PL80573B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania nowego antybiotyku — negamycyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku, zwanego negamycyna. W szczególnosci wynalazek dotyczy sposobu wytwa¬ rzania negamycyny metoda fermentacji oraz spo¬ sobów odzyskiwania i oczyszczania. Wynalazek do¬ tyczy sposobu wytwarzania czynnika o dzialaniu przeciwbakteryjnym oraz jego soli w rozcienczo¬ nych roztworach, surowych koncentratów, suro¬ wych osadów i czystego proszku. Substancja ta skutecznie hamuje dzialanie: Pseudomonas, Salmo¬ nella, Klebsiella i Staphylococci. Odznacza sie ona mala toksycznoscia i,dziala leczniczo przeciwko za¬ razkom Pseudomonas i innym wrazliwym mikro¬ organizmom u myszy, ludzi i zwierzat. Antybiotyk ten jest rozpuszczalny w wodzie i praktycznie nie¬ rozpuszczalny w metanolu, etanolu, butanolu, octa¬ nie etylu, octanie butylu, chloroformie i benzenie, nie wykazuje maksimum absorpcji w nadfiolecie w pasmie 220—400 m^, wykazuje reakcje dodatnia z ninhydryna, czerwienia tetrazolowa i odczynni¬ kiem Rydon-femitha oraz reakcje ujemna z odczyn¬ nikami Sakaguchi'ego i Moloscha, wykazuje pasma absorpcji w podczerwieni (w pastylkach z brom¬ kiem potasu) przy dlugosciach: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 i 720 cm-1 i jest optycznie czynna — (a)D29 wynosi +2,5° (c2, H2'0). Substancja ta posiada wzór suma¬ ryczny C9H2oN404, wykazuje ona trzy wartosci pK 3,55, 8,10 i 9,75, a budowe wyraza nastepujacy wzór. 10 15 20 25 30 Z CH2/Niy—CH/OH/—CH2—CH/NH2/—CH2—CO—NH —N/CH3/—CH2—COOH Na fig. 1 przedstawiono widmo absorpcyjne w podczerwieni dla negamycyny lacznie z bromkiem potasu, a ma fig. 2 — widmo magnetycznego rezo¬ nansu jadrowego negamycyny w D20.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania negamycyny o dzialaniu antybiotyku, obejmujacy hodowle gatunku Streptomyces purpeofuscus ATCC 21470 w wodnym roztworze weglowodanów zawie¬ rajacych zasobny w azot srodek odzywczy, w wa¬ runkach aerobowych, po czym wyodrebnia wytwo¬ rzona negamycyne z wodnego roztworu i ewentual¬ nie dalej oczyszcza.Negamycyna jest nowym antybiotykiem. Mikro¬ organizm wytwarzajacy ten antybiotyk po raz pierwszy wydzielono z próbki gleby Myogisan, pre¬ fektura Gumma, w sierpniu 1964 r. i nadano mu numer laboratoryjny M890-C2.Szczep nr M890-C2 zlozono w Kogyogijutsuin Hakko Kenkyujo 6 maja 1969 r. i przypisano mu numer depozytowy 306. Zlozono go równiez w American Type Culture Collection i oznaczono ATCC 21470.Szczep nr M890-C2 wykazuje nastepujace cechy.Pod mikroskopem obserwuje sie dobrze rozgalezio¬ na grzybnie podloza, tworzaca prosta i kreta grzyb¬ nie zewnetrzna, lecz bez zwojów czy spiral. Po¬ wierzchnia sporu jest gladka.Cechy w róznych srodowiskach sa nastepujace 80 5733 (okreslenie barwy podano w nawiasach, zgodnie z „Color Harmony Manual", Container Corporation of America). 1. Na pozywce Czapeka (agar z gliceryna) przy inkubacji w temperaturze 27°C: jasno zólta do ciemno-ióltawo-brazowej {Spice brown 4 ni) kolo¬ nia bakteryjna tworzaca obfita grzybnie zewnetrz¬ na barwy jasno szarej; wytwarza sie rozpuszczalny pigment o barwie brazowej do jasno czerwonawo- -brazowej. 2. Na pozywce Krainsky'ego (agar z glikoza i asparagina) przy inkubacji w temperaturze 27°C: kolonia bakteryjna o barwie od zóltawo-brazowej (Luggage Tan 4 ne) do ciemno zóltawo-brazowej (Clove Brown 3 ni), wytwarzajaca grzybnie zew¬ netrzna o barwie od zóltawo-bialej do jasno hra- zowawo-szarej; rozpuszczalny pigment jest jasno brazowy. 3. W srodowisku agaru z jablczanem wapnia przy inkubacji w temperaturze 27°C: kolonia bakteryj¬ na o barwie szarawo-brazowej (Fawn 4 ig) tworza¬ ca grzybnie zewnetrzna o barwie od slabo szarawo- -bialej do lekko szarej. Pigment nierozpuszczalny.Jablczan wapnia wokól kolonii ulega znacznemu rozpuszczeniu w okresie 3 dniowej inkubacji. 4. W roztworze peptonu zawierajacym 1% azo¬ tanu sodu przy inkubacji w temperaturze 27UC: bezbarwna do jasno zóltawo-brazowej kolonia bak¬ teryjna bez grzybni zewnetrznej. Pigment nieroz¬ puszczalny lub nieznacznie rozpuszczalny, brazowy.Wystepuje slaba redukcja azotanu. 