PT1341531E - Composto lactama para inibir a libertação ou a síntese de reptídeo beta-amilóide - Google Patents

Description

1 ΡΕ1341531

DESCRIÇÃO

"COMPOSTO LACTAMA PARA INIBIR A LIBERTAÇÃO OU A SÍNTESE DE PEPTÍDEO BETA—AMILÓIDE"

Campo da Invenção A presente invenção relaciona-se com o campo da quimica farmacêutica e orgânica e diz respeito a um composto que inibe a libertação do peptideo β-amilóide e/ou a sua sintese.

Antecedentes da Invenção

Algumas lactamas, que inibem a libertação do peptideo β-amilóide e/ou a sua sintese, e consequentemente, são úteis para o tratamento da doença de Alzheimer, são descritas no Pedido de Publicação PCT No. PCT/US97/22986. 0 composto da presente invenção (N)—((S)—2— hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona é útil para inibir a libertação do peptideo β-amilóide e/ou a sua sintese, e, consequentemente, é útil no tratamento da doença de Alzheimer e apresenta eficácia conveniente e propriedades mais seguras. 2 ΡΕ1341531

Sumário da Invenção

Esta invenção fornece o composto (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona.

Num dos aspectos deste método, esta invenção é dirigida para um método para inibir a libertação do peptideo β-amilóide e/ou a sua síntese compreendendo a administração a um paciente que dele necessite de uma quantidade eficaz de (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. Numa forma de realização preferida, a presente invenção descreve um método para tratar a doença de Alzheimer compreendendo a administração a um paciente que dele necessite de uma quantidade eficaz de (N) — ( (S)—2— hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. A presente invenção também descreve um método para prevenir ou inibir a progressão da doença de Alzheimer compreendendo a administração a um paciente que dele necessite de uma quantidade eficaz de (N)- ( (S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)- (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona.

Noutra forma de realização, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo (N)—((S)— 2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3- 3 ΡΕ1341531 metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona e um di-luente farmaceuticamente aceitável. Estas composições são úteis para inibir a libertação do peptideo β-amilóide e/ou a sua síntese, incluindo o tratamento da doença de Alzheimer.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como são aqui utilizados, os termos acima têm os significados indicados: 0 termo "ee" ou "excesso enantiomérico" refere-se à percentagem pela qual um enantiómero, Ei, está em excesso numa mistura de ambos os enantiómeros (Ei + E2), como calculado pela equação ( (Ei - E2) + (Ei + e2) ) x 100% = ee.

Como é bem sabido na técnica, o excesso enantiomérico pode ser determinado por electroforese capilar e por HPLC quiral dos compostos ou dos seus derivados.

As designações de Cahn-Prelog-Ingold de (R)- e (S)- e as designações de L- e D- para estereoquímica relativa aos isómeros de glicerídeo, aqui incluídas, são utilizadas para referir isómeros específicos. 0 composto da presente invenção pode ser preparado como descrito acima. Nos Esquemas acima, todos os substituintes, a não ser no caso de indicação em contrário, 4 ΡΕ1341531 são como previamente definido e todos os reagentes são bem conhecidos e valorizados na técnica.

Esquema 1

Passo 3

No Esquema 1, passo 1, a N-metilfenetilamina de fórmula (1) é acetilada com um reagente de transferência acetato de bis-alcoxicarbonilo adequado para dar um composto de fórmula (2) . A N-metilfenetilamina está disponível comercialmente e é facilmente preparada por reacção de um 2-bromo ou 2-cloroetilbenzeno, em condições bem conhecidas e valorizadas na técnica, com uma metil-amina. Um reagente de transferência acetato de bis-alcoxi-carbonilo adequado é um em que R4 é Ci-C4 alquilo e transfere um grupo bis-alcoxicarbonilacetilo para o composto de 5 ΡΕ1341531 fórmula (1), tal como, ácidos bis-alcoxicarbonilacéticos e cloretos de bis-alcoxicarbonilacetilo. (Ver Bem-lshai, Tetrahedron, 43, 439-450 (1987)).

Por exemplo, o composto de fórmula (1) é posto em contacto com um ácido bis-alcoxicarbonilacético para dar um composto de fórmula (2) . Tais reacções de acoplamento são comuns em sínteses de peptídeos e os métodos de síntese aí utilizados podem ser empregues. Por exemplo, agentes de acoplamento bem conhecidos tal como carbodiimidas com ou sem a utilização de aditivos bem conhecidos tal como N-hidroxisuccinimida, 1-hidroxibenzotriazole, etc. podem ser utilizados para facilitar esta acilação. Estas reacções de acoplamento utilizam muitas vezes uma base adequada para capturar o ácido gerado durante a reacção. Bases adequadas incluem, por exemplo, trietilamina, N,N-diisopropiletil-amina, N-metilmorfolina e outros semelhantes. A reacção é habitualmente levada a cabo num solvente polar aprótico inerte tal como dimetilformamida, cloreto de metileno, clo- rofórmio, acetonitrilo, tetra-hidrofurano e outros semelhantes. Tipicamente a reacção é levada a cabo a temperaturas desde cerca de 0°C até cerca de 60°C e tipicamente requer mais de 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção estar completa, o produto de fórmula (2) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes. 6 ΡΕ1341531

Alternativamente, por exemplo, o composto de fórmula (1) é posto em contacto com um cloreto de bisalco-xicarbonilacetilo para dar o composto de fórmula (2). Estes cloretos de ácido são facilmente preparados a partir dos ácido correspondentes por métodos bem conhecidos na técnica, tal como por acção de tricloreto de fósforo, oxi-cloreto de fósforo, pentacloreto de fósforo, cloreto de tionilo, ou cloreto de oxalilo, com ou sem uma pequena quantidade de dimetilformamida, num solvente inerte tal como, tolueno, cloreto de metileno, ou clorofórmio; a uma temperatura desde cerca 0-80°C. A reacção é tipicamente levada a cabo durante um período de tempo variando desde 1 hora até 24 horas. 0 cloreto de ácido pode ser isolado e purificado ou pode muitas vezes ser utilizado directamente, ou seja, com ou sem ser isolado e/ou purificado. Estas reacções de acilação utilizam geralmente uma base adequada para capturar o ácido gerado durante a reacção. Bases adequadas incluem, por exemplo, piridina, trietilamina, N,N-diisopropiletilamina, N-metilmorfolina e outros semelhantes. A reacção é convencionalmente levada a cabo num solvente aprótico inerte tal como cloreto de metileno, clorofórmio, tetra-hidrofurano e outros semelhantes. Tipicamente a reacção é levada a cabo com temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 80°C e tipicamente necessita desde cerca de 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção se completar, o produto de fórmula (2) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, 7 ΡΕ1341531 cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

No Esquema 1, passo 2, um composto de fórmula (2) é ciclizado para dar um composto de fórmula (3).

Por exemplo, um composto de fórmula (2) é posto em contacto com um ácido, tal como ácido metanossulfónico ou ácido sulfúrico. A reacção é tipicamente levada a cabo utilizando o ácido seleccionado como um solvente.

Habitualmente os reagentes são inicialmente misturados a temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 0°C e em seguida deixa-se aquecer até temperaturas desde cerca da temperatura ambiente até cerca de 60°C. A reacção de ciclização requer habitualmente desde cerca de 12 até cerca de 72 horas. Após a reacção estar completa, o produto de fórmula (2) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

No Esquema 1, passo 3, um composto de fórmula (3) é desprotegido para dar um composto de fórmula (4). A remoção destes grupos protectores alcoxicar-bonilo amina é bem conhecida e valorizada na técnica. Por exemplo ver, Protecting Groups in Organic Syntesis, Theodora Greene (Ia e 2a Edições, Wiley-Interscience) e Bem-Ishai, Tetrahedron, 43, 435-450 (1987) . ΡΕ1341531

Esquema 2

No Esquema 2, passo 1, um ácido fenilacético de fórmula (5) apropriado é acoplado com um acetal de fórmula (6) apropriado para dar um composto de fórmula (7) . Um ácido fenilacético de fórmula (5) apropriado é um em que A2 é um grupo activado, por exemplo, -OH, -Cl, ou -Br. Um acetal de fórmula (6) apropriado é um em que R5 é um C1-C4 alquilo. Estas reacções de acoplamento são comuns em sintese de peptideos e métodos sintéticos ai utilizados que podem ser empregues como descrito no Esquema 1, passo 1. 9 ΡΕ1341531

Também, o acoplamento descrito no Esquema 2, passo 2, pode ser levado a cabo sob condições de Schotten-Baumann utilizando um haleto ácido do composto de fórmula (5) numa mistura de solventes tal como, éter metilo t-butilo, acetato de etilo, tetra-hidrofurano, acetona, ou éter dietilico e água. Estas reacções são levadas a cabo utilizando uma base adequada, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, carbonato de potássio, bicarbonato de sódio, ou bicarbonato de potássio. Habitualmente a reacção é agitada ou agitada vigorosamente e é levada a cabo a temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 80°Ce habitualmente requer desde cerca de 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção estar completa, o produto de fórmula (7) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

