PT1192448E - Processo para a utilização de uma plataforma de sensor - Google Patents
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Description
ΡΕ1192448 1
DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A UTILIZAÇÃO DE UMA PLATAFORMA DE SENSOR"
Esta invenção refere-se, de um modo geral, ao campo da análise de amostras e em particular, mas não exclusivamente, à aplicação no campo da sensibilidade de afinidade, por exemplo aquela conhecida de um modo geral como tecnologia de chips de DNA, proteina, péptido e anticorpo. A invenção refere-se a um processo para analisar amostras que fazem uso de uma plataforma de sensor. São conhecidas técnicas para analisar matrizes bi-dimensionais de amostras. Uma dessas técnicas é conhecida como um ensaio de ELISA e baseia-se na reacção bioquímica intensa entre anticorpos e antigénios. Anticorpos mono ou policlonais especiais são imobilizados em substratos e reagem com espécies complementares. São adicionados marcadores marcados com fluoróforos, activados através de anticorpos ligados por via enzimática e as amostras são irradiadas com luz, de modo a induzir fluorescência. A fluorescência é detectada e a intensidade da fluorescência é indicadora da reacção de afinidade.
Outra técnica conhecida é a descrita em WO98/27430. Nesta, um número elevado de espécies diferentes são imobilizadas numa matriz num substrato. As espécies são 2 ΡΕ1192448 imobilizadas no substrato por meios de fotolitografia. São adicionados à espécie marcadores marcados com fluoróforo. É preparada uma amostra e reagida com a espécie imobilizada e o chip total é varrido com um feixe de laser focado. Alternativamente, é preparada uma amostra e modificada com marcadores marcados com fluoróforo e reagida com a espécie imobilizada e o chip total é varrido com um feixe de laser focado. Os sinais fluorescentes são detectados por foto-detectores e é produzido um padrão de 2D. As alterações neste padrão entre amostras individuais proporcionam uma indicação de diferenças na expressão genética e por isso proporcionam informação sobre farmacologia e toxicologia.
Outra técnica conhecida é então baseada em sensores de onda evanescente. Estes fazem uso de luz laser coerente que é presa numa camada muito fina e cria os denominados campos electromagnéticos evanescentes que se estendem para uma distância pequena fora do próprio sensor fisico.
Este campo pode interagir com moléculas ligadas à superfície do sensor. Esta excitação evanescente ou interacção está limitada a uma região muito próxima da vizinhança da guia de onda, tipicamente 0,5 microns para a luz visível da superfície. Os campos evanescentes permanecem localizados espacialmente e não transferem a sua energia armazenada para outras regiões. A interacção da luz laser com as moléculas pode ser utilizada numa variedade de modos diferentes. Estes incluem: 3 ΡΕ1192448 1 Detecção de luminescência induzida por um campo evanescente. 2. Detecção de alterações no índice de refracção que ocorre quando as moléculas de uma amostra se ligam a moléculas de captura. 3. Detecção de ressonância de plasmão superficial.
Um sensor particular que utiliza um campo evanescente é conhecido como um sensor de guia de onda. 0 sensor de guia de onda plano compreende um substrato plano possuindo, formado nele, uma camada fina de guia de onda. Parte da camada de guia de onda incorpora uma rede de difracção, no qual a luz de laser incide e a partir do qual a luz de laser é lançada de modo a propagar-se através da camada de guia de onda para uma região sensível distante da rede de difracção. 0 sensor do guia de onda pode ser quer utilizado num modo sensível à massa (cf. 2,3 acima), ou com sensibilidade superior, em combinação com excitação e detecção de luminescência (cf. 1 acima) . As moléculas de captura são imobilizadas na área sensível e o analito (amostra) é então colocado em contacto com a área de sensibilidade/moléculas de captura na presença de moléculas marcadas adicionadas com afinidade semelhante (competição). Alternativamente, as moléculas de analito podem ligar-se a moléculas de captura imobilizadas e são introduzidas marcações de fluorescência através da reacção de uma outra 4 ΡΕ1192448 espécie marcada com as moléculas de analito capturadas. A luz de laser lançada para a camada de guia de onda conduz à excitação evanescente dos fluoróforos que depois permite a quantificação do analito. A fluorescência emitida é detectada e a intensidade da fluorescência proporciona uma indicação da interacção que ocorreu entre parceiros de afinidade presentes no analito e as moléculas de captura imobilizadas. Deve ser referido que neste tipo de arranjo, a radiação laser propaga-se dentro da guia de onda ao longo de distâncias relativamente longas e a rede de difracção de acoplamento e as áreas de sensibilidade estão geometricamente separados. (Ver WO 95/33197, W095/33198, e WO 96/35940) . EP-0 455 067 descreve um sensor de guia de onda plano explorando o principio de detecção de alterações do indice de refracção. Os sulcos superficiais da plataforma formados ao longo de toda a plataforma acoplam a luz polarizada, coerente, com a camada de guia de onda transparente, onde é acoplado após alguma distância. O ângulo das alterações do feixe desacoplado quando as moléculas de analito se ligam a moléculas de captura.
Outro exemplo do tipo de índice de refracção é fornecido em US-A-5738825. A plataforma contém redes de difracção individuais estando em contacto com os poços de uma placa de microtitulação. 5 ΡΕ1192448 A EP 178083 revela a Ressonância de Plasmão Superficial (SPR) na qual a energia de fotões de entrada se convertem em energia eléctrica como uma onda de plasmão superficial. A arquitectura do sensor requer uma camada metálica em contraste com a plataforma da presente invenção, e a quantidade de luz reflectida no ângulo é, ou aproxima-se de zero, em contraste com a presente invenção em que a intensidade reflectida alcança quase 100%.
Todas as técnicas acima sofrem de várias desvantagens. Algumas são muito lentas porque cada amostra tem que ser excitada individualmente. Outras, tais como a guia de onda plana, permite a excitação e mais do que uma amostra de cada vez, mas não proporcionam resultados totalmente fiáveis devido à fluorescência cruzada entre diferentes elementos de captura e intensidades de luz de excitação de variação local, devido a perdas dos guias de onda e variações locais de pó acoplado, devido a variações de eficiências de acoplamento da rede de difracção. A presente invenção refere-se a uma técnica que permite que amostras múltiplas sejam analisadas simultaneamente de um modo extremamente sensível, fiável e quantitativo .
Em contraste com sensores de guia de onda planos, a presente invenção não apresenta luminescência cruzada e as intensidades da luz local são bem definidas. A presente 6 ΡΕ1192448 invenção permite um verdadeiro sistema de "multiplex", i.e. o transdutor não necessita de uma estrutura em pilha (como é o caso para guias de onda planas) e pode ser observado como uma plataforma universal em que, dependendo dos requisitos, o tamanho e o número de elementos de reconhecimento podem ser variados dentro das limitações exequíveis da técnica, sem necessitar de alterações na estrutura do chip (as áreas corrugadas e as áreas de sensibilidade não estão separadas como é o caso de guias de onda anteriores). Adicionalmente, a invenção distribui intensidades de luminescência cerca de 100 vezes mais fortes, em comparação com as técnicas anteriores de epifluorescência. A instalação experimental é muito simples e requer apenas um ajuste simples do ângulo do feixe de luz incidente. Os transdutores descritos na presente invenção podem ser facilmente adaptados a microscópios de fluorescência convencionais, microscópios confocais e aparelhos de varrimento de laser. Além disso, para transdutores com uma banda de ressonância larga (definida com Banda Total a Meio do Máximo, FWHM) e uma posição de ressonância na incidência normal, ou próximo desta, os ajustamentos do ângulo estão obsoletos. O processo de produção da plataforma é relativamente simples (barata) e o desempenho dos sistemas existentes (i.e., aparelhos de varrimento de fluorescência, microscópios, leitores de placas de microtitulação de fluorescência,...) pode ser facilmente aumentado através de modificações modestas das respectivas instalações. 7 ΡΕ1192448
De acordo com a presente invenção é proporcionado um processo para analisar uma amostra ou amostras que compreendem colocar a amostra, ou amostras, em contacto com a área de sensibilidade de uma plataforma de sensor, compreendendo a referida plataforma um substrato opticmente transparente, possuindo um índice de refracção ni, uma camada opticamente transparente não metálica, formada numa superfície do substrato, possuindo a referida camada um índice de refracção n2 que é superior a ni, incorporando aí a referida plataforma uma ou mais estruturas corrugadas, compreendendo sulcos periódicos que definem uma ou múltiplas áreas, ou regiões de sensibilidade, cada uma para um ou múltiplos elementos de captura, em que (a) a profundidade dos sulcos está no intervalo de 3 mm para a espessura da camada opticamente transparente, (b) a espessura da camada opticamente transparente está no intervalo de 30 a 1000 mm, (c) o período da estrutura corrugada está no intervalo de 200 a 1000 mm, (d) a proporção da profundidade do sulco para a espessura da camada opticamente transparente está no intervalo de 0,02 a 1, e (e) a proporção da largura do sulco para o período dos sulcos está no intervalo de 0,2 a 0,8, em que ΡΕ1192448 1) a luz coerente incidente na referida plataforma num ângulo apropriado pode ser difractada em feixes individuais ou ordens de difracção que interferem resultando na redução do feixe transmitido e uma reflexão anormal elevada da luz incidente, criando assim um campo evanescente aumentado na superfície de uma ou múltiplas áreas de sensibilidade; ou 2) a luz coerente e linearmente polarizada incidente na referida plataforma num ângulo apropriado pode ser difractada em feixes individuais ou ordens de difracção, que interferem resultando em extinção quase total do feixe transmitido e uma reflexão anormal elevada da luz incidente, gerando assim um campo evanescente aumentado na superfície de uma ou múltiplas áreas de sensibilidade, e pelo qual a plataforma de sensor é irradiada com um feixe de luz que é incidente na plataforma num ângulo tal que a ressonância evanescente ocorre criando o referido campo evanescente aumentado na área de sensibilidade da plataforma e detectando radiação que emana da área de sensibilidade.
Como aqui utilizado, orientação é entendida como significando que o vector do capo eléctrico da luz linearmente polarizada é paralelo ou perpendicular aos sulcos. Como aqui utilizado, a luz coerente é entendida como significando que a luz coerente da radiação, i.e., a exten- 9 ΡΕ1192448 são espacial para a qual o feixe incidente possui uma relação de fase definida, é grande em comparação com a espessura da plataforma. 0 campo evanescente decai exponencialmente dentro das dimensões de comprimento de onda do feixe incidente (menos de 1 μιη) .
Um aspecto importante da presente invenção é a utilização de uma plataforma na qual a denominada ressonância evanescente pode ser criada. A reflexão anormal de um fenómeno que foi descrito teoricamente na arte anterior, por exemplo num artigo intitulado "Theory and applications of guided mode resonance filters" de SS Wang e R Magnusson em Applied Optics, Vol. 32, N° 14, 10 de Maio de 1993, páginas 2606 a 2613 e num artigo intitulado "Coupling gratings as waveguide functional elements" de O. Parriaux et al., Pure & Applied Optics 5, (1996) páginas 453-469. Como explicado nestes artigos, podem ocorrer fenómenos de ressonância em redes de difracção de camada dieléctrica plana, em que quase 100% da mudança de energia óptica entre ondas reflectidas e transmitidas ocorre quando os sulcos da rede de difracção possuem profundidade suficiente e a radiação incidente da estrutura corrugada está num ângulo particular. Na presente invenção, este fenómeno é explorado na área de sensibilidade da plataforma em que essa área de sensibilidade inclui sulcos de difracção de profundidade suficiente e a luz é feita incidir na área de sensibilidade da plataforma a um ângulo tal que a ressonância evanescente 10 ΡΕ1192448 ocorre nessa região de sensibilidade. Isto cria na região de sensibilidade um campo evanescente aumentado que é utilizado para excitar as amostras sob investigação. Deve ser salientado que a substituição de 100% acima referida ocorre com feixe paralelo e luz coerente linearmente polarizada e o efeito de um campo evanescente aumentado pode também ser atingido com luz não polarizada de um feixe laser não paralelo focado.
Em condições de ressonância, os feixes individuais interferem de tal modo que o feixe transmitido é cancelado (interferência destrutiva.) e o feixe reflectido interfere construtivamente dando origem a reflexão elevada anormal.
Es co1hendo os parâmetros apropriados p 3. X.' cL cl estr utura de camada corri .ligada a cirna mencionada, a energia excitação permanece altamente localizada. Essas estru tu ras são desc rri i ras na I iterat -.ura corno es itri J.tU .ras Γ 0 tóni in tervalo de banda, ma ter lais com v a. ri ,aç; 0 p C] iii c* S.. p 3 0. j. pe ri óí "j i. C 3. S d.O S0 u índio p H p ·> refracção té 3. is O'1 ne a r adi a. Θ-1. ect. comagnéti ..ca. não se pode propagar em qu; 3.1 quer d.i recç A C; e s trutaras 1 0 tónicas de in tervalo de bar ida peri mi tem ' C' - · O '.U. r j ai n modos altamente loca lizados, vi 21' e, , o . ’ rv * Ci 3. Γ P in tr tu. alado "I j O C c. 11 i s a t i c >n of One Photo ) D ο ι-Ο 1 .ates «t de Ad larc i, Ξ, R. Pr ke e S. Sarkar em Physic ‘cll Re VT 6' W L Θ t Z Θ Vo 1. 7 9, No 0 páginas : 158 5 -87 (1997). Ξ | q C; · as e st rutu exibem perdas de propagação extremamente grandes corres ponoendo a uma localização de modo no regime m. 11 ΡΕ1192448 A plataforma cia presente invenção pode ser considerada como opticamente activa em contraste com plataformas opticamente passivas construídas a partir de e.g. um vidro ou polímero. Aqui, opticamente actívo significa aumentar o campo electromagnético do feixe de excitaçã.o por confinamento de energia. 0 substrato da plataforma pode ser formado a partir de materiais inorgânicos tais corno vidro, 3102, quartzo, Si. Alternativamente o substrato pode ser formado a partir de materiais orgânicos, tais como polímeros, preferencialmente policarbonato (PC) , poli (metacrilato de rnetilo) (PMMA) , poliimida (PI), poliestireno (PS), polietileno (PE), polietíieno tereftaiato (PET) ou poliuretano (PU).
Estes materiais orgânicos são especialmente preferidos para aplicações médicas de "point-of-care" ("diagnóstico no consultório”, POC) e personalizadas uma vez gue o vidro não é aceite nesse ambiente. Os substratos plásticos podem ser estruturados (gravados) muito mais facilmente que o vidro. Num exemplo, o substrato é formado a partir de vidro. A camada opticamente transparente pode ser formada a partir de material inorgânico. Alternativamente, pode ser formado a partir de material orgânico. Num exemplo, a camada opticamente transparente é um óxido de metal, tal como TaCg, liCo, NbgOU, ZrCg, ZnO ou Hf Cg. A camada opticamente transparente é não metálica. 12 ΡΕ1192448
Alternativamente, a camada opticamente transparente pode ser construída de material orgânico, tal como poliamida, poliimida, polipropileno (PP), PS, PMMA, ácidos poliacrilicos, éteres poliacrilicos, politioéter, poli (sulfureto de fenileno), e derivados destes (ver, por exemplo S. S. Hardecker et al., J. of Polymer Science B: Polymer Physics, Vol. 31,1951-63,1993). A profundidade dos sulcos de difracção é, preferencialmente, de 10 nm para. a espessura da camada opticamente transparente e.g., 30 nm para a espessura da camada opticamente transparente. A espessura da camada opticamente transparente é, preferenciaimente, 50-200 nm, o período da estrutura corrugada é preíerencialmente 250-500 nm., a proporção da profundidade do sulco em relação à espessura da camada opticamente transparente é preferencialmente 0,3 a 0,7, e a proporção das larguras dos sulcos em relação ao período dos sulcos ("duty cycie”) pode estar no intervalo de 0,4 a 0,6.
