JP4464048B2 - 血液細胞抗原および該抗原に対して指向される抗体の検出方法 - Google Patents

血液細胞抗原および該抗原に対して指向される抗体の検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、血液細胞上の抗原を検出する方法または該抗原に対して指向される抗体をヒトの血中で検出する方法に関する。本方法は、患者から採取された血液を用いてin vitroで実施される。
今日では特定の疾患の診断は、赤血球および白血球並びに血小板に由来する選択された抗原を検出するか、また別にはこの抗原に対して指向される特異的抗体を患者の血中で検出することを必要とする。
血液細胞抗原は、赤血球、血小板および白血球上の表面マーカー（特徴）である。それら抗原は通常は、糖タンパク質、糖脂質またはタンパク質である。この点に関する要旨は、例えば以下の成書で見出すことができる：Transfusionsmedizin［Transfusion medicine］、Mueller-Eckhardt (編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.137-200。
これら血液細胞抗原の臨床的な重要性は、それらの免疫原性、すなわち、例えば通常の環境下ではこれらの抗原を保有していない個体で輸血後に、特異的抗体の生成を刺激する能力によって確認される。
血液細胞抗原に対して指向される上記抗体の生成はまた、例えば出生後に、血液型群同種凝集素の場合のように（抗Ａおよび抗Ｂ）、または妊娠、器官移植もしくは骨髄移植の背景状況の中で選ばれる同種異系細胞によって、誘発され得る。対応する抗体の例は、赤血球に対して指向される抗Ｄ、抗Ｋ、抗Ｆｙなど、血小板に対して指向される抗ＨＰＡ−１および抗ＨＰＡ−２、顆粒球に対して指向される抗ＩＮＡ−１および抗ＩＮＡ−２、またはＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩに対して指向される抗体である。
上記の他に、抗体はまた内因性抗原に対してもまた生成され得る（自己抗体）。これらの抗体は、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症または自己免疫性好中球減少症（顆粒球減少症）の事例のように自己由来細胞の成熟前の分解または崩壊をもたらし得る。
胎児および新生児では、赤血球に対して指向されるアロ抗体、特に免疫抗体（例えば抗Ｄおよび抗Ｃ）は種々の重篤度をもつ溶血（新生児溶血症）を生じる。
同種凝集素および臨床的に関連を有するアロ抗体は、赤血球を用いる輸血の前に考慮しなければならない。通例は、血清学的に認容できない赤血球はいずれも輸血することができない。例えば、（Ｒｈ陰性）レシピエントが抗Ｄ特異性を有するアロ抗体を保有するとき、Ｒｈ陽性赤血球は凝集する。このような理由で、輸血前に赤血球に対して指向される抗体を特定して輸血中にそれらを考慮する必要がある。さらにまた、輸血前には常に、輸血用に保存されている保存血サンプルの全てを用いて血清学的寛容検査（クロステスト）を実施する必要がある。
今日まで、赤血球抗原に対して指向される抗体は、日常的には、血清サンプルを天然の選択されたテスト赤血球とインキュベートするか（抗体検索さらに適切な場合には抗体特定）、または輸血前にドナー赤血球とインキュベートする（クロステスト）ことによって検出されてきた。血清と赤血球間の不耐性は、検査時に赤血球の直接または間接凝集によって示される。例えば同種凝集素抗Ａおよび抗Ｂは赤血球の直接凝集を誘発する。間接凝
集は、例えば抗ＤをＲｈ陽性テスト赤血球とインキュベートし、続いて抗ヒトグロブリン血清を添加することによって（間接クームス試験）誘発される。
テスト赤血球を用いる欠点は、あるテスト赤血球の選別、希少性および入手可能性並びに前記細胞の保存時間が短いことから生じる。前記細胞を単離するためには、既知の抗原を保有する選択されたドナーを定期的に検索することが必要で、単離された細胞は短期間しか保存できない。
これまでに記載されてきた実質的に全ての検査方法は前記のような細胞の使用に依存している（以下を参照されたい：Transfusionsmedizin［Transfusion medicine]、Mueller-Eckhardt (編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.587-596およびNew diagnostic methods in oncology and hematology, Huhn (編) Springer Verlag, Berlin, 1998, pp. 197-212）。
これらの方法に付随する欠点はしたがって以下のとおりである：
* 単離された（単一）特性を有する赤血球（例えば特徴的な“Ｄ”のみを保持する細胞）を得ることが可能でないので、特異的抗体を識別するために、いくつかの（通常は１１を越える）テスト赤血球（テスト細胞）を各検査につき使用する必要がある。
* 特定の抗体を認識する稀な特徴を有するテスト赤血球は通常は入手することができない。上記の理由のために患者の看護が常には保証できない。
* 一般的に、通常存在する特徴を欠くテスト赤血球は、特異的抗体の認識のためには利用できない場合が多い。このためにまた患者の看護が常には保証できない。
* 適切なテスト細胞を選択することは複雑で費用のかかる事柄である。
* 上記材料はヒトから単離される生物学的材料であるので、該材料を取り扱う医療従事者および医師の感染の危険性を常に排除できない。
* 上細胞は限定された期間しか保存できない。
血小板抗原に対して指向される抗体の臨床的重要性は、自己免疫性血小板減少症（ＡＩＴＰ）、新生児アロ免疫性血小板減少症（ＮＡＩＴ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）および不適切な血小板輸血で示される。いずれの場合でも、抗体は止血の主要な混乱および患者の出血性素質をもたらし得る。