No Esquema 2, passo 2, um composto de fórmula (7) é ciclizado para dar um composto de fórmula (8) . Estas reacções de ciclização são levadas a cabo num ácido tal como ácido sulfúrico. Habitualmente o ácido é utilizado como solvente. Em geral, a reacção é levada a cabo a temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 150°C e tipicamente requer desde cerca de 1 hora até cerca de 24 horas. Após a reacção se completar, o produto de fórmula (8) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes. 10 ΡΕ1341531

No Esquema 2, passo 3, um composto de fórmula (8) sofre uma reacção de transferência de amina para dar um composto de fórmula (9) . No Esquema 2 é descrita uma oximação. Estas oximações são levadas a cabo pondo em contacto o enolato de um composto de fórmula (8) com um reagente de transferência de oxima, tal como um éster de alquilo nitrilo. O enolato de um composto de fórmula (8) pode ser preparado por reacção um composto de fórmula (8) com uma base adequada, tal como t-butóxido de potássio, diisopropilamideto de litio, hexametilsilazeto de litio, hexametilsilazeto de potássio, e outros semelhantes. Estas oximações são exemplificadas por Wheeler, et al., Organic Syntheses, Coll. Vol. VI, p.840 que descreve a reacção de nitrilo de isoamilo com uma cetona para preparar a oxima desejada. A reacção é habitualmente levada a cabo num solvente, tal como tetra-hidrofurano. Geralmente, a reacção é levada a cabo a temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 50°C e habitualmente necessita desde 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção se completar, o produto de fórmula (8) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

Alternativamente, esta reacção de transferência de amina pode ser levada a cabo através de uma azida. Uma azida pode ser formada pela reacção do enolato de um composto de fórmula (8) com um reagente de transferência de azida, tal como toluenossulfonil-azida e triisopropilben-zenossulfonil-azida. Estas reacções são exemplificadas em Evans, et al.r J. Am. Chem. Soc., 112:4011-4030 (1990)41. A 11 ΡΕ1341531 reacção é habitualmente levada a cabo num solvente tal, como tetra-hidrofurano. Em geral, a reacção é levada a cabo a temperaturas desde cerca de -20°C até cerca de 50°C e habitualmente requer desde cerca de 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção estar completa, o produto de fórmula (8) tendo uma azida em vez de uma oxima é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

Como é descrito no Esquema 2, passo 4, uma oxima é reduzida ao composto de fórmula (4) . Estas reduções são acompanhadas por tratamento com hidrogénio e um catalisador adequado, tal como catalisadores de Raney-niquel ou de paládio, tal como paládio sobre carbono. A reacção é habitualmente levada a cabo num solvente, tal como tetra-hidrofurano, acetato de etilo, ou álcoois inferiores, tal como metanol, etanol, e isopropanol, em ácido acético, água, amónia aquosa, e outros semelhantes, e suas misturas. A reacção é geralmente levada a cabo a pressões de hidrogénio variando desde a pressão atmosférica até cerca de 600 psi (4137 kPa). Em geral, a reacção é levada a cabo a temperaturas desde cerca de 20°C até cerca de 100°C e habitualmente requer desde cerca de 1 até cerca de 24 horas. Após a reacção estar completa, o produto de fórmula (4) é recuperado por métodos convencionais incluindo extracção, precipitação, cromatografia, filtração, trituração, cristalização e outros semelhantes.

Alternativamente, quando a amina é transferida 12 ΡΕ1341531 através de uma azida, o grupo azido é reduzido, estas reduções são levadas a cabo por hidrogenação como descrito acima.

Processos para preparação de (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-e-benzazepin-2-ona são descritos no

Esquema A.

Esquema A

13 ΡΕ1341531 0 Esquema A, passo 1, descreve a resolução este-reoquímica de uma lactama de fórmula (4) apropriada para dar uma lactama de fórmula (10), ou seja, de uma (S)—1— amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona essencialmente pura. Como é aqui utilizada a expressão "essencialmente pura" refere-se à pureza enantiomérica de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. De acordo com a presente invenção (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona substancialmente pura pode ser preparada compreendendo o enantiómero-(S) sendo superior a 80%, preferencialmente superior a 90%, mais preferencialmente superior a 95%, mais referencialmente superior a 97%.

Por exemplo, o isómero-(S) do composto de fórmula (4) pode ser resolvido por cristalização fraccionada de tartarato de dibenzoilo, sais dos ácido (R)-(-)d-canforossulfónico, e ácido (D)-(-)-mandélico. É esperado que uma grande variedade de tartaratos de dibenzoílos sejam adequados para este fim. Em particular os ésteres de dibenzoilos tendo um substituinte para seleccionado do grupo constituído por hidrogénio, halogéneo, C1-C4 alquilo, e C1-C4 alcoxi são preferidos sendo o tartarato de di-p-toluilo preferido. O L-tartarato de di-p-toluilo é utilizado para obter o isómero-(S).

De acordo com o presente processo, o composto de fórmula (4) é posto em contacto com o ácido seleccionado. Geralmente, podem ser utilizados desde cerca de 0,4 14 ΡΕ1341531 equivalentes molares até um grande excesso do ácido seleccionado sendo preferido desde cerca de 0,4 até cerca de 1,5 equivalentes molares e sendo mais preferido desde cerca de 0,5 até cerca de 1,1 equivalentes molares. O processo é habitualmente levado a cabo por cristalização do sal de adição ácido a partir de uma solução. Em particular, solventes tal como álcoois inferiores, incluindo metanol, etanol, n-propanol, iso-propanol, butanol, sec-butanol, iso-butanol, t-butanol, álcool amilico, álcool iso-amílico, álcool t-amilico, hexa-nol, ciclopentanol, e ciclo-hexanol são adequados, sendo metanol, etanol, e isopropanol preferidos. A utilização de um anti-solvente pode ser vantajosa. Como é aqui utilizada, a expressão "anti-solvente" refere-se a um solvente em que o sal é significativamente menos solúvel quando comparado com o solvente. Preferencialmente, quando é utilizado um anti-solvente este é miscível com o solvente seleccionado. Anti-solventes adequados incluem éteres, tal como éter dietilico, éter metilo t-butilico, e outros semelhantes, e acetatos de alquilo inferiores, tal como acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de iso-propilo, acetato de propilo, acetato de iso-butilo, acetato de sec-butilo, acetato de butilo, acetato de amilo, acetato de iso-amilo, e outros semelhantes, e alcanos, tal como pentano, hexano, heptano, ciclo-hexano, e outros semelhantes. Quando o presente processo é levado a cabo por cristalização do sal de adição ácida da mistura racémica, é necessário ter em atenção na utilização de um anti-solvente para evitar a cristalização do sal diastereomérico indesejado. 15 ΡΕ1341531

Habitualmente, a cristalização é levada a cabo a temperaturas iniciais de cerca de 40°C até à temperatura de refluxo do(s) solvente(s) seleccionado(s) a concentrações iniciais desde cerca de 0,05 molar até cerca de 0,25 molar. A mistura é então arrefecida para dar o sal. Pode ser vantajoso colocar algumas partículas sólidas. A agitação do precipitado inicial durante desde cerca de 4 até cerca de 48 horas pode ser vantajosa. Preferencialmente a solução de cristalização é arrefecida lentamente. A solução de cristalização é mais convenientemente arrefecida a temperaturas desde a temperatura ambiente até -20°C. O sal pode ser recolhido utilizando que são bem conhecidas na técnica, incluindo filtração, decantação, centrifugação, evaporação, secagem, e outros semelhantes. O composto de fórmula (10) pode ser directamente utilizado directamente como o sal de adição ácida do ácido seleccionado. Alternativamente, antes da utilização o composto (10) pode ser isolado como outro sal de adição ácida após a troca de ácido ou pode ser isolado como a base por extracção em condições básicas como é bem conhecido e apreciado na técnica.

Um processo preferido dá (S)-l-amino-3-metil- 2.3.4.5- tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona de pureza enan-tiomérica substancial por cristalização de l-amino-3-metil- 2.3.4.5- tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona como o seu sal de adição ácida de um ácido seleccionado do grupo constituído por ácido di-p-tolilo-L-tartárico, ácido (R)-(-)-d-canfo-rossulfónico, e (D)-(-)-mandélico como um processo dinâmico 16 ΡΕ1341531 na presença de um aldeído aromático. 0 processo dinâmico apresenta a vantagem da l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona sofrer a conversão num único isómero durante a cristalização, assim, aumentando o rendimento e evitando uma corrente de efluentes que inclui um isómero não desejado. É esperado que uma grande variedade de aldeídos aromáticos seja adequada para o processo dinâmico, verificámos que na prática vários aldeídos são particularmente adequados. Especificamente, verificámos que ácidos salicílicos são preferidos e aldeído salicílico, aldeído 5-nitrossalicílico, e aldeído 3,5-diclorossalicílico são mais preferidos no presente processo de resolução dinâmica.

