KR20030064275A - 면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강 - Google Patents

면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강 Download PDF

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Abstract

종양 치료를 위한 방법 및 조성물을 개시한다. 개시된 방법 및 조성물은 종양 내로의 면역싸이토카인의 흡수를 증강시키며, 면역싸이토카인 흡수 증강제와 면역싸이토카인의 조합에 기초한 것이다. 기재한 방법 및 조성물은, 포유류에서 종양 크기 및 전이 감소에 특히 유용하다.

Description

면역싸이토카인 흡수 증강제와의 조합 치료에 의한 항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응 증강{ENHANCEMENT OF ANTIBODY-CYTOKINE FUSION PROTEIN MEDIATED IMMUNE RESPONSES BY COMBINED TREATMENT WITH IMMUNOCYTOKINE UPTAKE ENHANCING AGENTS}
관련 출원
본 출원은 2000.6.29에 출원된 60/215,038의 우선권과 혜택을 주장하며 이의 내용은 여기에 참고로 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 목표화된 면역 치료에 유용한 항체-싸이토카인 융합 단백질에 관련된다. 일반적으로, 본 발명은 일례로 종양 세포와 같은 미리 선정된 목표에 대항한 항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응을 제고하기 위한 조합 치료에 있어서 면역싸이토카인 흡수 증강제의 사용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 세포 또는 기타 암 또는 질환 세포를 치료하기 위한 탁산 및/또는 알킬화제와 조합되는 항체-싸이토카인 융합 단백질의 투여에 관한 것이다.
발명의 배경
암과 같은 질환의 효과적 치료는 자연 킬러 (NK) 세포, 마크로파지 또는 T 림포사이트와 같은 하나 이상의 효과 세포 타입의 강한 면역 반응을 요구한다. 종양을 소지한 동물 및 환자에서, 면역 시스템은 성장 종양을 효과적으로 대처하지 못하였는데, 이는 대부분, 종양이 면역 반응을 억제하기 위해 발전시킨 특이 기작 때문이다. 많은 경우에서, 일례로 마크로파지와 같은 잠정적으로 종양 파괴성인 단구세포가 성장 종양 기층에 이동하지만, 종양 세포에 의한 프로스타글란딘, TGF-β 및 IL-10와 같은 인자 분비가 이들의 조직 독성 활성을 조절한다 (일례로, Sharma 등, 1999, J. IMMUNOL. 163:5020-5028). 유사하게, 림포사이트 세포로서 NK 및 T 세포와 같은 것이 종양으로 이동하나, 종양에 의해 분비되는 인자에 의해 억제될 뿐 아니라, 면역 세포의 에이팝토시스를 활성화하는 종양 세포 표면에서 발현되는 수용체와의 상호작용에 의해 억제된다 (일례로, Villunger 등, 1997, BLOOD 90:12-20). 이들 림포사이트가 종양 기층의 면역 억제 단구세포에 노출되면, 효과적인 항종양 반응을 억제하는 이들의 능력이 더욱 감소된다.
국소적인 종양 미세 환경의 면역 억제 효과를 극복하고자하는 노력으로는, 목표화된 면역 자극, 일례로 종양-특이성인 항체-싸이토카인 융합 단백질을 이용한 치료를 포함한다. 이를 이용한 효과적 치료는 각종 마우스 종양 전이 모델에서 개시되었으나, 종양 크기 증가와 비교하여 치료가 매우 비효과적이다. 이는, 종양 덩어리에 의해 분비되는 억제 인자의 수준 증가 및 종양 간극액 압력 증가, 고체 종양에 대한 치료제 침투의 장벽과 같은 기타 인자에 의한 것으로 보여진다 (Griffon-Etienne 등, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782).
대부분의 암환자들이 하나 이상의 화학 치료 요법으로 아직도 치료받고 있으나, 암의 조직 독성 치료가 면역 시스템에 유해함은 공지이다. 면역 세포는 인간 신체에 있어서 가장 빨리 분화하는 세포 중의 하나로서, 분화 세포를 죽이는 치료는 면역 세포 또한 죽이는 것이다. 따라서, 방사선 조사, DNA-손상 화학물질, DNA 합성 억제제 및 마이크로튜뷸 기능 억제제를 포함한 치료는 모두 면역 시스템의 파괴를 초래한다. 암 치료와 더불어 골수 이식이 필요한데, 이는 면역 시스템이 파괴되어 다시 회복되어야 하는 바로 그 이유 때문이다. 메토트릭세이트 및 기타 항암 약물이 또한 면역 억제제로 종종 사용된다. 항암 치료가 T 세포 기능을 특이하게 억제한다는 증거가 있다. 일례로 Hodgkin씨 병으로 전신 방사선 조사의 치료를 받는 환자는, 신생 T 세포가 명백하게 영구 손상된다 (Watanabe 등, 1997, Blood 90:3662).
현재 지식으로는, 표준 방법 (화학 치료 및 방사선 조사) 및 국소 면역 제고가 암의 효과적 치료를 위한 유용한 조합 접근으로는 보여지지 않는다. 따라서, 당분야에서는, 일례로 종양 세포와 같은 미리 선택된 세포 타입에 대항하는 항체-싸이토카인 융합 단백질 매개 면역 반응을 증강하는 방법 및 이들 방법에 사용되는 조성물이 필요하다.
발명의 요약
항체-싸이토카인 융합 단백질 (면역싸이토카인)을 종양 또는 종양 전이를 가지는 포유류에 투여할 때, 종양에 의해 흡수가 증강 또는 제고됨에 의해 항체-싸이토카인 융합 단백질의 치료 효과를 증강 또는 제고하는 면역싸이토카인 흡수 증강제를 포유류 치료 전, 동시에 또는 이후에 투여함에 의해 보다 강한 항종양 반응을 얻을 수 있음이 밝혀졌다. 유용한 면역싸이토카인 흡수 증강제는, 알킬화 화학 치료제 및, 파클리탁셀 (paclitaxel)과 같은 탁산을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 특히 종양 세포 또는 바이러스 감염 세포와 같은 미리 선택된 세포 타입의 면역 파괴 매개에, 이러한 조합이 유용함을 밝혀내었다.
한 구현에서, 본 발명은, 포유류에서 미리 선택된 세포 타입의 세포 파괴성 면역 반응 유도법을 제공한다. 본 방법은, (i) 미리 선택된 세포 타입에 대해 면역 반응과 같은 것을 유도하는 싸이토카인과 미리 선택된 세포 타입에 결합할 수 있는 결합 부위를 소지한 항체를 함유하는 면역싸이토카인, 및 (ii) 면역싸이토카인 단독에 의해 촉진되는 면역 반응에 비해 면역 반응을 증강시키기에 충분한 양의 면역싸이토카인 흡수 증강제를 포유류에 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 구현에서, 미리 선택된 세포 타입은, 일례로 고형 종양, 보다 바람직하게는 거대 고형 종양 (일례로 약 100mm3초과)과 같은 존재하는 암세포이다. 이와 다르게는, 미리 선택된 세포 타입은, 소형 전이로 존재하는 암세포일 수 있다.
다른 바람직한 구현에서는, 면역싸이토카인 흡수 증강제를 면역싸이토카인과 동시에 투여 가능하다. 이와 다르게는, 면역싸이토카인 투여 전에 면역싸이토카인 흡수 증강제를 투여 가능하다. 또한, 상이한 복수의 면역싸이토카인 흡수증강제와 함께 면역싸이토카인을 투여할 수도 있을 것이다. 이와 다르게는, 상이한 복수의 면역싸이토카인과 함께 면역싸이토카인 흡수 증강제를 투여할 수 있다.
다른 구현에서, 본 발명은, 포유류에서 미리 선택된 세포 타입에 대해 세포 파괴성 면역 반응을 유도하는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 (i) 포유류에서 미리 선택된 세포 타입에 대해 면역 반응과 같은 것을 유도하는 싸이토카인과, 미리 선택된 세포 타입에 결합할 수 있는 결합 부위를 소지한 항체를 함유하는 면역싸이토카인, 및 (ii) 면역싸이토카인 단독에 의해 촉진되는 면역 반응에 비해 조직 파괴 반응을 증강시키기에 충분한 양인 조성물의 면역싸이토카인 중의 면역싸이토카인 흡수 증강제를 포함하는 것이다.
바람직한 구현에서, 면역싸이토카인의 항체 결합 부위는, 면역 글로불린 중쇄 및 이들의 항원 결합 단편을 바람직하게 포함한다. 면역 글로불린 중쇄는, 바람직하게는, 아미노말단에서 카르복시 말단 방향으로, 미리 선택된 항원에 결합 가능한 면역 글로불린 가변 (VH) 영역 도메인, 면역 글로불린 일정 중 1 (CH1) 도메인, 면역 글로불린 일정 중 2 (CH2) 도메인을 함유하며, 임의로는 면역 글로불린 일정 중 3 (CH3) 도메인을 추가로 함유할 수 있다. 보다 바람직한 구현에서, 면역싸이토카인은, 싸이토카인에 대해 폴리펩타이드 결합을 통해 융합된 면역 글로불린 중쇄 또는 이들의 항원 결합 단편을 함유한 융합 단백질이다.
이에 따라, 바람직한 항체-싸이토카인 융합 단백질은, 아미노말단에서 카르복시 말단 방향으로, (i) 미리 선택된 세포 타입의 세포 표면 항원에 결합 가능한 면역 글로불린 가변 영역을 함유하는 항체 결합 부위, 면역 글로불린 CH1 도메인, 면역 글로불린 CH2 도메인 (임의로는 면역 글로불린 CH3 도메인) 및, (ii) 면역싸이토카인을 포함한다. 이들 융합 단백질을 제조 및 사용하는 방법은 하기에 자세히 개시되어 있다; Gillies 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160; 6195-6203; 및 U.S. 특허 5,650,150.
면역 글로불린은 일정 도메인 (일례로, CH1, CH2 및/또는 CH3 도메인)은, 자연적으로 발생하는 항체에서 가변 영역과 일반적으로 관련된 일정 영역일 수 있다. 이와 다르게는, 하나 이상의 면역 글로불린 일정 영역 도메인은, 가변 영역 도메인의 공급원으로 사용되는 항체와 다른 항체에서 유도될 수 있다. 달리 말하자면, 면역 글로불린 일정 및 가변 영역 도메인은, 일례로 상이한 종에서 유도된 항체와 같은 상이한 항체에서 유도될 수 있다. 미국 특허 4,816,567을 참고한다. 나아가, 면역 글로불린 가변 영역은 일례로 인간인 한 종에서 유도된 골격 영역 (FR)과, 일례로 마우스와 같은 상이한 종에서 유도되며 FR사이에 위치한 상보 결정 영역 (CDR)을 함유할 수 있다. 이와 같은 카이메라 면역 글로불린 가변 영역을 제조 및 사용하는 방법은 일례로 미국 특허 5,225,539 및 5,585,089에 공지인 것이다.
항체 기초 면역싸이토카인은 바람직하게는, 면역 글로불린 중쇄에 일례로 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합한 면역 글로불린 경쇄를 포함할 수 있다. 결합한 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 미리 선택된 항원에 대한 단독 및 완전한 결합 부위를 함께 제공한다. 다른 구현에서, 면역싸이토카인은 2 개의 카이메라쇄를 포함하며, 이는 각각 면역 글로불린 중쇄가 싸이토카인에 융합된 것의 일부를 포함한다. 두 개의 카이메라쇄는, 바람직하게는 일례로 하나 이상의 사슬 내 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다.
본 발명은, 항원 결합 활성 및 항체 활성이 싸이토카인의 잠정 생활성과 결합된 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 생체 내에서의 목표 세포로 싸이토카인을 선택적으로 전달하는 것에 사용되며, 이에 의해 목표 세포 부근에서 싸이토카인이 국소화된 생활성을 나타내게 한다. 바람직한 구현에서, 융합 단백질의 항체 성분은 암세포 상 또는 내부의 항원에 특이적으로 결합하여, 그 결과, 융합 단백질은 국소화된 항암 활성을 나타낸다. 이와 다른 바람직한 구현에서, 융합 단백질의 항체 성분은 HIV 감염 세포와 같은 바이러스 감염 세포에 특이 결합하여, 그 결과, 융합 단백질이 국소화된 항바이러스 활성을 나타내게 된다.
