PL217085B1 - Koniugat hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu, zastosowanie koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu oraz kompozycja farmaceutyczna koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest koniugat hydroksyalkiloskrobi (HAS) i polipeptydu dalej również jako HAS-polipeptyd, sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi (HAS) i polipeptydu, zastosowanie koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu oraz kompozycja farmaceutyczna koniugatu hydroksyalkiloskrobi i polipeptydu.

Aplikacja polipeptydów, a zwłaszcza enzymów albo cytokin, do układu krążenia w celu uzyskania szczególnego skutku fizjologicznego jest dobrze znanym narzędziem w nowoczesnej medycynie.

Erytropoetyna (EPO) jest hormonem glikoproteinowym koniecznym do dojrzewania prekursorowych komórek czerwonokrwinkowego układu szpiku do erytrocytów. U ludzi dorosłych jest ona wytwarzana w nerkach. EPO ma podstawowe znaczenie przy regulowaniu poziomu czerwonych krwinek w krążeniu. Stany chorobowe odznaczające się niskimi poziomami tlenu w tkankach powodują zwiększoną syntezę EPO, co z kolei pobudza wytwarzanie krwinek czerwonych. Utrata funkcjonowania nerek, jak na przykład w przypadku przewlekłej niewydolności nerek, daje w wyniku typowo obniżoną biosyntezę EPO i jednoczesne zmniejszenie poziomu krwinek czerwonych.

Erytropoetyna jest kwaśnym hormonem glikoproteinowym o wielkości w przybliżeniu 34000 Da. Erytropoetyna ludzka jest polipeptydem zawierającym 166 aminokwasów, który występuje w warunkach naturalnych jako monomer (Lin et al., 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605 B2, EP 411 678 B2). Identyfikacja, klonowanie i ekspresja genów kodujących erytropoetynę są znane na przykład z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4703008. Oczyszczanie rekombinacyjnej erytropoetyny z hodowlanego medium komórek, które sprzyjało wzrostowi komórek ssaczych zawierających plazmidy rekombinacyjnej erytropoetyny, jest znane na przykład z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4667016.

W tej dziedzinie techniki na ogół uważa się, że aktywność biologiczna EPO in vivo zależy głównie od ilości kwasów sialowych związanych z EPO (patrz na przykład EP 428 267 B1). Teoretycznie 14 cząsteczek kwasu sialowego może wiązać się z jedną cząsteczką EPO na terminalnych końcach bocznych łańcuchów węglowodanowych, związanych z N- albo O-centrami glikozylacji. Dla uzyskania silnie sialilowanych preparatów EPO konieczne są bardzo wyrafinowane etapy oczyszczania.

Odnośnie dalszych szczegółowych informacji o erytropoetynie należy odnieść się do Krantza, Erythropoietin, 1991, Blood, 77(3):419-34 (Review) i Cerami, Beyond erythropoiesis: novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7): 33-9 (Review).

Dobrze znany problem ze stosowaniem polipeptydów i enzymów polega na tym, że te proteiny wykazują bardzo często niezadowalającą trwałość, przy czym zwłaszcza erytropoetyna ma stosunkowo krótki czas półtrwania w osoczu (Spivak and Hogans, 1989, Blood, 73, 90, McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718). Oznacza to, że terapeutyczne poziomy w surowicy szybko obniżają się i należy prowadzić powtarzające się podawania dożylne. Co więcej, w pewnych okolicznościach obserwuje się reakcję immunologiczną przeciw peptydom.

Na ogół przyjmuje się, że trwałość polipeptydów można zwiększyć, a reakcję immunologiczną przeciw tym polipeptydom zmniejszyć, gdy polipeptydy są sprzężone z cząsteczkami polimerowymi. Ze zgłoszenia patentowego nr WO 94/28024 wiadomo, że fizjologicznie czynne polipeptydy modyfikowane poliglikolem etylenowym (PEG) wykazują mniejszą immunogenność i antygenowość i krążą w strumieniu krwi znacznie dłużej niż proteiny niesprzężone, to jest wykazują dłuższy okres klirensu.

Przy tym jednak produkty sprzęgania PEG-lek wykazują szereg niedogodności i na przykład nie mają one naturalnej struktury, która może być rozpoznawana przez elementy szlaków rozpadu in vivo. Stąd poza produktami sprzęgania PEG wytworzono i inne produkty sprzęgania i polimeryzaty protein. W literaturze opisano szereg sposobów sieciowania różnych protein i makrocząsteczek, takich jak polimeraza (patrz na przykład Wong, Chemistry of protein conjugation and crosslinking, 1993, CRCS, Inc.).

Hydroksyetyloskrobia (HES) jest pochodną naturalnie występującej amylopektyny i jest rozkładana w organizmie przez α-amylazę. Otrzymywanie produktów sprzęgania HES-proteina jest znane w stanie techniki (patrz na przykład produkty sprzęgania HES-hemoglobina w DE 26 16 086 albo

DE 26 46 854).

Sposoby sprzęgania hemoglobiny z HES są znane z niemieckiego opisu patentowego nr DE 26 56 854. W tych sposobach HES poddaje się reakcji z nadjodanem sodu, co daje w wyniku tworzenie się dwualdehydów, które wiążą się z hemoglobiną. W przeciwieństwie do tego z niemieckiego opisu patentowego nr DE 26 16 086 jest znane sprzęganie hemoglobiny z HES zgodnie ze sposobem

PL 217 085 B1 postępowania, w którym środek sieciujący (na przykład bromocyjan) wiąże się z HES, a następnie hemoglobina wiąże się z produktem pośrednim.

HES jest podstawioną pochodną polimeru węglowodanowego, amylopektyny, który występuje w skrobi zbożowej w ilości do 95% wagowo. HES wykazuje korzystne właściwości biologiczne i wykorzystuje się ją jako środek do objętościowego zastępowania krwi oraz w terapii hemodylucyjnej w klinikach (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278, i Weidler et al., 1991, Arznem.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498).

Amylopektyna składa się z ugrupowań glukozowych, w których w łańcuchu głównym są obecne wiązania a-1,4-glikozydowe, a w miejscach rozgałęzienia znajdują się wiązania a-1,6-glikozydowe. Właściwości fizyczne tej cząsteczki są wyznaczone głównie przez rodzaj wiązań glikozydowych. Dzięki skrzyżowanemu wiązaniu a-1,4-glikozydowemu wytwarzają się z kolei struktury helisowe z około sześcioma monomerami glukozowymi.

Właściwości fizykochemiczne oraz biologiczne polimeru można modyfikować drogą podstawiania. Wprowadzenie grupy hydroksyetylowej można osiągnąć poprzez hydroksyetylowanie alkaliczne, a przez przystosowanie warunków reakcyjnych możliwe jest wykorzystywanie różnej reaktywności odnośnej grupy hydroksylowej w niepodstawionym monomerze glukozowym względem hydroksyetylowania. Dzięki temu specjalista może wpływać na wzorzec podstawiania w ograniczonym stopniu.

Stąd HES charakteryzuje się głównie rozkładem ciężarów cząsteczkowych i stopniem podstawienia. Istnieją dwie możliwości opisywania stopnia podstawienia, a mianowicie:

1. Stopień podstawienia można opisywać względem części podstawionych monomerów glukozy względem wszystkich ugrupowań glukozowych (DS).

2. Stopień podstawienia można opisywać także jako „podstawienie molowe” (MS), w którym opisuje się liczbę grup hydroksyetylowych przypadających na ugrupowanie glukozowe.

Roztwory HES występują jako kompozycje wielodyspersyjne, w których każda cząsteczka różni się od drugiej pod względem stopnia polimeryzacji, liczby i wzorców miejsc rozgałęzienia i wzorca podstawienia. HES jest zatem mieszaniną związków o różnych ciężarach cząsteczkowych. Stąd roztwór szczególnej HES określa się średnim ciężarem cząsteczkowym za pomocą środka statystycznego. W tym kontekście Mn oblicza się jako średnią arytmetyczną w zależności od liczby cząsteczek. Alternatywnie Mw, średnia wagowa, przedstawia jednostkę, która zależy od masy HES.

Produkty sprzężenia HES-lek, znane z techniki, wykazują niedogodność polegającą na tym, że HES nie jest sprzężona z lekiem specyficznie pod względem miejsca, skutkiem czego sprzężenie daje w wyniku bardzo niejednorodny produkt, który ma wiele składników, które mogą być nieczynne na skutek rozkładu 3-wymiarowej struktury w etapie sprzęgania.

Podsumowując wciąż istnieje zapotrzebowanie na dalsze ulepszone polipeptydy o większej trwałości i ewentualnie lepszej aktywności biologicznej. Stosuje się to zwłaszcza do erytropoetyny, której izopostacie o dużych ilościach kwasów sialowych, a zatem wysokiej aktywności, muszą być oczyszczane od izopostaci o małych ilościach kwasów sialowych (patrz EP 428 267 B1). Stąd byłoby wysoce korzystne, gdyby były dostępne sposoby wytwarzania, które dawałyby wysoko aktywne polipeptydy bez konieczności znacznego oczyszczania. Niestety, wytwarzanie polipeptydów w bakteriach albo komórkach owadów jest często utrudnione, ponieważ polipeptydy często nie tworzą się we właściwie pofałdowanej, natywnej konformacji i występuje brak właściwego glikozylowania.

Stąd celem niniejszego wynalazku jest opracowanie pochodnych polipeptydów o wysokiej aktywności biologicznej in vivo, które można wytwarzać łatwo i przy niższych kosztach. Ponadto dalszym celem niniejszego wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania pochodnych polipeptydów, który jest łatwy do realizacji i daje produkty o wysokiej aktywności biologicznej. Dalszym celem niniejszego wynalazku jest opracowanie kompozycji farmaceutycznych zawierających pochodne polipeptydów o wysokiej aktywności biologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest koniugat hydroksyalkiloskrobi (HAS) i polipeptydu dalej jako HAS-polipeptyd, charakteryzujący się tym, że zawiera jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym polipeptyd zawiera jeden lub więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu poprzez N- lub O-związaną glikozylację lub N- i O-związaną glikozylację i każda HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią tych węglowodanowych łańcuchów bocznych, przy czym HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez cząsteczkę linkera i

HAS i cząsteczka linkera są połączone poprzez koniec redukujący HAS,

PL 217 085 B1 przy czym HAS jest modyfikowana przez cząsteczkę linkera w taki sposób, że zawiera wolną hydrazydową, hydroksyloaminową, tiolową albo semikarbazydową grupę funkcyjną.

Korzystnie polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.

Korzystnie polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z erytropoetyny (EPO), interleukin, zwłaszcza interleukiny-2, IFN-β, IFN-alfa, CSF, interleukiny-6 i przeciwciał terapeutycznych.

Korzystnie węglowodanowe łańcuchy boczne zostały przyłączone do polipeptydu w czasie jego wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzi, owadów albo drożdży.

Korzystnie HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią węglowodanowych łańcuchów bocznych i które jest utlenione.

Korzystnie HAS jest sprzężona z resztą galaktozową węglowodanowych łańcuchów bocznych.

Korzystnie koniugat zawiera 1-12, korzystnie 1-6 albo 1-3, a zwłaszcza 1-4 cząsteczek HAS na cząsteczkę polipeptydu.

Korzystnie HAS jest wybrana z grupy składającej się z hydroksyetyloskrobi, hydroksypropyloskrobi i hydroksybutyloskrobi.

Korzystnie HAS jest hydroksyetyloskrobią (HES).

Korzystnie HES ma masę cząsteczkową od 1 do 300 kDa, korzystnie od 5 do 100 kDa.

Korzystnie HES wykazuje molowy stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek podstawienia C2:C6 w zakresie 2-20 w stosunku do grup hydroksyetylowych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi (HAS) i polipeptydu dalej jako HAS-polipeptyd, polegający na tym, że obejmuje etapy w których:

a) dostarcza się polipeptyd, wspomniany polipeptyd zawiera jeden lub więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu poprzez N- lub O-związaną glikozylację lub N- i O-związaną glikozylację,

b) dostarcza się zmodyfikowaną HAS, przy czym HAS jest modyfikowany na swoim końcu redukującym za pomocą cząsteczki linkera, w taki sposób, iż obejmuje wolną hydrazydową, hydroksyloaminową, tiolową albo semikarbazydową grupę funkcyjną i

c) poddaje się reakcji polipeptyd z etapu a) z HAS z etapu b), wytwarzając HAS-polipeptyd zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym każda HAS jest sprzężona poprzez cząsteczkę linkera z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią węglowodanowych łańcuchów bocznych.

Korzystnie stosuje się polipeptyd pochodzenia ludzkiego.

Korzystnie polipeptyd wybiera się z grupy składającej się z erytropoetyny (EPO), interleukin, zwłaszcza interleukiny-2, IFN-β, IFN-alfa, CSF, interleukiny-6 i przeciwciał terapeutycznych.

Korzystnie polipeptyd wytwarza się na drodze rekombinacji.

Korzystniej węglowodanowe łańcuchy boczne zostały przyłączone do polipeptydu w czasie jego wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzi, owadów albo drożdży.