Consequentemente, quando o presente processo é levado a cabo como uma resolução dinâmica, l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona é posta em contacto com o ácido seleccionado na presença de um aldeído aromático. Geralmente, para a resolução dinâmica são utilizados desde cerca de 0,9 até cerca de 1,2 equivalentes molares de ácidos, sendo cerca de 1 equivalente molar preferido. O aldeído aromático é geralmente utilizado numa quantidade catalítica. Habitualmente, são utilizados desde cerca de 0,5 até cerca de 0,001 equivalentes molares de aldeído molar, sendo desde cerca de 0,1 até cerca de cerca de 0,01 equivalentes molares preferidos. O processo dinâmico é habitualmente levado a cabo 17 ΡΕ1341531 num solvente sem um anti-solvente como descrito acima. A mistura de l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona, do ácido seleccionado, e do aldeído aromático é agitada para permitir a conversão no isómero desejado. Geralmente esta conversão é levada a cabo a temperaturas desde a temperatura ambiente até à temperatura de refluxo do solvente. Geralmente a conversão necessita de 6 até 48 horas.

Como será verificado pela pessoa especializada, quando o presente processo é levado a cabo como uma resolução dinâmica, a utilização do sal de adição ácida de (S) -l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona pode ser complicada pela presença de uma pequena quantidade de aldeído aromático no produto isolado. Portanto, após a resolução dinâmica é preferível que a (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona seja isolada por troca de sal, preferencialmente como o sal cloridrato, antes da sua utilização ou da formação da base. 0 Esquema A, passo 2, descreve a reacção de acoplamento de uma alanina amino-protegida de fórmula PgNH-CHCH3-C(0)-A e uma lactama apropriada de fórmula (10). Uma alanina amino-protegida apropriada é uma em que Pg é um grupo protector de amina, tem a configuração L, e A é um grupo activador, por exemplo -OH ou -Cl, capaz de acoplamento com o grupo amino do composto de fórmula (10) . Estas alaninas amino-protegidas estão facilmente disponíveis para uma pessoa especializada. 18 ΡΕ1341531 A reacção de acoplamento descrita no Esquema Reaccional A, passo 2, envolve uma reacção que é habitualmente levada a cabo para síntese de peptídeos e métodos sintéticos aqui utilizados podem também ser utilizados. Estes métodos são descritos no Esquema 1, passo 1. 0 Esquema Reaccional A, passo 3, descreve a desprotecção de um composto de fórmula (11) para dar um composto de fórmula (12) . Estas desprotecções de grupos protectores de amino são bem conhecidas e apreciadas na técnica. 0 Esquema Reaccional A, passo 4, descreve a reacção de acoplamento de um composto de fórmula (13) apropriado, (CH3) 2CH-CHOH-C(0)Ai e um composto de fórmula (12) para dar um composto de fórmula I. 0 isómero S do composto de fórmula (13) está disponível comercialmente e é bem conhecido na técnica, incluindo o Pedido de Publicação de Patente PCT No. PCT/US97/22986, entregue em 22 de Dezembro de 1997. A reacção de acoplamento descrita no passo 3 é levada a cabo utilizando o ácido de fórmula (13) (compostos em que Ai é -OH) ou o haleto de ácido dele derivado compostos em que Ai é -Cl ou -Br), de um modo semelhante aos descritos no Esquema 1, passol.

Um método alternativo para a preparação dos compostos de fórmula I é descrito no Esquema A, passo 5, que mostra a reacção de acoplamento de um composto de 19 ΡΕ1341531 fórmula (10) apropriado e um composto de fórmula (14) apropriado, (CH3) 2CH-CHOH-C (O) -NH-CHCH3-C (O) A2, para dar directamente um composto de fórmula I. Um composto de fórmula (10) apropriado é como descrito no passo 2. Um composto de fórmula (14) apropriado é um que tem a este-reoquímica como desejado no produto de fórmula I final.

Compostos de fórmula (14) são facilmente preparados por reacção de acoplamento de ácidos carboxilicos amino-protegidos, H2N-CHCH3-C (O) OPgi, com compostos de fórmula (13) como descrito acima. Mais uma vez estas reacções de acoplamento são bem conhecidas na técnica, e originam um produto, que após desprotecção, origina um composto de fórmula (14). O composto de fórmula I pode ser isolado e purificado por várias técnicas, incluindo cristalização. Técnicas de cristalização a partir de uma solução e suspensões espessas podem ser utilizadas. Em particular, o composto da presente invenção pode ser preparado por cristalização de vários solventes anidros e aquosos. Solventes adequados: acetona, álcoois inferiores (tal como metanol, etanol, e isopropanol), ácido acético, e aceto-nitrilo com e sem água e acetato de etilo, éter dietílico, e éter metilo t-butilico. Na prática, verificou acetona aquosa é preferida. Para um dado solvente aquoso a quantidade de água utilizada irá depender da solubilidade relativa de (N)- ((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-ala-ninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benza- 20 ΡΕ1341531 zepin-2-ona no solvente em comparação com a solubilidade em água e se se utiliza uma técnica de cristalização ou de formação de suspensões espessas. A cristalização é geralmente levada a cabo por dissolução de (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2, 3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-onanum solvente aquoso e em seguida deixando a solução arrefecer, com ou sem a adição de mais água, para dar um sólido. Habitualmente, a cristalização é levada a cabo a temperaturas iniciais desde cerca de 40°C até à temperatura de refluxo do solvente aquoso seleccionado. A mistura é então arrefecida para dar o di-hidrato cristalino. Pode ser vantajoso colocar algumas partículas sólidas. Preferencialmente a solução de cristalização é arrefecida lentamente. A cristalização é mais convenientemente arrefecida a temperaturas desde a temperatura ambiente até cerca de -20°C. A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos e preparações que se seguem. Estes exemplos e preparações são unicamente ilustrativos e não se pretende que limitem a invenção de qualquer modo.

Os termos utilizados nos exemplos e preparações têm o seu significado normal a não ser no caso de designação de outro modo. Por exemplo ,,0c" refere-se a graus Celsius; "mmole" refere-se a milimole ou milimoles; "g" refere-se a grama ou gramas; "mL" refere-se a mililitro 21 ΡΕ1341531 ou mililitros; "salmoura" refere-se a solução aquosa saturada de cloreto de sódio; "THF" refere-se a tetra-hidrofurano; "HPLC" refere-se a cromatografia liquida de alta pressão; etc.

Exemplo 1

Sintese de l-amino-3-metil-2, 3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona A uma lama de hidreto de sódio (1,1 eq.) em 15 mL de DMF seco adicionou-se 4,5,6,7-tetra-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona (0,0042 mole) como uma solução em 10 mL de DMF. Iodeto de metilo (cerca de 2 eq.) foi então adicionado. Quando por TLC a reacção estava completa, a mistura reaccional foi despejada sobre gelo e extraída com acetato de etilo. As fases orgânicas foram lavadas com água, e em seguida salmoura. A fase orgânica foi então seca sobre Na2S04, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC (LC 2000), eluíndo com um sistema acetato de etilo/hexano para dar 3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. 3-Metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (1 eq.) foi dissolvido em THF e adicionou-se isoamil-nitrilo (1,2 eq.). A mistura foi arrefecida a 0°C num banho de gelo. Adicionou-se NaHMDS (1,1 eq., 1M em THF) gota a gota. Após agitar durante 1 hora ou até a reacção estar completa, a mistura foi concentrada, em seguida acidificada 22 ΡΕ1341531 com solução aquosa IN de ácido clorídrico e foi extraída com acetato de etilo. A fracção orgânica foi seca e concentrada para dar um produto bruto que foi purificado por cromatografia em sílica gel para dar l-hidroxiimino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona: Espectrometria de Massa (M+H)+, 205,1. l-Hidroxiimino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona foi dissolvido em EtOH/NH3 (20:l)e hidro-genado numa bomba utilizando níquel Raney e hidrogénio (500 psi/3447 kPa) a 100°C durante 10 horas. A mistura resultante foi filtrada e concentrada para dar um óleo que foi purificado por cromatografia sobre sílica gel para dar o composto em epígrafe.

