PT1209232E

PT1209232E - Regulação da ramificação das plantas.

Info

Publication number: PT1209232E
Application number: PT00953493T
Authority: PT
Inventors: Mineo Kojima; Takuji Sasaki; Masayuki Nozue; Hidenari Shioiri
Original assignee: Mineo Kojima; Kumiai Chemical Industry Co
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2007-08-28
Also published as: KR20020029104A; EP1209232B1; JP4567933B2; WO2001014559A1; BR0013337A; AU6595400A; KR100765292B1; CA2382290C; CN100540665C; ATE366817T1; DE60035509D1; CN1375005A; EP1209232A1; EP1209232A4; NZ517583A; DE60035509T2; AU780310B2; CA2382290A1; US6995302B1

Description

DESCRIÇÃO "REGULAÇÃO DA RAMIFICAÇÃO DAS PLANTAS"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para regular a ramificação das plantas e a uma planta transgénica obtida pelo referido método.

Antecedentes da Invenção A promoção da ramificação em plantas ornamentais ou em plantas agrícolas é preferida porque o valor das plantas ornamentais e o rendimento das plantas agrícolas pode ser aumentado. Deste modo, tem sido desejada uma técnica para regular a ramificação em várias plantas. 0 gene tbl de milho é conhecido como um gene regulador da ramificação (J. Doebley et al., "Nature" 386, 485-488 (1997)). 0 gene é um gene que funciona para suprimir a ramificação. Alternativamente, apenas o gene dos dedos de zinco foi descrito como um gene que promove a ramificação (H. Takatsuji, "Plant Biol. Mol. (review)", 39, 1073-1078 (1999) e Hiroshi Takatsuji, "Kagaku a Seibutsu", Vol. 37, pp. 287-289 (1999)).

Como acima descrito, a promoção da ramificação serve para aumentar os valores das plantas ornamentais ou plantas agrícolas de modo que estas técnicas sejam técnicas significativas no campo da agricultura e floricultura. Contudo, não se pode dizer 1 que estas técnicas são aplicáveis a todas as plantas, conduzindo a um grande resultado. Por este motivo, é fortemente desejada uma outra nova técnica para promover a ramificação.

Além disso, a supressão do crescimento da planta para produzir assim uma planta anã de um tamanho pequeno tem sido frequentemente realizado. Por este motivo, é desejado proporcionar uma técnica para realizar a supressão de um modo simples através da utilização da manipulação génica.

Actualmente, apenas um número de genes incluindo um gene isolado a partir do ADN cromossomal de Arabidopsis thaliana são conhecidos como esses genes que controlam o nanismo das plantas (Patente Japonesa Publicada N° 56382/1997). 0 documento WO 96/11566 divulga o gene OsMADSl da caixa MADS de arroz que quando sobre-expresso em plantas transgénicas conduz a um fenótipo de ramificação modificado. A sequência de ácidos nucleicos assim como a sequência de aminoácidos deduzida de um gene da caixa MADS de arroz é apresentada por Sasaki T. na Base de Dados EBI sob o N° de Acesso N° AB003325. A invenção foi realizada no estado da técnica como acima descrito. É um objectivo da invenção proporcionar uma técnica de regulação da ramificação de plantas, tais como plantas ornamentais e plantas agrícolas. 2

Divulgação da Invenção

Os requerentes rastrearam muitos genes para encontrar um gene que controla a ramificação das plantas. Os requerentes verificaram finalmente que o gene da caixa MADS de arroz tem uma função de regulação da ramificação da planta.

Do mesmo modo, os requerentes verificaram em plantas transformadas por um vector com o gene, através de um microrganismo hospedeiro apropriado, que é promovida a ramificação ou nanismo dependendo do sentido do gene. Assim, a invenção foi conseguida. A invenção proporciona um método para regular a ramificação de plantas, em que o método é caracterizado por integração do gene da caixa MADS de arroz ou um gene homólogo ao gene num vector e a transferência do vector através de um microrganismo hospedeiro numa planta e uma planta transgénica obtida através do referido método.

De acordo com a invenção, é utilizado um gene de regulação da ramificação das plantas da técnica anterior no método da invenção, em que o gene é caracterizado por conter o gene da caixa MADS de arroz ou um gene homólogo ao gene.

