PT1386160E

PT1386160E - Método para a detenção de antigénios de células sanguínias e os anticorpos em resposta aos mesmos

Info

Publication number: PT1386160E
Application number: PT02738051T
Authority: PT
Inventors: Holger Kiesewetter; Abdulgabar Salama
Original assignee: Holger Kiesewetter; Abdulgabar Salama
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2008-10-27
Also published as: ES2309174T3; DE50212790D1; ATE408832T1; DK1386160T3; JP4464048B2; EP1386160B1; WO2002090989A3; DE10122806A1; US20040142492A1; EP1386160A2; WO2002090989A2; JP2004531724A

Description

1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE ÁNTIGÉNIOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS E OS ANTICORPOS EM RESPOSTA AOS MESMOS" A presente invenção refere-se a um método para a detecção de ántigénios de células sanguíneas ou para a detecção de anticorpos dirigidos contra estes ántigénios no sangue humano. Este método é realizado in vitro utilizando sangue que é retirado do paciente.

No diagnóstico actual de doenças especificas, é necessário detectar ántigénios seleccionados derivados de glóbulos brancos e vermelhos (eritrócitos e leucócitos, respectivamente) e das plaquetas sanguineas,.ou então, anticorpos específicos dirigidos contra estes ántigénios, no sangue dos pacientes.

Os ántigénios de células sanguíneas são marcadores superficiais (característicos) sobre os glóbulos, vermelhos (eritrócitos), as plaquetas (trombócitos) e os glóbulos brancos (leucócitos). Eles normalmente são glicoproteínas, glicolípidos ou proteínas. Um resumo,.' a este respeito pode ser encontrado, por exemplo, em Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt' Editores Springer Berlim (1999), páginas 137-200. A importância clinica destes ántigénios de células sanguíneas decorre da sua imunogenicidade, ou seja, a sua capacidade para estimular a formação de anticorpos específicos, por exemplo., depois de uma transfusão, em uma pessoa que não possua estes ántigénios em circunstâncias normais. 2 A formação destes anticorpos dirigidos contra antigénios de células sanguíneas também pode ser induzida, por exemplo, pós-natal, como é o caso com o grupo sanguíneo das iso-aglutininas (anti-A e anti-B) , ou por células alogénicas que sejam transferidas dentro do contexto de uma gravidez, de um transplante de órgão, ou de um transplante de medula óssea. Exemplos de anticorpos correspondentes são anti-D, anti-K, anti-Fy, etc, dirigidos contra os eritrócitos, anti-HPA-1 e anti-HPA-2, dirigidos contra as plaquetas, anti-INA-1 e anti-INA-2, dirigidos contra os granulócitos, ou os anticorpos dirigidos contra a classe I e a classe II de HLA.

Além destes, os anticorpos também podem ser formados contra antigénios endógenos (auto-anticorpos). Estes anticorpos podem levar à ruptura ou destruição prematura de células autólogas, como no caso da anemia hemolítica auto-imune, trombocitopenia autoimune ou neutropenia autoimune (agranulocitose).

Nos fetos e nos recém-nascidos, os aloanticorpos dirigidos contra os eritrócitos, em particular anticorpos imunes, tais como anti-D e anti-c, podem dar lugar a hemólise (síndroma de Halbrecht) de diferentes gravidades.

As isoaglutininas e os aloanticorpos clinicamente relevantes têm de ser tidos em conta antes de qualquer transfusão de sangue utilizando eritrócitos. Em regra, nenhuns eritrócitos sorologicamente não tolerados, por exemplo concentrados eritrocitários Rhesus-positivos quando o destinatário (Rhesus-negativo) possua um aloanticorpo da especificidade anti-D, podem ser transfundidos. Por esta razão, é necessário, antes das transfusões de sangue, identificar os anticorpos dirigidos contra os eritrócitos e tê-los em conta durante uma transfusão. Além 3 disso, é necessário, antes de qualquer transfusão, realizar um teste sorológico de tolerância (teste de cruzamento}, utilizando todas as amostras de sangue armazenadas que. se destinam à transfusão.

Até ao momento, os anticorpos dirigidos contra, antigénios eritrõcitários foram detectados rotineiramente por ' se incubarem amostras de, soro contra eritrócitos de teste nativos selecionados (pesquisa- de anticorpos, e,. quando apropriado,, identificação do anticorpo),, ou, antes de' uma transfusão, contra os· eritrócitos dadores (teste de cruzamento). A. intolerância entre' o soro e os eritrócitos· é manifestada por aglutinação' directa ou indirecta dos eritrócitos sob investigação. As iso-aglutininas anti-A e anti-B, por: exemplo, induzem a aglutinação directa dos eritrócitos. A. aglutinação indirecta é induzida,, por exemplo, pela incubação de anti-D com os eritrócitos de teste Rhesus-positivos e, em seguida, adicionar-se soro de globulina anti-humano (teste- de Coombs ir.directo) .

As desvantagens de se utilizarem eritrócitos de tes:te surge a partir da selecção, raridade e disponibilidade dos eritrócitos de teste e dado o curto espaço de tempo durante o qual as células podem ser. armazenadas. A fim de se isolarem as células, é necessário regularmente pesquisar dadores seleccionados que possuam antigénios conhecidos, e as células isoladas podem somente ser armazenadas, durante um curto, periodo.

Praticamente todos os métodos de teste anteriormente descritos são baseados na utilização de tais- células (ver Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt Editores, Springer Berlim (1999), páginas 587-596 e New diagnostic methods in oncology and hematologyr Huhn Editores 4

Springer, Berlim, .1998,, páginas 197-212).

Os inconvenientes associados a esses métodos são, portanto: • Á fim de reconhecer, anticorpos específicos, é necessário utilizar diversos ' (ém regra mais de 11) eritrócitos de teste (células de ensaio) por teste, uma vez que não é possível obterem-se eritrócitos que . possuam características isoladas . (individuais) (por exemplo, células, que só exercem - a Caracteristica "D"). • Como regra., os eritrócitos de teste que possuem características raras para. se reconhecerem anticorpos' particulares não estão disponíveis. Não é sempre possível" garantir, que os pacientes afectadps serão acendidos. : . • Como regra,. os eritrócitos de teste aos quais faltam, características que normalménte .ocorrem com frequência não estão disponíveis para o reconhecimento de anticorpos específicos. Por esta razão, também,.' não é .sempre possível garantir que os pacientes afectados são atendidos. • É uma matéria cara é elaborada seleccionar, as células de teste apropriadas. • Uma vez que o material é material biológico isolado a partir de seres humanos, a possibilidade, do pessoal clínico, médicos, etc, que lidam com o material, de estarem em risco de uma infecção não é . de excluir.. 5 • As células só podem,ser armazenadas por um período limitado. A importância clínica dos anticorpos dirigidos contra os antigénios trombocíticos reflecte-se ná trombocitopenia auto-imune (AITP), alo-imunetrombo-citopenia neonatal (NAIT), púrpura . pós-transfusionai (PTP) e a transfusão de plaquetas incompatíveis. Em todos os casos, os anticorpos podem dar lugar a um distúrbio primário em hemostasia e' diátese hemorrágica nos pacientes af ectados.