Exemplo 2 Síntese de l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona

Num balão de Morton de 20 L adicionou-se MTBE (5,52 L, 7 volumes) e acetal dimetílico de (N-metilamino)-acetaldeído (614 g, 5 mole) para formar uma solução à temperatura ambiente. Uma solução de bicarbonato de sódio preparada por adição de bicarbonato de sódio (546 g, 6,5 mole) e água (6,31 L, 8 volumes) foi adicionada ao balão reaccional de Morton. A mistura foi arrefecida abaixo dos 10°C e uma solução de cloreto de fenilacetilo (789 g, 5 mL) em MTBE (798 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de um 23 ΡΕ1341531 período de 1 hora à mistura reaccional arrefecida. Após a adição, a mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. Nesta fase uma análise de HPLC indicou que a reacção estava completa. Tratamento por extracção com MTBE (4 volumes), secagem com sulfato de magnésio anidro seguido por concentração no evaporador rotativo originou 1,187 kg (98%) N-metil-N-(2,2-dime-toxietil)fenilacetamida como um líquido, (M+H)+ = 237,9. A um balão de Norton de 5L sob uma forte atmosfera de azoto adicionou-se H2SO4, (1,42 L) e N-metil-N-(2,2-dimetoxi-etil)fenilacetamida (712 g, 3 mole) foi adicionada gota a gota ao balão reaccional o que originou uma reacção exotérmica (22 a 78°C). A reacção resultante foi então aquecida a 110°C durante 3 h em seguida foi arrefecida até a temperatura ambiente e foi transferida para um balão de Morton de 20 L. A uma temperatura inferior a 10°C, a mistura reaccional foi tratada como solução aquosa de hidróxido de sódio (0,18 L, 5 N) . Tratamento com extracção com acetato de etilo (2 x 2,85 L), secagem com sulfato de sódio seguida por concentração até um sólido, originou 520 g (73,5%) de 3-metil-4,5-di-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona como um sólido. Este material pode ser recristalizado de MTBE para aumento da pureza para dar um sólido, pf = 81-82°C; (M+H)+ = 174,2.

Uma solução de 3-metil-4,5-di-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona (113,8 g, 0, 657 mole) em THF (0,5 L) foi arrefecida até 0°C e adicionou-se nitrito de isoamilo (100,75 g, 0,86 mole) gota a gota. À mistura resultante adicionou-se gota a gota LiHMDS (solução IN em THF, 854 mL, 24 ΡΕ1341531 0,854 mole) a uma velocidade tal que a temperatura permaneça abaixo dos 10°C. Após a adição, deixou-se a reacção a agitar à temperatura ambiente durante 2-3 horas enquanto se monitorizava o progresso da reacção por HPLC. Após a reacção estar completa, a mistura foi arrefecida a 0°C, e o pH ajustado de 12 para 2-3 utilizando HCl aquoso (2N) . O precipitado resultante foi agitado durante 12-16 horas antes de ser isolado por filtração e seco para dar 86,3 g (64,9%) de l-hidroxxiimino-3-metil-4,5-di-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona; pf = 225-226°C; (M+H)+ = 203,0.

Uma solução de l-hidroxiimino-3-metil-4,5-di-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (35g, 0,173 mole) em etanol (525 mL) foi adicionada a uma autoclave em conjunto com paládio sobre carbono (10%, 3,5 g) como uma suspensão espessa em HCl (aquosa concentrada, 17,5 g em 17 mL de água). A mistura resultante foi hidrogenada a 50°C e 250 psi (1723 kPa) até a reacção estar completa. A mistura reaccional foi filtrada sobre uma camada de celite utilizando etanol como solvente e o filtrado foi concentrado até 90 mL. Adicionou-se água (350 mL) ao concentrado e a solução resultante foi de novo concentrada até cerca de 200 mL. Adicionou-se diclorometano (350 mL) à solução aquosa antes de ajustar o pH a 11-11,5 como hidróxido de sódio aquoso (1 N) . A fase orgânica foi separada e a fracção aquosa foi extraída com diclorometano (175 mL) . Os extractos combinados foram concentrados até um resíduo que cristalizou após se deixar repousar para dar o composto em epígrafe: pf = 69-81°C; (M+H)+ = 191,0. ΡΕ1341531 25

Exemplo 3 Síntese de l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona

Num balão de Morton de 22 L adicionou-se diclo-rometano (4,73 L, 8 volumes), N-metilfenetilamina (591 g, 4,33 mole), e bicarbonato de sódio aquoso (436,7 g, 5,2 moles em 4,73 L de água) . A mistura foi arrefecida até abaixo de 5°C e uma solução de cloreto de cloroacetilo (513,7 g, 4,55 mmole) em diclorometano (887 mL) foi adicionada gota a gota ao longo de um período de 70 min à mistura reaccional arrefecida. Após a adição, uma análise de HPLC indicou que a reacção estava completa. As fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio anidro e concentradas no evaporador rotativo para dar 915,7 g 899,8%) de N-metil-N-(2-fenil-etil)-1-cloroacetamida: (M+H) = 212,1. A um balão de 12 L sob uma atmosfera de azoto adicionou-se N-metil-N-(2-feniletil)-1-cloroacetamida 883,3 g, 4,17 mole) e orto-diclorobenzeno (6,18 L) . Adicionou-se cloreto de alumínio (1319 g, 10,13 mole) o que causou um aumento da temperatura (de 22 para 50°C) . A reacção resultante foi então aquecida a 165°C durante 2,5 h em seguida foi arrefecida até cerca da temperatura ambiente durante 14 horas. A mistura reaccional foi arrefecida até cerca de 0 aC, e foi adicionada a água gelada (8,86 L, 26 ΡΕ1341531 cerca de 5°C) em quatro porções de modo a manter a temperatura a cerca de 40°C. As fases foram separadas e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (7,07 L) e as fases separadas. As fases orgânicas foram combinadas e extraídas com ácido clorídrico aquoso (8,83 L, 1 N) e em seguida com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (7,07 L) , secas sobre sulfato de magnésio, combinadas com sílica gel (83 g) e aplicadas numa coluna de sílica gel (3,53 kg, num funil de vidro sinterizado, empacotada como uma suspensão espessa em diclorometano). A coluna foi eluída com diclorometano até serem recolhidos 25 L e em seguida com acetato de etilo para dar o produto. As fracções contendo o produto foram evaporadas para dar 3-metil-2,3, 4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona como um sólido castanho-amarelado, 608 g (83%).

Num balão de 22 L, sob atmosfera de azoto, adicionou-se 3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (606 g, 3,46 mole) e nitrilo de isoamilo (543 g, 4,5 mole) em THF (7,88 L). A mistura foi arrefecida até cerca de 0°C antes de se adicionar LiHMDS (solução IN em THF, 4,5 L, 4,5 mole) a uma velocidade tal que a temperatura se mantenha abaixo de cerca de 7°C. Após a adição, deixou-se a reacção agitar à temperatura ambiente durante cerca de 2 h enquanto se monitorizava o progresso da reacção por HPLC. Após a reacção estar completa, a mistura foi então arrefecida até cerca de 0°C, e o pH foi ajustado de 12 até cerca de 2-1 utilizando HC1 aquoso (2 N) . O precipitado resultante foi agitado durante cerca de 6 h antes do 27 ΡΕ1341531 isolamento por filtração e secagem para dar 1-hidroxiimino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona 604,7 g (85,6%). l-Hidroxiimino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (625 g, 3,06 mole) e etanol 3A (15,6 L) . A mistura resultante foi hidrogenada a 50°C e 250 psi (1723 kPa) com agitação vigorosa até a reacção estar completa (cerca de 4 horas) . A mistura reaccional foi filtrada sobre uma camada de celite utilizando etanol como solvente e o filtrado foi concentrado para dar um sólido. O sólido foi tratado com diclorometano (6 L) e adicionou-se solução aguosa de hidróxido de sódio 1 N até o pH da fase aquosa estar entre 11-11,5. A mistura foi agitada, as fases foram separadas, e a fase aquosa foi extraída com diclorometano (2 L) . As fases orgânicas foram secas sobre sulfato de magnésio, filtradas, e evaporadas num evaporador rotativo para dar o composto em epígrafe 477 g (81,9%).

Exemplo 4 Síntese de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzaze-pin-2-ona (1,544 g, 8,12 mmole) foi aquecida suavemente em 15 mL de metanol para formar uma solução. Noutro balão, dissolveu-se ácido di-p-toluilo-l-tartárico (3,12 g, 8,08 mmole) em 15 mL de metanol e adicionou-se à solução quente 28 ΡΕ1341531 da amina utilizando uma pipeta. A mistura foi aquecida como um precipitado sólido. Foram adicionados mais 30 mL de metanol para obter uma solução, que foi refluída durante 30-40 minutos e em sequida foi arrefecida lentamente até à temperatura ambiente para dar um sólido. Após agitar durante cerca de 18 horas, o sólido foi recolhido por filtração e lavado com uma pequena quantidade de metanol frio para dar 2,24 g do sal do ácido tartárico da (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (96% de rendimento, 94,7% ee). O sal do ácido tartárico da (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (11,83 g, 20,5 mmole) foi dissolvido em 45 mL de solução aquosa de hidróxido de sódio 1,0 N e foi extraído com cloreto de metileno (3 x 25 mL) . As fases combinadas de cloreto de metileno foram lavadas com 35 mL de solução aquosa de hidróxido de sódio 1,0 N, em seguida com uma solução de salmoura, e foram secas sobre MgSCh anidro. A remoção do solvente sob vácuo deu o composto em epígrafe (3,38 g) como um óleo incolor (87% de rendimento, 93,2% ee).