これまでのところ血小板に対して指向される抗体を検出することは困難で、そのような検出は少数の専門検査室でのみ実施可能である。血小板の性質のために、これまでのところ赤血球の場合のような簡便で迅速な凝集テストの開発は可能ではなかった。もっとも頻繁に用いられるこれまでに報告された方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および血小板吸着免疫蛍光検査（ＰＩＦＴ）、並びに、結合免疫グロブリンを特定するための免疫沈澱またはＭＡＩＰＡ（血小板抗原のモノクローナル抗体固定化）アッセイである（以下を参照されたい：Transfusionsmedizin［Transfusion medicine]、Mueller-Eckhardt (編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.597-602; New diagnostic methods in oncology and hematology, Huhn (編) Springer Verlag, Berlin, 1998, pp. 213-228; McMillan, Transfusion Medicine Reviews, Vol.IV, No.2, pp136-143(1990)）。
上記の方法は以下の多様な欠点を有する：
* 全ての検査方法は、標準化血小板が通常入手不能であるので労働集約型であり、さら
にエキスパートのみがその検査を実施できる。
* 例えばＥＬＩＳＡまたはＭＡＩＰＡで、自己血小板、または血小板の数が少ない患者の場合、十分な数の自己血小板の単離および検査がしばしば不可能である。
* 特異性（ＥＬＩＳＡおよびＰＩＦＴ）および感度（ＭＡＩＰＡ）は限定的であり、結果としてしばしば結果を解釈することができない。
* 赤血球抗原の検出に関連して上記で述べた欠点の本質的に全てが本欠点にも適用される。
好中球依存抗原に対して指向される抗体の臨床的重要性は、自己免疫性好中球減少症、新生児アロ免疫性好中球減少症およびＴＲＡＬＩ（輸血付随急性肺不全）によって特徴付けられる。本抗体の検出は血小板抗体の検出よりもさらに困難である。これまでに知られている検査方法は、血小板に対して指向される抗体の検出方法を広範囲に応用している（以下を参照されたい：Transfusionsmedizin［Transfusion medicine]、Mueller-Eckhardt
(編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.603-609; New diagnostic methods in oncology and hematology, Huhn (編) Springer Verlag, Berlin, (1998), pp. 228-235; Minchinton and Waters, British Journal of Haematology, 56, pp.521-528, (1984), McCullough and William, Transfusion Medicine Reviews, Vol.1, No.3, pp150-160(1987)）。
さらにまた、リンパ球（特にＴリンパ球）に対して指向される抗体は移植免疫学において極めて重要である。これらの抗体は移植物（骨髄、心臓、肺臓、腎臓および他の器官）の急性または遅延性拒絶を生じ得る。この理由のために、骨髄および腎臓移植を実施する前に、ドナー器官に対して指向されるリンパ球性抗体の存在を一切排除することが必要である。
さらにまた、リンパ球抗原（ＨＬＡ抗原）は、妊娠および輸血に関連してＨＬＡ特性に対して指向される特異的抗体の生成をもたらし得る。この理由から、その抗体の存在の可能性は、該当する場合には移植、並びに血小板および白血球の輸血に関連して考慮する必要がある。
ＨＬＡ抗体を検出する古典的な方法はこれまでのところリンパ球細胞毒性検査に限定されていた。しかしながら、この検査は補体活性化抗体の測定に用いることができるだけである。最近用いられているＥＬＩＳＡ法は極めて難しく、一部の専門検査室でのみ実施される（以下を参照されたい：Transfusionsmedizin［Transfusion medicine]、Mueller-Eckhardt (編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.611-617; Zacharyら， Transplantation, Vol.60, No.12, pp.1600-1606 (1995); Lubenko および Rodi, Transfusion, Vol.38, pp.41-44 (1998)）。
要約すれば、血液細胞に対して指向される抗体を検出する全ての検査原理は、選択された生物学的な、さらに通常は天然のテスト細胞に基づく。この細胞は、選択された個体から得られ、続いて利用可能にされる。
比較的迅速で単純な検査は、赤血球に対して指向される通常的抗体、例えば抗Ｄ抗体の検出についてのみ可能である。
別の選択肢についての探索はこれまでのところ成功していない。
ほとんどの血液型系（赤血球、血小板および白血球）の遺伝子がこれまでにクローニングされ、それらのいくつかは配列が決定されたが、組み換え抗原およびペプチドは、あっても抗体検出のために単離された事例でのみ用いられている（Bowditchら, Blood, Vol. 88(12)：4579-4584 (1996); Petersonら, Blood, Vol. 92(6)：2053-2063 (1998)； Yazdanbakhsh, Transfusion Medicine Reviews, Vol. 15(1):53-66 (2001)）。
上記で述べたＭＡＩＰＡ検査においてさえも（ここで抗体は間接ＥＬＩＳＡ試験を実施するためにマイクロタイタープレートに固定される）、操作に多くの実際的な問題がなお存在する。したがって、この検査は約７〜８時間を要し、検査結果はしばしばあいまいである。さらに、被覆したマイクロタイタープレートを十分に長期にわたって保存することは不可能で、適切な溶液は全て検査室で実施に際して新しく調製しなければならない。
