PT1007537E - Proteína receptora designada 2f1 - Google Patents

Description

ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Proteína receptora designada 2F1"

ANTECEDENTES DO INVENTO O receptor da interleucina-1 tipo I (IL-1RI) medeia os efeitos biológicos da interleucina-1, uma citoquina pró-inflamatória (Sims et al., Science 241: 585-589, 1988; Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 3045-3049, 1989). Um segundo receptor da interleucina-1 (designado IL-1R tipo II ou IL-1RII) liga IL-1, mas não parece mediar a transdução de sinal (McMahan et al., EMBO J. 10: 2821, 1991; Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6155-6159, 1993). IL-1RI e IL-lRII ligam, cada um, IL-ΐα e IL-ΐβ. IL-1RI e IL-lRII pertencem a uma família de proteínas que exibem homologia de sequências significativa. Uma destas proteínas é a proteína acessória IL-1R (IL-1R AcP), descrita em Greenfeder et al. (J. Biol. Chem. 270: 13757-13765, 1995). Esta proteína, por si só, não é capaz de ligar IL-1, mas forma um complexo com IL-1RI e ou IL-Ια ou IL-ΐβ. Quando co-expressa com IL-1RI, a IL-1RI AcP recombinante aumenta a afinidade de ligação de IL-1RI para IL-ΐβ (Greenfeder et al., supra). A proteína diversamente conhecida como ST2, ST2L, Tl ou Fit-1 é também um membro da família IL-1R, mas não liga IL-1. Foi descrita a clonagem de ADNc de ratinho e rato que codificam formas ligadas a membrana e segregadas desta proteína (Klemenz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 5708, 1989; Tominaga, FEBS LETTERS 258: 301, 1989; Yanagisawa et al., FEBS LETTERS 318: 83, 1993; Bergers et al., EMBO J. 13: 1176, 1994). Foi também isolado ADNc de ST2 humano e clones genómicos (Tominaga et al., Biochimica et Biophysica Acta 1171: 215, 1992).

Outras proteínas que exibem homologia de sequência significativa com IL-lRI são MyD88 de murino (Lord et al., Oncogene 5: 1095-1097, 1990), rsc786 humano (Nomura et al., DNA Res. 1: 27-35, 1994) e um número de proteínas de Drosophila, das quais a mais bem caracterizada é Toll 2 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (Hashimoto et al., Cell 52, 269-279, 1988). O gene N do tabaco (Whitham et al., Cell 78: 1101-1115, 1994) está entre os membros da família IL-1R adicionais.

MyD88, rsc786, Toll e o produto de gene N de tabaco contêm domínios que exibem homologia significativa para o domínio citoplasmático da IL-1RI. As proteínas IL-1R AcP e ST2 exibem similaridade de sequência para IL-1RI nas suas porções extracelulares e citoplasmáticas. A proteína B16R de vírus vacínia (Goebel et al., Virology 179: 247, 1990) parece ser um homólogo virai de IL-1RII. A identificação de receptores adicionais desta família é desejável. Tais proteínas receptoras podem ser estudadas para determinar se ligam ou não IL-1 e, se sim, se os receptores desempenham um papel na mediação da transdução de sinal. A existência possível de subunidades conversoras de afinidade adicionais para receptores desta família pode também ser explorada.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona uma nova proteína receptora designada 2F1. São aqui descritas as duas formas de 2F1, solúvel e ligada a membrana. 0 presente invento proporciona também ADN isolado que codifica proteínas 2F1, vectores de expressão compreendendo o ADN isolado e um método para produção de 2F1 por cultura de células hospedeiras transformadas com os vectores de expressão sob condições adequadas para expressão da proteína 2F1. São também descritos anticorpos dirigidos contra 2F1. A 2F1 tem utilidade na inibição da síntese de prostaglandinas e no alívio da inflamação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O ADN que codifica uma nova proteína receptora designada 2F1 foi isolado de acordo com o presente invento. São proporcionados vectores de expressão compreendendo o ADN de 2F1, assim como métodos para produção de polipéptidos 2F1 recombinantes por cultura de células hospedeiras contendo os vectores de expressão sob condições adequadas para expressão 3 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ de 2F1, seguindo-se recuperação da proteína 2F1 expressa. A proteína 2F1 purificada está também abrangida pelo presente invento, incluindo formas solúveis da proteína que compreendem o domínio extracelular. O presente invento proporciona também 2F1 e seus fragmentos imunogénicos que podem ser utilizados como imunogénios para produzir anticorpos específicos para eles. Numa concretização, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

Os clones de 2F1 humanos foram isolados como descrito no exemplo 1. A sequência de ADN de 2F1 humana é apresentada em SEQ ID NO:l e a sequência de aminoácidos assim codificada é apresentada em SEQ ID NO:2. A proteína inclui um péptido de sinal (aminoácidos -19 a -1) seguido por um domínio extracelular (aminoácidos 1 a 310), uma região transmembranar (aminoácidos 311 a 332) e um domínio citoplasmático (aminoácidos 333 a 522). O ADNc de 2F1 de ratinho foi isolado por hibridação inter-espécies, como descrito no exemplo 2. O ADN e as sequências de aminoácidos codificadas deste ADN DE 2F1 de ratinho são apresentados em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4. A proteína de SEQ ID NO: 4 compreende um péptido de sinal (aminoácidos -18 a -1), um domínio extracelular (aminoácidos 1 a 307), uma região transmembranar (aminoácidos 308 a 330) e um domínio citoplasmático (aminoácidos 331 a 519). As sequências de aminoácidos de 2F1 de ratinho e humana são 65% idênticas. A sequência de aminoácidos da proteína 2F1 indica que esta é um membro da família de receptores de IL-1. Dos membros conhecidos da família de receptores de IL-1, a 2F1 tem o maior grau de homologia de sequências com a proteína acessória IL-lR (IL-1R AcP), T1/ST2 e o receptor da IL-1 tipo I (IL-1RI). A sequência de aminoácidos de 2F1 de murino de SEQ ID NO: 4 é 31% idêntica à sequência de aminoácidos de IL-IR AcP de murino, 30% idêntica à de T1/ST2 de murino de comprimento total e 27% idêntica à de IL-1RI de murino. Os domínios citoplasmáticos mostram conservação de sequência ligeiramente maior (36%-44%) do que as porções extracelulares (20%-27%). 4 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ Ο teste de ligação descrito no exemplo 3 foi realizado para determinar se 2F1 liga IL-la, IL-ΐβ ou antagonista do receptor de IL-1. Embora 2F1 seja um membro da família de receptores de IL-1, não ligou qualquer uma das três proteínas testadas. A 2F1 humana e de ratinho estão no âmbito do presente invento, assim como as proteínas 2F1 derivadas de outros organismos, incluindo mas não se lhes limitando, espécies de mamíferos tais como rato, bovino, porcino ou vários primatas não humanos. O ADN que codifica proteínas 2F1 a partir de organismos adicionais pode ser identificado por técnicas de hibridação inter-espécies. Os ARN mensageiros isolados a partir de vários tipos de células podem ser analisados em transferências de Northern para determinar uma fonte adequada de ARNm para utilização na clonagem de ADNc de 2F1 de outras espécies. O termo "2Fl" como aqui utilizado refere-se a um género de polipéptidos que são substancialmente homólogos a uma proteína 2F1 nativa (por exemplo, a proteína de SEQ ID NO:2 ou 4) e que exibem uma actividade biológica de uma proteína 2F1 nativa. As proteínas 2F1 do presente invento incluem proteínas ligadas à membrana (compreendendo um domínio extracelular, uma região transmembranar e um domínio citoplasmático) assim como proteínas truncadas que retêm uma propriedade desejada. Tais proteínas truncadas incluem, por exemplo, 2F1 solúvel compreendendo apenas o domínio extracelular ou um seu fragmento. São também incluídas variantes de proteínas 2F1 nativas, em que as variantes retêm uma actividade biológica desejada de um 2F1 nativo. Tais variantes são descritas com mais detalhe abaixo.

Um polipéptido 2F1, ou um seu fragmento ou variante, pode ser testado quanto à actividade biológica em qualquer teste adequado. Quando o domínio citoplasmático é alterado (por exemplo, truncado ou alterado por deleção, adição ou substituição de resíduos de aminoácido), o polipéptido 2F1 pode ser testado quanto à actividade biológica num teste de transdução de sinal. Tais testes incluem, mas não se lhes limitam, os descritos nos exemplos 5 a 7 abaixo. O domínio citoplasmático alterado pode ser fundido com o domínio 5 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ extracelular de um receptor de IL-1 e o receptor quimérico resultante pode ser testado quanto à capacidade para responder a IL-1 por activação de NF-KB (ver o procedimento do exemplo 5), indução da função promotora de IL-8 (exemplo 6) ou estimulação da síntese de prostaglandina E2 (exemplo 7). Os polipéptidos 2F1 que incluem um domínio extracelular (por exemplo, 2F1 solúvel, como descrito abaixo) podem ser testados quanto à capacidade para inibir a síntese de prostaglandina E2 in vivo em estudos animais. O 2F1 é administrado in vivo sendo medidos os níveis de prostaglandina E2 nos animais (antes e após administração de 2F1 e comparados com animais de controlo) por um qualquer meio adequado, por exemplo, por ELISA.

Uma concretização do presente invento refere-se a polipéptidos 2F1 solúveis. Os polipéptidos 2F1 solúveis compreendem todo ou parte do domínio extracelular de uma 2F1 nativa, mas carecem da região transmembranar que pode causar retenção do polipéptido numa membrana celular. Quando inicialmente sintetizados, os polipéptidos 2F1 solúveis compreendem vantajosamente 0 péptido de sinal nativo (ou um heterólogo) para promover secreção, no entanto o péptido de sinal é clivado após secreção de 2F1 a partir da célula.

Uma utilização dos polipéptidos 2F1 solúveis é no bloqueio de uma actividade biológica de 2F1. A 2F1 solúvel pode ser administrada a um mamífero para ligar um qualquer ligando de 2F1 endógeno, inibindo assim a ligação de destes ligandos a receptores endógenos que compreendem 2F1. Numa concretização, um polipéptido 2F1 solúvel é administrado para tratar dor ou inflamação por inibição da síntese de prostaglandinas, como discutido com mais detalhe abaixo. A 2F1 solúvel pode ser identificada (e distinguida das suas contrapartidas ligadas à membrana, não solúveis) por separação de células intactas que expressam a proteína desejada a partir do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação e análise do meio (sobrenadante) quanto à presença da proteína desejada. A presença de 2F1 no meio indica que a proteína foi segregada a partir das células sendo assim uma forma solúvel da proteína desejada. A 2F1 solúvel pode ser uma forma de ocorrência natural desta 6 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ proteína. A utilização de formas solúveis de 2F1 é vantajosa para certas aplicações. A purificação das proteínas a partir de células hospedeiras recombinantes está facilitada, uma vez que as proteínas solúveis são segregadas pelas células. Além disso, as proteínas solúveis são geralmente mais adequadas para administração intravenosa.

Exemplos de polipéptidos 2F1 solúveis incluem aqueles compreendendo o domínio extracelular completo de uma proteína 2F1 nativa. Um tal polipéptido é uma 2F1 humana solúvel compreendendo os aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:2. Um outro é uma 2F1 de murino solúvel compreendendo os aminoácidos 1 a 307 de SEQ ID NO:4. Quando inicialmente expresso numa célula hospedeira, o polipéptido solúvel pode compreender adicionalmente um dos péptidos de sinal heterólogos descritos abaixo que é funcional nas células hospedeiras utilizadas. Alternativamente, o polipéptido pode compreender o péptido de sinal nativo, de modo que o 2F1 compreenda os aminoácidos -19 a 310 de SEQ ID NO:2 ou os aminoácidos -18 a 307 de SEQ ID NO:4. Os polipéptidos 2Fl solúveis incluem fragmentos do domínio extracelular que retêm uma actividade biológica desejada. As sequências de adn que codificam os polipéptidos 2F1 solúveis estão abrangidas pelo presente invento.

Os fragmentos 2F1, incluindo polipéptidos solúveis, podem ser preparados por um qualquer número de técnicas convencionais. Uma sequência de ADN desejada pode ser quimicamente sintetizada utilizando técnicas conhecidas. Os fragmentos de ADN podem também ser produzidos por digestão com endonuclease de restrição de uma sequência de ADN clonada de comprimento total e isolados por electroforese em géis de agarose. Os oligonucleótidos que reconstroem a extremidade 5' ou 3' de um fragmento de ADN num ponto desejado podem ser sintetizados. Os oligonucleótidos podem conter um local de clivagem por endonuclease de restrição a montante da sequência de codificação desejada e posicionam um codão de iniciação (ATG) no terminal 5' da sequência de codificação. Os ligantes contendo o(s) local(s) de clivagem para endonucleases de restrição podem ser utilizados para inserir o fragmento de ADN desejado num vector de expressão. 7 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de mutagénese conhecidas para inserir um codão de paragem num ponto desejado, por exemplo, imediatamente a jusante do codão para o último aminoácido do domínio extracelular.

Como uma outra alternativa, pode-se utilizar o procedimento de reacção em cadeia com polimerase (PCR) bem conhecido para isolar uma sequência de ADN que codifica um fragmento de proteína desejado. Os oligonucleótidos que definem os terminais do fragmento desejado são utilizados como iniciadores na reacção. São descritos procedimentos de PCR, por exemplo, em Saiki et al. (Science 239: 487, 1988) e em Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press Inc., San Diego, 1989, pg. 189-196.

Relativamente à discussão anterior de péptidos de sinal e dos vários domínios das proteínas 2F1, o técnico experimentado reconhecerá que as fronteiras acima descritas destas regiões das proteínas são aproximadas. Por exemplo, embora estejam disponíveis programas de computador que prevêem o local de clivagem de um péptido de sinal, pode ocorrer clivagem noutros locais diferentes dos previstos. Além disso, reconhece-se que uma preparação de proteína pode compreender uma mistura de moléculas de proteínas tendo aminoácidos N-terminais diferentes, devido a clivagem do péptido de sinal em mais do que um local. Adicionalmente, as fronteiras exactas de uma região transmembranar podem diferir dos previstos por um programa de computador. Tais formas de 2F1 que retêm a actividade biológica desejada estão incluídas entre os polipéptidos 2F1 do presente invento. O presente invento proporciona polipéptidos 2F1 purificados, recombinantes e não recombinantes. As variantes e derivados de proteínas 2F1 nativas que retêm a actividade biológica desejada estão também no âmbito do presente invento. As variantes de 2F1 podem ser obtidas por mutações de sequências nucleotídicas que codificam os polipéptidos 2F1 nativos. Uma variante de 2F1, como aqui referida, é um polipéptido substancialmente homólogo a um 2F1 nativo, mas que tem uma sequência de aminoácidos diferente da de um 2F1 nativo devido a uma ou mais deleções, inserções ou substituições. 8 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ A sequência de aminoácidos variante é, de preferência, pelo menos, 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos de 2F1 nativa, mais preferivelmente, pelo menos, 90% idêntica. A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, por comparação da informação de sequência utilizando o programa de computador GAP, versão 6.0 descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) e disponível de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). O programa GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), revisto por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math 2: 482, 1981). Os parâmetros por defeito preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unitária (contendo um valor de 1 para identidades e de 0 para não identidades) para nucleótidos e a matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, descrita por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pgs. 353-358, 1979; (2) uma penalização de 3,0 para cada hiato e uma penalização adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) sem penalizações para hiatos terminais. O ADN que codifica tais variantes é também proporcionado pelo presente invento. Tais sequências de ADN são, de preferência, pelo menos, 80% idênticas a uma sequência de ADN de 2F1 nativa, mais preferivelmente, pelo menos, 90% idêntica. A percentagem de identidade pode ser determinada utilizando programas de computador conhecidos, tal como o programa GAP acima descrito.

As alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser realizadas por qualquer uma de várias técnicas conhecidas. As mutações podem ser introduzidas em loci particulares por síntese de oligonucleótidos contendo uma sequência mutante, flanqueada por locais de restrição que permitem a ligação a fragmentos da sequência nativa. Após ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo tendo a inserção, substituição ou deleção de aminoácidos desejadas.

Alternativamente, podem ser utilizados procedimentos de mutagénese específica do local dirigida por oligonucleótidos 9 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ para proporcionar um gene alterado tendo codões particulares alterados de acordo com a substituição, deleção ou inserção requeridas. Os métodos para efectuar as alterações acima estabelecidas são descritos por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Janeiro 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); e Patentes U.S. 4518584 e 4737462.

As variantes incluem sequências conservativamente substituídas, o que significa que um ou mais dos resíduos de aminoácido de um 2F1 nativo é(são) substituído(s) por um resíduo diferente, mas que o polipéptido 2F1 conservativamente substituído retém a actividade biológica desejada da proteína nativa. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de resíduos que não alteram a estrutura secundária ou terciária da proteína.

Um dado aminoácido pode ser substituído por um resíduo tendo características físico-químicas similares. Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo alifático por um outro, tal como ile, vai, Leu ou Ala por um outro ou substituições de um resíduo polar por um outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. São também conhecidas outras substituições conservativas, por exemplo, envolvendo substituições de regiões completas com características de hidrofobicidade similares.

As proteínas 2F1 podem também ser modificadas para criar derivados de 2F1 por formação de conjugados covalentes ou agregados com outras porções químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo e semelhantes. Os derivados covalentes de 2F1 podem ser preparados por ligação das porções químicas a grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácidos de 2F1 ou no terminal N ou no terminal C de um polipéptido 2F1 ou no seu domínio extracelular. Outros derivados de 2F1 no âmbito deste invento incluem conjugados covalentes ou agregados de 2F1 com outras proteínas ou polipéptidos, por exemplo, fusões N-terminais ou C-terminais produzidas por tecnologia de ADN recombinante. Por exemplo, o 10 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ conjugado pode compreender uma sequência polipeptídica de sinal ou de comando, heteróloga, no N-terminal de um polipéptido 2F1. O péptido de sinal ou de comando dirige em co-tradução ou pós-tradução a transferência do conjugado do seu local de síntese para um local dentro ou fora da membrana ou parede celular.

As fusões de polipéptidos 2F1 podem compreender péptidos adicionados para facilitar a purificação e a identificação de 2F1. Tais péptidos incluem, por exemplo, poli-His ou os péptidos de identificação antigénicos descritos na Patente U.S. 5011912 e em Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988. Um tal péptido é o péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:5), que é altamente antigénico e proporciona um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico, que permite a análise rápida e a purificação fácil da proteína recombinante expressa. Os sistemas de expressão úteis para fusão do octapéptido Flag® no terminal N ou C de uma dada proteína estão disponíveis em Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, CT, assim como anticorpos monoclonais que ligam o octapéptido. 0 presente invento inclui adicionalmente polipéptidos 2F1 com ou sem um padrão de glicosilação nativo associado. 0 2F1 expresso em sistemas de expressão de levedura ou de mamíferos pode ser similar a, ou significativamente diferente de, um polipéptido 2F1 nativo em peso molecular e padrão de glicosilação, dependendo da escolha do sistema de expressão. A expressão de polipéptidos 2F1 em sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli, proporciona moléculas não glicosiladas.

Os locais de N-glicosilação no domínio extracelular de 2Fl podem ser modificados para impedir a glicosilação. Os locais de N-glicosilação em polipéptidos eucarióticos são caracterizados por um tripleto de aminoácidos Asn-X-Y, em que X é um qualquer aminoácido com excepção de Pro e Y é Ser ou Thr. O domínio extracelular da proteína 2F1 humana contém estes tripletos nos aminoácidos 72-74, 83-85, 131-133, 149-

151, 178-180, 184-186, 217-219 e 278-280 de SEQ ID NO:2. A proteína 2Fl de murino contém estes tripletos nos aminoácidos 11 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 32-34, 53-55, 89-91, 93-95, 116-118, 171-173, 176-178, 182- 184, 215-217, 277-279 e 460-462 de SEQ ID NO:4. As modificações adequadas na sequência nucleotidica que codifica este tripleto vão resultar em substituições, adições ou deleções que impedem a ligação de resíduos de hidrato de carbono na cadeia lateral de Asn. A alteração de um único nucleótido, escolhido de modo a Asn ser substituído por um aminoácido diferente, por exemplo, é suficiente para inactivar um local de N-glicosilação. Os procedimentos conhecidos para inactivação de locais de N-glicosilação em proteínas incluem aqueles descritos na Patente U.S. 5071972 e EP 276846.

As variantes adicionais são aquelas nas quais os resíduos de cisteína que não são essenciais para actividade a biológica são eliminados ou substituídos por outros aminoácidos, prevenindo a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas após renaturação. Assim, como com os outros membros da família il-Ir, o domínio extracelular de 2F1 contém três domínios semelhantes a imunoglobulina (Ig). Com base no alinhamento da sequência de aminoácidos de 2F1 humana com a de outros membros da família, as cisteínas que se prevêem formar ligações dissulfureto intradomínio típicas dos domínios ig estão localizadas nas posições 121, 166, 218 e 279 de SEQ ID NO:2. O primeiro domínio Ig (mais N-terminal) inclui a primeira (resíduo 22) mas carece da segunda cisteína do par conservado noutras proteínas desta família. Assim, prevê-se que o primeiro domínio Ig de 2F1 careça da ligação dissulfureto intradomínio que é típica de domínios Ig. Tal como todas as proteínas semelhantes a IL-IR com excepção de T1/ST2, a 2F1 de ratinho e humana têm também um resíduo de cisteína apenas a alguns resíduos no sentido C-terminal do ponto de clivagem do péptido de sinal (a cisteína na posição 2 de SEQ ID NO:2 e na posição 4 de SEQ ID NO: 4). Os fragmentos e variantes de 2F1 contêm, de preferência, estas cisteínas conservadas.

Outras variantes são preparadas por modificação de resíduos de aminoácido dibásicos adjacentes para aumentar a expressão em sistemas de levedura nos quais está presente actividade de protease KEX2. Em EP 212914 descreve-se a utilização de mutagénese específica do local para inactivar 12 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ locais de processamento por protease KEX2 numa proteína. Os locais de processamento por protease KEX2 são inactivados por deleção, adição ou substituição de resíduos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys e Lys-Arg para eliminar a ocorrência destes resíduos básicos adjacentes. A 2F1 humana contém estes locais de processamento por protease KEX2 nos aminoácidos 94-95, 296-297, 345-346, 418-419 e 448-449 de SEQ ID NO:2. A 2F1 de murino contém locais de processamento por protease KEX2 nos aminoácidos 87-88, 96-97, 231-232, 244-245, 295-296, 339-340, 416-417, 432-433 e 446-447 de SEQ ID NO:4. Os pares Lys-Lys são consideravelmente menos susceptíveis a clivagem por KEX2 e a conversão de Arg-Lys ou Lys-Arg em Lys-Lys representa uma abordagem conservativa e preferida para inactivação de locais KEX2.

As variantes de 2F1 que ocorrem naturalmente estão também abrangidas pelo presente invento. Exemplos de tais variantes são proteínas que resultam de eventos de splicing alternativo do ARNm ou de clivagem proteolítica da proteína 2F1, em que é retida a actividade biológica desejada. A união alternativa de ARNm pode originar uma proteína 2F1 truncada mas biologicamente activa, tal como, por exemplo, uma forma solúvel que ocorre naturalmente da proteína. As variações atribuíveis ao processamento pós-tradução ou proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C após expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido à remoção proteolítica de um ou mais aminoácido(s) terminal(ais) da proteína 2F1 (geralmente dos aminoácidos terminais 1-5).

As proteínas 2F1 nas quais as diferenças da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 são atribuíveis a polimorfismo genético (variação alélica entre indivíduos que produzem a proteína) estão também entre as variantes que ocorrem naturalmente aqui contempladas. A sequência de 2F1 humana apresentada em SEQ ID NO:l é derivada dos três clones de ADNc de uma biblioteca de linfócitos de sangue periférico e quatro clones de PCR da linha de carcinoma epidérmico KB (ver exemplo 1). O codão para a alanina 298 é polimórfico, estando presente nos clones de PBL e em dois dos clones KB e ausente dos outros dois clones KB. Está também ausente dos dois clones de ratinho que são derivados de uma biblioteca de 13 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ células Τ EL4. Ο presente invento proporciona assim proteínas 2F1 humanas contendo ou carecendo de um resíduo alanina na posição 298. O presente invento proporciona sequências de ADN isoladas que codificam os polipéptidos 2F1 novos aqui descritos. O ADN que codifica 2F1 abrangido pelo presente invento inclui, por exemplo, ADNc, ADN quimicamente sintetizado, ADN isolado por PCR, ADN genómico e suas combinações. O ADN genómico de 2F1 pode ser isolado por técnicas convencionais, por exemplo, utilizando o ADN das SEQ ID N0:1 ou 3, ou um seu fragmento, como uma sonda no procedimento de hibridação.

As concretizações particulares do presente invento referem-se a um ADN isolado compreendendo os nucleótidos 1 a 1626 de SEQ ID N0:1 (a região de codificação completa), os nucleótidos 58 a 1626 de SEQ ID N0:1 (que codificam 2F1 humana madura), os nucleótidos 381 a 1994 de SEQ ID NO:3 (a região de codificação completa) ou os nucleótidos 435 a 1994 de SEQ ID NO:3 (que codificam 2F1 de murino madura). Noutras concretizações, as sequências de ADN isoladas codificam um fragmento de 2F1, tal como um dos polipéptidos solúveis acima descritos. Tais ADN incluem um ADN compreendendo os nucleótidos 1 a 985 de SEQ ID NO:l (que codificam os aminoácidos -19 a 310 de SEQ ID NO:2), os nucleótidos 58 a 985 de SEQ ID NO:l (que codificam os aminoácidos 1 a 310 de SEQ ID NO:2), os nucleótidos 381 a 1355 de SEQ ID NO:3 (que codificam os aminoácidos -18 a 307 de SEQ ID NO:4) e os nucleótidos 435 a 1355 de SEQ ID NO: 3 (que codificam os aminoácidos 1 a 307 de SEQ ID NO:4). Os ADN que codificam as várias formas de 2F1 aqui descritas, por exemplo, variantes e proteínas de fusão de 2F1, estão abrangidos pelo presente invento.

As sequências de ácido nucleico no âmbito do presente invento incluem sequências de ADN e ARN isoladas que hibridam com as sequências nucleotídicas de 2F1 nativas aqui descritas sob condições moderada ou altamente rigorosas e que codificam 2F1 biologicamente activo. As condições de hibridação de rigor moderado referem-se às condições descritas, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory 14 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Manual, 2a ed. Vol. 1, pgs.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). As condições de rigor moderado, definidas por Sambrook et al., incluem a utilização de uma solução de pré-lavagem de SSC 5X, SDS a 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), hibridação a aproximadamente 55°C em SSC 5X durante a noite, seguida por lavagem a 50-55°C em SSC 2x, SDS a 0,1%. As condições de elevado rigor incluem temperaturas de hibridação e lavagem mais elevadas. O técnico especialista reconhecerá que a temperatura e concentração salina da solução de lavagem podem ser ajustadas quando necessário de acordo com factores tais como comprimento da sonda. Numa concretização, as condições de elevado rigor incluem hibridação a 68°C seguida por lavagem em SSC 0,1X/SDS a 0,1% a 68°C.

Devido à conhecida degeneração do código genético, em que mais do que um codão pode codificar o mesmo aminoácido, uma sequência de ADN pode variar da apresentada em SEQ ID NO:l ou 3 e por outro lado codificar uma proteína 2F1 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou 4, respectivamente. Tais sequências de ADN variantes podem resultar de mutações silenciosas que ocorrem, por exemplo, durante a amplificação por PCR. Alternativamente, a sequência variante pode ser o produto de mutagénese deliberada de uma sequência nativa. O presente invento proporciona assim sequências de ADN isoladas que codificam 2F1 biologicamente activo, seleccionado a partir de: (a) ADN derivado da região de codificação de um gene 2F1 de mamífero nativo (por exemplo, ADN compreendendo a região de codificação da sequência nucleotídica apresentada em SEQ ID NO:l ou 3); (b) ADN capaz de hibridar num ADN de (a) sob condições modera ou altamente rigorosas; e (c) ADN que é degenerado em resultado do código genético num ADN definido em (a) ou (b) . As proteínas 2F1 codificadas por tais sequências de ADN estão abrangidas pelo presente invento.

Exemplos de proteínas 2F1 codificadas pelo ADN que varia da sequência de ADN nativa de SEQ ID NO:l ou 3, em que o ADN variante vai hibridar com a sequência de ADN nativa sob condições moderada ou altamente rigorosas, incluem, mas não 15 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ estão limitados a, fragmentos de 2F1 e proteínas 2F1 compreendendo local(s) de N-glicosilação inactivado(s) ou local(s) de processamento por protease KEX2 inactivado(s). Outros exemplos são proteínas 2F1 codificadas por ADN derivado de outras espécies de mamíferos, em que o ADN vai hibridar com o ADN humano de SEQ ID NO:l ou com o ADN de ratinho de SEQ ID NO:3.

Proteína 2F1 Purificada e Suas Utilizações O presente invento proporciona polipéptidos 2F1 purificados, que podem ser produzidos por sistemas de expressão recombinante como descrito abaixo ou purificados a partir de células que ocorrem naturalmente. Podem ser utilizadas técnicas de purificação de proteínas convencionais. O grau de pureza desejado pode depender da utilização pretendida da proteína. Um grau de pureza relativamente elevado é desejado quando, por exemplo, a proteína se destina a ser administrada in vivo. Os polipéptidos 2F1 são vantajosamente purificados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) de forma a não serem detectadas quaisquer outras bandas de proteína correspondentes a outras proteínas (que não 2F1) . Será reconhecido por um perito na área pertinente que podem ser detectadas por SDS-PAGE bandas múltiplas correspondentes à proteína 2F1, devido a glicosilação diferencial, variações no processamento pós-tradução e semelhantes, como acima discutido. Mais preferivelmente, a 2F1 é purificada até homogeneidade substancial, indicada por uma única banda de proteína após análise por SDS-PAGE. A banda de proteína pode ser visualizada por coloração com prata, coloração com azul de Coomassie ou (se a proteína for radiomarcada) por autorradiografia.

