de grupo na Figura 4 para o período total de monitorização (dias 0 a 42) . Quando analisados durante a totalidade do período de tratamento e monitorização, os ratinhos tratados com excipiente desenvolveram uma média cumulativa de EAE de 17,4 ± 5,0, enquanto o tratamento com 3 e 1 mg/kg de estetrol reduziu a pontuação média cumulativa da EAE para 5,8 ± 2,9 e 3,9 ± 1,8, respectivamente (Figura 3). 0 tratamento com as duas dosagens mais baixas de estetrol (0,3 e 0,1 mg/kg) não apresentou diferenças 47 estatisticamente significativas quando comparadas com os ratinhos tratados com excipiente. Com base na comparação por ANOVA entre os grupos de tratamento e a análise post hoc LSD, conclui-se, portanto, que o tratamento oral com estetrol apresenta uma redução estatisticamente significativa da pontuação da incapacidade cumulativa da EAE de uma forma dose-dependente, quando comparada com os ratinhos tratados com excipiente (P = 0,025 e P = 0,012 para estetrol a 3 mg/kg e 1 mg/kg, respectivamente). 25.0

o 111 to + £ m > 3

E

S £ 0 <v 1 0 01 s

V %

Figura 4: Efeito do tratamento com estetrol sobre a pontuação clínica cumulativa na EAE (dias 0 a 42) em ratinhos SJL/J. * P=0,025 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,012 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com o excipiente. # P=0,042 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,022 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com estetrol a 0,3 mg/kg. 48

Como é normal do modelo de EAE induzida por PLPi39_151 nos ratinhos SJL/J, um número substancial de ratinhos de controlo que foram apenas tratados com excipiente desenvolveram um segundo episódio de doença (recaída). A avaliação da segunda fase de actividade da doença, i. e., a pontuação clinica na EAE a partir do dia 26 até ao dia 42, demonstrou que os ratinhos tratados com 3 mg/kg e 1 mg/kg de estetrol apresentaram evidências baixas de actividade da doença, em oposição aos ratinhos tratados com excipiente e aos outros grupos de tratamento (Figura 5) . Com base na comparação por ANOVA entre os grupos de tratamento e a análise post hoc LSD, conclui-se, portanto, que o tratamento oral com estetrol apresenta uma redução estatisticamente significativa das recaídas de EAE de uma forma dose-dependente, quando comparada com os ratinhos tratados com excipiente (P=0,045 e P=0,023 para estetrol a 3 mg/kg e 1 mg/kg, respectivamente). 12 S iu w + «0 b <u E <e > B W 3 E 3 O O i« U" RI S c o 0. 10

« x o τΓ φ 3 o

I η=θ

5? 49

Figura 5: Efeito do tratamento com estetrol sobre a pontuação clinica cumulativa na EAE na fase de recaida (dias 26 a 42) em ratinhos SJL/J. * P=0,045 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,023 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com o excipiente. # P=0,050 (estetrol 3 mg/kg) e P=0,018 (estetrol 1 mg/kg) quando comparado com estetrol a 0,3 mg/kg.

Estes dados demonstram que o estetrol, administrado oralmente numa quantidade eficaz para também modificar os parâmetros endócrinos (especialmente a cornificação vaginal), suprime surpreendentemente o desenvolvimento clínico da EAE. Maís ainda, o estetrol atenua os sintomas nos animais afectados pela EAE e impede os animais de desenvolverem recaídas da doença com sintomas graves.