본 발명의 면역싸이토카인에 포함될 수 있는 싸이토카인은 일례로, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 칼러니 자극인자, 림포카인 및, 당분야에 알려진 기타를 포함한다. 바람직한 종양 괴사 인자는 일례로, 조직 괴사 인자 α (TNFα)를 포함한다. 바람직한 인터루킨은 일례로, 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4 (IL-4), 인터루킨-5 (IL-5), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-12 (IL-12), 인터루킨-15 (IL-15) 및 인터루킨-18 (IL-18)을 포함한다. 바람직한 칼러니 자극 인자는 일례로, 과립구-마크로파지 칼러니 자극 인자 (GM-CSF) 및 마크로파지 칼러니 자극 인자 (M-GSF)를 포함한다. 바람직한 림포카인은, 일례로 림포톡신 (LT)을 포함한다. 기타 유용한 싸이토카인은, 모두 면역 효과를 소지할 뿐 아니라, 이들의 항 바이러스 활성과 무관한 항 안지오제닉 효과를 가지는 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ를 포함하는 인터페론을 포함한다.
화학 치료제의 몇 타입이 효과적인 면역싸이토카인 흡수 증강제임이 밝혀졌다. 특히, 유용한 면역싸이토카인 흡수 증강제는 탁산 및 알킬화 화학 치료제를 포함한다. 여러 탁산이 당분야 공지이다 (Bissery 및 Lavelle, 1997, Cancer Therapeutics: Experimental and Clinical Agents, Chapter 8, B. Teieher, 편). 바람직한 구현에서, 탁산은 파클리탁셀로 또한 알려진 탁솔이다. 기타 구현은, 반합성 탁산으로, 몇 종양 모델 및 임상면에서 파클리탁셀보다 효과적인 도세탁셀 (docetaxel)을 포함한다. 추가의 구현으로는, 유럽 유 (yew) 나무에서 추출된 10-디아세틸 바카틴 III와 같은 천연 출발 물질에서 유도된 추가의 탁산 유도체를 포함한다. 일례로, 구강 가능 화합물인 IDN5109이 있으며, 이는 또한 P-당단백질에 대해 열악한 기질로서 복합 약물 저항 종양에 일반적으로 보다 활성을 가지는 것이다. 구강 생활성인 것에 추가하여, 이는 또한 제고된 약물 수용성을 가지며 신경 독성 부작용이 덜하다 (Polizzi 등, 1999, Cancer Res. 59: 1036-1040).
또한 제공되는 것은, 면역싸이토카인 흡수 증강제와 조합되어 투여되는 면역싸이토카인의 투여를 위한 바람직한 투여량 및 투여 계획이다.
도면의 설명
도 1은, 싸이토카인의 모식도이다.
도 2는, 시간에 걸친, LLC/KSA 종양 부피에 대한 파클리탁셀 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 3은, 평균 종양 부피에 대한 시간에 따른 파클리탁셀 및 면역싸이토카인의 다중 투여의 효과를 나타낸다.
도 4는, 폐 전이 어세이에서의 종양 중량에 대한 파클리탁셀 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 5는, CT26/KSA 종양 부피에 대한 면역싸이토카인 및 파클리탁셀의 시간에 따른 효과를 나타낸다.
도 6은, 간 전이 어세이에서의 종양 중량에 대한 파클리탁셀 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 7A 및 B는, 종양에 의한 면역싸이토카인의 흡수에 대한 파클리탁셀의 효과를 나타낸다.
도 8은, 종양에 의한 면역싸이토카인의 흡수에 대한 시클로포스파미드의 효과를 나타낸다.
도 9는, 폐 전이 어세이에서의 종양 중량에 대한 시클로포스파미드 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 9B는, 종양 성장 어세이에서의 종양 부피에 대한 시클로포스파미드 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 9C는, 종양 성장 어세이에서의 종양 부피에 대한 시클로포스파미드 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
도 10은, 종양 성장 어세이에서의 종양 부피에 대한 카보플라틴 및 면역싸이토카인의 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
연구에 의하면, 일반적으로 디세미네이션된 전이성 포시 (foci)에 비해 항체 매개 치료적 중재 및 면역 치료에 대해 고형 종양이 보다 저항적이다 (Sulitzeanu 등, (1993) Adv. Cancer Res. 60: 247-267). 항체 기초 치료에 대해 반응성이 낮은 것은, 일부분, 종양에 의해 생산되는 면역 억제 인자에 기인하는 것으로 보여진다.
종양 제거를 위한 기작이 완전 규명되지는 않았으나, 조직 독성의 T 림포사이트 (CTL) 반응이 암세포의 붕괴 및 면역 기억을 제공하는 것으로 생각된다. 나아가, 특정 환경 하에서는 천연 킬러 (NK) 세포가 CTL의 부재 하에서 종양 제거를 담당하는 것으로 여겨진다. 상이한 면역 반응은, 특정 종양이 상이한 타입 또는 T 세포를 다운 (down) 조절 가능한 물질의 상이한 량을 생산하는 사실에 기인한다. 이는, 특히 마이크로전이성 포시에 비해, 임계 질량을 달성하고 종양에 대해 면역 반응을 조절하기에 충분한 수준인 면역 억제 인자를 생산 분비 가능한 고형 종양에 있어서 사실이다.
미리 선택된 세포에 대항하는 면역싸이토카인에 의해 개시되는 조직 독성 면역 반응이, 면역싸이토카인 흡수 증강제와 면역싸이토카인을 함께 투여함에 의해 상당히 증강될 수 있음이 밝혀졌다. 조합 치료는, 발달된 종양과 같은 질환 조직의 면역성 파괴를 매개함에 특히 유용한 것이다. 이론에 국한되지 않고, 면역싸이토카인 흡수 증강제는 면역싸이토카인이 종양 미세 환경 내로의 침투를 제고시켜, 면역 억제 효과를 극복하고, 종양에 대한 세포 면역 반응을 활성화하는데 보다 효과적으로 여겨진다. 유사하게, 이러한 방법은 일례로 HIV 감염과 같이 유사한 면역 억제 기작이 효과적인 세포 면역성을 저하시키는 특정 바이러스 질환의 치료에 유용할 것이다. 면역싸이토카인 흡수 증강제는 면역싸이토카인과 공조하여 시너지로 작용함으로써, 발달된 종양 또는 바이러스성 감염된 세포의 면역성 붕괴를 매개한다. 본 발명은 또한, 유용한 면역싸이토카인의 제조 및 사용법, 또한, 적절한 면역싸이토카인 흡수 증강제와 조합하여 이들의 생체내 동물 모델에서 예비 임상으로 약학 동력 활성의 측정에 유용하다.
여기에서 사용된 "면역싸이토카인 흡수 증강제"라는 용어는, 미리 선택된 세포에 대항하여 면역싸이토카인에 의해 조직 독성 면역 반응을 증강하는 임의의 시약을 나타낸다. 보다 특별하게는, 바람직한 면역싸이토카인 흡수 증강제는 종양 흡수 증강제로서, 종양 내로 면역싸이토카인의 투과를 증가시키는 것이다. 면역싸이토카인 흡수 증강제의 예는, 탁산과 같은 화학 치료제, 알킬화 화학 치료제를 포함하는 DNA 손상제, 방사선 조사 치료제, 및 혈압 조절제를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 탁산은, 탁솔, 도세탁셀, 10-디아세틸 바카틴 III, 및 이들의 유도체이다. 바람직한 알킬화제는, 시클로포스파미드, 카보플라틴, 시스플라틴, 및 이들의 유도체이다. 바람직한 혈압 조절제는, 안지오텐신 II 자체와 같은 안지오텐신 II 아고니스트로서, Netti 등 (Cancer Research [1995] 55:5451-8) 및 Netti 등 (Proc. Nat. Acad. Sci. [1999] 96:3137-3142)에 의해 기재된 일반 원리에 따라 주기적으로 바람직하게 투여되는 것이다. 면역 반응은, 당업자에게 공지인 방법 및/또는 여기에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.
여기에 사용된 "조직 독성의 면역 반응"이라는 용어는, 그 성질이 체액성 또는 세포성인, 포유류에서의 임의의 면역 반응을 나타내며, 이는, 면역싸이토카인에 의해 자극됨으로써, 포유류에서의 미리 선택된 세포 타입의 생활성을 죽이거나 감소시키는 것이다. 면역 반응은, T 세포, NK세포 및 마크로파지를 포함하는 하나 이상의 세포 타입을 포함하는 것이다.
여기에서 사용된 "면역싸이토카인"이라는 용어는, (i) 세포 타입 특정 항원과 같은 미리 선택된 항원에 결합할 수 있고 결합 특성을 가지는 항체 결합 부위 및, (ii) 암 또는 바이러스성 감염 세포에 대해 조직 독성 면역 반응을 유도 또는 자극하는 싸이토카인의 융합을 의미한다. 이렇게 하여 선택된 항원은, 암세포 상 또는 바이러스 감염된 세포 상과 같은 세포 표본 항원을 포함하며, 세포 막에 부착되어 남아있는 일례로 괴사성 세포인 불용성 세포내 항원을 포함한다. 바람직한 항원은, 목표 항원으로서, 종양 특이 항원과 같은 종양 세포에 특이한 것이다. 따라서, 면역싸이토카인은 싸이토카인을 목표 (일반적으로 세포)에 선택적으로 생체 내에서 전달하며, 따라서 싸이토카인은 목표 세포에 대해 국소화된 면역반응을 매개한다. 일례로, 면역싸이토카인의 항체 성분이 고형 종양의 암세포, 특히 약 100mm3초과의 거대 종양 세포와 같은 암세포의 항원에 선택적으로 결합하면, 면역싸이토카인은 국소화된 항암 활성을 나타낸다.
이와 다르게는, HIV 감염 세포와 같은 바이러스 감염된 세포 상의 항원에 면역싸이토카인의 항체 성분이 선택적으로 결합하여 면역싸이토카인은 국소화된 항바이러스 활성을 나타낸다
여기에서 사용된 "항체 결합 부위"는, 세포 타입과 같은 미리 선택된 항원에 결합 가능한 일례로 면역 글로불린 가변 영역인 면역 글로불린 중쇄의 일부 이상을 의미한다. 항체 결합 부위는 또한, 일례로 CH1 도메인, CH2 도메인, 및 임의로 CH3 도메인 및, 최소한 CH2 도메인 또는 이들 부분의 하나 이상을 포함하는 면역 글로불린 가변 영역의 일부분 이상을 바람직하게 포함한다. 나아가, 면역 글로불린 중쇄는 공유성 또는 비공유성으로, 일례로 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 임의로 경쇄 일정 영역을 포함하는 면역 글로불린 경쇄와 연결된다. 따라서, 항체 결합 부위는, 미리 선택된 항원에 결합 가능한 완전한 항체 또는 이들의 단편 또는 단쇄 항체를 포함 가능한 것으로 여겨진다.
면역싸이토카인에 있어서, 항체 단편은, 당분야 공지의 각종 방법으로 싸이토카인에 연결 가능하다. 일례로, 항체 결합 부위는 융합 단백질 구축물 내에서 폴리펩타이드 결합 또는 링커를 통해 싸이토카인에 바람직하게 연결된다. 이와 다르게는, 항체 결합 부위는, 일례로 항체 결합 부위 및 싸이토카인 내의 아미노산 분지쇄에 존재하는 SH 기와 같은 반응성 기를 통해 싸이토카인에 결합되어진다.
여기에서 사용된 "싸이토카인" 이라는 용어는, 포유류에서 암세포 또는 바이러스 감염된 세포와 같은 미리 선택된 세포 타입에 대해 세포 파괴성 면역 반응을 자극 또는 유도 가능한, 임의의 단백질 또는 펩타이드, 이들의 유도체 기능성 단편을 의미한다. 따라서, 각종 싸이토카인인 본 발명의 면역싸이토카인에 혼입 가능할 것이다. 유용한 싸이토카인은 세포 파괴성 면역 반응을 자극 또는 유도하는 일례로, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터루킨 (IL), 림포사이트 (L), 칼러니 자극 인자 (CSF), 인터페론 (IFN)과, 이들의 종 변이체 및 단축된 유도체를 포함한다. 유용한 종양 괴사 인자는, 일례로, TNFα를 포함한다. 유용한 림포카인은, 일례로 LT를 포함한다. 유용한 칼러니 자극 인자는 일례로, GM-CSF 및 M-CSF를 포함한다. 유용한 인터루킨은, 일례로 IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 및 IL-18을 포함한다. 유용한 인터페론은, 일례로, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ를 포함한다.
목적하는 특정 싸이토카인을 코딩하는 유전자는, 가능한 공급원으로부터 수득하여 처음부터 (de novo) 클로닝되거나, 공지의 뉴클레오타이드 서열로부터 DNA 표준 합성에 의해 합성 가능하다. 일례로, LT의 DNA 서열 (일례로 Nedwin 등, (1985) Nucleic Acid Res. 13: 6361), IL-2 서열 (일례로 Taniguchi 등, (1983) Nature 302: 305-318), GM-CSF 서열 (일례로 Gasson 등, (1984) SCIENCE 266: 1339-1342), 및 TNF α 서열 (일례로 Nedwin 등, (1985) NUCLEIC ACIDS RES. 13:6361)은 공지이다.