Um processo para produção da proteína 2F1 compreende a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão compreendendo uma sequência de ADN que codifica 2F1 sob condições em que seja expressa 2F1. A proteína 2F1 é então recuperada a partir do meio de cultura ou extractos de células, dependendo do sistema de expressão utilizado. Como 16 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ reconhecido pelo técnico especialista, os procedimentos de purificação de 2F1 recombinante vão variar de acordo com factores tais como o tipo de células hospedeiras utilizadas e se é a 2F1 segregada ou não para o meio de cultura.

Por exemplo, quando se utilizam sistemas de expressão que segregam a proteína recombinante, o meio de cultura pode ser primeiramente concentrado utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado numa matriz de purificação tal como meio de filtração de gel. Alternativamente, pode ser utilizada uma resina de permuta aniónica, por exemplo, uma matriz ou substrato tendo grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente utilizados na purificação de proteínas. Alternativamente, pode ser utilizado um passo de permuta catiónica. Os permutadores catiónicos adequados incluem matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Preferem-se os grupos sulfopropilo. Finalmente, podem ser utilizados para purificar adicionalmente 2F1, um ou mais passos de cromatografia líquida de elevada resolução de fase inversa (rp-hplc) que utilizam meios RP-HPLC hidrófobos (por exemplo, sílica gel tendo grupos metilo ou outros alifáticos pendentes). Utilizam-se todos ou alguns dos passos de purificação anteriores, em várias combinações, para proporcionar a proteína recombinante substancialmente homogénea. É também possível utilizar uma coluna de afinidade compreendendo um anticorpo que liga 2F1 para purificar polipéptidos 2F1 por cromatografia de imunoafinidade. O exemplo 8 descreve um procedimento para utilização da proteína 2F1 do presente invento como um imunogénio para produzir anticorpos monoclonais.

Os procedimentos cromatográficos anteriores estão entre os que podem ser utilizados para purificar quer 2F1 recombinante quer 2F1 não recombinante. A cultura de células recombinantes permite a produção da proteína isenta das proteínas contaminantes que podem estar normalmente 17 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ associadas a 2F1 tal como se encontra na natureza, por exemplo, na superfície de certos tipos de células. A proteína recombinante produzida em culturas bacterianas é normalmente isolada por ruptura inicial das células hospedeiras, centrifugação, extracção a partir das peletes de células se o polipéptido for insolúvel ou a partir do fluído sobrenadante se o polipéptido for solúvel, seguida por um ou mais passo(s) de concentração, dessalinização, permuta iónica, purificação de afinidade ou cromatografia de exclusão por tamanhos. Finalmente, pode-se utilizar RP-HPLC nos passos finais de purificação. As células microbianas podem ser rompidas por um qualquer método adequado, incluindo ciclos de congelação-descongelação, tratamento com ultra-sons, rotura mecânica ou utilização de agentes de lise celular. 2F1 é expresso, de preferência, como um polipéptido segregado para simplificar a purificação. Os polipéptidos recombinantes segregados a partir de uma fermentação de células hospedeiras de levedura podem ser purificados por métodos análogos aos descritos por Urdal et al. (J.

Chromatog. 296: 171, 1984), que incluem dois passos de HPLC de fase inversa, sequenciais. São aqui proporcionados conjugados compreendendo um polipéptido 2F1 e um agente detectável. O agente está, de preferência, covalentemente ligado ao polipéptido 2F1. Tais conjugados têm utilidade, por exemplo, em teste in vitro.

Os agentes adequados incluem, mas não estão limitados a, radionuclidos, cromóforos, compostos fluorescentes, enzimas que catalisam uma reacção colorimétrica ou fluorimétrica e semelhantes, sendo o agente particular escolhido de acordo com a aplicação pretendida. Os radionuclidos adequados incluem, mas não estão limitados a, 123I, 131I, 99mTc, mIn e 76Br.

Os agentes podem ser ligados ao 2F1 utilizando um qualquer método convencional pelo qual tais compostos são ligados aos polipéptidos em geral. Os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos de um 2F1 podem ser feitos 18 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ reagir, por exemplo, com grupos funcionais num agente desejado para formar ligações covalentes. O agente pode ser covalentemente ligado a 2F1 por via de uma ligação amida, ligação dissulfureto impedida, ligação clivável por ácido e semelhante, que estão entre as ligações que podem ser escolhidas de acordo com factores tais como a estrutura do agente desejado. Alternativamente, o 2F1 ou o agente podem ser derivatizados para produzir ou ligar um grupo funcional reactivo desejado. A derivatização pode envolver a ligação de um dos reagentes de acoplamento bifuncional disponíveis para ligação de várias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford Illinois). Conhece-se um certo número técnicas para radiomarcação de proteínas. Os metais radionuclido podem ser ligados a 2F1 utilizando um agente quelante bifuncional adequado, cujos exemplos estão descritos nas patentes U.S. 4897255 e 4965392.

Como descrito no exemplo 7, o domínio (citoplasmático) de sinalização de 2F1 transduz um sinal biológico que estimula a síntese de prostaglandina E2. As prostaglandinas são hidroxi-ácidos gordos de cadeia longa que ocorrem naturalmente e que exibem efeitos biológicos que incluem, inter alia, a mediação da dor e inflamação.

Uma concretização do presente invento refere-se à utilização de polipéptidos 2F1 solúveis para inibir a síntese de prostaglandinas. In vivo, a transdução de sinal pode ser iniciada pela ligação de ligando(s) não identificado(s) a receptores compreendendo 2F1. 2F1 solúvel é administrado a um mamífero para ligar tais ligandos, inibindo assim a ligação de ligando ao 2F1 da superfície celular endógena.

Os polipéptidos 2F1 solúveis podem ser administrados a um mamífero para tratar condições que são mediadas por uma prostaglandina. Uma condição é aqui referida como sendo mediada por uma prostaglandina quando a condição é, pelo menos, em parte, causada ou exacerbada (directa ou indirectamente) por uma prostaglandina.

Tais condições incluem, mas não estão limitadas a, inflamação associada a artrite (especialmente artrite reumatóide e osteoartrite), inflamação dos pulmões associada 19 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ a alergia ou asma, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, doença inflamatória do intestino e inflamação resultante de lesão (especialmente lesão de uma articulação). A característica desejável de inibição das prostaglandinas para tratar a febre, síndroma de Bartter, diabetes mellitus, persistência do canal arterial e dismenorreia é discutida em Harrisons's Principies of Internai Medicine, 13a Edição, Vol. 1, Isselbacher et al., Eds., McGraw-Hill, Inc. New York, 1994, pgs. 433-435. A prostaglandina E2 (PGE2) tem também sido implicada na reabsorção óssea, incluindo a reabsorção óssea associada a artrite reumatóide e doença periodontal (Isselbacher et al., Eds., supra, na página 434). Foi relatado que a PGE2 causa permeabilidade vascular aumentada, que é um aspecto da resposta inflamatória que pode conduzir a edema local (Isselbacher et al., Eds., supra, na página 435). As prostaglandinas e o seu papel na inflamação são adicionalmente discutidos em Pathophysiology: Clinicai

Concepts of Disease Processes, 3a Edição, Price e Wilson, Eds., McGraw-Hill Book Company, New York, 1986, pgs. 36-38; e Inflammation: Basic Principies and Clinicai Correlates,

Segunda Edição, Galin et al., Eds., Raven Press, New York, 1992 .

Sugeriu-se que as prostaglandinas desempenham papéis na modulação da resposta imunitária. A PGE2 pode, por exemplo, suprimir a estimulação induzida por mitogénio de linfócitos humanos. A inibição da PGE2 pode assim ser benéfica em doentes nos quais a imunidade celular deprimida é atribuível, pelo menos em parte, à acção das prostaglandinas. (Ver

Isselbacher et al., Eds., supra, na página 435). Têm também sido sugeridos papéis para PGE2 e PGE2 na angiogénese. É de notar que o domínio de sinalização de 2F1 transduziu um sinal que resultou na activação do factor de transcrição NF-KB (ver exemplo 5) . Pensa-se que o efeito anti-inflamatório de certos fármacos (glucocorticóides) é atribuível, pelo menos em parte, à inibição da activação de NF-KB (Auphan et al., Science 270: 286-290, 1995; Marx,

Science, 270: 232-233, 1995). Os polipéptidos 2F1 solúveis podem assim ser utilizados para inibir os sinais de activação 20 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ de NF-KB transduzidos por via da 2F1. A activação de NF-KB tem sido ligada à replicação induzida por TNF de virus da imunodeficiência humana (VIH) em células infectadas, incluindo células T (Howard et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2335-2339, 1993). A 2F1 é expressa em células T sendo transduzido um sinal de activação de NF-KB pelo domínio de sinalização de 2F1. Assim, 2F1 solúvel pode ser utilizado para reduzir a expressão do VIH em células infectadas por VIH. Administra-se in vivo uma quantidade eficaz de 2F1 solúvel para inibir a activação de NF-KB que resulta da sinalização através de 2F1. Qualquer replicação de VIH que podia ter resultado de uma tal activação de NF-KB é assim diminuída.

Formas Oliqoméricas de 2Fl

Estão abrangidos pelo presente invento oligómeros, tais como dimeros, trimeros ou oligómeros maiores, que contêm 2F1. Tais oligómeros podem ocorrer naturalmente ou ser produzidos por meios, tais como, tecnologia de ADN recombinante.

As porções 2F1 do oligómero podem ser polipéptidos 2f1 solúveis. Em certas concretizações, os oligómeros compreendem dois a quatro polipéptidos 2F1.

Os oligómeros podem ser formados, por exemplo, por ligações dissulfureto entre os resíduos cisteína em polipéptidos 2F1 diferentes ou por interaeções não covalentes entre cadeias de polipéptidos 2F1. Noutras concretizações, os oligómeros compreendem polipéptidos 2F1 múltiplos ligados via interaeções covalentes ou não covalentes entre porções peptidicas fundidas aos polipéptidos 2F1. Tais péptidos podem ser ligantes peptídicos (espaçadores) ou péptidos que têm a propriedade de promover a oligomerização. Os fechos de correr (zipper) de leucinas e certos polipéptidos derivados de anticorpos estão entre os péptidos que podem promover a oligomerização de polipéptidos 2F1 a si ligados, como descrito com mais detalhe abaixo. 21 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ A preparação de proteínas de fusão compreendendo polipéptidos heterólogos fundidos em várias porções de polipéptidos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990); e Hollenbaugh e Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992). Numa concretização do invento, é criado um dímero de 2F1 por fusão de um 2F1 com a região Fc de um anticorpo (IgGl). O polipéptido Fc é fundido, de preferência, no terminal C de um 2F1 solúvel. Uma fusão génica que codifica a proteína de fusão 2F1/Fc é inserida num vector de expressão adequado. As proteínas de fusão 2F1/Fc são expressas em células hospedeiras transformadas com o vector de expressão recombinante e deixadas montar muito similarmente às moléculas de anticorpo, após o que se formam ligações dissulfureto intercadeias entre os polipéptidos Fc para originar 2F1 bivalente. O dímero desejado pode ser recuperado por procedimentos convencionais, por exemplo, por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de proteína A ou proteína G que vai ligar as porções Fc. O termo "polipéptido Fc" como aqui utilizado inclui formas nativas e de muteína de polipéptidos derivados da região Fc de um anticorpo. Estão também incluídas formas truncadas de tais polipéptidos contendo a região de charneira que promove a dimerização. Um polipéptido Fc adequado está descrito no pedido PCT WO 93/10151, aqui incorporado por referência. Este polipéptido Fc é um polipéptido de cadeia simples que se prolonga da região de charneira N-terminal até ao terminal C nativo (í.e., é uma região Fc de anticorpo de comprimento essencialmente total). Um outro polipéptido Fc útil é descrito na Patente U.S. 5457035. A sequência de aminoácidos da muteína é idêntica à sequência de Fc nativa apresentada em WO 93/10151, com excepção do aminoácido 19 que foi alterado de Leu para Ala, do aminoácido 20 que foi alterado de Leu para Glu e do aminoácido 22 que foi alterado de Gly para Ala. Esta muteína de Fc exibe afinidade reduzida para receptores Fc. Os procedimentos para preparação de uma proteína de fusão contendo um polipéptido Fc ou muteína de Fc são adicionalmente descritos em Baum et al. (EMBO J. 13: 3992-4001, 1994) . 22 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Noutras concretizações, 2F1 pode ser substituído pela porção variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo. Se as proteínas de fusão forem preparadas com cadeias pesadas e leves de um anticorpo, é possível formar um oligómero de 2F1 com até quatro regiões extracelulares 2F1.

Um outro método para preparação de 2F1 oligomérico envolve a utilização de um fecho de correr de leucinas. Os domínios de fecho de correr de leucinas são péptidos que promovem a oligomerização das proteínas nas quais se encontram. Originalmente identificados em várias proteínas de ligação a ADN (Landschulz et al.r Science 240: 1759, 1988), os fechos de correr de leucinas têm sido encontrados numa variedade de proteínas diferentes. Entre os fechos de correr de leucinas conhecidos estão os péptidos que ocorrem naturalmente e seus derivados que dimerizam ou trimerizam. Exemplos de domínios de fecho de correr de leucinas adequados para produção de proteínas oligoméricas solúveis são aqueles descritos no pedido PCT wo 94/10308. Os péptidos que formam preferencialmente trímeros incluem, por exemplo, o fecho de correr de leucinas derivado da proteína surfactante pulmonar D (SPD) descrita em Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994) e no pedido de Patente U.S. com n.° série 08/446922, aqui incorporados por referência. As proteínas de fusão recombinantes compreendendo um polipéptido 2F1 solúvel fundido a um péptido de fecho de correr de leucinas são expressas em células hospedeiras adequadas e o 2F1 oligomérico solúvel resultante que formam é recuperado a partir do sobrenadante de cultura.

Como outra alternativa, o 2F1 oligomérico pode ser expresso como uma proteína de fusão recombinante, com ou sem ligantes peptídicos entre as porções 2F1. Os ligantes peptídicos adequados são conhecidos na especialidade e podem ser utilizados de acordo com técnicas convencionais. Entre os ligantes peptídicos adequados estão aqueles descritos nas Patentes U.S. 4751180 e 4935233, que são aqui incorporadas por referência. Uma sequência de ADN que codifica um ligante peptídico desejado pode ser inserida entre, e na mesma estrutura de leitura que, as sequências de ADN que codificam 2F1, utilizando uma qualquer técnica convencional adequada. Numa concretização, os dois polipéptidos 2F1 solúveis são 23 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ ligados por um ligante peptídico.