5. Na skrawku ziemniaka przy inkubacji w tem¬ peraturze 27°C: pofaldowana kolonia bakteryjna o barwie od jasno zóltawo-brazowej (Lt Gold 2 ic) do zóltawo-brazowej (Yellow Mapie 3 ng), a w koncu od ciemno zóltawo-brazowej (Clove Brown 3 pi) do czarnej. Nie wystepuje grzybnia zewnetrz¬ na. Slabo brazowawy, rozpuszczalny pigment. 8. Na plytce z agarem i skrobia pray inkubacji w temperaturze 27°C: kolonia bakteryjna o barwie jasno zóltawo-brazowej do zóltawo-brazowej (Spice Brown 4 ni) wytwarzajaca grzybnie zewnetrzna o barwie od zóltawo-bialej do jasno szarej. Rozpu¬ szczalny pigment o barwie od brazowawej do jasno czerwonawo-brazowej. Skrobia ulega hydrolizie. 7. W srodowisku odzywczego agaru przy inku¬ bacji w temperaturze 37°C: po 14 dniach inkubacji nie obserwuje sie wystepowania kolonii bakteryj¬ nej. 8. W srodowisku odzywczego agaru przy inku¬ bacji w temperaturze Z7°C: kolonia bakteryjna o barwie jasno czerwonawo-brazowej (Brick Red 0 1/2 mg) wytwarzajaca grzybnie zewnetrzna i jas¬ no czerwonawo-brazowy, rozpuszczalny pigment; 9. W srodowisku skoagulowanej surowicy Loeff- lera przy inkubacji w temperaturze 37^: po 14 dniach inkubacji nie obserwuje sie kolonii bakte¬ ryjnej. 10. W srodowisku zelatyny i utrzymywaniu ho¬ dowli w temperaturze ztf°C: bezbarwna do jasno $óltawo-brazowej kolonia bakteryjna, nie wytwa¬ rzajaca grzybni zewnetrznej i wytwarzajaca roz¬ puszczalny pigment o barwie od brazowej do ciem¬ no brazowej. Wystepuje silne stapianie zelatyny. 11. W odtluszczonym mleku przy inkubacji w 1573 4 temperaturze 37°C: bezbarwna kolonia bakteryjna, nie wytwarzajaca ani grzybni zewnetrznej ani roz¬ puszczalnego pigmentu. Po calkowitej koagulacji mleka w czwartym dniu inkubacji nastepuje po- 5 wolna peptyzacja. 12. W srodowisku agaru z tyrozyna przy inku¬ bacji w temperaturze 27°C: bezbarwna lub szara do ciemno brazowej kolonia bakteryjna, wytwa¬ rzajaca cienka grzybnie zewnetrzna o barwie od 10 bialej do szarawo-bialej. Ze wzgledu na ciemne zabarwienie rozpuszczalnego pigmentu, trudne jest okreslenie aktywnosci tyrozyny. 13. Na celulozie (bibula filtracyjna) przy inkubacji w temperaturze 27°C: slabo widoczna kolonia bak- 15 teryjna, bez rozkladu celulozy. 14. Z zastosowaniem weglowodanów na podsta¬ wowej pozywce Pradham-Gotflieba przy inkubacji w temperaturze 27°C: Wystepowanie kolonii bak¬ teryjnej ze skrobia, dekstryna, gliceryna, galakto- 20 za, glikoza, sacharoza, maltoza i mannoza. Brak ko¬ lonii przy inozycie, laktozie, mannicie, rafinozle, ramnozie, Lnulinie, sorbicie, fruktozie, ksylozie, arabinozie, salicymie i dulcycie.Wlasciwosci szczepu nr M890-C2 przedstawiaja 25 sie nastepujaco: nalezy on do rodzaju Streptomy- ces, posiadajacych grzybnie zewnetrzna, nie two¬ rzaca ani spiral ani skretów, powierzchnia porów jest gladka; w róznych srodowiskach tworzy ciem¬ no zóltawo-brazowa kolonie bakteryjna z szara ao lub lekko szara do lekko brazowawo-szarej grzyb¬ nia zewnetrzna; tworzy nierozpuszczalny lub bar¬ dzo slabo rozpuszczalny pigment, lekko czerwo¬ nawo-brazowy; w ciagu kilkudniowej inkubacji za¬ barwienie kolonii przechodzi w czarne; w odzyw- S5 czym agarze w temperaturze 27°C: tworzy czerwo- nawo-brazowa kolonie i czerwonawo-brazowy roz¬ puszczalny pigment; tworzy pigment melaminy, hy- drolizuje skrobie i wykazuje stosunkowo silne dzia¬ lanie proteolityczne. 4i Ilosc negamycyny okresla sie zwykla metoda cy- lindrowo-plytkowa z zastosowaniem czystej nega¬ mycyny jako wzorca oraz wrazliwego mikroorga¬ nizmu, jak inp. E. coli K12, Fseudomonas aerugi- naosa itp. ^5 Streptomyces wytwarzaja negamycyne, o ile wzrastaja w odpowiednich warunkach. Bulion fer¬ mentacyjny, zawierajacy negamycyne, uzyskuje sie przez wszczepienie sporów lub grzybni mikroorga¬ nizmów, wytwarzajacych negamycyne, do odpowie- 30 dniej pozywki, a nastepnie hodowle w warunkach aerobowych. .W celu wytwarzania negamycyny mozliwa jest hodowla na podlozu stalym, lecz dla uzyskania licznej hodowli korzystne jest srodo¬ wisko ciekle. Fermentacja