Meyerら（THE LANCET, Vol. 354(9189):1525-1526 (1999)）は、抗原被覆ビーズに患者の血清サンプルを添加することによって、粒子凝集テストで血小板因子４およびヘパリンから成る複合体に対して指向される抗体を検出することができる検査系を報告した。凝集サンプルは、ゲルカードテストによって検出された（例えば以下を参照されたい：Salama
and Mueller-Eckhard in:Transfusionsmedizin［Transfusion medicine]、Mueller-Eckhardt (編), Springer-Verlag Berlin (1999), pp.587-617）。しかしながら、かれらの精力的な努力にもかかわらず、発明者らは、この比較的迅速で実施が容易なテストを他の血液細胞抗原またはこの抗原に対して指向される抗体の検出に用いることには成功しなかった。
選択された血液細胞抗原に対して指向される抗体の検出に用いることが可能で、さらに上記に挙げた欠点を克服することができるテスト系に対する、上記に述べた事柄から必然的に生じる極めて強い必要性があるにもかかわらず、そのようなテスト系は本発明の前には利用可能ではなかった。
米国特許第６２０３７０６号は、例えば血液細胞抗原または血液サンプル中の抗体の検出に用いられる方法を開示している。しかしながら、その該当する方法（抗原が直接ビーズに結合されている）は、稀な事例でのみ機能することが判明した。
上述の先行技術から見れば、本発明はしたがって、選択された血液細胞抗原に対して指向される抗体を特異的に検出するために、または血液細胞抗原自体を検出するために用いることが可能な方法を利用できるようにするという目的をベースにしていた。本方法は、操作が簡単で迅速であり、その実施に信頼性があり経済的である。さらにまた、本方法は生きている生物から得ることができるサンプルでインビトロで実施することが可能であるはずである。
本発明の目的および他の目的（明示的には述べられていないが、紹介することにより本明細書で考察されている関連事項から容易に推測または推論できる）は、特許請求の範囲１から４の全ての特徴を有する方法によって達成される。本発明の新規な方法の都合の良い改変は付随するサブクレームで保護される。
変法１：
インビトロの方法で、以下の手段によって達成される：
（ｉ）ビーズを検出されるべき特定の血液細胞抗原に対して指向される非ヒト抗体で被覆し；
（ii）付属の特定の選択された血液細胞抗原であって、適切な場合には、それ自体は従来技術で既に公知である標準化された血液細胞を可溶化することによって、また別には組換え方法またはタンパク質化学による方法を用いて得ることができる抗原を、（ｉ）で得られた被覆ビーズと混合し；
（iii）上記選択された抗原と（ｉ）のビーズに結合された非ヒト抗体との結合の結果として抗原で被覆されている該ビーズを、検査されるべき患者の血清サンプルと混合し；さらに
（iv）特異的抗ヒト抗体テストを用いて、上記サンプルに由来し、さらに上記ビーズに結合した抗原と結合することができた患者の血液細胞抗原抗体を検出する。
そしてこれは、容易には予測できない態様であって、血液細胞抗原に対して指向される抗体をサンプル中で検出する方法を利用可能にし、検出の容易な実施を可能にする。
変法２：
ただ、以下の場合血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出する新規な方法のわずかな改変を示す：
（ｉ）ビーズを非抗ヒト種特異的抗体で被覆し；
（ii）標準細胞を可溶化するか、または組換えもしくはタンパク質化学的方法を用いて得られた血液細胞抗原を溶液にし；
（iii）（ii）の結果として生じる、上記可溶化物、または組換えもしくはタンパク質化学的方法を用いて得られた血液細胞抗原の溶液を、検出されるべき抗原に対して指向され、かつ（ｉ）で限定される種に由来する特異的抗体とインキュベートし；さらに
（iv）（ｉ）のビーズと一緒に（iii）で形成された複合体を遠心分離によって単離し；さらに
（ｖ）患者由来の抗体含有血清に対して、凝集テストで直接検査するか、または後で検査する。
変法３：
インビトロの方法はまた以下によって達成される：
（ｉ）ビーズを検出されるべき特定の血液細胞抗原に対して指向される抗体で被覆し；
（ii）検査されるべき患者に由来する血液サンプルを、その中に含まれている血液細胞とともに、該血液細胞の膜に存在する抗原が可溶化される処理に付し、さらに適切な場合には抗原濃縮分画を調製し；
（iii）（ｉ）で得られた被覆ビーズを（ii）で得られたサンプルと混合し；
（iv）特異的抗体テストを用いて、上記サンプルに由来し、かつ上記ビーズに結合した抗体と結合することができる血液細胞抗原を検出する。
変法４：
さらにまた以下によってサンプル中の血液抗原を検出することができる：
（ｉ）ビーズを非抗ヒト種特異的抗体で被覆し；
（ii）検査されるべき患者に由来する血液細胞を可溶化し；
（iii）（ii）で得られた可溶化物を、検出されるべき抗原に対して指向され、かつ（ｉ）で限定される種に由来する特異的抗体とインキュベートし；
（iv）（ｉ）のビーズと一緒に（iii）で形成された複合体を遠心分離によって単離し；さらに
（ｖ）凝集テストで上記サンプルを検査する。
新規な本方法は、特に操作が簡単で迅速であり、さらにその実施には信頼性があり経済的である。
一方、以前にはほとんど常に天然のテスト細胞を使用するか、または天然のテスト細胞を近い時点で調製することが、従来技術でこれまで述べてきた系を実行するために要求されたが、新規な本方法ではこの点が免除される。特に、本発明にしたがって用いることができる被覆済みのビーズは、天然のテスト細胞よりも実質的に高い保存性を提供する。さらにこれら被覆ビーズは、理論的には無制限の量で提供され、必要が生じた時のために保存することができ、これにより実質的な単純化が同様に得られる。
本発明にとって極めて重要なことは、血液細胞抗原、またはそれらに対して指向される抗体は、天然の抗原に対して指向されるモノクローナル抗体を用いてサンプルから探し出された該天然の抗原によって検出されるということである。本改変方法を用いたときにのみ、上記の技術的目的は、極めて容易にさらに高い信頼性をもって、少ない投入エネルギーで首尾よく達成され、これは従来技術と比較したとき極めて重要である。