Exemplo 5 Síntese de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benza-zepin-2-ona (6,0 g, 31,5 mmole) foi aquecida suavemente em 29 ΡΕ1341531 75 mL de metanol para formar uma solução e foi combinada com uma solução de ácido di-p-toluilo-l-tartárico (12,2 g, 31,5 mmole) em 75 mL de metanol quente. Colocaram-se algumas partículas sólidas na solução e formou-se um sólido. Foram adicionados mais 100 mL de metanol e deixou-se a mistura a agitar. Após agitar durante cerca de 18 horas, o sólido foi recolhido e lavado com uma pequena quantidade de metanol frio para dar 6,7 g de um sólido. O sólido foi combinado com metanol (200 mL), e agitado. Após 18 horas, o sólido foi recolhido para dar o sal do ácido tartárico da (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (4,4 g). O isolamento da base pelo processo descrito no Exemplo 4 deu o composto em epígrafe. (96% ee).

Exemplo 6 Síntese de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona

Num vaso de 22 L, sob azoto, aqueceu-se 1-amino-3-metil-2,3, 4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (438 g, 2,3 mole) (cerca de 40°C) para dar uma solução em metanol (4,38 mL). Noutro balão, dissolveu-se ácido di-p-toluilo-l-tartárico (889,7 g, 2,3 mole) em 4,38 L de metanol e aqueceu-se até cerca de 40°C antes de se adicionar a solução de l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. O aquecimento continuou e adicionou-se mais 6,13 L de metanol antes da mistura ser posta ao refluxo durante cerca de 45 minutos e em seguida arrefeceu-se até à temperatura 30 ΡΕ1341531 ambiente para dar um sólido. Após agitar durante cerca de 18 horas, o sólido foi recolhido por filtração e foi lavado com uma pequena quantidade das águas mães, e após seco ao ar, com cerca de 2 L de acetato de etilo para dar 561,6 g do sal do ácido tartárico da (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. Combinou-se o sal do ácido tartárico da (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona, diclorometano (6,57 L) e solução aquosa de hidróxido de sódio (6,57 L) e agitou-se. As fases foram separadas e a fase orgânica foi extraída duas vezes com solução aquosa de hidróxido de sódio 1 N (3,28 L), uma vez com salmoura (2,46 L) antes de ser seca com sulfato de magnésio, filtrada, e evaporada em evaporador rotativo para dar o composto em epígrafe 250g (57%, 94,1% ee).

Exemplo 7 Síntese de sal do ácido clorídrico de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona

Foi preparada uma lama de l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (31,9 g, 168 mmole) em cerca de 300 ml de acetato de isopropanol e aqueceu-se a 45°C. Num balão separado, ácido (R)-(-)-D-mandélico (25,0 g, 164 mmole) foi aquecido em cerca de 130 mL de álcool isopropílico até se formar uma solução e adicionou-se à suspensão l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona/acetato de isopropilo obtido acima para dar uma solução a partir da qual se forma 31 ΡΕ1341531 rapidamente um precipitado. A mistura foi agitada a 45°C durante cerca de 3 horas. Adicionou-se 5-nitrossalicil-aldeído (2-hidroxi-5-nitrobenzaldeído) (1,40 g,8,38 mmoles, 5% molar) à solução quente e a mistura foi agitada a 45°C. Após cerca de 14 horas, a suspensão espessa foi arrefecida até à temperatura ambiente e agitada durante 2 horas antes dos sólidos serem recolhidos por filtração e lavados com 70 mL de acetato de isopropanol frio, e secos num forno de vácuo a 40°C para obter 46, 62 g de sal do ácido (R)-mandélico de (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (82,9% de rendimento, 98,4% ee).

Exemplo 8 Síntese de (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alani-nil)-(S)-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona

Um balão de fundo redondo foi carregado com N-t-Boc-L-alanina (1,0 eq.), hidrato de hidroxibenzotriazole (cerca de 1,1 eq.) e (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (1,0 eq.) em THF sob atmosfera de azoto. Adicionou-se base de Hunig (N,N-diisopropil-etilamina, 1,1 eq.) a uma mistura bem agitada e em seguida EDC (1,1 eq.). Após agitar durante 4 a 17 horas à temperatura ambiente o solvente foi removido a pressão reduzida, o resíduo foi recuperado em acetato de etilo e água, foi lavado com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, HC1 aquoso IN, salmoura, seco sobre sulfato de sódio 32 ΡΕ1341531 anidro, filtrado, e o solvente foi removido a pressão reduzida para dar 1-(N-t-Boc-L-alaninil)-amino-3-metil- 2.3.4.5- tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona: espectroscopia de massa (M+H)+, 362,3.

Fez-se passar uma corrente gasosa de HC1 anidro através da solução de 1-(N-t-Boc-L-alaninil)-amino-3-metil- 2.3.4.5- tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona em agitação em 1,4-dioxano (0,03-0,09 M), gelada num banho de gelo a cerca de 10°C sob N2, durante 10-15 minutos. A solução foi tapada, em seguida o banho de arrefecimento foi removido, e deixou-se a solução aquecer até à temperatura ambiente com agitação durante 2-8 horas, monitorizando por TLC para o consumo do material de partida. A solução foi concentrada para dar 1-(L-alaninil)-(S)-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona que foi utilizado sem outra purificação. 1-(L-alaninil)-(S)-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (1,00 eq.), hidrato de hidroxi-benzotriazole (1,1 eq.) e ácido (S)-2-hidroxi-3-metil-butí-rico (1,0 eq.) em THF sob atmosfera de azoto. Adicionou-se base de Hunig (N,N-diisopropiletilamina, 1,1 eq.) à mistura bem agitada seguida por EDC (1,1 eq.) . Após agitar de 4 a 17 horas à temperatura ambiente o solvente foi removido a pressão reduzida, o resíduo foi recuperado em acetato de etilo (ou solvente semelhante) e água, lavado com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio, HC1 1 N, salmoura, seco sobre sulfato de sódio anidro e o solvente foi removido a pressão reduzida para dar o composto em epígrafe. 33 ΡΕ1341531

Exemplo 9 Síntese de (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alani-nil)-(S)-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona

Um balão de fundo redondo foi carregado com N-t-Boc-L-alanina (249,5 g, 1,32 mole), hidrato de hidroxiben-zotriazole (232,2g, 1,52 mole), e (S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (250,8 g, 1,32 mole) em THF (3,76 L) sob atmosfera de azoto. A mistura foi arrefecida a temperatura inferior a 5°C antes de adicionar base de Hunig (N, N-diisopropiletilamina, 188,4 g, 1,45 mole) seguido por EDC (283,7 g, 1,45 mole). Após agitar 6 horas a mistura reaccional foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante cerca de 14 horas. O solvente foi removido a pressão reduzida, o resíduo foi recuperado em acetato de etilo (3,76 L) e água (1,76 L), as fases foram separadas, a fase orgânica foi extraída com água (1,76 L), as fases aquosas foram combinadas e extraídas com acetato de etilo (1,76 L). As fases orgânicas foram combinadas, extraídas com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (1,76 L), secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas, e evaporadas num evaporador rotativo para dar 1-(N-t-Boc-L-alaninil)amino-3-metil-2,3, 4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona 463 g (97,2%).

Uma solução de HC1 em acetato de etilo foi 34 ΡΕ1341531 preparada fazendo passar HCl gasoso anidro, utilizando um tubo de dispersão por baixo da superfície, através de acetato de etilo (1,76 L) arrefecido a cerca de 0°C. A solução de HCl de acetato de etilo preparada acima foi adicionada com agitação vigorosa a uma suspensão espessa de 1-(N-t-Boc-L-alaninil)amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (462 g, 1,28 mole) em acetato de etilo (3,7 L). Uma quantidade adicional de acetato de etilo (1 L) foi adicionada e deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agitou-se durante 22 h. A mistura reaccional foi filtrada para dar um sólido. Preparou-se uma suspensão espessa do sólido com acetonitrilo (5 L), aqueceu-se ao refluxo e em seguida arrefeceu-se até cerca de 60°C antes de filtrar e secar para dar 1-(L-alaninil)-(S)-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona 389,9 g (94,7 %). 1-(L-Alaninil)-(S)-amino-3-metil-2, 3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona (369,5 g, 1,18 mole), hidrato de hidroxibenzotriazole (207,6 g, 1,36 mole), base de Hunig (N,N-diisopropiletilamina, 352,2 g, 2,71 mole), e ácido (S)-2-hidroxi-3-metil-butírico (140,6 g, 1,18 mole) em THF (4,8 L) foram combinados sob uma atmosfera de azoto e foram arrefecidos e temperatura inferior a 5°C. Adicionou-se EDC (253,7 g, 1,3 mole) e deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agitar. Pós cerca de 25 horas a mistura reaccional foi diluída com diclorometano (5,54 L) e extraiu-se com água (2,22 L) . A fase orgânica foi extraída com água (2,22 L) , as fases aquosas foram 35 ΡΕ1341531 combinadas e extraídas com diclorometano (5,54 L). As fases orgânicas foram combinadas, extraídas duas vezes com água (2,22 L), com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2,22 L) , secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas, e evaporadas num evaporador rotativo para dar um sólido 428 g (100%). Os sólidos foram recuperados numa mistura de solventes contendo acetona (3,42 L) e água (0,856 L) com aquecimento ligeiro (40°C). A solução foi separada em duas porções de ~2 L e a cada uma foi adicionada água (7,19 L) enquanto se aquecia a solução turva a 50°C. Após completar a adição da água deixou-se a solução turva arrefecer até à temperatura ambiente para dar um sólido que foi agitado como uma suspensão espessa até à temperatura ambiente durante 14 horas antes de ser filtrada e seca para dar o composto em epígrafe 310,6 g (66,2%) como o seu desidrato.