Os sulcos podem ser, de um modo geral, rectan-gulares em corte transversal. Alternativamente, os sulcos podem ser sinusoidais ou de corte transversal em dentes de serra. A estrutura de superfície pode ser geralmente simétrica. Geometrias preferidas incluem cortes transversais rectangulares, sinusoidais, e trapezoidais. Alternativamente, os sulcos podem ser de corte transversal de dentes de serra (rede de difracção marcada) ou de outra 13 ΡΕ1192448 geometria assimétrica. Noutro aspecto, a proiunciidacie cio sulco p:Ocie variar, e.g, em modulações periódicas. A plataforma pode ser quadrada ou rectangular e os sulcos podem estender-se linearmente ao longo de uma plataforma de modo a cobrir a superficie. Alternativamente, a plataforma pode ser em forma de disco e os sulcos podem ser circulares ou lineares.
Os SUbS trato. A numa. super ;f.í uma outra ai na superf: ’ r·' ή suce r f í. c i e p;; sulcos .ternati cie da ser na t i\ e do s camada podem ser formados .vamente, os sulcos camada opticamente /a, os sulcos podem substrato que é a opticamente transps numa superficie do podei τι ser formados tran sparente. Como s e r formados tanto int.e rface como na rente. A superficie corrugada de urna única área de sensibilidade pode ser optimizada para um comprimento de onda. de excitação particular e para um tipo de polarização particular. Através de meros apropriados, e.gu superposição de várias estruturas periódicas que são paralelas ou perpendiculares umas às outras, podem ser obtidos relevos da superficie periódica que são adequados para utilização de comprimentos de onda múltiplos da plataforma (aplicações "multicolores") . Alternativamente, áreas de sensibilidade individuais numa plataforma podem ser optirnizadas para diferentes comprimentos de onda e/ou orientações de polarização. transparente A superficie da camada opticamente 14 ΡΕ1192448 pode incluir unia ou uma pluralidade de áreas de sensibilidade corrugada que pode, cada uma, comportar um ou uma pluralidade de elementos de captura.
Cada element: :> de captura pod< s conter moléculas de captura individuais s ;/ou misturas. que são capazes eis reacções de afinidade. A forma de um element o de captura individu ai pode ser r< retangular, circ ular, ei ipsoidai, ou qualquer outra forma. A área de um elementc ) de captura individu ai está entre 1 μπύ e 10 mrrf:. e.g. ent re 20 pm e 1 mm.2 e preferencialmente entre 100 piri e 1 mrri. Os elementos de captura podem ser dispostos numa matriz regular b .1G rmensro na.i * A c lis tán . c .ί. a centro a cgn l iro (c :tc) dos e 1. eme r .tos H captura po 0.0 a.\ o t.ar entre 1 pm. e 1 mm, 0 # (Ύ , 5 pm a 1 mm, pre ferenci a I rn ente 1.0 C ) u: a 1 . mm. 0 i TÚrr ie.ro de ereme ritos d e cap doura . por área G sen sibilid ade e; :~j 0 ã en 1 ire e 1,000,1 100, p refe rericra Iment .e 1 e 1 00,000. No ut: aspecto, o número de ei emen tos de capt .ura a s erern in l.ob 1 1. i zad O id na plat a ro rma pode n ã o estar .1 im.it ado e p ode cor res po; ode: r a S1 « G e Ci número de eje ae to F s e cj \x e ncras de DMA , motiv o s de DM IA, micross atéli te s de DMA, polrm orf is mios num único nuc ;ie ótl OdO (SNPs}, protei nas 0' u f r agment o s c e 1 u “ lar es cons tr t ui; odo nm genoma de uma espéc re o u orga nismo de int eresse, '•S L ama se lecção ou combinaç ãO C lestes . . Noa .tro asp ecto, t ϊ P lai raf; arma l pode conter n s Qd j enoim as de duas ou mai s espéc Ί CZ'. C‘ d- \_, f e,g , mr irganho e rato, 15 ΡΕ1192448 A plataforma pode incluir uma camada promotora de adesão disposta à superfície da camada optícamente transparente de modo a permitir a imobilização de moléculas de captura. A camada promotora de adesão também pode compreender uma camada microporosa (cerâmica, vidro, Si) para aumentar a eficiência do ensaio e da detecção ou camadas de gel que podem ser utilizadas quer como meio para realizar a imobilização do elemento de captura e a análise da amostra, aumentando ainda deste modo a eficiência do ensaio e detecção, ou que permitem a separação de misturas de ana-lito no sentido da eiectroforese em gel. A plataforma pode ser formada com uma plural.id.ade de áreas de sensibilidade ou regiões, possuindo cada uma delas os seus próprios sulcos de difracção.
Uma característica. da plataforma desta, invenção é que a energia de luz que entra na camada optícamente transparente é difractada para fora da camada imediatamente devido à natureza da plataforma corrugada. Por isso, não ocorre guia de onda ou esta é insignificante. Tipicamente a distância de propagação é 100 um ou inferior, preferencialmente 10 pm ou inferior. Isto é uma distância surpreendentemente muito curta. A distância de propagação é a distância em relação à qual a energia da radiação é reduzida para 1/e. A gama de ângulos do feixe de luz incidente na plataforma adequada para criar uma condição de ressonância 16 ΡΕ1192448 é limitada pelo ângulo cie reflexão total para a luz incidente na plataforma. Ângulos preferidos são menos de ao , e.g. 3U ou inienor, e.g, rU a 10 ou aoarxo, e.g, 0,1° a 9,9°. 0 ângulo pode igualar ou aproximar-se da incidência normal. 0 meio de criação de luz pode compreender um laser para emitir um feixe laser coerente. Outras fontes de luz adequadas incluem lâmpadas de descarga ou lâmpadas de pressão baixa, e.g. Hg ou Xe, em que as rinhas do espectrc 3 emitido possuem comprimento de coerência suficiente, e díodos de emissão de luz (LED). 0 d .ispositívo para. realizar o processo pode incluir elementos ópticos para. dirigir o feixe laser de modo a que seja incidente numa plataforma de um ângulo Θ, e elementos para modelar o piano de polarização do feixe coerente, e.g, adaptado para transmitir luz línearmente polarizada, 0 ângulo Θ pode ser definido pela expressão sin 9-n-./A, em que A é um período dos sulcos de difracçâo, X é o comprimento de onda da luz incidente e n é o Índice de refracção eficaz da camada opticamente transparente.
Exemplos de ias ; 0 y; 3 que po ΟΘΠ1 ser utilizados sã lasers de aás, lasers no 3 f -. ado sói ri . ϋ / lasers oe corar lasers de semicondutor. Se necessá no, 0 comprimento d onda de emissão pode ser du pricado por meio de eremer Ί S 0 ópticos não lineares. Lasers especialmente adequados são lasers de ião árgon, lasers de ião crípton, lasers de ião argon/c rípton, e lasers héli .o/néon que emitem a comori mentos de onda entre 275 e 753 nm. São muito adequado lasers de díodc 1 ou lasers de díodo de frequência dupiicad 17 ΡΕ1192448 de material semicondutor que possui dimensões pequenas e baixo consumo de energia.
Outro tipo de excitação apropriado faz uso de VCSEL * s (lasers de emissão de superfície de cavidade vertical) que podem excitar individualmente os elementos de reconhecimento na plataforma.
Dispositivos para realizar o processo podem incluir meios de detecçâo dispostos para detectar luminescência, ta.is como fluorescência. Podem ser marcados parceiros de afinidade, de tal modo que pode ocorrer transferência de energia de fluorescência de Fõrster (FRET) após a ligação de moléculas de analito com moléculas de captura. 0 máximo da intensidade de luminescência pode ser ligeiramente desviado em relação à posição da reflexão anormal ma.is elevada dependendo dos valores do índice de refracção do sistema de camada e dos correspondentes Coeficientes de Fresnel.
As amostras podem ser utilizadas quer de forma não diluída, ou com. solventes adicionados. Os solventes adequados incluem água, soluções tampão aquosas, soluções de proteína, soluções de oligómero ou polímero natural ou artificial, e solventes orgânicos. Solventes orgânicos adequados incluem álcoois, cetonas, ésteres, hidrocar-bonetos alifáticos, aldeídos, acetonitrilos ou nitrilos.
Podem ser incluídos soiubíiizadores ou aditivos. 18 ΡΕ1192448 e poderá ser compostos orgânicos ou inorgânicos ou reagentes bioquímicos, tais como dietilpirocarbonato, fenol, forma-mi da, S3C (citrato de sódio/cioreto de sódio), 3DS (Dodecil sulfato de sódio), reagentes de tampão, enzimas, trans-criptase reversa, RNAse, polímeros orgânicos ou inorgânicos . A amostra pode também compreender constituintes que não são solúveis nos solventes utilizados, tais como partículas de pigmento, dispersantes e oligómeros ou polímeros naturais ou sintéticos.
Os corantes de luminescência utilizados como marcadores podem ser ligados quimicamente ou fisicamente, por exemplo electrostaticamente, a um ou a. múltiplos parceiros de ligação de afinidade (ou derivados destes) presentes na solução de analito e/ou ligados à plataforma. No caso de oligómeros ou polímeros que ocorrem naturalmente, tais como DNA, RN A, sacáridos, proteínas, ou pépfci- dos, ci c 3 sim como oli .gómeros ou polímeros sínt ét i cos, envo.lv id .OS I ia reacção de afi r irda.de, corantes i n ter cal. a.d.os s cí o "b ain bérn adequados. Podem ser ligados rum .ínóí (oro s a parceí r o 1S CL e afinidad* e prese 11 C 0 S Π ci S ϋ 1 \X C ci O c|(C' ana rito atravê O il0 interacção biológi .ca, tal como iigr içâo bi oti- na/avi di na ou formaçã o de c íomplexo metálico, ta .1 C ΟΙΓίΟ ic o p1ame n t ο ΗIS-ma r c adc
Podem ser ligados um ou múitipios marcadores d·; luminescência a parceiros de afinidade presentes na soluça·; 19 ΡΕ1192448 do analito, a elementos de captura imobilizados na plataforma, ou a ambos parceiros de afinidade presentes na solução de analito e elementos de captura imobilizados na plataforma, de modo a determinar quantitativamente a presença de um ou múltiplos parceiros de ligação de nidade. As pr oprreaaoes espectrosc épicas dos marcadores luminescência podem ser seiecciona das para c orresponder condições par a a Transferência de Energia de Forster ou nsferência de Electrões Fotoinduzic ia. A iumin escência de aceitadores e dadores dependente da distância e concentração pode ser então utilizada para a quantificação de moléculas de analito. aaçao oe molecu ]. a r ' Θ .1 L. 0. d O -T.’ Θ 3 finada :.d.0 v alares o p pvy çí Ί é^r'! ~ Moleci: i. .1. 0 Γ >çy), CT: ·: ^ A quantificação de parceiros de afinidade pode ser baseada, em interacção in e/on intramolecular entre esses dadores e aceitadores ligados a moléculas envolvidas em reacções de Também podem ser utilizadas montagens intramoleculares de dadores e aceitadores de luminescências licrados covaler
terei] te a parceiros de liga Ç 0 ΐ Beacons (S. Tyagi e t b 1 * f N alteram a distância entre dador e aceitador após reaeçSo de afinidade, como moléculas de captura ou aditivos para a solução de analito. Adicionalmente, podem ser utilizados pH e luminóforos potencialmente sensíveis ou luminóforos sensíveis à actividade enzimática, tais como a formação de derivados de fluorescência mediada por enzimas.
Podem ser utíiiz como marcadores trans- 20 ΡΕ1192448 fluorósforos ou seus derivados para marcação de fluores cência, e moléculas quimio-luminescentes ou electro luminescentes.
Compostos luminescentes possuindo luminescênci no intervalo entre 400 nm e 1200 nm que são funcionalizado ou modificados de modo a serem ligados a um ou a mai parceiros de afinidade, tais como derivados de polifenilo e compostos heteroaromáticos estilbenos, cumarinas, corantes de xanteno, corantes de metina, corantes de oxazina, rodaminas, fluoresceinas, cumarinas, estiIbenos, pirenos, perílenos, cianinas, oxacianinas, ftalocianinas, porfirinas, naf talocianinaSf derivados de azobenzeno, diestiril-bife nilos, complexos de metal de transição e. g. complexo de polípirídilo/ruténio, de tris{2,2'-bipiridrl}cloret de ruténio, tris{1,IQ-fenantroIina)cloreto de ruténio tris {4, /-complexos podem ser difenii-1,10-fenantrolina)cloreto de ruténio de polipiridilo/fenazina/ruténio, tais com platina-porfirina, complexos Európio e Térbio utilizados como marcadores de luminescência. Sâo adequados para a análise de sangue 21 ΡΕ1192448 corantes possuindo compris emissão no intervalo de 400 ser utilizados luminóforos dois e três fotões. .ent o de onda de absorção e nm a 1 . 0 0 0 nm. AJ _êm disso, podem adç ;qu; rd o s para a excitação de
Corantes que são adequados nesta invenção podem conter grupos funcionais para ligação covaiente, e.g. derivados de fluoresceína, tais como isotiocianato de fluo-resceina. São também adequados os corantes fluorescentes funcionais comercia.lin.ente disponíveis de Amersham Life Science, Inc. Texas, e Molecular Probes Inc.
Outros corantes adequados incluem corantes modificados com trifosfato de desoxinucleótido (d.NTP) , que pode ser incorporado enzimaticamente em cadeias de RNA ou DNA. corantes adequados incluem Partículas ou
Esferas Qas intarn Dot (Qu antum Dot Cooperation, Paio Alto CA) ou seus derivados ou derivados de complexos de metal oí transição q ue podem ser excitados num comprime nto de ond igual defi 111Q. O f ti O s derivados apresentam emissão d luminescência a comprimentos de onda distinguíveis.
Os analitos podem ser detectados quer através de marcadores de luminescência marcados directamente, ou indirectamente por competição com espécies de luminescência 22 ΡΕ1192448 marcada adicionadas, ou por interacção de dadores de luminescência e luminescência/ aceitadores de electrões dependente de concentração, distância, pi-1, potencial ou potencial redox, utilizados como marcadores ligados a uma e/ou múltiplas espécies de analito e/ou elementos de captura. A luminescência do dador e/ou a luminescência do inibidor podem ser medidos para a quantificação dos anaiitos.
Do mesmo modo os parceiros de afinidade podem ser marcados de tal modo que a transferência de electrões ou a transferência de electrões f otoinduzida. conduz à interrupção da fluorescência após ligação de moléculas de analito a moléculas de captura,
Detectores apropriados para luminescência incluem câmaras CCD, tubos de fotomultiplicador, fotodíodos de avalanche, fotodíodos, tubos fotomultiplicador híbridos. 0 meio de detenção pode ser proporcionado para detectar, adicionalmente, alterações no Índice de rerrac-çSo. 0 feixe incidente pode ser disposto paira iluminar a área de sensibilidade ou todas as áreas de sensibilidade numa plataforma comum. Alternativamente, o feixe pode ser disposto de modo a iluminar apenas uma pequena sub-área da área de sensibilidade a ser analisada e o feixe e/ou a plataforma pode ser disposto de modo a que possa sofrer 23 ΡΕ1192448 movimento relativo de modo a varrer a área de sensibilidade da plataforma.