바람직한 구현에서 면역싸이토카인은, 통상의 재조합 DNA 법에 의해 제조되는 재조합 융합 단백질이며, 일례로, 카이메라 면역싸이토카인을 코딩하는 핵산 구축물의 형성에 의한다. 재조합 항체- 싸이토카인 융합 단백질의 구축은, 선행 기술에 기재된 바 있다. 일례로, Gillies 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428-1432; Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203; 및 미국 특허 5,650,150를 참조한다. 바람직하게는, 본 발명의 면역싸이토카인을 코딩하는 유전자 구축물은, 5'에서 3' 방향으로 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 도메인 코딩 DNA 단편, 면역 글로불린 중쇄 일정 영역 도메인 코딩 DNA 단편, 및 싸이토카인 코딩 DNA를 포함한다.
융합 유전자는, 융합된 유전자가 발현되는 적절한 수용 세포 내에서 형질 전환을 위해 발현 벡터 내로 조합 또는 삽입된다. 하이브리드 폴리펩타이드 쇄는 바람직하게는 면역 글로불린 경쇄와 조합되어, 중쇄의 면역 글로불린 가변 영역 (VH) 및 경쇄의 면역 글로불린 가변 영역 (VL)이 결합하여, 미리 선택된 항원에 대해 단일 및 완전한 결합 부위를 제공하게된다. 바람직한 구현에서, 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄는 일례로 사슬간 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합된다. 나아가, 하나 또는 모두가 싸이토카인에 융합된 두 개의 면역 글로불린 중쇄는 일례로, 하나 이상의 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합 가능한 것이다.
따라서, WO99/29732, WO99/43713, WO99/52562, WO99/53958, 및 WO01/10912에공지된 면역싸이토카인 조성물 및 방법, 및 연결 영역에서 변형된 아미노산 서열을 가지는 항원-기재 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 방법은 종양 치료를 위한 치료법에서 사용되는 면역싸이토카인의 항종양 활성 제고에 유용하다. 한 구현에서, 본 발명의 방법은, Fc-인터페론-α와 같은 Fc 융합 단백질과의 조합 사용에 유용하다.
도 1은, 보기로서의 면역싸이토카인 1의 모식도이다. 이 구현에서, 싸이토카인 분자 2 및 4는 항체 중쇄 14 및 16의 CH3 영역의 10 및 12의 카르복시 말단 6 및 8에 펩타이드 연결된다. VL영역 26 및 28 은, 일반적인 IgG 구조인 VH영역 18 및 20에 결합되며, 따라서 면역싸이토카인 1 의 아미노 말단에 두 개의 항원 결합 부위 30 및 32를 제공하고, 2 개의 싸이토카인 수용체 결합 부위 40 및 42를 면역싸이토카인 1의 40 및 42에서 제공한다. 물론, 보다 큰 관점에서, 면역싸이토카인은 예시한대로 결합될 필요가 없으며, 2 개의 면역 글로불린 중쇄의 하나 이상만이 싸이토카인 분자에 융합되면 된다.
본 발명의 면역싸이토카인은, 이들 구조의 두 가지 면에서 카이메라성으로 볼 수 있다. 먼저, 항원 결합 특이성을 가진 면역 글로불린 중쇄가 주어진 싸이토카인에 결합된 면에 있어서 면역싸이토카인은 카이메라 성이다. 다음으로, 본 발명의 면역싸이토카인은, 결과의 단백질이 V/C 카이메라가 되도록 상이한 항체에서 모두 유도된 면역 글로불린 가변 영역 (V) 및 면역 글로불린 일정 영역 (C)를 포함한다는 면에서 카이메라 성이다. 일례로, 가변 및 일정 영역은, 상이한 종에서 분리되는 자연 발생 항체 분자에서 유도될 수 있다. 일례로, 미국 특허 4,816,567을 참조한다. 또한, 면역 글로불린 가변 영역의 하나 또는 모두가 골격 영역 (FR) 서열 및 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는 구축물을 포함하는 것이다.
이러한 구축물은, 일례로, Jones 등, (1986) Nature 321: 522-525, Verhoyen 등, (1988) SCIENCE 239: 1534-1535, 및 미국 특허 5,225,539 및 5,585,089에 기재되어 있다. 나아가, 가변 영역 서열은, 목적 친화도를 가지고 미리 선택된 항원에 결합하는 가변 영역 서열에 대해 라이브러리 스크리닝, 일례로 파지 디스플레이 라이브러리에 의해 유도된다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 및 사용법은 일례로, Huse 등 (1989, Science 246: 1275-1281) 및 Kang 등 (1991, PNAS, USA 88:11120-11123)에 공지이다.
면역싸이토카인의 면역 글로불린 중쇄 일정 영역 도메인은 IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε), IgG (Igγ), 및 IgM (Igμ)로 언급되는 5 개의 면역 글로불린 군의 어느 것으로부터도 선택 가능하다. 그러나, IgG 군에서 선택된 면역 글로불린 중쇄 일정 영역이 바람직하다. 나아가, IgG 항체 하부군에서 선택되는 임의의 면역 글로불린 중쇄는 당분야에서 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4일 수 있다. 공지된 바와 같이, 각 면역 글로불린 중쇄 일정 영역은 4 또는 5 개의 도메인을 소지한다. 도메인은 하기와 같이 연속적으로 명명된다: CH1-힌지-CH2-CH3-(-CH4). CH4는 IgM내에 존재하며, 인지 영역이 없다. 중쇄 도메인의 DNA 서열은 면역 글로불린 군 중에서 교차 상동성을 가지며, 일례로 IgG의 CH2 도메인은 IgA 및 IgD 의 CH2 도메인과 상동성이고, IgM 및 IgE 의 CH3 도메인과 상동성이다. 면역 글로불린 경쇄는 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 일정 영역 중 하나를 가진다. 이들 면역 글로불린 영역의 서열 및 서열 배치는 당분야 공지이다 (Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, 제 3 판, 1983, 제 4 판, 1987, 및 Huck 등, 1986, Nuc. Acids Res, 14, 1779-1789).
바람직한 구현에서, 가변 영역은 미리 선택된 세포 표면 항원 (암세포 또는 바이러스 감염된 질환 세포 관련 항원)에 대해 특이적인 항체로부터 유도되며, 일정 영역은 가변 영역의 원천이며, 항체와 동일 또는 상이한 항체 도메인의 CH1과 CH2 (임의로 CH3)를 포함한다. 본 발명의 시행에서, 면역싸이토카인의 항체 부분은 바람직하게는, 목적하는 수용자 내에서 비면역성 또는 약한 면역성이다. 따라서, 가능한 한 항체 부분은 목적하는 수용자와 동일한 종으로부터 바람직하게 유도된다. 일례로, 면역싸이토카인이 인간에게 투여될 때, 일정 영역 도메인은 바람직하게는 인간 기원이다. 일례로 미국 특허 4,816,567을 참조한다. 나아가, 목적하는 수용자와 상이한 종으로부터 면역 글로불린 가변 영역이 유도되는 경우, 일례로, 가변 영역 서열이 쥐 기원이고 목적하는 수용자는 인간인 경우, 가변 영역은 바람직하게는 인간 FR 서열과 쥐의 CDR 서열이 FR 서열 사이에 위치하여 카이메라 가변 영역이 미리 선택된 항원에는 결합 특이성을 가지나 목적 호스트에서는 면역 반응성을 최소화 하도록 한다. 이러한 카이메라 가변 영역의 디자인 및 합성은 공지이다 (Jones 등, 1986, Nature, 321: 522-525, Verhoyen 등,1988 Science, 239: 1534-1535 및 미국 특허 5,225,535 및 5,585,089). 인간화된 항체-싸이토카인 융합 단백질, KS-1/4 항-EpCAM 항체-IL-12 융합 단백질의 클로닝 및 발현 및 대장 육종 전이에 대한 이들의 근절 효과는 공지이다 (Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203).
싸이토카인을 코딩하는 유전자는, 직접 또는 링커를 통해 결합되는데, 일례로, 면역 글로불린 일정 영역 (일례로 CH2 또는 CH3 엑손)을 코딩하는 유전자의 3' 말단에 프레임 내의 (Gly4-Ser)3링커를 코딩하는 DNA 에 의한다. 어떤 구현에서는, 링커는, 단백질 분해 부위를 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함 가능하다. 이러한 부위는, 면역 글로불린 일정 영역 및 싸이토카인 사이에 존재하며, 목적 부위에서 싸이토카인의 단백질 분해를 제공하도록 디자인된다. 일례로, 프로테아제에 노출되는 부위의 라이신 및 아르기닌 뒤에서 플라스민 및 트립신이 분리됨은 공지이다. 기타 많은 부위 특이성 엔도프로테아제 및 절단되는 아미노산 서열이 당분야 공지이다. 바람직한 단백질 분해 부위 및 그러한 절단 부위와 반응하는 단백질 분해 효소는 공지이다 (미국 특허 5,541,087 및 5,726,044).
카이메라 면역 글로불린 쇄의 발현을 조절하기 위해, 핵산 구축물은, 가변 영역 코딩 유전자에 대한 내재 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있다. 일례로, 가변 영역 코딩 유전자는, 리더 펩타이드, 경쇄에 대한 VJ 유전자 (연결 (J) 단편에 가변 (V) 영역이 기능적으로 재배열된), 또는 중쇄에 대한 VDJ 유전자, 및 이들 유전자에 대한 내재 프로모터 및 인핸서를 포함하는 DNA 단편으로 수득 가능하다.이와 다르게는, 가변 영역을 코딩하는 유전자는, 내재 조절 성분과 분리 수득하여, 이들 성분을 제공하는 발현 벡터 내에서 사용 가능하다.
가변 영역 유전자는, 목적 항체를 생산하는 세포로부터 표준 DNA 클로닝 방법으로 수득 가능하다. 기능적으로 재배열된 특이 가변 영역에 대한 제놈 라이브러리 스크리닝은, J 영역 DNA 서열 및 하류 서열을 함유하는 DNA 단편과 같은 적절한 DNA 프로브를 이용하여 실시한다. 올바른 클론의 동정 및 확인은, 클론 유전자의 시퀀싱 및, 해당하는 완전 길이의 적절하게 잘라진 mRNA의 서열에 대한 서열 비교에 의한다.
목표 항원은, 암세포, 바이러스 감염 세포 또는 기타 질환 세포의 세포 표면 항원이다. 목적 항원은, 또한 괴사성 세포의 불용성 세포 내 항원일 수 있다 (일례로, 미국 특허 5,019,368). 면역 글로불린을 코딩하는 림포이드 세포주로부터 적절한 가변 영역을 코딩하는 유전자를 수득 가능하다. 일례로, 항원 또는 바이러스성 항원과 관련된 종양에 특이한 면역 글로불린을 생산하는 하이브리도마 세포주는, 당분야 공지의 표준 소마틱 세포 하이브리다이제이션 기술로 제조한다 (일례로, 미국 특허 4,196,265).
이들 면역 글로불린 생산 세포주는, 기능적으로 재배열된 가변 영역 유전자의 공급원을 제공한다. 가변 영역 유전자는 보통 쥐 기원인데, 이는 쥐 시스템이 목적 특이성을 가진 다양한 종류의 면역 글로불린을 제공하기 때문이다. 나아가, 가변 영역 서열은 일례로 파지 디스플레이 라이브러리와 같은 라이브러리를, 목적 친화성을 가지는 미리 선택된 항원에 결합하는 다양한 가변 영역에 대해 스크리닝 함으로써 얻는다. 파지 디스플레이 라이브러리의 제조와 스크리닝 법은, 공지이다 (일례로, Huse 등, (1989) Science 246: 1275-1281 및 Kang 등, (1991) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 88: 11120-11123).
기능적으로 활성인 가변 영역 유전자를 코딩하는 DNA 단편은 목적 일정 영역 (또는 그 부분)을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편에 연결된다. 면역 글로불린 일정 영역 (중쇄 및 경쇄)은, 표준 유전자 클로닝 법에 의해 항체 생산 세포로부터 수득한다. 인간 경쇄의 2개 군 (λ, κ) 및 인간 중쇄의 5개 군 (α, δ, ε, γ, μ)이 클로닝되었으며, 따라서 인간 기원의 일정 영역은 이들 클론으로부터 얻을 수 있다.
하이브리드 면역 글로불린 중쇄를 코딩하는 융합 유전자는 수용자 세포 내에 혼입시키기 위해 발현 벡터 내로 삽입되거나 어셈블된다. 플라스미드 벡터 내로 유전자를 도입하는 것은 표준 유전자 스플라이싱 법에 의해 가능하다. 카이메라 면역 글로불린 중쇄는, 해당 면역 글로불린 경쇄와 함께 동일한 세포 내에서 동시 발현 가능하며, 따라서 완전한 면역 글로불린이 발현되어 동시에 어셈블된다. 이를 위해, 중쇄 및 경쇄 구축물은 동일 또는 별개의 벡터 내에 놓여진다.