Korzystnie w etapie a) polipeptyd modyfikuje się drogą utleniania co najmniej jednego ugrupowania węglowodanowego, korzystnie co najmniej jednej końcowej jednostki cukrowej, korzystniej galaktozy, jednego albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych polipeptydu.

Korzystniej końcową jednostkę cukrową utlenia się po częściowym albo całkowitym (enzymatycznym i/lub chemicznym) usunięciu końcowego kwasu sialowego.

Korzystnie w etapie c) zmodyfikowaną HAS sprzęga się z utlenioną końcową jednostką cukrową.

Korzystnie etap c) prowadzi się w medium reakcyjnym zawierającym co najmniej 10% wagowych H2O.

Korzystnie HAS jest hydroksyetyloskrobią (HES), hydroksypropyloskrobią albo hydroksybutyloskrobią, korzystnie hydroksyetyloskrobią (HES).

Korzystniej ma właściwości jak określono w którymkolwiek z zastrz. 10 albo 11.

Przedmiotem wynalazku jest także HAS-polipeptyd określony powyżej, do stosowania w sposobie leczenia organizmu ludzkiego lub zwierzęcego.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca HAS-polipeptyd określony powyżej.

Korzystnie kompozycja dodatkowo zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Zgodnie z jednym z aspektów niniejszego wynalazku ten problem rozwiązuje się za pomocą produktu sprzężenia (HAS-EPO) hydroksyalkiloskrobia (HAS)-erytropoietyna (EPO), zawierającego

PL 217 085 B1 jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym każda HAS jest sprzężona z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

Produkt HAS-EPO według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że wykazuje on większą trwałość biologiczną w porównaniu z erytropoetyną przed sprzęganiem. Poza tym wykazuje on wyższą aktywność biologiczną niż standardowa EPO według BRP i jest to spowodowane głównie faktem, że HAS-EPO jest w mniejszym stopniu albo nawet w ogóle nierozpoznawany przez układy usuwania w wątrobie i nerkach, a zatem utrzymuje się w układzie krążenia w ciągu dłuższego okresu czasu. Ponadto, ponieważ HAS jest przyłączona specyficznie pod względem miejsca, to ryzyko zniszczenia biologicznej aktywności EPO in vivo przez sprzężenie HAS z EPO jest minimalne.

HAS-EPO według wynalazku zawiera głównie dwa składniki, a mianowicie polipeptyd erytropoetynę (EPO) i związaną z nią hydroksyalkiloskrobię (HAS).

EPO może pochodzić z każdego źródła ludzkiego (patrz na przykład Inoue, Wada, Takeuchi, 1994, An improved method for the purification of human erythropoietin with high in vivo activity from the urine of anemic patients, Biol Pharm Bull. 17(2), 180-4, Miyake, Kung, Goldwasser, 1977, Purification of human erythropoietin., J Biol Chem., 252(15), 5558-64) albo ssaka i można ją otrzymać drogą oczyszczania z naturalnie występujących źródeł, takich jak ludzka nerka, wątroby ludzkiego embrionu albo zwierzęcej, korzystnie małpiej nerki. Ponadto wyrażenie „erytropoetyna” albo „EPO” obejmuje także odmianę EPO, w której jeden albo więcej aminokwasów (na przykład 1 do 25, korzystnie 1 do 10, jeszcze korzystniej 1 do 5, a zwłaszcza 1 albo 2) można wymienić na inny aminokwas i która wykazuje aktywność erytropoetyczną (patrz na przykład EP 640 619 B1). Pomiar aktywności erytropoetycznej jest opisany w technice (co do pomiaru aktywności in vivo patrz na przykład Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ff, Kitamura et al., 1989, J. Cell Phys., 140, 323-334, co do pomiaru aktywności EPO in vivo patrz Ph. Eur. 2001, 911-917, Ph. Eur. 2000, 1316 Erythropoietini solutio concentrata, 780-785, European Pharmacopoeia (1996/2000), European Pharmacopoeia, 1996, Erythropoietin concentrated solution, Pharmaeuropa, 8, 371-377, Fibi, Hermentin, Pauly, Lauffer, Zettlmeissl., 1995, N- and O-glycosylation muteins of recombinant human erythropoietin secreted from BHK-21 cells, Blood, 85(5), 1229-36, (EPO and modified EPO forms were injected into female NMRI mice (equal amounts of protein 50 ng/mouse) at day 1, 2 and 3 blood samples were taken at day 4 and reticulocytes were determined)). Dalsze publikacje, w których próby pomiaru aktywności EPO, obejmują Barbone, Aparicio, Anderson, Natarajan, Ritchie, 1994, Reticulocytes measurements as a bioassay for erythropoietin, J. Pharm. Biomed. Anal., 12(4), 515-22, Bowen, Culligan, Beguin, Kendall, Villis, 1994, Estimation of effective and total erythropoiesis in myelodysplasia using serum transferrin receptor and erythropoietin concentrations, with automated reticulocyte parameters, Leukemi, 8(1), 151-5, Delorme, Lorenzini, Giffin, Martin, Jacobsen, Boone, Ellion, 1992, Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin, Biochemistry, 31(41), 9871-6; Higuchi, Oheda, Kuboniva, Tomonoh, Shimonaka, Ochi, 1992; Role of sugar chains in the expression of the biological activity of human erythropoietin, J. Biol, Chem., 267(11), 7703-9; Yama-guchi, Akai, Kawanishi, Ueda, Masuda, Sasaki, 1991, Effects of site-directed removal of N-glycosylation sites in human erythropoietin on its production and biological properties, J. Biol. Chem., 266(30), 20434-9; Takeuchi, Inoue, Strickland, Kubota, Wada, Shimizu, Hoshi, Kozutsumi, Takasaki, Kobata, 1989, Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(20), 7819-22; Kurtz, Eckhardt, 1989, Assay methods for erythropoietin, Nephron., 51(1), 11-4 (German); Zucali, Sulkowski, 1985, Purification of human urinary erythropoietin on controlledpore glass and silicic acid. Exp. Hematol., 13(3), 833-7; Krystal, 1983, Physical and biological characterization of erythroblast enhancing factor (EEF), a late acting erythropoietin stimulator in serum distinct from erythropoietin, Exp. Hematol., 11(1), 18-31.

EPO wytwarza się korzystnie drogą rekombinacji i obejmuje to wytwarzanie w komórkach eukariotycznych i prokariotycznych, korzystnie w komórkach ssaków, owadów, drożdży, bakterii albo w każdym innym rodzaju komórek, które nadają się do rekombinacyjnego wytwarzania EPO. Ponadto EPO może dawać ekspresję u zwierząt transgenicznych (na przykład w płynach ustrojowych, takich jak mleko, krew, itp.), w jajach ptaków transgenicznych, a zwłaszcza drobiu, korzystnie kurcząt, albo w roślinach transgenicznych.

Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydów jest znane w tej dziedzinie i na ogół obejmuje ono transfekcję komórek gospodarza za pomocą odpowiedniego wektora ekspresji, hodowanie komórek gospodarza w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu i oczyszczanie polipeptydu z komórek gospodarza (odnośnie szczegółowych informacji patrz na przykład Krystal, Pankratz, Far6

PL 217 085 B1 ber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1 and EP 668 351 B1).

W korzystnym rozwiązaniu EPO ma sekwencję aminokwasów ludzkiej EPO (patrz EP 148 605 B2).

EPO zawiera jeden albo więcej bocznych łańcuchów węglowodanowych (korzystnie 1-4, a zwłaszcza 4) przyłączonych do EPO drogą N- i ewentualnie O-związanego glikozylowania, co oznacza, że EPO poddaje się glikozylacji. Zwykle, gdy EPO wytwarza się w komórkach eukariotycznych, to polipeptyd po translacji poddaje się glikozylacji. Skutkiem tego węglowodanowe łańcuchy boczne mogą być przyłączone do EPO w czasie biosyntezy w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzkich, komórkach owadów albo drożdży. Struktura i właściwości poddanej glikozylacji EPO zostały obszernie zbadane w tej dziedzinie (patrz EP 428 267 B1, EP 640 619 B1; Rush, Smith, Merry, Rogers, Rohde, Katta, 1995, Microheterogeneity of erythropoietin carbohydrate structure, Anal Chem., 67(8), 1442-52; Takeuchi, Kobata, 1991, Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins, Glycobiology, 1(4), 337-46 (Review)).

HAS jest sprzężona z EPO poprzez cząsteczkę linkera. Natura cząsteczki linkera zależy od sposobu, w jaki HAS jest związana z EPO. Możliwe grupy funkcyjne linkerów są opisane w Tabeli 1 i niżej. Szereg linkerów jest dostępny w handlu (na przykład u Pierce, dostępny u Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Germany). Niektóre odpowiednie linkery są opisane w Tabeli 2. Natura linkera i jego przeznaczenie są opisane szczegółowo niżej w sekcji dotyczącej sposobu wytwarzania HES-EPO.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem HAS sprzęga się z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „ugrupowanie węglowodanowe” odnosi się do hydroksyaldehydów albo hydroksyketonów oraz ich chemicznych modyfikacji (patrz Rompp Chemielexicon, Thieme Verlag Stuttgart, Niemcy, 9 wydanie 1990, tom 9, strony 2281-2285 i cytowana tam literatura). Ponadto odnosi się ono także do pochodnych naturalnie występujących ugrupowań węglowodanowych, takich jak glukoza, galaktoza, mannoza, kwas sialowy, itp. To określenie obejmuje także utlenione chemicznie naturalnie występujące ugrupowania węglowodanowe, w których została otwarta struktura pierścieniowa.

Ugrupowanie węglowodanowe może być związane bezpośrednio z polipeptydowym szkieletem EPO. Ugrupowanie węglowodanowe stanowi korzystnie część węglowodanowego łańcucha bocznego. W takim przypadku pomiędzy ugrupowaniem węglowodanowym, z którym jest związana HAS, i polipeptydowym szkieletem EPO mogą znajdować się dalsze ugrupowania węglowodanowe. Jeszcze korzystniej ugrupowanie węglowodanowe jest terminalnym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu HAS sprzęga się z resztą galaktozową węglowodanowych łańcuchów bocznych, korzystnie z terminalną galaktozową resztą węglowodanowego łańcucha bocznego. Tę resztę galaktozową można udostępnić dla sprzęgania drogą usunięcia terminalnych kwasów sialowych, a następnie utleniania (patrz niżej).

Możliwe jest także, iż HAS sprzęga się z resztą kwasu sialowego węglowodanowych łańcuchów bocznych, korzystnie z terminalną resztą kwasu sialowego węglowodanowego łańcucha bocznego.

Niniejszym ujawniono także, (przy czym jest to przedmiotem zgłoszenia wydzielonego) iż HAS można sprzęgać z EPO poprzez tioeter. Atom S może pochodzić z każdej grupy SH przyłączonej do EPO, występującej zarówno naturalnie, jak i nienaturalnie.

Atom S może także pochodzić z grupy SH, która została wprowadzona w utlenionym węglowodanowym ugrupowaniu HES, korzystnie utlenionym węglowodanowym ugrupowaniu, które jest częścią węglowodanowego łańcucha bocznego EPO (patrz niżej).

Atom S w tioeterze może pochodzić z naturalnie występującej cysteiny albo cysteiny dodanej. EPO może mieć sekwencję aminokwasową ludzkiej EPO, a naturalnie występujące cysteiny są cysteiną 29 i ewentualnie 33. HAS może być sprzężone z cysteiną 29, a cysteinę 33 można zastąpić innym aminokwasem. Można także HAS sprzęgać z cysteiną 33, a cysteinę 29 zastąpić innym aminokwasem.

Przy czym określenie „cysteiny dodane” oznacza, iż polipeptydy, a zwłaszcza EPO, zawierają resztę cysteinową, która nie występuje w polipeptydzie typu naturalnego. Zatem cysteina może być dodatkowym aminokwasem dodanym na N- albo C-terminalnym końcu EPO. Cysteina dodana może

PL 217 085 B1 być dodawana drogą zastępowania cysteiną naturalnie występującego aminokwasu, przy czym odpowiednie sposoby są znane w tej dziedzinie (patrz wyżej). Zauważono, iż EPO powinna być zwłaszcza EPO ludzką, a zastąpiona reszta aminokwasowa jest seryną 126.

Drugim składnikiem produktu HAS-EPO według wynalazku jest hydroksyalkiloskrobia (HAS).

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „hydroksyalkiloskrobia” stosuje się do pokazania pochodnych skrobi, które zostały podstawione grupami hydroksyalkilowymi. W tym kontekście grupa alkilowa może być podstawiona. Hydroksyalkil zawiera korzystnie 2-10 atomów węgla, a zwłaszcza 2-4 atomy węgla. „Hydroksyalkiloskrobia” obejmuje zatem korzystnie hydroksyetyloskrobię, hydroksypropyloskrobię i hydroksybutyloskrobię, przy czym korzystna jest hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia.

Grupa (grupy) hydroksyalkilowa HAS zawiera co najmniej jedną grupę OH.