Cons equentemente r '-s me i o de de t< seção pode ser pr opo rcion . cl 0.0 de um modo aproo rriado pa ra ac iquirr: r o s inal cie 1: amine scên; oia da área . de sensibii -ídad·; s inte si ra f num ún ico pass o de exposição. AI ter nati vamente, o meio de detei ação e/ou Θ X C -i. Γ. ação po ser dispi osto de modc ) dl varrer ar i áre : a. s de sens ibi - 1 i dad e pas ο O 3 passo, 0 dispositivo pc "rde inci u i r um cai rtucho par, loc 31 X Z 3 C 3 O rontra a áre ra de sensi .bilid .3.0.0 da plat aform· par a ooloo ar uma amost ra em con tacto CC )m a ár o p rj, sen síbiiída 0iTi . 0 cartuchc ) p ode con tf rr oui :ros me i o s d· e mod< cl I realizar a preparação, d iiuição, cone·: ri ít i—q açã o, mi stura T" d p. cções bi c> / 'químicas, s< epa rações, da ar ra num £ ormat< min iaturiza r-\ r-> (ver WO 97/ 02: /57). 0 d ispos itiv ro E ) o cie i. nciui. u.m. di sposi' ti- vo de tipo rn icrot itu7 !. 0. Ç 3.0 pa: 3 conte r um. plu Γ.'·3. .1 .1 dS.d.0 d e amostras a serem inve st iga H p Ά invenção se rá agora descr J. C 3 a ti tu 1 o d< exe mplo ape na s com partie n li rir rei erê n c i a. 3 O S der ;enhos que . aco mpanham: FIG. 1 é uma ilustra CãC ) esquemá de um dispo sitiv< de cont ro lo de quali dac ie para anaii sar 0 s parâ metro óptreos Θ a condição de ressonância < esc ente : de um. plataforma de sensor. - 24 - ΡΕ1192448 FIG. 2 é uma ilustração esquemática de uma plataforma de sensor. FIG. 3 é uma visão esquemática apresentando o perfil de campo evanescente em relação à plataforma; FIGS 4a e 4b são visões esquemáticas apresentando um cartucho em ehrp; hi o -j aprese mta . um pi; ;L Π 0 em matr: lz r rum exer PP 1 o da pr es ent e invenção FI z"’ '0 apres enta es; rueri rati carne nte 0 "P lano irtiirz ado pa '£ 3. me ;dir ff uorescên cr a; s de ; a c ordo com um exe mplo da in ve nçã G f FI >"7 aprese nta uma cor ripar ação de resi iltac i Q p. obti dos po r uma técnic : a d a av ; ;e a .nter :ior Θ 31 Ο Γ Θ 8 ;en te ru vençi mo; hi o 0 ilustrs L fO rmas ait itivi as de pia Ltafc ir ma / d J_ C’ r\ _ r; d cl 9c apre c; rd tam ima igens de fluore :SCêil C 0 d Ob ti das dp Ó 8 inci ubaçã . 0 C ie 3 0 pí 4 de anali to PM f re ge ne r a cao , e 30 pM de ; anaJ Lite MM, utr 1 í z a .nciG 3. }Z irese nte pi at afo rma em con diçõC gS c ie r< ssso nância cc dlPO c iesc rito no Ex em pio 5, e 25 ΡΕ1192448 FIG. 10 apresenta imagens de fluorescência e resultados obtidos utilizando a presente plataforma sob epifluo-rescêneia e condições de ressonância como descrito no Exemplo 6. A invenção será descrita em termos da deter-mrnaçâo de luminescência excitada nas amostras. Esta determinação envolve a utilização de uma plataforma de sensor que constitui um aspecto da presente invenção, mas será entendido que a utilização dessa plataforma não está necessariamente restrita à aplicação particular a ser descrita. A utilização da plataforma está restrita ao processo definido na reivindicação 1. Antes de descrever a plataforma em detalhe será fornecida uma descrição em termos gerais sobre o modo como a plataforma pode ser utilizada para determinar a luminescência das amostras.
As seguintes são definições de termos que serão utilizados na descrição:
Plataforma: um transdutor/chip inteiro contendo uma ou uma pluralidade de áreas de sensibilidade de sensibilidade: uma área corrugada de criar um campo evanescente por inteira capaz um efeito de ressonância e contendo um ou uma pluralidade de elementos de captura 26 ΡΕ1192448
Elemento de captura: um ponto de sensibilidade individual contendo uma ou uma variedade de espécies de moléculas de captura
Molécula de captura: uma molécula individual capaz de uma reacção de afinidade
Nos exemplos seguintes, todas as temperaturas estão em graus Centígrados e não foram corrigidas.
Em referência à FIG. 1, a plataforma utilizada, na presente invenção é apresentada em (10) e pode receber luz coerente de um laser (11), tendo sido a luz do laser expandida por um conjunto de lentes (12, 14), que produz um feixe expandido e paralelo (16), e polarizado por um polarizador (18). Como será explicado em maior detalhe mais tarde, a. plataforma (10) possui uma área. de sensibilidade à qual estão ligadas moléculas de captura. O comprimento de onda da luz estará tipicamente na gama de UV até â gama de NIR, preferencialmente entre 350 nm e 1000 nm. G dispositivo também inclui um detector (20) que pode detectar luz transmitida através da plataforma (10), uma câmara CCD (21) paira detectar ai luz refiectida e uma unidade de processamento de resultados (22).
Na utilização do dispositivo um feixe laser altamente paralelo, expandido, coerente, linearmente polarizado, (16) é condicionado a incidir na área de 27 ΡΕ1192448 sensibilidade da plataiorma (10) a um ângulo apropriado e a luz trana mal tida atravé bú '.U.CI plataforma é deteetada peio de te ctor (2 0) e a luz refle ctida é regis' tada pe^a câmara CGD (21) , 0 diâm etro do (.; i. X ú; i de excitação expandido excede o tamanho da plataforma (10) . O ângulo de incidência do feixe na plataforma é ajustado por rotação da plataforma até que o detector (20) detecta efectivamente que não é transmitida luz através da plataforma. Isto indica a existência de uma posição de ressonância na qual a ressonância evanescente ocorre na área de sensibilidade da plataforma. Nesta condição, a intensidade da luz reflectida registada pela câmara (21) atinge um máximo e os resultados da câmara são adquiridos pela unidade de processamento de resultados (22) para processamento,
Voltando a.gora. à Figura 2 d.os desenhos, uma forma de realização da. plataforma (10) compreende um substrato de vidro (30) em cuja superfície de topo do substrato foi inserida uma pluralidade de sulcos (31). Uma camada de óxido de metal opticamente transparente (32) é depositada na superfície superior do substrato (30) e essa camada (32) também tem aí formado sulcos (33) . O substrato (30) pode, por exemplo ser formado de vidro, tal como vidro AF45 produzido pela Schott e tipicamente possui uma espessura de 0,5 mm - 1,0 mim Será entendido que podem ser utilizados outros materiais orgânicos ou inorgânicos paira o substraito, desde que sejam opticamente transparente.
clIUclC )pt :amente transnarente é um ;xic 28 ΡΕ1192448 diel .éctríco tran sparente de pellc ula metálica, tal como ifCb com um índic e de refracção ele V 3.0.0 f de aproximadamente 2,2 a um : compri .mento de onda de 633 nm, i.e, signifi- C cl l, 1 .vamente ma is elevado do que 0 índJ l c e de r e t r acçã 0 cm substrato. A espessura desta camada estará tipicamente ao intervalo de 50 a 200 no ou superior, e.g., 50 a 300 nm. As estruturas corrugadas (31) e (33) possuem um período no intervalo de 200-1000 nm, e.g. 200 a 500 nm, tipicamente 250 ··· 500 nm. A profundidade das estruturas corruga- exemp i c : / ΤΓ. 3. u. S como T2O5, Ί Ή NbvCq, . 3 i. O u.Tíi.d. . t. al como a apresentaaa 5 n a Figura paralelo d.0 luz laser polari: cada incide i. 0 cie ín Ía êncí a particular, 0 c 0 2 vre um como r βί. Lex; lo a normal na ca ma d a (32) . ocon '0 π 3 c transmitida, si u b s t a ncial- atravé s da p 1 a. t . a f 0 riria (1 0 ) s ϊ efe ctiva- reflectida na c amada (32) de modo a que rle es tá C O j af rnr ada à camada mu í t í a fina tal. 0 C c rmpo de laser elevado resti Itante ramado pa 3. fora i da camada (i 32) c riando e que exc a eva mescentemente 0 ma terial das/sulcos de difracção pode estar no intervalo de 3 nm até à espessura da camada opticamente transparente, preferencialmente 10 nrn até à. espessura da camada opticamente transparente. O óxido de metal pode ser qualquer um de um número variado c ZrCp, Zn O, ou Hf O; 2, quanao um r nesta com um efeito conheci Quando este ei mente nenhuma fluorescente que está na superfície ou na vizinhança próxima da camada (32). Deve ser salientado que esta 29 ΡΕ1192448 condição de ressonância pode ser alcançada apenas quando são empregues sulcos difractivos (31, 33) possuindo uma profundidade particular ou superior e deve ser também referido que as per das de radiação de uma tal estrutura corrugada são muito elevadas de modo a que não ocorra nenhuma guia de onda eficaz, de nenhuma radiação eiectromagnética no intervalo de comprimento de onda preferido, na camada de óxido de metal (32) . É preferido que a profundidade dos sulcos seja, pelo menos, 10 nm mas a ressonância evanescente começa a formar-se com sulcos mais rasos. Todavia, desde que a amostra a ser investigada esteja na vizinhança, da camada (32) na qual a ressonância é criada, o campo evanescente aumentado pode ser utilizado para excitar luminescência, tars como fluorescência na amostra.
Uma característica importante da presente plataforma é que a amplitude deste campo evanescente na posição de ressonância é significativamente maior do que a dos arranjos da. arte anterior (epifluorescência correspondendo à condição de ausência de ressonância) por uma ordem de aproximadamente 100.
Isto significa que a intensidade de luminescência, e.g. fluorescência, que pode ser criada a partir de amostras é também aumentada por um factor de 100. A função da plataforma pode ser vista em termos da estrutura difractiva actuando como uma rede de difracção de volume que difracta a luz e em que os feixes difractores inter- 30 ΡΕ1192448 fer em c riando a c o n d r ç á o ref iectr da da primeira ri int er f ac e de tu IP o, que é (32 ) int erfere construtiva: íTLcí . Sob condiç ões de res SUO1 stanc ialment e confinada condição de ressonância em que a luz .nterface e a luz reflectida cia e ê a superfície superior da camada ti 3 Ό 0 S 31 indo a reflexão máxi-energia do laser é da camada fina (32) aumentando deste modo a intensidade do campo eléctrico.
Para nm determinado comprimento de onda do laser e periodo da estrutura corrugada, a ressonância é dependente do ângulo. A ressonância dependente do ângulo possui tipicamente uma largura com metade da altura máxima (FWHM) ( -| O J / de modo prefi er i dc 0 O ou su per.i L Ο Γ θ o y 1,0° sup e r i o r Esta iargi era. de res S O Π 3. Π C i 3 é c lepe : ridente pro fundi dade dos sulc r\ c do "dut y cycl e" < bi ã ^ Q0 ometria Θ 31. rutur a corrugada. Con n.pa.rada. com 0 comp i Ο Τ' 0 amento a.co pi ame nto de uma r ede de difraeção de gn.í a c ίθ onciu f FWHM da rPssor'á;mí s d* escri ..ta. é si uperioi: ; em. mu i tas ordens < mag ni tud Θ V Será entenc i i Η n que os sulco s d .0 Ci. ifr; acçâo (3 33) pod em ser forir ! 3.0.0 S numa p 1 ata f ΟΏ na. por técni c con v e ri c i o na.is aproprí .adas . Uma forma de com; ;egu .ir isto gra var o s sulcos atra' "'és c íe uma técnicc i fo togr áfica. West uma comp •osição de fot .orre vestimento é oep; o s i t ada na supe .ç ' ie do substrato a uma profundidade de apr o adamente pm. uma estrutura pe: riódi .ca cor respondenc .o a urm a formaç C|o sulcc ϊ 0 0 O Lei O Q X ri CUtlcl no re- vestiam ; Π 10 quí r. r- : através int erfer ometria/holog. rafia de dois f eixe s ou pe utilização cie uiru Η o -F tt c: a·, o r] ^ rr r\ ί -i f~\ -v ,·-Λ τ 7 /-. ^ ΡΕ1192448 31 gr 7-\ >' ado C( sm ÍX na técn i C CL de T- cavação com : iões react 1 V Ci ut il izan do gás ár gon .C O 1 ina lm e n t e o ma ter ral de fo 1: iv -L x 0 ve stim en to lesr dual ó X 0 mo ViGO O'· a sup erfi cre. E st té on ica po de SC Λ jX' Χΐ tilr Z 3clcL par :a x Cd XTfUb. i. tanto 0 s s ulcos ( D) ·'. X X co mo os C‘ ' ' ,lc< ss (33) c mtr C' ·°ι modos de inço rporar 3 tr utur 3.3 c or: iuga . 0- 3 3 incl uem Cf x 3 V cL 0'- 3 0 em re levo , grav a ÇcL por feixe de electrões, ablação a laser, processo LiGA.
De rm a preparai ma plataforma t o em u.t 111 z devem
Fiaur referência (d X; numa. me d e r seguidos ta: rios p 2 de modt como a 11 u ocessos. do tipo descri-que possa ser da na Figura 6, Ç) primeix o pas s o é Limpar 3. piatai :orma pa -C 3 remos i0 r imp' urezas r-\ a supe r f i c i e da. pia i.taf orma, 0 proces de ].: Lmpeza pode s ;er alcan çado pc í r uma va.r i. Θ 0.3 G6 de meio k-: / por exem.pl c ! por m€ d 1 0 d Θ um di sposit 1 vo de 1: ίmpeza p o r ultra ivioletc :j., por 1.1 .mpeza de pias ma, ou poi : limpe iza quími C 3 ut i i i 7 a d n rnateri 3 X s tais ; como ácidos , b ases, solvente O f gases > e liqi iíoos - A ssrm c [ue a piatafí orma tenta sido . i. impa, O O fi s s o 3 ^ g ain L 0 0 ap 1 i c á super f icre da; camada de óxido de me tal, uma camada d e um age: nte de um promot :or de ades 30 * Es ta cama d a é apl ic 333 cl prata forma uma vez que os el emen tos c 1θ C il P tur a que se ; vão depositar na pl cl 0 3 x ϋ riria PO dern nao i Ldexir r ap i c lamente à prc •pria camac ia de óxido de me tal. uxr s tem vá rio S i modos a ltr avés dos quais a cam a da p ode ser f c irmads l . Um mo d .o é forir iar uma l camada d· e uma rede ΌiTi 32 ΡΕ1192448 molé C Li la s de si fano 0 : outro i mc o V e u l dliz ar aquela s que S cl O conh 0 C rd as como mon .oca madas a uto- -mon Cada; 5 (SAM). Es r a s são técn ic P, P conhec idas qu‘ e serã iv óbv das para o especi ai is t a na técn ic a. A s í 1 a niza cão , por 0 xenij ;;lo, pode env ver uma fase li quida ou Cí cl ic O o cl, é Q. S C C ita em Coll ei ds and
Interface Science 6, L Boksanyi, 0 Liardon, S Kovats, 1976,95-237. A formação de monocamadas auto-montadas é descrita, por exemplo, em "Ultra thin organic films" por Abraham Ulman, 1991, Academic Press inc. Adicionalmente, existem outros métodos disponíveis para a imobilização de elementos de captura tais como modificação química da superfície do chip com grupos reactivos e das moléculas de captura com ligandos apropriados (U. Maskos e E.M, Southern, Nvcleic Acids Research 1992, vol. 20, 1679-84) mo a ί ficaçã G moléculas de super T "! f'' ie e le ca ot ura C om 1 i ga ndos/g r upos fotor.ro r a c t i. v o s (WC 98 /2743 Q pr WG 0 .L /1 6425) Im ob ilizaç ã.o at ravés de in teracçã 0 C o u .1 onr mica V *-J P C 4 — O / 1., 9 9 0 A 2) ac op larnent O at. vave.s de marcador Θ S (por exerr P / p.r. 0 ~ te in a-’!tag 5? , Hl Q „ F? i- .-v F? ' C Lcd-j } em reacções c luelai ites e v ε .rios Oi itroi métodos , Por exe mpl o con .o de. d v.^ ri t vd em Me 1- Lií eds ii En z y rnology A cademic P 0 0 S s, Ne w 1 o :k , 1 Ic Mo Q h·’. acher (ed. ), Vol. 137, Imr loba lisec ‘-V-‘ iiá yr JGS nd Ce 11 s, 198 8 • im Ob iiizaç ao/cr iaçâo inc .uzida põe pi asma d0 C am a da de Pr on oçâo c [f : a d ssâo cont :endo gru) oos func ionai / 0 / rea ct 33 ΡΕ1192448 vos, que permitem o acoplamento directo de moléculas de captura ou moléculas derivadas de captura, ou acoplamento indirecto de moléculas de captura ou moléculas de captura derivadas através de ligandos químicos ou ligandos fotoquimicos.