moze przebiegac w do- $5 wolnej temperaturze, przy której mikroorganizmy rozrastaja sie i wytwarzaja negamycyne, korzystne Jest jednak utrzymywanie temperatury w grani¬ cach 25—32°C Dla wytwarzania negamycyny sto¬ suje sie srodowisko, skladajace sie ze znanych dla w actinomycetes rodzajów pozywek. Jako zródlo azotu stosuje sie na przyklad takie produkty handlowe, jak: peptony, ekstrakty miesne, aminy N—Z, ka¬ zeina, maczka fasoli sojowej, ekstrakt zbozowy, maczka z orzechów ziemnych, maczka z nasion ba- m welny, azotan sodu, azotan amonu, siarczan amonu80 573 5 6 i inne, zawierajace azot produkty, jak otreby psze¬ nicy, otreby ryzu itp. Jako zródlo wegla stosuje sie takie produkty handlowe, jak: glikoza, glice¬ ryna, skrobia, maltoza, dekstryna, sacharoza, lak¬ toza, oleje z fasoli sojowej i inne czyste lub w sta- 5 nie surowym weglowodany lub tluszcze. Mozna równiez dodawac chlorek sodu, fosforan sodu lub potasu, weglan wapnia oraz w razie potrzeby sole metali. Mozliwe jest zastosowanie dowolnego rodza¬ ju skladników, wykorzystywanych przez mikro- 10 organizmy do wytwarzania negamycyny.Fermentacje, prowadzi sie do chwili nagromadze¬ nia znacznych ilosci negamycyny. Na przyklad, spory i grzybnie na hodowli skosnej S. purpeofu- scus wszczepia sie do pozywki, skladajacej sie z 2% 15 glikozy, 2% skrobi, 2% maczki z fasoli sojowej, 0,5% ekstraktu drozdzowego, 0,25% chlorku sodu, 0,35% weglanu wapnia, 0,0005% CuS04 • 5H20, 0,0005% MnCl2 . 7H20, 0,005% ZnS04 . 7H20 (pH dopro¬ wadza sie do wartosci 7) i hodowle wytrzasa sie 20 w temperaturze 27°C. Nastepnie obserwuje sie na¬ gromadzanie negamycyny w ciagu 3 do 8 dni, z szybkoscia na przyklad 20 ^ig/ml w trzecim dniu, 108 ^ig/ml (pH=7,4) w szóstym dniu, 185 fig/ml (pH=7,6) w siódmym dniu i 122 \ig/ml (pH= 7,8) 25 w ósmym dniu.Wodny roztwór negamycyny jest wzglednie trwa¬ ly. Na przyklad ogrzewajac roztwór, zawierajacy 5 mg/ml negamycyny, przy róznych wartosciach pH to jest 1,8, 7,2 i 9,2 w temperaturze 60°C w 30 ciagu 30 minut stwierdza sie, ze 91% negamycyny nie ulega rozkladowi. Utrzymujac roztwór, zawie¬ rajacy 2 mg/ml negamycyny, przy róznych warto¬ sciach pH, w temperaturze 27°C w ciagu jednego tygodnia stwierdza sie, ze nastepujace ilosci nega- 35 mycyny nie ulegaja rozkladowi: 86% przy pH= 2,25; 80% przy pH=4,90; 76% przy pH=7,15; 89% przy pH=9,0 i 79% przy pH=10,2.Sposób wedlug wynalazku obejmuje równiez ekstrakcje i oczyszczanie negamycyny. Negamycyna 40 jest rozpuszczalna w wodzie i wystepuje glównie ^ w czesci cieklej bulionu fermentacyjnego. Zawar¬ ta w bulionie negamycyna nie przechodzi do orga¬ nicznych rozpuszczalników takich, jak: butanol, octan etylu, eter, chloroform i benzen. 45 Negamycyne wydziela sie z przefermentowanego bulionu lub z jej wodnego roztworu, uzywajac adsorbentów, korzystnie wegla aktywnego. Zaad- sorbowana na weglu aktywnym negamycyne ko¬ rzystnie wymywa sie wodnym roztworem meta- 50 nolu, butanolu i acetonu. Najlatwiej wymywa sie w warunkach kwasnych, stosujac kwas solny. Po¬ mimo istnienia grupy karboksylowej ze wzgledu na obecnosc dwóch grup zasadowych cala czastecz¬ ka negamycyny ma charakter zasadowy i ulega 55 adsorpcji na jonowymiennej zywicy typu kationitu.Najbardziej odpowiednia metoda jest ekstrakcja negamycyny z przefermentowanego bulionu lub z jej wodnego roztworu przy uzyciu zywicy katio- nitowej. W metodzie tej mozna stosowac wszystkie 60 rodzaje zywic, posiadajacych grupe kwasu karbo- ksylowego lub sulfonowego z jonem wodorowym, potasowym lub amonowym, lub ich kombinacje.Negamycyne, zaadsorbowana na kationicie, wymy¬ wa sie takimi kwasami, jak kwas solny, siarkowy 65 itp., lecz najkorzystniej wodnym roztworem amo¬ niaku. Negamycyne, jako posiadajaca grupe kar¬ boksylowa mozna równiez adsorbowac na jonowy¬ miennej zywicy typu anionitu. Na przyklad na zy¬ wicy Dowex 1X2 (nazwa handlowa, Dow Chemical Co., U.S.A.) z jonem wodorotlenowym, po czym zaadsorbowana negamycyne wymywa sie rozcien¬ czonym kwasem solnym. Zywica amonitowa, posia¬ dajaca slabe grupy zasadowe taka, jak Amberlit