本発明にしたがって用いることができる被覆済みビーズは、変法１の工程（ii）で得られるビーズ、変法２の工程（iv）で得られるビーズ、変法３の工程（ｉ）で得られるビーズ、および変法４の工程（ｉ）で得られるビーズである。
これらのビーズは長期にわたって、すなわち天然のテスト細胞の場合よりも実質的に長く保存することができる。
生物学的な出発材料は、上記目的のために特別に適合させた専門の検査室で調製することができるので、関与する職員が感染する危険性もまた減少する。
本発明は、血液細胞抗原またはそれらに対して指向される抗体を検出することを含む。現時点では、７００を越える赤血球抗原が報告されている。さらに多くの抗原が他の血液細胞で存在することが報告されている。これら全ての抗原が臨床的に関連を有するか、または有する可能性がある。したがって、本発明が基本的にこれらの抗原全てを迅速にさらに信頼性をもって検出するために用いることができることは当業者には明白である。
これら血液細胞抗原の編集物は例えば以下で見出すことができる：Issitt, P. および
Anstee, D. (編) : APPLIED BLOOD GROUP SEROLOGY, Montgomery Scientific Publications, Durham, North Carolina, USA。好ましくは本発明を用いて検出される特に重要な血液群抗原は以下のとおりである：ＡＢＯ；Ｃ、ＣW、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｋ、ｋ、Ｆｙ（ａ）、Ｆｙ（ｂ）、Ｊｋ（ａ）、Ｊｋ（ｂ）、Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｎ、Ｐ（１）、Ｌｅ（ａ）、Ｌｅ（ｂ）。
必要とされる極めて多くの抗体もまた既に利用可能である。これらの抗体の例は以下のとおりである：抗Ｊｋａ（DiaClonから入手可能）、抗Ｊｋｂ（DiaClon）、抗Ｌｅａ（DiaClon）、抗Ｌｅｂ（DiaClon）Ｒｈテスト血清（BIOLITH DIAGNOSTIKA, Hann. Meunden, Germany）、抗Ｄ、抗Ｃ、抗ｃ、抗ＣW、抗Ｅ、抗ｅ、ＭＮＳｓ系のテスト血清（抗Ｍ、抗Ｎ、抗Ｓ）またはその他の血清（Dadeから供給される）（例えば抗Ｋ1）。血液細胞抗原に対して指向される合計６００を越える種々のモノクローナル抗体が世界中で市販されている。
そのような抗体が入手できない場合には、それら抗体はポリクローナル抗体としてまたはモノクローナル抗体として調製できる。抗体の製造方法に関して当業者は周知している。
従来技術で既に記載された方法でも用いられているプロトコルが、血液細胞または血液細胞抗原の可溶化に利用することができる。すでにどこかで説明したように、非常に重要
な本発明の利点は、被覆ビーズの実質的により長期にわたる耐久性のために、これらのプロトコルが、該プロトコルに適合する検査室で大規模に実施できるということである。
本発明にしたがって用いることができる被覆ビーズを調製するために、ビーズに特異的抗体を結合させなければならない。
この結合は、好ましくはストレプトアビジンまたはアビジン／ビオチン複合体により仲介され、ビオチン化抗体がストレプトアビジンまたはアビジン被覆微小担体に結合される。前記に該当する方法は当業者には周知で、米国特許第６２０３７０６号に詳細に記載されている。
特に好ましくは、ビオチン化された、検出されるべき抗原に対して指向される抗体を先ず初めに天然の細胞（テスト細胞）と反応させ、その後該細胞を可溶化し、生成された抗原およびビオチン化抗体の複合体をストレプトアビジンまたはアビジン被覆ビーズ（微小担体）を用いて反応混合物から分離する。
生成されたこの複合体を続いて以下の異なる２つの方法で用いることができる：
１）抗原に対して指向される抗体の存在を患者の血清中で検出しようとする場合は、生成された複合体を続いて直接血清とインキュベートすることができる。存在し得るいずれの抗体もその抗原と反応し該複合体と結合する。検出されるこれらの抗体はヒト由来であるので、検出される抗体は、テスト混合物から分離された後抗ヒト抗体および周知の方法を用いて結合させることができる。
以下は使用可能な方法の例示リストである：標準的抗ヒトグロブリンテスト、カードテスト（Y. Lapierre ら, (1990) Transfusion 30(2):109-113）、ＥＬＩＳＡ（マイクロタイタープレートで検出）、マイクロチップ、毛細管拡散、フローサイトメトリー、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ；例えばビーズをヨード125で標識）など。上記一連の方法が当業者には利用可能である。ゲルカード法（カードテスト）およびフローサイトメトリーが特に適していることが証明された。
２）抗原を直接検出しようとする場合は、同じ方法を用いて、抗原およびビオチン化抗体およびストレプトアビジン被覆またはアビジン被覆ビーズからなる上記の複合体と第二の抗体を直接結合させることができる。このために、第二の抗体を直接標識するか（例えばヨード125、酵素標識）、または別には、種特異的抗体を手段として、および上記の方法を用いてもう一度検出される。このとき、この種特異的抗体は第二の抗体が由来する種に対して指向されなければならない。
血液細胞抗原、または該抗原に対して指向される抗体を血清サンプルで検出する新規な系の特に好ましい変型はしたがって以下を含む：
患者の血清サンプルで血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するインビトロの方法の場合：
（ｉ）検出されるべき抗原に対して指向されるビオチン化非ヒト抗体を、対応する天然の血液細胞抗原を保有するヒトテスト細胞と接触させ；
（ii）（ｉ）で生成された複合体を上記血液細胞が可溶化される条件に付し；
（iii）抗原およびビオチン化抗体からなる上記複合体を、ストレプトアビジン被覆またはアビジン被覆微粒子を用いて上記サンプルから取り出し；
（iv）（iii）で生成された複合体を検査されるべき患者由来の血清サンプルと接触させ；さらに