Exemplo 7 A capacidade do estetrol (E4) em atenuar os sintomas e a gravidade das doenças mediadas pelo sistema imunitário é avaliada em ratinhos B10.PL com encefalomielite auto-imune experimental (EAE), uma doença inflamatória despoletada pela indução de linfócitos T auto-reactivos e amplamente estudada como um modelo da esclerose múltipla (MS) em humanos. São obtidos ratinhos fêmea B10.PL, com uma idade de 8 a 12 semanas, dos Laboratórios Jackson (Bar Harbor, Me.) e divididos em grupos de tratamento de 12 ratinhos. Nos três dias prévios à indução da doença EAE, os animais são anestesiados utilizando uma mistura de anestésicos de cetamina/xilazina e ooforectomizados. Os ovários são removidos após uma incisão única através da pele do dorso e uma incisão bilateral no flanco através do peritoneu. 50 A proteína básica da mielina (MBP) é isolada a partir da medula espinal de porquinhos-da-índia seguindo o procedimento de Deibler, et al. (Deibler, G. E. et ai., Prep. Biochem., 1972, 2: 139, 1972). A MBP é armazenada liofilizada a -20 °C e é dissolvida, antes da sua utilização, em ácido acético 0,1M a uma concentração de 8 mg/mL. Para as imunizações, a MBP é emulsificada em igual volume de adjuvante de Freund completo (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosis H.sub.37 Ra (4 mg/mL).

Para induzir a EAE, os ratinhos são imunizados na pele da base da cauda com 400 pg de MBP numa emulsão de CFA (0,1 mL) , contendo Mycobacterium tuberculosis H.sub.37 Ra. Imediatamente após a imunização com MBP e 48 horas depois, os ratinhos recebem uma injecção intraperitoneal adicional de 200 ng de toxina pertussis (Sigma, St. Louis, Mo.). Os ratinhos são diariamente examinados pesquisando sinais clínicos de EAE durante 40 dias, e os sintomas de doença são pontuados de acordo com Clayton et al. (J. Exp. Med., 1989, 169: 1681) : 0: sem paralisia, 1: claudicação da cauda/lagoftalmos ou ptose palpebral, 2: paralisia parcial dos membros posteriores ou fraqueza dos membros; 3: dificuldade em virar-se, fraqueza grave dos membros ou paralisia moderada, 4: paralisia grave a total, 5: moribundo/ morto. O estudo compreende um protocolo combinado de prevenção/terapêutica, no qual são administradas várias quantidades de E4 aos ratinhos, iniciando no dia 1 do estudo (dia da imunização MBP) até, e incluindo, o dia 40. Quatro grupos de ratinhos são tratados oralmente uma vez por dia com E4 (0,1, 0,3, 1,0 ou 3,0 mg/kg/dia) e um grupo de ratinhos recebe uma vez por dia, oralmente, o excipiente de tratamento (hidroxipropil-beta-eiclodextrina a 20% p/vol) como controlo negativo. Do mesmo modo, o estudo compreende adicionalmente 4 grupos de ratinhos tratados subcutaneamente uma vez por dia com E4 (0,1, 0,3, 1,0 ou 3,0 mg/kg/dia) e um grupo de ratinhos recebe uma vez por 51 dia, por via subcutânea, o excipiente de tratamento (hidroxipropil-beta-ciclodextrina a 20% p/vol) como controlo negativo. 0 tratamento oral ou subcutâneo com o excipiente não é eficaz para prevenir o desenvolvimento da doença EAE em ratinhos imunizados com MBP. Os animais apresentam, geralmente, um inicio rápido dos sintomas da doença e desenvolvem progressivamente mais sinais de doença auto-imune ao longo do período de avaliação. Aos 40 dias, a maior parte dos animais apresenta formas graves de EAE (geralmente com pontuação de 3 ou mais). Curiosamente, o tratamento subcutâneo e oral com E4 apresenta efeitos dose-dependentes no atraso do início dos sintomas da doença EAE e previne o desenvolvimento de uma doença auto-imune grave ao longo do período de 40 dias de avaliação. A comparação entre os grupos de tratamento e os grupos de controlo revela que o número de animais atingidos e/ou a gravidade dos sintomas de EAE são reduzidos de forma dose-dependente ao longo da gama de dosagem testada nos ratinhos tratados com E4. 0 estudo é repetido separadamente com ratinhos fêmea B10.PL não castradas e machos B10.PL, demonstrando novamente a capacidade da E4 em atenuar os sintomas e a gravidade da EAE de uma forma dose-dependente, após a sua administração subcutânea e/ou oral diariamente.