수용자 세포는 일반적으로 림포이드 세포이다. 바람직한 림포이드 세포는 미엘로마 (또는 하이브리도마)이다. 미엘로마는, 합성, 어셈블, 및 트랜스펙션된 유전자에 의해 코딩되는 면역 글로불린을 분비할 수 있다. 특히 바람직한 수용자 또는 호스트 세포는, 내지 면역 글로불린을 일반적으로 생산하지 않는 Sp2/0 미엘로마 및 마우스 미엘로마 NS/0 세포를 포함한다. 트랜스펙션 시, 세포는, 트랜스펙션된 유전자 구축물에 의해 코딩되는 면역 글로불린만을 생산한다. 트랜스펙션된 미엘로마는, 배지 또는, 어사이트 액으로부터 면역싸이토카인을 회수 가능한 마우스의 복막에서 배양한다. B 림포사이트와 같은 기타 림포이드 세포도 수용자 세포로 사용된다.
카이메라 면역 글로불린 쇄를 코딩하는 핵산 구축물을 함유하는 벡터로 림포이드 세포를 트랜스펙션하는 각종 방법이 있다. 일례로, 벡터를 스피로블라스트 융합에 의해 림포이드 세포로 도입한다 (일례로, Gillies 등, (1989) BIOTECHNOL. 7: 798-804). 기타 유용한 방법은, 전기 천공, 인산칼슘 침전이 있다 (일례로, Sambrook 등, 편집 (1989) "Molecular Cloning: Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press).
면역싸이토카인을 제조하는 기타 유용한 방법은 구축물을 코딩하는 RNA 서열을 제조하여, 생체 내 또는 생체외 시스템에서 이를 발현시키는 것이다. 항체-싸이토카인 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 합성, 호스트 세포로 유전자를 도입, 호스트 내에서 유전자의 발현, 및 결과의 융합 단백질을 수득하는 재조합 DNA 법은, 당분야 공지로서 널리 이용되어 있다. 특정 프로토콜은 일례로 하기를 참조한다: Sambrook 등, 편찬 (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press.
화학적으로 연결된 면역싸이토카인은 당업자에게 공지인 각종 방법으로 생산 가능하다. 일례로, 항체 또는 항체 단편은, 항체 또는 항체 단편과 싸이토카인 내의 반응성 아미노산 쇄를 이용하여 싸이토카인에 화학적으로 연결된다. 아미노산 분지쇄는, 일례로 다이설파이드 결합에 의해 공유 결합되거나, 일례로 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석시네이트 에스테르, 및, 1,4-디-[3'(2'-피리딜티오)프로피온아미도]부탄 (이들 모두는 Pierce, Rocldord, IL로부터 시판)을 포함하는 호모 또는 헤테로 이작용기 교차연결 시약에 의해 공유 결합된다.
본 발명의 방법에 따르면, 면역싸이토카인과 면역싸이토카인 흡수 증강제의 조합은, 면역 시스템의 증강된 자극에 유용하며, 따라서, 일례로 종양 또는 기타 질환 세포와 같은 목적 세포 타입 부위에서의 조직 독성 반응을 도모한다. 면역싸이토카인과 면역싸이토카인 흡수 증강제의 조합은, 면역싸이토카인 단독으로는 비-조직 독성이므로, 생체 외에서는 조합 또는 시너지의 항암 효과가 없는 것으로 기대된다.
특정 이론에 국한되지 않고, 생체내의 효과적인 조합 치료는, (1) 제고된 화학 치료 조직 독성 (종양 세포에서 면역싸이토카인이 화학 치료적인 면역싸이토카인 흡수 증강제의 흡수를 증강시키는 경우); 및/또는 (2) 제고된 면역 자극 (면역싸이토카인 흡수 증강제가 어떤 방법으로 종양으로의 면역싸이토카인의 흡수를 증가시키는 경우)의 하나 또는 모두를 수반하는 나머지의 작용에 의한 제제의 증강된 흡수를 포함한다. 기작 (1)의 경우, 국소적인 정맥 리크 (leak)를 유도하는 항체-IL2 면역 컨쥬게이트를 과량 투약하는 선 처리에 의해 종양으로의 방사성 표지된 항체 (및, 아마도 작은 분자 약물)의 흡수를 증가시킬 수 있음이 보고되었다 (일례로, Hornick 등, 1999, CLIN CANCER RES 5:51-60). 이러한 특정 기작이 면역싸이토카인 및 면역싸이토카인 흡수 증강제의 조합 치료에서 작용한다면, 종양 소지 동물을 면역싸이토카인으로 먼저 치료하는 것이 필요하다. 그러나, 면역싸이토카인 치료 전의 면역싸이토카인 흡수 증강제 단일 투여가 항암 활성에 시너지 효과를 가져온다면, 그러한 기작은 작용하지 않을 것이다. 따라서, 보다 적절한 설명은, 면역싸이토카인 흡수 증강제가 면역싸이토카인의 흡수를 기작 (2)에 의해 증가시키는 것이다. 이러한 가설은 면역싸이토카인 흡수 증강제를 동시에 투여하면 방사성 표지화된 면역싸이토카인이 고형 종양으로 흡수되는 것을 증가시킴을 증명함에 의해 입증된다.
본 발명의 방법에 따르면, 조합 치료는 면역싸이토카인 흡수 증강제로 작용하는 화학 치료제의 조직 독성 효과를 면역싸이토카인의 투여가 증가시키는 장점을 가진다. 따라서, 화학 치료제의 소량만을 환자에게 투약 가능하다. 따라서, 종종 화학 치료제의 치료에 수반되는 환자의 면역 시스템 일부의 저하를 감소시킨다. 한 구현에서, 화학 치료 면역싸이토카인 흡수 증강제의 단일 투여량을 면역싸이토카인이 투여되기 전에 환자에게 투약한다. 화학 치료 면역싸이토카인 흡수 증강제는 면역싸이토카인 전에, 바람직하게는 약 4 일 내지 약 4 시간 전, 가장 바람직하게는 약 24-48 시간 전에 투여한다. 본 발명의 다른 구현에서, 화학 치료 면역싸이토카인 흡수 증강제의 여러 투여량을 면역싸이토카인 전에 환자에게 투여한다. 본 발명의 또 다른 구현에서, 화학 치료 면역싸이토카인 흡수 증강제는 면역싸이토카인 전, 동시, 및/또는 후에 투여한다.
파클리탁셀은 화학 치료 면역싸이토카인 흡수 증강제의 예로써, 환자 면역시스템의 양태를 억제 또는 변형 가능하다. 파클리탁셀의 면역 잠재화 효과 대부분이 마크로파지/단구 세포에 의해 매개되나, 많은 림포사이트 기능 연구에 따르면, 이들 하부군에 있어서 파클리탁셀의 부정적 효과가 보고되었다. 일례로, 파클리탁셀 치료는 정상 및 종양 소지 마우스에서 증식 능력을 심하게 손상하고 (Mullins 등, 1998, IMMUNOPHARMACOL IMMUNOTOXICOL 20:473-492), NK 세포 및 IL-2를 함유한 세포 배양에서의 림포카인 활성화된 조직 독성의 생성을 모두 방해하는 것으로 알려졌다 (Chuang 등, 1993, GYNECOL ONCOL 49:291-298). 실제로, 실재 증거는, 세포의 림포사이트 하부군이 면역싸이토카인의 항암 활성에서의 필수 효과 군인 것을 나타낸다 (Lode 등, 1998, PHARMACOL THER 80:277-292). 본 발명에 포함된 실험 결과는 선행 기술에서 예견되지 못한 여러 신규 사항, 특히 약물 투여 순서에 관한 것을 밝혀내었다.
탁산은 면역싸이토카인과 동시에 투여, 또는 상이한 투여 경로를 통해 별개로 투여 가능하다. 본 발명의 조성물은, 특별 분자에 적절한 임의의 경로에 의해 투여 가능하다. 따라서, 적절하면, 투여는 구강 또는 정맥내 및 복강내 투여 경로인 비경구일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 적절한 수단에 의해 동물에게 직접 (일례로, 국소적으로 주사, 이식, 조직 부분에 국소 투여), 또는 전신적으로 (비경구성 또는 구강)으로 투여 가능하다. 조성물을 정맥내, 피하, 안과적, 복강내, 근육내, 협측, 항문, 바지날, 오비탈내, 뇌내, 두개골내, 척수내, 벤트리큘라내, 초내 (intrathecal), 조내 (intracisternal), 비강내와 같은 비경구, 또는 에어로졸 투여에 의해 제공하는 경우, 조성물은, 액체 서스펜션 또는 용액에 적합한 수성 또는 생리적인 부분을 바람직하게 함유한다. 따라서, 캐리어 또는 담체 (vehicle)에 생리학적으로 수용되어, 목적하는 조성물을 환자에게 전달하는 이외에 환자의 전해질 및/또는 부피 밸런스에 악영향을 미치지 않도록 한다. 제제를 위한 액체 매질은 따라서 정상 생리 식염수 (즉, 9.85% 수성 NaCl, 0.15M, pH 7-7.4)를 포함하는 것이다. 많은 탁산에 있어 제제는 보다 복잡한데, 이는 일반적으로 이들의 용해도가 부정적이기 때문이다. 일례로, 파클리탁셀의 표준 제제는 10% Cremophor, 10% 에탄올, 및 80% 식염수 (0.9% NaCl)이며, 도세탁셀에 대한 제제는 1:1의 에탄올:폴피소르베이트 80의 비율로써, 이는 투여 전에 5% 글루코스 용액으로 1: 10으로 희석된다 (Bissery and Lavelle, 1999). 그러나, 탁산 및 신규 합성된 유도체를 포함하는 제제는 당업자에 의해 인지 및/또는 용이하게 개발될 것이다.
투여당 바람직한 면역싸이토카인 투여량은, 0.1 mg/m2- 100 mg/m2, 보다 바람직하게는 1 mg/m2- 20 mg/m2및 가장 바람직하게는 2 mg/m2- 6 mg/m2범위이다. 면역싸이토카인 흡수 증강제의 바람직한 투여량은 일반적으로 사용되는 면역싸이토카인 흡수 증강제의 타입에 의존하나, 적절한 투여량은 일반 실험에 의해 결정 가능하다. 싸이토카인 및/또는 면역싸이토카인 흡수 증강제의 투여는, 주기적인 볼루스 주사 또는 연속적인 정맥내 또는 외부 저장액을 사용하는 복강 내 투여 (일례로, 정맥내 백으로부터) 또는 내부 (일례로, 생분해성 이식물로부터)이다.나아가, 본 발명의 면역싸이토카인은 상이한 복수의 면역싸이토카인 흡수 증강제와 함께 목적 수용자에게 또한 투여 가능하다. 그러나, 면역싸이토카인 흡수 증강제 및 면역싸이토카인의 적절한 조합, 투여 모드, 투여량은, 당업자에게 공지인 일반 실험에 의해 결정 가능하다.
항체-싸이토카인 융합 단백질 및 면역싸이토카인 흡수 증강제를 사용한 면역 반응에 대한 조합 치료의 효과 측정을 위해, 각종 방법이 사용 가능하다. 일례로, 하기의 실시예에 기재된 동물 모델 또는 기타 적절한 동물 모델은 당업자에게 의해 이용되어 면역싸이토카인 흡수 증강제 또는 면역싸이토카인 흡수 증강제의 조합 중 어느 것이 면역싸이토카인 (일례로, 항체-IL2 융합 단백질)과 함께 발달한 종양을 면역 파괴하는데 시너지적으로 가장 효과적인지를 테스트할 수 있다.
면역싸이토카인 흡수 증강제, 또는 면역싸이토카인 흡수 증강제의 조합은 면역싸이토카인 치료 과정 이전 또는 동시에 투여 가능하며, 종양에 대한 효과는 부피 측정에 의해 쉽게 측정할 수 있다. 또한, 신규한 면역싸이토카인 흡수 증강제가 확인됨에 따라, 당업자는 여기에 기재된 방법을 이용하여 항체-싸이토카인 융합 단백질의 항암 활성을 증강 또는 변형시키는데 이들 신규 화합물을 사용 가능하다.
이와 다르게는, 치료 이후 종양을 절개하고, 분리하여 표준 조직법 또는 특수 면역-조직 시약으로 염색하여, 면역 반응에 대한 조합 치료의 효과를 검증한다. 일례로, 헤마톡솔린 및 에오신을 이용한 간단한 염색에 의해 고형 종양 내로의 림포사이트 침투의 상이점을 검증할 수 있으며, 이는 세포 면역 반응의 지표가 된다.나아가, 면역 세포의 특수 군에 대한 항체로 부분을 면역 염색하면, 유도된 반응의 성질을 알 수 있다. 일례로, CD45 (일반적 루코사이트 마커), CD4 및 CD8 (T 세포 하부군 동정을 위한), 및 NK1.1 (NK 세포 마커)에 결합하는 항체는 본 발명의 면역싸이토카인에 의해 매개된 면역 반응의 타입 측정에 사용된다.