IR45 (nazwa handlowa, Rhom and Haas Co., U.S.A.) z jonem wodorotlenowym moze byc zastosowana do zobojetnienia kwasnego roztworu negamycyny, jednakze bez adsorpcji wiekszych ilosci tego anty¬ biotyku.Grzybnie z bulionu fermentacyjnego usuwa sie przez odsaczenie lub odwirowanie. Bulion fermen¬ tacyjny, zawierajacy grzybnie mozna równiez wpro¬ wadzac bezposrednio do kolumny z zywica z pomi¬ nieciem ^procesu usuwania grzybni. Jest to mozliwe, o ile usunie sie duze czastki, które wstrzymalyby przeplyw przez kolumne, przez przepuszczenie bu¬ lionu przez siatke metaliczna. Ponizej podany jest jeden ze sposobów wydzielania negamycyny z bu¬ lionu fermentacyjnego S.purpeofuscus: bulion fer¬ mentacyjny odsacza sie lub odwirowuje i przesacz lub sklarowana ciecz przepuszcza sie przez kolumne z zywica kationowa, zawierajaca 70% jonów amo¬ nowych. Po przemyciu kolumny woda, zaadsorbo¬ wana negamycyne wymywa sie 2% roztworem NH4OH 'w wodzie, a zawierajacy negamycyne eluat zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem w celu usuniecia amoniaku. Zatezony roztwór przepuszcza sie przez kolumne, wypelniona zywica Dowex 1X2 z jonami OH i po przemyciu woda negamycyne wy¬ mywa sie z zywicy 0,5 n roztworem kwasu solnego; Eluat, zawierajacy negamycyne, zobojetnia sie zy¬ wica IR45 z jonami OH, odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem do sucha i uzyskuje sie surowy osad chlorowodorku negamycyny. Surowy osad chlorowodorku rozpuszcza sie w wodzie i przepu¬ szcza przez zywice typu Amberlitu CG-50 (nazwa handlowa, Rhom and Hass Co., U.S.A.) z jonami a- monowymi i wydziela na drodze chromatografii bi¬ bulowej, stosujac wode lub 0,1%-owy roztwór NH4OH; frakcje, zawierajace negamycyne^ odparo¬ wuje sie wprózni i uzyskuje sie bialy osad czystej ne¬ gamycyny; jesli czystosc jest niezadowalajaca pro¬ dukt powtórnie oczyszcza sie na drodze chromato¬ graficznej. Ze wzgledu na zasadowy,charakter, ne¬ gamycyne mozna wytracac przez dodanie nieroz¬ puszczalnego w wodzie kwasu takiego, jak na przy¬ klad kwas pikrynowy, kwas p-hydroksyazobenze- no-p'-sulfonowy itp. Negamycyna krystalizuje v/ postaci soli kwasu p-hydroksyazobenzeno-p^sulfo- nowego. Negamycyne w formie nierozpuszczalnych w wodzie soli wydziela sie z kwasów metodami znanymi dla wydzielania zasady z nierozpuszczal¬ nego w wodzie kwasu. Na przyklad, na p-hydro- ksyazobenzeno-p'-sulfonian negamycyny dziala sie kwasem solnym w etanolu w celu wytracenia chlo¬ rowodorku negamycyny. Do wytracenia negamycy¬ ny mozna równiez stosowac nierozpuszczalny w wodzie kwas taki, jak Targitol 4, Targitol 7 (Unnion Carbide and Carbon Chemical CO.), jak równiez sól kwasu sulfolaurynowego.7 Oczyszczona wyzej opisana metoda negamycyna ma postac bialego proszku. Jest ona latwo rozpu¬ szczalna w wodzie i nierozpuszczalna w metanolu, etanolu, estrach i benzenie. Widmo wodnego roz¬ tworu negamycyny wykazuje koniec absorpcji, lecz w zakresie 220 do 40 mji nie wystepuje maksimum absorpcji w ultrafiolecie. Negamycyna jest amfo- terem i wykazuje silne wlasnosci zasadowe, a sla¬ be wlasnosci kwasowe. Pod napieciem 3500 V w obecnosci buforu o pH=l,8 (kwas mrówkowy — kwas octowy — woda; w stosunku objetosciowym 25:75:900), negamycyna przemieszcza sie o 12 cm w kierunku katody oraz wykazuje ruchliwosc 1,4 przy przyjeciu ruchliwosci alaniny za 1,0. Negamy¬ cyna tworzy kwasne sole addycyjne z kwasem sol¬ nym, siarkowym, p-hydroksyazobenzeno-p'-sulfo- nowym, pikrynowym itp. Jako posiadajaca grupe karboksylowa* negamycyna tworzy równiez sole z metalami i estry. Wykazuje ona dodatnia reakcje z ninhydryna i odczynnikiem Rydon-Smitha oraz reakcje ujemna z antronem i odczynnikiem Saka- guchisgo. Po ogrzaniu negamycyny w 6 n kwasie solnym w temperaturze 105°C w ciagu 6 godzin uzyskuje sie wiecej niz trzy produkty hydrolizy ninhydryny (trzy glówne produkty).Trzema glównymi produktami hydrolizy sa r-hyd- roksy-^-lizyna, N,N'-dwumetylohydrazyna i mety¬ loamina. Jako drugorzedne produkty hydrolizy otrzymuje sie sakrozyne i kwas 1-metylohydrazy- nooctowy.Czysta negamycyna topi sie stopniowo poczyna¬ jac od temperatury 75°C i rozklada sie z pienie¬ niem w temperaturze 110—120°C. Na podstawie analizy elementarnej uzyskuje sie nastepujace wy¬ niki: wartosci obliczone dla C9H2oN404 . 