Quando utilizado como um fármaco a presente invenção é usualmente administrada na forma de uma composição farmacêutica. Portanto, noutra forma de realização, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de N-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1- (L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona e um diluente farmaceuticamente aceitável. Estas composições são para ser utilizadas para inibir a libertação do peptídeo β-amilóide e/ou a sua síntese, incluindo o tratamento da doença de Alzheimer. Portanto, a presente invenção inclui a utilização de -((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3- 36 ΡΕ1341531 metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona para o fabrico de um medicamento para inibir a libertação do peptideo β-amilóide e/ou da sua sintes, e inclui especi-ficamente, o tratamento da doença de Alzheimer. N- ( (S)-2-Hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona pode ser administrada por várias vias. 0 presente composto pode ser administrado em qualquer forma ou modo, que torne o composto biodisponivel numa quantidade eficaz, incluindo as vias oral e parentérica. Por exemplo, o presente composto pode ser administrado oralmente, por inalação, subcutaneamente, intravenosamente, transdermicamente, intranasalmente, rectalmente, ocularmente, topicamente, sub-lingualmente, bucalmente, e outros semelhantes.

Na preparação das composições desta invenção, o ingrediente activo é habitualmente misturado com um excipiente, diluído por um excipiente ou incluído num veículo tal que pode estar na forma de uma cápsula, saqueta, papel ou outro contentor. 0 composto da presente invenção pode ser administrado isolado ou na forma de uma composição farmacêutica, ou seja, combinado com diluentes farmaceu-ticamente aceitáveis, tal como veículos ou excipientes, a proporção e natureza dos quais é determinada pela solubilidade e propriedades químicas do presente composto, da via de administração escolhida, e prática farmacêutica padrão. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18aEdição, Marck Publishing Co. (1990)). 37 ΡΕ1341531

As presentes composições farmacêuticas são preparadas de um modo bem conhecido na técnica farmacêutica. 0 veiculo ou excipiente pode ser um material sólido, semi-sólido, ou liquido que pode servir como veiculo ou meio para o ingrediente activo. Veículos ou excipientes adequados são bem conhecidos na técnica. A composição farmacêutica pode ser adaptada para utilização oral, por inalação, parentérica, ou tópica e pode ser administrada ao paciente na forma de comprimidos, cápsulas, aerossóis, inalantes, supositórios, soluções, suspensões, ou outros semelhantes.

Com o objectivo de administração terapêutica oral, os compostos podes ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas, pastilhas elásticas, e outros semelhantes. Estas preparações devem conter pelo menos 4% do composto da presente invenção, o ingrediente activo, mas pode variar dependendo da forma particular e pode convenientemente estar entre 2% e 90% do peso da unidade. A quantidade do composto da presente invenção é tal que será obtida uma dosagem adequada. Composições e preparações preferidas de acordo com a presente invenção podem ser determinadas por uma pessoa especializada.

Os comprimidos pílulas, cápsulas, trocisco, e outros semelhantes podem também conter um ou mais dos 38 ΡΕ1341531 seguintes adjuvantes: ligandos tal como celulose microcris-talina, goma de tragacanto ou gelatina; excipientes tal como amido ou lactose; desintegrantes tal como ácido algí-nico, Primogel, amido de milho e outros semelhantes; lubrificantes tal como estearato de magnésio, óleo de silicio, ou Sterotex; agentes de viscosidade tal como dióxido de silicio coloidal; e agentes edulcorantes tal como sacarose ou sacarina podem ser adicionados ou um agente aromatizante tal como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, para além dos materiais dos tipos anteriores, um veiculo liquido tal como polietilenoglicol ou uma gordura na forma de óleo. Outras formas de dosagens unitárias podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da forma de dosagem unitária, por exemplo, como coberturas. Portanto, comprimidos ou pílulas podem ser cobertos com açúcar, goma laca, ou outros agentes de cobertura. Um xarope pode conter, para além dos presentes compostos, sacarose como um agente edulcorante e alguns conservantes, tinturas, corantes e aromatizantes. Os materiais utilizados na preparação destas várias composições devem ser farmaco-logicamente puros nas quantidades utilizadas.

Com o objectivo de administração parentérica, o composto da presente invenção pode ser incorporado numa solução ou suspensão. Estas preparações contêm habitualmente pelo 0,1% do composto da invenção, mas pode variar entre cerca de 0,1% e cerca de 90% do seu peso. A 39 ΡΕ1341531 quantidade do composto presente nestas composições é tal que será obtida uma dosagem adequada. As soluções ou suspensões podem também incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis tal como água para injecções, solução salina, óleos fixos, polietilenos glicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como álcool benzilico ou parabeno de metilo; antioxidantes tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tal como ácido etileno diaminotetraacético; tampões tal como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser inclusa em ampolas, seringas descartáveis ou pequenos frascos de doses múltiplas de vidro ou plástico. Composições e preparações preferidas podem ser determinadas por uma pessoa especializada. 0 composto da presente invenção pode também ser administrado topicamente, e nesse caso o veiculo pode compreender, de modo adequado, uma solução, unguento, ou uma base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: vaselina, lanolina, polietilenoglicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes tal como água e álcool, e emulsificantes, e estabilizantes. Formulações tópicas podem conter uma concentração de fórmula I ou do seu sal farmaceuticamente aceitável desde cerca de 0,1 até cerca de 10% p/v (peso/unidade de volume). 40 ΡΕ1341531

Outra formulação preferida da presente invenção utiliza dispositivos de libertação transdérmica ("emplastros") Estes emplastros transdérmicos podem ser utilizados para originar uma infusão continua ou descontinua do produto da presente invenção em quantidades controladas. O fabrico e a utilização dos emplastros transdérmicos para a libertação de agentes farmacêuticos é bem conhecida na técnica. Ver, e.g., Patente U.S. 5.023.252, publicada a 11 de Janeiro de 1991. Estes emplastros podem ser fabricados para a libertação contínua, pulsátil, ou conforme necessário dos agentes farmacêuticos.

Para ilustrar de modo mais completo a operação desta invenção, composições farmacêuticas habituais são descritas abaixo. Os exemplos são unicamente ilustrativos, e não se pretende que limitem de algum modo o objectivo da presente invenção.

Exemplo de Formulação 1 São preparadas cápsulas de gelatina dura contendo os seguintes ingredientes

Ingrediente Quantidade (mg/cápsula)

Ingrediente activo 30,0

Amido 305,0

Estearato de magnésio 5,0 41 ΡΕ1341531

Os ingredientes acima são misturados e introduzidos em cápsulas de gelatina duras numa quantidade de 340 mg.

Exemplo de Formulação 2 É preparado um comprimido contendo os ingredientes abaixo:

Ingrediente Ingrediente activo Celulose microcristalina Dióxido de silício coloidal Ácido esteárico

Quantidade (mg/comprimido) 25.0 200.0 10,0 5,0

Os componentes são misturados e comprimidos para formar comprimido, cada um pesando 240 mg.

Exemplo de Formulação 3

Uma formulação em pó seco para inalação é preparada contendo os seguintes ingredientes:

Ingrediente Peso Ingrediente activo 5 Lactose 95 O ingrediente activo é misturado com a lactose e a mistura é adicionada a um aplicador de pó seco. 42 ΡΕ1341531

Exemplo de Formulação 4

Comprimidos, cada um contendo 30 mg de ingrediente activo, são preparados como se segue:

Ingrediente Quantidade (mg/comprimido)

Ingrediente activo 30,0 mg

Amido 45,0 mg

Celulose microcristalina 35,0 mg

Polivinilpirrolidona (como uma solução a 10% em água estéril) 4,0 mg

Carboximetilamido de sódio 4,5 mg

Estearato de magnésio 0,5 mg

Talco 1,0 mg

Total 120,0 mg O ingrediente activo, o amido e a celulose são passados através de um peneiro de rede N° 20 U.S. e são misturados vigorosamente. A solução de polivilpirrolidona é misturada com os pós resultantes, que são então passados através de um peneiro de rede N° 16 U.S. O carboximetilamido de sódio, o estearato de magnésio, e o talco, previa-mente passados através de um peneiro de rede N° 30 U.S., são então adicionados aos grânulos que, após mistura, são comprimidos numa máquina de formar comprimidos para originar comprimidos cada um pesando 150 mg. ΡΕ1341531 43

Exemplo de Formulação 5 Cápsulas, cada um contendo 40 mg de medicamento são preparadas como se segue:

Ingrediente Ingrediente activo Amido Estearato de magnésio Total

Quantidade (mg/cápsula) 40.0 mg 109.0 mg 1,0 mg 150.0 mg O ingrediente activo, o amido e o estearato de magnésio são misturados, passados através de um peneiro de malha No. 20 U.S., e introduzem-se em cápsulas de gelatina dura com uma quantidade de 150 mg.