Exemplo 8 A capacidade do estetrol em atenuar a gravidade das doenças mediadas pelo sistema imunitário e os seus possíveis efeitos colaterais foram avaliados e comparados com a dexametasona em ratinhos que desenvolveram artrite induzida pelo colagénio (CIA), que é um outro sistema experimental de doenças auto-imunes e inflamatórias crónicas, representativo de doenças articulares humanas, particularmente a artrite reumatóide (RA). 52 A artrite foi induzida em ratinhos macho DBA/1 utilizando um protocolo de imunização em duas etapas (Joosten et al., «Dual role of IL-12 in early and late stages of murine collagen type II arthritis», in J. Immunol., 1997, 159: 4094-4102; Joosten et al., «IL-Ιβ blockade prevents cartilage and bone destruction in murine type II collagen-índuced arthritis, whereas TNFa blockade only ameliorates joint inflammation», in J. Immunol., 1999, 163: 5049-55). Esta estirpe é altamente susceptivel à CIA induzida com colagénio bovino tipo II. No dia 0, os ratinhos foram imunizados com colagénio bovino tipo II (100 pg) , emulsificado com adjuvante completo de Freund (quatro ínjecções subcutâneas no dorso). No dia 21, a resposta dos ratinhos foi amplificada com uma injecção i.p. de 100 pg de colagénio tipo II diluido em PBS. 0 efeito do tratamento oral com estetrol sobre a artrite induzida pelo colagénio foi estudado num desenho de estudo de 6 semanas. A partir do dia 22 até ac final do estudo (dia 42) , os animais foram tratados uma vez por dia com excipiente (hidroxipropil-beta-ciclodextrina numa solução aquosa a 20% p/vol), que serviu como controlo negativo ou com quatro diferentes dosagens de estetrol (3 mg/kg, 1 mg/kg, 0,3 mg/kg e 0,1 mg/kg). A dexametasona (1 mg/kg) foi seleccionada como controlo positivo na medida em que é um corticosteróide bem estudado que reduz o edema e a inflamação e é utilizada numa variedade de doenças, como doenças de pele (psoriase, febre dos fenos), situações alérgicas, problemas respiratórios, cancro, doenças do sangue (anemia), problemas digestivos, doenças oculares e para o tratamento da artrite. Embora seja eficaz como anti-agente inflamatório, a dexametasona é também conhecida por induzir um número de efeitos colaterais, os quais, entre outros, incluem em humanos a indução de osteoporose, redução da função supra-renal, tonturas, náuseas, indigestão, aumento do apetite, aumento de peso devido ao aumento da retenção de fluidos, fraqueza e/ou perturbações 53 do sono. Adicionalmente, o tratamento sistemático com dexametasona em roedores resulta em fortes efeitos catabólicos, que podem ser facilmente observados como perda de peso (Orzechowski et al., «Rats with glucocorticoid-induced catabolic State show symptoms of oxidative stress and spleen atrophy: the effects of age and recovery», in J. Vet. Med. A Physiol. Pathol. Clin. Med., 2002, 49: 256-63).

Todos os grupos utilizados no estudo consistiram era 13 ratinhos. Durante o estudo, os animais foram pesados e monitorizados para sinais clinicos de artrite. A pontuação da gravidade da doença (pontuação clínica da artrite) foi realizada de acordo com o sistema de pontuação descrito por Joosten et al. (J. Immunol., 1997, 159: 4094-4102) e Joosten et al. (J. Immunol., 1999, 163: 5049-55).

As análises estatísticas de base foram realizadas como se segue: foi testado o significado das diferenças entre todos os grupos de tratamento nas variáveis clínicas dependentes principais utilizando a análise de variância (ANOVA). Cada ANOVA significativa foi seguida de testes de Tukey post hoc para determinar o significado das diferenças entre cada grupo de tratamento e o grupo de controlo. Adicionalmente, utilizou-se uma análise de regressão linear para estudar a dependência de dose dos efeitos do tratamento com estetrol. Todas as análises estatísticas foram feitas utilizando o programa de software estatístico SPSS 10.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, 111., EUA).