Os oligómeros acima descritos podem ser purificados por procedimentos de purificação de proteínas convencionais. Por exemplo, pode ser utilizada a cromatografia de imunoafinidade que utiliza um anticorpo dirigido contra 2F1. Os oligómeros contendo polipéptidos Fc derivados de anticorpo podem ser purificados por cromatografia de afinidade, utilizando uma coluna de proteína A ou proteína G que vai ligar as porções Fc. O presente invento proporciona sequências de ADN isoladas que codificam polipéptidos 2F1 fundidos com polipéptidos derivados de imunoglobulina. Estas sequências de ADN podem codificar, por exemplo, um 2F1 solúvel fundido com um polipéptido de região Fc de anticorpo. As sequências de ADN que codificam as proteínas de fusão compreendendo porções polipeptídicas 2F1 múltiplas estão também abrangidas pelo presente invento.

Composições Compreendendo 2F1 O presente invento proporciona composições (incluindo composições farmacêuticas) que compreendem uma quantidade eficaz de um polipéptido 2F1 purificado e um diluente, excipiente ou veículo adequado. Os polipéptidos 2F1 administrados in vivo estão, de preferência, na forma de uma composição farmacêutica.

As composições do presente invento podem conter uma proteína 2F1 em qualquer forma aqui descrita, incluindo oligómeros, variantes, derivados e fragmentos biologicamente activos. Numa concretização do invento, a composição compreende uma proteína 2F1 humana solúvel.

As proteínas 2F1 podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos que são utilizados para preparar composições farmaceuticamente úteis. Os componentes que são normalmente utilizados em formulações farmacêuticas incluem os descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., 1980, Mack Publishing Company. 24 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ A proteína 2F1 utilizada numa composição farmacêutica é, de preferência, purificada de modo a que a proteína 2F1 esteja substancialmente livre de outras proteínas de origem natural ou endógena, contendo desejavelmente menos de cerca de 1% em massa de contaminantes de proteínas residuais de processos de produção. No entanto, tais composições podem conter outras proteínas adicionadas como estabilizantes, veículos, excipientes ou co-terapêuticos.

Os componentes das composições não são tóxicos para doentes nas doses e concentrações utilizadas. Normalmente a preparação de tais composições implica a combinação de um polipéptido 2F1 de mamífero ou seu derivado com tampões, antioxidantes tal como ácido ascórbico, péptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono incluindo glucose, sacarose ou dextranos, agentes quelantes tais como EDTA, glutationa ou outros estabilizantes e excipientes. A solução salina tamponada neutra é um diluente adequado.

Para utilização terapêutica, as composições são administradas de uma forma e dose adequadas para a indicação e para o doente. A administração pode ser por uma qualquer via adequada incluindo, mas não se lhe limitando, perfusão contínua, administração local, libertação prolongada a partir de implantes (géis, membranas e semelhantes) ou injecção intravenosa.

Anticorpos que Ligam Especificamente 2F1

As proteínas 2F1 do presente invento, ou seus fragmentos imunogénicos, podem ser utilizadas na geração de anticorpos. O presente invento proporciona assim anticorpos que ligam especificamente 2F1, i.e., os anticorpos ligam-se a 2F1 por via dos locais de ligação ao antigénio do anticorpo (em oposição à ligação não específica).

Podem ser preparados anticorpos policlonais e monoclonais por técnicas convencionais. Ver, por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Bíological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Land 25 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988). A produção de anticorpos monoclonais que são imunorreactivos com 2F1 é adicionalmente ilustrada no exemplo 8 abaixo.

Os fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos, que podem ser produzidos utilizando técnicas convencionais, estão também abrangidos pelo presente invento. Exemplos de tais fragmentos incluem, mas não lhes estão limitados, fragmentos Fab, F(ab') e F(ab')2. São também proporcionados fragmentos de anticorpo e derivados produzidos por técnicas de engenharia genética

Os anticorpos monoclonais do presente invento incluem anticorpos quiméricos, por exemplo, versões humanizadas de anticorpos monoclonais de murino. Tais anticorpos humanizados podem ser preparados por técnicas conhecidas e oferecem a vantagem de imunogenicidade reduzida quando os anticorpos são administrados a seres humanos. Numa concretização, um anticorpo monoclonal humanizado compreende a região variável de um anticorpo de murino (ou apenas o seu local de ligação ao antigénio) e uma região constante derivada de um anticorpo humano. Alternativamente, um fragmento de anticorpo humanizado pode compreender o local de ligação ao antigénio de um anticorpo monoclonal de murino e um fragmento da região variável (que carece do local de ligação ao antigénio) derivado de um anticorpo humano. Os procedimentos para a produção de anticorpos monoclonais quiméricos e adicionalmente manipulados incluem os descritos em Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989) e Winter e Harris (TIPS 14: 139, Maio, 1993).

Entre as utilizações dos anticorpos está a utilização em testes para detectar a presença de polipéptidos 2F1, quer in vitro quer in vivo. Os anticorpos têm ainda utilidade na purificação de 2Fl por cromatografia de imunoafinidade. Estes anticorpos que podem bloquear adicionalmente a transdução de um sinal biológico através de 2F1 podem ser utilizados para inibir uma actividade biológica mediada por esse sinal de transdução. As desordens mediadas ou exacerbadas (directa ou indirectamente) por sinalização através de 2F1 são assim 26 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ tratadas. Um método terapêutico envolve a administração in vivo de uma quantidade de um tal anticorpo, que seja eficaz na inibição de uma actividade biológica mediada por 2F1 indesejada. Tais anticorpos podem ser administrados para inibir a sintese de prostaglandina, tratando assim, por exemplo, uma das desordens mediadas por prostaglandina acima descritas. São aqui proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo que é dirigido contra 2F1 e um diluente, excipiente ou veiculo, adequados. Os componentes adequados destas composições são como acima descrito para as composições contendo proteínas 2F1. São aqui proporcionados conjugados compreendendo um agente de diagnóstico (detectável) ou terapêutico ligado aos anticorpos acima descritos. Numa concretização, o agente é um radionuclido ou fármaco. As técnicas para ligação destes agentes a anticorpos são bem conhecidas.

Sistemas de Expressão O presente invento proporciona vectores de expressão recombinantes para expressão de 2F1 e células hospedeiras transformadas com os vectores de expressão. Pode ser utilizado um qualquer sistema de expressão adequado. Os vectores incluem uma sequência de ADN de 2f1 operativamente ligada a sequências nucleotídicas reguladoras da transcrição ou da tradução, adequadas, tais como as derivadas de um gene de mamífero, micróbio, vírus ou insecto. Exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, operadores ou intensificadores da transcrição, um local de ligação ao ribossoma de ARNm e sequências adequadas que controlam o início e a terminação da transcrição e da tradução. As sequências nucleotídicas estão operativamente ligadas quando a sequência reguladora se relaciona funcionalmente com a sequência de ADN de 2F1. Assim, um promotor está operativamente ligado a uma sequência de ADN de 2F1 se o promotor controlar a transcrição da sequência de ADN de 2F1. São geralmente incorporados no vector de expressão, uma origem de replicação, que confere a capacidade de replicar nas células hospedeiras desejadas e um gene de selecção 27 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ através do qual os transformantes são identificados.

Adicionalmente, as sequências que codificam péptidos de sinal adequados que não são nativas para o gene 2F1 podem ser incorporadas em vectores de expressão. Por exemplo, uma sequência de ADN para um péptido de sinal (comando de secreção) pode ser fundida em enquadramento na extremidade 5' de uma sequência de 2F1. Um péptido de sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas aumenta a secreção extracelular do polipéptido 2F1. O péptido de sinal é clivado a partir do polipéptido 2F1 após secreção de 2F1 pela célula.

As células hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos 2F1 incluem células de procariotas, leveduras ou eucariotas superiores. A clonagem e os vectores de expressão adequados para utilização com hospedeiros de células bacterianas, de fungos, leveduras e mamíferos são descritos, por exemplo, em Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Os sistemas de tradução isentos de células podiam também ser utilizados para produzir polipéptidos 2F1 utilizando ARN derivados de construções de ADN aqui descritas.

Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, E. coli ou Bacilli. As células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Baclllus subtilis, Salmonella typhimurium e várias outras espécies dos géneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus. Numa célula hospedeira procariótica, tal como E. coli, um polipéptido 2F1 pode incluir um resíduo de metionina N-terminal para facilitar a expressão do polipéptido recombinante na célula hospedeira procariótica. A Met N-terminal pode ser clivada a partir do polipéptido 2F1 recombinante expresso.

Os vectores de expressão para utilização em células hospedeiras procarióticas compreendem geralmente um ou mais genes marcadores fenotípicos seleccionáveis. Um gene marcador fenotípico seleccionável é, por exemplo, um gene que codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos ou que fornece um requisito autotrófico. Exemplos de vectores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas 28 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ incluem aqueles derivados de plasmideos comercialmente disponíveis tais como o vector de clonagem pBR322 (ATCC 37017) . O pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e proporciona assim um meio simples para identificação de células transformadas. Um promotor adequado e uma sequência de ADN de 2F1 são inseridos no vector pBR322.

As sequências promotoras normalmente utilizadas para vectores de expressão de células hospedeiras procarióticas recombinantes incluem β-lactamase (penicilinase), sistema promotor da lactose (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; e Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; e EP-A-36776) e promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pg. 412, 1982). Um sistema de expressão de células hospedeiras procarióticas particularmente útil utiliza um promotor PL de fago λ e uma sequência repressora termo-lábil cl857ts. Os vectores plasmídicos disponíveis na American Type Culture Collection que incorporam derivados do promotor PL λ incluem o plasmídeo pHUB2 (residente na estirpe JMB9 de E. coli (ATCC 37092)) e pPLc28 (residente em RRl de E. coll (ATCC 53082)) . 2F1 pode ser alternativamente expresso em células hospedeiras de levedura, de preferência, do género

Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae) . Podem também ser utilizados outros géneros de levedura, tais como Pichla ou Kluyveromyces. Os vectores de levedura vão frequentemente conter uma origem de sequência de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região promotora, sequências de poliadenilação, sequências de terminação da transcrição e um gene marcador seleccionável.

As sequências promotoras adequadas para vectores de levedura incluem, entre outros, promotores de metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1: 149, 1968; e Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato- 29 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ desidrogenase, hexoquinase, fosfofrutoquinase, piruvato-descarboxilase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. Outros vectores e promotores adequados para utilização na expressão de leveduras são adicionalmente descritos em Hitzeman, EPA-73657. Uma outra alternativa é o promotor ADH2 reprimível por glucose descrito por Russel et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Os vectores vaivém replicáveis em leveduras e E. coli podem ser construídos por inserção de sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) nos vectores de levedura acima descritos. A sequência de comando do factor-α de levedura pode ser utilizada para dirigir a secreção do polipéptido 2F1. A sequência de comando do factor-α é inserida entre a sequência promotora e a sequência do gene estrutural. Ver, por exemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5330, 1984; Patente U.S. 4546082; e EP 324274. São conhecidas dos peritos na especialidade, outras sequências de comando adequadas para facilitar a secreção de polipéptidos recombinantes a partir de hospedeiros de levedura. Uma sequência de comando pode ser modificada próximo da sua extremidade 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto vai facilitar a fusão da sequência de comando com o gene estrutural.

Os protocolos de transformação de leveduras são conhecidos dos peritos na especialidade. Um destes protocolos é descrito por Hinnen et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 75: 1929, 1978. O protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, em que o meio selectivo consiste em base de azoto de levedura a 0,67%, casaminoácidos a 0,5%, glucose a 2%, 10 μg/ml de adenina e 20 μg/ml de uracilo.

As células hospedeiras de levedura transformadas por vectores contendo a sequência promotora ADH2 podem ser deixadas crescer para indução de expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é aquele que consiste em extracto 30 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ de levedura a 1%, peptona a 2% e glucose a 1% suplementado com 80 μρ/ιηΐ de adenina e 80 μ/ml de uracilo. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre quando a glucose é removida do meio.

Os sistemas de cultura de células hospedeiras de mamífero ou insecto podem também ser utilizados para expressar polipéptidos 2F1 recombinantes. Os sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterólogas em células de insectos são revistos por Luckow e Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). Podem também ser utilizadas linhas de células estabelecidas de origem em mamíferos. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células COS derivadas de células de rim de macaco (por exemplo, a linha de células COS-1 ATCC CRL 1650 ou a linha COS-7 ATCC CRL 1651, Gluzman et al.r Cell 23: 175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster Chinês (CHO), células HeLa e linhas de células BHK (ATCC CRL 10) e a linha de células CV-l/EBNA-1 derivada da linha de células de rim de macaco verde Africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) .

As sequências de controlo de transcrição e tradução para vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser excisadas a partir de genomas virais. As sequências promotoras e as sequências intensificadoras normalmente utilizadas são derivadas de poliomavírus, Adenovírus 2, Vírus de Símio 40 (SV40) e citomegalovírus humano. As sequências de adn derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo, origem de SV40, promotor precoce e tardio, intensificador, locais de ligação e poliadenilação podem ser utilizadas para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência de gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores precoces e tardios virais são particularmente úteis porque são ambos facilmente obtidos a partir de um genoma virai na forma de um fragmento que pode também conter uma origem de replicação virai (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978). Podem também ser utilizados fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde que seja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se prolonga do local Hind III até ao local Bgl I localizada na origem do local de replicação virai de SV40. 31 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Os vectores de expressão para utilização em células hospedeiras de mamífero podem ser construídos como descrito por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983). Um sistema útil para expressão de elevado nível estável de ADNc de mamífero em células epiteliais mamárias de murino C127 pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Um vector de expressão elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al. (Nature 312: 768, 1984) foi depositado como ATCC 39890. Os vectores de expressão de mamífero adicionais são pDC406 (McMahan et ai., EMBO J. 10: 2821, 1991); HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142: 4314, 1989); pDC201 (Sims et al., Science 241: 585, 1988); pDC302 (Mosley et al., Cell 59: 335, 1989); e os descritos na Patente U.S. 5350683. Outros vectores adequados podem ser derivados de retrovírus.

Em vez da sequência de sinal nativa, pode ser adicionada uma sequência de sinal heteróloga tal como a sequência de sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente dos Estados Unidos 4965195; a sequência de sinal para o receptor da interleucina-2 descrita em Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); o péptido de sinal do receptor da interleucina-4 descrito na EP 367566; o péptido de sinal do receptor da interleucina-1 tipo I descrito na Patente U.S. 4968607; e o péptido de sinal do receptor de interleucina-1 tipo II descrito na EP 460846. Ácidos Nucleicos e Suas Utilizações

Os ADN que codificam 2F1 aqui descritos têm utilidade na produção de polipéptidos 2F1, como acima discutido. São aqui proporcionados complementos de ADN e ARN do ADN apresentado nas SEQ ID NO:l e 3, juntamente com suas formas de cadeia simples e dupla. Os fragmentos das sequências nucleotídicas de 2F1 aqui apresentados são também úteis. Tais fragmentos compreendem desejavelmente, pelo menos, cerca de 17 nucleótidos adjacentes da sequência apresentada em SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:3, ou seu complemento.