Tem sido assim, até agora, difícil de detectar anticorpos dirigidos contra as plaquetas, e tal detecção só poderá ' ser . realizada em alguns laboratórios especializados. Devido à natureza das plaquetas sanguíneas, , não foi possível até ao momento desenvolver um teste simples e rápido de aglutinação, como no caso dos eritrócitos. Os métodos anteriormente descritos, que são mais frequentemente utilizados são o ensaio imunoabsòrventè ligadò ,a enzima (ELISA) e o teste de imunofluorescência . de adesão plaquetária (PIFT) e, para especificar as imunoglobulinas de ligação, o ensaio de imunoprecipitação ou MAIPA (imunobilização do anticorpo monoclonal de antigénios plaquetários) (ver' Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt Editores, Springer. Berlim (1999), páginas 597-602, New diagnostic méthods in oncology and hematology, Huhn Editores Springer, Berlim (1998), páginas 213-228, McMillan, Transfusion Medicine Reviews, Volume IV. No. 2, páginas 136-143 (1990).

Estes métodos sofrem de uma grande variedade de desvantagens: • Todos os métodos- de ensaio são mão-de-obra intensiva uma vez que as plaquetas padronizadas não estão, em regra disponíveis e os testes só podem ser realizados por peritos. 6 · ' Frequentemente não é possível isolar.e investigar,,por exemplo, em. um ELISA ou MAIPA, quaisquer plaquetas, ãutól.ogas, . ou um número suficiente de. plaquetas autólogas, no caso dos .pacientes que sofrem de baixa de plaquetas. • A especificidade (ELISA e PIFT) e a sensibilidade (MÂIPA) são limitados e., como. resultado, muitas vezes não é possível interpretar os,resultados. • Essencialmente todos os inconvenientes, que foram descritos : acima, em conexão com a dètecçãc de antigénics eritrocitários também se aplicam. ' A importância clínica dos anticorpos dirigidos contra os antigénios dependentes da neutcfila é caracterizada por neutropenia auto-irtiunc, neutrcpenia alo-immune neo-natal e TRALI · (insuficiência pulmonar, aguda associada à transfusão). A detecção destes anticorpos é ainda mais difícil do . que detectar anticorpos trombócitos. Os métodos de ensaio previamente. conhecidos, .são em grande medida, , adaptados .a 'partir de .métodos .para a detecção de anticorpos dirigidos contra as plaquetas (ver Transfusionsmedizin,. Mueller-Eckhardt Editores, Springer Berlim (1999) , páginas 603-609, New diagnosti.c methods in oncology and hematology, : Huh.n Editores Springer,. Berlim, .(1998) , páginas 228-235, Minchinton 'and Waters, British Journal of Haematology, 56, páginas· 521-528.,. (1984),

McCullough and William, Transfusion Medicine Reviews, Volume 1, No,.' 3, páginas 150-160 (1987)).

Além disso, \ os anticorpos dirigidos contra linfócitos, principalmente os linfócitos T, são da maior importância na. imunologia do transplante. Estes anticorpos podem levar à rejeição' aguda ou retardada dos transplantes (medula óssea, coração, pulmão, rim e outros' órgãos). Por esta razão, é necessário, : antes de realizar os transplantes de medula óssea è de rim, excluir a presença' de quaisquer anticorpos linfociticos dirigidos contra 'orgãos dadores. . .

Além disso, os antigénios linfócitos (antigénios HLA) podem levar à formação de anticorpos específicos dirigidos contra características de HLA em conexão com gestações e transfusões. Por esta razão, a eventual presença destes 'anticorpos tem de ser tida ém conta no âmbito de transplantes e. transfusões de plaquetas e leucócitos, se for o caso. ".·'· 0. método clássico para a detecção de anticorpos HLA tem sido assim até agora limitado ao testè. linfocitotóxico. No entanto, este .teste só pode, ser utilizado para determinar os anticorpos de ativação, complementar. A técnica ELISA, que foi .recentemente utilizada é extremamente; difícil, e.somente implementado em alguns laboratórios especializados (ver Transfusionsmedizin, Mueller-Eckhardt Editores, Springer Berlim (1999), páginas .611-617, Zachary et . al. Transplantation, Volume 60, No. 12, páginas. 1600-1606 (1995), Lubenko and Rodi, Transfusion, .Volume. 38, páginas 41-44 (1998)).

Em suma, todos os princípios.do teste para a detecção de anticorpos dirigidos contra as células do, sangue são baseados na utilização de células de' teste biológicas/ e normalmente nativas seleccionadas, que são obtidas a partir de indivíduos seleccionados e, em seguida, postas· à disposição.

Um teste relativamente rápido-e simples só é possível para detectar 8 anticorpos habituais dirigidos contra . eritrócitos, por. exemplo, para' detectar um anticorpo anti-D. A pesquisa de alternativas tem sido assim até agora sem êxito·..·'

Embora, os. genes para a maioria dos sistemas de grupos sanguíneos' (eritrócitos, .plaquetas e leucócitos) , tenham até;, agora ' sido clonados, cora alguns .deles a terem, sido sequenciados, os ar.ri génios e os péptidos recornb i n a nt e s são utilizados apenas em casos isolados, quando muito,, para a detecção. de anticorpos (Bowditch, et ai.., Blcodf Volume , 88, ' No... 12, páginas 4579-4584 (1.996), Peterscn et ai., ; Blood,. : Volume 92, No.· 6,. ' paginas . 2053-2063 (1998) , Y a z d a r;b a kh s h, Transfusion Medicine Reviews, .' Volume. 15, No. 1,1 páginas 5 3-66, (2001) ) .'

Mesmo' o.ensaio de MAÍPA supracitado,' no qual os anticorpos são imobilizados, . em placas de microtitulação com a finalidade de executar um teste de ELISA indirecto, ainda apresenta enormes problemas práticos no manuseamento. Assim,· este teste dura aproximadaménte 7-8 horas e os resultados do teste são frequentemente ambíguos. Além disso, não é possível armazenar as placas de microtitulação revestidas por um período suficientemente longo,· o que levou a que todas as soluções adequadas, na prática, têm de ser recém-preparadas nõ laboratório. :

Von Meyer et ai., . The Lancet. Volume 354,. No. 9189, páginas 1525-1526 (1999) descreveram um sistema de teste que foi. utilizado com sucesso para detectar anticorpos dirigidos contra o complexo constituído pelo factor 4 plaquetário . e hepariná, por se adicionarem amostras de soro de pacientes a gotas revestidas de antigénio em um teste de aglutinação de partícula. As amostras aglutinadas foram detectadas por.meio de um teste de .placa de gel (ver, .por exemplo. Salama e Mueller-Eckhard em: Transfusions-medizin,'' Mueller-Eckhârdt Editores, Springer Berlim (1999), páginas 587-617}. Nc entanto, apesar dos seus esforços mais, enérgicos, os inventores,, não conseguiram utilizar este teste relativamente rápido e. facilmente implementável para detectar outros antigénios ou anticorpos c.e células sanguíneas dirigidos conrra . estes antigénics. .'1

Apesar da.necessidade extremamente grande, seguindo inevitavelmente a partir de aquilo que fci dito acima,, para um sistema de teste que possa ser utilizado para a detecção de anticorpos dirigidos contra antigénios de células', sanguíneas seleccionadas e que superar as desvantagens .acima enumeradas., , nenhum. desses sistemas de teste foi' disponibilizadc· antes da presente invenção. A patente norte-americana No. 6 2C3 706 divulga métodos que são para serem utilizados para' a. detecção de antigénios. de células sanguíneas ou de anticorpos em amostras de sangue, por- exemplo. No entanto, verificou-se que os métodos correspondentes·, 'nos quais os antigénios·estão ligados directamente a gotas, somente funcionam'em casos raros.