Adicionalmente, a invenção utiliza um vector com o referido gene ai integrado e um microrganismo transformado com o vector.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 representa a primeira metade do método para a construção do vector de sentido de acordo com a invenção. 3 A Fig. 2 representa a segunda metade do método para a construção do vector de sentido de acordo com a invenção. A Fig. 3 representa a primeira metade do método para a construção do vector anti-sentido de acordo com a invenção. A Fig. 4 representa a segunda metade do método para a construção do vector anti-sentido de acordo com a invenção. A Fig. 5 mostra fotografias representando a aparência de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1, em que o gene que regula a ramificação da planta é introduzido nas posições de sentido e anti-sentido. A Fig. 6 mostra fotografias representando a comparação na aparência entre indivíduos de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1, em que a gene que regula a ramificação da planta é introduzido nas posições de sentido e anti-sentido e Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 sem tratamento. A Fig. 7 é uma imagem representando os resultados da hibridação genómica de Southern de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 (Tl), em que o gene que regula a ramificação da planta é introduzido na orientação de sentido. A Fig. 8 é uma imagem representando os resultados da hibridação genómica de Southern de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 (Tl), em que o gene que regula a ramificação da planta é introduzido na orientação anti-sentido. A Fig. 9 é uma imagem representando os resultados da electroforese, através da qual pode ser confirmada a integração do gene que regula a ramificação da planta no genoma. 4 A Fig. 10 mostra diagramas que apresentam esquematicamente o gene MADS integrado nas posições de sentido e anti-sentido. A Fig. 11 é uma imagem representando os resultados da análise da hibridação de Southern para a confirmação do sentido do ADNc integrado no genoma. A Fig. 12 mostra fotografias representando a comparação na aparência entre Kalanchoe daigremontiana em que o gene que regula a ramificação da planta é introduzido na orientação de sentido, Kalanchoe daigremontiana em que é introduzido o gene GUS e Kalancho daigremontiana sem tratamento. A melhor Forma de Realização da Invenção 0 gene a ser utilizado como um gene que regula a ramificação da planta de acordo com a invenção, inclui o gene da caixa MADS de arroz ou um gene homólogo ao gene. O gene da caixa MADS de arroz tem a seguinte sequência de nucleótidos. ctcctcctcc tagcagctaa gaggatgggg gacgt tctcc cgacgccgag tgactccagg tcttatttca tcttcttctt ggt taggtcg cgggggaagg aagaggagga gtcgccgcca atggacaaaa gctgaatccg cttccactag gatcgagatc tgcagctgaa atggattgct tcgtcttctc tccttgaacg agagtgaggg ctagttcgtc gggatcggcc gcggatagag gaagaaggcg ccccaagggc ttatgagcgc aaattggtgc ttcctcct tc gccggcgagc aacaagatca cacgagatct aagctctacg tattcatatg catgaataca agctagcttg ggcgagcggc acaggcaggt ccgtcctctg agtacgccac ctgaaaaggc ggaaacttaa 5 ggcaaagatt cctgaatctc aatatcaaga gtcactgcag gaggggccag ccaaccccaa tct tccacca ggcggcggcg atggatgctg c tgccgtatg atcctagcga agcgattaag atgatttgca cacgtaccta tgcatgccat gagaccatac aaagaactcc aagagccacc gaggagaaca cagcaagtag gcccagacaa caaaatatct gcggtggcgg agccacctca caccgtgaat taatatatat ctattcttat agaaat taat gtgcttccta gctcccgtga aaaaatgtca aacagctaga ttatgcttga aggctctgca ggcagtggga gctcctcctc gctacccgcc cgcagggcca atgcttaaga catgggagca gattctccta atatgtgtt t tatgagcaag ctgatatata tggttaatt caaacacctc gcagcagctg gtccatttcc gaaggaactg ccaaacccag ctcctccatg ggtgatgatg ggtgcaactc tgatcatcgt accttgaatg aaatgaaatt gcctgctgcc gatcaggatg tgcatgcaat atgggagagg gagagttcat gagctgcaga gtggagaggc gtccaggccc ctgagggatc ggcgagagaa cgcatcggag cgtcgtcgtc aat tgaagtc gatctcaaaa ccctacccta tgtctttgtg tgtgtgcata atctagaatc tgaagcacat aaaaggagag agaagaatgt aggcccaagc agcaggcact atgatgcggc gtcttccgcc ggccaaacag attggtatcg aaacaaacct caggctacat taatcatcag taaatatat t

Além disso, o termo "gene homólogo ao gene" inclui uma gama de genes, que não são idênticos ao último gene per se devido aos resultados da presença de substituição, delecção, inserção ou semelhante numa parte das sequências de nucleótidos mas pode ser assumido como idêntico em termos das funções exercidas através dos genes.

Entre os aminoácidos codificados pelo gene, é elucidado que uma parte peptídica representada através da seguinte sequência regula a ramificação como um factor de transcrição. 6 20

MetGlyArgGlyLysValGInLeuLysArglleGluAsnLyslIeAsnArgGInVaIThr 40

PheSerLysArgArgAsnGIyLeuLeuLysLysAIaH i sGIulIeSerVaILeuCysAsp 60 AIaGluValAlaAIalIeVaIPheSe rProLysGIyLysLeuTyrGIuTyrAlaThrAsp 80

SerArgMetAspLysIIeLeuGIuArgTyrGIuArgTyrSerTyrAIaGIuLysAIaLeu 100 11eSerAIaGluSerGIuSerGIuGIyAsnTrpCysHisGIuTyrArgLysLeuLysAIa 120

Lys11eGIuThr11eGInLysCysHi sLysHi sLeuMetGIyGluAspLeuGIuSerLeu 140

AsnLeuLysGIuLeuGInGInLeuGIuGInGInLeuGIuSerSerLeuLysHisI leile 160

SerArgLysSerHi sLeuMetLeuGIuSer11eSerGIuLeuGInLysLysGIuArgSer 180

LeuGInGIuGIuAsnLysAIaLeuGInLysGIuLeuValGIuArgGInLysAsnVaIArg 200

GlyGInGInGInVaIGlyGInTrpAspGInThrGInValGlnAIaGI ηAIaGI πAI aG I n 220

ProGlnAlaGInThrSerSerSerSerSerSerMetLeuArgAspGInGIπΑIaLeuLeu 240

ProProGInAsnIIeCysTyrProProVaIMetMetGIyGIuArgAsnAspAIaAIaAIa 260

AlaAlaAlaValAlaAlaGInGlyGInValGInLeuArglleGlyGlyLeuProProTrp 267

MetLeuSerH i sLeuAsnAIa 7

De acordo com o exposto, o termo "MADS" do gene MADS é o acrónimo de "M" da levedura MCMl, "A" da planta AGAMOUS, "D" da planta DEFICIENS, e "S" do factor SRF de resposta do soro humano. Assim, verificou-se que os genes da caixa MADS possuem uma sequência de nucleótidos comum, independentemente do tipo de espécie. Estes genes são factores de transcrição (ADN de regulação génica de modo que o ADN possa ser transcrito em ARNm), tal como um gene envolvido na morfologia biológica, nomeadamente o gene homeótico.