Entre as utilizações de tais ácidos nucleicos de 2F1 (incluindo fragmentos) está a utilização como sonda. Tais sondas podem ser utilizadas em procedimentos de hibridação 32 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ inter-espécies para isolar ADN de 2F1 a partir de espécies de mamíferos adicionais. Como exemplo, pode ser utilizada uma sonda correspondente ao domínio extracelular de 2F1. As sondas têm também utilidade na detecção da presença de ácidos nucleicos de 2F1 em testes in vitro e em procedimentos tais como transferências de Northern e Southern. Os tipos de células que expressam 2F1 podem ser identificados. Tais procedimentos são bem conhecidos e os técnicos especialistas podem escolher uma sonda de comprimento adequado, dependendo da aplicação pretendida particular. As sondas podem ser marcadas (por exemplo, com 32P) por técnicas convencionais.

Os fraqmentos de ácidos nucleicos de 2F1 têm também utilidade como iniciadores nas reacções em cadeia com polimerase (PCR). Os iniciadores 5' e 3' correspondentes aos terminais de um ADN de 2F1 desejado podem ser utilizados no isolamento e amplificação do ADN, utilizando técnicas de PCR convencionais.

Outros fragmentos de ácidos nucleicos de 2F1 úteis são oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos de cadeia simples (ou ARN ou ADN) capaz de ligação às sequências de ARNm de 2F1 (sentido directo) ou ADN de 2F1 (anti-sentido), alvo. Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo, de acordo com o presente invento, compreendem um fragmento da região de codificação de ADNc de 2F1. Um tal fragmento compreende geralmente, pelo menos, cerca de 14 nucleótidos, de preferência, de cerca de 14 a cerca de 30 nucleótidos. A capacidade para criar um oligonucleótido anti-sentido ou de sentido directo baseado numa sequência de ADNc para uma dada proteína é descrita, por exemplo, em Stein e Cohen, Câncer Res. 48: 2659, 1988 e van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988. A ligação de oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo a sequências de ácidos nucleicos alvo resulta na formação de dúplices que bloqueiam a tradução (ARN) ou a transcrição (ADN) por um de vários meios, incluindo degradação aumentada dos dúplices, terminação prematura da transcrição ou da tradução ou por outros meios. Os oligonucleótidos anti-sentido podem assim ser utilizados para 33 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ bloquear a expressão de proteínas 2F1.

Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo compreendem adicionalmente oligonucleótidos tendo estruturas açúcar-fosfodiéster modificadas (ou outras ligações de açúcar, tais como as descritas em WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcar são resistentes a nucleases endógenas. Tais oligonulceótidos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (i.e., capazes de resistir a degradação enzimática) mas retêm a especificidade de sequência para serem capazes de ligar sequências nucleotídicas alvo. Outros exemplos de oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido incluem os oligonucleótidos que estão covalentemente ligados a porções orgânicas, tais como as descritas em WO 90/10448 e outras porções que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácidos nucleicos alvo, tais como poli-(L-lisina). Por outro lado, os agentes intercalares, tais como elipticina, e os agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser ligados a oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido para modificar as especificidades de ligação do oligonucleótido anti-sentido ou de sentido directo para a sequência nucleotidica alvo.

Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de ácidos nucleicos alvo por um qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, transfecção de ADN mediada por CaP04, electroporação ou utilizando vectores de transferência de genes tais como vírus Epstein-Barr. Os oligonucleótidos anti-sentido ou de sentido directo são, de preferência, introduzidos numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por inserção do oligonucleótido anti-sentido ou de sentido directo num vector retroviral adequado, depois contacto da célula com o vector retroviral contendo a sequência inserida, quer in vivo quer ex vivo. Os vectores retrovirais adequados incluem, mas não lhes estão limitados, os derivados do retrovírus de murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M-MuLV) ou os vectores de cópia dupla designados DCT5A, DCT5B e DCT5C (ver Pedido PCT WO 90/13641).

Os oligonucleótidos de sentido directo ou anti-sentido podem também ser introduzidos numa célula contendo a 34 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ sequência nucleotídica alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação a ligandos, como descrito na WO 91/04753. As moléculas de ligação a ligandos adequadas incluem, mas não se lhes estão limitadas, receptores de superfície celular, factores de crescimento, outras citoquinas ou outros ligandos que se ligam aos receptores da superfície das células.

Alternativamente, um oligonucleótido de sentido directo ou anti-sentido pode ser introduzido numa célula contendo a sequência de ácido nucleico alvo por formação de um complexo oligonucleótido-lípido, como descrito na WO 90/10448. O complexo oligonucleótido de sentido directo ou anti-sentido-lípido é, de preferência, dissociado na célula por uma lipase endógena.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar concretizações particulares e não limitar o âmbito do invento. EXEMPLO 1

Isolamento de ADNc que Codifica 2F1 Humana

Um ADN de 2F1 humana foi isolado por reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os iniciadores utilizados na reacção eram oligonucleótidos degenerados baseados em duas regiões do domínio citoplasmático da IL-1R tipo I. Estas duas regiões estão entre os motivos que são conservados na família de receptores da IL-1.

Inicialmente, foram determinadas as condições adequadas para amplificação por PCR com os iniciadores degenerados utilizando receptores de IL-1 Tipo I de humano e ratinho e clones de ADNc T1/ST2 de ratinho como molde. Utilizando as condições que foram determinadas para dar um produto de amplificação a partir de cada um destes ADNc, realizou-se a PCR utilizando um cromossoma artificial de levedura (YAC) humano de 500 kb como molde. Este YAC, designado C02133, contém ADN da região 2ql2 do cromossoma humano e sabe-se que inclui o receptor de IL-1 tipo I, parte do receptor de IL-1 tipo II e ST2 (Sims et al., Cytokine 7: 483-490, 1995). 35 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

As reacções em cadeia com polimerase (20 μΐ) utilizaram 0,5μ1 de uma mistura a 16:1 de ADN-polimerases Taq (Perkin-Elmer) e Vent (New England Biolabs) e continham 200 pmol de cada iniciador, dNTP 200μΜ e 5-10μ1 de ADN YAC C02133 humano, parcialmente purificado por extracção a partir de um gel de campos de impulsos. As condições dos ciclos foram: 5 minutos a 94°C, tempo durante o qual se adicionou a mistura de ADN-polimerase; 40 ciclos de (1 minuto a 94°C, 3 minutos a 35°C, 1 minuto a 72°C); seguidos por 10 minutos a 72°C. Os produtos reaccionais foram separados por electroforese num gel de agarose de baixa temperatura de fusão. A banda contendo material entre 90 e 150 pb de comprimento foi cortada, fundida utilizando-se 5μ1 como molde numa segunda PCR. A segunda reacção foi realizada similarmente à primeira, com excepção de apenas serem corridos 20 ciclos. Os produtos de reacção foram separados por electroforese num gel de agarose. A fracção de 90-150 pb foi eluida e o ADN foi tornado de extremidades lisas utilizando ADN-polimerase de T4, fosforilado utilizando polinucleótido-quinase de T4, aquecido durante 10 minutos a 65°C, precipitado com etanol e ligado num vector designado pCRScript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) na presença da enzima de restrição Srfl.

As células DHlO de E. coli foram transformadas com os produtos da ligação. As colónias brancas foram colhidas das placas Xgal, as suas inserções foram amplificadas por PCR utilizando iniciadores de vectores e uma pequena quantidade salpicada em filtros de nylon. Os filtros foram subsequentemente hibridados a 42°C em condições aquosas numa mistura de sondas oligonucleotídicas marcadas com 32P derivadas de IL-1R tipo I de humano e murino. Os filtros foram lavados a 50°C em NaCl 0,3M. Por conseguinte, a hibridação foi realizada sob condições de rigor relativamente baixo.

Apenas 5 das 180 inserções hibridaram. A sequenciação aleatória de ADN de 9 das inserções que não hibridaram revelou que estas eram derivadas de ADN de levedura. Uma das cinco inserções que hibridaram originou um forte sinal de hibridação e a sequenciação do ADN revelou ser amplificado a partir do gene IL-1R tipo I. Das quatro inserções que hibridaram fracamente, três vinham de ADN de levedura e um 36 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ mostrou representar um gene novo, que foi designado 2F1. O fragmento de ADN de 2F1 assim isolado foi utilizado para sondar uma biblioteca de ADNc preparada a partir de linfócitos de sangue periférico (PBL) humanos, num esforço para isolar um clone de ADNc de comprimento total. Identificaram-se os clones de hibridação e isolaram-se três clones de ADNc de 2F1 a partir da biblioteca de PBL. Isolaram-se por PCR quatro clones de 2F1 adicionais a partir da linha de carcinoma epidérmico humano KB (ATCC CCL 17).

Uma sequência de ADN de 2F1 humana foi elucidada por sequenciação destes clones. A sequência nucleotidica da região de codificação é apresentada em SEQ id NO:l e a sequência de aminoácidos assim codificada é apresentada em SEQ ID NO:2. A proteina de SEQ ID NO:2 é uma proteína transmembranar tipo I, com um péptido de sinal N-terminal (aminoácidos -19 a - 1) seguida por um domínio extracelular (aminoácidos 1 a 329), uma região transmembranar (aminoácidos 330 a 351) e um domínio citoplasmático (aminoácidos 352 a 541). 0 codão para alanina 298 é polimórfico, estando presente nos clones PBL e dois dos clones KB e ausente dos outros dois clones KB. EXEMPLO 2

Isolamento de ADNc de 2F1 de Murino O ADNc que codifica 2F1 de murino foi isolado por hibridação inter-espécies, como se segue. O ADNc de 2F1 humano foi utilizado como sonda para analisar uma biblioteca de ADNc de ratinho derivada da linha de células designada EL4 6.1 (MacDonald et al., J. Immunol. 135: 3944, 1985), que é um subclone da linha de células de timoma EL4 (ATCC TIB 39). Isolou-se um clone de hibridação. A sequência nucleotidica deste ADNc de 2F1 de ratinho e a sequência de aminoácidos assim codificada são apresentadas em SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.

A proteina de SEQ ID NO:4 compreende um péptido de sinal (aminoácidos -18 a -1), um domínio extracelular (aminoácidos 1 a 307), uma região transmembranar (aminoácidos 308 a 330) e um domínio citoplasmático (aminoácidos 331 a 519) . A 37 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ sequência de aminoácidos 2F1 de ratinho de SEQ ID NO:4 é 65% idêntica à sequência de aminoácidos de 2F1 humana apresentada em SEQ ID NO:2. EXEMPLO 3 Teste de Ligação A 2F1 é um membro da família de receptores de IL-1, como acima discutido. Uma vez que o domínio extracelular de 2F1 se assemelha ao dos receptores de IL-1 tipo I e tipo II, investiqou-se a capacidade de 2F1 para se liqar aos membros da família IL-1, como se segue.

Testou-se a 2F1 quanto à capacidade para ligar IL-Ια e IL-ΐβ (March et al., Nature (Lond.) 315: 641, 1985), assim como proteína antagonista do receptor de IL-1 (Eisenberg et al., Nature 343: 341, 1990; Hannum et al., Nature 343: 336, 1990; e Cárter et al., Nature 344: 633, 1990). O antagonista do receptor de IL-1 (IL-lra) liga-se aos receptores de IL-1, mas não transduz um sinal. Por competição com IL-1 pela ligação aos receptores de IL-1 endógenos, IL-lra inibe os efeitos biológicos mediados por IL-1.

Uma proteína de fusão solúvel designada 2F1/Fc, que compreende o domínio extracelular de 2F1 humana ligado à região Fc de uma igGl humana, foi produzida por procedimentos análogos aos descritos em Baum et al. (EMBO J. 13: 3992-4001, 1994). Uma proteína de fusão IL-lR/Fc tipo I solúvel compreendendo o domínio extracelular de IL-1R tipo I humano fundido com o polipéptido da região Fc, foi preparada para utilização como controlo positivo.

Utilizou-se um biossensor BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Piscataway, New Jersey) para examinar a ligação de ligandos IL-1 à proteína de fusão 2F1/Fc humana, utilizando procedimentos essencialmente como descritos em Arend et al. (J. Immunol. 153: 4766-4774, 1994). Em resumo, utilizou-se um soro de IgG anti-humana de cabra dirigida contra a região Fc (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA), covalentemente acoplada à matriz de dextrano de um chip de hidrogel, para capturar a proteína 2F1/Fc humana. A proteína de fusão 2Fl/Fc foi assim imobilizada no chip BIAcore. Os 38 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ três ligandos de IL-1, em várias concentrações diferentes, foram feitos reagir com a proteína capturada medindo-se a alteração da massa por unidade de área ao longo do tempo. A análise do biossensor demonstrou ligação facilmente mensurável de IL-la, IL-Ιβ e IL-Ira humana à proteína de fusão IL—ÍR/Fc tipo I humana (controlo positivo). No entanto, não foi detectada ligação de qualquer uma das três proteínas IL-1 à proteína de fusão 2Fl/Fc. Assim, apesar da sua homologia de sequência significativa, 2F1 não é um receptor de IL-1. EXEMPLO 4

Análise de Transferência de Northern A presença de ARNm de 2F1 em vários tipos de células foi investigada por análise de transferência de Northern, utilizando técnicas padrão. As transferências de Northern adquiridas a partir de Clonetech, Paio Alto, Califórnia, que contêm 2 mg de ARN poliA+ humano em cada pista, foram sondadas durante a noite com uma ribossonda de 2F1 anti-sentido marcada com 32P, a 63°C, em NaCl 0,75M/formamida a 50% e lavada a 63°C em NaCl 0,3M. Para verificar a uniformidade de carga assim como a eficácia da remoção do ARNr, os filtros foram subsequentemente sondados para GAPDH e ARNr 28S.