Uma camada promotora de adesão pode ser produzida, por exemplo, por siianizaçâo com 3-(giícidoxipro-pil)trimetoxissilano (GOPTS). Compostos contendo grupos nucleofilicos tais como aminas podem reagir com a função epoxi do s11 ano, de modo a ser imobilizado covalentenente, Essa siianizaçâo pode, por isso, ser utilizada, e.g. para imobilização de anticorpos que contêm grupos amaino múltiplos, uma vez que os anticorpos consistem em. aminoácidos. Adiciona.lm.ente, as cadeias de DNA/RNA/PNA como moléculas de captura também podem ser modificadas com grupos ami.no de modo a ligar essas moléculas de captura covalentemente à plataforma, como apresentado no Exemplo de aplicação 4 (discriminação SNP). Neste exemplo, os oligonucleótidos com função amúno foram imobilizados covalentemente na superfície da plataforma. Todavia, outros tipos de moléculas de captura podem ser modificados para este objectivo. de modo a manipular
Adicionalmente, uma camada promotora de adesão pode ser ainda modificada quimicamente de modo a alterar as propriedades de superfície. Por exemplo, uma plataforma silanizada com GOPTS pode ser feita reagir com moléculas /derivados funcionalizados saturados ou insaturados orgânicos/hetero-orgânicos/inorgânicos 34 ΡΕ1192448 o equilíbrio hídrofóbico/hídrofίlico da plataforma, i. e. alterar o ângulo de contacto da plataforma. Além disso, compostos iónicos ou potencialmente iónicos podem ser utilizados para criar cargas positivas ou negativas na superficie da plataforma. As moléculas de captura podem ser ligadas quer covalentemente ou por fisisorção ou por ínteracção coulombica de moléculas carregadas ou por uma mistura destas a essas superfícies/plataformas modificadas. Isto é demonstrado no Exemplo de aplicação 2 abaixo, em que é utilizado 3-amino-l-propanol para modificar as carac-terísticas de superficie da plataforma síianízada com GOPTS num segundo passo de reacção de modo a imobilizar moléculas de captura de DNA/RNA/PNA. Neste exemplo o azoto (grupo arnina) introduzido na superficie da plataforma é quat.er-nizada por protões e proporciona, por isso cargas positivas que interagem com cargas negativas do DMA (natureza polieleetrolítiea). Em vez de 3-amino-l-propanol também podem ser utilizados outros derivados orgânicos de aminas, e.g. aminas alifáticas, ou aminas alifáticas ramificadas, ou aminas contendo estruturas cíclicas aromáticas ou não aromáticas, ou aminas contendo heteroá. tomos, ou aminas contendo grupos funcionais, ou aminas contendo combinações destas para a imobilização de moléculas de captura, e.g. cadeias de DNA/RNA/PNA.
Podem ser utilizadas moléculas orgânicas funcio-nalizadas que proporcionam cadeias de hidrocarboneto para tornar a plataforma miais hidrofóbica, podem ser utilizados grupos polares para tornar a plataforma mais hidrofilica, 35 ΡΕ1192448 ou podem ser utilizados grupos iónicos, ou grupos poten-eialmente iónicos para introduzir alterações. Por exemplo, pode ser utilizado polietilenoglicol (PEG) ou seus derivados para tornar a plataforma hidrofílica, o que evita a absorção não especifica de proteínas à plataforma/superfície.
Podem ser ligados grupos reactivos ou fotor-reactivos à superfície da plataforma, que podem servir como grupos âncora para outros passos de reacção.
Pod.e s er obtida uma SAM como camada promotora de adesão s.d.equads l para. imob.i lizaçã.o de ant :. i corpi os por tra t.am Θ .0. L 0 d. 8 I olatafoi cm a. co: rn alquilfosfa .tos anf i fíli cos (e, o. fo sfato c le este ar i 1 o) 0 grupo fc · 3 T. 3. to pr incipal y' 0 ge com . os gru pos bid roxi ! na. superfície d. 0. p J. 0 "C. 3. forma e con ou z 0 formão :ão de uma monocamada. ord* enada doí í an.fr- fí 1 i o o s alqui if> osfatos cadeias alcrui lo hidro fóbicas tor nam cl supern cie da p .1. 0 Ϊ. :.af orma hidrofób: ·; C'· Ç, e des se modo per mi t em a f i s í sorção de c in t .ícorpos, como a.p oa.d.o no Exe mp ]. o d .e aplic ação 6 {imu. noensaíos muitíp iex; ados). Também pode ser ui ilizada uma í >AM para a imo- bil iza ÇãO de out ras mol écul cL S de capturai, e * 9 ° para C 0.0.0 0 0. s C|o DNi l/RI SiA/PNA. Neste C 0 S C J r também podem S 8 r u l j_ lizados fos fat ,-'n r· / •-O O / fosfato s modíficad C· S anfifílicos « a, g. , com grupos amí na OU q r up o s epoxí. As mo iécuias de captu ra pof iem ser que r 0 C C spladas direct camer ite à SAM, e. q, a u! ma SAM mo d if i cada com amina, o u 3-p ós a plataforma ter sido reagida 36 ΡΕ1192448 cora derivados orgânicos de aminas, e.g. aminas aiifáticas, ou araínas aiif áticas ramificadas, ou araínas contendo estruturas cíclicas aromáticas ou não aromáticas, ou arai nas contendo heteroátomos, ou aminas contendo grupos funcionais, ou aminas contendo combinações destas, ou quaisquer outras moléculas orgânicas, hetero-orgânicas, e/ou inorgânicas (e.g. SAM modificada com epoxi).
Uma camada promotora de adesão pode consistir em camadas múltiplas de modo a manipular caracteristicas de superfície, e.g. bidrofobicidade, ângulo de contacto, densidade de carga. Adicionalmente, uma. camada. ligada, à plataforma com qualquer um dos métodos acima mencionados pode proporcionar ou introduzir funcionalidade quimica que é necessária, quer para a camada seguinte, subsequente, ou para. o acoplamento de moléculas de captura, ou derivados de moléculas de captura. Urna ligação de moléculas de ligando químico ou moléculas de ligando fotoquímico também pode ser vista como uma camada intermédia que permite a ligação de moléculas de captura, à plataforma.
Esta combinação controlada de camadas/moléculas com diferentes funcionalidades, em gerar, é atribuída como Supramolecular Chemistry (J-M. Lehn, Supramolecular chemistry - Scope and perspectives, Molecules, supezmolecules, and molecular devices, {Nobel Lecture, 8.12,1987), Angew. Chem. Int. Ed. Engd., 27, 89, 1938,). A estrutura supramolecular obtida proporciona uma funcionalidade que difere da funcionalidade das moléculas indi- 37 ΡΕ1192448 vidu ais itilizadas j; a r a as caimadais ind ividuais. Pai Lra a pres ente invenção, uma camada inte rmé o i ai t ai mo e m pode intr oduz i j : rumínóforo s num tal sistema;. 0 cariada, que pode ser uri lizado quer como dador de ene : X" Q JL cl O li ei C eita- dor/ inib ic :1o r de enei :çía : no sentido Cl d Transferênci .a de Ener gra <3 .e Forster (FRET) 0 Li d. li Cl 1 i S f 3 rên O 5 <30 0 i 0 Q troes fotoinduzida, ou iuminoforos sensíveis potenciais, antes de as moléculas de captura ou moléculas de captura modificadas serem ligadas à plataforma.
Para os métodos de tratamento de superfície acima descritos, podem ser utilizadas as seguintes moléculas orgânicas ou inorgânicas e seus derivados: ami 11 cl 3 / ami nas ; roc iif icada.s, jef f aminas , amin al i f át icas , álcoois, 8' eidos, alde idos, cetona s, ami da. ar; i d. ri. nnp- . fosfatos, í :osfonatos, su i f a. ros, s ulfonato 116 O f atero-átomo contendo compo stos, rnolécal mát j cas e al i f; -x 1". i cas i c a. s funcj o mo.l 0 c u aromá ticas 0 a 1. .11_ ã t.". .1 c a s beter o-orgá; nicas, po.l irre r o s naturals 0 artificiai; s, si i ti r·, /-t c- ... j. j. u_. i molécul mo d. r .l. .l Pdvi Cl s com O rupos a cr ar vos qu ín l.j. C O >io fot OQU imic os, seus de rivados e tuncionalize idos, e. derivados funcionalizados ómega dais espécies listadas.
Em principio, parai a construção dais estruturas de camada consistindo numa ou múltiplas camadas, são necessários grupos químicos reactivos e/ou grupos químicos possuindo propriedades especiais físicas ou electroquímicas 38 ΡΕ1192448 (e,g, cargas) para as moléculas utilizadas com todos os tratamentos de superfície acima descritos. reacções os/inor cas/ ca/e com
Podem ser empregues quer interacçõe otoquímicas (e.g, adição, substituição nu ectrofílica, reacção radical, condensação, derivados carboniio orgânícos/hetero-orgâni gânicos, ou reacções foto-induzidas, ou reacções termo-induzidas, conceito de ácido/base de Lewis), e/ou interacção física/electroquimica (e.g. interacção de Coulomb, interacção bidrofóbica/bidrofilica), e/ou interacção biológica (e.g. antigene/anticorpo, brbridação, interacção Estreptavidina/Avidina-Biotina, interacção ago-nista/antagonista), e/ou interacção fotoguimica/fotofísica para. acoplamento entre moléculas/componentes incorporadas nesse sistema de camada/camada de promoção de adesão. A promoção de adesão também pode ser alcançada pela deposição de camadas de microporos ou géis na superfície da plataforma, as caracteristicas/funcionalídade de superfície das camadas microporosas ou géis facilitando a siçac ) de ereme: O cL C cl C 5 necessár. ções subsequent nder compostos s, m ontagens itu odem compreende. L. ri 0 ; cerâmica, tos de captura encurtando o tempo de o e aumentando a sensibilidade das ;S. As camadas microporosas podem com-orgânicos tais como polímeros, mono- 39 ΡΕ1192448
Pode ser produzi da uma camada de promoção j de ad .esão por siianizaç ão e.g. ut . i 1 i z a ndo 3- (gire :idoxiprop il) “ tr imetc !XÍS silano (GO Ό rp C’ 'j J\ ca nada promotora c ie adesão pode se r ai i i Ci. cL modificao ia quim: t O cL mente de modo a alterar as pr oprie es de sut ;erf í cie • Por exemplo f u: na plataf orma ÍC d. laniz ;ada com GO PT; 3 pode se; r fei ta reagir com moléc ulas or cfânr cas í’1- incion al. 0- zó Cl d ia s satura; las ou r nsaturada .8 d e m o ci a mani pui Cl d. o equ .il íbr io hidrof 6. bic o/hid rofilico da pia c a fo 1 TIVidL y a s sim a It era: ndo o ángi ilo CóG ( nontacto da pia ta f 0 rma . Utí ia ve z f orm. a da a cama . G 8. prorm atora de ade S 8.0 n pi ataf ort, a t poderr ser ne c θ s s a τ ΐ ( m a um ρ asso ou. pas; 10 r ~'· d"; d' 1 r mpez 3.dl ciona; ί s pa ra remove r t a exi cesso de pr Odu to Qp 1 ímic os ut; iIizad 0 8 π a Ό i 'epara cã o c ΐ θ s s a camada.. Αρό 8 Θ s s cara receber limpeza, a plataforma está então pror elementos de captara. uma matrnz n i ca ί nen s · ο π 8 > de i eme'· onhecimento na superfície 3-D da canv oreviamente depositada na taf orma matriz de elementos de capturai pode ser depositada numa variedade de formas. Técnicas que podem ser utilizadas para tar eier nentos de captura : Lnc lu· em impress ;or d 13 de j ac to ta que i Xissuer n actuadores P ez oeléctricc \ C‘ •( ciC tuador cl·, c; orna gnét; i-cos, actuadores c le vá 1 vu I a. de pr. ' 8 S S â o / 'sol. 0 ” ou. out.rf Λ O v· p r nsdutores de f o rç a; impress : ρ γ as d-Θ j ac to ..ha. Q“! 1 Cl· fazem u. S O Ci Θ 8. C l ' ) i p ρ; ,·-·λ y es termoe lé ctr ico C f ou 40 ΡΕ1192448 actuadores de laser; impressoras de "ring-pin"; "pín tool-spotters"; síntese em chip, tais como os descritos em u W092/10092; síntese de polímero imobilizado em ίπ s c )3.13. muito g de (VLS IPS) , t. ai comc ; o t.t W KJ 98/2 r7 Λ —. Γ\ / *‘í 3 KJ ; fot< oa; otd :/aç cl o/f 0 todí 2spr< st.· ecção 0iTi y'c: d C- L. vos de cor cepçc lO 0 spec d.al anc o r ados numa G 3. C 31 nada de prc moção d.0 30Θ são; ímpre ssão C 0 ritacr to; caneta s G6 Θ 3 r·' r i t a de m.ic rc •conta cto; f otoqr ripo; desenho ou almofada de transi erência/car inibo de elementos de captura; canais de microíluidos e fluxos de células produzidos enca.stoa.ndo a. partir do polímero, tal como masters de PMMA, ρ o: r exemplo utilizando PDMS (polidimetc >xíssilano) ou por meios micromecânicos ou mecânicos, ou produz idos por técnicas de gravação para O 3 0 ° ou cepos: IÇ 3 Cí G j_ utilizando um. qual .quer outra te·· distribuição local de elementos de captura; estruturação de elementos de captura por fotoablaoão; elementos de captura em almofadas ( técnicas previamente mencionadas c de fotoimobilisapão.