이와 다르게는, 면역싸이토카인에 의해 매개되는 면역 반응은 일례로 하기에 기재된 통상의 세포 일부 고갈 연구에 의해 측정 가능하다; Lode 등, (1998) Blood 91: 1706-1715. 항체 고갈의 예는, T 세포 마커 CD4 및 CD8과의 반응 및, NK 마커 NK1.1에 결합하는 것, 및 아시알로 GM을 포함한다. 간략하게, 상당한 고 투여량 (일례로 약 0.5mg/마우스의 투여량)으로 항체-싸이토카인 치료 전에 포유류에게 이들 항체를 투여하고, 실험 종결 시까지 매주 간격으로 공급한다. 이러한 방법은, 포유류에서 관측된 면역 반응의 유도에 필요한 세포 타입 확인을 가능하게 하는 것이다.
다른 방법에서, 조합 치료로 처리된 동물에서 분리된 스플레노사이트의 조직 독성 활성을, 기타 처리 그룹의 그것과 비교한다. 스플레노사이트 배양은, 일반적 면역학 실험책에 기재된 표준 법으로 수득하여 소독한 비장을 기계적으로 다져서 얻는다 (일례로 Coligan 등, 편찬 (1988) "Current Protocols in Immunology," John Wiley and Sons, Inc). 결과의 세포를 혈청, 항생제 및 저농도의 IL-2 (~10 U/mL)을 함유한 적절한 세포 배양액 (일례로 DMEM, GIBCO)에서 배양한다. 일례로, NK 활성을 비교하기 위해서는 3 일간의 배양이 보통 적절하고, T 세포 조직 독성 활성을 비교하기 위해서는 5 일간의 배양이 보통 적절하다.조직 독성 활성은 30 분간51Cr을 이용하여 목적 종양 세포 (일례로 LLC 세포)를 방사성 활성 표지화함으로써 측정한다. 과량의 방사성 표지를 제거한 후, 배양한 비장 세포의 다양한 농도와 4 시간 혼합한다. 혼합 종결시에, 세포에서 분리된51Cr을, γ계수기로 측정하여, 면역 세포에 의한 세포 용해의 양을 칭량한다. 일반적 조직 독성 T 림포사이트 (또는 CTL)활성을 이 방식으로 측정한다.
본 발명을 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시한다.
실시예 1. 동물 모델
면역싸이토카인 및 탁산이 종양에 대항하여 효과적인 조직 독성 반응을 매개하는 조합 효과를 연구하기 위해 쥐 암 모델을 개발하였다. 하기 실시예에 사용된 면역싸이토카인은 표피 유도된 종양의 대부분에서 발견되는 인간 종양 항원 EpCAM 이다 (Perez 및 Walker (1989) J. Immunol. 142: 3662-3667). 면역컴피턴트 쥐 모델의 효용을 측정하기 위해, 마우스 호스트와 시너지한 인간 항원을 마우스 종양 세포 상에 발현시킬 필요가 있다. 루이스 폐 육종(LLC) 세포는, 공지의 마우스 폐암 세포주로서, 본 목적을 위해 처음 선택된 세포주이다. 이 세포주는 면역 시스템의 억제제를 과량으로 생산하며, 국소화된 면역 억제를 유도하는 종양 미세환경 내에서의 면역 세포로부터의 IL-10 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Sharma 등, 1999, J. Immunol. 163:5020-5028). 인간 종양 항원 EpCAM (KSA로 또한 알려진)을 LLC 세포 표면에 발현시켜, 마우스 항-EpCAM 항체,KS-1/4로부터 유도된 면역싸이토카인과 생체내에서 목표화 되도록 하였다. 이를 위해, EpCAM cDNA 서열을 문헌에 기재된 재조합 레트로바이러스 벡터 (Gillies, 미국 특허 출원 09/293,042)와 트랜스듀싱시켜, LLC/KSA로 표시되는 세포주를 수득하였다. 이들 세포를 10% 가열 비활성화된 태아 소 혈청, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 Geneticin (GIBCO)이 보충된 DMEM에서 37℃ 및 7.0% CO2에서 유지한다.
상이한 조직 기원을 가지는 추가의 육종 발현 세포주를 유사한 방법으로 조작한다. 비면역성 쥐 유선 육종 세포주 4T1는 Dr. Paul Sondel (Univ. of Wisconsin)로부터 얻었다. 이 세포주는 피하 이식후 서서히 성장 및 진행하여 일차 종양의 외과적 제거 전에서도 많은 기관으로 자발적으로 전이화한다. 정맥 내 주사에 의해 폐 내에서의 실험적 전이를 또한 유도 가능하다. 쥐 대장 육종 세포주인 CT26는, N-니트로소-N-메틸유레탄을 BALB/C 마우스 (Dr. I.J. Fidler 공급, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX)에 렉탈 내로 주사함에 의해 유도된다. 4T1 및 CT26 세포를, 기재된 대로 Ep-CAM으로 트랜스펙션 시켰다 (Gillies 등, 1998, J IMMUNOL 160:6195-6203). 4T1/KSA 세포를 10% 가열 비활성화된 태아 소 혈청, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 Geneticin (GIBCO)이 보충된 RPMI에서 37℃ 및 7.0% CO2에서 유지한다. CT26/4SA 세포를 10% 가열 비활성화된 태아 소 혈청, L-글루타민, 비타민, 소듐 파이루베이트, 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신 및 Geneticin (GIBCO, Gaithersberg, MD)이 보충된DMEM에서 37℃ 및 7.0% CO2에서 유지한다. Geneticin은, KSA 발현을 유지하기 위해 트랜스펙션된 세포 내에 가한 것이다. 트랜스펙션된 세포주 모두, 그들 세포 표면에 인간 EpCAM 분자 (잠재적 외래 항원)의 발현함에도 불구하고 피부 종양 (피하 주사 이후) 또는 전이 (정맥내 주사 이후)에 따라 서서히 진행하여 마우스를 사멸시켰다.
종양 성장 연구를 위해, LLC/KSA 또는 CT26/KSA 종양을 마우스 등에 피하 이식하였다. LLC/KSA 연구를 위해, 100㎕ PBS 내의 1 x 106세포의 단일 세포 현탁액으로 주사된 수 개의 스탁 종양으로부터 종양을 트랜스플랜트하였다. 약 2 주후, 종양을 방부적으로 수합하여, 150μm 스크린이 부착된 시브를 통해 거른다. 세포를 주사기 및 23게이지 바늘 토우를 통해 3회 통과시켜, 2회 세척하고, PBS에 현탁하였다. 100㎕ PBS 내의 1 x 106LLC/KSA 세포를, 마우스 등에 30½ 게이지 니들을 사용하여 피하 주사한다.
CT26/KSA 연구를 위해서는, 배양 내에서 기하 급수적으로 성장하는 100㎕ PBS 내의 1 x 106의 단일 세포 현탁액을 주사하였다. 종양이 발달한 후, 이식 후 약 2 주 후에, Day 0부터 투약을 실시하였다. 주 당 2회 칼리퍼를 사용하여 종양을 측정하였다. 종양 부피는 하기 식을 이용하여 계산하였다:
부피 = ½ x 4/3 π (L/2 x W/2 x H)
(식 중, L = 종양의 길이, W = 폭, 및 H = 높이).
동물을 칭량하였고, 연구 과정 중 일반적 건강을 모니터링한다. 종양이 괴사성이거나 동물이 사멸하게 되면, 이산화탄소 질식으로 동물을 치사시킨다.
데이터를 그래픽 형태로 나타내었다. 그래프는, 투여 전 또는 이후에서의 개개 종양 부피를 나타낸다 (+/- SEM). 데이터를 또한, 담체 처리한 마우스에 대해 처리한 마우스의 평균 종양 부피의 백분율로 나타낸다. Student's t test를 개개 종양 부피에 대해 실시하여 유의차를 검증하였다.
실험적 간 전이 연구를 위해, 80 mg/kg 케타민 HCl (Fort Dodge Animal Health, Port Dodge, IA) 및 5 mg/kg 자일라진 (xylazine; Bayer, Shawnee Mission, KS)으로 마취하였다. 25 mM HEPES를 함유한 100㎕ DMEM (GIBCO) 내의 1 x 106CT26/KSA 세포를, 비장 캡슐 밑으로 27½ 게이지 니들을 이용하여 Day 0에서 60 초의 간격으로 주사하였다. 코터리 유닛 (Roboz, Rockville, MD)으로 2 분 후 비장 베슬을 소작 (燒灼)하여, 비장을 제거하였다. 오토클립을 이용하여 동물을 봉합한다. 주사 후 3 주후에 동물을 희생시키고, 이들의 간을 제거하여 칭량하였다. 간을 Bouin's solution (Sigma, St. Louis MO)을 이용하여 고정 및 염색하였다.
데이터를 그래픽 형태로 나타내었다. 그래프는, 희생 시에서의 평균 종양 무게를 나타낸다 (+/- SEM). 종양 무게는, 실험 간에서 정상간의 무게를 뺀것으로 계산한다. 담체 처리한 마우스에 대한 처리한 마우스의 평균 종양 무게의 조절 퍼센트로 데이터를 또한 표시하였다. Student's t test를 개개 종양 무게에 대해 실시하여 유의차를 검증하였다.
실험적 폐 전이 연구를 위해, 100㎕ PBS 내의 2.5 x 105T1/KSA 세포를, 수평 꼬리 정맥을 통해 27½ 게이지 니들을 이용하여 Day 0에서 서서히 주사하였다. 주사후 3 주 후에 동물을 희생시키고, 이들의 폐를 제거하여 칭량하였다. 폐를 Bouin's solution (Sigma)을 이용하여 고정 및 염색하였다. 데이터를 그래픽 형태로 나타내었다. 그래프는, 희생 시에서의 평균 종양 무게를 나타낸다 (+/- SEM). 종양 무게는 실험 폐에서 정상 폐의 무게를 감한 것으로부터 계산한다. 담체 처리한 마우스에 대한 처리한 마우스의 평균 종양 무게의 조절 퍼센트로 데이터를 또한 표시하였다. Student's t test를 개개 종양 무게에 대해 실시하여 유의차를 검증하였다.
실시예 2: 항체-융합 단백질 (면역싸이토카인)의 제조
하기 실시예에서 수 개의 항체-융합 단백질을 설명한다.
huKS-huγl-huIL2 (KS-IL2로 약칭)
huKS-huγl-huIL2 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203 및 미국 특허 5,650,150에 모두 기재된 바와 같이 제조 발현하였다. 간단하게, 마우스 KS1/4 항체 (Varki 등, (1984) Cancer Res. 44:681-687)의 인간화 가변 영역을, 각 KS1/4 가변 영역의 CDR을 높은 상동성을 가진 인간 가변 영역의 컨센서스 골격 서열에 삽입하는 것을 포함하는 Jones 등, (1986) Nature 321: 522-525 에 기재된 방법에 의해 모델링 하였다. BioSym 소프트웨어가 장착된 Silicon Graphics Indigo 워크 스테이션에 의해 CDR의 형태가 유지됨을 확인하였다. 단백질을 역방향 트랜슬레이션하고, 중첩 올리고뉴클레오타이드의 결찰에 의해 유전자를 구축한다.
결과의 가변 영역을, 양쇄의 발현을 위해 메탈로티오네인 프로모터 및 면역 글로불린 중쇄가 CMV 프로모터/인핸서에 의해 대체된 것을 제외하고는, Gillies 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428-1432에 본질적으로 기재된 인간 κ경쇄 및 인간 Cγ1 중쇄의 일정 영역을 함유하는 발현 벡터 내에 삽입한다. 인간 중쇄의 카르복시 말단에 대한 IL-2 성숙 서열의 융합은, Gillies 등, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1428-1432에 본질적으로 기재된 바에 의해 제조하며, 단 IL-2 유전자의 3' 비번역 영역은 SV40 폴리 (A) 영역에서 유도되어진 것이다.