Todos os animais tratados com excipiente (controlos) desenvolveram artrite pouco após a segunda imunização com colagénio tipo II no dia 21. A média do dia de início da doença para os ratinhos tratados com excipiente foi de 25,4 ± 0,64 dias e atingiu uma incidência de doença de 100% no dia 28 (Figura 6) . Após o booster no dia 21, nenhum dos animais tratados com dexametasona (controlo positivo) desenvolveu artrite antes do final do estudo. Para este grupo de tratamento, a incidência da doença foi de 0% até 54 ao dia 42 (Figura 6). O tratamento com estetrol atrasou de uma forma dose-dependente a média do dia de inicio da doença para 25,8, 26,0, 28,2, e 30,7 para os grupos de tratamento com 0,1, 0,3, 1,0 e 3,0 mg/kg de estetrol. Este efeito é também observado na Figura 6, onde o aumento da incidência da doença é claramente atrasado nos grupos de 1,0 mg e 3,0 mg/kg de estetrol, quando comparado com o grupo de controlo de animais tratados com excipiente.

Incidência da doença

Dias depois da imunização

Figura 6: Efeito do tratamento com estetrol sobre a incidência de CIA no ratinho, apresentando a incidência da doença para todos os grupos de tratamento versus tempo. «Doença» é definida como uma pontuação de artrite macroscópica > 0. A pontuação de artrite macroscópica aumentou paulatinamente com o tempo nos ratinhos tratados com excipiente, atingindo uma pontuação média de 5,90 ± 0,38 no dia 42 (Figura 7). Durante a totalidade do periodo de monitorização, a pontuação cumulativa média da artrite (dias 21 a 42) nos ratinhos tratados com excipiente foi de 31,4 ± 1,73 (Figura 8). Uma vez que os animais tratados com dexametasona não desenvolveram a doença, a pontuação de artrite macroscópica permaneceu 0 até ao dia 42 (Figura 7) . Consequentemente, a pontuação cumulativa média da artrite (dias 21 a 42) nos 55 animais tratados com dexametasona foi também de 0 (Figura 8) . Ainda em conformidade com o atraso na incidência da artrite, também o desenvolvimento da pontuação da artrite macroscópica foi reduzido de uma forma dose-dependente nos ratinhos que receberam estetrol (Figura 7) . Do mesmo modo, a pontuação cumulativa média da artrite (dias 21 a 42} nos animais tratados com estetrol foi reduzida de uma forma dose-dependente e significativamente diferente quando comparada com os animais tratados com excipiente (figuras 8A e 8B).

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Dias depois da imunização

Figura 7: Efeito do tratamento com estetrol na pontuação de artrite macroscópica na CIA do ratinho. Cada ponto representa a média do grupo (n = 13). 56

Estetrol [mg/kg]

40 ® SS 35 w t: <v 30 • u 25 1 <** JS 20 3 E 15 3 O O 10 «V <v 5 3 ** c o 0 CL

Figuras 8A e 8B: Efeito do tratamento com estetrol na pontuação de artrite macroscópica na CIA do ratinho. A pontuação cumulativa foi calculada, para cada ratinho, a partir da soma das pontuações obtidas em cada um dos 10 pontos do tempo. Painel A: os dados do grupo estão apresentados como a média ± SEM (n = 13) . Painel B: Regressão linear da dose de estetrol versus a pontuação cumulativa da artrite. # indica p < 0,001 versus controlo, com base na ANOVA e no teste post hoc de Tukey.

Os pesos corporais foram medidos semanalmente como um variável adicional para a gravidade da doença e/ou efeitos colaterais induzidos pelo fármaco. O peso corporal dos animais tratados com excipiente (controlo negativo) diminuiu para 94,2%, 85,7% e 87,9% do peso inicial (no dia 21) nos dias 28, 35 e 42, respectivamente (Figura 9) . Após o tratamento com dexametasona, o peso corporal dos ratinhos também diminuiu para 91,5%, 91,4% e 94,0% do seu peso inicial (dia 21) nos dias 28, 35 e 42, respectivamente 57 (Figura 9). A perda de peso nos ratinhos tratados oralmente com estetrol foi comparável à dos animais dos grupos de controlo positivo e negativo para as três doses mais baixas (0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg). No entanto, a dose mais elevada de estetrol (3,0 mg/kg) protegeu os ratinhos da perda de peso; o peso corporal dos ratinhos neste grupo apenas diminuiu para 99,3%, 96,7% e 97,9% do seu peso inicial (dia 21) nos dias 28, 35 e 42, respectivamente (Figura 9), indicando que nem a artrite nem os efeitos colaterais induzidos pelo fármaco (como, por exemplo, observado com a dexametasona) afectaram negativamente os animais tratados com a dose de 3,0 mg/kg.