2H20: C — 38,02; H — 8,51; N — 19,71; O — 33,77; wartosci oznaczone: C — 37,38; H — 8,62; N — 18,94 i O — 31,70. Jako równowaznik miareczkowy uzyskuje sie wartosc 287. p-Hydroksyazobenzeno-p'-sulfonian negamycyny otrzymuje sie w postaci zólto-poma- ranczowych krysztalów o temperaturze topnienia 180—182°C (rozklad), wykazuje on 1/3 przeciwbak- teryjnego dzialania negamycyny, a na podstawie analizy elementarnej uzyskuje sie nastepujace wy¬ niki: wartosci obliczone dla CgH2oN404(C12H10N204S)2 2H2: C — 47,13; H — 5,27; N — 13,33; O — 26,64 i S — 7,63, wartosci oznaczone: C — 47,09; H — 5,16; N — 13,20; O — 25,53 i S — 8,01. Negamycyna ma trzy wartosci pK: 3,55; 8,10 i 9,75. W widmie w podczerwieni negamycyna lacznie z bromkiem potasu wykazuje pasma absorpcji przy wartosciach: 3430, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 i 720 cm-1. p-Hydroksyazoben- zeno-p'-sulfonian negamycyny wykazuje pasma absorpcji przy wartosciach: 3550, 3400, 3350, 3250, 3200, 3050, 2950, 1730, 1690, 1600, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280—1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 900, 880, 850, 800, 715 i 680 cm"1. Dla tej soli pasmo dla kwasu karboksylowego wystepuje przy wartosci 1730 cm-1. Ester metylowy negamy¬ cyny wykazuje pasma absorpcji w podczerwieni przy wartosciach: 3400, 3200, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445, 1400, 1220, 1140, 1050, 1000, 960, 890 i 720 cm-1. Pasmo grupy estrowej wystepuje przy wartosciach 1740 i 1220 cm-1. Wskazana juz budowe 1573 S negamycyny ustalono na podstawie spektrofoto¬ metrii masowej estru metylowego negamycyny i estru metylowego trójacetylonegamycyny oraz na podstawie budowy produktów hydrolizy. 5 Negamycyna hamuje wzrost mikroorganizmów Gram dodatnich i ujemnych. Podczas badania dzia¬ lania przeciwbakteryjnego metoda nakladania pas¬ ma na agar z zastosowaniem agaru z ekstraktem miesnym i peptonem, zahamowaniu ulegal rozwój 10 nastepujacych mikroorganizmów przy wskazanych stezeniach (pokrywano iloscia z jednego cyklu po¬ dzialowego, inkubowanej hodowli w odzywczym bulionie w ciagu 20 godzin; wartosci w kawiasach oznaczaja stezenie, przy których nastepuje czescio- 15 we zahamowanie rozrostu): Staphylococcus aureus 209 p, 50 jAg/ml; Staphylococcus aureus 193, 12,5 '\igfml (6,12 JAg/ml); Staphylococcus aureus Smith 50 jxg/ml; Sarcina lutea PCI-1001 12,5 ^g/ml (1,56 jAg/ml); Bacillus subtilis NRRL-B558 25 |jig/ml (12,5 20 ng/ml); E.coli K12, 3,12 \igjml (1,56 fig/ml); E.coli NIHJ 12,5 |ig/ml (3,12 \ig/ml); Shigella flexneri 12,5 ng/ml; Salmonella Typhosa 3,12 ^g/ml; Keb- siella pneumoniae PCI 602, 12,5 [Ag/ml (6,25 [Ag/ml); Seratia marscescens 12-,5 [Ag/ml (6,25 ^ig/ml); Pro- 25 teus vulgaris OX19 6,25 \ig/m\; Proteus rettgeri (GN311) 12,5 jAg/ml; Pseudomonas aeruginosa (nr 2) 12,5 jAg/ml; Pseudomonas aeruginosa nr 3,25 jjig/ml (12,5 jjig/ttil); Pseudomonas fluorescens 6,25 jAg/ml (3,12 fJig/ml); Mycobacterium smegmatis 607, 100 30 p,g/ml. Gdy hodowle inkubowana w odzywczym bu- ftonie w ciagu 20 godzin rozcienczono 1000-krotnie i pokryto iloscia z jednego cyklu podzialowego, wówczas zahamowanie wzrostu obserwowano przy polowie opisanego powyzej stezenia. W agarze z 35 dodatkiem 0,5°/o peptonu efekt hamujacy jest sil¬ niejszy, niz na agarze odzywczym i zahamowaniu ulega rozwój nastepujacych mikroorganizmów przy wskazanych stezeniach (wartosci w nawiasach oznaczaja stezenia, przy których nastepuje czescio- 40 we zahamowanie wzrostu): S.aureus 209 p 1,56 p,g/ml; S.lutea PCI 1001 5,0 jAg/ml (2,5 jAg/ml); B.sub- tilis NNRL-B558 12,5 n-g/ml; E.coli K12 1,56 |ig/ml; E.coli NIHJ 1,56 [Ag/ml; S.flexneri 3,12 jAg/ml: K.pneumoniae PCI 602 6,25 ^Ag/ml (3,12 |Jig/ml); 45 S.typhosa < 0,78 ^g/ml; Pr.rettgeri CN311 1,56 [Ag/ml; S.marscenscens 12,5 |xg/ml (3,12 ng/ml); Ps.aeruginosa nr 3 6,25 jAg/ml; Ps.aeruginosa