Wyrażenie „hydroksyalkiloskrobia” obejmuje także pochodne, w których grupa alkilowa jest jedno- albo wielopodstawiona. W tym kontekście grupa alkilowa jest podstawiona korzystnie chlorowcem, a zwłaszcza fluorem, albo grupą arylową, pod warunkiem, że HAS zachowuje rozpuszczalność w wodzie. Poza tym terminalną grupę hydroksylową hydroksyalkilu można estryfikować albo eteryfikować. Ponadto grupa alkilowa hydroksyalkiloskrobi może być liniowa albo rozgałęziona.

Ponadto, zamiast alkilu, stosować można także liniowe albo rozgałęzione, podstawione albo niepodstawione grupy alkenowe.

We wszystkich rozwiązaniach niniejszego wynalazku najkorzystniejsza jest hydroksyetyloskrobia (HES).

W kontekście niniejszego wynalazku hydroksyetyloskrobia może mieć średni ciężar cząsteczkowy (średni wagowo) 1-300 kDa, przy czym korzystniejszy jest średni ciężar cząsteczkowy 5-100 kDa. Hydroksyetyloskrobia może mieć ponadto molowy stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek pomiędzy podstawieniem C2:C6 w granicach 2-20 w stosunku do grup hydroksylowych.

HAS-EPO może zawierać 1-12, korzystnie 1-9, 1-6 albo 1-3, a zwłaszcza 1-4 cząsteczek HAS na cząsteczkę EPO. Liczbę cząsteczek HAS na cząsteczkę EPO można oznaczać drogą ilościowej analizy składu węglowodanowego stosując GC-MS po hydrolizie produktu i otrzymywania pochodnych otrzymanych jednosacharydów (patrz Chaplin i Kennedy (redaktorzy), 1986, Carbohydrate Analysis: a practical approach, IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3), especially Chapter 1, Monosacharides, page 1-36; Chapter 2, Oligosaccharides, page 37-53, Chapter 3, Neutral Polysacharides, page 55-96).

Produkt sprzężenia HAS-EPO według wynalazku może wykazywać w zasadzie tę samą aktywność biologiczną in vitro jak rekombinacyjna naturalna EPO, ponieważ aktywność biologiczna in vitro mierzy tylko powinowactwo wiązania z receptorem EPO. Sposoby oznaczania aktywności biologicznej in vitro są znane w tej dziedzinie (patrz wyżej).

HAS-EPO wykazuje dalej większą aktywność in vivo niż EPO stosowana jako materiał wyjściowy do sprzęgania (EPO niesprzężona). Sposoby oznaczania aktywności biologicznej in vivo są znane w tej dziedzinie (patrz wyżej). Próby oznaczania aktywności EPO in vivo i in vitro są podane w Przykładach 9 i 10.

Produkt sprzężenia HAS-EPO może wykazywać aktywność in vivo od 110 do 500%, korzystnie od 300 do 400%, albo od 110 do 300%, korzystnie od 110 do 200%, jeszcze korzystniej od 110 do 180% albo od 110 do 150%, a zwłaszcza od 110 do 140%, jeżeli aktywność in vivo niesprzężonej EPO przyjmuje się za 100%.

W porównaniu z wysoko sialilowaną EPO z Amgen (patrz EP 428 267 B1) HAS-EPO wykazuje korzystnie co najmniej 50%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%, a zwłaszcza co najmniej 85%, albo co najmniej 95%, co najmniej 150%, co najmniej 200% albo co najmniej 300% aktywności in vivo wysoko sialilowanej EPO, jeżeli aktywność in vivo wysoko sialilowanej EPO przyjmuje się za 100%. Najkorzystniej HAS-EPO wykazuje co najmniej 95% aktywności in vivo wysoko sialilowanej EPO.

Wysoka aktywność biologiczna in vivo produktu sprzężenia HAS-EPO według wynalazku wynika głównie z faktu, że produkt sprzężenia HAS-EPO krąży dłużej niż niesprzężona EPO, ponieważ jest rozpoznawana w mniejszym stopniu przez układy usuwania z wątroby oraz ponieważ klirens z nerek jest mniejszy na skutek wysokiego ciężaru cząsteczkowego. Sposoby oznaczania czasu półtrwania in vivo EPO w układzie krążenia są znane w tej dziedzinie (Sykowski, Lunn, Davis, Feldman, Siekman, 1998, Human erythropoietin dimers with markedly enhanced in vivo activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(3), 1184-8).

PL 217 085 B1

Stąd wielka zaleta niniejszego wynalazku polega na tym, że opracowano produkt HAS-EPO, który można podawać rzadziej niż preparaty EPO dostępne aktualnie w handlu. O ile standardowe preparaty muszą być podawane co najmniej co 3 dni, to produkt sprzężenia HAS-EPO według wynalazku podaje się korzystnie dwa razy w tygodniu, a zwłaszcza jeden raz w tygodniu.

Wszystkie rozwiązania ujawnione niżej w odniesieniu do sposobu według wynalazku wytwarzania produktu HAS-EPO dotyczące właściwości EPO albo HAS stosują się także do produktu sprzężenia HAS-EPO według wynalazku.

Hydroksyalkiloskrobia jest eterową pochodną skrobi. Oprócz wymienionych pochodnych eterowych w kontekście niniejszego wynalazku można stosować także i inne pochodne skrobi i na przykład użyteczne są pochodne, które zawierają zestryfikowane grupy hydroksylowe. Te pochodne mogą być na przykład pochodnymi niepodstawionych kwasów jedno- albo dwukarboksylowych z 2-12 atomami węgla albo ich podstawionymi pochodnymi. Szczególnie użyteczne są pochodne niepodstawionych kwasów jednokarboksylowych z 2-6 atomami węgla, a zwłaszcza kwasu octowego. W tym kontekście korzystna jest acetyloskrobia, butyloskrobia albo propyloskrobia.

Dalej korzystne są pochodne niepodstawionych kwasów dwukarboksylowych z 2-6 atomami węgla.

W przypadku pochodnych kwasów dwukarboksylowych korzystnie jest zestryfikowana także druga grupa karboksylowa kwasu dwukarboksylowego. W kontekście niniejszego wynalazku odpowiednie są ponadto także pochodne jedno-alkilowych estrów kwasów dwukarboksylowych.

W przypadku podstawionych kwasów jedno- i dwukarboksylowych grupy podstawiające mogą być korzystnie takie same jak wspomniano wyżej dla podstawionych reszt alkilowych.

Techniki estryfikacji skrobi są znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry, tom 2, 1998, Whiley-VCH, Wenheim, Nowy Jork, a zwłaszcza rozdział 4.4, Estryfikacja Celulozy (ISBN 3-527-29489-9).

W dalszym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania produktu sprzężenia (HAS-EPO) hydroksyalkiloskrobia (HAS)-erytropoietyna (EPO), obejmujący etapy:

a) dostarczania odpowiedniej EPO, która może reagować ze zmodyfikowaną HAS,

b) dostarczania odpowiedniej zmodyfikowanej HAS, która może reagować z EPO z etapu a) i

c) poddawania reakcji EPO z etapu a) z HAS z etapu b), przez co wytwarza się produkt

HAS-EPO zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym każda HAS jest sprzężona poprzez cząsteczkę linkera z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią węglowodanowych łańcuchów bocznych.

Sposób według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że wytwarza się produkt sprzężenia, który wykazuje wysoką aktywność biologiczną. Ponadto sposób według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że skuteczną pochodną EPO można wytwarzać przy niższych kosztach ponieważ sposób nie obejmuje obszernych i czasochłonnych etapów oczyszczania, dających w wyniku niską wydajność końcową, to jest nie ma konieczności usuwania niedosialilowanych postaci EPO, o których wiadomo, że wykazują niską albo w ogóle nie wykazują aktywności biologicznej in vivo. W szczególności Przykład 20 wykazuje, że produkt HES-EPO wytworzony z małą liczbą etapów modyfikacji wykazuje 3-krotną aktywność w porównaniu ze standardową EPO według BRP.

Zgodnie z powyższym w pierwszym etapie sposobu według wynalazku dostarcza się EPO, która nadaje się do reakcji ze zmodyfikowaną HAS.

Stosowane w niniejszym wynalazku określenie „dostarczanie” należy interpretować w taki sposób, że po odnośnym etapie jest dostępna cząsteczka (w etapie a) EPO, w etapie b) HAS) o pożądanych właściwościach.

W przypadku etapu a) obejmuje to oczyszczanie EPO ze źródeł naturalnych, jak również rekombinacyjne wytwarzanie w komórkach albo organizmach gospodarza oraz, jeżeli jest to konieczne, modyfikację tak otrzymanej EPO.

Co się tyczy EPO jako materiału wyjściowego według niniejszego wynalazku, to to samo stosuje się do erytropoetyny, która stanowi część produktu sprzężenia HAS-EPO według wynalazku. W tym kontekście ujawnione wyżej korzystne rozwiązania stosują się także do sposobu według wynalazku.

Stąd w korzystnym rozwiązaniu EPO ma sekwencję aminokwasową ludzkiej EPO.

EPO wytwarza się korzystnie drogą rekombinacji i obejmuje to wytwarzanie w komórkach eukariotyczych albo prokariotycznych, korzystnie w komórkach ssaków, owadów, drożdży, bakterii albo w każdym innym rodzaju komórki, który nadaje się do rekombinacyjnego wytwarzania EPO. Ponadto EPO może dawać ekspresję u zwierząt transgenicznych (na przykład w płynach ustrojowych, takich

PL 217 085 B1 jak mleko, krew, itp.), w jajach ptaków transgenicznych, a zwłaszcza drobiu, korzystnie kurcząt, albo w roślinach transgenicznych.

Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydu jest znane w tej dziedzinie i na ogół obejmuje ono transfekcję komórek gospodarza za pomocą odpowiedniego wektora ekspresji, hodowlę komórek gospodarza w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu i oczyszczanie polipeptydu z komórek gospodarza (Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1 i EP 668 351 B1.

EPO zawiera jeden albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do EPO drogą N- i ewentualnie O-związanej glikozylacji, co oznacza, że EPO jest poddawana glikozylacji. Gdy EPO wytwarza się w komórkach eukariotycznych, to polipeptyd poddaje się zwykle glikozylacji po translacji. Stąd węglowodanowe łańcuchy boczne mogą być przyłączone do EPO w czasie wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza człowieka, owadów albo drożdży, które mogą być komórkami zwierzęcia transgenicznego (patrz wyżej), albo ekstrahowane ze zwierzęcia albo wciąż znajdujące się w zwierzęciu.

Te węglowodanowe łańcuchy boczne można modyfikować chemicznie albo enzymatycznie po ekspresji w odpowiednich komórkach, na przykład drogą usuwania albo dodawania jednego albo więcej ugrupowań węglowodanowych (patrz na przykład Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt i Schomburg (redaktorzy), GBFMonographs, 12, 231-246, VCH Publishers, Wenheim, New York, Cambridge).

Celem sposobu według wynalazku jest opracowanie HAS-EPO zawierającego jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym HAS jest sprzężona z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe (i). Stąd EPO otrzymana w etapie a) powinna mieć takie właściwości, aby było możliwe sprzężenie poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

(1) Przy czym ujawniono, iż EPO po etapie a) może zawierać co najmniej jedną grupę reaktywną związaną, bezpośrednio albo poprzez cząsteczkę linkera, z grupami siarczkowymi albo ugrupowaniami węglowodanowymi, która może reagować z HES albo modyfikowaną HES, albo (2) co najmniej jedno ugrupowanie węglowodanowe, z którym może sprzęgać się zmodyfikowana HAS i ewentualnie (3) co najmniej jedną wolną grupę SH.

Co się tyczy powyższej możliwości (1), to EPO w etapie a) można otrzymywać korzystnie drogą sprzęgania cząsteczki odpowiedniego linkera z grupą (grupami) SH albo węglowodanowymi ugrupowaniami EPO. Przykład takiej modyfikowanej EPO znajduje się w Przykładzie 4,2.1, przy czym ważne jest upewnienie się, czy dodanie cząsteczki linkera nie uszkadza EPO, co jest znane specjaliście w tej dziedzinie.

Co się tyczy powyższej możliwości (2) w korzystnym rozwiązaniu, to zmodyfikowaną HAS sprzęga się z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

Ugrupowanie węglowodanowe może być związane bezpośrednio ze szkieletem polipeptydowym EPO. Ugrupowanie węglowodanowe stanowi korzystnie część węglowodanowego łańcucha bocznego i w takim przypadku pomiędzy ugrupowaniem węglowodanowym, z którym jest związana HAS, i polipeptydowym szkieletem EPO mogą znajdować się dalsze ugrupowania węglowodanowe. Jeszcze korzystniej ugrupowanie węglowodanowe jest terminalnym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

Stąd w korzystnym rozwiązaniu modyfikowana HAS jest przyłączona (poprzez linker) do łańcuchów węglowodanowych związanych z N- i ewentualnie O-centrami glikozylacji EPO.

Przy tym jednak EPO może zawierać także (a) dalsze ugrupowanie (ugrupowania) węglowodanowe, z którym jest sprzężona zmodyfikowana HAS. W tej dziedzinie są znane techniki przyłączania ugrupowań węglowodanowych do polipeptydów albo enzymatycznie albo drogą inżynierii genetycznej, a następnie ekspresji w odpowiednich komórkach (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glucans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8; Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, and Schomburg eds., GBE-Monographs, 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge).