Além disso, a maioria dos genes MADS das plantas, excluindo o arroz, estão envolvidos na morfologia da flor, mas nenhum deles é conhecido por estar envolvido na regulação da ramificação das plantas.

De acordo com a invenção, gene que regula a ramificação da planta está integrado num vector, que é depois introduzido através de um microrganismo hospedeiro apropriado numa planta, para regular a ramificação da planta. Mais especificamente, uma célula vegetal é transformada por conjugação de um promotor capaz de funcionar numa célula vegetal, o gene que regula a ramificação da planta e um terminador capaz de funcionar numa célula vegetal de um modo que o conjugado resultante possa funcionar de forma a construir um plasmideo de expressão e depois introduzindo o plasmideo de expressão na célula vegetal.

Como o promotor para utilização para esse objectivo, por exemplo, pode ser utilizado um promotor CaMV35S e um promotor para a nopalina sintase, sem limitação especifica.

Adicionalmente, pode ser utilizado um intensificador para expressão elevada do produto génico. Como tal intensificador, por exemplo, pode ser utilizado o intensificador contido na sequência numa região a montante da sequência de nucleótidos do promotor CaMV35S. Pode ser utilizada uma pluralidade desses intensificadores. Alternativamente, o terminador inclui, mas não está limitado a, um terminador CaMV35S e um terminador para a nopalina sintase.

De acordo com a invenção, pode ser utilizado um gene marcador de selecção para o pronto rastreio do microrganismo transformante resultante e da planta transformante.

Podem ser utilizados marcadores de selecção, incluindo por exemplo, o gene da neomicina fosfotransferase 2 (MPT2) e o gene da higromicina fosfotransferase (HPT).

Como o vector para utilização na integração do gene que regula a ramificação da planta de acordo com o método da invenção, podem ser utilizados de um modo preferido vectores da série pBI e série pUC. Os vectores da série pBI incluem, por exemplo, pBI121, pBHOl, pBI101.2 e pBI101.3, enquanto os vectores da série pUC incluem, por exemplo, pUC18, pUC19 e pUC9.

Além disso, também podem ser utilizados vectores, tais como pTOKl62, desenvolvidos para a transformação de plantas monocotiledóneas.

Como o método para transformar plantas com o vector com o gene que regula a ramificação da planta ai integrado, pode ser utilizado o método do Agrobacterium, o método de polietilenoglicol, o método da electroporação e o método da pistola de partículas, e semelhantes.

Entre os métodos de transformação, o método do Agrobacterium é um método para introduzir um gene numa célula vegetal através do cultivo de Agrobacterium contendo um vector que incorpora o gene recombinante na presença simultânea de uma cultura de células vegetais. Como um método mais simples, pode também ser 9 utilizado um método de pulverização ou revestimento ou injecção de uma solução contendo o Agrobacterium na proximidade do ponto de crescimento da planta. É então feito, de um modo preferido, um arranhão no corpo da planta. A regulação da ramificação através do método da invenção é aplicável a qualquer planta com células, tecidos ou órgãos na qual o gene pode ser introduzido e para a qual tenham sido estabelecidos métodos de rediferenciação, ou qualquer planta em que o gene possa ser introduzido directamente no corpo da planta.

Especificamente, as plantas transformadas de plantas ornamentais, tais como chrysanthemum, lirio, cravo, túlipa, rosa e orquidea, e plantas agrícolas, tais como soja, algodão, arroz, milho, trigo e cevada podem ser recuperadas através de tratamento dos calli ou seus pontos de crescimento com uma suspensão de Agrobacterium contendo um vector com o gene que regula a ramificação da planta ai integrado ou através de injecção directa de um vector com o gene ai integrado nas células ou tecidos da mesma e rastreando e crescendo um transformante. 0 resultado da invenção, como descrito nos seguintes Exemplos, varia de forma diversa, dependendo se o gene que regula a ramificação da planta está integrado nas plantas na orientação de sentido ou se o gene está integrado nas plantas na orientação anti-sentido. Por outras palavras, a ramificação da planta é promovida quando o gene é integrado na orientação de sentido, enquanto o crescimento de planta é suprimido resultando em nanismo quando o gene é integrado na orientação anti-sentido.

Aplicabilidade Industrial 10 0 gene que regula a ramificação da planta pode promover a ramificação ou o nanismo da planta, quando o gene é introduzido em plantas. Adicionalmente, a propriedade resultante pode ser herdada pelas progenias. Assim, a invenção proporciona uma técnica para criar uma planta com tal fenótipo novo; particularmente, a invenção é eficaz para a elevação da ramificação em plantas, tais como plantas ornamentais e plantas agrícolas, para aumentar o valor das plantas ornamentais ou o rendimento das plantas agrícolas.

Exemplos A invenção será agora descrita abaixo nos Exemplos, em mais detalhe. Mas a invenção não está nunca limitada a estes Exemplos.