Em virtude da técnica anterior, acima mencionada, a, presente invenção foi, portanto, baseada no objectivo da dísponibilização-de um método', que pode' ser utilizado, para detectar especifícamente anticorpos, que são ' dirigidos , contra antigénios de células sanguíneas seleccionadas. ou para.detectar os próprios antigénios de células sanguíneas. Este método' ' deve ser simples e .rápido no seu funcionamento e confiável e eçonómi.co na sua .implementação. Além disso,, deverá ser possível.efectuar o método in vitro em amostras 10 que podem sér obtidas a partir de organismos' vivos.

Este objectivo, e outros objectivos que não são explicitamente mencionados, mas que podemser facilmente deduzidos ou inferidos a partir das correlações .que são aqui discutidos a título de introdução, são alcançados através, de um método com todas as funcionalidades d.a. reivindicação 1 da patente. As modificações de expediente do novo método estão protegidas, nas sub-roivindicações apensas, ' '.10.

VARIANTE 1: Ϊ V

Por meio de um método in vitro, de (i) revestir um micrcglóbulo ("gota") . que. apresenta um diâmetro .de 2-4 pm e uma densidade de 1,1-1,8 g/cm3 com um anticorpo não-humano dirigido contra o antigénio de célula sanguínea específico a ser deteçtado, .:/:, (ii) misturar antiqénios de células sanguíneas seleccionadas, especificas, anexas;,; que podem ser obtidas,, se, for o caso, por se solubilizarem células sanguíneas padronizadas, .que, por si só já são conhecidas na técnica ' anterior, ou então através de métodos recombinantes ou métodos de· química- de proteína, com as gotas revestidas obtidas a partir de (i), (iii) misturarias gotas, que são revestidas com antigénio como um resultado da . ligação do, antigénio selecionado ao anticorpo, não-humano, que é ligado à gota em (i) , com uma amostra de ' soro de um paciente, a ser investigado, e (iv) utilizar um teste de, anticorpo anti-humano específico para detectar o antiçorpo do antigénioda célula -sanguínea do paciente, que. é obtido..a partir da amostra e que pode ter sido ligado ao 11 antigénio, o qual é ligado à gota, sendo o sucesso alcançado, de uma forma, que não; é facilmente previsível, no sentido de tornar, disponível· um método para a detecção, em uma amostra, os .anticorpos dirigidos contra antigénios de células sanguíneas, com o método que permita a detecção de ser efectuada. facilmente. Ao mesmo tempo,, este método apresenta as vantagens acima mencionadas, em comparação com a técnica anterior. VARIANTE 2: . f-t

Apenas indica uma ligeira modificação dc . novo método para ã. detecção de' anticorpos dirigidos contra" antigénios de "células sanguíneas',.' quando. 12 pacientes . VARIANTE 3: ' ' 0 sucesso também é alcançado por, num. método in vit.ro, '1' (i) revestir um. microglóbulo ("gota") que apresenta um diâmetro de 2-4 μιπ e uma densidade de 1,1-1,8 g/cm1 2 3 com um' anticorpo não-humano dirigido contra o antigénio de célula sanguínea específico a ser detecta.dc·, · - (ii) sujeitar as amostras ' de. sangue', derivadas, do paciente ' a ' ser investigado, juntamente;com as células do sangue nelas contidas, a um tratamento pelo qual os ar.uiçénios presentes na membrana das' células dc sangue são solubilizados, e preparar uma fracção rica em antigénioy. se for o caso,. : (iiij. misturar as gotas revestidas obtidas ã partir de, (i) com a amostra obtida a partir de (ii), . (iv) utilizar um teste de anticorpo específico" para detectar o antigénio de células sanguíneas·,· . que é Obtido a partir da amostra e que pode ter ligação ao anticorpo, que é ligado à gota. VARIANTE 4:

Além disso, é .possível detectar' antigénios de sangue nas amostras, por ' 1 , gotas que apresentam um diâmetro de 2,4 um e uma. densidade de 1,1-1,8 g/cm3 revestidas com espécies específicas de anticorpos não-humanos, 2 (ii) . solubilizar células sanguíneas, que são derivadas de pacientes 3 a serem, investigados, - (iii) incubar o solubilizado resultante de (ii) com anticorpos específicos, que. são dirigidos., contra . ò , anti.génio a . ser detectado e : que são provenientes das espécies definidas era (i) , (iv) isolar os. complexos, que foram formados em: (iii; com as gotas de (i), por centrifugação, e (v) investigar a amestra em um teste de aglutinação.. ;

Em· particular,, os novos métodos sãc: • simples e rápidos no seu funcionamento, e ♦ confiáveis e económicos na sua implementação.

Considerando que anteriormente . foi ' q.ua'se sempre necessário utilizar células de teste nativas, ou preparar células de teste nativas, num ponto próximo no tempo, a fim de implementar os sistemas que até agora foram descritos na técnica anterior, o novo método pode ser dispensado disto. Em particular, as gotas revestidas prontas que podem ser utilizadas de acordo- com a .invenção fornecem capacidade de:; armazenamento substancialmente mais elevada do que as células de teste nativas. Além disso/ estas gotas revestidas, én teoria, podem , ser fornecidas em quantidade ilimitada e mantidas para o momento em que a necessidade surge.,· resultando em uma simplificação substancial, também por esta razão. fe essencial para a presente: invenção que os antigéni.os de células sanguíneas, ou anticorpos , que: são dirigidos contra, ele.s, sejam detectados pelo ant.igénios' nativos â serem obtidos, fora de uma amostra utilizando os anticorpos monoclcnais, que são dirigidas contra eles. É· só quando^ se utiliza este método de modificação, o qual é essencial quando comparado, com a técnica anterior, que o objectivo da técnica acima mencionada é facilmente alcançado, com 14 tanto sucesso e em segurança e com pouca contribuição.

As gotas revestidas prontas que podem ser utilizadas de acordo com a invenção são as gotas obtidas á partir da etapa (ii) na variante 1, as. gotas obtidas a partir da etapa (iv) na variante 2, as gotas obtidas a partir da etapa (i) na variante e 3 as. gotas obtidas a partir da etapa (i) na variante 4 . · ' Estas gotas podem ser . armazenadas durante uir. longo período de tempo, ou.seja, substancialmente maior do que no caso das-células de teste, nativas.