（ｖ）抗ヒト抗体テストを用いて、特異的抗体が上記血清サンプルに存在するときにビオチン化抗体、抗原および該血清中のヒト抗体から生成される複合体を、該複合体をいっ
たんサンプルから分離して検出する。
さらにまた、選択された血液細胞抗原を検出するインビトロの方法の場合：
（ｉ）検出されるべき抗原に対して指向されるビオチン化抗体を、対応する天然の血液細胞抗原を保有するヒトテスト細胞と接触させ；
（ii）（ｉ）で生成された複合体を上記血液細胞が可溶化される条件に付し；
（iii）抗原およびビオチン化抗体からなる上記複合体を、ストレプトアビジン被覆またはアビジン被覆微粒子を用いて上記サンプルから取り出し；
（iv）（iii）で生成された複合体を、上記抗原に対して指向される好ましくは標識された第二の抗体と接触させ；さらに
（ｖ）慣例の方法を用いて、ビオチン化抗体、抗原および第二の抗体から生成される複合体を、該複合体をいったんサンプルから分離して検出する。
上記抗体を化学的にビーズに結合させることもできる。
本発明の目的のためには、ビーズは、種々の素材で構成された球状の微小担体であると通常考えられる。
これに関して、強磁性体ストレプトアビジン粒子（例えばＭ２８０ストレプトアビジンダイナビーズ）を用いることが好ましい。
これら粒子の物理的特性は以下のとおりである：
直径：２〜４ｍｍ
密度：１.１〜１.８ｇ／ｃｍ3
磁気質量モーメント（magnetic mass moment）：１００±２５×１０-6ｍ3／ｋｇ
懸濁液は好ましくは１０ｍｇ粒子／ｍＬ（６.７×１０8／ｍＬに該当）を含む。
該粒子の結合特性は好ましくは以下のとおりである：
１ｍｇのＭ２８０ストレプトアビジンダイナビーズは５−１０ｇのビオチン化抗体と結合することができる（１００％飽和の、ポリスチレンの表面と共有結合したストレプトアビジン）。
これら粒子の利点は以下のとおりである：
その常磁性特性の結果として、これらの粒子はビオチン−抗体−抗原複合体を不均質混合物（例えば細胞溶解物）から単に磁石（磁性粒子濃縮装置）を用いることによって単離するために適切である。
しかしながらこれら粒子は以下のような欠点を有する：
* 着色−蛍光粒子が存在しない；
* フローサイトメトリーによって分析することができない。
したがって、周知であり市販もされている赤色−蛍光性高密度ストレプトアビジンポリスチレン粒子が本発明では特に好ましく用いられる。
該粒子の物理的特性は以下のとおりである：
直径：２〜４ｍｍ
密度：１.１〜１.８ｇ／ｃｍ3
これら粒子の結合特性は好ましくは以下のとおりである：
ビオチン抗体結合に関するストレプトアビジンの密度及び性質はダイナビーズと同じで
ある（上記参照）。
これら粒子の利点は以下のとおりである：
* それらは赤色蛍光を発し、したがって読み取りを容易にする。
* 性能もまたフローサイトメトリーでモニターすることができる。
総合すれば、該粒子は、好ましくはポリスチレンで構成され、直径は０.０１から１０μｍ、特に好ましくは２〜４μｍであるべきである。これらの微粒子はエポキシ、カルボキシおよび／またはアミノラジカル、またはトシル基をその表面に保有することが特に好ましい。
しかしながら、本発明にしたがって用いることができる微粒子は多数の様々な材料で構成されてあってもよいことは当業者には明白であろう。微粒子技術分野に関して当業者は熟知しており、本発明にしたがって用いることが可能な多くの異なる市販の微粒子が存在する。この微粒子の好ましいサイズは上記に示されている。
第二の抗体がビーズ−第一の抗体−抗原複合体に結合した後、この第二の抗体を検出する。この目的のために、例えばその第二の抗体を蛍光標識するか、もしくは酵素標識するかのいずれか、また別にはこの第二の抗体に対して指向される第三の標識抗体を用いることも可能である。凝集テストを実施する場合は抗体を標識する必要はない。
そのようなテストおよび検出方法は当業者にはよく知られている。凝集テストおよびフローサイトメトリーは、好ましくは本発明にしたがって用いることができる。
新規な本検出方法の個々の構成が当業者に周知であることは本発明の特徴である。しかしながら、これら個々の工程の組み合わせが、上記のように極めて驚くべき有利な態様で、科学業界の非常に強い要請に対する単純な解決を提供する方法をもたらすとは全く予測不可能であった。
特に、本発明にしたがって、血液細胞抗原または血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するキットを提供することができる。該キットは少なくとも以下を含む：直径が０.０１から１０μｍ、好ましくは２〜４μｍの球状ビーズ、血液細胞抗原に対して指向される特異的抗体および特異的抗ヒト抗体。
別の好ましい実施態様では、血液細胞抗原または血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するキットは少なくとも以下を含む：直径が０.０１から１０μｍ、好ましくは２〜４μｍの球状ビーズ、第一の非抗ヒト種特異的抗体、および検出されるべき抗原に対して指向され、さらに該第一の抗体が指向される種に由来する抗体。
本発明の方法に記載した本質的に必要な構成を含む他のキットもまた本出願の主題の一部分を構成することは明白であろう。
以下の実施例で本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は範囲を限定するものと解されるべきではない。
細胞の可溶化
可溶化緩衝液：１.２１ｇのトリスを９５０ｍＬのＮａＣｌ（ｐＨ７.４）に添加し、さらに５ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加して１０００ｍＬとする。
テスト細胞（血小板）を卓上遠心機（Hettich製）で１００００ｒｐｍで１分沈澱させ
る。上清を吸引除去し、細胞ペレットを１００μＬの可溶化緩衝液に採取する。
特異的抗ＧＰＩＩａ−ＩＩＩｂ抗体（BioTest）をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いて溶液中で処理した。その抗体がビーズに結合したことが示された。これに関しては、１ｍＭの亜鉛の存在が結合を促進することが判明した。