Exemplo 1 (1) Construção de um vector com o gene da caixa MADS de arroz aí integrado na orientação de sentido (Figs. 1 e 2) 0 vector com o gene da caixa MADS de arroz aí integrado na orientação de sentido foi construído por substituição do gene da β-glucuronidase (GUS) num vector binário (pBI121) adquirido à Toyobo Co., Ltd., com o ADNc na orientação de sentido (1,3 kb) do gene da caixa MADS de arroz (N° de acesso DDBJ AB003325) de acordo com o seguinte método.

0 plasmídeo pBluescriptSK+M (disponível do banco de ADN no National Institute of Agrobiological Sciences, Ministry of Agriculture, Forestry e fishery) em que o gene da caixa MADS 11 foi introduzido no sitio de clivagem de restrição Sall e no sitio de clivagem de restrição Notl a partir da orientação 5' ->3', foi digerido com Sall e as extremidades tornadas rombas, que foi adicionalmente digerido com Saci. 0 produto resultante foi submetido a electroforese, para recuperar um fragmento de ADN de 1,3 kb.

Por outro lado, o plasmideo pUC18 (produzido pela Nippon Gene/correspondente ao pBl221 produzido pela Toyobo, Co., Ltd.), em que foi introduzido um fragmento de ADN de 3,1 kb derivado de pBI121 (contendo o promotor CaMV35S e o gene GUS e o terminador Nos) nos sítios de clivagem de restrição HindIII e EcoRI, foi digerido com Smal e Saci. 0 produto resultante foi submetido a electroforese em agarose, para recuperar um fragmento de ADN de 4,0 kb. O plasmideo pBl221-M foi preparado por ligação conjunta do fragmento de 1,3 kb e do resultante fragmento de 4,0 kb, que foi depois introduzido em Escherichia coli (JM109). A partir das colónias positivas de Escherichia coli, o plasmideo pBl221-M foi isolado e digerido com BamHI e Saci, para recuperar o ADNc de 1,3 kb. O ADNc com os sítios de clivagem BamHI e Saci, como recuperado desse modo, foi conjugado com um plasmideo pBI121 previamente digerido com BamHI e Saci para eliminar o gene GUS, para recuperar um vector pBI121-MS em que o gene da caixa MADS de arroz foi integrado na orientação de sentido (aqui referido abaixo como o "vector de sentido"). (2) Construção de um vector com o gene da caixa MADS de arroz aí integrado na orientação anti-sentido (Figs. 3 e 4) 12

Um vector pBI121-MA em que o gene GUS foi substituído com o ADNc na orientação anti-sentido foi preparado através do seguinte método. Primeiro, o plasmídeo pBluescriptSK+M em que o ADNc foi introduzido nos sítios de clivagem de restrição Sall e Notl na orientação 5' -► 3' foi digerido com Notl e as extremidades tornadas rombas, seguido por digestão com Kpnl. 0 produto resultante foi submetido a electroforese para recuperar um fragmento de ADN de 1,3 kb.

Por outro lado, o plasmídeo pUC18 foi digerido com BamHl e as extremidades foram depois tornadas rombas, seguido por digestão com Kpnl. 0 produto foi submetido a electroforese, para recuperar um fragmento de ADN de 2,6 kb. 0 fragmento foi conjugado com o fragmento de 1,3 kb, para preparar um plasmídeo pUC18-M, que foi depois introduzido em Escherichia coli (HB101). A partir das colónias positivas de Escherichia colif o plasmídeo pUC18-M foi isolado e digerido com Saci e Xbal para recuperar um ADNc de 1,3 kb com sítios de clivagem Saci e Xbal. 0 ADNc foi conjugado com um vector pBI121 previamente digerido com Saci e Xbal para recuperar um vector pBI121-MA em que o gene da caixa MADS de arroz foi integrado na orientação anti-sentido (aqui referido abaixo como o "vector anti-sentido"). (3) Introdução do vector no microrganismo hospedeiro

Como o microrganismo hospedeiro, foi utilizado Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) LBA 4404 disponível a partir da Toyobo Co., Ltd. A introdução do vector recuperado acima em (1) ou (2) no microrganismo foi realizada através de um método previamente descrito (M. Holster et al., "Mol. Gen. Gene", 163, 181-187 (1978)). Após introdução, o 13 microrganismo foi cultivado num meio de cultura LB suplementado com 50 yg/mL de canamicina, 10 yg/mL de rifampicina e 50 yg/mL de estreptomicina a 28 °C durante 18 horas. Após terminação da cultura, as células foram recolhidas por centrifugação, e foram lavadas em água e suspensas em água (1,0 χ 108 células/mL), para utilização na inoculação em plantas. (4) Inoculação em plantas A semente de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 foi esterilizada com hipoclorito de sódio e foi depois plantada no solo de um vaso. O vaso foi colocado sob condições de uma temperatura de 25 °C, durante 8 horas sob luz e 16 horas no escuro. Quatro 5 dias após semear, abriram duas folhas da planta. Justamente quando a planta atingiu uma altura de 7 a 8 cm, foi perfurado com uma agulha um pequeno furo no meristema apical do topo do caule, onde foi inoculada a suspensão aquosa (cerca de 1,0 χ 108 células/mL) de A. tumefaciens contendo o vector. A inoculação foi conduzida em 50 espécimes de plântulas de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1, que foram colocadas sob condições de uma temperatura de 22 °C durante 3 dias no escuro absoluto. Subsequentemente, as plantas individuais foram cultivadas a 30 °C sob uma iluminação de cerca de 4000 lux numa estufa de crescimento durante 8 horas. Em Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 floresceram dois tipos de flores com diferentes comprimentos de estilete, nomeadamente cerca de 1,8 mm e cerca de 0,6 mm (heterostilia; fenómeno com diferentes estiletes) . A polinização entre os diferentes tipos de flores pode conduzir à fertilização. Deste modo, de Forma a recuperar uma semente (planta Tl) , foi conduzida polinização entre a 14 flor da planta transformante (TO) e um tipo diferente de flor da planta sem transformação.