Peso corporal

Dias depois da imunização

Figura 9: Efeito do tratamento com estetrol na pontuação de artrite macroscópica na CIA do ratinho. Os ratinhos foram pesados por grupos nos dias 21, 28, 35 e 42.

Em conclusão, estes dados demonstram que o estetrol administrado oralmente numa quantidade eficaz para modificar também os parâmetros endócrinos (e. g., cornificação vaginal) suprime, surpreendentemente, o desenvolvimento de artrite, assim como a gravidade da 58 artrite na CIA, Como tal, o estetrol pode ser uma modalidade terapêutica para o tratamento da artrite, sem exibir os efeitos secundários observados com os fármacos existentes actualmente, e. g., a dexametasona.

Exemplo 9 A capacidade do estetrol (E4) em atenuar os sintomas e a gravidade de doenças mediadas pelo sistema imunitário é ulteriormente avaliada em ratinhos ooforectomizados que desenvolveram artrite induzida pelo colagénio (CIA).

Dividiram-se ratinhos fêmea DBA-1 de uma idade de 8 a 12 semanas no inicio das experiências em grupos de tratamento de 12 ratinhos. Três dias antes da indução da doença CIA, os animais foram anestesiados utilizando uma mistura de anestésicos de cetamina/xilazina e ooforectomizadas. Os ovários foram removidos após uma única incisão na pele do dorso e uma incisão bilateral nos flancos através do peritoneu. 0 colagénio bovino tipo II (CB) foi isolado e purificado de acordo com o protocolo de Wooley et al. (J. Exp. Med. , 1981, 154, 688-700). Antes da utilização, o CII foi priraeiramente dissolvido em ácido acético 0,1 M a uma concentração de 2 mg/mL e, seguidamente, emulsificado de 1:1 com adjuvante completo de Freund (CFA) contendo Mycobacterium tuberculosís H.sub.37 Ra (4 mg/mL) ou, para amplificar a imunização, emulsificado de 1:1 com adjuvante incompleto de Freund (IFA).