続いて、上記ビーズを可溶化された血液細胞とインキュベートし、さらに第二の蛍光標識抗体を添加する。陽性テストアッセイの特徴はその二次抗体の上記複合体との結合の増加で、これは、続いて単離したビーズ−第一の抗体−抗原−第二の抗体複合体の蛍光（これは上記結合によって付与された）によって測定することができる。
このようにして、極めて簡単な態様で血中のＧＰＩＩａ−ＩＩＩｂ抗原を検出することができた。
凝集テスト（ゲルカードテスト（Diamed, Switzerland））を蛍光標識によるテストの代わりに実施した。
このようにしてまた、極めて簡単な態様で血中のＧＰＩＩａ−ＩＩＩｂ抗原を検出できた。
ＥＬＩＳＡテストを用いる代わりに、第二の抗体により標識されたビーズをフローサイトメトリーで検出した。
このようにしてまた、極めて簡単な態様でＧＰＩＩａ−ＩＩＩｂ抗原を検出できた。
Diamedによって供給されたストレプトアビジン粒子による本発明のテストの実施
患者／ドナーおよびサンプル物質：２０μＬの血清（５６℃で３０分不活化）
試薬および装置：赤色蛍光高密度ストレプトアビジンポリスチレン粒子（Diamed）
物理的特性：直径は２〜４μｍ、
密度は１.１〜１.８ｇ／ｃｍ3
懸濁液は０.０７５％（ｖ／ｖ）の粒子を含み、この理由でこれらビーズを５０μＬの容積で用いた（ダイナビーズの場合には１０μＬと比較）。
結合特性：ビオチン抗体との結合に対するストレプトアビジンの密度および性質はダイナビーズの場合と同じである。
利点：粒子は赤色の蛍光を発し、これは読み取りを容易にし、その性能はまたフローサイトメトリーの方法を用いてモニターすることができる（フローサイトメトリーは当業者には周知である）。
欠点：この粒子は持続的に高い吸収性を示すので、被覆後に粒子をＰＢＳ−ＢＳＡでブロックすることが必要なようである。
緩衝液
粒子緩衝液：
１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７.４）、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ−ＢＳＡ（濃度２％）：
ダルベッコ（Dulbecco's）リン酸緩衝生理食塩水×１０
蒸留水で１：１０に希釈（ｐＨ７.２）
２２％（１：１０）のウシアルブミンを添加
可溶化緩衝液：
１.２１ｇのトリスを９５０ｍＬのＮａＣｌ（ｐＨ７.４）に添加し、さらに５ｍＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加して１０００ｍＬとする。
Figure 0004464048
ビオチン：スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、２５ｍｇ（Pierce, Perbio Science, Rockford, USA）。
ミリポアウルトラフリーＭＣ３０フィルターユニット（Millipore Corporation, Bedford, USA）でビオチン化後にろ過（ろ過限界３０ｋＤａ）。
メンブレン：低結合再生セルロース
校正：
偶発的凝集をテストし陰性コントロールを含める。新しいバッチ毎にまたはカップリング毎に、フローサイトメトリー分析で定量的にチェックする。これに関連して、抗原被覆粒子をこの抗原に対して特異的に指向される蛍光標識抗体とインキュベートする。粒子表面の蛍光の強さ（フローサイトメトリーで容易に測定できる）は被覆の程度に比例する。
性能管理：陽性および陰性コントロール血清を含める。
手順：
ビオチン化モノクローナル抗体の調製
ビオチンは、カルボキシラーゼのための補助因子として機能するビタミン（２４４ダルトン）である。サイズが小さいことの結果として、ビオチンは、結合後に原則として巨大分子の特性に対して影響を及ぼさない。ビオチンのための反応基はリジンおよびチロシンのε−アミノ基で（ＮＨＳ−ビオチン）、アミン結合が形成される。抗体はまた可変領域にリジンを含むことができるので、ビオチン化によって抗原の検出が失われる。この作用を排除または減少させるために、抗体結合の機能的領域が混乱されない最適ビオチン濃度（ビオチン過剰）を各抗体について見つけなければならない（Ternyck and Avrameas, 1990）。ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンの使用は巨大分子（例えば糖タンパク質）にとって有利であることが判明した。この場合には、巨大分子の立体的妨害の可能性はいずれも、６炭素分子を含むさらに別の鎖（ヘキサノエートスペーサー、２２Ａ）によって防止される。溶解されたビオチンは加水分解に非常に感受性が高いので、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを溶液にした後は迅速に処理することが推奨される。
手順：
１ｍＬのＰＢＳにタンパク質を溶解し、以下を計算する：過剰ビオチン（率、１０〜１５）のｍｍｏｌ：タンパク質のｍｍｏｌ×（１２または２０）＝添加されるビオチン試薬のｍｍｏｌ：ピペットで添加されるビオチンのｍｍｏｌ×５５６*＝添加されるビオチン
試薬のｍｇ
（*５５６はスルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチンの分子量）計算：タンパク質のｍｇ／タンパク質の分子量＝タンパク質のｍｍｏｌ
例えば１.３／１５００００＝８.７×１０-6ｍｍｏｌのＩｇＧ、
８.７×１０-6×２０＝１.７３×１０-4ｍｍｏｌのビオチン試薬、
１.７３×１０-4×５５６＝０.０９６３７３ｍｇ（０.１ｍｇ）のビオチン。
１．開封の前にスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを室温に戻す。
２．１ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを１０００μＬの蒸留水（１μｇ＝１μＬ）に溶解する。
３．室温で３０分インキュベートする（また別には氷上で２時間インキュベートする）。
４．ミリポアＭＣ３０フィルターを用いて未結合ビオチンをＰＢＳ中で遠心分離して除去する。