Uma vez . que o material de partida biológico, pode. ser preparado em laboratórios especializados, que· . estão:., voltados , especificamente para este' fim, o também reduzido. riscc do pessoal envolvido· se tornar infectado é A invenção envolvei a detecção de antigénios de células sanguíneas ou de anticorpos que são dirigidos contra, eles. Actualmente, ma is de, -700 antigénios eritrocitários diferentes foram descritos. Múito rr.ais numerosos antigénios foram reportados como.- estando presentes em.. Outras células' do sangue. Todos estes antigénios· possuem, ou podem, possuir, relevância clínica.. É claro,· portanto, para o especialista que a presente invenção' pode, em. princípio, ser utilizada para detectar todos estes. antigénios rapidamente- e de forma' fiável. ;

Uma compilação destes antigénios de células sanguíneas pode ser encontrada, por. exemplo, em Issitt, P. e Anstee, D. Editores: APPLIED BLOQD GROUP SEROLOGY, Montgomery Scientifiç PUblications, Durham, N.C., E.U.A.. Particularmente importantes, os antigénios de 15 grupos sanguíneos,', que são preferivelmente detoctados utilizando a. presente invenção, são: ABO; C, C';, c, D, E, E, K, k, Fy (a) ,· Fy (b) , Jk (a), Jk (b) , S, s, M, N, F (1), Le (a), Le (b)i

Muitos . dos, anticorpos, .que são ,' também necessários já · estão disponíveis. Exemplos destes anticorpos- são: anti-Jka (da· -firma DiaClon)., antí-Jkb (da firma DiaClon) , anti-Lea (DiaCion) , anti-Leb. (DiaClon), 0 teste de Rh do soro de BIOLITH DIAGNOSTIKA, Hann. Mundén, A1 emár.ha (ant i - D, anti-C,' anti-c, anti-Cw, anri-E, anti-e, soro teste de do sistema MNSs. (anti-M, anti-N, anti-S) ou então o soro . fornecido pela firma Dade (por exemplo, anti-Ki) . Ao todo, ma is de 600'; anticorpos monoclonais. diferentes 'dirigidos contra antigénios de células sanguíneas estão comercialmente disponíveis em toco o mundo. V -'

Nos; cases em que esses anticorpos não estão disponíveis, podem ser preparados,· quer policlor.almente ou monoclonalmente. Ò especialista está muito'- familiarizado com os métodos', de preparação dos' •anticorpos.';

Os protocolos que também são utilizados nos métodos· que j á se encontram descritos na técnica' anterior podem ser. empregues, pára a solubilização de células sanguíneas ou dos seus antigénios. Como já foi explicado noutro; local, uma· vantagem muito importante da presente .invenção é que, devido à durabilidade, substançialmente maior das gotas revestidas, estes protocolos, podem ser, executados em uma larga escala e:n laboratórios que são apropriados'para .eles. A, fim de preparar as. gotas revestidas que podem, ser utilizadas de acordo, com a invenção, os anticorpos .específicos têm que estar ligados às gotas.

Essa' ligação, é mediada preferivelmente por meio de um: complexo . de estreptavidina ou avidina/bidtina, com anticorpos biotinilados sendo ligados a microportadores, que .. são revestidos , com estreptavidina ou avidina. ; Qs métodos correspondentes são . bem conhecidos do especialista e descritos em detalhe na patente norte-americana No. 6,203,7C6.

Em particular,' é preferido, quando' um anticorpo, que é biotinilado e que é . dirigido, contra o . antigénio a , ser detectado, inicialmente reage com s.s células nativas (células, de. teste·).,'1 depois do que as células são solutilizadas e o complexo, de antigénio e o anticorpo biotinilado çuo foi formado é removido da mistura de re&cçãc utilizando gotas(microportadores) que são revestidas· com estreptavidina ou avidina.

Este complexo, ) que. foi formado pode depois ser. utilizado de duas maneiras diferentes: 1.) Se a presença de um anticorpo dirigido contra um antigénio é para ser detectado nò soro de um paciente, o complexo que foi formado pode depois, ser incubado directamente com c soro. Quaisquer anticorpos que. podem estar presentes, em seguida, reagem com o antigénio. e ligam-se ao complexo. , Uma vez que estes anticorpos a serem, detectados são de origem humana, os . .anticorpos á. serem detectados podem ser. ligados, depois do complexo ter sido separado da mistura de teste, utilizando um anticorpo anti-humano e empregando métodos bem conhecidos. A seguinte é uma lista não exaustiva dos ; métodos possíveis : teste de globulina anti-humana padrão, teste de placa (Y. Lapierre et ai., .{1990), Transfusion 30(2) :109-113) , ELISA ; (detecção em uma placa de microtitulação),. microchapa, difusão capilar, citomerria de fluxo,. rádio- . imunoensaio(RIA; por exemplo iodo125, marcação das gotas}', etc 2.) Se o antigénio é para ser detectado directamente, os mesmos métodos podem ser usados para ligar directamente um segundo anticorpo ao complexo acima mencionado composto de antigénio-, e anticorpo biotinilado e gotas ' revestidas com estreptavidina '.ou . revestidas.·., com avidina. Por isso, o . segundo , anticorpo é marcado . quer directamente (por., exemplo', marcação, enzimática com. iodo125), ou, então é detectado mais uma" vez, por meio de um anticorpo.específico da espécie e utilizando os métodos, acima mencionados, com o anticorpo especifico da cspécio a ter de, ser dirigido contra espécies das quais o 'segundo'anticorpo, é derivado.

As variantes;, particularmente preferidas· do novo sistema \ para detectar antigénios de células sanguíneas,' ou anticorpos dirigidos contra ' elas, ern amostras séricas, compreendem. Por conseguinte: Um método in vitro para a a de.tecçáo, em uma amostra·: de soro do 'paciente, . de. .anticorpos ; dirigidos contra, antigénios de células sanguíneas, etri cujo método (i) os anticorpos, não- humano s b i o t i n i 1 a do s que são dirigidos contra cs antigénios a serem .detectados são colocados em contacto comias célu_as de teste humanas que transportam os antigénios de células sanguíneas nativas correspondentes, (ii) o complexo formado a partir de (i; é submetido a .condições nas -quais as células sanguíneas solubil.i zan, {iii} o complexo composto por antigénios. e anticorpos biotinilados é retirado· da ' amostra utilizando micropartículas ' revestidas. de "estreptavidina ou revestidas de avidina, (iv) o complexo- que foi formado em (iii} é posto .em. contacto com uma amostra de soro de um paciente a ser investigado, e (v) o.complexo. que tem sido um teste de anticorpos anti-humano, é 18 usado para detectar os complexos que são formados a partir: de anticorpos biotinilados, antigénios e anticorpos humanos a partir do sorò quando, os anticorpos· específicos estão presentes na amostra do soro, uma vez que o complexo foi separado da amostra e também um método in vitro para a detecção de antigénios de células sanguíneas.selecionados, em.cujo método j (i) os anticorpos biotinilados . que são .dirigidos contra, cs antigénios a serem detectados são colocados em contacto com as células de teste humanas que transportam os antigéniós de células sanguíneas correspondentes, .i i (ii) o complexo formado, a partir, de, ,(i) é submetido a condições nas quais as células sanguíneas splubilizam, '. . i (.iii) o complexo composto por'antigénios e anticorpos biotinilados é retirado da amosura utilizando micropartícuias revestidas de estreptavidina ou. revestidas de avidina, (iv) o complexo que foi formado em (iii) é posto.em.contacto com um segundo anticorpo preferivelmente marcado,. . que. é. dirigido contra, o antigénio, e (v) métodos habituais são usados para .detectar os complexos que são formados a partir de anticorpos biotinilados, antigénios e um segundo anticorpo logo que d Complexo tenha sido.separado para fora da amostra. É também possível que ,o anticorpo seja quimicamente ligado às gotas,

Para os objectivos da presente invenção, as gotas são geralmente consideradas como., sendo microportadores esféricos compostos- de .19. diferentes materiais. É dada preferência, neste contexto, à utilização de partículas de estreptavidina ferromagnéticas (por '' exemplo, Dynabeads de estreptavidina M280} . '

As propriedades físicas cestas partículas' são.as seguintes:

Diameiro: 2-4 mm · -. . -.1. ,· .Densidade·: 1,1-1,8 ç/cm1 2 3 : Área dc superfície: 4-8 m2/g

Momento de massa'magnético: 100-25x10-6 m.3/kg A suspensão . ccntérr. preferivelmente 10 mg ' de . partículas/ml, ocrrespondendo a β,7 x 10£/mL.