Entre as 50 plantas inoculadas com A. tumefaciens contendo o vector de sentido, a ramificação foi promovida em 33 indivíduos das plantas, de modo que foram formadas muitas ramificações. Contudo, os níveis de expressão dos fenótipos dos transformantes variaram entre as plantas. Não foi observado alteração na diferenciação e estrutura da flor.

Entre as 50 plantas inoculadas com A. tumefaciens contendo o vector anti-sentido, a ramificação e o crescimento foram suprimidos em 30 indivíduos das plantas. Os níveis de expressão dos fenótipos variaram entre as plantas, como nas plantas acima descritas. Não foi observada alteração aparente em termos de desenvolvimento da flor e da estrutura das flores destas plantas. A Fig. 5 (fotografias) representa a aparência de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 com gene que regula a ramificação da planta aí introduzido nas orientações de sentido e anti-sentido. Na Fig. 5(A), o sinal "1" expressa Fagopyrum esculantum var. Shinano N° 1 sem tratamento; o sinal "2", Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 tratado com A. tumefaciens contendo o vector pBI121 (gene GUS); o sinal "3", Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 tratado com A. tumefaciens contendo o vector de sentido; e o sinal "4", Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 tratado com A. tumefaciens contendo o vector anti-sentido. Estas fotografias foram obtidas um mês após os tratamentos. Além disso, a barra nas fotografias mostra uma escala com um comprimento de 30-30 cm. 15

Os resultados mostram que a ramificação foi promovida em Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 quando introduzido com a gene que regula a ramificação da planta na orientação de sentido (3 em Fig. 5(A)) , enquanto a ramificação foi suprimida em Fagopyrum esculentum Var. Shinano Ichigo introduzido com o gene na orientação anti-sentido (4 em Fig. 5 (A)) . Além disso, a Fig. 5(B) representa Fagopyrum esculentum var Shinano N° 1 introduzido com a gene que regula a ramificação da planta na orientação de sentido no fenótipo de mais elevada expressão da transformação (nivel de ramificação) entre esses indivíduos de Fagopyrum esculentum Var. Shinano N° 1 introduzidos com o gene na orientação de sentido. A fotografia foi obtida depois da planta parar o seu crescimento e murcha, 6 meses após o tratamento. (5) No teste acima descrito, A. tumefaciens foi inoculado no meristema apical nos topos do caule das plântulas para transformação, sem processo subsequente de eliminação para remover o Agrobacterium das plântulas. Deste modo, as plantas TO e as plantas TI foram examinadas através do seguinte método, relativamente à permanência ou ausência do Agrobacterium inoculado, nomeadamente se as alterações morfológicas das plantas transformadas foram causadas pelo efeito de A. Tumefaciens. A totalidade das plantas (plantas TO) após inoculação foi moída num almofariz com água estéril. A solução de planta moída foi espalhada numa placa de cultura LB contendo um antibiótico capaz de crescer A. tumefaciens utilizado para a transformação, por incubação a 28 °C. 0 número de colónias emergentes na placa foi diminuindo à medida da passagem do tempo após a inoculação. No dia 14 após a inoculação, emergiram apenas algumas colónias. 16 É sugerido que um grande número de Agrobacteria foi provavelmente eliminado através da reacção de resistência da planta Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1.

No caso das plantas Tl, as sementes foram esterilizadas com solução de hipoclorito de sódio, para subsequente germinação e crescimento asséptico. As plântulas consequentemente recuperadas foram moídas com água estéril e foram depois cultivadas numa placa de cultura LB contendo um antibiótico, como acima descrito. Não emergiu absolutamente nenhuma colónia, e foi confirmado que quaisquer Agrobacteria utilizados para a transformação estavam totalmente ausentes nas plantas Tl.

Exemplo 2

Confirmação do fenótipo da progenia (Tl) de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado A flor de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 apresenta heterostilia, deste modo a polinização ocorre apenas entre os diferentes tipos das flores. Deste modo, a flor do Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 (TO) transformado e a flor de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 de tipo selvagem foram polinizadas. A semente consequentemente recuperada foi plantada e cultivada para examinar o fenótipo das plantas Tl (Fig. 6) . Tanto em Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 introduzido com o gene que regula a ramificação da planta na orientação de sentido como em Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 introduzido com o gene na orientação anti-sentido, cerca de metade dos indivíduos da progenia (10 indivíduos) tinham herdado individualmente fenótipos das plantas TO. Por outras palavras, a ramificação foi promovida nas progenias de Fagopyrum esculentum 17 var. Shinano N° 1 introduzidas com o gene na orientação de sentido (2 em Fig. 6(A)). Em contraste, a ramificação e o crescimento foram suprimidos nas progenias de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 com o gene introduzido na orientação anti-sentido (2 em Fig. 6 (B)). Como acima descrito, os fenótipos de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformados com o gene introduzido nas orientações opostas entre si também tiveram uma relação oposta relativamente às sua progenias.

Exemplo 3

Confirmação da integração do gene que regula a ramificação da planta no isolamento do genoma (1) e na purificação do ADN genómico da progenia (Tl) de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado.