nr 46 3,12 fig/ml (1,56 [Ag/ml); M.smegmatis 607 50 ^g/ml.Zahamowaniu nie ulegaja albicans przy stezeniu 50 100 [Ag/ml. Surowica nie zmniejsza hamujacego dzialania negamycyny i tak na przyklad 3,12 [Ag/ml negamycyny zahamowuje rozwój E.coli we wszy¬ stkich srodowiskach^ zawierajacych 0,5, 10,20 i 40°/o surowicy. Negamycyna wykazuje silniejsze dziala- 55 nie przeciwbakteryjne w warunkach alkalicznych na przyklad stezenia, przy których nastepuje za¬ hamowanie rozwoju E.coli w wodzie, zawierajacej 0,5% peptonu przy róznych wartosciach pH, wy¬ nosza: pH=5,0 12,5 n-g/ml (3,12 [Ag/ml); pH=6 12,5 M [ig/ml (3,12 [Ag/ml); pH=7,0 3,12 [Ag/ml (1,56 \ig/m\); pH=8,0 1,56 [Ag/ml (0,78 M (0,78 jAg/ml). W metodzie cylindrowej z zastoso¬ waniem agaru, zawierajacego 0,5°/o peptonu i E.co¬ li KI2, negamycyna w stezeniu 25 jAg/ml wykazuje na- 65 stepujace srednice zahamowania przy wskazanych \80 573 10 wartosciach pH: pH= 6,0 16 mm, pH=7,0 20 mm, pH= 8,0 21 mm.Negamycyna odznacza sie mala toksycznoscia i dozylne wstrzykniecie 400 mg/kg powoduje smierc myszy. Dzialania toksycznego negamycyny nie ob¬ serwuje sie przy dootrzewnowym wstrzykiwaniu myszom dawki 200 mg/kg w ciagu 30 dni. Nie wy¬ kazuje ona równiez toksycznosci po uplywie czasu.Domiesniowe wstrzykniecie szczurom dawki 50 mg/kg wywoluje duze stezenie we krwi, az do 100 ^ig/ml w ciagu 1 godziny po podaniu negamy¬ cyny, przy czym w ciagu 24 godzin 80% leku, prze- • chodzi do moczu; na przyklad po uplywie 1—2 go¬ dzin od chwili wstrzykniecia, stezenie wynosi 4480 \ig/m\.Wyniki te sugeruja równiez dodatnie dzialanie in vivo. W rzeczywistosci, potwierdzono skuteczne dzialanie negamycyny przeciw zarazkom Pseudo- monas aeruginosa nr 12, Klebsiella pneumoniae S-1802, Salmonella typhosa 63 i Staphylococcus aureus Smith S-424 u myszy. Wskaznik CD50 prze¬ ciw tym zarazkom wynosi odpowiednio 4,4; 5,0; 2,5 i 12,5 mg/kg, jesli zaraza sie dootrzewnowo 10 MLD, a negamycyne wstrzykuje sie podskórnie bezposrednio i po uplywie 6 godzin po zarazeniu.Jak to opisano powyzej, negamycyna jest anty¬ biotykiem o malej toksycznosci i dziala hamujaco na bakterie Gram dodatnie i ujemne, a w tym Pseudomonas. Antybiotyk ten latwo odróznia sie od innych na podstawie oznaczen analitycznych, widma w podczerwieni, wlasnosci amfoterycznych, zachowania przy elektroforezie pod wysokim na¬ pieciem i budowy. Negamycyna jest zatem scisle okreslonym nowym antybiotykiem.Jak to wskazuje budowa negamycyny, w wyniku jej hydrolizy powstaje kwas 1-metylohydrazyno- octowy, który, jak to stwierdzono, przechodzi w N,N'-dwumetylohydrazyne. Stwierdzono, ze kwas 1-metylohydrazynooctowy dziala* hamujaco na tran- saminaze glutaminowo-pirogronowa i dziala tok¬ sycznie na watrobe. Negamycyna nie wykazuje ta¬ kiej toksycznosci, zwazywszy jednak na mozliwcsc hydrolizy, negamycyne powinno sie podawac na krótki okres czasu do zwalczenia wrazliwych mi¬ kroorganizmów. Negamycyne mozna równiez sto¬ sowac domiejscowo do leczenia infekcji powierzch¬ niowych takich, jak infekcje skóry i blony sluzo¬ wej. Ponadto, negamycyna znajduje zastosowanie do syntezy jej analogów.Ponizej podane przyklady, wyjasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. 125 ml pozywki, zawierajacej 2% glikozy, 2% skrobii, 2°/o maczki fasoli sojowej, 0,5% 10 15 25 ekstraktu drozdzowego, 0,25% NaCl, 0,35% CaC03, 0,0005% CuS04 . 5H20, 0,0005% MnCl2 . 7H20 i 0,0005% ZnS04 . 7H20 umieszcza sie w butelce do wytrzasania o pojemnosci 500 ml. Wartosc pH doprowadza sie do 7,0 i zawartosc sterylizuje sie przez ogrzewanie w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. Do tej pozywki wszczepia sie aseptycznie 2,5 ml wytrzasanego w ciagu 2 dni bulionu szczepu nr M890-C2. Pozywka dla hodowli zaszczepiajacej zawiera 1% glikozy, 1% skrobi, 0,75% ekstraktu miesnego, 0,75% peptonu, 0,3% NaCl, 0,1 MgS04 . . 7H20, 0,0007% CuS04 . 5H20, 0,0001% FeS04 • . 7H20, 0,0008% MnCl2 . 