PL 217 085 B1

W korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku ugrupowanie węglowodanowe utlenia się w celu umożliwienia reakcji ze zmodyfikowaną HAS, przy czym to utlenianie można prowadzić albo chemicznie albo enzymatyczn ie.

Sposoby chemicznego utleniania węglowodanowych ugrupowań polipeptydów są znane w tej dziedzinie i obejmują traktowanie nadjodanem (Chamov et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 1591615922).

Drogą utleniania chemicznego możliwe jest w zasadzie utlenianie każdego ugrupowania węglowodanowego, które jest albo nie jest usytuowane terminalnie. Przy tym jednak wybierając łagodne warunki (1 mM nadjodan, 0°C w przeciwieństwie do warunków ostrych: 10 mM nadjodan, 1 godz. w temperaturze pokojowej) możliwe jest korzystnie utlenianie terminalnego ugrupowania węglowodanowego, na przykład kwasu sialowego albo galaktozy, węglowodanowego łańcucha bocznego.

Alternatywnie ugrupowanie węglowodanowe można utleniać enzymatycznie. Enzymy do utleniania poszczególnych ugrupowań węglowodanowych są znane w tej dziedzinie i na przykład w przypadku galaktozy enzymem jest oksydaza galaktozy.

Jeżeli przewiduje się utlenianie terminalnych ugrupowań galaktozowych, to ewentualnie konieczne będzie usunięcie terminalnych kwasów sialowych (częściowo albo całkowicie), jeżeli EPO została wytworzona w komórkach nadających się do przyłączania kwasów sialowych do łańcuchów węglowodanowych, na przykład w komórkach ssaków albo w komórkach, które zostały zmodyfikowane genetycznie, tak aby nadawać się do przyłączania kwasów sialowych do łańcuchów węglowodanowych. Chemiczne albo enzymatyczne sposoby usuwania kwasów sialowych są znane w tej dziedzinie (Chaplin and Kennedy (redaktorzy), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, a zwłaszcza Chapter 5 Montreuill, Glycoproteins, strony 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).

Przy czym niniejszy wynalazek obejmuje fakt, że ugrupowanie węglowodanowe, do którego ma być przyłączona zmodyfikowana HAS, jest przyłączane do EPO w etapie a). W przypadku, gdy pożądane jest przyłączenie galaktozy, to można to osiągnąć za pomocą galaktozylotransferazy. Te sposoby są znane w tej dziedzinie (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferase-dependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8).

W najkorzystniejszym rozwiązaniu, w etapie a) EPO modyfikuje się drogą utleniania co najmniej jednej terminalnej jednostki cukrowej, korzystnie galaktozy, jednego albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych EPO, a jeżeli jest to konieczne, to korzystnie po częściowym albo całkowitym (enzymatycznym i ewentualnie chemicznym) usunięciu terminalnego kwasu sialowego (patrz wyżej).

Stąd zmodyfikowaną HAS sprzęga się korzystnie z utlenioną terminalną jednostką cukrową łańcucha węglowodanowego, korzystnie galaktozą.

Zmodyfikowaną HAS można sprzęgać poza tym korzystnie z terminalnym kwasem sialowym, który utlenia się korzystnie w etapie a) sposobu według wynalazku.

Jak ujawniono powyżej EPO może zawierać co najmniej jedną wolną grupę SH.

Ta grupa SH może być związana z utlenionym korzystnie ugrupowaniem węglowodanowym, stosując na przykład pochodną hydroksyloaminy, na przykład chlorowodorek 2-(aminooksy)etylomerkaptanu (Bauer L. et al., 1965, J. Org. Chem., 30,949) albo stosując pochodną hydrazydu, na przykład hydrazyd kwasu tioglikolowego (Whitesides et al., 1977, J. Org. Chem., 42, 332). Sposoby sprzęgania tych cząsteczek z utlenionym ugrupowaniem węglowodanowym EPO mogą być analogiczne do sposobów opisanych w Przykładowych protokołach 8 i 9.

Wolna grupa SH może być częścią naturalnie występującej cysteiny albo cysteiny dodanej.

EPO pochodząca z ssaka zawiera kilka cystein, które tworzą normalnie wiązania dwusiarczkowe. Przy tym jednak zastępując co najmniej jedną z cystein innym aminokwasem (na przykład za pomocą środka rekombinacyjnego) możliwe jest otrzymanie EPO, w której co najmniej jedna z naturalnie występujących cystein zawiera wolną grupę SH. Sposoby zastępowania aminokwasów są znane w tej dziedzinie (Elliott, Lorenzini, Chang, Barzilay, Delorme, 1997, Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin, Blood, 89(2), 493-502; Boissel, Lee, Presnell, Cohen, Bunn, 1993, Erythropoietin structure-function relationships. Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J Biol Chem., 268 (21), 15983-93)).

EPO może mieć sekwencję aminokwasową ludzkiej EPO, a naturalnie występujące cysteiny są cysteiną 29 i ewentualnie 33, cysteinę 33 można zastąpić też innym aminokwasem, a w etapie c)

PL 217 085 B1 można zmodyfikowaną HAS sprzęgać z cysteiną 29. Można także cysteinę 29 zastąpić innym aminokwasem, a w etapie c) można zmodyfikowaną HAS sprzęgać z cysteiną 33.

Przy czym przez określenie „cysteiny dodane” rozumie się, że polipeptydy, a zwłaszcza EPO, zawierają resztę cysteinową, która nie występuje w polipeptydzie typu naturalnego. Można to osiągnąć drogą dodawania (na przykład za pomocą środka rekombinacyjnego) reszty cysteinowej albo na końcu N albo C polipeptydu albo drogą zastępowania (na przykład za pomocą środka rekombinacyjnego) naturalnie występującego aminokwasu przez cysteinę. Odpowiednie sposoby są znane specjaliście w tej dziedzinie (patrz wyżej).

Dodana cysteina może być dodana drogą zastąpienia naturalnie występującego aminokwasu cysteiną.

EPO może być ludzką EPO, a zastąpiona reszta aminokwasowa może być seryną 126.

Zmodyfikowaną HAS można w etapie c) sprzęgać z dodaną cysteiną.

W etapie b) sposobu według wynalazku przygotowuje się zmodyfikowaną HAS, która nadaje się do reakcji z EPO z etapu a).

W tym kontekście HAS może być korzystnie modyfikowana na swoim końcu redukującym i ma to tę zaletę, że reakcję chemiczną można łatwo regulować, a specjalista może być pewny, którą grupę HAS modyfikuje się w czasie reakcji. Ponieważ do HAS wprowadza się tylko jedną grupę, to można zapobiegać sieciowaniu pomiędzy różnymi cząsteczkami EPO przez wielofunkcyjne cząsteczki HAS oraz innym reakcjom ubocznym.

Ujawniono, iż zmodyfikowana HAS może nadawać się do reakcji z (1) co najmniej jedną grupą związaną bezpośrednio albo poprzez cząsteczkę linkera z grupami siarczkowymi albo węglowodanowymi ugrupowaniami EPO, (2) co najmniej jednym ugrupowaniem węglowodanowym, które korzystnie utlenia się, albo ewentualnie z (3) co najmniej jedną wolną grupą SH.

Co się tyczy powyższego punktu (1), to modyfikacja HAS będzie zależeć od grupy związanej z EPO. Poniższy mechanizm jest znany w tej dziedzinie, a przykład jest podany w Przykładzie 4, 2.1.

Co się tyczy powyższych punktów (2) i (3) to w tej dziedzinie jest znany szereg sposobów modyfikacji HAS. Podstawowa zasada sprzyjająca realizacji tych sposobów polega na tym, że albo modyfikuje się reaktywną grupę HAS, tak aby nadawała się ona do reakcji z ugrupowaniem węglowodanowym albo grupą SH, albo tak jak według wynalazku cząsteczkę linkera sprzęga się z HAS, która zawiera reaktywną grupę nadającą się do reakcji z ugrupowaniem węglowodanowym albo grupą SH.

W przypadku punktu (2) zmodyfikowana HAS nadaje się do reakcji z utlenionymi ugrupowaniami węglowodanowymi, korzystnie z terminalną resztą cukrową, a zwłaszcza galaktozą, albo terminalnym kwasem sialowym.

Znane jest kilka sposobów modyfikowania HAS, tak że nadaje się ona do reakcji z utlenioną, korzystnie terminalną resztą cukrową. Jak wspomniano wyżej, tę modyfikację można wprowadzać w sposób obszarowo selektywny na redukującym końcu łańcucha HES. W tym przypadku, w pierwszym etapie, grupę aldehydową utlenia się do laktonu. Modyfikacje obejmują, lecz nie tylko, dodawanie do HAS hydrazydowej, aminowej (także hydroksyloaminowej), semikarbazydowej albo tiolowej grupy funkcyjnej, albo bezpośrednio albo poprzez linker. Te techniki są wyjaśnione w dalszych szczegółach w Przykładach 2-4. Mechanizmy jako takie są ponadto znane w tej dziedzinie (patrz na przykład DE 196 28 705 A1; Hpoe et al., 1981, Carbohydrate Res., 91, 39; Fissekis et al., 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, 2, 47; Frie, 1998, diploma thesis, Fachhochszule Hamburg, DE).

Możliwe jest także dodawanie hydrazydowej albo hydroksyloaminowej grupy funkcyjnej. W tym przypadku, drogą korzystnego prowadzenia reakcji w etapie c) sposobu, przy pH 5,5, można zapewnić, aby zmodyfikowana HAS reagowała selektywnie z utlenionym węglowodanowym ugrupowaniem EPO, bez między- albo wewnątrzcząsteczkowego sieciowania EPO, drogą tworzenia iminy lizynowych łańcuchów bocznych z utlenioną resztą cukrową.

W przypadku punktu (3) znane jest także kilka sposobów modyfikowania HAS, tak że nadaje się ona do reakcji z wolną grupą SH. Tę modyfikację wprowadza się korzystnie obszarowo selektywnie na redukującym końcu łańcucha HES. Te sposoby obejmują, lecz nie tylko, dodawanie do HAS imidomaleinowej, dwusiarczkowej albo chlorowcoacetamidowej grupy funkcyjnej. Takie techniki są wyjaśnione w dalszych szczegółach w Przykładach 2-4.

PL 217 085 B1

Dalsze szczegóły co do tych technik można uzyskać u Chamova et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 63; Greenfield et al., 1990, Cancer Research, 50, 6600, oraz z literatury cytowanej w Przykładzie 2, 1.3.

Dalsze możliwe funkcje są zebrane w Tabeli 1 dając systematyczny przegląd możliwych cząsteczek linkerów. Ponadto mechanizmy jako takie są znane w tej dziedzinie.

Szereg cząsteczek linkera, które są użyteczne w kontekście niniejszego wynalazku, jest znany w tej dziedzinie albo jest dostępny w handlu (na przykład z firmy Pierce, dostępny z Perbio Science Deutschland GmbH, Niemcy), a przykłady są podane w Tabeli 2.

W etapie c) sposobu według niniejszego wynalazku EPO z etapu 2) poddaje się reakcji z HAS z etapu b), przez co otrzymuje się produkt HAS-EPO zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym HAS jest sprzężony z EPO poprzez ugrupowanie węglowodanowe albo poprzez tioeter.

W zasadzie szczegółowe sposoby, w jaki sposób poddawać reakcji EPO ze zmodyfikowaną HAS, zależą od indywidualnej modyfikacji EPO i ewentualnie HAS i są one znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Rose, 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 30, O'Shannessay and Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 191, 1; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 63; Chamov et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 15916).

W przypadku sposobów podanych przykładowo w niniejszym wynalazku szczegóły są podane w Przykładach 2-4, a zwłaszcza 4.

Etap c) można prowadzić w medium reakcyjnym zawierającym co najmniej 10% wagowo H2O.

Medium reakcyjne w tym korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku zawiera co najmniej 10% wagowo wody, korzystnie co najmniej 50%, a zwłaszcza co najmniej 80%, na przykład 90% albo do 100%. Odpowiednio oblicza się stopień rozpuszczalników organicznych. W konsekwencji reakcja ma miejsce w fazie wodnej, a korzystnym medium reakcyjnym jest woda.

Jedna z zalet tego rozwiązania sposobu według wynalazku polega na tym, że nie jest konieczne stosowanie toksykologicznie krytycznych rozpuszczalników oraz że zatem nie jest konieczne usuwanie tych rozpuszczalników po procesie wytwarzania w celu uniknięcia zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem. Ponadto nie jest konieczne prowadzenie dodatkowych kontroli jakości względem resztkowych toksykologicznie krytycznych rozpuszczalników. Jako rozpuszczalniki organiczne korzystne jest stosowanie toksykologicznie niekrytycznych rozpuszczalników, takich jak etanol albo glikol propylenowy.