Observou-se uma única banda de hibridação, que migra com o ARNr 28S ou ligeiramente mais rápido, no baço, timo, leucócito, fígado, pulmão, coração, intestino delgado e grosso, próstata e placenta. É possível, mas não certo, que seja observado um sinal fraco no testículo e ovário. Não foi detectada qualquer banda de hibridação no cérebro, músculo esquelético, rim e pâncreas. EXEMPLO 5

Teste de Sinalização A capacidade de transdução de sinal do domínio citoplasmático de 2F1 foi investigada no teste seguinte. Construiu-se um vector de expressão que codifica um receptor quimérico, no qual as porções extracelulares e transmembranar do receptor de IL-1 tipo I de ratinho (IL-1RI) foram fundidas 39 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ com a porção citoplasmática do 2F1 humano. O vector codificava os aminoácidos 1 a 362 da IL-1RI de murino fundidos com os aminoácidos 332 a 522 de 2F1 humano. Na preparação da construção, introduziu-se um local BglII no ADN de IL-lRI de murino, a 3' da região transmembranar. Isto resultou na alteração do resíduo valina na posição 361 de IL-lRI de murino para isoleucina, que é o aminoácido presente em IL-lRI humano naquela posição. A utilização do receptor quimérico tornou possível analisar a resposta a um ligando conhecido (IL-1). Quando as células que expressam IL-lRI são postas em contacto com IL-la ou IL-ΐβ, induz-se um certo número de respostas, incluindo a estimulação da localização nuclear do factor de transcrição NF-KB (Thanos, D. e T. Maniatis, Cell 80: 529-532, 1995). Os complexos NF-KB activados translocam-se para o núcleo e ligam a sequência de reconhecimento cognata. O receptor quimérico foi expresso em células COS-7 (ATCC CRL 1651) examinando-se, num teste de gel de NF-KB, a capacidade de IL-1 para activar a transcrição do factor NF-KB. Um anti-soro policlonal de IL-lRI anti-humano de ovelha (aqui designado P3) foi utilizado para bloquear o IL-lR de macaco endógeno (cruzadamente reactivo), sem afectar a ligação de IL-1 à quimera IL-1RI/2F1 de murino transfectada. As células COS-7 transfectadas com um vector de expressão que codifica as porções extracelulares e transmembranar de IL-lRI de murino, mas não o domínio citoplasmático, foram utilizadas como controlo negativo. Como controlo positivo, transfectaram-se células COS-7 com um vector de expressão que codifica IL-lRI de murino de comprimento total. O procedimento de teste foi como se segue. As células COS-7 foram transfectadas com as construções de receptor. Dois dias após a transfecção, as células foram tratadas com o anticorpo de bloqueio e estimuladas (30 minutos, 1 ng/ml) com IL-Ια humana, imediatamente após o bloqueio e a estimulação com IL-1, prepararam-se extractos nucleares a partir de amostras de células, essencialmente como descrito por Ostrowski et al. (J. Biol. Chem. 266: 12722-33, 1991). 40 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Marcou-se na extremidade 5' por fosforilação com [γ-32Ρ]ΑΤΡ uma sonda oligonucleotídica sintética de cadeia dupla contendo o elemento intensificador kb da cadeia leve da imunoglobulina K. Os extractos nucleares (lC^g) foram incubados com sonda marcada com 32P durante 20 minutos à temperatura ambiente e os complexos de proteina-ADN foram então resolvidos por electroforese em géis de TBE 0,5X poliacrialamida a 10% (Novex). O NF-kb complexado com ADN indica activação de NF-KB. O domínio citoplasmático 2F1 mostrou induzir capacidade de ligação a ADN de NF-KB, em resposta à estimulação por IL-1 da molécula receptora quimérica. A indução era comparável em magnitude à mediada através da IL-1RI de murino (controlo positivo). EXEMPLO 6

Teste de Sinalização A capacidade de sinalização de 2F1 foi adicionalmente examinada num teste de activação de promotor de interleucina-8 (IL—8). Quando as células que expressam IL-1R tipo I são postas em contacto com IL-1, estimula-se a transcrição do gene IL-8 (Mukaida et al., J. Biol. Chem. 265: 21128-33, 1990). Utiliza-se neste teste, o receptor quimérico IL-1R/2F1 descrito no exemplo 5, de modo a que possa ser investigada a resposta a um ligando conhecido (IL-1).

Preparou-se um plasmídeo relator designado pIL8p, que transporta um promotor IL-8 humano parcial fundido na região de codificação da cadeia alfa do receptor de IL-2 humano. As células COS-7 (lxlO5 células por poço numa placa de cultura de tecidos de 12 poços) foram co-transfectadas com 1500 ng de pIL8p e 500 ng de um vector de expressão que codifica o receptor quimérico IL-1R/2F1. Vinte e quatro horas após transfecção, o meio de cultura foi mudado e as células foram postas em contacto com um anticorpo de bloqueio, depois estimuladas com 1 ng/ml de IL-Ια humana ou deixadas por estimular. O anticorpo de bloqueio estava numa diluição de 1:100 de soro policlonal de IL-1RI anti-humano de ovelha P3 (ver exemplo 5), que àquela concentração bloqueia a ligação de IL-1 aos receptores de IL-1 de células COS-7 endógenas, 41 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ mas não tem qualquer efeito na ligação de IL-1 à porção IL-lRI de ratinho do receptor quimérico recombinante.

Doze a dezasseis horas após a estimulação, as células foram lavadas duas vezes com meio de ligação contendo leite em pó magro a 5% (p/v) (mbm a 5%) e bloqueadas com 2 ml de MBM a 5%, à temperatura ambiente durante 30 minutos. As células foram então incubadas à temperatura ambiente durante 60-90 minutos com 1,5 ml/poço de MBM a 5% contendo ^g/ml de anticorpo monoclonal de ratinho 2A3 dirigido contra IL-2R0C (Cosman et al., Nature 312: 768-771, 1984), com revolução suave. As células foram lavadas com MBM a 5%, depois incubadas durante uma hora à temperatura ambiente com 1 ml/poço de MBM a 5% contendo uma diluição a 1:100 de IgG anti-ratinho de [125I] cabra (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri). Os poços foram lavados quatro vezes com MBM a 5%, duas vezes com PBS, depois despidas por adição de 1 ml de NaOH 0,5M determinando-se as contagens por minuto. O receptor quimérico IL-1R/2F1 mostrou responder a IL-la por indução da função promotora de IL-8. A transcrição da construção relatora foi induzida por estimulação de IL-1 da quimera IL-1R/2F1, até cerca de metade do nível mediado pela IL-lR tipo I de ratinho intacta. EXEMPLO 7 Síntese de Prostaglandinas

Num terceiro teste, o receptor quimérico IL-1R/2F1 foi expresso em células do carcinoma epidérmico humano KB (ATCC CCL 17) . Na presença de anti-soro policlonal que bloqueia os receptores de IL-1 tipo I humanos (ver exemplo 5), a estimulação por IL-1 do receptor quimérico resultou na síntese de prostaglandina E2. EXEMPLO 8

Anticorpos Monoclonais Dirigidos Contra 2F1

Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que são imunorreactivos com uma proteína 2F1. A 2F1 humana é expressa em células hospedeiras de mamífero, tais como células COS-7 ou CV-l/EBNA-1. A 2F1 expressa é purificada e utilizada como um imunogénio na produção de 42 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ anticorpos monoclonais, utilizando técnicas convencionais tais como as descritas na patente U.S. 4411993. Imunogénios alternativos incluem, mas não se lhes limitam, fragmentos de 2F1 (por exemplo, 2F1 solúvel compreendendo o dominio extracelular), uma proteína de fusão 2F1/Fc solúvel ou células que expressam 2F1 recombinante na superfície celular.

Em resumo, os ratinhos são imunizados com 2F1 emulsionada em adjuvante de Freund completo e subcutânea ou intraperitonealmente injectados com quantidades no intervalo de 10-100 μg. Dez a doze dias mais tarde, os animais imunizados recebem um reforço de 2F1 adicional emulsionada em adjuvante de Freund incompleto. Em seguida, os ratinhos recebem reforços num esquema de imunização semanal ou bissemanal. São periodicamente colhidas amostras de soro por sangramento retro-orbital ou excisão da ponta da cauda para análise num teste de transferência pontual (dot-blot) ou ELISA (Teste Imunossorvente com Enzima Ligada) para os anticorpos 2F1.

Após detecção de um título de anticorpo adequado, fornece-se aos animais positivos uma última injecção intravenosa de 2F1 em solução salina. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados e as células do baço colhidas e fundidas com uma linha de células de mieloma de murino, por exemplo, NS1 ou, de preferência, P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) . As fusões produzem células de hibridoma, que são plaqueadas em placas de microtitulação múltiplas num meio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.

As células de hibridoma são analisadas por ELISA quanto a reactividade contra 2F1 purificada por adaptações das técnicas descritas em Engvall et al. (Immunochem. 8: 871, 1971) e na Patente U.S. 4703004. Uma técnica de análise preferida é a técnica de captura de anticorpos descrita em Beckmann et al. (J. Immunol. 144: 4212, 1990). As células de hibridoma positivas podem ser intraperitonealmente injectadas em ratinhos BALB/c singénicos para produzir ascites contendo concentrações elevadas de anticorpos monoclonais anti-2Fl. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser deixadas 43 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ crescer ίη vitro em frascos ou garrafas cilíndricas por várias técnicas. Os anticorpos monoclonais produzidos em ascites de ratinho podem ser purificados por precipitação com sulfato de amónio, seguida por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode também ser utilizada a cromatografia de afinidade baseada na ligação do anticorpo à proteína A ou proteína G, assim como cromatografia de afinidade baseada na ligação a 2F1.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Immunex Corporation (ii) TÍTULO DO INVENTO: Receptor de Proteína Designado 2F1 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 5 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Janis C. Henry, Immunex Corporation (B) RUA: 51 University Street (C) CIDADE: Seattle

(D) ESTADO: WA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 98101 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/windows 95 (D) SOFTWARE: Word for Windows 95, 7.0a (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/US97/01697 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 06-FEV-1997 (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/604,333 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 21-FEV-1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Janis C. Henry (B) NÚMERO DE REGISTRO: 34,347

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 2619-WO (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206) 233-0644 (C) TELEX: 756822 44 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1626 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA.: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: hu2Fl (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1626 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 58..1623 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sig_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 1..57 45 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: ATG AAT TGT AGA GAA TTA ccc TTG ACC CTT TGG GTG CTT ATA TCT GTA 48 Met Asn Cys Arg Glu Leu Pro Leu Thr Leu Trp Val Leu Ile Ser Val -19 -15 -10 -5 AGC ACT GCA GAA TCT TGT ACT TCA CGT CCC CAC ATT ACT GTG GTT GAA 96 Ser Thr Ala Glu Ser Cys Thr Ser Arg Pro His Ile Thr Val Val Glu 1 5 10 GGG GAA CCT TTC TAT CTG AAA CAT TGC TCG TGT TCA CTT GCA CAT GAG 144 Gly Glu Pro Phe Tyr Leu Lys His Cys Ser Cys Ser Leu Ala His Glu 15 20 25 ATT GAA ACA ACC ACC AAA AGC TGG TAC AAA AGC AGT GGA TCA CAG GAA 192 ile Glu Thr Thr Thr Lys Ser Trp Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Gin Glu 30 35 40 45 CAT GTG GAG CTG AAC CCA AGG AGT TCC TCG AGA ATT GCT TTG CAT GAT 240 His Vai Glu Leu Asn Pro Arg Ser Ser Ser Arg Ile Ala Leu His Asp 50 55 60 TGT GTT TTG GAG TTT TGG CCA GTT GAG TTG AAT GAC ACA GGA TCT TAC 288 Cys Vai Leu Glu Phe Trp Pro Val Glu Leu Asn Asp Thr Gly Ser Tyr 65 70 75 TTT TTC CAA ATG AAA AAT TAT ACT CAG AAA TGG AAA TTA AAT GTC ATC 336 Phe Phe Gin Met Lys Asn Tyr Thr Gin Lys Trp Lys Leu Asn Val Ile 80 85 90 AGA AGA AAT AAA CAC AGC TGT TTC ACT GAA AGA CAA GTA ACT AGT AAA 384 Arg Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Thr Glu Arg Gin Val Thr Ser Lys 95 100 105 ATT GTG GAA GTT AAA AAA TTT TTT CAG ATA ACC TGT GAA AAC AGT TAC 432 Ile Vai Glu val Lys Lys Phe Phe Gin Ile Thr Cys Glu Asn Ser Tyr 110 115 120 125 TAT CAA ACA CTG GTC AAC AGC ACA TCA TTG TAT AAG AAC TGT AAA AAG 480 Tyr Gin Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Asn Cys Lys Lys 130 135 140 CTA CTA CTG GAG AAC AAT AAA AAC CCA ACG ATA AAG AAG AAC GCC GAG 528 Leu Leu Leu Glu Asn Asn Lys Asn Pro Thr ile Lys Lys Asn Ala Glu 145 150 155 46 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ τττ GAA GAT CAG GGG TAT TAC TCC TGC GTG CAT TTC CTT CAT CAT AAT 576 Phe Glu Asp Gin Gly Tyr Tyr Ser Cys Vai His Phe Leu His His Asn 160 165 170 GGA AAA CTA TTT AAT ATC ACC AAA ACC TTC AAT ATA ACA ATA GTG GAA 624 Gly Lys Leu Phe Asn Ile Thr Lys Thr Phe Asn Ile Thr Ile Vai Glu 175 180 185 GAT CGC AGT AAT ATA GTT CCG GTT CTT CTT GGA CCA AAG CTT AAC CAT 672 Asp Arg Ser Asn Ile Vai Pro Vai Leu Leu Gly Pro Lys Leu Asn His 190 195 200 205 GTT GCA GTG GAA TTA GGA AAA AAC GTA AGG CTC AAC TGC TCT GCT TTG 720 Vai Ala Vai Glu Leu Gly Lys Asn Vai Arg Leu Asn Cys Ser Ala Leu 210 215 220 CTG AAT GAA GAO GAT GTA ATT TAT TGG ATG TTT GGG GAA GAA AAT GGA 763 Leu Asn Glu Glu Asp Vai Ile Tyr Trp Met Phe Gly Glu Glu Asn Gly 225 230 235 TCG GAT CCT AAT ATA CAT GAA GAG AAA GAA ATG AGA ATT ATG ACT CCA 816 Ser Asp Pro Asn Ile His Glu Glu Lys Glu Met Arg Ile Met Thr Pro 240 245 250 GAA GGC AAA TGG CAT GCT TCA AAA GTA TTG AGA ATT GAA AAT ATT GGT 864 Glu Gly Lys Trp His Ala Ser Lys Vai Leu Arg Ile Glu Asn Ile Gly 255 260 265 GAA AGC AAT CTA AAT GTT TTA TAT AAT TGC ACT GTG GCC AGC ACG GGA 912 Glu Ser Asn Leu Asn Vai Leu Tyr Asn Cys Thr Vai Ala Ser Thr Gly 270 275 280 285 GGC ACA GAC ACC AAA AGC TTC ATC TTG GTG AGA AAA GCA GAC ATG GCT 960 Gly Thr Asp Thr Lys Ser Phe Ile Leu Vai Arg Lys Ala Asp Met Ala 290 295 300 GAT ATC CCA GGC CAC GTC TTC ACA AGA GGA ATG ATC ATA GCT GTT TTG 100B Asp Ile Pro Gly His Vai Phe Thr Arg Gly Met Ile Ile Ala Vai Leu 305 310 315 ATC TTG GTG GCA GTA GTG TGC CTA GTG ACT GTG TGT GTC ATT TAT AGA 1056 Ile Leu Vai Ala Vai Vai Cys Leu Vai Thr Vai Cys Vai Ile Tyr Arg 320 325 330 GTT GAC TTG GTT CTA TTT TAT AGA CAT TTA ACG AGA AGA GAT GAA ACA 1104 Vai Asp Leu Vai Leu Phe Tyr Arg HÍS Leu Thr Arg Arg Asp Glu Thr 335 340 345 TTA ACA GAT GGA AAA ACA TAT GAT GCT TTT GTG TCT TAC CTA AAA GAA 1152 Leu Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Vai Ser Tyr Leu Lys Glu 350 355 360 365 TGC CGA CCT GAA AAT GGA GAG GAG CAC ACC TTT GCT GTG GAG ATT TTG 1200 Cys Arg Pro Glu Asn Gly Glu Glu His Thr Phe Ala Vai Glu Ile Leu 370 375 380 CCC AGG GTG TTG GAG AAA CAT TTT GGG TAT AAG TTA TGC ATA TTT GAA 1248 Pro Arg Vai Leu Glu Lys His Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Glu 385 390 395 47 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ AGG GAT GTA GTG CCT GGA GGA GCT GTT GTT GAT GAA ATC CAC TCA CTG 1296 Arg Asp Vai Vai Pro Gly Gly Ala Vai Vai Asp Glu Ile His Ser Leu 400 405 410 ATA GAG AAA AGC CGA AGA CTA ATC ATT GTC CTA AGT AAA AGT TAT ATG 1344 Ile Glu Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Vai Leu Ser Lys Ser Tyr Met 415 420 425 TCT AAT GAG GTC AGG TAT GAA CTT GAA AGT GGA CTC CAT GAA GCA TTG 13 92 Ser Asn Glu Vai Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Leu His Glu Ala Leu 430 435 440 445 GTG GAA AGA AAA ATT AAA ATA ATC TTA ATT GAA TTT ACA CCT GTT ACT 1440 Vai Glu Arg Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr Pro Vai Thr 450 455 460 GAC TTC ACA TTC TTG CCC CAA TCA CTA AAG CTT TTG AAA TCT CAC AGA 1488 Asp Phe Thr Phe Leu Pro Gin Ser Leu Lys Leu Leu Lys Ser His Arg 4S5 470 475 GTT CTG AAG TGG AAG GCC GAT AAA TCT CTT TCT TAT AAC TCA AGG TTC 1536 Vai Leu Lys Trp Lys Ala Asp Lys Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Arg Phe 480 485 490 TGG AAG AAC CTT CTT TAC TTA ATG CCT GCA AAA ACA GTC AAG CCA GGT 1584 Trp Lys Asn Leu Leu Tyr Leu Met Pro Ala Lys Thr Vai Lys Pro Gly 495 500 505 AGA GAC GAA CCG GAA GTC TTG CCT GTT CTT TCC GAG TCT TAA 1626 Arg Asp Glu Pro Glu Vai Leu Pro Vai Leu Ser Glu Ser * 510 515 520 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 542 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Asn Cys Arg Glu Leu Pro Leu Thr Leu Trp Vai Leu Ile Ser Vai -19 -15 -10 -5 Ser Thr Ala Glu Ser Cys Thr Ser Arg Pro His Ile Thr Vai Vai Glu 1 5 10 Gly Glu Pro Phe Tyr Leu Lys His Cys Ser Cys Ser Leu Ala His Glu 15 20 25 Ile Glu Thr Thr Thr Lys Ser Trp Tyr Lys Ser Ser Gly Ser Gin Glu 30 35 40 45 His Vai Glu Leu Asn Pro Arg Ser Ser Ser Arg Ile Ala Leu His Asp 50 55 60 Cys Vai Leu Glu Phe Trp Pro Vai Glu Leu Asn Asp Thr Gly Ser Tyr 65 70 75 48 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Phe Phe Gin Met Lys Asn Tyr Thr Gin Lys Trp Lys Leu Asn Val Ile 80 85 90 Arg Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Thr Glu Arg Gin Val Thr Ser Lys 95 100 105 Ile Vai Glu val Lys Lys Phe Phe Gin Ile Thr Cys Glu Asn Ser Tyr 110 115 120 125 Tyr Gin Thr Leu Val Asn Ser Thr Ser Leu Tyr Lys Asn Cys Lys Lys 130 135 140 Leu Leu Leu Glu Asn Asn Lys Asn Pro Thr Ile Lys Lys Asn Ala Glu 145 150 155 Phe Glu Asp Gin Gly Tyr Tyr Ser Cys Val His Phe Leu His His Asn ISO 165 170 Gly Lys Leu Phe Asn Ile Thr Lys Thr Phe Asn Ile Thr Ile Val Glu 175 130 185 Asp Arg Ser Asn Ile Val Pro Val Leu Leu Gly Pro Lys Leu Asn His 190 195 200 205 Vai Ala Vai Glu Leu Gly Lys Asn Val Arg Leu Asn Cys Ser Ala Leu 210 215 220 Leu Aan Glu Glu Asp Val Ile Tyr Trp Met Phe Gly Glu Glu Asn Gly 225 230 235 Ser Asp Pro Asn. Ile His Glu Glu Lys Glu Met Arg Ile Met Thr Pro 240 245 250 Glu Gly Lys Trp His Ala Ser Lys Val Leu Arg Ile Glu Asn Ile Gly 255 260 265 Glu Ser Asn Leu Asn Val Leu Tyr Asn Cys Thr Val Ala Ser Thr Gly 270 275 2 B0 285 Gly Thr Asp Thr Lys Ser Phe Ile Leu Val Arg Lys Ala Asp Met Ala 290 295 300 Asp Ile Pro Gly His Val Phe Thr Arg Gly Met Ile Ile Ala Val Leu 305 310 315 Ile Leu Vai Ala Val Val Cys Leu Val Thr Val Cys Val Ile Tyr Arg 320 325 330 Vai Asp Leu Val Leu Phe Tyr Arg His Leu Thr Arg Arg Asp Glu Thr 335 340 345 Leu Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Val' Ser Tyr Leu Lys Glu 350 355 360 365 Cys Arg Pro Glu Asn Gly Glu Glu His Thr Phe Ala Val Glu Ile Leu 370 375 380