IL-2 융합 단백질을, 0.1 μM 메토트릭세이트 (MTX)를 함유하는 선택 배양액으로 NS/0 미엘로마 세포에 결과의 플라스미드를 트랜스펙션시켜 발현하였다. 간단하게, 안정하게 트랙스펙션된 클론을 얻기 위해, 플라스미드 DNA를 전기 천공에 의해 마우스 미엘로마 NS/0 세포에 도입하였다. 10% 태아 소 혈청이 보강된 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 세포를 성장시켰다. 약 5 x106세포를PBS로 1 회 세척하고, 0.5ml PBS 내에 재현탁한다. 선형화된 플라스미드 DNA 10 마이크로그램을 세포와 함께 Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극 간격, BioRad)에서 얼음상에서 10 분간 보관한다. 전기 천공은 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA)를 이용하며, 0.25 V 및 500 μF에서 실시한다. 10분 동안 얼음에서 세포를 회복시켜, 성장 배양액에 재현탁하고, 두 개의 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 안정하게 트랜스펙션된 세포를, 트랜스펙션 후 2 일 후에 도입한 100nM 메토트릭세이트 존재 하에서 선택한다. 세포에게 3일마다 3회 이상 영양 공급하면 MTX 저항 클론이 2 내지 3 주에 발생하였다.
적절한 항체 (일례로 Gillies 등, (1989) Biotechnol. 7: 798-804)를 사용하여 Fc 또는 싸이토카인 ELISA에 의해 발현 클론을 확인한다. 수득한 융합 단백질을 제조업자의 설명에 따라 단백질 A Sepharose (Pharmacia)로 결합 용출시켜 정제하였다.
huKS-huγ4-huIL2
huKS-huγ4-huIL2 융합 단백질을 코딩하는 유전자를, U.S.S.N. 09/256,156, (2. 24, 1999 출원, 60/075,887, 2. 25, 1998 출원의 우선권 주장)에 본질적으로 기재된 것에 따라 구축 및 발현시켰다.
간단하게, 상기에서 기재한 huKS-huγ1-huIL2 융합 단백질의 Igγ4 버전을, huKS-huγ1-huIL2 발현 벡터의 면역 글로불린 일정 영역 Cγ1 유전자 단편을 제거하고, 이를 인간 Cγ4 유전자의 해당 서열로 대체함으로써 제조하였다. 인간중쇄 일정 영역 Cγ1, Cγ2, Cγ3, 및 Cγ4 의 서열 및 서열 배열은, 공지이다 (Huek 등, (1986) Nuc. Acids Res. 14: 1779-1789).
Cγ1 및 Cγ4 단편의 스와핑은, 원래 Cγ1 함유 플라스미드 DNA를 Hind III 및 Xho I로 소화시켜, 아가로스 젤 전기영동에 의해 거대한 7.8kb 단편을 정제하여 실시하였다. Cγ4 유전자를 함유하는 제 2 플라스미드 DNA를 HindIII 및 NsiI으로 소화시켜 1.75kb 단편을 수득하였다. 인간 Cγ1 유전자의 카르복시 말단에 융합된 인간 IL-2 cDNA 및 SV40 폴리A 부위를 가지는 제 3의 플라스미드를 XhoI 및 NsiI으로 소화시켜 작은 470bp 단편을 정제하였다. 이들 세 단편 모두를 거의 동량의 몰로 함께 결찰시켰다. 결찰물로 컴피턴트 이콜라이를 형질전환하여, 앰피실린 함유 플레이트에서 성장에 의해 선택하였다. 바르게 어셈블된 재조합 플라스미드를, 분리된 형질전환체의 플라스미드 DNA물의 제한 분석에 의해 확인하고, FspI의 소화에 의해 Cγ1 (FspI 없음) 및 Cγ4 (한 부위) 유전자 삽입물을 구별하였다.
Cγ4-IL2 중쇄 대체를 함유한 최종 벡터를, 전기 천공 (0.25 V 및 500 μF)에 의해 마우스 미엘로마 세포에 도입하고, 트랜스펙턴트를, 메토트릭세이트 0.1마이크로 몰을 함유한 배양에서의 성장에 의해 선별한다. huKS-huγ4-huIL2 융합 단백질을 높게 발현하는 세포 클론을 확인하여, 확장시켜, 단백질 A Sepharose 크로마토그래피로 배양 상층액으로부터 분리한다. SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동으로 Cγ4 융합 단백질의 순도 및 완전성을 확인하였다. T-세포 증식 어세이로 IL-2 활성을 측정하였고 (Gillis 등, (1978) J. Immunol. 120: 2027-2032),γl 구축물의 그것과 동일함을 발견하였다.
huKS-muγ2a-muIL2
huKS-muγ2a-muIL2 융합 단백질을 코딩하는 유전자를, 상기의 인간 항체 일정 영역 및 huKS-huγl-huIL2 융합 단백질의 인간 IL-2를 해당 마우스 서열로 대체함으로써 구축하였다. 구체적으로, 인간 Cγl-IL2 DNA를, 쥐 IL-2를 코딩하는 DNA에 결합된 쥐 Cγ2a cDNA로 대체하였다. 간단하게, huKS 의 VH영역을, 하기의 중첩 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 중첩 PCR에 의해 쥐 γ2a cDNA에 프레임 내로 결합하였다:
(센스) 5' CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC(SEQ ID NO: 3);
(안티센스) 5'GG GGC TGT TGT TTT GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA CG (SEQ ID NO: 4);
(센스) 5' C TTA AGCCAG ATC CAG TTG GTG CAG(SEQ ID NO: 5); 및
(안티센스) 5' CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C (SEQ ID NO: 6).
SEQ ID NOS: 3 및 4의 올리고뉴클레오타이드는, huKS의 VH도메인 및 쥐 γ2a cDNA (이탤릭)의 일정 영역의 연결부위에 하이브리다이즈 되도록 디자인하였다. PCR 제 1 라운드에서는 2개의 독립 반응이 있었다. 한 반응에서는 huKS DNA의 VH가 SEQ ID NOS: 4 및 5의 올리고뉴클레오타이드와 함께 템플레이트로사용된다. 프라이머 SEQ ID NO: 5는, huKS VH의 성숙 아미노말단를 코딩하는 서열 (굵은 글자)의 상류에 AflII (CTTAAG) 제한 부위를 도입한다. 다른 반응에서, 쥐의 γ2a cDNA를, SEQ ID NOS: 3 및 6 올리고뉴클레오타이드와 함께 템플레이트로 사용하였다. 프라이머 SEQ ID NO: 6는, γ2a C 말단 부근 영역을 코딩하는 cDNA에 하이브리다이즈되었고, muIL2 cDNA의 연속 결찰을 위해, XmaI (CCCGGG) 제한 부위에 결합되었다. 이들 두 반응의 PCR 생성물을 혼합하여, SEQ ID NOS: 5 및 6의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 2 라운드의 PCR을 돌린다. 수득한 PCR 생성물을 클로닝하여, 서열 확인 후, huKS의 VH와 쥐 γ2a 일정 영역을 코딩하는 AflII-XmaI 단편을, XmaI 부위에서 muIL2 cDNA와 AflII 부위에서 시그날 펩타이드를 코딩하는 DNA의 결찰에 이용한다.
하기의 SEQ ID NOS: 7 및 8에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 단핵성 쥐 말초 혈액 단핵 세포의 mRNA로부터 쥐 IL2 cDNA를 클로닝한다:
(센스) 5' GGC CCG GGT AAAGCA CCC ACT TCA AGC TCC(SEQ ID NO. 7); 및
(안티센스) 5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEQ ID NO. 8).
XmaI 제한 부위 (CCCGGG)에서 muγ2a 에 결합되도록 프라이머 SEQ ID NO: 7 는 muIL2 (굵은 서열)을 포함한다. 프라이머 SEQ ID NO: 8은, 번역된 종결 코돈 (굵은 안티센스)바로 뒤에 XhoI 제한 부위 (CTCGAG)를 도입한다.
유사하게, 중첩 PCR에 의해 huKS의 가변 경 (VL) 도메인을 mu κcDNA 서열에 결합하였다. 사용한 중첩 올리고뉴클레오타이드는 하기를 포함한다:
(센스) 5' 6 GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G(SEQ ID NO. 9);
(안티센스) 5'GC AGC ATC AGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC (SEQ ID NO. 10);
(센스) 5' C TTA AGCGAG ATC GTG CTG ACC CAG(SEQ ID NO. 11); 및
(안티센스) 5' CTC GAGCTAACA CTC ATT CCT GTT GAA GC (SEQ ID NO. 12).
올리고뉴클레오타이드는, huKS의 VL및 쥐 κ cDNA (이탤릭)의 일정 영역의 연결부위에 하이브리다이즈 되도록 디자인하였다. PCR 제 1 라운드에서는 2개의 독립 반응이 있었다. 한 반응에서는 huKS DNA의 VL가 SEQ ID NOS: 10 및 11의 올리고뉴클레오타이드와 함께 템플레이트로 사용되어, huKS VL의 성숙 아미노말단를 코딩하는 서열 (굵은 글자)의 상류에 AflII (CTTAAG) 제한 부위를 도입한다. 다른 반응에서, 쥐의 κcDNA를, SEQ ID NOS: 9 및 12 올리고뉴클레오타이드와 함께 템플레이트로 사용하여, 번역 종결 코돈 (굵은 안티센스) 뒤에 XhoI 제한 부위를 도입하였다.
이들 두 반응의 PCR 생성물을 혼합하여, SEQ ID NOS: 11 및 12의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 2 라운드의 PCR을 돌린다. 수득한 PCR 생성물을 클로닝하여, 서열 확인 후, huKS의 VL와 쥐 κ 일정 영역을 코딩하는 AflII-XhoI 단편을, AflII 부위에서 시그날 펩타이드를 코딩하는 DNA에 결찰시켰다.
쥐 중쇄 및 경쇄 모두로 인간 서열 pdHL7을 대체시켰다. dhfr 선택성 마커 유전자를 함유하는 결과의 항체 발현 벡터를, 쥐 NS/0 미엘로마 세포 내로 전기천공시켜 (6.25 V, 500 μF), 0.1마이크로몰 메토트릭세이트를 함유하는 배양에서 배양하여 선택하였다. 메토트릭세이트에 내성인 트랜스펙션 클론을, 표준 ELISA 법에 의한 항체 결정물의 분지에 의해 측정하였다. 융합 단백질을 단백질 A Sepharose 크로마토그래피로 제조업자 지시에 따라 정제하였다.
huKS-muγ2a-muIL12
huKS-huγ2a-huIL12 융합 단백질을 코딩하는 유전자를, U.S.S.N. 08/986,997 (12.8 1997 출원) 및 Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203 에 본질적으로 기재된 것에 따라 구축 및 발현시켰다. 간단하게, 상기에서 기재한 huKS-muγ2a 중쇄 코딩 영역에 p35 IL-12 서브 유닛 cDNA를 융합시킴으로써 실시하였다. 결과의 벡터를, p40 IL-12로 미리 트랜스펙션되고, 이를 발현 가능한 NS/0 미엘로마 세포 내로 트랜스펙션시킨다. 달리 말하면, p40 단독으로 트랜스펙션된 세포 및 안정한 고발현 세포를 선택하여, p35 함유 융합 단백질에 의한 트랜스펙션의 수용자로 사용하였다 (일례로 연속 트랜스펙션).
Concanavalin A (배양액 중 5 마이크로그램/ml, 3 일간)으로 활성화된 비장 세포에서 제조된 mRNA로부터 PCR 에 의해 쥐 p35 및 p40 IL-12 서브유닛을 분리한다. p35 코딩 핵산 분리에 사용되며, XmaI-XhoI 제한 단편으로서의 p35 cDNA에 또한 적용된 PCR 프라이머는 하기를 포함한다:
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEQ ID NO: 13); 및
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEQ ID NO: 14).
p40 코딩 핵산 서열 분리에 사용된 PCR 프라이머는 하기를 포함한다:
5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEQ ID NO: 15); 및
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEQ ID NO: 16).
dhfr 선택성 마커 유전자, 마우스 IL-12의 p35 서브유닛에 융합된 쥐 중쇄 코딩 전사 유닛, 및 인간화 KS 항체 경쇄 코딩 전사 유닛을 함유하는 플라스미드 벡터 (pdHL7-huKS-muγ2a-p35)를 문헌 (Gillies 등, (1998) J. Immunol. Methods 125: 191)에 따라 구축하였다. 융합은, 적용된 p35 서브유닛 cDNA의 XmaI 내지 XhoI 단편을, 미리 제조된 쥐 γ2a 유전자의 CH3 엑손 말단의 dhfr XmaI 부위에 결합함으로써 실시하였다. H 및 L 쇄 전사 단위 모두 사이코메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (원 문헌에서 메탈로티오나인 프로모터 대신)를 5' 말단에 함유하며, 3' 말단에 폴리아데닐화 부위를 함유한다.