As propriedades de ligação das partículas são preferivelmente ás .seguintes: 1 mg de Dynabeads de estreptavidina M280 .pode ligar 5-10 g de um anticorpo biotinilado (100% de saturação da estreptavidina que está ligada covalenremente à superfície de poliestireno) Ãs vantagens destas partículas são: 2

Como resultado das suas propriedades paramagnéticas, essas 3 partículas são adequadas.· para isolar ps. complexos de, antigénio-anticorpo-biotina a partir de uma mistura, heterogénea, tal como um lisado de célula, por se utilizar simplesmente um imã· (concentrador de partículas magnéticas). 20

No entanto,. estas; partículas sofrem das seguintes desvantagens: . - Nenhumas partículas de 'cor fluorescente estão, presentes. . - Não. há qualquer possibilidade de análise por citometria de fluxo..

As partículas de poliestireno de estreptavidina de. elevada, densidade, de fluorescência Vermelha, que são bem conhecidas e comercialmente disponíveis, são por· conseguinte· particularmente preferivellmente utilizadas em conformidade com a invenção. ;

As propriedades físicas destas partículas são as seguintes:

Diâmetro: 2-4 mm ' u

Densidade: 1,1-1,8 g/cm3 .- ·

As propriedades de ligação dessas partículas são preferivelmente as seguintes:·' A densidade, da estreptavidina e c comportamento em relação à ligação do anticorpo de biotina são os mesmos que para. a Dynabeads (ver acima).

As vantagens destas .partículas- são: ,·' " , - Eles fluorescem de vermelho, facilitando: assim a leitura. - A qualidade· também pode ser controlada por citometria de fluxo.

No. total, as : partículas devem ser preferencialmente compostas de poliestireno e terem um diâmetro de 2-4, pm. É particularmente preferido que estas micropartículas transportem radicais de epóxi, carboxilo e/ou de amino, ou grupos de tosilo, na sua superfície.

No. entanto, é evidente para o especialista, queas micropartículas que'podem ser utilizadas ;de acordo com a invenção também podem.ser compostas." por um ..grande número de diferentes materiais.., O especialista está · muito . familiarizado com o domínio da tecnologia de micro-partículas e existem diversas micrc-partículas diferentes-disponíveis . comercialmente que podem· potencialmente ser usadas de .acordo com a invenção. 0 tamanho preferido das micropartículas é dada acima. .

Depois do segundo anticorpo se ter ligado ao complexo de antigénio-anticorpo da primeira gota, este segundo ' anticorpo é det.ectadc. Para esse efeito, quer este segundo anticorpo pode scr marcado por fluorescência cu marcado enzimatimente, por exemplo, ou então ser possível usar um terceiro anticorpo marcado, que é dirigido contra 'este segundo anticorpo. Nâo;há necessidade de marcar o anticorpo se um teste de aglutinação for realizado.

Esses testes e métodos de detecçâo são bem 1 conhecidos do especialista na matéria.v. Os testes de aglutinação- e a citometria de fluxo podem ser preferencialmer.te utilizados, ·. em conformidade com à invenção. É uma caraoterística da· presente ' invenção que os componentes individuais do novo método de detecçâo são : conhecidos do especialista... No entanto, não foi de forma nenhuma possível prever que uma combinação destas etapas individuais levaria a um método que proporciona,., de ' uma tal maneira. extremamente surpreendentemente vantajosa,· uma solução, simples para uma: necessidade .sentida tão intensamente pela comunidade cientifica.

Em particular, também é possível, de acordo 'com a invenção, 22 fornecer estojos para. a detecção de antigénios de células sanguíneas· ou de anticorposdirigidoscontra antigénios de células sanguíneas, cujos estojos compreendem·pelo menos gotas esféricas com um. diâmetro de 2,4 uir. e uma. densidade de 1,1-1,8. g/cm3, um anticorpo específico dirigido cor.trs. um anti génio de células sanguíneas e de um anticorpo específico anti-humano.

Em outra, forma de realização.: preferida, o escojc para a detecção de antigénios' de células sanguíneas ou de anticorpos, dirigidos contra antigénios de células,-' sanguíneas, compreende ' pelo menos '' gotas esféricas com um diâmetro de 2,4 pm, . e uma censidade de 1,1-1,8 g/cm3, um primeiro anticorpo especifico ca espécie não-anti-numano, e também um anticorpo,'·..'que . é dirigido, contra o antigénio ' a . ser detectado eique é derivado das espécies contra as quais o primeiro anticorpo -é. dirigido. É claro que outros estojos, qué contêm os componentes essencialir.ente requeridos que são descritos nos métodos de acordo com a invenção também fazem parte do objectivo do peditíò..

Os exemplos que se seguem 'explicam a invenção de forma ma is detalhada.. No entanto, V eles não devem ser considerados como sendo de forma alguma limitativos. EXEMPLO 1: Células de; Solubilizaçâo

Tampão de Solubilizaçâo: 1,21 g de Tris para 950 iriL de NaCl ' pH 7,4 : ' .adição de 5 mL de Tricon X-1C0 para 10 0C n", de Na Cl

As células de teste (plaquetas) são sedimentadas a. 10 000 U/minuto .23 durante ;1 minuto em, um banco de centrifugação' (fabricante: Hettich) ., 0 sobrenadanfe é aspirado para fora e, o granulado de célula é tomado, em 100 pL,de tampão de solubilização. EXEMPLO COMPARATIVO 2 :

Um anticorpo especifico anti-GPIIa-IIIb (da firma BioTesr.). ..foi biot.inilado e tratado em solução com ·, gotas. revestidas! de estrepravidina. O anticorpo· monstrou ter-se ligado às gotas. Neste .contexto, foi verificado que a presença de 1 mM de zinco promove a ligação. :·.';' ; ç:· I' -

Posteriormente,. as gotas são incubadas com’ células’ sanguíneas solubilizadas e um segundo' anticorpo marcado por fluorescência ...é adicionado. Um ensaio de teste positivo' é caracterizado por Um aumento na ligação do anticorpo secundário ao complexo, o qual por sua vez, poderá ser medido através da fluorescência, a qual foi assim transmitida., do complexo de anticorpo isolado do segundo antigénio de anticorpo da primeira gota.

Desta maneira, foi possível detectar o antigénio GPIIa-IIIb no sangue de uma. maneira.surpreendentemente simples. EXEMPLO 3

Um teste de aglutinação (teste de placa de gel da firma Diamea, .Suíça),, foi realizado em vez de um teste baseado na marcação por fluorescência.