Para induzir a CIA, os ratinhos foram imunizados com 0,1 mL da emulsão preparada em CFA na base da cauda. Vinte e um dias depois, os animais receberam uma injecção booster de 0,1 mL da emulsão preparada em IFA. Os ratinhos foram diariamente examinados, procurando sinais clínicos de CIA a partir do início da experiência até ao seu fim, no dia 60 após a primeira imunização. Os sinais clínicos de CIA foram 59 pontuados de acordo com Wooley et al. (J. Exp. Med., 1981, 154: 688-700), utilizando uma escala de 0 a 3 para cada pata: 0: sem artrite; 1: eritema e edema na pata ou nos dedos; 2: edema grave ou deformidade da pata e 3: anquilose. Obteve-se uma pontuação de artrite para cada ratinho através da soma da pontuação de todas as patas. Para cada ratinho, a possível gravidade, como medido através da pontuação de artrite, pode variar de 0 a 12. É utilizado um protocolo combinado de prevenção/terapêutica, no qual são administradas aos os ratinhos várias quantidades de E4, com início no dia 1 do estudo (dia da primeira imunização com CII) até, e incluindo, o dia 60. Quatro grupos de ratinhos são tratados oralmente uma vez por dia com E4 (0,1, 0,3, 1,0 ou 3,0 mg/kg/dia) com um grupo de ratinhos, recebendo uma vez por dia o excipiente de tratamento oral (hidroxipropil-beta-ciclodextrina a 20% p/vol) como controlo negativo. Do mesmo modo, o estudo compreende adicionalmente 4 grupos de ratinhos tratados por via subcutânea uma vez por dia com E4 (0,1, 0,3, 1,0 ou 3,0 mg/kg/dia) com um grupo de ratinhos, recebendo uma vez por dia o excipiente de tratamento por via subcutânea (hidroxipropil-beta-ciclodextrina a 20% p/vol) como controlo negativo. 0 tratamento com excipiente por via oral ou subcutânea não é eficaz para prevenir o desenvolvimento da doença CIA em ratinhos imunizados com CII. Os animais tratados com excipiente apresentam geralmente um início rápido dos sintomas da doença e desenvolvem mais sinais de CIA ao longo do período de avaliação. Aos 60 dias, a maior parte dos animais sofre de formas graves de CTA (geralmente com pontuação de 4 ou mais). Curiosamente, o tratamento com E4 por via subcutânea e oral apresenta efeitos dose-dependentes no atraso do início dos sintomas de CIA e previne o desenvolvimento progressivo de formas mais graves de destruição articular ao longo dos 60 dias do período de avaliação. A comparação dos grupos de tratamento com os 60 grupos de controlo demonstra que o número de animais atingidos e/ou a gravidade dos sintomas de CIA são reduzidos de uma forma dose-dependente nos ratinhos tratados com E4. 0 estudo é repetido separadamente com fêmeas não castradas DBA-1, demonstrando novamente a capacidade do E4 em atenuar os sintomas e a gravidade da CIA de uma forma dose-dependente após a administração diária por via subcutânea e/ou oral.

Exemplo 10 - Preparação de 100 cápsulas, contendo 2 mg de estetrol e 2 mg de dexametasona por cápsula:

Misturaram-se em conjunto 200 mg de estetrol, 200 mg de dexametasona (como sal de fosfato di-sódico) e 75 mg de dióxido de silício coloidal (Aerosil© 200V). A mistura em pó resultante é transferida para um copo com indicação de volume. 0 volume é ajustado a 37 mL com celulose microcristalina (Avicel® PH102). Subsequentemente, a mistura em pó é colocada em 100 cápsulas de gelatina dura constituídas por duas peças (Capsugel® 2).

Exemplo 11 - Preparação de 100 cápsulas, contendo 2 mg de estetrol e 3 mg de metotrexato por cápsula:

Misturaram-se em conjunto 200 mg de estetrol, 300 mg de metotrexato (como sal di-sódico) e 75 mg de dióxido de silício coloidal (Aerosil® 200V). A mistura em pó assim obtida é transferida para um copo com indicação de volume. 0 volume é ajustado a 37 mL com celulose microcristalina (Avicel® PH102). A mistura em pó é colocada em 100 cápsulas de gelatina dura constituídas por duas peças (Capsugel® 2). 18.12.2006

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um componente estrogénico seleccionado a partir do grupo caracterizado por substâncias representadas pela seguinte fórmula

em que Ri, R2, R3 e R4 da fórmula são, independentemente, um átomo de hidrogénio, um grupo hidróxilo ou um grupo alcóxi com 1 a 5 átomos de carbono; cada R5, R6 e R-? é um grupo hidróxilo; não ma is do que 3 de entre Ri, R2, R3 e R4 são átomos de hidrogénio; precursores com a capacidade de libertar uma substância de acordo com a fórmula supracitada guando utilizados no presente método, sendo os referidos precursores derivados de substâncias estrogénicas, nas quais o átomo de hidrogénio de pelo menos um dos grupos hidróxilo foi substituído por um radical acilo de um hidrocarboneto carboxílico, ácido sulfónico ou ácido sulfâmico de 1 a 25 átomos de carbono; tetra-hidrofuranilo; tetra-hidropiranal; ou um resíduo glicosídico de cadeia linear ou ramificada contendo 1 a 20 unidades glicosídícas por resíduo; e misturas de uma ou mais substâncias supracitadas e/ou seus precursores; as referidas substâncias apresentam 1