Exemplo de Formulação 6

Supositórios, cada um contendo 25 mg de ingrediente activo são preparados como se segue:

Ingrediente Quantidade

Ingrediente activo 25 mg

Glicerideos de ácido gordo saturado até 2.000 mg O ingrediente activo é passado através de um peneiro de malha No. 60 U.S. e é preparada uma suspensão nos glicerideos de ácido gordo saturado previamente fundi

dos utilizando a quantidade de calor mínima necessária. A 44 ΡΕ1341531 mistura é então despejada para dentro de um molde de supo- sitórios de capacidade nominal de 2,0 g fecer. e deixa-se arre- Exemplo de Formulação 7

Suspensões, cada um contendo 50 mg de medicamento por dose de 5,0 mL, são preparados como se segue:

Ingrediente Quantidade Ingrediente activo 50,0 mg Goma de xantano Carboximetilcelulose de sódio (11%) 4,0 mg Celulose microcristalina (89%) 50,0 mg Sacarose 1,75 mg Benzoato de sódio 10,0 mg Aromatizante e corante q.b. Água purificada até 5,0 mL O ingrediente activo, o sacarose e a goma de xantano são misturados, passados através de um peneiro de rede N° 10 U.S., e em seguida são misturados com uma solução previamente preparada de celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio em água. O benzoato de sódio, o aromatizante, e o corante são diluídos com a mesma água e são adicionados com agitação. É então adicionada água suficiente para produzir o volume desejado. ΡΕ1341531 45

Exemplo de Formulação 8 Cápsulas, cada um contendo 15 mg de medicamento são preparadas como se segue:

Ingrediente Ingrediente activo Amido Estearato de magnésio Total

Quantidade (mg/cápsula) 15.0 mg 407.0 mg 3,0 mg 425.0 mg O ingrediente activo, o amido e o estearato de magnésio são misturados, passados através de um peneiro de malha No. 20 U.S., e introduzem-se em cápsulas de gelatina dura com uma quantidade de 560 mg.

Exemplo de Formulação 9

Uma formulação subcutânea pode ser preparada como se segue:

Ingrediente Quantidade (mg/cápsula)

Ingrediente activo 1,0 mg

Óleo de milho 1 mL

Dependendo da solubilidade do ingrediente activo no óleo de milho, até cerca de 5,0 mg ou mais de ingrediente activo podem ser utilizados nesta formulação, se desejado. ΡΕ1341531 46

Exemplo de Formulação 10 para utilização tópica pode ser

Uma formulação preparada como se segue: Ingrediente Ingrediente activo Cera emulsificante Parafina líquida Parafina mole branca

Quantidade (mg/cápsula) 1-10 g 30 g 20 g até 100 g A parafina branca mole é aquecida até fundir. A parafina líquida e a cera emulsificante são incorporadas e agitadas até dissolver. O ingrediente activo é adicionado e a agitação continua até estar tudo disperso. A mistura é então arrefecida até ficar sólida.

Num dos seus aspectos, esta invenção descreve um método para inibir a libertação e/ou síntese do peptídeo β-amilóide compreendendo a administração a um paciente que dele necessite de uma quantidade eficaz de - ( (S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3, 4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona. Numa forma de realização particular, a presente invenção fornece um composto que é adequado para o tratamento da doença de Alzheimer compreendendo a administração a um paciente que dele necessite de uma quantidade eficaz do referido composto que 47 ΡΕ1341531 é (N)- ((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-1-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona.

Verifica-se também que uma pessoa especializada pode controlar a doença de Alzheimer tratando um paciente actualmente atingido pela doença ou tratando de modo profiláctico um paciente em risco de desenvolver a doença. Portanto, pretende-se que os termos "tratamento" e "tratando" se refiram a todos os processo em que pode haver uma retardando, interrompendo, impedindo, controlando, ou parando o progresso da doença de Alzheimer, mas não indicam necessariamente uma eliminação total de todos os sintomas. Como tal, os métodos descritos incluem para a prevenção do início da doença de Alzheimer num paciente em risco de desenvolver a doença de Alzheimer, a inibição da progressão da doença de Alzheimer, e o tratamento da doença de Alzheimer avançada.

Como é aqui utilizado, o termo "paciente" refere-se a um animal de sangue quente, tal como um mamífero, que sofre de uma doença que está associada com o aumento da libertação do peptídeo β-amilóide e/ou a sua síntese, incluindo a doença de Alzheimer. É entendido que cobaias, cães, ratos, ratinhos, cavalos, gado bovino, ovelhas, e seres humanos são exemplos de animais que estão incluídos no significado do termo. Pacientes que necessitem deste tratamento são facilmente diagnosticados.

Como é aqui utilizada a expressão "quantidade 48 ΡΕ1341531 eficaz" de um composto de fórmula I refere-se a uma quantidade que é eficaz na inibição da libertação do peptideo β-amilóide e/ou na sua síntese, e especificamente, no tratamento da doença de Alzheimer.

Uma quantidade eficaz pode ser facilmente determinada pelo médico assistente que faz o diagnóstico, como perito na técnica, pela utilização de técnicas convencionais e pela observação dos resultados obtidos em circunstâncias análogas. Na determinação de uma quantidade eficaz, a dose de N-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona, são considerados vários factores pelo médico assistente que faz o diagnóstico, incluindo, mas não estando limitado a: a potência e as características da N-((S) -2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)- (S)-1-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona; a espécie do paciente; o seu tamanho, idade, e estado geral de saúde; o grau de envolvimento ou gravidade da doença; a resposta individual do paciente; o modo de administração; a biodisponibilidade característica da preparação administrada; o regime de dosagem seleccionado; a utilização de outra medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes .

Uma quantidade eficaz de N-( (S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona é esperada que varie desde cerca de 0,1 miligramas por quilograma de peso 49 ΡΕ1341531 corpóreo por dia (mg/kg/dia) até cerca de 100 mg/kg/dia. Quantidades preferidas são possíveis de ser determinadas por um perito na técnica. A N- ( (S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alani-nil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzaze-pin-2-ona desidratada da presente invenção pode ser testada em vários sistemas biológicos incluindo os que se seguem.

Exemplo A

Pesquisa Celular para a Detecção de Inibidores de Produção de β-Amilóide

Foram testados numerosos compostos de fórmula I anterior para verificar a sua capacidade para inibir a produção de β-amilóide numa linha celular possuindo a mutação Swedish. Neste ensaio de pesquisa utilizaram-se células (K293 = linha celular de rim humano) que foram transfecta-das de modo estável com o gene para a proteína 751 (APP751) precursora de amilóide contendo a dupla mutação Lys65iMet652 a Asn65iLeu652 (numeração APP751) no modo descrito no Pedido de Publicação de Patente Internacional No. 94/105698 e Citron et al.12. Esta mutação é habitualmente designada por mutação de Swedish e as células, designadas por "293 751 SWE", foram colocadas numa placa de 96-poços de Corning com 2-4 x 104 células por poço no meio mínimo essencial de Dulbecco (Sigmam St. Louis, MO) mais 10% de soro fetal bovino. O número de células é importante de modo a 50 ΡΕ1341531 conseguir resultados do teste ELISA para relativos ao β-amilóide dentro do intervalo linear do ensaio (~0,2 a 2,5 ng por mL).

Após incubação de um dia para o outro a 37°C num incubador equilibrado com dióxido de carbono a 10%, o meio foi removido e substituído com 200 μL de meio contendo um composto de fórmula I (fármaco) por poço durante um período de pré-tratamento de duas horas e as células foram incubadas como acima. Foram preparados fármacos para armazenar em sulfóxido de dimetilo a 100% de tal modo que na concentração final de fármaco utilizada no tratamento, a concentração de sulfóxido de dimetilo não exceda 0,5% e, na realidade, habitualmente seja igual a 0,1%.

No fim do período de pré-tratamento, o meio foi de novo removido e substituído por meio fresco contendo fármaco como acima e as células foram incubadas por mais duas horas. Após o tratamento, as placas foram centrifu-gadas num Beckman GPR a 1200 rpm durante cinco minutos à temperatura ambiente até à formação de resíduos do aglomerado celular do meio acondicionado. De cada poço, 100 yL de meio condicionado ou diluições apropriadas deste foram transferidos para uma placa ELISA pré-coberta com anticorpo 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] contra aminoácidos 13-28 de peptídeo β-amilóide como descrito no Pedido de Publicação de Patente Internacional No. 94/10569 e foram armazenados a -4°C de um dia para o 51 ΡΕ1341531 outro. Um ensaio ELISA utilizando anticorpo 3D6 marcado [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] para os aminoácidos 1-5 do peptídeo β-amilóide foi levado a cabo para determinar a quantidade de peptídeo β-amilóide produzido.