Pro Arg Vai Leu Glu Lys His Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Glu 385 390 395 49 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Arg Asp Vai Vai Pro Gly Gly Ala Vai Vai Asp Glu Ile His Ser Leu 400 405 410 Ile Glu Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Vai Leu Ser Lys Ser Tyr Met 415 420 425 Ser Asn Glu Vai Arg Tyr Glu Leu Glu Ser Gly Leu His Glu Ala Leu 430 435 440 445 Vai Glu Arg Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr Pro Vai Thr 450 455 460 Asp Phe Thr Phe Leu Pro Gin Ser Leu Lys Leu Leu Lys Ser His Arg 465 470 475 Vai Leu Lys Trp Lys Ala Asp Lys Ser Leu Ser Tvr Asn Ser Arg Phe 480 485 490 Trp Lys Asn Leu Leu Tyr Leu Met Pro Ala Lys Thr Vai Lys Pro Gly 495 500 505 Arg Asp Glu Pro Glu Vai Leu Pro Vai Leu Ser Glu Ser * 510 515 520 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2830 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: mu2Fl (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 381..1994 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: mat_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 435..1991 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sig_peptide (B) LOCALIZAÇÃO: 381..434 50 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: TCCCAGCCCT CCACCTCCCT ACCCCCGGTC GTTGGCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTTTTT 60 TTTTTTCCTG CGATAATTCT CTGGTTTGCC AAATCTCTCT AATCAAGCTC CTGGCCTTGC 120 CTCACTGTGC CTTCCCTCCC TGTCTGTTGT CACAGTTGTG GACCAGGAGG TATTTAGTCT 180 CACTTGCTGG GCGAATCCTG CTTCACAGAT GTAAGCGAAG GAGAAGCCAC TGCCCAGGCC 240 TGTGTGTGGG CCACCTCTCT GAAGGTAAGG GCAGACTCTG ATGTCCAGTC CTCACTGTCT 300 TCTGCTGTCT GGAGCAAGGA GAGGAACCAC CCACAACGAT CCTGAAAACA AGAGATACCA 360 TTCAAAGTGG AAGCCTAAAC ATG CAT CAT GAA GAA TTA ATC TTG ACA CTC 410

Met His His Glu Glu Leu Ile Leu Thr Leu -18 -15 -10 TGC ATT CTC ATT GTT AAA AGT GCC TCA AAA AGT TGT ATT CAC CGA TCA 458 Cys Ile Leu Ile Vai Lys Ser Ala Ser Lys Ser Cys Ile His Arg Ser -5 1 5 CAA ATT CAT GTG GTA GAG GGA GAA CCT TTT TAT CTG AAG CCA TGT GGC 506 Gin Ile His Vai Vai Glu Gly Glu Pro Phe Tyr Leu Lys Pro Cys Gly 10 15 20 ATA TCT GCA CCA GTG CAC AGG AAT GAA ACA GCC ACC ATG AGA TGG TTC 554 Ile Ser Ala Pro val His Arg Asn Glu Thr Ala Thr Met Arg Trp Phe 25 30 35 40 AAA GGC AGT GCT TCA CAT GAG TAT AGA GAG CTG AAC AAC AGA AGC TCG 602 Lys Gly Ser Ala Ser His Glu Tyr Arg Glu Leu Asn Asn Arg Ser Ser 45 50 55 CCC AGA GTC ACT TTT CAT GAT CAC ACC TTG GAA TTC TGG CCA GTT GAG 650 Pro Arg Vai Thr Phe His Asp His Thr Leu Glu Phe Trp Pro Val Glu 60 65 70 ATG GAG GAT GAG GGA ACG TAC ATT TCT CAA GTC GGA AAT GAT CGT CGC 698 Met Glu Asp Glu Gly Thr Tyr Ile Ser Gin Val Gly Asn Asp Arg Arg 75 80 85 AAT TGG ACC TTA AAT GTC ACC AAA AGA AAC AAA CAC AGC TGT TTC TCT 746 Asn Trp Thr Leu Asn Val Thr Lys Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Ser 90 95 100 GAC AAG CTC GTG ACA AGC AGA GAT GTT GAA GTT AAC AAA TCT CTG CAT 7 94 Asp Lys Leu Vai Thr Ser Arg Asp Val Glu val Asn Lys ser Leu His 105 110 115 120 ATC ACT TGT AAG AAT CCT AAC TAT GAA GAG CTG ATC CAG GAC ACA TGG 842 Ile Thr Cys Lys Asn Pro Asn Tyr Glu Glu Leu Ile Gin Asp Thr Trp 125 130 135 CTG TAT AAG AAC TGT AAG GAA ATA TCC AAA ACC CCA AGG ATC CTG AAG 890 Leu Tyr Lys Asn Cys Lys Glu Ile Ser Lys Thr Pro Arg Ile Leu Lys 140 145 150 GAT GCC GAG TTT GGA GAT GAG GGC TAC TAC TCC TGC GTG TTT TCT GTC 938 A3p Ala Glu Phe Gly Asp Glu Gly Tyr Tyr Ser Cys Val Phe Ser Val 155 160 165 CAC CAT AAT GGG ACA CGG TAC AAC ATC ACC AAG ACT GTC AAT ATA ACA 986 His His Asn Gly Thr Arg Tyr Asn Ile Thr Lys Thr Val Asn Ile Thr 170 175 180 51 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ GTT ATT GAA GGA AGG AGT AAA GTA ACT CCA GCT ATT TTA GGA CCA AAG 1034 Vai Ile Glu Gly Arg Ser Lys Vai Thr Pro Ala Ile Leu Gly Pro Lys 185 190 195 200 TGT GAG AAG GTT GGT GTA GAA CTA GGA AAG GAT GTG GAG TTG AAC TGC 1082 Cys Glu Lys Vai Gly Vai Glu Leu Gly Lys Asp Vai Glu Leu Asn Cys 205 210 215 AGT GCT TCA TTG AAT AAA GAC GAT CTG TTT TAT TGG AGC ATC AGG AAA 1130 Ser Ala Ser Leu Asn Lys Asp Asp Leu Phe Tyr Trp Ser Ile Arg Lys 220 225 230 GAG GAC AGC TCA GAC CCT AAT GTG CAA GAA GAC AGG AAG GAG ACG ACA 1178 Glu Asp Ser Ser Asp Pro Asn Vai Gin Glu Asp Arg Lys Glu Thr Thr 235 240 245 ACA TGG ATT TCT GAA GGC AAA CTG CAT GCT TCA AAA ATA CTG AGA TTT 1226 Thr Trp Ile Ser GlU Gly Lys Leu His Ala Ser Lys Ile Leu Arg Phe 250 255 260 CAG AAA ATT ACT GAA AAC TAT CTC AAT GTT TTA TAT AAT TGC ACC GTG 1274 Gin Lys Ile Thr Glu Asn Tyr Leu Asn Vai Leu Tyr Asn Cys Thr Val 265 270 275 280 GCC AAC GAA GAA GCC ATA GAC ACC AAG AGC TTC GTC TTG GTG AGA AAA 1322 Ala Asn Glu Glu Ala Ile Asp Thr Lys Ser Phe Val Leu Val Arg Lys 285 290 295 GAA ATA CCT GAT ATC CCA GGC CAT GTC TTT ACA GGA GGA GTA ACT GTG 1370 Glu Ile Pro Asp Ile Pro Gly His Vai Phe Thr Gly Gly Val Thr Val 3Ò0 305 310 CTT GTT CTC GCC TCT GTG GCA GCA GTG TGT ATA GTG ATT TTG TGT GTC 1418 Leu Vai Leu Ala Ser Vai Ala Ala Vai Cys Ile Val Ile Leu Cys Val 315 320 325 ATT TAT AAA GTT GAC TTG GTT CTG TTC TAT AGG CGC ATA GCG GAA AGA 1466 Ile Tyr Lys Vai Asp Leu Vai Leu Phe Tyr Arg Arg Ile Ala Glu Arg 330 335 340 GAC GAG ACA CTA ACA GAT GGT AAA ACA TAT GAT GCC TTT GTG TCT TAC 1514 Asp Glu Thr Leu Thr Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr 345 350 355 360 CTG AAA GAG TGT CAT CCT GAG AAT AAA GAA GAG TAT ACT TTT GCT GTG 1562 Leu Lys Glu Cys His Pro Glu Asn Lys Glu Glu Tyr Thr Phe Ala Val 365 370 375 GAG ACG TTA CCC AGG GTC CTG GAG AAA CAG TTT GGG TAT AAG TTA TGC 1610 Glu Thr Leu Pro Arg Vai Leu Glu Lys Gin Phe Gly Tyr Lys Leu Cys 380 385 390 ATA TTT GAA AGA GAT GTG GTG CCT GGC GGA GCT GTT GTC GAG GAG ATC 1658 Ile Phe Glu Arg Asp Vai Vai Pro Gly Gly Ala Val Val Glu Glu Ile 395 400 405 • CAT TCA CTG ATA GAG AAA AGC CGG AGG CTA ATC ATC GTT CTC AGC CAG 1706 His Ser Leu Ile Glu Lys Ser Arg Arg Leu Ile Ile Val Leu Ser Gin 410 415 420 AGT TAC CTG ACT AAC GGA GCC AGG CGT GAG CTC GAG AGT GGA CTC CA C 1754 52 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Ala Arg Arg Glu Leu Glu Ser Gly Leu His 425 430 435 440 GAA GCA CTG GTA GAG AGG AAG ATT AAG ATC ATC TTA ATT GAG TTT ACT 1802 Glu Ala Leu Vai Glu Arg Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr 445 450 455 CCA GCC AGC AAC ATC ACC TTT CTC ccc CCG TCG CTG AAA CTC CTG AAG 1850 Pro Ala Ser Asn Ile Thr Phe Leu Pro Pro Ser Leu Lys Leu Leu Lys 460 465 a nn t / u TCC TAC AGA GTT CTA AAA TGG AGG GCT GAC AGT CCC TCC ATG AAC TCA 1898 Ser Tyr Arg Vai Leu Lys Trp Arg Ala Asp Ser Pro Ser Met Asn Ser 475 480 485 AGG TTC TGG AAG AAT CTT GTT TAC CTG ATG CCC GCA AAA GCC GTC AAG 1946 Arg Phe Trp Lys Asn Leu Vai Tyr Leu Met Pro Ala Lys Ala Vai Lys 490 495 SOO CCA TGG AGA GAG GAG TCG GAG GCG CGG TCT GTT CTC TCA GCA CCT TGA 1994 Pro Trp Arg Glu Glu Ser Glu Ala Arg Ser Vai Leu Ser Ala Pro * 505 510 515 520 GCTCCAGACG AGCTTGATGT CAAAAGCAAG TGAAGCGCTG CTAGAGGTCA TGCGTGTGCC 2054 TATTCACAGC GGTAGCTGTG GTTCAAAAGG CTGAATTTTG TGACTATACC CCCCACTCCC 2114 AGTTAGGAOA GTTGTCATCG GGTCATCACA GATGAAACAG AGCCTTGGTT GTGATCCTGA 2174 ACTCGCAGAG GGGGCCTTGG GATTCACAAG AAATCAGTTT GTTATTCTTT CTTCCTCTGG 2234 AGCAGTGATT CCCAACCTGT GGGTTGTGGC CCCTTTGGCA AACCTTTATC TCCAAAATAG 2294 ATGTACGCTA TGATTCATAA CTGTAGCCAA CTCACAGTTA CAAAGTAGCA ACGAAAAAAG 2354 TTTTATGGTT GGGGGTTTCA CCACAGTGTG AAGAACTGTA TTAAAGGGTT GAAGCATTAG 2414 GAAGGTTGAG AACCGCTGGC CTAGAGCTGT CTGCCCAAAG CTTCTTGTGA CCTTGCAAGT 2474 GCCTGAGTGA AGCAAGAATA TTCTAGGGAA GTCTAGAGCA GAGACTGTGC TGAACAAACA 2534 CAGTAGATTT TAGGAAAACC AAACCAAACC AAATGAAAGG AAAGGAAACA GAAAAAAAAA 2594 CAAGAAGAAT GGGGATTCTT AAGTAATTTT TGTAACTCAT GACTTCATGT GCTATTTGAC 2654 TGACTTGAGA AAAGAAGGTA AATTCATTCA ACATCTGCTG TCACAACAGC TGTGTGTGAA 2714 AACCTAGCAT CAGAAGAGAG TTGGGAGAGT TTGAGACTTC GCTTTGTTCT TCTATCAGCC 2774 AAGCTTCGAC ACATGAAGTT TATTTTATAT GAAATATATT TTGTATTAAA TCTGCC 2830 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 538 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 53 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