Inna zaleta sposobu według wynalazku polega na tym, że unika się nieodwracalnych albo odwracalnych zmian strukturalnych, które są wywoływane przez rozpuszczalniki organiczne. Skutkiem tego polipeptydy otrzymane sposobem według wynalazku różnią się od polipeptydów otrzymanych w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak DMSO.

Ponadto nieoczekiwanie zaobserwowano, że sprzężenie HAS z lekami w roztworze wodnym minimalizuje reakcje uboczne albo unika się reakcji ubocznych. Skutkiem tego to rozwiązanie sposobu według wynalazku prowadzi do lepszych produktów o dużej czystości.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „hydroksyalkiloskrobia” stosuje się do wskazywania pochodnych skrobi, które zostały podstawione grupami hydroksyalkilowymi. W tym kontekście grupa alkilowa może być podstawiona. Hydroksyalkil zawiera korzystnie 2-10 atomów węgla, a zwłaszcza 2-4 atomy węgla. „Hydroksyalkiloskrobia” jest zatem korzystnie hydroksyetyloskrobią, hydroksypropyloskrobią i hydroksybutyloskrobią, przy czym korzystna jest hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia.

Grupa (grupy) hydroksyalkilowa HAS zawiera co najmniej jedną grupę OH.

Dla wszystkich rozwiązań niniejszego wynalazku najkorzystniejsza jest hydroksyetyloskrobia.

Wyrażenie „hydroksyalkiloskrobia” obejmuje także pochodne, w który grupa alkilowa jest jednoalbo wielopodstawiona. W tym kontekście korzystne jest aby grupa alkilowa była podstawiona chlorowcem, a zwłaszcza fluorem, albo grupą arylową, pod warunkiem, że HAS pozostaje rozpuszczalna w wodzie. Poza tym terminalna grupa hydroksylowa hydroksyalkilu może być zestryfikowana albo zeteryfikowana. Ponadto grupa alkilowa hydroksyalkiloskrobi może być liniowa albo rozgałęziona.

Zamiast alkilu można stosować ponadto liniowe albo rozgałęzione, podstawione albo niepodstawione grupy alkilenowe.

W kontekście niniejszego wynalazku hydroksyetyloskrobia może mieć średni ciężar cząsteczkowy (średni wagowo) 1-300 kDa, przy czym korzystniejszy jest średni ciężar cząsteczkowy 5-100 kDa. Hydroksyetyloskrobia może mieć dalej stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek pomiędzy podstawieniami C2:C6 wynoszący 2-20 w stosunku do grup hydroksyetylowych.

PL 217 085 B1

HAS-EPO wytworzony sposobem według wynalazku można oczyszczać i charakteryzować, jak następuje:

Wydzielanie HAS-EPO można prowadzić stosując znane sposoby postępowania przy oczyszczaniu naturalnej i rekombinacyjnej EPO (chromatografia z eliminacją wielkości, chromatografia jonowymienna, RP-HPLC, chromatografia na hydroksyapatycie, chromatografia z oddziaływaniem hydrofobowym, sposób postępowania opisany w Przykładzie 20.8 albo ich połączenia).

Kowalencyjne przyłączenie HAS do polipeptydu EPO można sprawdzić drogą analizy składu węglowodanowego po hydrolizie zmodyfikowanej proteiny (stosunek hydroksyetyloglukozy i mannozy obecnych w trzech miejscach N-glikozylowania EPO.

Wykazanie modyfikacji HAS na N-związanych oligosacharydach EPO można przeprowadzić drogą usunięcia N-glikanów modyfikowanych za pomocą HAS i obserwacji przewidywanego przesunięcia do obszaru o większej ruchliwości w SDS-PAGE +/- analizie odcisku Western.

Modyfikację EPO za pomocą HAS na resztach cysternowych można wykazać brakiem wykrywania w RP-HPLC i MALDI/TOF-MS odpowiedniego proteolitycznego peptydu Cys w proteolitycznych fragmentach produktu modyfikowanego za pomocą HAS (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospraymass spektrometry and matrixassisted laserdesorption/jonization - time of flight - mass spectrometry to the characterization of recombinant human erythropoietin. Electrophoresis, 19(13), 2348-55). Wydzielanie frakcji zawierającej HAS po trawieniu proteolitycznym EPO modyfikowanej za pomocą Cys umożliwia sprawdzenie w tej frakcji odpowiedniego peptydu drogą konwencjonalnej analizy składu aminokwasowego.

Wszystkie opisane wyżej rozwiązania odnośnie HAS-EPO według wynalazku dotyczące właściwości EPO albo HAS stosują się także do sposobu otrzymywania HAS-EPO według wynalazku.

Jednym z aspektów według wynalazku jest także HAS-EPO otrzymywany sposobem według wynalazku. Ten produkt sprzężenia HAS-EPO ma cechy określone dla powyższego HAS-EPO według wynalazku.

HAS-EPO według wynalazku jest użyteczny do stosowania w sposobie leczenia organizmu ludzkiego albo zwierzęcego.

Przedmiotem wynalazku jest poza tym kompozycja farmaceutyczna zawierająca HAS-EPO według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny rozcieńczalnik, środek wspomagający i ewentualnie nośnik, użyteczne w terapii erytropoetycznej.

Kompozycję farmaceutyczną stosuje się korzystnie do leczenia zaburzeń chorobowych związanych z anemią albo zaburzeń chorobowych związanych z zaburzeniem czynności krwiotwórczej albo chorób z nią związanych.

Stosowane tu określenie „terapeutycznie skuteczna ilość” dotyczy tej ilości, która zapewnia terapeutyczny skutek dla danego stanu chorobowego i reżimu podawania. Podawanie izopostaci erytropoetyny odbywa się korzystnie pozajelitowo. Wybrana specyficzna droga podawania będzie zależeć od leczonego stanu chorobowego. Podawanie izopostaci erytropoetyny prowadzi się korzystnie jako część kompozycji zawierającej odpowiedni nośnik, taki jak albumina z surowicy krwi ludzkiej, odpowiedni rozcieńczalnik, taki jak buforowy roztwór soli, i ewentualnie odpowiedni środek wspomagający. Wymagane dawkowanie będzie odpowiadać ilościom wystarczającym do podniesienia hematokrytu pacjentów i będzie zmieniać się w zależności od ostrości leczonego stanu chorobowego, sposobu podawania, itp.

Celem leczenia za pomocą kompozycji farmaceutycznej według wynalazku jest korzystnie zwiększenie wartości hemoglobiny we krwi większej niż 6,8 mmol/l. W tym celu kompozycję farmaceutyczną można podawać w taki sposób, aby wartość hemoglobiny wynosiła od 0,6 do 1,6 mmola/l tygodniowo. Jeżeli wartość hemoglobiny przekracza 8,7 mmola/l, to terapia powinna być korzystnie przerwana aż wartość hemoglobiny spadnie poniżej 8,1 mmola/l.

Kompozycję według wynalazku stosuje się korzystnie w postaci odpowiedniej do zastrzyku podskórnego albo dożylnego albo podawania pozajelitowego. W tym celu odpowiednim rozczynnikiem i nośnikiem jest na przykład dwuwodorofosforan sodowy, wodorofosforan dwusodowy, chloran sodowy, polisorbat 80, HSA i woda do zastrzyków. Kompozycję można podawać trzy razy tygodniowo, korzystnie dwa razy tygodniowo, jeszcze korzystniej jeden raz tygodniowo, a zwłaszcza co dwa tygodnie.

PL 217 085 B1

Kompozycję farmaceutyczną podaje się korzystnie w ilości 0,01-10 ąg/kg ciężaru ciała pacjenta, jeszcze korzystniej od 0,1 do 5 ąg/kg, 0,1 do 1 ąg/kg albo 0,2-0,9 ąg/kg, najkorzystniej 0,3-0,7 ąg/kg, a zwłaszcza 0,4-0,6 ąg/kg ciężaru ciała.

Na ogół na dawkę podaje się korzystnie od 10 do 200 ąg, a zwłaszcza od 15 do 100 ąg.

Zgodnie z dalszym aspektem niniejszego wynalazku ten problem rozwiązuje się za pomocą produktu sprzężenia hydroksyalkiloskrobia (HAS)-polipeptyd (HAS-polipeptyd), zawierającego jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym każda HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

HAS-polipeptyd według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że wykazuje on większą trwałość biologiczną w porównaniu z polipeptydem przed sprzęganiem i jest to spowodowane głównie faktem, że HAS-polipeptyd jest rozpoznawany w mniejszym stopniu albo w ogóle nierozpoznawany przez układy usuwania z wątroby i nerek, a zatem utrzymuje się w układzie krążenia w ciągu dłuższego okresu czasu. Ponadto, ponieważ HAS jest przyłączona specyficznie pod względem miejsca, to ryzyko zniszczenia aktywności biologicznej in vivo polipeptydu przez sprzężenie HAS z polipeptydem jest minimalne.

HAS-polipeptyd według wynalazku zawiera głównie dwa składniki, a mianowicie polipeptyd i związaną z nim hydroksyalkiloskrobię (HAS).

Polipeptyd może pochodzić z jakiegokolwiek źródła ludzkiego albo zwierzęcego, a w korzystnym rozwiązaniu polipeptyd pochodzi ze źródła ludzkiego.

Polipeptyd może być cytokiną, a zwłaszcza erytropoetyną, antytrombiną (AT), taką jak AT III, interleukiną, a zwłaszcza interleukiną-2, IFN-beta, IFN-alfa, G-CSF, CSF, interleukiną 6 i przeciwciałami terapeutycznymi.

Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem polipeptyd jest antytrombiną (AT), korzystnie AT III (Levy JH, Weisinger A, Ziomek CA, Echelard Υ, Recombinant Antithrombin: Production and Role in Cardiovascular Disorder, Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27, 4 (2001) 405-416; Edmunds T, Van Patten SM, Pollock J, Hanson E, Bernasconi R, Higgins E, Manalavan P, Ziomek C, Meade H, McPherson J, Cole ES, Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin, Blood 91, 12 (1998) 4661-4671; Minnema MC, Chang ACK, Jansen PM, Lubbers YTP, Pratt BM, Whittaker BG, Taylor FB, Hack CE, Friedman B, Recombinant human antithrombin III improves survival and attenuates inflammatory responses in baboons Iethally challenged with Escherichia coli, Blood 95, 4 (2000) 1117-1123; Van Patten SM, Hanson EH, Bernasconi R, Zhang K, Manavaln P, Cole ES, McPherson JM, Edmunds T, Oxidation of Methionine Residues In Antithrombin, J. Biol. Chemistry 274, 15 (1999) 10268-10276).

Zgodnie z innym korzystnym rozwiązaniem polipeptyd jest ludzką IFN-beta, a zwłaszcza IFNbeta 1a (por. Avonex®, REBIF®) i IFN-beta 1b (por. BETASERON®).

Dalszym korzystnym peptydem jest ludzki G-CSF (czynnik stymulujący kolonię granulocytów, patrz na przykład Nagata et al., The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colonystimulating factor, EMBO J. 5: 575-581, 1986; Souza et al., Recombinant human granulocyte colonystimulating factor: effects on normal and leukemic myeloid cells, Science 232 (1986) 61-65; i Herman et al., Characterization, formulation, and stability of Neupogen® (Filgrastim), a recombinant human granulocytecolony stimulating factor, in: Formulation, characterization, and stability of protein drugs, Rodney Pearlman and Y. John Wang, eds., Plenum Press, New York, 1996, 303-328).

Co się tyczy erytropoetyny, to stosują się tu także wszystkie opisane wyżej rozwiązania.

Polipeptyd wytwarza się korzystnie drogą rekombinacji i obejmuje ona wytwarzanie w komórkach eukariotycznych albo prokariotycznych, korzystnie w komórkach ssaków, owadów, drożdży i bakterii albo w każdym innym rodzaju komórek, który nadaje się do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu. Ponadto polipeptyd może dawać ekspresję u zwierząt transgenicznych (na przykład w płynach ustrojowych, takich jak mleko, krew, itp.), w jajach ptaków transgenicznych, zwłaszcza drobiu, korzystnie kurcząt, albo w roślinach transgenicznych.

Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydu jest znane w tej dziedzinie i na ogół obejmuje ono transfekcję komórek gospodarza odpowiednim wektorem ekspresji, hodowlę komórek gospodarza w warunkach, które umożliwiają otrzymywanie polipeptydu i oczyszczanie polipeptydu z komórek gospodarza (odnośnie szczegółowych informacji należy odnieść się na przykład do Krystal, Pankratz, Farber, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, High-level expression and purificaPL 217 085 B1 tion of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1 i EP 668 351 B1).

Polipeptyd zawiera jeden albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu drogą N- i ewentualnie O-glikozylacji, co oznacza, że polipeptyd jest poddany glikozylacji. Zwykle, gdy polipeptyd wytwarza się w komórkach eukariotycznych, to polipeptyd poddaje się glikozylacji po translacji. Stąd węglowodanowe łańcuchy boczne mogą być przyłączone do polipeptydu w czasie biosyntezy w komórkach ssaków, korzystnie ludzkich, owadów albo drożdży.

HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez cząsteczkę linkera. Natura cząsteczki linkera zależy od sposobu, w jaki HAS jest związana z polipeptydem. Szereg linkerów jest dostępny w handlu (na przykład w firmie Pierce, patrz wyżej). Natura linkera i jego przeznaczenie są opisane szczegółowo niżej w sekcji dotyczącej sposobu wytwarzania HES-polipeptydu.

Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem produktu sprzężenia HAS-polipeptyd według wynalazku HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe i stosuje się to korzystnie, jeżeli polipeptyd jest antytrombiną, a zwłaszcza AT III.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „ugrupowanie węglowodanowe” odnosi się do hydroksyaldehydów albo hydroksyketonów oraz ich chemicznych modyfikacji (patrz Romp Chemielexikon, 1990, Thieme Verlag Stuttgart, Niemcy, 9 wydanie, 9, 2281-2285, i cytowana tam literatura). Poza tym odnosi się to pochodnych naturalnie występujących ugrupowań węglowodanowych, takich jak glukoza, galaktoza, mannoza, kwas sialowy, itp. To określenie obejmuje także chemicznie utlenione, naturalnie występujące ugrupowania węglowodanowe, w których została otwarta struktura pierścieniowa.

Ugrupowanie węglowodanowe może być związane bezpośrednio ze szkieletem polipeptydowym. Ugrupowanie węglowodanowe stanowi korzystnie część węglowodanowego łańcucha bocznego i w takim przypadku pomiędzy ugrupowaniem węglowodanowym, z którym jest związana HAS, i szkieletem polipeptydowym mogą znajdować się dalsze ugrupowania węglowodanowe. Jeszcze korzystniej ugrupowanie węglowodanowe jest terminalnym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

W korzystniejszym rozwiązaniu HAS jest sprzężona z galaktozową resztą węglowodanowych łańcuchów bocznych, korzystnie z terminalną galaktozową resztą węglowodanowego łańcucha bocznego. Tę resztę galaktozową można udostępnić dla sprzęgania drogą usunięcia terminalnych kwasów sialowych, a następnie utleniania (patrz niżej).

W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu HAS jest sprzężona z resztą kwasu sialowego węglowodanowych łańcuchów bocznych, korzystnie z resztą terminalnego kwasu sialowego węglowodanowego łańcucha bocznego.

Ponadto, jak niniejszym ujawniono HAS można sprzęgać również z polipeptydem poprzez tioeter. Jak wyjaśniono szczegółowo niżej, atom S może pochodzić z jakiejkolwiek grupy SH przyłączonej do polipeptydu, występującego zarówno naturalnie, jak i nienaturalnie.

Atom S może pochodzić z grupy SH, która została wprowadzona w utlenionym węglowodanowym ugrupowaniu HES, korzystnie utlenionym węglowodanowym ugrupowaniu, które stanowi część węglowodanowego bocznego łańcucha polipeptydu (patrz niżej).

Atom S w tioeterze może pochodzić z naturalnie występującej cysteiny albo z cysteiny dodanej.

Przy czym przez określenie „dodane cysteiny” rozumie się, że polipeptydy zawierają resztę cysteinową, która nie występuje w polipeptydzie typu naturalnego.

Cysteina może być dodatkowym aminokwasem dodanym do N- albo C-terminalnego końca polipeptydu, dodawaną cysteinę można dodawać zastępując naturalnie występujący aminokwas cysteiną.

Drugim składnikiem produktu HAS-polipeptyd jest HAS.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „hydroksyalkiloskrobia” stosuje się do wskazywania pochodnych skrobi, które zostały podstawione grupami hydroksyalkilowymi. W tym kontekście grupa alkilowa może być podstawiona. Hydroksyalkil zawiera korzystnie 2-10 atomów węgla, a zwłaszcza 2-4 atomy węgla. Zatem „hydroksyalkiloskrobia” jest korzystnie hydroksyetyloskrobią, hydroksypropyloskrobią i hydroksybutyloskrobią, przy czym korzystna jest hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia.

Grupa (grupy) hydroksyalkilowa HAS zawiera co najmniej jedną grupę OH.

Wyrażenie „hydroksyalkiloskrobia” obejmuje także pochodne, w których grupa alkilowa jest jedno- albo wielopodstawiona. W tym kontekście grupa alkilowa jest podstawiona korzystne chlorowcem, a zwłaszcza fluorem, albo grupą arylową, pod warunkiem, że HAS pozostaje rozpuszczalna w wodzie.

PL 217 085 B1

Poza tym terminalna grupa hydroksylowa hydroksyalkilu może być zestryfikowana albo zeteryfikowana, a ponadto grupa alkilowa hydroksyalkiloskrobi może być liniowa albo rozgałęziona.

Ponadto zamiast alkilu stosować można także liniowe albo rozgałęzione, podstawione albo niepodstawione grupy alkenowe.

We wszystkich rozwiązaniach niniejszego wynalazku najkorzystniejsza jest hydroksyetyloskrobia.

W kontekście niniejszego wynalazku hydroksyetyloskrobia może mieć średni ciężar cząsteczkowy (średnia wagowo) 1-300 kDa, przy czym korzystny jest średni ciężar cząsteczkowy 5-100 kDa. Hydroksyetyloskrobia może mieć ponadto stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek podstawienia C2:C6 w granicach 2-20 w stosunku do grup hydroksylowych.

HAS-polipeptyd może zawierać 1-12, korzystnie 1-9, 1-6 albo 1-3, a zwłaszcza 1-4 cząsteczek HAS na cząsteczkę polipeptydu. Liczbę cząsteczek HAS na cząsteczkę polipeptydu można oznaczać drogą ilościowej analizy składu węglowodanowego stosując GC-MS po hydrolizie produktu i przemianie otrzymanych jednosacharydów w pochodne (Chaplin and Kennedy, 1986, Carbohydrate Analysis (eds.): a practical approach ed., Chapter 1, Monosaccharides page 1-36; Chapter 2. Oligosaccharides page 37-53; Chapter 3. Neutral Polysaccharides; 55-96; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3).

Wszystkie opisane niżej rozwiązania sposobu według wynalazku wytwarzania HAS-polipeptydu dotyczące właściwości polipeptydu albo HAS stosują się także do HAS-polipeptydu według wynalazku. Poza tym wszystkie opisane wyżej rozwiązania HAS-EPO albo jego wytwarzania, które odnoszą się na ogół do HAS, stosują się także do HAS-polipeptydu według wynalazku.

Hydroksyalkiloskrobia jest eterową pochodną skrobi. Oprócz wymienionych pochodnych eterowych w kontekście niniejszego wynalazku można stosować także i inne pochodne skrobi i na przykład użyteczne są pochodne, które zawierają zestryfikowane grupy hydroksylowe. Te pochodne mogą być na przykład pochodnymi jednopodstawionych kwasów jedno- albo dwukarboksylowych z 2-12 atomami węgla albo ich podstawionych pochodnych. Szczególnie użyteczne są pochodne niepodstawionych kwasów jednokarboksylowych z 2-6 atomami węgla, a zwłaszcza kwasu octowego. W tym kontekście korzystna jest acetyloskrobia, butyloskrobia albo propyloskrobia.

Ponadto korzystne są pochodne niepodstawionych kwasów dwukarboksylowych zawierających 2-6 atomów węgla.

W przypadku pochodnych kwasów dwukarboksylowych korzystnie jest zestryfikowana także i druga grupa karboksylowa. Ponadto w kontekście niniejszego wynalazku odpowiednie są także pochodne jednoalkilowych estrów kwasów dwukarboksylowych.

W przypadku podstawionych kwasów jedno- albo dwukarboksylowych grupy podstawnikowe mogą być korzystnie takie same jak podano wyżej dla podstawionych reszt alkilowych.

Techniki estryfikacji skrobi są znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Klemm D. et al., Comprehensive Cellulose Chemistry, tom 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, Nowy Jork, a zwłaszcza rozdział 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).

W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania produktu sprzężenia (HAS-polipeptyd) hydroksyalkiloskrobi (HAS)-polipeptydu, obejmujący etapy:

a) dostarczania odpowiedniego polipeptydu, który może reagować ze zmodyfikowaną HAS,

b) dostarczania odpowiedniej zmodyfikowanej HAS, która może reagować z polipeptydem z etapu a) i

c) poddawania reakcji polipeptydu z etapu a) z HAS z etapu b), przez co otrzymuje się HAS-polipeptyd zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią łańcuchów bocznych.

Sposób według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że wytwarza się produkt sprzężenia HAS-polipeptyd, który wykazuje wysoką aktywność biologiczną. Ponadto sposób według wynalazku ma zaletę polegającą na tym, że skuteczną pochodną polipeptydu można wytwarzać przy niższych kosztach, ponieważ sposób nie obejmuje obszernych i czasochłonnych etapów oczyszczania dających w wyniku niską wydajność końcową.

Zgodnie z powyższym w pierwszym etapie sposobu według wynalazku otrzymuje się polipeptyd, który nadaje się do reakcji ze zmodyfikowaną HAS.

Stosowane w niniejszym wynalazku określenie „dostarczanie” należy interpretować w taki sposób, że po odnośnym etapie dostępna jest cząsteczka (w etapie a) polipeptyd, w etapie b) HAS) o wymaganych właściwościach.

PL 217 085 B1

W przypadku etapu a) obejmuje ono oczyszczanie polipeptydu z naturalnych źródeł oraz rekombinacyjne wytwarzanie w komórkach albo organizmie gospodarza oraz, jeżeli jest to konieczne, modyfikację tak otrzymanego polipeptydu.

Co się tyczy polipeptydu jako materiału wyjściowego według niniejszego wynalazku, to to samo stosuje się do erytropoetyny jako części produktu sprzężenia HAS-polipeptyd według wynalazku. W tym kontekście opisane wyżej korzystne rozwiązania stosują się także do sposobu według wynalazku.

Polipeptyd wytwarza się korzystnie drogą rekombinacji i obejmuje to wytwarzanie w komórkach eukariotycznych, korzystnie komórkach ssaków, owadów, drożdży i bakterii albo w jakimkolwiek innym rodzaju komórek, które nadają się do rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu. Ponadto polipeptyd może dawać ekspresję w zwierzętach transgenicznych (na przykład w płynach ustrojowych, takich jak mleko, krew, itp.), w jajach ptaków transgenicznych, a zwłaszcza drobiu, korzystnie kurcząt, albo w roślinach transgenicznych.

Rekombinacyjne wytwarzanie polipeptydu jest znane w tej dziedzinie i na ogół obejmuje ono transfekcję komórek gospodarza odpowiednim wektorem ekspresji, hodowlę komórek gospodarza w warunkach, które umożliwiają wytwarzanie polipeptydu i oczyszczanie polipeptydu z komórek gospodarza (Krystal, Pankratz, Smart, 1986, Purification of human erythropoietin to homogeneity by a rapid five-step procedure, Blood, 67(1), 71-9; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchows ki , 1989, Highlevel expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using a baculovirus vector. Blood, 74(2), 652-7; EP 640 619 B1 i EP 668 351 B1).

Polipeptyd zawiera jeden albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu drogą N- i ewentualnie O-związanej glikozylacji, co oznacza, że polipeptyd poddaje się glikozylacji. Zwykle, gdy polipeptyd wytwarza się w komórkach eukariotycznych, to poddaje się go glikozylacji po translacji. Stąd węglowodanowe łańcuchy boczne można przyłączać do polipeptydu w czasie wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzi, owadów albo drożdży, przy czym komórki mogą być komórkami transgenicznego zwierzęcia albo rośliny (patrz wyżej).

Te węglowodanowe łańcuchy boczne można modyfikować chemicznie albo enzymatycznie po ekspresji w odpowiednich komórkach, na przykład drogą usuwania albo dodawania jednego albo więcej ugrupowań węglowodanowych (patrz na przykład Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, and Schomburg eds., GBFMonographs, 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge).

Celem sposobu według wynalazku jest opracowanie HAS-polipeptydu zawierającego jedną albo więcej cząsteczek HAS, w którym HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe. Stąd polipeptyd otrzymany w etapie a) powinien mieć takie właściwości, że możliwe jest sprzężenie poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

Przy czym ujawniono, iż polipeptyd po etapie a) może zawierać korzystnie albo (1) co najmniej jedną grupę reaktywną związaną albo bezpośrednio albo poprzez cząsteczkę linkera z grupami siarczkowymi albo ugrupowaniami węglowodanowymi, która może reagować z HES albo ze zmodyfikowaną HES, (2) co najmniej jedno ugrupowanie węglowodanowe, z którym może sprzęgać się zmodyfikowana HAS, i ewentualnie (3) co najmniej jedną wolną grupę SH.

Co się tyczy powyższej możliwości (1), to polipeptyd w etapie a) można otrzymywać korzystnie drogą sprzęgania cząsteczki odpowiedniego linkera z grupą (grupami) SH albo węglowodanowymi ugrupowaniami polipeptydu. Przykład takiego zmodyfikowanego polipeptydu jest podany w Przykładzie 4, 2.1, przy czym ważne jest aby upewnić się, że dodanie cząsteczki linkera nie narusza polipeptydu i jest to znane specjaliście w tej dziedzinie.