Utilizando um kit de extracção de ADN Nuclear Phytopure (Amersham Pharmacia Biotec), o ADN genómico foi extraído de plântulas ou plantas maduras recuperadas no Exemplo 2, de acordo com as instruções. 0 ADN extraído foi adicionalmente purificado através do seguinte método. Especificamente, o ADN foi dissolvido em 10 pL de tampão Tris-HCl (pH 8,0) contendo 500 pL de EDTA a 1 mM, que foi depois incubado com 2 pL de RNase (Nippon Gene; 10 mg/mL) a 37 °C durante 45 minutos. Continuamente, foi adicionada uma solução de 100 pL contendo 60 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,8), 60 mM de EDTA, 30% de SDS e 5 pL de Protease K (10 mg/mL), para incubação a 50 °C durante 3 horas. A solução foi extraída sequencialmente em fenol, numa solução de mistura de fenol/clorofórmio (1:1, v/v) e fenol. O ADN foi precipitado em etanol a partir da solução resultante de 18 ADN, e foi lavado em 70% de etanol, para recuperar o ADN genómico purificado. (2) Hibridação de Southern Genómica

Foram digeridos 15 yg de ADN genómico recuperado acima em (1) com endonucleases de restrição (utilizando EcoRI, Saci, Xhol e Sall, não tendo sitios de restrição no ADNc do gene MADS), seguido por electroforese em agarose (1%) e transferência subsequente em membrana de nylon Hybond N + (Amersham Pharmacia Biotec). Foi prepara da uma sonda marcada com 32P utilizando ADNc (1,3 kb) do gene da caixa MADS de arroz e um kit de marcação de iniciação aleatória (produzido por Takara), que foi purificado numa coluna Sephadex G-50. A membrana de nylon em que o ADN foi transferido foi primeiro submetida a pré-hibridação em solução 5χ SSPE (solução a pH 7,7, contendo 0,18 M de NaCl, 10 mM de fosfato de sódio, 1 mM de EDTA), contendo solução de Denhardt 5χ, 0,5% de SDS e 20 yg/mL de ADN de esperma de salmão a 65 °C durante uma hora.

Subsequentemente, foi adicionada a sonda marcada com 32P à solução de pré-hibridação, para hibridação a 65 °C durante 18 horas. A membrana foi lavada duas vezes em solução 2 χ SSPE contendo 0,1% de SDS a 20 °C durante 10 minutos. Continuamente, a membrana foi lavada uma vez em solução 1χ SSPE contendo 0,1% de SDS a 65 °C durante 15 minutos. Finalmente, a membrana foi lavada duas vezes em solução 0,1χ SSPE contendo 0,1% de SDS a 65 °C durante 10 minutos. A banda de ADN que híbrida com a sonda foi visualizada através de um analisador de imagem (Molecular Dynamics). Os resultados são mostrados nas Figs. 7 e 8. A Fig. 7 representa a progenia de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 com o gene aí introduzido na orientação de sentido; 19 e a Fig. 8 representa a progenia de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 com o gene aí introduzido na orientação anti-sentido. Em ambas as figuras, a pista 1 representa o resultado de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 sem tratamento, após digestão com EcoRI; a pista 2 representa o resultado dos transformantes, após digestão com EcoRI; a pista 3 representa o resultado dos transformantes, após digestão com Saci; a pista 4 representa o resultado dos transformantes, após digestão com Xhol; e a pista 5 representa o resultado dos transformantes, após digestão com Sall.

Como mostrado aparentemente nas Figs. 7 e 8, não foi observada nenhuma banda para Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 sem tratamento. Contudo, foi detectada apenas uma banda de hibridação em todas as pistas para cada um de ambos os ADN genómicos da progenia de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1, com o gene introduzido na orientação de sentido (Fig. 7) e da progenia de Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 com o gene introduzido na orientação anti-sentido (Fig. 8). Assim, é indicado que uma cópia do ADNc foi introduzida nos genomas das plantas Tl analisadas.

Exemplo 4

Confirmação da integração no genoma do gene que regula a ramificação da planta 20

Para a amplificação do ADNc integrado no genoma, foram concebidos dois tipos de iniciadores de PCR, nomeadamente Pl e P2.

Pl: 5'-ACAATCCCACTATCCTTCGC-3' P2: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3'

Particularmente, Pl corresponde à sequência do terminal 3' do promotor CaMV35S posicionado a montante do gene GUS no vector binário pBH21 original; e P2 corresponde a uma sequência na proximidade do limite à direita do T-ADN posicionado a jusante do gene GUS no vector binário pBI121 original. 0 ADN genómico (1-2 pL, 500 ng) preparado no Exemplo 3(1) foi adicionado a um volume final de 50 pL de uma solução de reacção (50 mM de KC1, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM de

MgCl2, 200 pM de cada nucleótido, 0,2 pM dos iniciadores, e 1,25 unidades de Taq polimerase (produzida pela Takara)) . A reacção de PCR foi conduzida em 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 58 °C durante 45 segundos e 72 °C durante 90 segundos e foi subsequentemente conduzida a 72 °C durante 10 minutos. Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose (1%) . Após amplificação, a solução de reacção foi directamente aplicada na electroforese e subsequentemente corada com brometo de etidio após a electroforese.

Os resultados são mostrados na Fig. 9. Na figura, a pista 1 representa o marcador de tamanho de ADN; a pista 2 representa o produto de PCR do vector com o gene ai introduzido na orientação de sentido; a pista 3 representa o produto de PCR do ADN genómico derivado de uma planta transformada com o gene na orientação de sentido; e a pista 4 representa o produto de PCR 21 do ADN genómico derivado de uma planta transformada com o gene na orientação anti-sentido. A Fig. 9 mostra aparentemente que foi amplificado o fragmento de ADN do tamanho previsto (1,7 kb) em ambos os ADN genómicos e que a sequência completa do ADNc foi integrada em ambas as plantas Tl.