Os ele mentos cí0 ca ptura G i, i. T 0 C ondeeimento que podi em s ;er d.eoosf·! za.d.os ns 1. p 33 G õ a. forma são mun .tos e vara ados. De um η rodo c feral , a. s mo ] . écu 1 a; a de c apl rura i utilizadas < devem ser cap azes de re ;acções de 3 3 3 nidade . I ilxempl Los de molé cuias C1P reco nheci mente ) ou cap tura q ue pod .em ser : utilizadas com a pre sent e pia taforma são como s e segu e: nuc. ieótrc JiO 3 y oligonu .cieóti . G 0 G \ e seus derivados qui- mi o·: os) DMA (cad·: da c tupi a ou cadel .a simple s) a) linear (e ÇPtl C‘ O ·-_ Q(~' Ρ/ rvados químicos) 41 ΡΕ1192448 b) circular (e.g, piasmideos, cosmideos, BACs, YACs) RNA total, RNA mensageiro, cRNA, RNA mitocondrral, RN artifreial, aptâmeros de PNA (ácidos nucleicos pépti dos}
Anticorpos Policlonais, Monoclonais, recombinant.es manrpulados, antigénios, haptenos, proteínas subunidades de anticorpo FAB (modificadas s necessário) proteínas modificadas, enzimas, cofactores ou inibi dores de enz imas C1 ompiexos de pro teíi na, lectin as proteí Π 3 S mau CG d. 3. t 5 com Histidin d. f συ ela.ntes pa.r cornpon entes Histid: I. Π G' -tag (HlS-tag ) . pro teínas mar ca G G S f anti corp os a V- -p “ ficiais, impr • 0 3 s õ 0 8 molecular 0 8: piast1 c o rp , ;-R O recept ores G0 mernb ran a, células cormo] . 01. G s, fra.gm.en L 0 célula .1' Θ 8 0 S U bestr :ut.i: iras celulares ri ; i n a τ ises, agoni S X as/ant agon is ta s, c élu las, organelos (Ίθ célula, e , g micros soma s pequen as m L 0 .1. Θ C ulas A G I. s como benzod: Í.azí; jpin r*. • dl O f prosta gian dr na s, antibi ót í c O s f tá rins I.C0E metabolitos , f :árm acos de me X G boiito s produt os n .atur ais hidrat o S d . 0 0 Cl rbono e derivados ligand os n atur ais e ar tifrciais esteró ides , ho rmona C; péptid o s políme r 0 S na ti vos o u a rtificiais sondas mor ecui ares 42 ΡΕ1192448 receptores naturais e artificiais e seus derivados químicos agentes quelantes, éter em coroa, ligandos, montagens supramoleculares indicadores (pH, potencial, potencial de membrana, potencial redox) amostras de tecido (micromatrizes de tecido) A actividade ou densidade das moléculas de captura podem ser optimizadas de várias formas. A plataforma com os elementos de captura nelas d.eposita.d.os pode ser incubada numa atmosfera saturada em vapor de água durante um determinado período de modo a re~b.idra.tar os locais impregnados, Isto opt.im.iza a densidade das moléculas de captura, i.e. aumenta, os locais disponíveis para ligação por unidade de área, Subsequentemente, os chips incubados podem ser cozidos durante um período definido, diga-se 1 minuto a 80°C para moléculas de captura de cDNA. A plataforma pode ser lavada por lavagem com uma pequena quantidade de água. pura ou quaisquer outros líquidos adequados ou soluções para. evitar contaminação cruzada d.os elementos de captura por excesso de material não ligado. Após estes procedimentos, a plataforma preparada pode ser elementos armazenada num excicador até utilização. Antes da utilização do chíp, pode ser necessário um. processo de lavagem adicional com 0,1 a 10 mL de tampão de híbridação ou outras soluções/líquidos adequados para reactivar ,/re-hidratar os elementos de captura secos e para remover ainda os elementos de captura não iigados/resíduos de tampão em 43 ΡΕ1192448 excesso . No caso de moléculas de captura de DMA, o process- de lava .gem revelou- se o ruais eficaz quando realizado a um. tempera tura entre 5 η ^ q o o r-
Os passos de processo para o manuseamento do chip pode ser automatizado através da utilização de estações de hibridação, tais como, e.g. a estação GeneTAC® Hybri-dization station de Genomic Solutions Inc., Michigan, EUA. A técnica de medição particular a ser descrita é aquela que envolve luminescência, em particular fluorescência, Ao realizar uma medição, uma amostra, a ser invés- to.Cf3.cia θ colocada na. área de sensr.D ii.ida.de aa pi a ta.forma, na qual os elementos de captura foram proporei onad. os, De modo a. aicanç ar fluores icencia., os f l.uoró foros são adi cionados ao sistema q, t rr c ,-1 a medição ser re 3. J. o. Z3.d.3 Os fiuoróforos lern ser adicionados à amostra, por exemplo como parceiros cados, embora i também elementos de oaptur se no facto de a ernr eja possível ligar na plataforma. As ão fluorescente d.os elementos de captura, contendo moléculas de captura marcadas Θ / O li S o parceiros de afinidade marcados ; s e r a i terada sua inte sracçâo com o analíto o u amostra sob ín ive s t i g' Pocle ΓΠ. S 3 r utilizados ir larcadores de diferen Lte com iprimen onda de excitação e er rdssão, ss ;ndo um ou v a. r i o s marca cl "í z θ rent es, sendo o Ift 3. Z C cl Ci O '£ 1 para um a expf iriênci controlo e o marcador 2 para a experiência.
Figura 3 apresenta esquematicamente o perfil 44 ΡΕ1192448 energia do campo evanescente na posição de ressonância e como se estende para lá da superfície da camada de óxido de metal (32), de modo a que possa excitar fluoróforos numa vizinhança próxima da superfície da área de sensibilidade, e.g. fluoróforos ligados a moléculas de captura ou fluoróforos ligados a moléculas ligadas às moléculas de captura (38) . 0 campo evanescente diminui exponencialmente até zero em aproximadamente um micron. S e r á entendido que, ao r 3 d -I__l Zi cl o. uma analise, s ci o realizadas uma i. ou imurt lpA. cl 3 me d ições* Uma pode ser a medição de fu indo antes Gô a. a.t tio st ra ser colocada em contacto com os elementos de captura. Uma segunda med: pode ser rea lizada com/após a amostra ter sido colocadí contacto com os elementos de captura., Para. comparação amostras múltiplas, por exemplo amostra "controlo" e "tra rada." em exper o.ênC. ias de exP: ressão genéri ca, o chi; pode S θ Γ regenerado apo S cX experlê nela de "eont rolo”, com· p O rito no exemplo de apl: i.cação 2, e i oode se r registad. ma i s uma medição de fun do e uma me dição após/co m a amostr. "tra rada." (foi.) apl: j. cadt .1. a o chip. 1 :ara ga nha.r in .formação e; rei. a. v cX 0 3. cinética d.0 u reacç :ão dos P a r c e / rros de arinidade pode ser registado um con j i unto cc impieto de me·. dições com· uma f unçã o do tempo de incir o a Ç ã ϋ 0 /ou te: mo de p iós-lavagem Um s irr an j o trpico p ci x' a uma tal m Lediçâo é aprt ssentaLdo n Figu ra 6. A platafc ;rma apre sentada l na Fi .gura 2 0 ci j :.i S t clQ· para o ân· guio no qu; al a ress :onâncic i evane scente é aicançad, 0 0 reai .izada uma mec iicãc • dCl J_ iuorescêncra emitida d, srficie da plataforma, utilizando a câmara CCD (66). 45 ΡΕ1192448
Isto proporciona uma indicação da fluorescência emitida de cada posição na matriz de elementos de captura depositados na plataforma. Isto pode ser analisado para deduzir a afinidade das reacções que ocorreram entre os elementos de captura e a amostra sob investigação.
Um arranjo como apresentado na Figura 6 captura a luminescência total, e.g, fluorescência, imagem da plataforma inteira de uma vez, sem a necessidade de quaisquer partes moviveis durante a medição. Esse dispositivo, sem ser de varrimento, pode ser muito simples e barato e é especialmente adequado para aplicação no consultório ou em sistemas portáteis. Outro arranjo típico confina a luz laser coerente até dimensões de micrómetro, por meio de elementos ópticos, aumentando assim o campo eléctrico no ponto focal e varre a área ou áreas de sensibilidade.
Será entendido que uma vasta variedade de amostras pode ser analisada utilizando a presente técnica. A amostra é geralmente considerada como a solução total a ser analisada e isto pode compreender uma ou muitas substâncias a serem detectadas. A amostra pode ser uma solução de tecido purificado e processado, ou outros mate :rí ais obtidos pc >r biopsia e exaii le de investigaç! 3.0 de pesq Li d- S cl 0 desenvc )lv imento incluindo amos t", Γ cl p 3. Γ cl ef er t os C|o diagnó stico. A amostra também pod e ser i rm me ro bioi ógico, tal cc no gema de ovo, fluid -os corpo rai . 0 ou componentes destes, tais como sangue, soro e urina. Poc também ser água de superfície, solução ou extractos c 46 ΡΕ1192448 meios naturais ou sintéticos, tais como solos ou partes de plantas, licores de processos biológicos ou licores sintéticos,
De mo do a realizar a me dição, a amostra pode se íntro duzída num a cé. lula de am l o s t r a do tine apresentado na
Figuras 4a e 4b dos desenhos. Esta célula compreende um invólucro (41) que é feito de um polímero, tal como ΡΜΜΆ, Este polímero foi construído para definir um compartimento central (44) com dimensões correspondendo às dimensões da piat. afo rma, É formada outr a de] oress ã.o o o 0 mpart. iment o (4 4) ]p 3.7Γ 3. de fin ir uma c : amara ( 46) que 0 O Θ J. 3 d 3. a volta d.a s a a extr em.i' da de por um anel em. ϊϊ p, í? (47) . A cama ra (46) é ab er ta no c ;eu topo e furi· do. A s oluç 3.0 3 S Θ r ans L1 1 sada pode s 0 p rntr odu 7; ] r-j ρ γ' a cám ara (4 6) 1 jfj Q anel em ; »0" t /il 7) atravé ri •^1 de uma 1 Í U ha de f luxe .·) (45) . Ç) t* 11 j x o na. 1 inh a de f1u x o (4 5) pode se r cont .'.rolado por u: ma v álvul . 3 í :.43) . A célula inel u i uma tampa (49) que pode se í r 1 c ;cal i Cl ti c. n sob: re, e segura a o, i nvó luc ro (41 .) par. a fechai :V 0 topo da cél uJ . a * A tampa (4 O, \ 0 ; i n c I u í uma P rj 0 ] _ · a (50) que : Θ S' c a loca 1 i n :ada sobr 0 O comp v +· imento (46) e por i ..sso perm. í te que , a : nadíação p as se atra ves da ta mpa. e para de nt.ro ui hl 1.. élu la (4 6) • Na util i zaçáo d .0 '.mil na cl íiul .a, o nvólucro (4 1) está localíz a do c ontra a su .per fi cie da P racaforma q. 0 fd pose ui os ele iment o; p de cap >tura ai : £ o r r nados de í modo a q ue a tampa (49) é remota em relação a essa superfície. Isto coloca o compartimento (46) em comunicação com a área de sensibilidade da plataforma. A amostra a ser investigada é 47 ΡΕ1192448 então aiime arcada uc i compar t im .ento (4 6) através da 11 nha de fluxo í 4 5) de mo do a que ; ! a colocada em coní cacto com os eiemen tos de capiu ara na su da plat aforma IJma mediçã 0 Cicl f 1 u o r e scência 1; aduzida a vários pont os de captur a é e ntão rea iizada c somo previamei •q j- 0 3 oS 0 rito. A Figura 8 ilustra possíveis formas alternativas da plataforma.
Os elementos de sensibilidade podem ser arranjados de vários modos, por exemplo rectangular, circular, hexagonal-cêntrico, elipsoidal, linear ou labiríntico. A área. de sensibilidade pode ser rectangular, redonda ou de qualquer outra forma. Os sulcos podem ser arranjados de forma quer equidistante linear ou equidistante circular, ou podem corresponder a. segmentos dessa.s estruturas. A plataforma pode ser, quer rectangular ou em forma de disco, ou de qualquer outra geometria. A plataforma pod.e compreender uma ou múltiplas áreas de sensibilidade, cada á.rea de sensibilidade pode compreender um ou múltiplos elementos de captura, e cada elemento de captura pode compreender uma ou múltiplas moléculas de captura marcadas ou não marcadas. A plataforma também pode ser adaptada a pia- cas/di spositivos c ie tipo microtituiação de modo a realcza.r um o u i múltiplos ensaií os nos poços de mic rotitulação indivi duais. Isto pode se ;r alcançado para todos os tipos de 48 ΡΕ1192448 placa: 96, 384, 1536, ou números cie poços superiores, independeutemente das dimensões da respectiva placa de microtituiação, 0 seguinte é um exemplo especifico de uma plataforma: 1. Desempenho físico da plataforma 3-S: reflexão anormal la. Plataforma 1 A plataforma de transdutor de chip genético compreende urn substrato planar, transparente (vidro AF45 da Schott) de 0,7 mm de espessura, No substrato, uma estrutura de superfície periódica é gravada por meios fotolito-gráficos (deposição de fotorrevestimento, <1 um; gravando a estrutura periódica no revestimento quer por interferome-tria/hoiografia de dois feixes; gravando o revestimento com gravação fónica reactiva utilizando gás Ar; removendo o fotorrevestimento residual).
As formas da estrutura, de superfície são próximas de sinusoídal. A largura (período) de uma estrutura única é de 360 um. A profundidade aos sulcos é de aproximadamente 3 8 nm.
No topo da superfície de vidro homogeneamente estruturada é depositada uma película de óxido de metal dieléctrica transparente (Ta205) com índice de refracçâo 49 ΡΕ1192448 elevado de aprox, 2,2 a 633 nm de comprimento de onda. 0 processo é por plaqueamento iónico. A espessura da camada é de 130 nm. A estrutura/arquitectura primária da superfície do vidro é transferida para o topo da camada de óxido de metal devido ao processo de deposição altamente energético e anísotrópico.
Quando um feixe laser altamente paralelo, expandido, coerente é direccionado para o transdutor a ângulos distintos Θ, correspondendo a uma denominada posição de ressonância, quase toda a luz é reflectida pela plataforma de transdutor e a ordem 0, de intensidade de transmissão é reduzida, para menos de 1% (comparada com 90-95% a um ângulo arbitrário). A largura ΔΘ do estado de ressonância, em que quase toda a luz é reflectida., é proporcional ao comprimento de onda λ (633 nm, fixo) e ao coeficiente de perda de radiação cm O coeficiente de perda de radiação é governado por uma profundidade dos sulcos da rede de difracção, geometria e "duty cycie” da estrutura corrugada, e aumenta quase o quádruplo com o aumento da profundidade dos sulcos. Neste caso (comprimento de onda do laser 633 nm, camada de óxido de metal 130 nm, profundidade do sulco 38 nm) a perda de radiação é aprox. 2000/cm, i.e, a distância de propagação de um feixe laser guiado nesse sistema de camada antes de ser difractado para fora da plataforma pela estrutura periódica é 1/2000 cm ^ 5 pm. Isto é uma distância surpreendentemente curta. Por isso, nestas 50 ΡΕ1192448 condições não ocorre guia ida das espe ser dficações da plataforma a ainda mais reduzida. través do relinament stância de propagaça
Para a caracterização do efeito de ressonância, a intensidade do feixe paralelo (polar ização TEj é ajustada para 100 pW para uma área de 4 mm de diâmetro ( ρθ\Λ7ΘΓ ΓΤ1Θ %ΘΓ Newport NRC 1835) . 0 ângulo entre a plataforma normal e o feixe incide ;nte é rodada 1 a 2 graus para longe da posição
central da reflexão anómala (estado de ressonância). A posi ção i i r- C* C θ Π Γ. -T.' 3 1 Θ 3 -d. f D , A p 1 a. tafoma é então rodada e: p 3 S S O S de 5/1000° (con.tr O J. 3 G O -T.’ Newport N RC PM 500) e a.iteraçs í.o da potência do feixe t ransmitido é monitorizada No ângul o de re s s onâ.n c i a., menos c lo que 1% ( < 1 uW) do feix original transmitido alc d e t e c t o r. A potência d laser incidente é totalmente refiectida (feixe refiectido de modo especular: aproximadamente 100%), A largura total a meio do máximo da ressonância para reflexão anormal (FWHM) é, neste caso, 0,3°, A homogeneidade da reflexão sobre a. superfície de transdutor total (18 mm x 18 mm) é melhor do que 90%. lb. Plataforma 2 estão única ó rj ρ
As formas da próximas de rectangular. estrutura é de 360 nm. estrutura de superfície i largura (período) de uma profundidade dos sulcos aproximadamente 52 nm. No topo da superfície de vidre 51 ΡΕ1192448 homogeneamente estruturada é depositada uma película de óxido de metal dieléctríco transparente (TazOs) com índice de refracçao elevado de aproximadamente 2,15 a 633 nm de comprimento de onda. 0 processo é por pulverização. A espessura da camada é de 150 nm. A estrutura/arquitectura primária da superfície de vidro é transferida para o topo da camada de óxido de metal devido ao processo de deposição altamente energético e anisotrópíco.