Desta forma, também fci possível á deteòção do'antigénio GPIIa-IIIb no sangue de uma maneira surpreendèritemente simples. 24 EXEMPLO COMPARATIVO 4

Em vez de se utilizar um teste de Elisa, as gotas marcadas com o segundo anticorpo foram detectadas.por meio dé citometria de fluxo.

Desta forma, também, foi possível detectar o antigénio GIIA-IIIb de uma maneira surpreendentemente simples.. EXEMPLO 5

Realização de um teste de acordo com 'a invenção utilizando partículas de estreptavidina fornecidas' pela firma Diamed.

Pacientes/Dadores e .Material'de amostra 20 μί de soro (inactivado a 56 °C durante 30 minutos} .

Reagentes e; equipamento \

Farticulas de Foliestireno do Estreptavidina de Elevada Densidade de Fluorescência a Vermelho (Diamed)

Propriedades físicas:

Diâmetro: 2-4 pm Densidade : 1,1-1, 8 g/cm3. A suspensão contém 0,075% de partículas (v/v); por esta razão, estas gotas foram usadas em um volume de 50 pL (em comparação com 10 pL no caso. das Dynabeads)

Propriedades de Ligação: A densidade da etreptavidina e o comportamento em relação à ligação do anticorpo de- biotina são os mesmos como no caso das Dynabeads.

Vantagens: partículas' de fluorescência vermelha;isto facilita a leitura e esta qualidade também pòde ser controlada· usando o método de citometria de .fluxo, que é bem conhecido dos especialistas na matéria. .1. /..-1 p. / .Desvantagens.: parece ser necessário bloquear as partículas com PBS-BSA depois do revestimento, uma vez..que estas partículas continuam a apresentar .elevada capacidade' de abscrvência.

Tampões ' . ··. .1/..- 1

Tampão de partícula solução de lOirM de P3S, pH 7,4, C, 1 % de Tween 20 - PB3-3SA (2% de .resistência)..: tampão fosfato de salina Duibecco x 10 1:10 diluídos em água destilada pH 7,2 1 v, : adição de 22% (1:10) de albumina de bovino ·

Tampão de Solubilizaçâo: 1,21 g de Tris para 950 mL de NaCl pH 7,4 . : ; ·. . · ·' adiçãò de. 5 mL de Triton X-100 para 1000 mL de NaCl . " anticorpos empregues.: ' 26

Especificidade Clone Espécie Isotipo Forma Factor de Excesso de Biotina GP Ilb/ITIa (CD41) ?2 Rato ' IgGl κ. Purificada 3.5' GP la/I.Ia (CD49b) .. Gi9 . Rato. IgGl κ Purificada . 15 GP Ib/IX (CD 42a) FMC-25' Rato IgGl κ Purificada 15 GP IV- (CD 36) FA6-152 .Rato ; IgG Purificada 15 · CD 9 AL3 6 . Rato : IgGl.κ Purificada . 15 Fragmento de IgG Fcy de Rato. Cabra Purificada ' Fragmento de IgG' Fcy de. Ser humano 'Cabra ' Peroxidase Biotina: sulfo-NHS-LC-biotina, . 25-mg,I Pierce,;- Pérbio Science, Rockford, E.U.A.

Filtração depois da biotinilaçãq err. unidades de filtro Millipore Ultrafree MC-30·' (Millipore Corporation, Bedford, E.U.A.), limite de filtração, de.30 kDa Membrana: celulose regenerada de baixá ligação

Calibração: , '1 : A.-aglutinação espontânea é testada e os controlos negativos são incluídos. Cada novo lote óu acoplamento é verificado quantitativamente em uma abálise de cifometria de fluxo.. Em ligação com este, as partículas revestidas de antigénio são incubadas com um anticorpo marcado por fluorescência, que. é dirigido especificamente contra o antigénio. A intensidade da . fluorescência na superfície das partículas, cuja intensidade pode ser facilmente medida por citometria. de fluxo, é proporcional ao - grau de revestimento. '

Controlo . de qualidade: inclusão, de soro. de controlo' positivo e negativo

Processo: 27

Preparação : "

Biotinilação de Anticorpos Monoclonais .V' A biotina é uma vitamina (244 daltons), ..qué . funciona como um cofactor para as carboxiiases. Como resultado da sua reduzida dimensão, a biotina, depois de. ter.sido ligada, como regra não tem qualquer influência sobre as propriedades de uma macrcmolécula. Os grupos reactivos para a biotina são os grupos e-aminc de lisina e tirosina (NHS-biotina), com a formação de uma ligação de aminá. Uma vez que os anticorpos também podem conter lisina na área das regiões, variáveis, a biotinilação pode leyar a uma perda da .detecção do antigénio. A fim de excluir òu reduzir este efeito, uma concentração óptima de biotina (excesso de biotina), à qual' as regiões' .funcionais, da ligação do anticorpo· não são. perturbadas (Ternyck e Avrair.eas 1990) , tem de ser encontrada para ' cada anticorpo. A utilização de NHS-LC-biotina foi verificada ser vantajosa para. as macromolé cuias tais como- as : glicoproteínas.. Neste, caso, quaisquer, obstáculos estéricos possíveis das macromoléculas. são prevenidos por..uma cadeia adicional contendo 6 moléculas de carbono (espaçador de hexanoato, 22 A). Depois da sulfo-NHS-LC-biotina ter sido colocada., em solução, um processamento rápido é recomendado uma' vez. que a biotina dissolvida é rnairo suscetível à hidrólise.' " . 1·,

Processo:

Dissolver a proteína em 1 mL de PBS1 e calcular mmoles d.o excesso de· biotina (factor 10-15) : mmole de proteína x (12 ou 20) = rrunole de reagente de biotina' a ser adicionado.:, mmole de biotina a ser pipetada x 556* - mg de. reagente ' de biotina ".a ser adicionado' (*556 28 é o MW de sulfo-NHS-LC-biotina) cálculo: mg de protcina/MW de proteina = mmoles de proteína

por exemplo: 1,3/lõC OCC = 8,7 x 10’δ miriole de IgG 8,7 x 1Q~S x 20 =:1,73 x./10~4 mmole de reagente de biotina 1,73 x IO-4 x 556 = 0,096373 mg de biotina (0,1 mg) 1. Permitir ; que:; a sulfc-NHS-LC-biotir.a atinja a temperatura ambiente'.antes da abertura.. , 2. Dissolver 1 mg de sulfo-NE3-lC-biotina, em 1000 pL de dHzC (1 ug = : 1 pL) . .7 i ·· 7 ambiente 3. Incubação, durante ' 30 minutos - à 7 temperatura (alterr.ativanr.ente 2 horas de incubação em gelo) . / y- > . 4. Remover' à- biotina não conjugada per. centrifugação utilizando um filtro }l;.llipore MC 33 em PBS. o. A colocação de centrifugadorá varia na dependência da proteína; por via de regra, 7 10-15 . minutos a 10 003 rpm são suficientes; alternativamente, 30 minutos a 3 500 rpm 6. - Conservar: o anticorpo biotinilado a 4 °C em 0,01% de ácido de sódio. Cálculo do Grau de Biot.ini 1-ação: : O grau de biotinilação é determinado fotometricamente utilizando o reagente Haba (2-hidrpxiazobenzeno-4-áçido carboxílico). Por isso, a absorção do reagente Haba 7(360 pL) a 500 nm é. medida em primeiro lugar por si só e anotada . por ordem, em seguida, adicionar a amostra biotinilada (40 pLj. 5 minutos depois da adição, a absorção é determinada ma is uma vez a 500. nm. Como resultado da ligação competitiva na molécula Haba,. tem lugar uma modificação de cor na dependência do conteúdo de biotina da amostra; ou seja, o grau em que a amostra é biotinilada é directamente proporcional a ZiA. 29 1. ASO Ο .= (0,9) x (ASO 3 do reagente HABA) ~ , (A500 da proteína biotinilada) 2. mmole/mL da proteína biotinilada =. mg da proteína/mL. biotinilada da amostra ' 3. pmoles da bioLina/mL da mistura de reacção