Co się tyczy powyższej możliwości (2) w korzystnym rozwiązaniu, to zmodyfikowaną HAS sprzęga się z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

Ugrupowanie węglowodanowe może być związane bezpośrednio ze szkieletem polipeptydowym. Ugrupowanie węglowodanowe jest korzystnie częścią węglowodanowego łańcucha bocznego i w takim przypadku pomiędzy ugrupowaniem węglowodanowym, z którym jest związana HAS, i szkieletem polipeptydowym mogą znajdować się dalsze ugrupowania węglowodanowe. Jeszcze korzystniej ugrupowanie węglowodanowe jest terminalnym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

Stąd w korzystnym rozwiązaniu zmodyfikowana HAS jest przyłączona (poprzez linker) do łańcuchów węglowodanowych związanych z miejscami N- i ewentualnie O-glikozylacji polipeptydu.

PL 217 085 B1

Przy tym polipeptyd może zawierać (a) dalsze ugrupowanie (ugrupowania) węglowodanowe, z którym jest sprzężona zmodyfikowana HAS. Techniki przyłączania ugrupowań węglowodanowych do polipeptydów, albo enzymatycznie albo drogą inżynierii genetycznej, a następnie ekspresji w odpowiednich komórkach, są znane w tej dziedzinie (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferasedependent sialylation of complex and endo-N-acetylglucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8; Dittmar, Conradt, Hauser, Hofer, Lindenmaier, 1989, Advances in Protein design; Bloecker, Collins, Schmidt, and Schomburg eds., GBF-Monographs, 12, 231-246, VCH Publishers, Weinheim, New York, Cambridge).

Ujawniono przy tym, iż ugrupowanie węglowodanowe można utlenić w celu umożliwienia reakcji ze zmodyfikowaną HAS. To utlenianie można prowadzić albo chemicznie albo enzymatycznie.

Sposoby chemicznego utleniania węglowodanowych ugrupowań polipeptydów są znane w tej dziedzinie i obejmują traktowanie nadjodanem (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 1591615922).

Drogą utleniania chemicznego w zasadzie jest możliwe utlenianie każdego ugrupowania węglowodanowego, niezależnie od tego, czy jest ono terminalne, czy nie. Przy tym jednak przy wyborze łagodnych warunków (1 mM nadjodan, 0°C w przeciwieństwie do warunków ostrych: 10 mM nadjodan, 1 godzina w temperaturze otoczenia) możliwe jest korzystne utlenianie terminalnego ugrupowania węglowodanowego, na przykład kwasu sialowego albo galaktozy, węglowodanowego łańcucha bocznego.

Alternatywnie ugrupowanie węglowodanowe można utleniać enzymatycznie. Enzymy do utleniania poszczególnych ugrupowań węglowodanowych są znane w tej dziedzinie i na przykład w przypadku galaktozy enzymem jest oksydaza galaktozy.

Jeżeli przewiduje się utlenianie terminalnych ugrupowań galaktozowych, to może być ewentualnie konieczne usunięcie terminalnych kwasów sialowych (częściowo albo całkowicie), jeżeli polipeptyd został wytworzony w komórkach, które mogą przyłączać kwasy sialowe do łańcuchów węglowodanowych, na przykład w komórkach ssaków albo w komórkach, które zostały genetycznie zmodyfikowane, tak aby mogły przyłączać kwasy sialowe do łańcuchów węglowodanowych. Chemiczne albo enzymatyczne sposoby usuwania kwasów sialowych są znane w tej dziedzinie (Chaplin i Kennedy (redaktorzy), 1996, Carbohydrate Analysis: a practical approach, zwłaszcza rozdział 5 Montreuill, Glycoproteins, str. 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3)).

Przy czym niniejszy wynalazek obejmuje fakt, iż ugrupowanie węglowodanowe, do którego ma być przyłączona zmodyfikowana HAS, jest przyłączone do polipeptydu w etapie a). W przypadku, gdy jest wymagane przyłączenie galaktozy, to można to osiągnąć za pomocą transferazy galaktozy, a sposoby są znane w tej dziedzinie (Berger, Greber, Mosbach, 1986, Galactosyltransferasedependent sialylation of complex and endo-N-acetyl-glucosaminidase H-treated core N-glycans in vitro, FEBS Lett., 203(1), 64-8).

W najkorzystniejszym rozwiązaniu w etapie a) polipeptyd modyfikuje się drogą utleniania co najmniej jednej terminalnej jednostki cukrowej, korzystnie galaktozy, jednego albo więcej węglowodanowych bocznych łańcuchów polipeptydu, korzystnie po częściowym albo całkowitym (enzymatycznym i ewentualnie chemicznym) usunięciu terminalnego kwasu sialowego, jeżeli jest to konieczne (patrz wyżej).

Skutkiem tego zmodyfikowana HAS sprzęga się korzystnie z utlenioną terminalną jednostką cukrową, korzystnie galaktozą.

Jak ujawniono powyżej polipeptyd może zawierać co najmniej jedną wolną grupę SH.

Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem wolna grupa SH jest częścią naturalnie występującej cysteiny albo cysteiny dodanej.

Sposoby zastępowania aminokwasów są znane w tej dziedzinie (Elliott, Lorenzini, Chang, Barzilay, Delorme, 1997, Mapping of the active site of recombinant human erythropoietin, Blood, 89(2), 493-502; Boissel, Lee, Presnell, Cohen, Bunn, 1993, Erythropoietin structurefunction relationships. Mutant proteins that test a model of tertiary structure, J. Biol Chem., 268(21), 15983-93)).

W kontekście niniejszego wynalazku przez określenie „cysteiny dodane” rozumie się, że polipeptydy zawierają resztę cysteinową, która nie występuje w polipeptydzie typu naturalnego, i można to osiągnąć drogą dodawania (na przykład środkami rekombinacyjnymi) reszty cysteinowej na końcu N albo C polipeptydu albo drogą zastępowania (na przykład środkami rekombinacyjnymi) naturalnie występującego aminokwasu przez cysteinę. Odpowiednie sposoby są znane specjaliście w tej dziedzinie (patrz wyżej).

PL 217 085 B1

Dodana cysteina została dodana korzystnie drogą zastępowania naturalnie występującego aminokwasu cysteiną.

Zmodyfikowana HAS sprzęga się korzystnie w etapie c) z dodaną cysteiną.

W etapie b) sposobu według wynalazku dostarcza się zmodyfikowaną HAS, która może reagować z polipeptydem z etapu a).

W tym kontekście HAS można modyfikować korzystnie na jej końcu redukującym i ma to tę zaletę, że reakcję chemiczną można łatwo regulować oraz że specjalista może być pewny, którą grupę HAS modyfikuje się w czasie reakcji. Ponieważ do HAS wprowadza się tylko jedną grupę, to można zapobiegać sieciowaniu pomiędzy różnymi cząsteczkami polipeptydu przez wielofunkcyjne cząsteczki HAS albo innym reakcjom ubocznym.

Ujawniono, iż zmodyfikowana HAS może reagować z (1) co najmniej jedną grupą związaną albo bezpośrednio albo poprzez cząsteczkę linkera z grupami siarczkowymi albo węglowodanowymi ugrupowaniami polipeptydu albo (2) co najmniej jednym ugrupowaniem węglowodanowym, który jest korzystnie utleniony i/lub, (3) co najmniej jedną wolną grupą SH.

Co się tyczy powyższego punktu (1), to modyfikacja HAS będzie zależeć od grupy związanej z polipeptydem. Poniższy mechanizm jest znany w tej dziedzinie, a przykład jest podany w Przykładzie 4, 2.1.

Co się tyczy powyższych punktów (2) i (3), to w tej dziedzinie jest znane kilka sposobów modyfikowania HAS. Podstawowa zasada ułatwiająca realizację tych sposobów polega na tym, że albo modyfikuje się reaktywną grupę, tak aby nadawała się ona do reakcji z ugrupowaniem węglowodanowym albo grupą SH, albo tak jak według wynalazku cząsteczkę linkera sprzęga się z HAS, która zawiera reaktywną grupę, która nadaje się do reakcji z ugrupowaniem węglowodanowym albo grupą SH.

W przypadku punktu (2) zmodyfikowana HAS nadaje się do reakcji z utlenionymi ugrupowaniami węglowodanowymi, korzystnie terminalną resztą cukrową, a zwłaszcza galaktozą, albo z terminalnym kwasem sialowym.

Znane jest kilka sposobów modyfikowania HAS, tak aby nadawała się ona do reakcji z utlenioną, korzystnie terminalną resztą cukrową. Jak wspomniano wyżej, tę modyfikację można wprowadzać selektywnie pod względem obszaru na redukującym końcu łańcucha HES. W takim przypadku w pierwszym etapie grupę aldehydową utlenia się do laktonu. Modyfikacje obejmują, lecz nie tylko, dodawanie do HAS hydrazydowej, aminowej (także hydroksyloaminowej), semikarbazydowej albo tiolowej grupy funkcyjnej, albo bezpośrednio albo poprzez linker. Te techniki są wyjaśnione bardziej szczegółowo w Przykładach 2-4. Ponadto mechanizmy jako takie są znane w tej dziedzinie (patrz na przykład DE 196 28 705 A1; Hpoe et al., 1981, Carbohydrate Res., 91, 39; Fissekis et al., 1960, Journal of Medicinal and Pharmaceutical Chemistry, 2, 47; Frie, 1998, diploma thesis, Fachhochschule Hamburg, DE).

Możliwe jest także dodawanie hydrazydowej albo hydroksyloaminowej grupy funkcyjnej i w takim przypadku drogą korzystnego prowadzenia reakcji w etapie c) sposobu przy pH 5 można zapewnić, aby zmodyfikowana HAS reagowała selektywnie z utlenionym ugrupowaniem węglowodanowym polipeptydu bez między- albo wewnątrzcząsteczkowego sieciowania polipeptydu przez tworzenie iminy lizynowych łańcuchów bocznych z utlenioną resztą cukrową.

W przypadku punktu (3) jest znane także kilka sposobów modyfikowania HAS, tak aby nadawała się ona do reakcji z wolną grupą SH. Tę modyfikację wprowadza się korzystnie selektywnie pod względem obszaru na redukującym końcu łańcucha HES. Te sposoby obejmują, lecz nie tylko, dodawanie do HAS maleinoimidowej, dwusiarczkowej albo chlorowcoacetamidowej grupy funkcyjnej. Te techniki są wyjaśnione w dalszych szczegółach w Przykładach 2-4.

Dalsze szczegóły co do tych technik można uzyskać u Chamova et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem, 140, 63; Greenfield et al., 1990, Cancer Research, 50, 6600, oraz z literatury cytowanej w Przykładzie 2, 1.3.

Dalsze możliwe grupy funkcyjne są zebrane w Tabeli 1 dając systematyczny przegląd ewentualnych cząsteczek linkera, a poza tym mechanizmy jako takie są znane w tej dziedzinie.

Kilka cząsteczek linkerów, które są użyteczne w kontekście niniejszego wynalazku, jest znane w tej dziedzinie albo dostępne w handlu (na przykład w firmie Pierce, dostępne w Perbio Science Deutschland GmbH, Niemcy).

PL 217 085 B1

W etapie c) sposobu według niniejszego wynalazku polipeptyd z etapu a) poddaje się reakcji z HAS z etapu b), przez co wytwarza się produkt sprzężenia HAS-polipeptyd zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym HAS utlenionym ugrupowaniem węglowodanowym polipeptydu bez między- albo wewnątrzcząsteczkowego sieciowania polipeptydu przez tworzenie iminy lizynowych łańcuchów bocznych z utlenioną resztą cukrową.

W przypadku punktu (3) jest znane także kilka sposobów modyfikowania HAS, tak aby nadawała się ona do reakcji z wolną grupą SH. Tę modyfikację wprowadza się korzystnie selektywnie pod względem obszaru na redukującym końcu łańcucha HES. Te sposoby obejmują, lecz nie tylko, dodawanie do HAS maleinoimidowej, dwusiarczkowej albo chlorowcoacetamidowej grupy funkcyjnej. Te techniki są wyjaśnione w dalszych szczegółach w Przykładach 2-4.

Dalsze szczegóły co do tych technik można uzyskać u Chamova et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem, 140, 63; Greenfield et al., 1990, Cancer Research, 50, 6600, oraz z literatury cytowanej w Przykładzie 2, 1.3.

Dalsze możliwe grupy funkcyjne są zebrane w Tabeli 1 dając systematyczny przegląd ewentualnych cząsteczek linkera, a poza tym mechanizmy jako takie są znane w tej dziedzinie.

Kilka cząsteczek linkerów, które są użyteczne w kontekście niniejszego wynalazku, jest znane w tej dziedzinie albo dostępne w handlu (na przykład w firmie Pierce, dostępne w Perbio Science Deutschland GmbH, Niemcy).

W etapie c) sposobu według niniejszego wynalazku polipeptyd z etapu a) poddaje się reakcji z HAS z etapu b), przez co wytwarza się produkt sprzężenia HAS-polipeptyd zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe.