５．遠心分離機の設定はタンパク質に応じて変動する。原則として、１００００ｒｐｍで１０〜１５分で十分である。また別には３５００ｒｐｍで３０分である。
６．ビオチン化抗体は０.０１％の酸化ナトリウム（sodium acid）中で４℃で保存する。
ビオチン化の程度の計算：
ビオチン化の程度は、ＨＡＢＡ試薬（２−ヒドロキシアゾベンゼン−４−カルボン酸）を用いて測光法により決定される。このために、５００ｎｍでのＨＡＢＡ試薬（３６０μＬ）の吸収を先ず初めにそれだけで測定し、続いてビオチン化サンプル（４０μＬ）を添加する。添加後５分して吸収をもう一度５００ｎｍで測定する。ＨＡＢＡ分子中での競合結合の結果として、サンプルのビオチン含有量に応じて色の変化が出現する。すなわち、サンプルのビオチン化の程度はΔＡに正比例する。
１．Ａ５００＝（０.９）×（ＨＡＢＡ試薬のＡ５００）−（ビオチン化タンパク質のＡ５００）
２．ビオチン化タンパク質のｍｍｏｌ／ｍＬ＝ビオチン化タンパク質のｍｇ／ｍＬサンプル
３．ビオチンのμモル／ｍＬ反応混合物＝Ａ５００
ＨＡＢＡ試薬テストの代替として、各使用タンパク質についてビオチン化校正曲線を構築することができる。この曲線を用いて、タンパク質毎およびバッチ毎に固有の最適ビオチン量（最適ビオチン量は各タンパク質について異なる）を決定することができる。
上記性質の校正曲線は図２に示されている。
血清：注意深くコントロール血清を−２０℃から融解させる。最初は４℃にし、遠心分離する（１３０００ｒｐｍで２分、エッペンドルフ遠心分離機）
血小板の糖タンパク質の標識と可溶化
２×１０7のテスト細胞（標準化細胞）をエッペンドルフチューブで１００００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを３０μＬのＰＢＳ−２％ＢＳＡに再懸濁する。
１０μＬの糖タンパク質特異的ビオチン化モノクローナル抗体を各アッセイに添加する。使用抗体の各々について最適な希釈は、ビオチン化の力価測定によって前もって決定しておかなければならない（偶発的凝集の除去の項を参照されたい）。ＣＤ４１は１：６０、ＣＤ４２ａおよびＣＤ４９ｂは１：１０、ＨＬＡ抗体は１：２００。バッチにしたがって変動する。
３７℃で３０分インキュベートする。
テスト血小板を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄する（１００００ｒｐｍで１分遠心分離し、上清を吸引除去し、血小板ペレットを１００μＬのＰＢＳに採取する）。
最後の洗浄後、ペレットを各々１００μＬの可溶化緩衝液で溶解し、個別にピペットで混合する。
４℃で３０分インキュベートする。
ストレプトアビジンポリマー粒子上の抗原の単離
溶解物を１３０００ｒｐｍで３０分遠心分離する（４℃、細胞膜残渣を除去する）。
溶解物を遠心分離している間に、DiaMedストレプトアビジン粒子を１回粒子緩衝液中１００００ｒｐｍで１分間洗浄する。１０μＬの粒子（濃度０.５％）を７０μＬの血小板溶解物に添加する。
３７℃で３０分インキュベートする。
粒子を１００μＬの粒子緩衝液で１回１００００ｒｐｍで１分間洗浄する。
上清を吸引除去する。
粒子を抗原で被覆し、粒子緩衝液に再懸濁し濃度を０.０７５％にした後、テスト系に導入することができる。
抗原／抗体検出のための検査手順
２０μＬの血清を粒子ペレットに添加し、ペレットをよく再懸濁する。
３７℃で３０分インキュベートする。
１００μＬの粒子緩衝液をピペットで粒子に添加する。
毎回１００μＬの粒子緩衝液で粒子を２回洗浄する。
５０μＬの粒子緩衝液にペレットを採取し、注意深くそれを混合する。
粒子懸濁物を直接ヤギ抗ヒトカード（Diamed; Y. Lapierre et al., (1990) Transfusion 30(2)：109-113で説明される）にピペットで適用する。
さらにインキュベートすることなく、そのカードをカード遠心装置（DiaMed）において９００ｒｐｍで１０分遠心する。
結果の判定（図１参照）
本テストの高い感度は明瞭である。
これまでのところ、異なる反応性を有する３４の血清を選択的に検査した。ＭＡＩＰＡとの比較によって、感度および特異性は比肩しえることが示される。
Ｎ＝８の血清で、抗Ｐｌａ１の特異性を平行して検出することができた。
Ｎ＝２の血清で、以前の発見にもかかわらず、ＭＡＩＰＡでもカードテストでも抗Ｐｌａ２は全く検出できなかった。
Ｎ＝４の血清で、抗Ｂｒａ特異性を有する抗体を検出できた。
Ｎ＝４の血清で、様々な特異性を有する自己抗体を検出できた。
Ｎ＝８の血清はＭＡＩＰＡおよびカードテストで陰性であった。
Ｎ＝８の血清は両テストで非特異的に反応した。
テストの所要時間は３０〜４５分であり（以前に被覆した粒子を使用）、投入された労力および時間は最小限である。
結果の提示：
判定（図１参照）
陽性：凝集ビーズはゲル上に赤い線を形成するか、またはゲル内に配分される（＋＋＋＋から＋）。
陰性：ＩＤカード内の窪みの底部に密に詰まった粒子が沈澱する。
抗体検出のための検査結果を示す図である。 ビオチン化校正曲線を示すグラフである。

Claims (11)

  1. ヒトのサンプルで血液細胞抗原、または血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するインビトロの方法であって、
    天然の血液細胞抗原、または天然の血液細胞抗原に対して指向される抗体は、直径が２〜４μｍであり、密度が１．１〜１．８ｇ／ｃｍ3のビーズを有するモノクローナル抗体を使用することによりサンプルから探し出され、そして
    血液細胞抗原、または血液細胞抗原に対して指向される抗体の検出は、検出に適した、血液細胞抗原を検出するために使用する抗体が由来する種、または検出される血液細胞抗原に対して指向される抗体が由来する種に対して指向される種特異的抗体を含有するゲルカード中での凝集により行われることを特徴とする前記方法。
  2. ヒトのサンプルで血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）ビーズを特定の血液細胞抗原に対して指向される非ヒト抗体で被覆し；