7H20 i 0,0002% ZnS04 • • 7H20. Fermentacje prowadzi sie w ciagu 5 dni, wytrzasajac z szybkoscia 130 przesuniec na minute i utrzymujac temperature 27°C. Ten bulion hodowli odwirowuje sie w celu oddzielenia grzybni i z 60 butelek otrzymuje sie 6000 ml przesaczu, który za¬ wiera 35 ^g/ml negamycyny. Przesacz przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 30 mm, wypelniona 400 ml Amberlitu IRC-50, zawierajaca 70% jonów sodowych. Po przemyciu woda, negamycyne wy¬ mywa sie 20%-owym roztworem amoniaku w wo¬ dzie. 600 ml aktywnej frakcji zateza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem i otrzymuje sie 144 ml zatezo- nego roztworu o pH=9,4, zawierajacego 800 fig/ml negamycyny.Zatezony roztwór przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 16 mm wypelniona 60 ml zywicy Dowex 1X2 w postaci jonów OH. Po przemyciu 200 ml wody, negamycyne wymywa sie roztworem 0,5 n kwasu solnego. Roztwór zobojetnia sie Amberlitem IR-45 w postaci jonów OH i aktywna frakcje suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 300 mg surowego proszku chlorowodorku negamy¬ cyny (21% czystego zwiazku).Przyklad II. 300 mg surowego proszku chloro¬ wodorku negamycyny, uzyskanego, jak w przy¬ kladzie I, rozpuszcza sie w 10 ml wody. Roztwór przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 16 mm, wypelniona 60 ml Amberlitu CG-50 w postaci jo¬ nów amonowych, a nastepnie przepuszcza sie wode destylowana. Zbiera sie eluaty po 10 ml. Aktywny skladnik znajduje sie we frakcjach 57—96. Z frak¬ cji 57—74 otrzymuje sie 25 mg lekko zóltego prosz¬ ku negamycyny (68 [xg/mg czystego zwiazku). Z frakcja 75—85 otrzymuje sie 20 mg bezbarwnego proszku czystego negamycyny, a z frakcji 86—96 otrzymuje sie 19 mg negamycyny (910 ^g/mg) czy¬ stego zwiazku.Przyklad III. Pod katem wydzielania nega¬ mycyny zbadano róznego rodzaju jonowymienne zy¬ wice. 200 ml przesaczu bulionu, uzyskanego, jak Wyniki przedstawiono w tabelce.Zywica jonowymienna Amberlit IRC-50 Amberlit IRC-50 Amberlit IRC-50 Amberlit IRC-50 Amberlit IR-120 Lewatit SP-100 Postac jony H 70% jonów Na 70% jonów Na 70% jonów NH4 jdny H jokiy H Wymywanie 2% NH4OH 2% NH4OH 1 n HCl 2% NH4OH 2% NH4OH 2% NH4OH Uzysk negamycyny 45*% 52% 29% 55% 45%| 50%;11 80 573 12 w przykladzie I, przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 10 ml wypelniona 10 ml zywicy. Kolumne przemywa sie 50 ml wody i skladnik wymywa sie jak podano ponizej. W kazdym z doswiadczen nie stwierdzono obecnosci aktywnego skladnika w wy¬ cieku z kolumny i w wodzie, stosowanej do prze¬ mywania kolumny.Przyklad IV. 10 litrów pozywki, zawierajacej te same skladniki, jak w przykladzie I, umieszcza sie w szklanej kadzi fermentacyjnej o pojemnosci 20 litrów. Pozywke sterylizuje sie i wszczepia sie aseptycznie 500 ml wytrzasnietego bulionu hodow¬ lanego szczepu nr M890-C2. Fermentacje przepro¬ wadza sie w temperaturze 27°C w ciagu 90 godzin, utrzymujac przeplyw powietrza i mieszanie. Taki bulion hodowlany o wartosci p'H=7,4 odwirowuje sie w celu oddzielenia grzybni i otrzymuje sie 6460 ml przesaczu o stezeniu 41 jig/ml. Przesacz przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 30 mm, wypelniona 400 ml Amberlitu IRC-50, zawieraja¬ cego 70% jonów Na. Kolumne przemywa sie 3000 ml wody i negamycyne wymywa sie 2%-owym roz¬ tworem amoniaku. 400 ml aktywnego eluatu suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje sie 685 g brazowego proszku surowej negamycyny (150 [Ag/ml czystego zwiazku).Przyklad V. 102 mg negamycyny rozpuszcza sie w 8 ml wody, zawierajacej 15% monometylo- wego eteru glikolu etylenowego. Do roztworu tego wprowadza sie 106 mg kwasu p-hydroksyazoben- zeno-p'-sulfonowego. W celu rozpuszczenia, miesza¬ nine ogrzewa sie do temperatury 50°C i nastepnie dodaje sie 0,5 ml 1 n kwasu solnego, az do uzys¬ kania pH=3. Roztwór pozostawia sie w lodówce i uzyskuje sie 49 mg zólte-pomaranczowych kry¬ sztalów, które krystalizuje sie z mieszaniny 4,5 ml wody i 0,5 ml metanolu. Otrzymuje sie 28 mg zólto-pomaranczowych krysztalów o temperaturze topnienia 180—182°C (rozklad). Krysztaly te wy¬ kazuja w 34%-ach dzialanie wolnej negamycyny przeciwko E-coli K12. Wyniki analizy i wartosci obliczone dla C9H20N4O4(C12H10N2O4S)2 . 