Efeitos citotóxicos dos compostos foram determinados por uma modificação do método de Hansen, et al. Ás células que permaneceram na placa de cultura de tecido foram adicionados 25 yL de solução stock de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio(MMT) (Sigma, St Louis, MO) (5 mg/mL) com uma concentração final de 1 mg/mL. As células foram incubadas a 37°C durante uma hora, e a actividade celular foi parada por adição de um volume igual de tampão de lise MTT (dodecilsulfato de sódio 20% p/v em dimetilformadia 50%, pH 4,7). A extracção completa foi conseguida por agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente. A diferença entre a OD562nm e a OD562nm foi determinada num leitor de UVmx Molecular Device de microplacas como indicador da viabilidade celular.

Os resultados de do teste ELISA do β-amilóide foram adaptados a uma curva padrão e foram expressos em ng/ml de peptídeo β-amilóide. De modo a normalizar para a citotoxicidade, estes resultados foram divididos pelos resultados de MTT e foram expressos como uma percentagem dos resultados de um controlo de fármaco livre. Todos os resultados são a média e o desvio padrão de pelo menos seis ensaios réplicas. 52 ΡΕ1341531

Exemplo B

Supressão In Vivo da Libertação e/ou Síntese de β-Amilóide

Este exemplo ilustra como os compostos desta invenção podem ser testados em relação à supressão in vivo da libertação e/ou síntese de β-amilóide. Para estas experiências são utilizados ratos PDAPP de 3 a 4 meses de idade [Games et al., (1995) Nature 373:523-527]. Dependendo de qual composto está a ser testado, o composto é habitualmente formulado com uma concentração entre 1 e 10 g/mL. Devido aos factores de baixa solubilidade dos compostos, estes podem ser formulados com vários veículos tal como óleo de milho (Safety, South San Francisco, CA) ; 10% de etanol e óleo de milho; 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (Research Biochemicals International, Natick MA); e carboxi-metilato de celulose (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).

Foram dadas aos ratos doses de modo subcutâneo com uma agulha de calibre 26 e 3 horas depois os ratos foram mortos por narcose com CO2 e o sangue foi retirado por punção cardíaca utilizando uma seringa de tuberculina 1 cc 25G 5/8"/agulha coberta com solução de EDTA 0,5 M, pH 8,0. O sangue é colocado num vacutainer de Becton-Dickinson contendo EDTA e são rodados invertidos durante 15 minutos a 1500 xg a 5°C. Os cérebros dos ratos são então removidos e 53 ΡΕ1341531 o córtex e o hipocampo são retirados por dissecação e colocados em gelo. 1. Ensaio do cérebro

Para preparar os tecidos hipocampal e cortical para ensaios imunoenzimáticos indirectos (ELISAs) cada região do cérebro é homogeneizada em 10 volumes de tampão guanidina gelado (guanidina-HCl 5,0 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0) utilizando um pilão mecânico Kontes (Fisher, Pitts-burgh PA) . Os homogenatos são agitados lentamente numa plataforma rotativa durante três a quatro horas à temperatura ambiente e são armazenados a -20°C antes da quantificação do β-amilóide.

Os homogenatos cerebrais são diluídos 1:10 com tampão de caseína gelado [0,25% de caseína, tampão fosfato-salino (PBS), azida de sódio 0,05%, aprotinina 20 μρ/πΛ, EDTA 5mM, pH 8,0, leupeptina 10 μρ/ηΛ], reduzindo assim a concentração final de guanidina a 0,5 M, antes da centrifugação a 16.000 xg durante 20 minutos a 4°C. As amostras, se necessário, são de novo diluídas para conseguir um intervalo óptimo para as determinações ELISA por adição de tampão caseína com cloridrato de guanidina 0,5 M adicionado. Os padrões de β-amilóide (aminoácidos 1-40 ou 1-42) foram preparados de tal modo que a composição final seja equivalente a guanidina 0,5 M na presença de albumina de soro bovino 0,1% (BSA). 54 ΡΕ1341531 0 teste "ELISA sandwich" do β-amilóide total, quantificando ambos o β-amilóide (aa 1-40) e β-amilóide (aa 1-42) consiste em dois anticorpos monoclonais (mAb) par o β-amilóide. O anticorpo de captura, 266 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327], é especifico para os aminoácidos 13 -28 do β-amilóide. O anticorpo 3D6 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94:1550-1555], que é especifico para os aminoácidos 1-5 do β-amilóide, é biotinilado e serve de anticorpo repórter no ensaio. O procedimento de bioti-nilação do 3D6 utiliza o protocolo do fabricante (Pierce, Rockford IL) para a marcação de imunoglobulinas com NHS-biotina excepto pela utilização de bicarbonato de sódio 100 mM, tampão pH 8,5. O anticorpo 3D6 não reconhece a proteina precursora de amilóide segregada (APP) ou o comprimento total de APP mas detecta só as espécies de amilóides com um grupo amino prato terminal do ácido aspártico. O ensaio tem um limite de sensibilidade inferior de -50 pg/mL (11 pM) e não apresenta reactividade cruzada com a murina endógena de peptideo β-amilóide para concentrações até 1 ng/mL. A configuração a quantificação pelo teste ELISA sandwich do nivel de β-amilóide (aa 1-42) utiliza o mAb 21F12 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] (que reconhece os aminoácidos 33-42 do β-amilóide) como o anticorpo de captura. 3D6 biotinilado é também o anticorpo repórter neste ensaio que tem um limite inferior de sensibilidade de -125 pg/mL (28 pM). 55 ΡΕ1341531 Ο 266 e 21F12 de captura do mABs a 10 μς/ητίΐ são utilizados para cobrir placas de 96 poços de ensaios imunológicos (Costar, Cambridge MA) de um dia para o outro à temperatura ambiente. As placas são então aspiradas e bloqueadas com albumina de soro humano a 0,25% em tampão PBS durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, em seguida são armazenadas com um excicante a 4°C até utilização. As placas são rehidratadas por lavagem com tampão (solução salina tris-tamponada, Tween 20 0,05%) antes da utilização. As amostras e os padrões são adicionados às placas e são incubadas de um dia para o outro a 4°C. As placas são lavadas 3 vezes com solução tampão entre cada passo do ensaio. O 3D6 biotinilado, diluido a 0,5 μρ/ηΛ com tampão de incubação de caseína (caseína 0,25%, PBS, Tween 20 0,0 5%, pH 7,4) é incubado no poço durante uma hora à temperatura ambiente. Avidina-HRP (Vector, Burlingame CA) diluída 1:4000 em tampão de incubação caseína é adicionada aos poços durante 1 hora à temperatura ambiente. O substrato colorimétrico, Slow TMB-ELISA (Pierce, Cambridge MA), é adicionado e deixa-se reagir durante 15 minutos, após o que se para a reacção enzimática com adição de H2SO4 2N. O produto da reacção é quantificado utilizando um Molecular Devices Vmax (Molecular Devices, Menlo Park CA) medindo a diferença de absorvância a 450 nm e 650 nm. 2. Ensaio de sangue O plasma em EDTA é diluído 1:1 em mistura diluente (fosfato de sódio 0,2 mg/L. H20 (monobásico), 56 ΡΕ1341531 fosfato de sódio 2,16 mg/L. H20 (dibásico) , timerosal 0,5 mg/L, cloreto de sódio 8,5 mg/mL, 0,5 mL Triton X-405, hemoglobina livre de albumina de soro bovino 6,0 g/L; e água) As amostras e padrões na solução diluente são testadas utilizando o teste do β-amilóide total (266 de captura/3D6 repórter) descrito acima para o ensaio de cérebro com excepção que foi utilizada mistura diluente em vez do diluente caseina descrito.

Lisboa, 27 de Março de 2007

Claims (9)

1. ΡΕ1341531 1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula I, (N)- ((S)-2-hidroxi- 3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3, 4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona:

   I
2. 2. Composição farmacêutica compreendendo o com- posto de fórmula I, (N)-((S)-2-hidroxi-3-metil-butiril)-1-(L-alaninil)-(S)-l-amino-3-metil-2,3,4,5-tetra-hidro-2H-3-benzazepin-2-ona:

   1 e um diluente farmaceuticamente aceitável.
3. 3. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para utilização como fármaco.
4. 4. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para utilização no tratamento da doença de Alzheimer. 2 ΡΕ1341531
5. 5. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para utilização na prevenção da doença de Alzheimer.
6. 6. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para utilização na inibição da libertação do peptideo β-amiloíde e/ou na sua síntese.
7. 7. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para utilização na inibição da doença de Alzheimer.
8. 8. Composto de acordo com a Reivindicação 1 para o fabrico de um medicamento para a inibição da libertação do peptideo β-amiloíde e/ou da sua síntese, incluindo o tratamento da doença de Alzheimer.
9. 9. Utilização de um composto de acordo com a Reivindicação 1 para a utilização no fabrico de um medicamento para prevenir a doença de Alzheimer e/ou inibir a progressão da doença de Alzheimer. Lisboa, 27 de Março de 2007