    （ii）特定の選択された血液細胞抗原であって、適切な場合には、それ自体は従来技術で既に公知である標準化された血液細胞を可溶化することによって、または組換え方法もしくはタンパク質化学的方法により得ることができる抗原を、（ｉ）で得られた被覆されたビーズと混合し；
    （iii）非ヒト抗体で被覆されたビーズおよび選択された血液細胞抗原からなる調製された複合体を、検査する患者の血清サンプルと混合し；さらに
    （iv）複合体に結合しうる患者の血液細胞抗原抗体をゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）ビーズを非抗ヒト種特異的抗体で被覆し；
    （ii）標準細胞を可溶化するか、または組換えかもしくはタンパク質化学的に得られた血液細胞抗原を溶液にし；
    （iii）（ii）から得られた可溶化物、または組換えかもしくはタンパク質化学的に得られた血液細胞抗原の溶液を、抗原に対して指向され、かつ（ｉ）で述べた種に由来する特異的抗体とインキュベートし；
    （iv）（ｉ）のビーズを使用して（iii）で形成された複合体を遠心分離によって単離し；
    （ｖ）直ちにまたは後で患者由来の抗体含有血清とインキュベートし；さらに
    （vi）複合体に結合した抗体をゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 血液細胞抗原を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）ビーズを検出する特定の血液細胞抗原に対して指向される抗体で被覆し；
    （ii）検査する患者からの血液サンプル、およびその中に含まれている血液細胞を、該血液細胞の膜に含まれる抗原が可溶化される処理に付し、さらに適切な場合には抗原濃縮分画を調製し；
    （iii）（ｉ）で得られた被覆ビーズを（ii）で得られたサンプルと混合し；
    （iv）ビーズ、検出する特定の血液細胞抗原に対して指向される抗体、および血液細胞抗原からなる複合体を血液細胞抗原に対して特異的な抗体とインキュベートし；さらに
    （ｖ）複合体に結合した抗体をゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 血液細胞抗原を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）ビーズを非抗ヒト種特異的抗体で被覆し；
    （ii）検査する患者からの血液細胞を可溶化し；
    （iii）（ii）で得られた可溶化物を、検出する抗原に対して指向され、かつ（ｉ）で述べた種に由来する特異的抗体とインキュベートし；
    （iv）（ｉ）のビーズを使用して（iii）で形成された複合体を遠心分離によって単離し；
    （ｖ）複合体を抗原に対して指向される抗体とインキュベートし；さらに
    （vi）複合体に結合する抗体をゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 患者の血清サンプルで血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）抗原に対して指向されるビオチン化非ヒト抗体を、天然の血液細胞抗原を保有するヒトテスト細胞と接触させ；
    （ii）（ｉ）で生成された複合体を上記血液細胞が可溶化される条件に付し；
    （iii）抗原およびビオチン化抗体からなる上記複合体を、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆されたビーズを用いて上記サンプルから取り出し；
    （iv）（iii）で生成された複合体を検査する患者由来の血清サンプルと接触させ；さらに
    （ｖ）特異的抗体が血清サンプル中に存在するときに形成される複合体であって、ビオチン化抗体、抗原、および血清からのヒト抗体からなる複合体を、いったん該複合体をサンプルから分離してゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 選択された血液細胞抗原を検出するインビトロの方法であって、
    （ｉ）検出する抗原に対して指向されるビオチン化抗体を、天然の血液細胞抗原を保有しうる検査される試料に由来するヒト細胞と接触させ；
    （ii）（ｉ）で生成された複合体を上記血液細胞が可溶化される条件に付し；
    （iii）抗原およびビオチン化抗体からなる上記複合体を、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆されたビーズを用いて上記サンプルから取り出し；
    （iv）（iii）で生成された複合体を、上記抗原に対して指向される好ましくは標識された第二の抗体と接触させ；さらに
    （ｖ）ビオチン化抗体、抗原および第二の抗体からなる生成される複合体を、いったん該複合体をサンプルから分離してゲルカード中での凝集により検出する
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 蛍光または酵素で標識された抗体が用いられる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ビオチン化抗体がストレプトアビジンおよび／またはアビジンで被覆されたビーズを用いて結合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 少なくとも、直径が２〜４μｍであり、密度が１．１〜１．８ｇ／ｃｍ3のビーズ、血液細胞抗原に対して指向される特異的抗体、および特異的抗ヒト抗体を含むゲルカードを含む、血液細胞抗原に対して指向される抗体を検出するキット。
  11. 少なくとも、直径が２〜４μｍであり、密度が１．１〜１．８ｇ／ｃｍ3のビーズ、第一の検出される抗原に対して指向される抗体、第二の検出する抗原に対して指向される抗体、および検出される抗原に対して指向される第二の抗体に対して指向される第三の種特異的抗体を含むゲルカードを含む、血液細胞抗原を検出するキット。
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