Exemplo 5

Confirmação da orientação do ADNc integrado no genoma

Um sítio de restrição Xbal está presente numa posição de 472 pb a partir do terminal 5' do gene (1,3 kb) que regula a ramificação da planta. Tendo em consideração o sítio Xbal do ADNc e o sítio em que os iniciadores de PCR emparelham, é previsto que a digestão Xbal do produto de PCR irá gerar fragmentos de ADN de 1,2 kb e 0,5 kb quando a inserção está na orientação de sentido e irá gerar dois fragmentos de 850 pb quando a inserção está na orientação anti-sentido (Fig 10). Os produtos de PCR com os ADN genómicos tanto das plantas Tl como dos produtos de PCR com os dois vectores binários contendo o ADNc utilizado para a transformação foram digeridos com Xbal e continuamente submetidos a análise de hibridação de Southern utilizando a sonda de ADNc marcada com 32P (Fig. 11).

Na Fig. 11, "1" representa o produto de PCR com o vector com o gene que regula a ramificação da planta na orientação anti-sentido; "2" representa o produto de PCR com o vector com o gene introduzido na orientação de sentido; "3" representa o produto de PCR do ADN genómico derivado da planta transformada com o gene na orientação anti-sentido; e "4" representa o 22 produto de PCR do ADN do genoma derivado da planta transformada com o gene na orientação de sentido.

Na Fig. 11 foram detectadas as bandas de hibridação dos tamanhos previstos nas amostras individuais. Os resultados mostram que o ADNc foi integrado nas orientações previstas nos genomas das plantas (Tl) transformadas nas orientações de sentido e anti-sentido.

Exemplo 6

Introdução do gene que regula a ramificação da planta em

Kalanchoe daigremontiana

Uma folha madura de Kalanchoe daigremontiana com um comprimento de 10 a 13 cm foi cortada do caule. Utilizando um estereomicroscópio, foram perfurados diversos furos nas células epidérmicas e células do mesófilo em torno das células em divisão na profundidade máxima de um recorte na periferia da folha e das células epidérmicas imediatamente acima das células em divisão.

Foi inoculada uma gota da suspensão aquosa (1,0 x 108 células/mL) de A. tumefaciens com o gene MADS ai introduzido na orientação de sentido, obtido no Exemplo 1(3) em cada parte recortada, utilizando uma pipeta de Pasteur. Depois, a folha foi deixada em repouso para secar à temperatura ambiente durante cerca de 30 minutos. A folha foi colocada em vermiculite molhada colocada numa caixa de plástico, e depois a tampa foi fechada para incubação a 25 °C (um ciclo de 8 horas de luz e 16 horas de escuro). 23

Emergiu um rebento e uma raiz fresca a partir da parte tratada da folha de Kalanchoe daigremontiana. Após crescimento, estes foram removidos por corte a partir da folha original, 4 semanas mais tarde e foram fotografados. Como controlo, foi utilizada uma folha tratada com A. tumefaciens não transformante e uma folha tratada com A. tumefaciens com o gene GUS (gene da beta-glucuronidase) ai introduzido em vez do gene MADS. Os resultados são mostrados na Fig. 12.

Foi observado que as folhas se desenvolveram em torno da raiz do stock transformado com o gene da caixa MADS. Contudo, esse fenómeno não foi observado no não transformante de controlo e no stock com o gene GUS ai introduzido em vez do gene MADS. Os resultados mostram que o gene da caixa MADS é um gene que regula a ramificação, como nos resultados de teste utilizando Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1. Porque o gene da caixa MADS regula a ramificação não apenas em Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 mas também Kalanchoe daigremontiana de uma espécie diferente, é sugerido que o gene é capaz de regular a ramificação em plantas gerais.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Kojima, Mineo

Kumiai Chemical Industry Co., Ltd. 24 <12Ο> Um gene que controla a ramificação das plantas, um vector contendo o referido gene, um microrganismo contendo o referido vector e um método para controlar a ramificação da planta <130> PF-000009-WO <14 0> <141> <150> JP 1999-232318 <151> 1999-08-19 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 1289 <212> ADN <213> Oryza sativa < 4 0 0 > 1 25 ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg 60 tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc 120 gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt 180 gacgttotcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg 240 cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac 300 tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc 360 tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa 420 ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc 480 cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat 540 aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag 600 gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt 660 gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc 720 ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact 780 tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc 840 ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc 900 atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag 960 ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg 1020 atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct 1080 agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat 1140 atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag 1200 cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt 1260 tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt 1289

<210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Oryza sativa <220> <221> DOMÍNIO <222> (1) .. (57)

<223> Domínio MADS <2 2 0 >

<221> DOMÍNIO <222> (92) .. (158) <223> Domínio K 26 <3 Ο 0> < 4 Ο Ο > 2

Met Gly Arg Gly Lys Vai Gin Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn 15 10 15

Arg Gin Vai Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala 20 25 30

His Glu Ile Ser Vai Leu Cys Asp Ala Glu Vai Ala Ala Ile Vai Phe 35 40 45

Ser Pro Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ala Thr Asp Ser Arg Met Asp 50 55 60