Como uma' alternativa para o. teste de reagente Haba, é possível construir, . uma curva . de calibração de biotinilação :para cada proteína . empregue. -.· Usando esta curva, é possível .'determinar, , unicamente por proteína e por lote,, a quantidade óptima de biotina, que é diferente para cada proteína. '

Uma curva de calibração dessa natureza é mostrada na FIG. 2. ;

Soros: descongelai: soros de controlo de -20 °C cuidadosamente, inicialmente a 4. °C; centrifugadora (2 minutos a 13, 00.0 rpm; centrifugadora Eppendorf) t.'

Marcar e solub.i l.izar as çlicoproteínas. das plaquetas, centrifugar 2 x 107 células de teste (padronizadas) a 10 000 rpm durante 1 minuto em um tubo Eppendorf, aspirar o sõbrenadante, resuspender 2% do granulado celular cm 30 pL de PBS-3SA 10 ' μΐ de anticorpos mo no c1ona i s biot ini1ado s específicos de glrccproteína são adicionados- por . ensaio;· uma diluição óptima, para cada anticorpo utilizado- deve. ser determinada 'previamente por-titulação para a biotinilação (ver Ruling out Spontaneous Agglutinatiõn) CD 41 1:60, CD 12a e CD49b 1:10, de anticorpo HLA., 1:200! As variações, são dependentes do lote! . '

Incubar à 37 °C durante 30 minutos

Lavar 3 vezes as plaquetas de teste, com 100 pL de PBS (centrifugar a 10 ^ 000 rpm durante 1 minuto, aspirar o sobrenadante e tomar o granulado de plaquetas em 100 pL de PBS.

Depois da. última lavagem, lisar o granulado em cada caso, em 100 .pL de tampão de solubilização; misturar 'individualmente com. uma pipeta Incubar a 4 °C durante 30 minutos

Isolamento do,antigénio na.partícula de polímero de estreptavidina Cer.trifugar os lisados a 13.000' rpm durante 30 minutos (4 °C, os resíduos da membrana celular,são removidos)'

Enquanto cs lisados estão a ser, cenrrifugados, lavar as partículas de estreptavidina DiaMed unia vez com tampão .de partículas a 10 000 rpm durante 1 minuto . .

Adicionar . 10 pL- de , partículas, (concentração, 0,5%) . a 70 pL dò lisado plaquetáriò

Incubar a 37 °C durante 30 minucos .

Lavar as partículas uma vez com' ICO pL de tampão de partícula, 10 000 rpm durante 1 minuto,' , t ·. ' .· 'Λ.·

Aspirar, o sobrenadante :

As partículas são revestidas com antigénioo podem:ser introduzidas no sistema de teste depois de terem sido ressuspensas .emtampão de partícula para o.ar uma concentração de 0,075%.

Frccediner.to de ensaio para a detecção de antigénio/anticcrpc .

Adicionar 2 0 pL de soro ao granulado de partículas, ·, ressuspender bem o granulado Incubar a 37 9C durante.30 minutos

Adicionar 100 pL de tampão- de partículas, às partículas através de uma pipeta

Lavar duas vezes em cada caso, com 100 pL de tampão de partícula Tomar 50. pL de' tampão de partícula, misturar cuidadosamente, o granulado 31

Pipetar a suspensão, de partícula directamente .sobre a placa de cabra anti-humano. (Diamed; explicado .em Lapierre Y. et al.r (1990), Transfusion 30 (2):109-113) ... ....·- .Cer.trifugar a placa, sem necessidade de qualquer outra, incubação, em um centrifugador. de placa. DiaMed .a 900 rpm durante 10 minutos

Avaliação dos resultados, ver a FIG . 1.. . -A elevada sensibilidade do teste é claramente evidente.

Até ao . momento, 34 dos soros, 'de· diferente 'réáctividade foram testados, selectivamenté- A .comparação' com MAIPA. mostra que a sensibilidade e a especificidade sãó comparáveis.

Nos soros N = 8, foi:possível detectar a: especificidade de,anti-Pla 1 em paralelo -1././ :.· · .. Nos soros N = 2,- não foi possível, apesar de uma verificação prévia, decectar qualquer anti-Pla 2, quer em MAIPA ou no teste de placa ' : .· · ’ ·1·. 111--

Nos soros . N = 4, foi possível detectar anticorpos, que têm . especificidade anti-3rs "

Nos soros K = 4, foi possível detectar auto-anticorpos· através da variação da especificidade

Os .soros N - 8 foram testados negativos· em MAIPA e no téste de placa '.· _'·..

Os soros N = 8 reagiram não especificamenre em ambos os testes . Com uma duração· de ensaio de 30-45 "minutos (usando previamente partículas, revestidas) ,: o trabalho e o tempo de entrada é mínimo.

Apresentação dos Resultados: 32

Avaliação (ver . a . figura 1) ...

Positivo: gotas aglutinadas formam uma. linha vermelha sobre o , gel ou estão divididas no gel (++++ para +)

Negativo: sedimento compacto da partícula no fundo da cavidade no placa ID.

Lisboa,. 15 de Outubro de 2 00,8..