Quando um feixe laser altamente paralelo, expandido, coerente é dirigido para o transdutor a ângulos Θ distintos correspondendo a uma posição de ressonância, quase toda a. luz é reflectida pela plataforma de transdutor e a ordem 0. da intensidade de transmissão é reduzida para menos de 1% (comparado com 90-95% a um ângulo arbitrário). A largura Δ8 do estado de ressonância, em que quase toda a luz é reflectida, é proporcional ao coeficiente de perda de radiação a. O coeficiente de perda de radiação para este caso (comprimento de onda do laser 633 nm, camada de óxido de metal 150 nrn, profundidade do sulco 52 nm) é de cerca de 2000/cm, i.e, a. distância de propagação da luz lançada num tai sistema de camada antes de ser difractado para fora da plataforma pela estrutura periódica é 1/2000 cm. = 5 μηυ. Por isso, nestas condições não ocorre guia de onda.
Para a caracterização do efeito de ressonância, a intensidade do feixe paralelo (polarização TE) é ajustada 52 ΡΕ1192448 paira 6G0 ρϊί para uma área de diâmetro de 4 mm (power meter Newport NRC 1635). 0 ângulo entre plataforma normal e feixe incidente é rodado 4 graus para longe da incidência normal, A plataforma é então rodada nos passos de 5/1000° (controiad ar Newport NRC PM 500) e a altera ção da potência do feixe transmitido é monitorizado. No ângulo de ressonânci a, menos de 0,5% (<3 pW) do feixe original transmitia o atinge o de tector. A potência do feixe laser incidente é reflectida totalmente (feixe re flectido de forma especular aproximadamente 100%) . D ev.i.do ó. db0ÍT. d.lâ d. a largura de ressonância d. a lata forma 2 de acordo con ulcos mais profundos, em ompa ração com a plataforma 1 • / '3- s curvas de ,7Γ Θ S S O 11 3 n C .1. 3 de rdem d.0 difracção +1 e -1. sobrepõem-s e criando uma esso ΤΡ pí. r'-, f^· η p. extremamente lar Cf 3. exactamente n ,3 incidência normal, A largura total a metade do máximo da ressonância para reflexão anormal (FARM) é, neste caso, 4,2°, A homogeneidade da reflexão sobre a superfície do transdutor total (18 mm x 18 mm) é melhor do que 35%,
Plataformas de sensor (dimensões Í8xl8rrarh) dc tipo descrito com referência à Figura 2 foram primeira sonicadas duas vezes em clorofórmio (FLUKA, "purriss.") · subsequentemente duas vezes em isopropanol (Merck, 53 ΡΕ1192448
Uvasol®) , cada uma durante 15 min. A p iataforma foi então S tb C 3. Θ ΙΓ· V cl C Ό. O e 11 mpa num dispositivo de limpeza com UV durante 30 min (Boec rkel industries Inc, modelo 135500). Foi aquecido 0~xíií d 3 O cl 75°C (com agitação) e foram adicionados 2% v/v de 3-glicidoxipropii trimetoxíssilano {Fluka, "purum”), bem como N-etildiisopropilamina a 0,2% v/v (Fluka, '"purum") ao solvente aquecido (com agitação) . As plataformas foram montadas err 'l pilhas e depois incubadas durante 7 h n 3. S G1U Ç ã 0 c. 7 :5°C (com agitação) Subse- quentemente, as plataformas fc )ram sónica das três vezes em aceton1trilo fresco (Fluka, "grau para HPLC"), durante 15 rnin cada uma. As plataformas foram então sonicadas numa solução de 3-amlno-l-propanol (Fluka, "purum") a 2% v/v em acetonitrilo durante 15 min e depois incubadas na mesma solução durante a norte à temperatura ambiente (com agitação). No dia seguinte, as plataformas foram primeiro sonicadas três vezes durante 15 min em rsopropanol fresco (Fluka "grau para HPLC”) e depois três vezes durante 15 rnin em metanol fresco (Merck, "Uvasol®"). Finalmente, as prataiormas; roram secas e a.rmiazenada.s soo vácuo . b) Imobilização de elementos de reconhecimento
Matrizes consistindo em 10 cDN As dlt erent es (c ada cDNA 10 répi icas: CYP 450 1A1, CYP 450 2B1 1 ÍST., CYP 450 2B1, CYP 450 2B2, CYP 4 50 3A1 humano, C' YP 4 50 3A2, CYP 450 4 AI, 3-actiní i, GAP DH, padrão externo) f oram 1; mpr im idas nas platí iformas c :om um; a impressora de jacto de 11 n ta (M icrod .rop
GmbH, Norderstedt, Alemanha). A concentração das soluções 54 ΡΕ1192448 de cDNA foi de 5 0 ng/pL. 0 d iam er.ro (10 gotíc U 1 Cl 8 CIA.; "j Cl C tj. ΟΛύ r. i n t, 3. / ρ o síçao) foi cerca í de 250 pm e o 1 ançamento da manchas roi de cei :ca de 500 pm. Por isso, a di .mensão globa GUI S íPícL’ÍG X' X Z íG S Ο.Θ i 0 x10 foi d e ce rca de 5x5 mm2 , 0 plano e papel das marcas de cDNA imo. bili ZcíCÍcLS 8 3- O apresentado esquemática: mente r ia Fig. 5. As rr ratri _zes foram imprimidas n centro das plataformas com as dimensões (18x18 mm") . Subsequentemente, as plataformas foram incubadas durante a noite num recipiente fechado em atmosferas de vapor de água saturado. No dia seguinte, os chips incubados podem ser cozidos durante um período definido, digamos 1 minuto a 8GcC. Depois as plataformas foram lavadas com água desionizada e secas com fluxo de azoto, c) Montagem de Detecção A montagem de detecção utilizada é apresentada esquematicamente na Fig. 6, Um laser de excitação (61) (laser HeNe, 633 nm, 1,3 mW) e um extensor de feixe de 20x (64) foram montados em conjunto (62) num goniómetro (63). 0 feixe laser expandido foi dirigido para a plataforma (67) por meio de um espelho dicroico (68) . 0 centro de rotação para o feixe laser frca no plano da camada de óxido de me Lcil Gã plataforma ( ò /) > A fluorescência emitida da Li perfície da plataforma foi recolhida através do espelho G. 1 V Q η / 68) . Foram utilizj ados filtros de fi uorescência a.d icionais (65) para 3 Θ p 3 -T. 8. .8' a fluorescência (69 ) da. luz de ex citação. F o .1 u t i Iizada uma câmara CCD arrefecida \ P, strocam ϊ ÍEV 30/11) (66) equ ípa.d.a com urna lente Nikon Noct 55 ΡΕ1192448 (Abertura Numérica 1,2) parai meei ir imagens cie fluorescência ciais plataformas de superfície. 0 goniómetro permitiu o ajuste do ângulo do feixe iaser incidente expandido em relação à superfície normal da plataforma. As imagens de fluorescência foram recolhidas em condições de ressonância evanescente (i.e. o feixe laser incidente expandido foi ajustado para o ângulo em que a. luz transmitida atra.vés da plataforma apresenta, um mínimo) . d) Cartucho de chip
As plataformas foram montadas no cartucho especialmente concebido (41) fabricado de PMMA/porímero que é esquematicamente apresentado na Fig. 4. A depressão (44) possui dimensões (18x18x0,7 mm') e a câmara de incubação (46) possui 0,2 mm de profundidade. A solução na câmara de incubação foi substituída através de canais de fluxo (45) de 0,5 mm de diâmetro que foram perfurados na ΡΜΜΆ. O conteúdo do cartucho foi substituído através de canal de entrada/canal de salda (42). A plataforma for posicionada na depressão correspondente do cartucho com a área de sensibilidade dirígida para a câmara de incubação. A tampa (4 9) foi fixada pa.ra pressionar a plataforma contra, a selagem. A janela fresada/microconstruída (50) na tampa permitiu iluminação com a luz de excitação e a aquisição de imagens de fluorescência da superfície da plataforma. O volume-válvula-para-válvula do cartucho foi de cerca de 14 uL . e) Unidade de Desnaturação 56 ΡΕ1192448
Foi utilizado um elemento termoeléctrico controlar a temperatura para desnaturação (79°C), bação, (42°C) regeneração (79°C) e lavagem (42°: plataforma no cartucho de fluxo. pa inc a ;l f) Preparação da amostra
For am ut iii zaaos 2 crrup O s c Ιθ "η 3 L o s I. cX ·... O 8 ca d· um.) pa.ra o O '· ·; 0 s. ente estudo, , Um gr ; ijp Q (tratadc ;) roi ura itad: com 8 0 rr 'O de fenobarbí talf ; sai de sód .L. O , em. S O.1. 1 .ç ^ iológic· o (0, 9% p/v NaCl ) por kg de peso C( irporal e seg- ando gr 'upc } ( ‘controlo) a .penas com 0, 9% Naí 01 Foi a Ldmi nis trado u ,m t rs lamento diá rio em . 4 dias con .80 cutivos . Μ· final dos 4 q 1 cl .do f O d) cl Π ima is foram sacri f i C cl Cl O S d cl amostras de fígado foram congeladas rapidamente em az liquido e armazenadas a -80°C.
Su. bsequen temer; .te, o RNA/m RN A total for a. S O J. 3 G O Θ marcado por transcrição reversa na primeira c a de : ia de o D RA (incorporaça çi pi ir c; og y ' irrucleót idos IlÍ.cl.j- ciC\C) 8 f o mesmo ou nuoroioros diferentes ρ a r a. o controlo 0 tratado ) , purificado e dissolvido em 20 pL de tampão de hib ridação. g) processamento do ensaio
Foi utilizada uma seringa Cavro paira bom-bear/aspirar tampões e soluções para o cartucho.
Os passos seguintes foram executados para medir ΡΕ1192448 57 indução de CYP 450 no rato: 1) 30 rtiin de pré-lavagem a 7 9°C com 1 mL de tampão de hibridação (HB), medição de fundo 1 da plataforma em contacto com HB. 2) Injecção de amostra ''controlo" no cartucho, 30 rnrn de desnaturação a 79°C, depois incubação durante a noite a 4 2°Ch 3) 10 min após-lavagem a 42cC com 1 mL de HB, medição das intensidades do ”controlo" da plataforma em contacto com. HB. 4) Regeneração: lavagem de 30 min a 79°C com 1 mL de tampão de hibridação (HB), medição de fundo 2 da plataforma em contacto com HB. 5) Injecção da amostra "tratada" no cartucho, 30 mrn de desnaturação noite a 42°C. Pos — Is.vagem oe de intensidades tacto com HB, ϊ 79°C, depois incubação durante a ) min a. 42 °C com 1 mu Hb, medrção tratadas" da. plataforma em con-
Toda.s as imagens de fluorescên foram medidas em condições d evanescente- h) Processamento de dados
As intens rdades líquidas {fundo 1 de controlo fundo 2 de tratado) de toc Λ O 3 O 3 J- O cais foram c alouradas todas as intensídac ies do conjunto de resnltad os tratad foram normalizados com o auxilio das intensidades do padrão 58 ΡΕ1192448 :erno. As taxas de expressão (vezes de alteração) entr respeotivos penes foram calculadas pela divisão de
Vezes de alteração - tratados normallzados/controlo,
Foram calculados os valores médios de cada répiicas, i) Resultados
Os ER-Chips medidos em condições de ressonância evanescente apresentaram, em geral, intensidades cerca de 100 vezes ma is fortes e proporções de sinal/fundo melhoradas .