Lys Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Lys Ala Leu 65 70 75 80

Ile Ser Ala Glu Ser Glu Ser Glu Gly Asn Trp Cys His Glu Tyr Arg 85 90 95

Lys Leu Lys Ala Lys Ile Glu Thr Ile Gin Lys Cys His Lys His Leu 100 105 110

Met Gly Glu Asp Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Glu Leu Gin Gin Leu 115 120 125

Glu Gin Gin Leu Glu Ser Ser Leu Lys His Ile Ile Ser Arg Lys Ser 130 135 140

His Leu Met Leu Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gin Lys Lys Glu Arg Ser 145 150 155 160

Leu Gin Glu Glu Asn Lys Ala Leu Gin Lys Glu Leu Vai Glu Arg Gin 165 170 175

Lys Asn Vai Arg Gly Gin Gin Gin Vai Gly Gin Trp Asp Gin Thr Gin 180 185 190

Vai Gin Ala Gin Ala Gin Ala Gin Pro Gin Ala Gin Thr Ser Ser Ser 195 200 205 27

Claims

Ser Ser Ser Met Leu Arg Asp Gin Gin Ala Leu Leu Pro Pro Gin Asn 210 215 220 Ile Cys Tyr Pro Pro Vai Met Met Gly Glu Arg Asn Asp Ala Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Vai Ala Ala Gin Gly Gin Vai Gin Leu Arg Ile Gly Gly 245 250 255 Leu Pro Pro Trp Met Leu Ser His Leu Asn Ala 260 265 Lisboa, 16 de Agosto de 2007 REIVINDICAÇÕES 28 1. Método para regular a ramificação da planta, em que o método é caracterizado por integração do gene da caixa MADS de arroz de acordo com a SEQ ID N° 1, ou um gene tendo uma substituição, delecção ou inserção numa parte da sequência de nucleótidos de SEQ ID N° 1, mas mantendo a função do gene de regulação da ramificação da planta, num vector e introduzindo o vector através de um microrganismo hospedeiro numa planta.

1 2 3 4 5 Sonda: Gene da Caixa MADS marcado com 32P Pista 1: Não transformado, digerido com EcoRI Pista 2: transformado, digerido com EcoRI Pista 3: transformado, digerido com Saci Pista 4: transformado, digerido com Xhol Pista 5: transformado, digerido com Sall 8/12 Figura 8 Análise de Hibridação de Southern Genómica de Fagopyrum esculentum (Planta Tl) Transformado com o Gene da Caixa MADS de Arroz na Orientação Anti-Sentido Tamanho do ADN (em kb)

2/12 Fig. 2

Eco RI 3/12 Fig. 3

Xba I

Clivagem com Notl e as extremidades tornadas subsequentemente rombas Clivagem com Kpnl Clivagem com BamHf e as extremidades tornadas subsequentemente rombas " Clivagem com Kpnl Xbal

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que gene que regula a ramificação da planta codifica um péptido de acordo com a SEQ ID N° 2, ou um péptido tendo uma substituição, delecção ou inserção de SEQ ID N° 2, mas mantendo a função de uma proteina de regulação da ramificação da planta.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o gene que regula a ramificação da planta é representado através de SEQ ID N° 1.

4/12 Fig. 4

5/12 Figura 5 (A)

6/12 Figura 6

7/12 Figura 7 Análise de Hibridação de Southern Genómica de Fagopyrum esculentum (Planta Tl) Transformado com o Gene da Caixa MADS de Arroz na Orientação de Sentido Tamanho do AON (em kb)

4. Planta transgénica obtida através de qualquer um dos métodos anteriores, em que o gene da caixa MADS de arroz é representado através da SEQ ID N° 1. Planta de acordo com a reivindicação 4, em que o gene da caixa MADS de arroz de acordo com a SEQ ID N° 1 é introduzido na orientação de sentido para promover a ramificação da planta. Planta de acordo com a reivindicação 4, em que o gene da caixa MADS de arroz de acordo com a SEQ ID N° 1 é 2 suprimir o introduzido na orientação anti-sentido para crescimento da planta em nanismo. Lisboa, 16 de Agosto de 2007 3 1/12 Fig. 1 Sph I

Clivagem com Sall e as extremidades tornadas subsequentemente rombas | Clivagem com Saci Clivagem com Smal (extremidades rombas) Clivagem com Saci Sphl

Eco RI

5,15-► 4,27-► 3,52-► 2,02-► 1,58-► 1,38-► 1 2 3 4 5 Sonda: Gene da Caixa MADS marcado com 32P Pista 1: Não transformado, digerido com EcoRI Pista 2: transformado, digerido com EcoRI Pista 3: transformado, digerido com Saci Pista 4: transformado, digerido com Xhol Pista 5: transformado, digerido com Sall 9/12 Figura 9

Pista 1: Marcador Pista 2: pBI121-MS Pista 3: Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado (na orientação de sentido) Pista 4: Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado (na orientação anti-sentido) P B I 1 2 1 - Μ A 10/12 Fig. 10 RB NOS-pro NPTH NOS-ter C«MV35S-pro MADS NOS-ter

RB NOS-pro ΝΡΤΠ NOS-ter CaMV35S-pro MADS NOS-ter

j 500 pb j 1,2 kb 11/12 Figura 11

<— 1,2 kb <— 500 pb 12 3 4 Pista 1: pBI121-MA Pista 2: pBI121-MS Pista 3: Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado (na orientação de sentido) Pista 4: Fagopyrum esculentum var. Shinano N° 1 transformado (na orientação anti-sentido) 12/12 Figura 12

gene da caixa MADS de arroz (sentido)

gene GUS

sem tratamento