Claims

. ' 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitrc para detectar. / antigénios de células sanguíneas, ou anticorpos que : actuam contra antigénios de células- sanguíneas, em amostras de . seres .humanos, caracterizado pelo., facto dos antigénios de células sanguíneas, nativas, ou . dos anticorpos : nativos que actuam contra, os antigénios de- células sanguíneas, como: pode, ser 0 caso,, são retirados das amostras,: utilizando anticorpos monoclonais, com gotas cujo diâmetro, é de 2-4/pm e cuja densidade é.de 1,1-1,8 '/g/cm1 2, e a détecção 'dós •antigénios de célglas sanguíneas, ou dos ancicc-rpos que actuam contra os antigénios de células ' sanguíneas, ser realizada por aglutinação em uma placa. de gel que contém um anticorpo específico ce espécie, adequado para a detecção, o qual actua contra as : espé.cies/à partir. das . quais o anticorpo 'utilizado para detectar a origem dc antigénio de 1 células- sanguíneas·,·, ou do qual o anticorpo actua' contra os antigénios de células sanguíneas que é para detectar a origem.. 1 Métcdo. in vitro para detectar anticorpos, que actuam contra- antigénios de células, sanguíneas,·- em amostras de seres humanos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pele fado de . 2 ’/. (i} as, gotas são revestidas com anticorpos não-humanes que actuam contra os' antigénios específicos das células sanguíneas'. (ii) os antigén:ioS de células sanguíneas associados, específicos,.seleccionados, cs quais podem, se necessário, ser ' obtidos· através da solubilizagão de células sanguíneas normais que já foram conhecidas por · si Sós- na.' técnica ..anterior ou . 2 mesrrio por métodos' de química recombinante ou de proteína,-' são misturadas; com as. gotas .revestidas obtidas, a partir de (i) ,· .(iii) os complexos produzidos compreendem gotas revestidas com anticorpos ánti-humanos e os antigénios de células sanguíneas, se3.eccicuados, são misturados com uma amostra de soro de u:r. 'paciente que está a ser examinado, e (iv) os anticorpos de células sanguíneas de um; paciente cs quais podem possivelmente, ser encontrados em complexos" são ' derectados por aglutinação na placa de gel'.· , :' 3. " Método in vitro para delectar anticorpos que actuam contra anoigénios de células sanguíneas, de acordo com ... a reivindicação 1, caracoerizado pele facto de . . (i) as gotas são revestidas com anticorpos específicos’ de , espécies-não-anti-humanaS ; ' o (ii) · as células sanguíneas nooais, . são solubilizadas ou os antigénios de células sanguíneas obtidos geneticamente ou por química de preteina são dissolvidas numa solução, (iii) o solubilizado obtido a partir de (i), ou a solução de antigénios de células.sanguíneas obtidos geneticamente ou por química de proteína é incubado corri anticorpos específicos os ,'quáis actuam contra o ántigénio e ó qual . origina das espécies definidas em (i), (iv) os complexos formados em (iii). são isolados, utilizando as cotas de (i), através de centrifugação, (v) são incubados çoir. soro · que contém o anticorpo originário do paciente imediatamente ou numa etapa posterior, e (vi) os anticorpos ligados aos complexos são détectados por aglutinação, na placa de gel.

3
4. Método in\ vitro para detectar · antigénios de células . sanguíneas, de acordo- com a - reivindicação: 1, çaracte.rizado pelo facto de· (i) asgotas são revestidas com anticorpos que actuam contra os antigénios de células sanguíneas que são para. serem detectados, (ii) as amostras de sangue derivadas de. um paciente que ..está a ser examinado,' e .as células , de 'sangue aí. contidas, .são· . submetidas a um tratamento .. peio·,· qual os antigénios presentes na membrana das ·células do sangue são solubilizados, e uma fracçâo enriquecida· de, antigénio é. produzida, se' for o caso, · .. (iii) as gotas revestidas obtidas, a partir de (i) são misturadas com a amostra obtida a partir de (11),.. ’ ' (iv) o ' complexo que., compreendei as gotas, os anticorpos, .que actuam contra os antigénios de células sanguíneas específicas que são para serem detectadas, . e os antigénios de células sanguíneas são incubados com anticorpos que são espedíficos para o antigénio de células sanguíneas; e (v) os anticorpos ligadosaos complexos são detectados por aglutinação na placa de gel.
5.. Método in vitro para . detectar antigénios de células sanguíneas, de acordo com a réivindlcação 1, caracterizado pelo facto' de (i) as gotas são revestidas com anticorpos específicos de espécies não-anti-humanas, (ii) as células sanguíneas de um paciente que está a ser .examinado são solubilizadas (iii) o solubilizado obtido a. partir, de (ii). é incubado com anticorpos específicos os quais actuam contra o antigénio que é para ser detectadc e o qual origina das espécies definadas ém (i), ..:,1. (iv) os complexos formados em (iii) são isolados, utilizando as gotas de (i) , através' de centrifugação, · : (v) os complexos são incubados ccm anticorpos os quais actuam contra c ar.tigéniõ, e . (vi) os anticorpos:ligados aos. complexos são detectados por aglutinação na placa de gel. Método iii vitro para dètectar anticorpos dirigidos cor.tra antigénios de células. sariguineas, . ém . uma. amostra- de soro. de 'um paciente, . de acordo com. a ..reivindicação 1,· caracterizado pelo facto de 1 ·. .. (.1) cs anticorpos, não-humanos. biotiniiados que são ídirigidos contra o ar.tigéniõ são colocados em contacto com as células de teste humanas quét transportam1 os.. antigénios de células sanguíneas nativas correspondentes, . (ii) o complexo formado a partir: de (i) é submetido’ a condições nas quais .as células sanguíneas solubilizam, (iii) o complexo que.compreende os antigénios e os anticorpos biotiniiados é retirado da amostra por meio de gotas revestidas' com. estreptavidina ou avidina, (iv) o complexo que: foi formado ém (iii) é colocado em contacto com uma amostra de soro a partir de um paciente a ser investigado, e ' (v.) os complexos que se .. formam a partir de anticorpos específicos a estarem presentes na amostra, do soro,.cujos complexos compreendem anticorpos: biotiniiados, antigénios e anticorpos humanos a partir do soro, são. detectados por aglutinação, .na placa de gel logo que os complexos tenham sido separados da amostra. 5
7. Método in vitro para detectar. antigénios de células, sanguíneas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peio facto de (i) os . anticorpos biotinilados que são dirigidos contra o antigénio a ser ·, detectado sâo colocados . em .contacto com as células humanas originárias do espécime a ser examinado, cujas células humanas podem possivelmente transportar os antigénios ... do células sanguíneas nativas apropriadas,! ; ' (ii) .. õ 1 complexo , formado a • partir.. de . {.i) é submetido a condições nas quais as.células sanguíneas solubilizam, . . (ili).; o; complexo que compreende, os' antigéniòs elos anticorpos biotinilados é retirado da amostra por rei o de gotas revestidas cora estreptavidinà òu avidina, (iv) o complexo que foi formado em (iii) é colocado em . contacto com um segundo anticorpo que áctua contra o antigénio, cujo segundo anticorpo é preferivelmente marcado, e (v) os complexos cuja forma compreende anticorpos biotinilados, antigénios é o segundo anticorpo são detectados . por aglutinação na placa de gel logo que os complexos tenham sido separados da amostra.:.
8. Método de acordo com uma das reivindicações, anteriores em que os anticorpos, marcados por fluorescência ou os anticorpos enzimaticamenie marcadossão ut.i].i.zados.
9. Método de acorde com uma das reivindicações anteriores, em que os. anticorpos biotinilados são ligados por ; meio de gotas revestidas com estreptavidina e/cu avidina..
10. Estojo para a detecção de anticorpos que actuam contra os antigénios de células sanguíneas, que compreende pelo menos

gotas gujc diâmetro é dé 2-4 p e cuja densidade é de 1,1-1,8 g/cm3,' um anticorpo especifico que açtua contra um antigénio de célula sanguínea, e uma. placa . de gel·.' que contém um anticorpo anti-humano específico.
11. Estojo para a detecção de .anticorpos; que actuam contra os an ti génios de células sanguíneas, que compreende \pelo menos gotas gujo diâmetro é de 2-4 um e cuja densidade é de 1,1-1,8 .. g/cm3, um primeiro anticorpo que. actua contra um antigénio a : ser detectado, um. segunde anticorpo que actua conrra um antigénio a ser detectado, e uma . placa de gel que. .contém um. : / segundo , anticorpo, específico da espécie que:, actua contra, o ' segundo,·: anticorpo, que . ..actua ' contra o antigénio a ser detectado. ; t·;·/··7 Lisboa., 15 de Outubro de 2008