Os valores médios para vezes de alteração estão resumidos na tabela seguinte: GEME Vezes de alteração CYP 4 50 1 A.1 (rato) 1,6 CYP 450 2E1 ΞST. (rato) 16 CYP 450 2B1 (rato) CYP 450 2B2 (rato) 32 CYP 450 3AI (humano) 3,2 CYP 450 3A2 (humano) 2,5 CYP 450 4A1 (rato) 1, 6 B-a.cti.na (rato) 2,1 GArDn (rato) 2,3 59 ΡΕ1192448
Foi preparada uma plataforma e processada de acordo com o exemplo agora descrito. Subsequentemente à célala com a
No exemplo descrito acima de amostra (41} para colocar rea de sensibilidade da plat a amostra íforma. St Q1 1 recípient te da am ostr a cie tipo micro t itul; uti rrz aco em ; compensa . c a o com a pl atafo: rrna p plu rai idade clt ϊ áreas de sensrbil. ίο. a cie p a i' a. me cl iça o de uma pluralí dade de amosti :as e desse 8 Θ fic iêncicL d; ϊ medrçã * da uma única em contacto rá entendido Ípão pode ser ossuindo uma permitir a modo melhora JL i i 0 \X ba çã o com a amostra, foram re· colhida is 2 ímag· ti F; < COi m tl disp os it. ivo de d etecção da câmara de CDD de se: oito 8. C im 01 cc m re fe rê nc ia à Fic çura 6. A prii neira irnager n foi rec ol. hi Gol a .O modo d epiflu .or escência sem a j ust . 0 p 8 X 8 as < condi çõ es P ar ol c; c; on ~i ro O.íí cia ev an escente ( "'eoi f iuor escenc: ; ^ í? .a Fi Cf „ 7 a) • segu nd d- imagen foi recol nida em condiçc ;es c ie re > 0 C; Λ. Λ án Cl .a evan Q ce nte (’ 'intensifica . O cl 0 de E ,R" na Fig. 7b) ί i G O 8. G Cf :j. lo i.o fel .> la.ser incider ite f. oi. ajustado re 1 a C ã' 0 à supe r f ic j r-, f \ y ma. ]. até que a li 1 7 -!—s· ·, ansmi 1.1 da ai tra.vé do C b i. O apre se nt. B S S Θ um mínimo. 0 8 per. ' f i S d. e ir nagem ( 3 in a í s 1 iqu. id os ) ciem p ΤΊ stram qu. 0 8 s i r itensid 3.d.0 8: me d. X G 3. S CC m i nte n s if ícação G e jsR são cerc a. de 10 0 ve Z 0 S Tl '18 1. S f o v 8 0 S ri r-· que 8 S intens id ades obti. . G B. S com epif Iir ore sc :êncra C 0 nv 0G -
Polimorfismo mm Único Nueleótida (SNP) 60 ΡΕ1192448
Preparação de Chio
Plataformas de sensor (dimensões 18x18 mrrf) do tipo descrito com referência à figura 2 foram primeiro sonicados duas vezes em clorofórmio (FLUKA, "purutru") e anol (Merck, sub seque nterne; a 0 Θ duas V0 z Θ 8 em. isopr U v aso 1® ίϊ \ -j / / -1- · 5 min cada uma. As platafo: rrna s f em vácuo ps j t Ímpas num dispositivo de ]. irnpez; 30 min ( 'Boeck .ei In id.ust.T . .1.0S .1.1.1.0/ ΓΠΟ de.lo 13550 O-x ileno até 7o°C (cc m:. agitação) 0 foram gli cidox iprop. il-tr: Ímeto: A 0 S 3 Ò C- cl Π O cl 2% V / V bem como ) N-et :ildii .sopre ypi lamina a 0,2% V / V ao sorvi ;nte aquec ido (com agltaç; ao) . As p( ent ão mc citada s em pirh as e depors inci toadas sor cL f A I.J (c o m agitação t 1 c Subsec pia taf or: mas f O O cíITl iavac ias três vezes cc :;m ace (^ -i- (J. fvd , de H PLC") , durante 11 ) min cada quentemente, aí /v (Fluka, "pururrd) as platadormas foram secas e armazenadas sob vácuo. b. Imobilização de elementos de captura
Dois oiigonucleótidos amino-modificados diferer tes (sondas d' e captura) foram i mpressos num plano oe típ tabuleiro de xadrez (5x5^25 locais) nas pia .taforma silanizadas. í íoí utilizado um dl Lspositiv o de prepa ração d* matrizes QMS 417 de "ring-pin” para a rmpressão (Geneti
Microsystems, Boston. MA). A concentração dos oligonu-cleótidos utilizados como moléculas de captura foi de 100 nmol/rnL. O diâmetro dos locais foi de 125 micrometros com 61 ΡΕ1192448 500 micrómetros de distância centro-a-centro. Os 2 oligonucleótidos foram denominados cPM ("captura de emparelhamento perfeito") e cMM ("desemparelhamento de captura") e diferem apenas numa base: cPM: 3»CACAATTCCACA5'-NH2 cMM: 3'CACAACTCCACA5f-NH2 cPM e cMM foram marcados com um grupo arni.no na extremidade 5' que permite a ligação covalente dos olrgonucleótidos para as plataformas funcionalizadas epoxi. As matrizes são impressas no centro d.as plataformas com as dimensões (18x18 mm2). Subsequentemente, as plataformas foram incubadas durante a noite num recipiente fechado em atmosfera de vapor de água saturada. No dia seguinte, os chips foram secos e lavados com 1 mL de solução aquosa de ureia a 50%. Alternativamente, foi utilizada uma solução aquosa de albumina de soro bovino (BSA, 1 mg/mL). Após bloqueamento, os chips foram lavados com água desionizada e depois secos com fluxo de azoto. c. Montagem cie dispositivo de Detecção
Foi utilizado o dispositivo de CCD descrito no exemplo anterior. cl Cartucho de chip
Foi utilizado o cartucho descrito no exemplo anterior. e. Analitos/amostras 62 ΡΕ1192448
Foram utilizados como os analitos dois oligonu-cleótidos marcados com Cy5 denominados PM ("emparelhamento perfeito") e MM ("desemparelhamento") com sequências complementares aos oligonucleótidos de captura imobilizados cPM e cMM: PM: Cv5~5 ' GTGTTAAGGTGT3 1 MM: Cv5~5 ' GTGTTGAGGTGT3 1 δ concentração aas s( ações de analiso foi de 30 pM cada. r. processamento ao tinsau om 1 mín cerca
Uma plataforma foi primeiro lavada 2 vezes mL de tampão de hibridação (HB) , com um intervalo de entre as lavagens. Subsequentemente, foram injectados de 15 mieroiitros de solução de anaiito PM (30 pM) no cartucho de fluxo. Após 3 0 min de incubação, a plataforma foi lavada com 1 mL de HB e foi recolhida uma imagem de scê' Γ3 “ 3 ” PM” na Fr; g. 9a) na posi . Ç â O ( ie ressonân cia P * Sub seqi .ent emente, o s ! . igon .ucle^ ót. ic j r-' s m. arcados com scê' nci a ligada foi :am V emov idos í e :.i : imii por : § o , de 2x1 ml, de uma sol uçí io aquosa de u r;0 í. a a 5 U % com de rrh ;erv alo entre a. s i n;; j ecçc ) Θ S * And; s mah . s 2 mm / o foi f c i V cl O o por inj ecç 3.0 de 2x1 mL .10 HB com um aro d< •p, min entr 0 3. S inj /*· Γ' .-"λ / Gd O '-v G ~:;S e a imagem de scê. nci "regeneraça : fí l vd na Fia * .X Iv ) f' oi ri acolhida na posição de ressonância do chip. Fin aimente, foram inj ectad os aproximadamente 15 mieroiitros de solução de anaiito MM (30 pM) no cartucho de fluxo. Amos 3 0 min de incuoacao. foi novamente lavada com a plataforma
mo de HB 63 ΡΕ1192448 :oi recolhida passos foram e a imagem cie fluorescência ("MM" na Fig. 9c) na posição cie ressonância do chip. Todos os realizados à temperatura ambiente. g. Processamento de dados A. inten s i dade média dos o c a. i: 3 cie c aptura ( η, pp p, cMM t foi xper: i θ n c i β; s (inci jb ação de 30 pM d nai i 1 to MM) λ .l. G '! f' snalmente, foi c nteru sidade média PM-cMM e a propo 2 grupos diferentes de calculada para. ambas as e anar í ro sM e r 0 ρΜ c.e a leu fada a diferença, da rção cPM/cMM. h. Resultados
Todos os resultados calculados foram resumidos na Tabela seguinte. Os dois analitos de oligonucleótido, PM marcado com Cy-5 e MM marcado com Cy-5f que diferem apenas numa base (SNP) podem ser claramente dist.inguid.os a partir dos resultados obtidos,
Intensidade média do analito PM a .30 pM [ contagens j Intensidade média do analito MM a 30 pM [contagens] Locais cPM 1140 7 04 Locais cMM / 2 075 cPM-cMM 1116 -1371 r· PM / r'MM 4 8 0,34 64 ΡΕ1192448
Os anticorpos primários são imobilizados determinados espacialmente (por exemplo padrão de tabuleiro de xadrez) numa superfície da. plataforma de sensor, A ligação dos antigénios a serem detestados e dos anticorpos secundários marcados com luminescência (utilizados para a detecçáo de um segundo epi topo dos antigénios indi viduais a serem detestados) é alcançada através de incubação subsequente, primeiro com o analito contendo os vários antigénios em concentrações diferentes, e d.epois com os anticorpos secundários marcados com luminescência,
Alternativamente, os antigénios (analito) e anticorpos secundários marcados com luminescência podem ser misturados num passo de pré-incubação, que permite a eom-plexaçáo de anticorpos secundários marcados com luminescência com os antigénios. Após este passo de pré-incubação, a. superfície da plataforma de sensor é incubada com a mistura.
Os complexos irnunomarcados comi luminescência a uma superfície foram quantificados com o dispositivo de ER. (Pré-lavagem com tampão adequado, PBS, e pós-lavaqem se necessário), €S3TÍ3<&1.03 imunológicos 65 ΡΕ1192448 a. Preparação do Chip
Foram sonicadas plataformas de sensor (dimensões 18x18 mmz) do tipo descrito acima, duas vezes em clorofórmio (FLIJKA, "purriss. "i e subsequentemente duas vezes em isopropanol (Merck, "Uvasol©"), 15 min cada. As plataformas foram secas em vácuo e limpas no sistema de limpeza UV durante 30 min (Boeckel Industries Inc, modelo 135500). Os chips foram colocados num recipiente pequeno e armazenados numa solução de octadecilfosfato a 0,5 mMolar em propanol durante 24 horas. Subsequentemente, os chips foram lavados com 5 mL de isopropanol de modo a remover o íuilf os f at o em er prc cedime n to criou íuilf os f at O i i a S prc motora de ade s ao C|o conta cto cerca prc ternas na plataf b. Imóbil iza çâo de oesso e secos num fluxo de azoto. Este uma Monocamada Auto Montada (SAM) de uperficíe das plataformas. Esta camada tornou a plataforma hidrofóbica (ângulo de 100°) e permitiu a adsorção de
Dois anticorpos monoclonais diferentes, anti íonadotropina Corrónica humana (anti-hCG) e antr
In (anti-IL 6) foram impressos num piano de L ipo ta buleiro de xadrez nas plataformas hidrofób e C cl em clt. mosfera de vapor de água saturada (matriz de 4x4, 8 Io O Cl 1 Çj 3. X Cl Cl\ àa antícc rpo) . A concentração das soli ações de 66 -00 mrcr ograma/ mL, ISSO ra dí a jacto de rsti :í H r - ^ r Alemanh a) . sron a com 32 0 tro. A q matr i zes 3. S num recipiente sa .turado. Sub s e - g /-'i m., < c. 3 cor: 10 mL de com f os: tato (P BS) >SA) , sac 1 cl lOS íl 3. ot 1 cl Vc agem broqueo li di i G. S C j rçdo de BSi i e 30 ÍS ; dos eiemen tos :io c :onse< ! na o esp ecífíca de isar o aumento de bf oc tu ei o , os ch ips eco; 5 com fluxo de mm fria c rífico até ΡΕ1192448 8.ΓΊ tzc :orpo de Cc :Lp t 'C iL 3. f oi de : 4 í A íl spe ctívament :;e. Fo r u ti liz i Cl Cl C L um ti- nta - para a imp res são ( Mac :roc Irop 0 dí ametro 0 -OS lo caí s fo 1 íe mi crc metros ; de di stância cs im pre 1S S 3. S L ϋ nT am ínc ;ubs ids ! Ί dur ante fe cha do em a tmo sf e. ra ds ; v ’ ap c ; r c qu ent emente. o s chi Ό ^ fc. iram s ecos so luç :ão de sí oro fl . S 1- C dó gíc :o tamç conreuao aiDumina ae soro oovmo a xu-s e azida de sódio a 0,02%. Este passo c superfície hidrofóbica dos chips por tornou a superfície mais hidrofíiica de captura terem srdo imobilizados, procedimento de bloqueio evitou a liga; proteínas à plataforma, que podiam causa ruído de fundo de fluorescência. Após foram lavados com água desionizada e utilização . Montagem do sistema de detecção
Foram utilíz iescritas no Exemplo 2 do chip
adas as condicoes de deteccao cor CCD ΡΕ1192448 67
Foi utilizado o cartucho descrito no Exemplo e. Analitos/amostras
Foram preparadas 3 soluções de analitos: I) uma solução contendo 500 ng/mL c ie IL6 marcada com Cy-5 , antigene II) uma solução contendo 50 ng/mL de gonadotripina cori ònica humana (hCG) mar cada cc >m Cy-5, antigene III) uma rn i s t u r a p r é - i n c ub a d a (1 r: tora) contendo 50 ng/m L de IL6 e 100 ng/mL de an t i corpo policlonal 8 Γι t, i -IL6 marcado com Cvõ,
PuS pH 7,0 contendo USA a 1% é utilizado como so Iv e n t. e pa ra os anal os . t. P roces sa me n t;. o do ens aio I1 o r a.rn prep; cl. I.' δ d cl. S : t rês plac ta formas (< somo des ('· γ· i t o em 0-0 * } pa ra a inci aba ção c lo anali ro (cf» θ ) ar trave de mo nt agem da pia taiorna s e m . cartucho S 0 1 cl V δ Á] 0 rn cc rn 1 rnL ce PB S V V “? ^ ^ · ϊ o C O π te ndo 1 33 a 1% , Subseq uentemente C ‘~ r u.- :r ca de 15 mi cr olitros ias solu ,çõ· o c: cie anaiitc ) I), II) e I II) foram in je ctada s no s c artuc - P-ι s o fluxo. 0 tempo de rncr LOciÇté o foi 0 Θ I hora LS '· J- δ -da para ~ \ 1 0 II .) . P a. r a o analito III ) o te mpo de d. ncuba çã o for de 1 L2 δ τ' as , Após i ncubação d o ar: :.al i t. as pi at. af orm iã s ± Ό Τ' 3^ m la vac Ias cc )m 1 ml; de PBS pH 7,0 con r. e ndo BS T. Aç. d 1 d. o 7\ .. Ad. kt ; imager > ri G0 f ] .li ores cêí ncia foram : ob ti dar dos 68 ΡΕ1192448 mp sob condicoes de ausêne res uo- resc ê i'i C ia, ceo 1 c a de 7' * pa. ra ‘ Lá do ângulo de 1? :7: sonâncía .) e sob condições ie ress onân .cia p > a r a cada c :hip ( A essonância, luz in; ridente cerca de ·") Γ. ^ ./ w' - em reiaçãc 1' 3 o normal). As imag ens e os dados ob d ido > s s cÍC : ap resenta· dos na Figura 10 . Todo s o s puassc '>G f oram e f e c :tna f \ r-> .3 3 temperatur . 3 3 .mb lente g. p roc essamer rt o de da ido S A ^ intensid; ades mé di as e o ru ido de : fundo dos loca is foram c; ilculad; as c om o aux ilio do Pr ogr ama Imag ;ene Arra y (Biodis covery, Los Anc Λ 0 _ L 0 fu / CA) * A n 'iédi .a locai na Fig. 10 reprec í & Γ: tâ 3 1T lédia da i ntensidade do rui .do de fu indo corr í gi do dos respect 3 V O 3 el em ente o s o ru ido fo i calcui ado como d e s v i o P1 adrão do ruic io 0iTi fundo Cí. ti 3 imagens de fluo res cência. Deste moc io, 0 s d.nal/ru .r ci o n a F i g. 10 corr Θ Sp onde à prropcori ção d. 3 m .édii 3 I.OC3Í obr; 3 0 d.0 3 ; v i 0 p 3. d .11' 3 0 do ruíc r-> de fur ido . h.. Resultados
Todos os dados calculados estão resumidos na Fig la. Na Fia 10. Imaaens e dados obtidos no modo de epi-
fluorescência assim como sob condições de ressonâ ncia estão resumidos na Figura 10. As linhas I) e II) apr; ssentam os resultados de uma imunorreac ção entre anticorpos de captura monoclonais i mobilizados e antigenes marcados ( IL6 e hCG marcadas com Cy5, respectivamente). A linha IJ. I) corresponde 3. ma. rea; lo imunitáu: 69 ΡΕ1192448 do tipo sanduíche entre um anticorpo monoclonal imobilizado (anti-ILG) e uma mistura pré-incubada do antiçene IL6 e um anticorpo policlonal secundário marcado com CY5 contrai IL6,
Para os resultados < da rinha I) a rntensidade de sinal au: menta de 16 contagens em modo de e :pif luorescên d_ cl para 110 0 contagens em modo c le ressonância da pratafor ma. Isto cor responde a um factor de aumento de cerca de 24 Clfp relação aos valores médios do locai, A proporção S 2- " nal/ruid; d melhora de '7,0 (epifIuorescência) ci 6 9,2 (res s o - nância), correspondendo a um f actor de 10.
Para os resultados da rinha II) a intensidade de sinal 1. aurr tenta de 32 co .0. L clA-f Θ3 s es rt mod.o d.0 ep.i t.. iuores C Θ .0. C Ί p 3.7Γ 3. o 4 6 contagens em modo i de .1 - p 0 0 r') ri 3 Π. C _Ί . d d3. p d t Ct for ma Isto c o r r esponde a um : factor d.0 aument O C le cerca de 2 0 a.\ rei as 3 cl 0 aos valores r nédios do local * A proporçã .0 sr na 1 / / CU ido mel. hora de 5,0 (epi f1uore c ('· ncia) para η (ressonância), correspondendo a um factor de 15.
Pa.ra os resultados da linha III) a. intensidade de sinal aumenta de 25 contagens em modo de epifIuorescência para 2 96 contagens em modo de ressonância da plataforma. Isto corresponde a um factor de aumento de cerca de 12 em relação aos valores médios do local. A proporção sinal /ruí do melhora de 3,8 (epifIuorescência) para 44,1 (ressonância), correspondem um factor de 12. todos A média local e os valores sínai/ruído para 70 ΡΕ1192448 os 3 ensaios são pelo menos uma ordem de magnitude superior paira os chips em modo de ressonância em comparação com os mesmos chips em modo de não-ressonância (epifiuorescência)* As imagens de fluorescência das linhas I) e 11) são complementares (piano tipo tabuleiro de xadrez). Todos os chips utilizados possuem o mesmo conjunto de elementos de captura, i.e, anti-hCG monoclonal e anti-IL6 monoclonal.
Deve ser entendido que são possíveis muitas alternativas às formas de realização descritas.
Outra característica da presente plataforma é que permite adquirir um conjunto de dados mais alargado em paralelo. Pode também ser utilizado várias vezes, Os complexos de afinidade imobilizados podem ser regenerados a uma temperatura elevada utilizando solventes orgânicos e/ou reagentes caotrópicos (soluções de sal) enquanto mantinha a capa.cida.d.e de ligação substa.ncia.lmente de forma completa..
Na descrição apresentada acima, é irradiada a área. total, de uma região de sensibilidade. É possível também utilizar um laser com um feixe focalizado não expandido e varrer a área de sensibilidade de modo que o elemento de captura final é excitado à vez. Este arranjo permite a utilização de um fotodeteetor menos dispendioso do que uma câmara CCD e. g. pode ser utilizado um fotomultiplicador, ou fotodiodo avalanche. Também este dispositivo pode ainda aumentar a sensibilidade devido ao facto de a energia laser ser mais confinada. 71 ΡΕ1192448 É possível também conceber plataformas de acordo com a presente invenção para utilização como lâminas de microscópio permitindo assim que possam ser utilizadas com um microscópio de fluorescência.