Met His His Glu Glu Leu Ile Leu Thr Leu Cys Ile Leu Ile Val Lys -18 -15 -10 -5 Ser Ala Ser Lys Ser Cys Ile His Arg Ser Gin Ile His Val Val Glu 1 5 10 Gly Glu Pro Phe Tyr Leu Lys Pro Cys Gly Ile Ser Ala Pro Val His 15 20 25 30 Arg Asn Glu Thr Ala Thr Met Arg Trp Phe Lys Gly Ser Ala Ser His 35 40 45 Glu Tyr Arg Glu Leu Asn Asn Arg Ser Ser Pro Arg Val Thr Phe His 50 55 60 Asp His Thr Leu Glu Phe Trp Pro Val Glu Met Glu Asp Glu Gly Thr 65 70 75 Tyr Ile Ser Gin Val Gly Asn Asp Arg Arg Asn Trp Thr Leu Asn Val 80 85 90 Thr Lys Arg Asn Lys His Ser Cys Phe Ser Asp Lys Leu Val Thr Ser 95 100 105 110 Arg Asp Vai Glu Val Asn Lys Ser Leu His Ile Thr Cys Lys Asn Pro 115 120 125 Asn Tyr Glu Glu Leu Ile Gin Asp Thr Trp Leu Tyr Lys Asn Cys Lys 130 135 140 Glu Ile Ser Lys Thr Pro Arg Ile Leu Lys Asp Ala Glu Phe Gly Asp 14 5 150 155 Glu Gly Tyr Tyr Ser Cys Val Phe Ser Val His His Asn Gly Thr Arg ISO 165 170 Tyr Asn Ile Thr Lys Thr Val Asn Ile Thr Val Ile Glu Gly Arg Ser 175 180 185 190 Lys Vai Thr Pro Ala Ile Leu Gly Pro Lys cys Glu Lys Val Gly Val 195 200 2 05 Glu Leu Gly Lys Asp Val Glu Leu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Asn Lys 210 215 220 Asp Asp Leu Phe Tyr Trp Ser Ile Arg Lys Glu Asp Ser Ser Asp Pro 225 230 235 Asn Vai Gin Glu Asp Arg Lys Glu Thr Thr Thr Trp Ile Ser Glu Gly 240 245 250 Lys Leu His Ala Ser Lys ile Leu Arg Phe Gin Lys Ile Thr Glu Asn 255 260 265 270 Tyr Leu Asn Val Leu Tyr Asn Cys Thr Val Ala Asn Glu Glu Ala Ile 275 280 285 Asp Thr Lys Ser Phe Val Leu Val Arg Lys Glu Ile Pro Asp ile Pro 290 295 300 54 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ

Gly His Vai Phe Thr Gly Gly Val Thr Val Leu Val Leu Ala Ser Val 305 310 315 Ala Ala Vai Cys Ile Vai Ile Leu Cys Val Ile Tyr Lys Val Asp Leu 320 325 330 Vai Leu Phe Tyr Arg Arg Ile Ala Glu Arg Asp Glu Thr Leu Thr Asp 335 340 345 350 Gly Lys Thr Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Leu Lys Glu Cys His Pro 355 360 365 Glu Asn Lys Glu Glu Tyr Thr Phe Ala Val Glu Thr Leu Pro Arg Val 370 375 380 Leu Glu Lys Gin Phe Gly Tyr Lys Leu Cys Ile Phe Glu Arg Asp Val 385 390 395 Vai Pro Gly Gly Ala Val Val Glu Glu Ile His Ser Leu Ile Glu Lys 400 405 410 Ser Arg Arg Leu Ile Ile Val Leu Ser Gin Ser Tyr Leu Thr Asn Gly 415 420 425 430 Ala Arg Arg Glu Leu Glu Ser Gly Leu His Glu Ala Leu Val Glu Arg 435 440 445 Lys Ile Lys Ile Ile Leu Ile Glu Phe Thr Pro Ala Ser Asn Ile Thr 450 455 460 Phe Leu Pro Pro Ser Leu Lys Leu Leu Lys Ser Tyr Arg Val Leu Lys 465 470 475 Trp Arg Ala Asp Ser Pro Ser Met Asn Ser Arg Phe Trp Lys Asn Leu 480 485 490 Vai Tyr Leu Met Pro Ala Lys Ala Val Lys Pro Trp Arg Glu Glu Ser 495 500 505 510 Glu Ala Arg Ser Vai Leu Ser Ala Pro * 515 520 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 8 aminoácidos (Β) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vii) FONTE IMEDIATA:

(B) CLONE: péptido FLAG 55 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Lisboa,

Claims (31)

1. ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. ADN isolado que codifica um polipéptido 2F1, em que o referido 2Fl compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído pelos residuos -19 a 552 de SEQ ID NO:2, residuos 1 a 552 de SEQ ID NO:2, residuos -19 a 310 de SEQ ID NO:2, residuos 1 a 310 de SEQ ID NO:2, residuos -18 a 519 de SEQ ID NO:4, residuos 1 a 519 de SEQ ID NO:4, residuos -18 a 307 de SEQ ID NO:4 e residuos 1 a 307 de SEQ ID NO:4.
2. 2. ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ADN codifica um polipéptido 2F1 humano solúvel compreendendo a sequência de aminoácidos dos residuos 1 a 310 de SEQ ID NO:2.
3. 3. ADN de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ADN compreende uma sequência nucleotidica seleccionada a partir do grupo constituído pelos nucleótidos 1 a 1626 de SEQ ID NO:l, nucleótidos 58 a 1626 de SEQ ID NO:l, nucleótidos 1 a 985 de SEQ ID NO:l, nucleótidos 58 a 985 de SEQ ID NO: 1, nucleótidos 381 a 1994 de SEQ ID NO:3, nucleótidos 435 a 1994 de SEQ ID NO:3, nucleótidos 381 a 1355 de SEQ ID NO:3 e nucleótidos 435 a 1355 de SEQ ID NO:3.
4. 4. ADN isolado que codifica um polipéptido 2F1, em que o referido polipéptido 2F1 compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80% idêntica a uma sequência seleccionada a partir do grupo constituído pelos resíduos 1 a 522 de SEQ ID NO:2 e resíduos 1 a 519 de SEQ ID NO:4.
5. 5. ADN de acordo com a reivindicação 4, em que o referido ADN codifica um polipéptido 2F1 humano compreendendo a sequência de aminoácidos 1 a 297 e 299 a 522 de SEQ ID NO:2, com a condição de o referido polipéptido 2F1 carecer do residuo na posição 298 de SEQ ID NO:2.
6. 6. ADN de acordo com a reivindicação 4, em que o referido ADN codifica um polipéptido 2F1 humano solúvel compreendendo a sequência de aminoácidos 1 a 297 e 299 a 310 de SEQ ID NO:2, com a condição de o referido polipéptido 2F1 carecer do resíduo na posição 298 de SEQ ID NO:2. ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 2/5
7. 7. ADN isolado que codifica um polipéptido 2F1 solúvel, em que o referido ADN isolado é capaz de hibridar com um ADN de acordo com a reivindicação 3 sob condições de 68 °C, seguidas por lavagem com SSC 0,1X/SDS a 0,1% a 68°C, em que o referido polipéptido 2F1 solúvel é capaz de inibir a activação de nf-kb.
8. 8. ADN de acordo com a reivindicação 7, em que o referido polipéptido 2F1 solúvel compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80% idêntica à sequência de resíduos 1 a 310 de SEQ id NO:2.
9. 9. ADN de acordo com a reivindicação 7, em que o referido ADN codifica polipéptido 2F1 humano solúvel seleccionado a partir do grupo constituído por: a) o domínio extracelular do 2F1 humano de SEQ ID NO:2, e b) um fragmento do referido domínio extracelular, em que o referido fragmento é capaz de inibir a activação de NF-KB.
10. 10. Vector de expressão compreendendo um ADN de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 4, reivindicação 7 ou reivindicação 9.
11. 11. Processo para preparação de um polipéptido 2F1, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um vector de acordo com a reivindicação 10 sob condições que promovem a expressão de 2F1, e recuperação do polipéptido 2F1.
12. 12. Polipéptido 2F1 purificado, compreendendo uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo de resíduos -19 a 552 de SEQ id N0:2, resíduos 1 a 552 de SEQ id N0:2, resíduos -19 a 310 de SEQ ID NO:2, resíduos 1 a 310 de SEQ ID NO:2, resíduos -18 a 519 de SEQ ID NO:4, resíduos 1 a 519 de SEQ ID NO: 4, resíduos -18 a 307 de SEQ ID NO:4 e resíduos 1 a 307 de SEQ ID NO:4.
13. 13. Polipéptido 2F1 de acordo com a reivindicação 12, em que o referido 2F1 é um polipéptido 2F1 humano solúvel compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 1 a 310 ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 3/5 de SEQ ID NO:2.
14. 14. Polipéptido 2F1 purificado, em que o referido 2F1 compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80% idêntica a uma sequência seleccionada a partir do grupo constituído pelos resíduos 1 a 522 de SEQ ID NO:2 e resíduos 1 a 519 de SEQ ID NO:4.
15. 15. Polipéptido 2F1 de acordo com a reivindicação 14, em que o referido 2F1 é um polipéptido 2F1 humano compreendendo a sequência de aminoácidos 1 a 297 e 299 a 522 de SEQ ID NO:2, com a condição de o referido polipéptido 2F1 carecer do resíduo na posição 298 de SEQ ID NO:2.
16. 16. Polipéptido 2F1 de acordo com a reivindicação 14, em que o referido 2F1 é um polipéptido 2F1 humano solúvel compreendendo a sequência de aminoácidos 1 a 297 e 299 a 310 de SEQ ID NO:2, com a condição de o referido polipéptido 2F1 carecer do resíduo na posição 298 de SEQ ID NO:2.
17. 17. Polipéptido 2F1 solúvel, purificado, em que o referido 2F1 é codificado pelo ADN de acordo com a reivindicação 7.
18. 18. Polipéptido 2F1 solúvel de acordo com a reivindicação 17, em que o referido 2F1 compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80% idêntica à sequência de resíduos 1 a 310 de SEQ ID NO:2.
19. 19. Polipéptido solúvel de acordo com a reivindicação 17, em que o referido 2F1 é um polipéptido 2F1 humano solúvel seleccionado a partir do grupo constituído por: a) o domínio extracelular do 2F1 humano de SEQ ID NO:2, e b) um fragmento do referido domínio extracelular, em que o referido fragmento é capaz de inibir a activação de NF-KB.
20. 20. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um polipéptido 2F1 solúvel de acordo com a reivindicação 18 ou a reivindicação 19 e um diluente ou veículo adequados. ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 4/5
21. 21. Anticorpo que é dirigido contra um polipéptido 2F1 de acordo com a reivindicação 12.
22. 22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.
23. 23. Polipéptido 2F1 solúvel de acordo com a reivindicação 17 ou a reivindicação 18 para utilização num medicamento.
24. 24. Utilização de um polipéptido 2F1 solúvel de acordo com a reivindicação 17 ou a reivindicação 18 na preparação de um medicamento para a inibição da activação de NF-kb num mamifero.
25. 25. Utilização de um polipéptido 2F1 solúvel de acordo com a reivindicação 17 ou a reivindicação 18 na preparação de um medicamento para a redução da inflamação num mamífero atingido por uma condição inflamatória.
26. 26. Oligómero compreendendo de dois a quatro polipéptidos 2F1 humanos solúveis de acordo com a reivindicação 17 ou reivindicação 18.
27. 27. Composição compreendendo o anticorpo de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22.
28. 28. Composição de acordo com a reivindicação 27 para utilização como um medicamento.
29. 29. Composição de acordo com a reivindicação 27 para utilização no tratamento de condições inflamatórias.
30. 30. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 27 no fabrico de um medicamento para 0 tratamento de condições inflamatórias.
31. 31. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29 ou utilização de acordo com a reivindicação 30 em que a condição inflamatória é artrite, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, alergia, asma ΕΡ 1 007 537/ΡΤ 5/5 ou doença inflamatória do intestino. Lisboa,