유사한 벡터 (pNC-p40)를, 선택성 마커 유전자 (항 네오마이신 유전자)를 함유한 자유 p40 서브유닛의 발현에 이용하며, 전사를 위해서는 CMV 프로모터를 여전히 사용한다. 이 경우의 코딩 영역은, 융합 단백질과의 어셈블리 및 ER로의 적절한 전달을 위해 p40 서브유닛의 천연 리더 서열을 함유한다. 세포 내로 플라스미드 pNC-p40를 전기 천공시켜, 약물 내성 클론의 배양 상층액을 ELISA로 측정하여 p40 서브유닛의 생성을 측정한다.
pdHL7-huKS-muγ2a-p35 발현 벡터를, 문헌에 따라 쥐 p40를 미리 발현하는 NS/0 세포주에 전기 천공시켰다 (Gillies 등, (1998) J. Immunol. 160: 6195-6203). 메토트릭세이트 내성 트랜스펙션 클론을, 표준 ELISA 법에 의해 항체결정물 및 마우스 IL-12의 분비로 측정하였다. 수득한 단백질을 제조업자의 설명에 따라 단백질 A Sepharose 컬럼으로 결합 용출시켜 정제하였다.
실시예 3. 조합 치료의 생체외 조직 독성 활성
동물 모델에서 사용되도록 조작된 세포 주 (실시예 1)를, 인간 IL-2에 H 쇄의 C 말단이 융합된 KS-1/4 항체의 인간화 형태를 함유하는 면역싸이토카인에 기초한 IL-2 (huKS-huγ1-huIL2, 이하, KS-IL2로 약칭)의 존재 또는 부재하에서, 배양액 중 이들의 탁산 유도성 조직 독성에 대한 민감도를 측정하였다. 100세포/웰로 플랫바텀 플레이트에 세포를 가하고, 24시간 동안 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 200ng/ml 내지 3.125ng/ml인 2배 희석의 파클리탁셀을, 세포 배양 플레이트에 두 세트로 가하고, 6 일간 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 테트라졸리움 염의 세포 전환에 기초한 세포 생활성을 측정하는 MTS 발색 어세이 (Promega)를 96웰 플레이트 상에서 직접 실시한다. 플레이트를 읽고 기록한 후, Crystal violet (Sigma St. Louis, MO)로 부착된 세포를 염색한다. 표 형태로 결과를 나타내었다. IC50는, 50% 조절 수준에서 조직 독성을 나타내는 약물 농도이다.
CT26/KSA, LLCIKSA 및 4T1/KSA 세포에 대해, 파클리탁셀 단독 (3-200ng/ml), 및 KS-IL2 또는 IL-2 (33.3 ng/ml, KS-IL2 내의 IL-2와 동일)과 조합된 것 (200ng/ml)을 이용하여 조직 독성 어세이를 실시하였다. 세 가지 테스트된 세포주에서는 KS-IL2 또는 IL-2 단독의 조직 독성이 없거나 미약하였다 (81% 내지101%의 조절, 표 1). KS-IL2 또는 IL-2 첨가는, 파클리탁셀의 조직 독성을 변화시키지 못하였다. 따라서, KS-IL2 또는 IL-2 가 파클리탁셀의 조직 독성을 변화시키지 못하므로, 조합 치료에서의 항암활성 증가 모두는, 종양 소지 동물에서만 발생하는 기타 기작 때문일 것이다.
표 1. KS-IL2 또는 IL-2 와 조합한, 파클리탁셀의 조직 독성
파클리탁셀 IC 50 (ng/ml)
CT26/KSA a LLC/KSA b 4T1/KSA b
탁솔 27 6 16
탁솔 + IL-2 (33 ng/ml) 30 8 20
탁솔 + KS-IL2 (200 ng/ml) 26 5 19
조절 %
CT26/KSA a LLC/KSA b 4T1/KSA b
IL-2 (33 ng/ml) 97 100 95
KS-IL2 (200 ng/ml) 90 10181
a. 3 실험의 평균
b. 2 실험의 평균
실시예 4. KS-IL2 및 탁산과의 LLC 피부 종양 조합 치료
단일 투여의 파클리탁셀 (80 mg/kg)과 이에 따른 일주일 후의 KS-IL2 (20 μg) 꼬리 정맥 내 주사 투여에 의해 5 일간, 빠르게 성장하는 LLC/KSA 종양을 이용하여, 종양 성장 억제 어세이를 실시하였다. 파클리탁셀 또는 KS-IL2 단독 (Days 0-4) 투여의 효과는 관측되지 않았다. 그러나, 파클리탁셀 이후 1 주일에 KS-IL2 투여시, 평균 종양 부피의 상당한 감소 (41%의 조절) 및 약 8 일의 종양 성장 지연 (TGD)가 관측되었고, 이는 파클리탁셀 단독에 비해 현저하게 상이한 것이다 (p = 0.023). 파클리탁셀 처리한 그룹에서 <5% 의 체중 감소가 있었던 것을 제외하고는 약물 관련 총 독성은 관측되지 않았다.
다음, 보다 효과적 화학 치료로 일반적으로 간주되는 파클리탁셀의 다중 투여 효과를, 어떻게 치료가 증강에 영향을 끼치는지 측정하기 위해, 파클리탁셀의 단일 투여와 KS-IL2 와의 조합과 비교한다. KS-IL2 (20 μg, Days 0-4) 단독은, LLC/KSA 종양 성장에는 역시 효과가 없었으나, 파클리탁셀 단독을 다중 투여시 (50 mg/kg, 매 격일로), 63%의 조절로 평균 종양 부피를 감소시키고, 4 일의 종양 성장 지연 (TGD)을 초래하였다 (도 3). KS-IL2 면역싸이토카인을 파클리탁셀 처리 일주일 후에 투여시, 27%의 조절로 평균 종양 부피를 감소시키고, 10 일의 종양 성장 지연을 초래한 바, 이는 파클리탁셀 단독과 비교하여 현저하게 상이하다 (p = 0.016). 파클리탁셀 처리한 그룹에서 <5% 의 체중 감소가 있었던 것을 제외하고는 약물 관련 총 독성은 관측되지 않았다. 조합 치료그룹의 체중 감소는 더 작았다. 이러한 양성 조합 치료 결과는, 림포사이트의 증식과 조직 독성을 자극하는 활성에 기초한 치료의 개시 및 화학 치료 (및 잠정적으로 면역 저해) 치료 간의 간격이 상대적으로 짧았음을 고려할 때, 놀라운 것이다.
조합 효과에 대한 한 설명은, 탁산 유도된 성장 종양 덩이 부분의 에이팝토시스가 간극 압력을 감소시켜, 따라서 종양으로의 효과적 KS-IL2의 흡수를 제고시키는 것이다. 최근의 연구는 (Griffon-Etienne 등, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782), 24 시간 내지 48 시간 동안 최대 효과로 간극액 압력을 파클리탁셀 단일 투여가 낮추는 것으로 보고되었다 (Griffon-Etienne 등, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782). 비록 종양 내로의 면역싸이토카인의 흡수를 위해 이것이 가장 좋은 시기이라 하더라도, 화학 치료 후에는 너무 짧은 시간이다. 그럼에도 불구하고, LLC/KSA 종양을 가진 마우스를, 파클리탁셀 단일 투여 이후 24 시간만에 5일 연속으로 KS-IL2 로 처리하였다. 결과에 의하면, 대장 육종 CT26 및 상기 종양 주를 파클리탁셀 단일 투여로 처리시보다 1 주 전에 면역싸이토카인 치료를 개시할 때, 조합 효과가 더 개선된다 (하기 참조).
실시예 5. KS-IL2 및 탁산의 4T1 전이 조합 치료
탁산 및 면역싸이토카인의 투여간 처리 간격이 기대보다 짧음을 발견하여, 면역싸이토카인과 탁산을 동일자에 투여하는 조합 치료를 실시하고, KS-IL2 처리 (투여 당 15 마이크로그램 X 파클리탁셀 후 4 시간에 공급, 3 일간)와 동시에 주어진 세분된 투약 (25mg/kg X 3 일)으로 파클리탁셀을 단일 투여량 (75mg/kg)과 비교하였다. 본 실험을 위해, 4T1/KSA 유방 육종에서 유도된 실험상의 폐 전이 모델을 사용하였다. 약물의 투여량은, 이들 자체로 최적 이하가 되도록 선택하여, 임의의 잠재적 중독 또는 시너지 효과를 측정할 수 있도록 하였다.
단독으로 투여한 각 시약 모두 유사한 정도로 평균 폐 중량을 감소시켰다 (p < 0.02): 파클리탁셀 단독 투여에서는 43% 감소, 파클리탁셀 다중 투여에서는 49% 감소, 및 KS-IL2 단독 투여에서는 39% 감소 (도 4). 파클리탁셀과 KS-IL2의 조합은, 폐 전이를 추가로 약간 감소시키나 상호 부가적이지는 않았다: KS-IL2와 조합된 파클리탁셀 단독 투여에서는 58% 감소, KS-IL2와 조합된 파클리탁셀 다중 투여에서는 68% 감소. 시너지가 관측되지는 않았으나, KS-IL2와 조합된 파클리탁셀 단독 투여는, 파클리탁셀 단독에 비해 현저한 차이를 보인다 (p = 0.047).
모든 군에 있어서 체중 감소는 10 % 미만이며, 최대 체중 감소는 격일로 3회 파클리탁셀 5 mg/kg을 투여한 경우이다. 이들 결과를 통해, 조합 치료의 최대 효과 면에서의 이러한 4T1 폐 전이 어세이의 최적 치료는, 파클리탁셀 단독 투여 이후 KS-IL2의 조합 치료로써, 이는 LLC/KSA 종양 성장 억제 모델과 동일하다. 이 경우의 투약 간격은 4 일에 불과하여, 이들 결과는 효과적 종양 흡수에는 적절하지 못할 수 있다.
실시예 6. KS-IL2 및 탁산의 CT26 피부 종양 조합 치료
실시예 5의 결과는 두 시약 투여 사이 4 시간 간격이 너무 짧음을 시사한다.KS-IL2 투여시에 동물에 남아 있는 파클리탁셀의 수준이, 림포사이트의 활성을 직접 방해하여, 조합 세팅에서의 잠재적 항암 활성을 감소시킬 것이다. 또한, 4시간 점에서, 종양 간극 액에 대한 최대 효과에 도달 할 수 없었다. 따라서, 다른 실험을 고안했는데, 여기서는 CT26/KSA 대장 육종의 성장한 피부 종양을 이용하여, 탁산 투여 이후 24 시간에 파클리탁셀 단일 투여 (75 mg/kg)와 5일간의 KS-IL2을 조합하였다. 파클리탁셀 단독으로는 종양 성장에 무영향이다 (도 5). KS-IL2의 최적 이하 투여 (10 마이크로그램, Days 1-5)는, 71% 조절된 종양 부피를 나타내었다. 8% 조절에 이르는 현격하며 시너지한 종양 감소 효과는, 파클리탁셀과 KS-IL2를 조합 처리한 경우 관측되고, 이는 파클리탁셀 처리 단독과 비교하여 현저하게 상이하다 (p < 0.001). 파클리탁셀 처리한 양 군에 있어 ~5%의 미미한 체중 감소가 관측되었다.
CT26/KSA 모델을 이용하여, 제 2 실험을 실시하되, 성장한 간 전이에 대한 조합 효과를 측정하며, 파클리탁셀 투여와 KS-IL2 처리간의 24 간격을 재 이용한다. 조합 치료에서의 파클리탁셀의 투여 반응을 또한 비교하였다. 전이 유도 5 일 이후 마우스에 25, 50, 75 mg/kg의 파클리탁셀을 단독, 또는 1 일 이후 5 일 동안 KS-IL2 (7ug)과 함께 주사하였다. 25, 50, 75 mg/kg의 파클리탁셀의 단독에 대해 각각 49%, 23%, 10%조절된 종양 무게인 투여 반응이 관측되었다 (도 6). 파클리탁셀을 KS-IL2와 조합하는 것은, 파클리탁셀의 동일한 각 투여량에 대해 12%, 9% 및 6% 조절로 폐 전이를 감소시켰다. KS-IL2와 조합한 최저 투여량의 파클리탁셀 (25mg/kg)은, KS-IL2와 파클리탁셀의 보다 많은 양에 비해 종양무게에서 최대 및 가장 유의한 (p<0.001) 감소를 나타내었다. 따라서, 파클리탁셀을 선행시킨 KS-IL2의 조합은, 각 시약 단독에 비해 항진된 항암 효과를 나타낸다. 나아가, KS-IL2와 조합한 최저 투여량의 파클리탁셀은, 파클리탁셀 단독의 최고 투여량에 비해 유사한 항암 효과를 나타내었다. 따라서, KS-IL2와 조합하여 저 투여량의 파클리탁셀을 사용하는 것은 독성을 감소하며 양호한 효능을 유지시킨다.