As plataformas podem também ser concebidas para utilização com sistemas de rnzcrofl.nido de larga escala tal como descrito em WO37/02357.
Na descrição acima, a utilização da plataforma foi descrita em aplicações que excitam e detectam fluorescência. Deve ser entendido que a plataforma pode ser utilizada em dispositivos em que reacções de afinidade são detectadas por alterações de luminescência. Deve também ser entendido que a plataforma pode ser utilizada em dispositivos em que as reacções de afinidade são detectadas por alterações no índice de refracção. ir process o de a cordo com a presente rnven; sã.o L r 1 .L z a o o em mui l, cl o ei p J. O cl C Ο Θ 8 ? tl ci S C çuais cl o :a nao exaus - va. pod· seguintes formam uma
Expressão genética
Genómrca
Farmacogenómica
Toxicogenómica
Toxi coproteórnrca
Genética
Farmacogenética 72 ΡΕ1192448
Toxlcogenétlca
Perfil de expressão do exão/íntrão
Tipagem de antigénios de Leucócitos Humanos (HLA)
Análise de variantes de excisão Proteómica (ensaios de proteína em chip) Monitorização de doentes (fármaco, metabolitos, e marcadores)
Cuidados no consultório, ''medicina personalizada"
Géis 2D para dzagnost :i xo em f :mp para proteom íca sepa: nação 2d 0([Tj o 0 .Γ α I SNP (polimorfismo de nucleótido único), mini-se-cruenciacão
Seiecçao de elevado processamento Química-Combinatória
Interseção pr o tei na proteína Interacção mo 1 eeular Interseção de proteína···anticorpo e péptide d com base em chip
Proteína verde fluorescente (GFP) nib -i- r d a. ç a o z n " a z. u
Microscopia confocal
Espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) Microscopia convencional MALDI-TOF MS
Lisboa, 21 de Dezembro de 2006
Claims (19)
- ΡΕ1192448 1 REIVINDICAÇÕES 1. Proc e s o para analrsar uma cíITLO ib í, X. ci Ci LI amostras que compreende colocar a amos l r v, o: u amostras, em contacto com a área de sensibíI idade de uma plataforma de sensor (19), compreen: lendo a referida τ Plataforma um substrat; d opticamente tr ansparen te (10) possu indo um Índice de refracçâo rii, uma camada não metálica opticamente transparente (32) , formada numa superfície do substrato., possuindo a referida camada um índice de refracçâo n2 que é maior do que nlf incorporando a.i a referida, plataforma uma ou múltiplas estruturas corrugadas (33) , compreendendo sulcos periódicos que definem uma ou múltiplas áreas ou regiões de sensibilidade, cada uma. para um ou múltiplos elementos de captura, em que (a) a profundidade dos sulcos está no intervalo de 3 nm para a espessura da camada opticamente transparente, (b) a espessura da camada opticamente transparente (32) está no intervalo de 30 a 1000 nm, (c) o periodo da estrutura corrugada (33) está no intervalo de 200 a 1000 nm, (d) a proporção da profundidade do sulco para a espessura da camada opticamente transparente (32) está no intervalo de 0,02 a 1, e (e) a proporção da largura do sulco para o período dos sulcos está no rntervalo de 0,2 a 0,8, pelo qual 2 ΡΕ1192448 1) a luz coerente incidente na referida plataforma a um ângulo apropriado pode ser difractada era feixes individuais ou ordens de difracção que interferem resultando na redução do feixe transmitido e numa reflexão elevada anormal da luz incidente, criando assim um campo evanes-cente aumentado na superfície de uma ou múltiplas áreas de sensibilidade; ou 2) a luz coerente linearmente polarizada incidente na referida plataforma a um ângulo apropriado pode ser difractada em feixes individuais ou ordens c le dif racção, ; que interf ere resultando em extin ção qz ; d. tí Θ t O t 3 I do feixe tra memitido e numa ref iexão elevada. £ ^normal, da luz incidente, criando assim um campo evanescent. ;e aumentado na superfície de uma ou múltrplas áreas de sensibilidade, e pelo qual a plataforma de sensor é irradiada com um feixe de luz (16) que é incidente na plataforma (19) a um ângulo tal que a ressonância evanescente é levada. a ocorrer criando o referido campo evanescente aumentado com a área de sensibr lidade da plataforma, e detecta a radiação que emana da referida área de sensibilidade. ação 1, em empreendem
- 2. Processo de acordo com a reivindi referidas estruturas corrugadas (33) ΡΕ1192448 3 sulcos substancialmente paralelos periódicos que são mono ou multidífraccionais e cujos sulcos representam uma ou múltiplas áreas ou regiões de sensibilidade.
- 3. Process reivindicações 1 ou plataforma é formado de materi õe acorao com qualquer uma das , em que o substrato (30) da inoraâníco.
- 4. Processo de acordo com qualquer uma das ;ivíndicações 1 ou 2, em que ato (30) é formado de material orgânico.
- 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o substrato (30) é formado de vidro, SiCn, quartzo ou 1 O reivrndrcacoes Processo de acordo c orn a reivindicação 4, em o (30) é : f orm ado de p ol ime ros orgânicos, tai.s PI, : n O L U f PE, PET ou PU • Processo de a e o r o u com qualquer uma das 1 ou -q f ΘΤΠ QU6 3 camada opticamente 32) é formada de mate rial inorgânico. Processo de acordo com qualquer uma das 1 ou q e- r em que 3. C cL^QclCIcí OPt J_ C ΡΙΓίθ 11 Γ, Θ transparente (32) é formada de material orgânico. Processo de acordo com a reivindicação 7, em 4 ΡΕ1192448 que a camada opticamente transparente (32) é um óxido de metal, tal como Ta205, Ti02, Nb205, ZrCÇ
- 12, Proí cl o o tv acordo com qualquer uma das
- 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a cam a da c >pticamente t :ranspare :nte (32) C2'. form iada por pol iamída, pol: Limida, PP, PS, PMMA . / ci — .dOS por iac: :iiic V.' lã f íS O. t- eres p; o 1 i a. c rilicos, pol itioéter , ou pol . i (sr 1 f u reto de fen ileno) e der •ivados deste s * 11. Processo de acordo com. qus : iquer ; orna da. s rei v i n d i c a çoes anteriores, em que a profi. jndi da de do: : s u 1 Η O 0 '30 difraccão é d.e 10 nr n. para a esj oess ura Οη. cá cam cá Cá d. opt icament Θ IV 0 .nsparente. reivindicações anteriores, em que os sulcos são geralmente rectangulares em corte transversal reivind:
- 13. Processo de acordo com. qualquer u .ΤΠ3 cações ; 1. a. 11, em que os sulcos são sinus 0.1.1 d 3. .1 8 F ,ΛΤΙ d ^ dentes de serra em corte transve rs :esso de acorc io com. quarquer uma d as p y -j γ·o c ^ em c ru e a plataforma (10) é
- 14. Pr« r e i v i n d i c a ç o e s a; quadrada ou rectangular e os sulcos estendem-se linearmente ao longo da plataforma.
- 15, Process; mordo com qualquer uma daí reivíndicaçõe 13, em que mataforma (10) tem íorma de disco e os sulcos são circulares ou lineares. 5 ΡΕ1192448
- 16. Processo de acordo corri qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os sulcos são formados numa superfície do substrato (30) .
- 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que os sulcos são formados numa superfície da camada opticamente transparente (32).
- 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que os sulcos são formados tanto na superfície do substrato (30) como na superfície da camada opticamente transparente (32). 19, p τ' o c e s s o c e acordo com qualquer i ama da e i v i nc li cações anteriores, ei m que a superfície corri igada d uma ou mais áreas de sensibilidade é optímizada. para um comprimento de onda de excitação particular e/ou tipo de polarização particular. Processo de acordo com qualquer uma d.as r e i v 1 n d i c a ç o e s i íi i 8 i ΘΓίΙ que a superfície corrugada de uma ou mais áreas de s í:- η s ’í Y) x 1 ’í .dade é optimizad; a para diferentes comprimentos de c mda e/ou orientações de p·. clarízação,
- 21, Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a superfície da camada opticamente transparente (32) inclui uma ou uma pluralidade de áreas de sensibilidade, em que ela, ou cada uma das ΡΕ1192448 6 qu a rs compo rua u: m ou cap tura. z« Pro ce S c 0 em que cada eiemen to de ind ividuais e/ou mi st T" CZ'. p. Vw O- cções de afinid . cl O. O O Pro ce S S 0 em que os clemente v 20 de bid 1 me n si o na. .1.. uma pluralidade de elementos de de acordo com a reivindicação 21, captura contém moléculas de captura iras destas, que são capazes de de acordo com a reivindicação 21, captura estão dispostos numa matriz
- 24, Processo de acordo com qualquer uma daí reivindicações 21 até reivindicação 23, em que a plataíorm? (10) inclui uma camada promotora, de adesão na superfície da camada opticamente transparente, de modo a permitir a imobilização de moléculas de captura.. em que a rnú l.tipl. as
- 25, Processo de acordo com a camada de promoção de adesão camadas de moléculas inorgânic reivindicação 24, ompreende urna ou r e/ou orgânicas, ou seus derivados, que proporcionam proprredadei físicas, espectroscópicas c a s / n v o j- 0' o ic a s / o no q u u n í o a s as propriedades funcionais e/ou fotofísicas adicionais, de modo gerais do sistema de químicas, fotoquimi-manipular camada o.e romocáo :esu ante.
- 26, Pro c e s s o de acordo com qualquer um reivindicações anteriores, em que a plataforma ( 7 ΡΕ1192448 formada por uma pluralidade de áreas ou regiões de sensibilidade, possuindo cada uma os seus próprios sulcos de difracção ou sulcos múltiplos, superimpostos, adequados para excitação mui ti color e detecçáo de a mo s t ras, 27 „ Proce sso de acordo com qual .quer uma das reivindicações 1 a 21, em que o númerc d de elementos ou moléculas de captura a serem imobilizados na plataforma não está limitada e cori responde ao número de gen es, sequências de DNA, motivos de DNA, microssatélites de DNA, poiimor- fismos num único nucleótido, proteínas O " "! fragmentos de células que contribuem para um genoma de uma espécie, ou organismo de interesse, ou uma selecção ou combinação destes. de acordo com qualquer umas d.as reivindicações 21 a 27, em que o elemento ou elementos ou moléculas de captura, compreendem um ou mais d.os seguintes: nu cl eótidos, r O 1 \. g o n u · Ί η τ' · i do s (e seus derivados quí- rnico s) DNA (cadeia dupi . d. O d cade r L a simples) a) linear (e seus x vados Ql limic os) b) c ircular (e. q . pia SiTlidO 0 iu f cosmideos, RAfq V AP d RNA total, RNA r geíro, RNA, RNA mi’ tocondríal, RNA ar ti .c ^ η aptâ meros PNA (ácidos nu cr ercos .pépt ido s) An ti corpos Polr iisf Mo noclonais, recombinantes, manipulados, antigénios, haptenos, proteinas subunida· ΡΕ1192448 necessar: des de anticorpo FAB (modificada modificadas, enzima enzimas, complexos marcadas com Hrs 3 Hístidina-tag (Hl proteínas dores de proteínas componente , cofactores ou inibi de proteína, lectinas idina, quelantes par -tag), proteínas marca das, anticorpos artificiais, impressões moleculares plasticorpos receptores de membrana, células completas fragmentos celulares e subestruturas celulares, sina pses, agonistas/antagonistas, células, organelos de célula, e.g. microssomas pequenas moléculas tais como benzodiazepinas, prostaglandinas, antibióticos, fármacos, metabolitos, fármacos de meta bolitOS produtos naturais hidratos de carbono e derivados irgandos naturais e artifrciars esteróídes, hormonas péptidos polímeros nativos ou artificiais sondas moleculares receptores naturars e artificiais e seus derivados químicos agentes quelantes, éter em coroa, ligandos, montagen supramoleculares indicadores (pH, potencial, potencial de membrana potencial redox) amostras de tecido (micromatrizes de tecido) 9 ΡΕ1192448
- 29. Processo vi ndi caçoes anteriores, incluindo adicionar material de . \x 0 ã O fluorescente às amo stras sob investigação e p tar por sensor a flúor rescência induzida nas referidas St τ 3. s por excitação das amostras peio campo evanescente aumenti S A Proce sso 0iTi ciC or do com d -1 em que o n nai :erial de liiCt U. Ç- o. o í 1 uores cen mar cador iumi nescent P 3 j. * Proce sso d.0 ac o r p r-> com. em. que o m .3.0. Θ -T.’ n. 3.1 de ir ;.dr iça , fluo r' 0 y composto ou c omposto s Ir rminesc ^ Θ c. I -l· cu c ru p c sui no interval p 0.0 4 0 0 nm. 100 xmt que Sã( 0i i modif ic. p, p O S d.0 mo d. o a. £ t Θ ,u •em 1 i g 3 d 3 ' p ci Γ' ceiros c le af in í d?j 3 de, rnc :ln rn d.0 de r: i vad d-O S seguinu es * polifen il o e compost ,.dS i. L0 L. er 3.. rornat ico; a. um estiIbenos, ma r s ma i s cu ma na s, cora .nt es de xanteno, cora .nt es de metina, cora .nt es de oxazina, roda .mi na Q ^ / fluo re SC ei na Q • ^ / cu ma .ri na s, e :stí ibenos f periien^R pirenos, 10 ΡΕ1192448 talocianinas, derivados de azobenzeno, diestlril-bife-n i 1 o s, complexos de metal de transição e.g. complexos de polipiridilo/ruténio, de tris(2,2'-bipiridil)cloreto de ruténio, tris(1,10-fenantrolina)cloreto de ruténio, tris (4, 7-difenil-1, 10-fenantrolina) cloreto de ruténio e complexos de polipiridilo/fenazina/ruténio, tais como octaetil-platrna-porfirina, complexos Európio e Térbio particuias/esferas de Quantum dot ou seus derivados. com qualquer reivin-em qualquer um ou mais
- 32. Processo de acordo dicação antecedente quando utilizado dos seguintes: Expressão genética Genómica Farmacogenétiea Toxicogenómica TOxicoproteómica Genética Farmacogenétiea Toxicogenética Perfil de expressão de exão/íntrão Tipagem de Antigénios de Leucócitos Humanos (HLA) “ Análise de va riantes d? í ex crsao “ Proteómica (e nsaios de pr o teina em chip) - Monitorização de doen te (fármaco, metabolitos e 11 ΡΕ1192448 Cuidados no consultório, "medicina personalizada" Diagnóstico géis 2d no chip para proteómica SNP {polimorfismos de únicos nucleótidos) , mini-sequenciação proteína·· proteína molecular proteina-anticorpo e péptido à base de Rastreio de Elevado Rendimento Química combinatória Interacçâo Interacçâo Interacçâo chip Proteína fluorescente verde (GFP) Hibridação in situ Mieroseopia confocai Espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) Microscopia convencional MALDI-TQF MS, Lisboa 21 de Dezembro de 2006i ΡΕ1192448 2/9ΡΕ1192448 3/9ΡΕ1192448 4/9ΡΕ1192448 5/9ΡΕ1192448 6/9 FÍG, 7aepxfluoraseãrsci aM—— β .[fâfft —----------»,„·-·φ· Csorsm de 10¾ vea&s 4® srassrot® de sltsal FIG7b aaiaísfifcíi <*« WkpôEr.fll da isaa^ôBi ΡΕ1192448 7/9 FI& 8aFIG. 8bm mam si dxbocsΡΕ1192448 8/99 t ♦ t_§ i * * i f • f μ ϋ *99 w ' 9 • · w “ 9 1 1 «ΡΕ1192448 9/9*rçidio i contagens i definido como daavio padrão do roído· da fundo
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