2HzO; C — 47,13; H — 5,27; N — 13,33; O — 26,64; S — 7,63; wartosci oznaczone: C — 47,09; H — 5,16; N — 13,20; O — 25,53 i S — 8,01.Przyklad VI. 130 litrów pozywki, zawieraja¬ cej 3% glikozy, 1% skrobi, 2% maczki fasoli sojo¬ wej, 0,5% sproszkowanych drozdzy, 0,35% CaC03, 0,0005% CuS04 . 5H20, 0,0005% MnCl2 • 7H20 i 0,0005% ZnS04 • 7H20 umieszcza sie w 200 litro¬ wej kadzi fermentacyjnej ze stali kwasoodpornej.Pozywke sterylizuje sie przez ogrzewanie w tem¬ peraturze 120°C w ciagu 30 minut i wszczepia sie aseptycznie 1,2 litra bulionu hodowlanego szczepu nr M890-C2. Fermentacje prowadzi sie w tempe¬ raturze 27°C w ciagu 113 godzin, utrzymujac mie¬ szanie z szybkoscia 200 obrotów na minute i prze¬ puszczajac powietrze z szybkoscia 25 litrów na mi¬ nute. Do 110 litrów bulionu hodowlanego (pH=7,4 i stezeniu 63 ng/ml dodaje sie 1 litr 6 n kwasu solnego, aby uzyskac pH=4,9 i bulion przesacza sie przy uzyciu 8 kg ziemi okrzemkowej. Otrzymuje sie 10 15 20 25 30 117 litrów przesaczu, lacznie z woda, stosowana do przemycia filtru. Przesacz przepuszcza sie przez kolumne, zawierajaca 6,5 litra Amberlitu IRC-50, zawierajacego 70% jonów NH4.Po przemyciu woda, negamycyne wymywa sie- 0,5 n roztworem amonia¬ ku. 3 litry aktywnego eluatu zateza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem do 495 ml o stezeniu 3520 jig/ml.Zatezony roztwór przepuszcza sie przez kolumne, wypelniona zywica Dowex 1X2 w formie jonów OH. Kolumne przemywa sie 350 ml wody i nega¬ mycyne wymywa sie 0,5 n roztworem kwasu sol¬ nego. 180 ml aktywnego eluatu zobojetnia sie 3 n roztworem amoniaku. Po wysuszeniu otrzymuje sie 5,5 g zólto-brazowego proszku surowej negamycy¬ ny 294 p.g/mg czystego zwiazku. Calkowita wydaj¬ nosc wynosi 23,4%.Przyklad VII. 3,4 g proszku o zawartosci 29,4% czystego zwiazku uzyskanego, jak w przy¬ kladzie VI, rozpuszcza sie w 22 ml wody i ustala sie pH na 8,8. Roztwór ten wprowadza sie do ko¬ lumny o srednicy 26 mm, wypelnionej 250 ml Amberlitu CG-50 w postaci jonów NHj. Kolumne przemywa sie 500 ml wody, przepuszcza sie 0,1%-owy roztwór NH4OH i zbiera sie eluaty po 20 ml. Negamycyna znajduje sie we frakcjach 69—81. Z frakcji 69—73 otrzymuje sie 233 mg jas- no-zóltawego proszku negamycyny o zawartosci 90% czystego zwiazku. Z frakcji 74—77 otrzymuje sie 383 mg czystej negamycyny. Z frakcji 78-^81 otrzymuje sie 395 mg czystej negamycyny. PL PL

Claims (6)

1. Zastrzezenia patentowe 35 40 45 50 55 60 amycyny o wzorze CH2/NH2/—CH/OH/—CH2—CH/ 2/—CH2—CO—NH—N/CHj/—CH2—COOH, zna- 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku ne- gamyc; NH2/—i mienny tym, ze hoduje sie szczep Streptomyces purpeofuscus ATCC 21470 w wodnym roztworze weglowodanów zawierajacym zasobny w azot sro¬ dek odzywczy, w warunkach aerobowych, wyod¬ rebnia wytworzona negamycyne z wodnego roztwo¬ ru i ewentualnie dalej oczyszcza.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze negamycyne wyodrebnia sie z jej wodnego roztwo¬ ru przez adsorpcje na zywicy kationitowej, a» na¬ stepnie wymywa z zywicy.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze negamycyne wyodrebnia sie z jej wodnego roz¬ tworu przez adsorpcje na weglu, a nastepnie wy¬ mywa z wegla.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze negamycyne wyodrebnia sie z jej wodnego r:ztwo- ru przez adsorpcje na silnie zasadowej zywicy amo¬ nitowej, a nastepnie wymywa z zywicy.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze negamycyne wyodrebnia sie z wodnego roztworu przez wytracanie nierozpuszczalnym w wodzie kwa¬ sem, a nastepnie wydziela z tego kwasu.

6. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze do wymywania zaadsorbowanego antybiotyku sto¬ suje sie amoniak.80 573 FIG. I 2.5A3 4 5 8 9 10 II I2I3I4I5 n )\ ^v / / r\ f L \ \ I li / / L n ufi 1 1 L /m/ _l 1_ ^_j "HM-i 4000 3000 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650 3500 2500 1900 1700 1500 1300 1100 900 70080 573 300 ^*V^J^^fW*" FIG.2 200 I 100 I^^ua/Uv Vv 5.0 4.0 3.0 2.0 Olsztynskie Zaklady Graficzne Lz. 2177/VIII (10 0) Cena zl 10 PL PL