실시예 7. 종양내 KS-IL2의 흡수 측정
면역싸이토카인 치료 이전의 조직 독성 약물 단일 투여 효과가 종양 간극액 압력 및 종양의 침투를 증가시킨다면, 이는 일례로 KS-IL2인 방사능 표지화된 면역싸이토카인을 이용하여 측정하여야만 한다. 표준 법 (참조)에 의해, 상용 업자 (New England Nuclear, Billerica, MA)와의 계약에 따른125I로 KS-IL2를 표지화하였다. 피부 종양 CT26/KSA을 실시예 1에 기재한 바와 같이 피하 이식하여, 100-200mm3이 되도록 성장시킨다. 4 마리 마우스의 두 개 군을 담체 내 파클리탁셀 (50 mg/kg) 또는 담체 단독으로 주사하고, 1 시간 (실험 1) 또는 24 시간 (실험 2) 후, 10마이크로그램의125I-KS-IL2 (95 μCi)를 가한다. 방사성 표지화한 면역싸이토카인 주사 6 시간 후, 마우스를 희생하여, 이들의 종양을 외과적으로 제거한다. 대조군으로, 동물의 간을 또한 수집하여 모든 조직을 칭량하고 γ 카운터로 계수하였다. 조직 중량에서 총 CPM에 의해 나눈 조직 그램 당 분 당 카운트(CPM)로 결과를 나타낸다.
표지화된 KS-1L2를 파클리탁셀 이후 한시간에서 주사 시 (도 7A), 약물 처리한 동물에서 절제된 종양으로부터 소량의 방사능만이 증가하였다. 반면, 표지화된 KS-1L2를 파클리탁셀 이후 24시간에서 주사 시, 담체 대조군과 비교하여 엄청난 흡수 증가가 관측되었다 (> 200 퍼센트) (도 7B). 1 시간과 24 시간 시점에서의 종양 흡수에서의 이러한 심대한 차이는 간극 압력에서 탁산 유도된 변화의 결과와 일치하며 (Griffon-Etienne 등, 1999, CANCER RES. 59:3776-3782), 파클리탁셀 이후 24 시간에서 개시되는 치료가 초기 시간 (4 시간)에서 실시되는 것보다 유용함을 나타내는 본 종양 모델의 결과와 일치하는 것이다.
다른 종류의 약물이 표지화된 면역싸이토카인의 고형 종양으로서의 흡수를 제고시키는 여부를 또한 측정하였다. 이 경우, 실험 전 24 시간 또는 3일 전에, 단일 투여량의 시크로포스파미드 (40 mg/kg)를 마우스에게 주사하였다.125I 표지화된 KS-IL2을 PBS로 선처리한 대조군 마우스를 포함하는 모든 마우스에 주사하고, 절개된 종양 내 방사능을 16 시간 이후 측정하였다. 결과는 (도 8), 시클로포스파미드 선처리가, 24 시간 전에 선처리한 마우스에서 48% 증가 및, 3 일간 선처리한 마우스에서 70%의 KS-IL2 흡수 증가를 나타내었다.
실시예 8. huKS-huγ4-IL2 및 탁산의 조합 치료
면역싸이토카인의 새 형태가 Fc 수용체에 대한 친화도 감소에 의한 개선된효능 및 순환 반감기를 증가시키는 것으로 보고되었다 (Gillies 등, 1999, CANCER RES. 59:2159-2166). 이들 개선된 IL-2 면역싸이토카인인 huKS-huγ4-IL2를, 파클리탁셀의 단일 투여의 조합에서 측정하였다. CT26/KSA 피부 종양을 소지한 마우스에서, 약물을 연속 투여 시, 효능의 개선이 다시금 관측되었다.
실시예 9. huKS-muγ2a-muIL12 및 탁산의 조합 치료
IL-2 기초 면역싸이토카인에 대해서만 특이적으로 시너지 치료 효과가 있는 것인가를 검증하기 위해, 성장한 CT26/KSA 벌키 종양을 파클리탁셀 (단일 투여량 75 mg/kg)으로 먼저 처리하고, 이어서 24 시간 후, 5 일 코스로 huKS-muγ2a-muIL12 (매일 당, 5 마이크로그램)으로 처리한다. 이러한 면역싸이토카인은 HuKS 항체의 쥐 형태 (일정 영역은 쥐 C 카파 및 C 감마 2a로 복구됨)와 쥐 IL-12 간의 융합을 나타낸다. IL-2와는 달리 IL-12 싸이토카인은 종에 대해 매우 특이적이며, 종양 성장에 대해 매우 약한 효과를 가지므로 IL-12를 사용하는 것이 필요하다. 결과에 따르면, 파클리탁셀 단독으로는 종양 성장에 매우 미미한 효과를 가진다. huKS-muγ2a-muIL12를 최적 투여량 미만으로 투여시 항암 효과를 가지며, 이는 파클리탁셀의 단일 투여량으로 먼저 처리시 마우스에서 그 효과가 증가하였다.
실시예 10. huKS-IL2 및 알킬화제의 조합 치료
1) huKS-IL2와 알킬화제 군의 화학 치료제인 시클로포스파미드의 개선된 치료 효과를 또한 개시하였다. 면역 컴피턴트한 마우스에 4T1 유방 육종 세포를 정맥 내 주사하여, 처리 3 일 전에 폐 전이가 일어나도록 하였다. 시클로포스파미드 (15, 40, 또는 80 mg/kg)의 단일 투여 3 일 후, 마우스에게 5 일 코스의 huKS-IL2 (15 ug/day)를 투여하였다. 최저 투여량 두 개만으로도 폐 전이 종양 무게를 어느 정도 감소시키나, huKS-IL2와의 조합이, 시클로포스파미드 단독에 비해 종양 무게에서 더 큰 감소를 초래하였다 (p < 0.05, 도 9). 그러나, 높은 투여량에서는 (80 mg/kg) 시너지가 없었다.
2) huKS-IL2와 시클로포스파미드의 개선된 치료 효과를, 성장한 유방 육종 피하 종양을 소지한 면역 컴피턴트한 마우스에서 종양 성장 어세이로 또한 개시하였다. 마우스에게 시클로포스파미드 (80 mg/kg)의 단일 투여를 단독 또는 시클로포스파미드 투여 3 일 후, 하루 5회 투여의 huKS-IL2 (30 마이크로그램)와의 조합으로 투여하였다. huKS-IL2 및 80 mg/kg 시클로포스파미드 단독에 대한 평균 종양 부피가 각각 31%, 69%로 감소하였다 (도 9B). 조합 치료는, Day 25에서 평균 종양 부피를 100% 감소시켰으며, 이는 huKS-IL2 단독 또는 시클로포스파미드 단독과 비교하여 매우 상이하였고 (p < 0.05), 초기 치료 12 주 후에는 8 마리 중 6 마리의 마우스에서 종양이 제거되었다. 동물은 이들 치료를 잘 견디었고, 전체 군에서 10% 미만의 체중 감소가 있었다.
3) huKS-IL2와 시클로포스파미드의 개선된 치료 효과를, 성장한 폐 육종 피하 종양을 소지한 면역 컴피턴트한 마우스에서 종양 성장 어세이로 또한 개시하였다. 마우스에게 시클로포스파미드 (80 mg/kg)의 단일 투여를 단독 또는 시클로포스파미드 투여 3 일 후, 하루 5회 투여의 huKS- IL2 (20 마이크로그램)와의 조합으로 투여하였다. huKS-IL2 및 80 mg/kg 시클로포스파미드 단독에 대한 평균 종양 부피는, 각각 2% 및 27% 감소하였다 (도 9C). 조합 치료는 평균 종양 부피를 Day 20에서 48% 감소시켰고, 이는 huKS-IL2 단독 또는 시클로포스파미드단독에 비해 매우 상이한 것이다 (p < 0.05). 동물은 이들 치료를 잘 견디었고, 전체 군에서 10% 미만의 체중 감소가 있었다.
실시예 11. huKS-IL2와 알킬화제의 조합 치료
huKS-IL2와 알킬화제 군의 다른 화학 치료제인 카보플라틴의 개선된 치료 효과를 개시하였다. 비소 (非小)성 세포 폐 육종 피하 종양 (LLC/KSA)을 소지한 마우스에게 Day 0에서 카보플라틴 (75 mg/kg)을 투여하고 3 일 후, 하루 5회 투여의 huKS-IL2 (매일 20 마이크로그램)를 투여하였다. huKS-IL2 및 카보플라틴 단독은 각각 종양 성장을 약하게 감소시켰으나, 조합 치료에 의해서만이 평균 종양 부피가 Day 30에서 현저히 감소하였다 (p < 0.05, 도 10). 또한, 카보플라틴 처리 단독에 비해 조합으로 처리한 마우스에서 종양의 성장이 매우 상이하였다 (p < 0.05).
본 발명은, 발명의 정신 및 필수 구성에 벗어나지 않고도 기타 특정 형태로 구현 가능하다. 상기의 구현은 따라서 여기에 기재된 본 발명의 예시일 뿐 어느 면에서도 이를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 범위는, 따라서, 상기 기재보다는 부가된 청구항에 의해 지시되며, 청구항의 균등 의미 및 범위내의 모든변화는 여기에 포함되는 것이다.
상기에 개시한 특허 문서 및 과학 출판물 각각은 여기에 참고로 편입되었다.

Claims (27)

  1. 포유류 종양에 대해 세포 파괴성 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 포유류에게 하기를 투여하는 단계를 포함하는 방법:
    (i) 항체 결합 부위를 포함하는 면역싸이토카인; 및,
    (ii) 면역싸이토카인에 의해 유도되는 면역 반응을 증강하는 면역싸이토카인 흡수 증강제.
  2. 제 1 항에 있어서, 항체 결합 부위가 암세포에 결합하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 항체가 종양 특이성 항원에 결합하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 면역싸이토카인 흡수 증강제를 면역싸이토카인과 함께 투여하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 면역싸이토카인 흡수 증강제를 면역싸이토카인 투여 이전에 투여하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 항체 결합 부위가 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로, 면역 글로불린 가변 영역, CH1 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 항체 결합 부위가 CH2 도메인의 카르복시 말단에 결합된 CH3 도메인을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 면역싸이토카인이 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 하기를 포함하는 융합 단백질인 방법:
    (i) 미리 선택된 세포 타입 상의 세포 표면 항원에 결합 가능한 면역 글로불린 가변 영역, 면역 글로불린 CH1 도메인, 면역 글로불린 CH2 도메인을 포함하는 항체 결합 부위, 및
    (ii) 싸이토카인.
  9. 제 8 항에 있어서, 항체 결합 부위가 CH2 도메인과 싸이토카인 사이에 존재하는 CH3 도메인을 추가로 함유하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 면역싸이토카인의 싸이토카인이, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 칼러니 자극 인자, 및 림포카인으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 면역싸이토카인 흡수 증강제가 탁산인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 탁산이, 탁솔, 도세탁솔, 10-디아세틸 바카틴III, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 면역싸이토카인 흡수 증강제가 알킬화 화학 치료제인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 알킬화 화학 치료제가 시클로포스파미드, 카보플라틴, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 2 개 이상의 상이한 면역싸이토카인 흡수 증강제를 상기 포유류에 투여하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 2 개 이상의 상이한 면역싸이토카인을 상기 포유류에 투여하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 면역싸이토카인에 앞서 약 24 시간 전에 상기 면역싸이토카인 흡수 증강제를 투여하는 방법.
  18. 포유류 종양에 대해 면역 반응을 유도하는 조성물로서 하기를 함유하는 조성물:
    (i) 항체 결합 부위를 함유하는 면역싸이토카인과 싸이토카인; 및
    (ii) 면역싸이토카인 흡수 증강제.
  19. 제 18 항에 있어서, 항체 결합 부위가 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로, 면역 글로불린 가변 영역, CH1 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 항체 결합 부위가 CH2 도메인의 카르복시 말단에 결합된 CH3 도메인을 추가로 포함하는 조성물.
  21. 제 18 항에 있어서, 면역싸이토카인이 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 하기를 포함하는 융합 단백질인 조성물:
    (i) 미리 선택된 세포 타입 상의 세포 표면 항원에 결합 가능한 면역 글로불린 가변 영역, 면역 글로불린 CH1 도메인, 면역 글로불린 CH2 도메인을 포함하는 항체 결합 부위, 및
    (ii) 싸이토카인.
  22. 제 21 항에 있어서, 항체 결합 부위가 CH2 도메인과 싸이토카인 사이에 존재하는 CH3 도메인을 추가로 함유하는 조성물.
  23. 제 18 항에 있어서, 면역싸이토카인의 싸이토카인이, 종양 괴사 인자, 인터루킨, 칼러니 자극 인자, 및 림포카인으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  24. 제 18 항에 있어서, 면역싸이토카인 흡수 증강제가 탁산인 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 탁산이, 탁솔, 도세탁솔, 10-디아세틸 바카틴 III, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
  26. 제 18 항에 있어서, 상기 면역싸이토카인 흡수 증강제가 알킬화 화학 치료제인 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 알킬화 화학 치료제가 시클로포스파미드, 카보플라틴, 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 조성물.
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