W zasadzie szczegółowe sposoby, jak polipeptyd poddawać reakcji ze zmodyfikowaną HAS, zależy od indywidualnej modyfikacji polipeptydu i ewentualnie od HAS i są one znane w tej dziedzinie (patrz na przykład Rose, 1994, J. Am. Chem. Soc., 116, 30; O'Shannessay and Wichek, 1990, Analytical Biochemistry, 191, 1; Thorpe et al., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 63; Chamov et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15915).

W przypadku sposobów przedstawionych przykładowo w niniejszym wynalazku szczegóły są podane w Przykładach 2-4, a zwłaszcza 4.

Etap c) można realizować w medium reakcyjnym zawierającym co najmniej 10% wagowo H2O.

Medium reakcyjne w tym korzystnym rozwiązaniu sposobu według wynalazku zawiera co najmniej 10% wagowo wody, korzystnie co najmniej 50%, a zwłaszcza co najmniej 80%, na przykład 90% albo do 100% wody. Odpowiednio do tego oblicza się stopień rozpuszczalników organicznych. Stąd reakcja ma miejsce w fazie wodnej, a korzystnym medium reakcyjnym jest woda.

Jedna z zalet tego rozwiązania sposobu według wynalazku polega na tym, że nie jest konieczne stosowanie toksykologicznie krytycznych rozpuszczalników oraz że nie jest zatem konieczne usuwanie tych rozpuszczalników po procesie produkcyjnym w celu uniknięcia zanieczyszczenia rozpuszczalnikiem. Ponadto nie jest konieczne prowadzenie dodatkowych kontroli jakości pod względem resztkowych toksykologicznie krytycznych rozpuszczalników. Korzystne jest stosowanie jako rozpuszczalników organicznych toksykologicznie niekrytycznych rozpuszczalników, takich jak etanol albo glikol propylenowy.

Inna zaleta sposobu według wynalazku polega na tym, że unika się nieodwracalnych albo odwracalnych zmian, które są wywoływane przez rozpuszczalniki organiczne. Stąd polipeptydy otrzymane sposobem według wynalazku różnią się od polipeptydów otrzymanych w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak DMSO.

Poza tym nieoczekiwanie zaobserwowano, że przy sprzęganiu HAS z lekami w roztworze wodnym unika się reakcji ubocznych. Skutkiem tego to rozwiązanie sposobu według wynalazku prowadzi do lepszych produktów o dużej czystości.

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „hydroksyalkiloskrobia” stosuje się do wskazywania pochodnych skrobi, które zostały podstawione grupami hydroksyalkilowymi. W tym kontekście grupa alkilowa może być podstawiona. Hydroksyalkil zawiera korzystnie 2-10 atomów węgla, a zwłaszcza 2-4 atomy węgla. „Hydroksyalkiloskrobia” stanowi zatem korzystnie hydroksyetyloskrobię, hydroksypropyloskrobię i hydroksybutyloskrobię, przy czym korzystna jest hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia. Grupa (grupy) hydroksyalkilowa HAS zawiera co najmniej jedną grupę OH.

Dla wszystkich rozwiązań według niniejszego wynalazku najkorzystniejsza jest hydroksyetyloskrobia (HES).

PL 217 085 B1

Wyrażenie „hydroksyalkiloskrobia” obejmuje także pochodne, w których grupa alkilowa jest grupą jedno- albo wielopodstawioną. W tym kontekście grupa alkilowa jest podstawiona korzystnie chlorowcem, a zwłaszcza fluorem, albo grupą arylową, pod warunkiem, że HAS pozostaje rozpuszczalna w wodzie. Poza tym terminalna grupa hydroksylowa hydroksyalkilu może być zestryfikowana albo zeteryfikowana, a ponadto grupa alkilowa hydroksyalkiloskrobi może być liniowa albo rozgałęziona.

Ponadto zamiast alkilu stosować można także liniowe albo rozgałęzione, podstawione albo niepodstawione grupy alkilenowe.

W kontekście niniejszego wynalazku hydroksyetyloskrobia może mieć średni ciężar cząsteczkowy (średni wagowo) 1-300 kDa, przy czym bardziej korzystny jest średni ciężar cząsteczkowy 5-100 kDa. Hydroksyetyloskrobia może mieć ponadto molowy stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek pomiędzy podstawieniami C2:C6 w granicach 2-20 w stosunku do grup hydroksyetylowych.

Produkt sprzężenia HAS-polipeptyd otrzymany sposobem według wynalazku można oczyszczać i charakteryzować w sposób następujący:

Wydzielanie HAS-polipeptydu można prowadzić stosując znane sposoby postępowania przy oczyszczaniu naturalnych i rekombinacyjnych polipeptydów (na przykład drogą chromatografii z eliminacją wielkości, chromatografii jonowymiennej, RP-HPLC, chromatografii z zastosowaniem hydroksyapatytu, chromatografii z oddziaływaniem hydrofobowym, sposobem postępowan ia opisanym w Przykładzie 20.8 albo ich połączeniami).

Kowalencyjne przyłączenie HAS do polipeptydu można sprawdzać drogą analizy składu węglowodanowego po hydrolizie zmodyfikowanej proteiny.

Wykazanie modyfikacji HAS na N-związanych oligosacharydach polipeptydu można przeprowadzić drogą usunięcia N-glikanów zmodyfikowanych przez HAS i obserwowania przewidywanego przesunięcia wyższej ruchliwości w SDS-PAGE +/- analiza odcisku Western.

Modyfikację polipeptydu przez HAS na resztach cysteinowych można wykazać poprzez brak wykrywania odpowiedniego proteolitycznego peptydu Cys w RP-HPLC i MALDI/TOF-MS w proteolitycznych fragmentach produktu modyfikowanego przez HAS (Zhou et al., 1998, Application of capillary electrophoresis, liquid chromatography, electrospraymass spectrometry and matrixassisted laserdesorption/ionization - time of flight - mass spectrometry to characterization of recombinant human erythropoietin, Electrophoresis, 19(13), 2348-55). Wydzielanie frakcji zawierającej HAS po proteolitycznym trawieniu polipeptydu modyfikowanego za pomocą Cys umożliwia sprawdzenie w tej frakcji odpowiedniego peptydu konwencjonalną analizą składu aminokwasowego.

Wszystkie opisane wyżej rozwiązania HAS-polipeptydu według wynalazku, dotyczące właściwości polipeptydu albo HAS, stosują się także do sposobu według wynalazku wytwarzania produktu sprzężenia HAS-polipeptyd. Co więcej, wszystkie opisane wyżej rozwiązania w odniesieniu do HASEPO albo jego wytwarzania, które odnoszą się na ogół do peptydów albo do HAS, stosują się także do sposobu według wynalazku otrzymywania produktu sprzężenia HAS-polipeptyd.

Jednym z aspektów wynalazku jest także HAS-polipeptyd otrzymywany sposobem według wynalazku. Ten HAS-polipeptyd ma korzystnie cechy jak określono dla powyższego HAS-polipeptydu według wynalazku.

Zgodnie z korzystnym rozwiązaniem niniejszego wynalazku stosowana HAS ma następujący wzór (I)

w którym R1, R2 i R3 oznaczają niezależnie wodór albo liniową lub rozgałęzioną grupę hydroksyalkilową. Stosowane w niniejszym wynalazku określenie „hydroksyalkiloskrobia” nie jest ograniczone do związków, w których terminalne ugrupowanie węglowodanowe zawiera grupy hydroksyalkilowe R1, R2

PL 217 085 B1 i ewentualnie R3, jak przedstawiono dla zachowania zwięzłości, we wzorze (I), lecz odnosi się także do związków, w których obecna gdziekolwiek co najmniej jedna grupa hydroksylowa, albo w terminalnym ugrupowaniu węglowodanowym i ewentualnie w pozostałej części cząsteczki skrobi, HAS', jest podstawiona przez grupę hydroksyalkilową R1, R2 albo R3. W tym kontekście grupa alkilowa może być liniową albo rozgałęzioną grupą alkilową, która może być odpowiednio podstawiona. Grupa hydroksyalkilowa zawiera korzystnie od 1 do 10 atomów węgla, jeszcze korzystniej od 1 do 6 atomów węgla, a zwłaszcza od 1 do 4 atomów węgla, a nawet 2-4 atomy węgla. „Hydroksyalkiloskrobia” stanowi zatem korzystnie hydroksyetyloskrobię, hydroksypropyloskrobię i hydroksybutyloskrobię, przy czym szczególnie korzystna jest hydroksyetyloskrobia i hydroksypropyloskrobia, a zwłaszcza hydroksyetyloskrobia.

Ujawniono, iż HAS, a zwłaszcza HES, mogą reagować ze związkiem sieciującym, który reaguje z HAS, a zwłaszcza z HES, i polipeptydem, takim jak polipeptydy opisane wyżej.

Reakcja pomiędzy HAS i związkiem sieciującym może mieć miejsce na redukującym końcu HAS albo na utlenionym redukującym końcu HAS. Zatem HAS może reagować mając strukturę według wzoru (I)

i ewentualnie, w przypadku, gdy koniec redukujący jest utleniony, według wzoru (IIa)

i ewentualnie według wzoru (IIb)

Jeżeli reakcji ze związkiem sieciującym poddaje się HAS według wzoru (I), to reakcja ma miejsce korzystnie w medium wodnym. Jeżeli reakcji ze związkiem sieciującym poddaje się HAS według wzoru (IIa) i ewentualnie (IIb), to reakcja ma miejsce korzystnie w medium niewodnym, takim jak polarny rozpuszczalnik nieprotonowy albo mieszanina rozpuszczalników, taka jak DMSO i ewentualnie DMF.

PL 217 085 B1

Jeżeli produkt sprzężenia HAS-polipeptyd wytwarza się poprzez reakcję pochodnej HAS, składającej się z HAS i związku sieciującego, z utlenionym węglowodanowym ugrupowaniem polipeptydu, to związek sieciujący jest korzystnie związkiem

PL 217 085 B1

Ujawniono, iż jeżeli produkt sprzężenia HAS-polipeptyd wytwarza się drogą reakcji pochodnej HAS, zawierającej HAS i co najmniej jeden związek sieciujący, z grupą tio polipeptydu, to korzystna jest reakcja HAS na jej ewentualnie utlenionym redukującym końcu z pierwszym związkiem sieciującym, który jest korzystnie związkiem

PL 217 085 B1

PL 217 085 B1 i reakcja otrzymanej pochodnej HAS z drugim związkiem sieciującym, który może reagować z pochodną HAS i grupą tio polipeptydu. Jeżeli na przykład pochodna HAS zawiera jako grupę funkcyjną, którą poddaje się reakcji z drugim związkiem sieciującym, strukturę -NH, jak opisano szczegółowo wyżej, to między innymi korzystne są następujące rodzaje grup funkcyjnych:

Rodzaj związku (L)	F1	F2
C	jodoalkil	ester N-sukcynimidu
D	bromoalkil	ester N-sukcynimidu
E	maleinoimido	ester N-sukcynimidu
F	pirydylodwutio	ester N-sukcynimidu
G	winylosulfon	ester N-sukcynimidu

Do szczególnie korzystnych przykładów pierwszego związku sieciującego należą związki

przy czym szczególnie korzystne są związki

oraz korzystne są następujące drugie związki sieciujące a zwłaszcza

PL 217 085 B1

W zależności od odnośnych warunków reakcji, zastosowanego rozpuszczalnika albo mieszaniny rozpuszczalników i ewentualnie reszt R' i ewentualnie R'' związku R'-NH-R'', a HAS poddaje się reakcji w medium wodnym, możliwe jest aby pochodna hydroksyalkiloskrobi otrzymywana opisanym wyżej sposobem albo sposobami miała następujące budowy (IIIa):

Zatem ujawniono także pochodną hydroksyalkiloskrobi, jak opisano wyżej, która ma budowę o wzorze (IlIa). Możliwe jest także, że na przykład w przypadku, gdy R' oznacza wodór, to pochodna hydroksyalkiloskrobi otrzymywana opisanym wyżej sposobem albo sposobami może mieć następujące budowy (IIIa) albo (IIIb), gdzie (IIIa) i (IIIb) mogą znajdować się jednocześnie w mieszaninie reakcyjnej, która ma pewien rozkład równowagowy:

Zatem ujawniono opisaną wyżej pochodną hydroksyalkiloskrobi, która ma budowę o wzorze (IIIb).

Co więcej, ujawniono także opisaną wyżej pochodną hydroksyalkiloskrobi, która występuje w postaci mieszaniny składników o wzorach (IIIa) i (IIIb).

W zależności od warunków reakcji i ewentualnie chemicznej natury związku R'-NH-R'' stosowanego w reakcji, związki o wzorze (IIIa) mogą występować z atomem azotu N w położeniu ekwatorialnym albo aksjalnym, gdzie także może być obecna mieszanina obydwóch postaci, która ma pewien rozkład równowagi.

W niektórych przypadkach może okazać się pożądane stabilizowanie związku o wzorze (IIIa) i jest to zwłaszcza przypadek, w którym związek o wzorze (IIIa) wytwarza się i ewentualnie stosuje w roztworze wodnym. Jako sposób stabilizacji szczególnie korzystne jest acylowanie związku o wzorze (IlIa), zwłaszcza wtedy, gdy R' oznacza wodór. Jako środek acylujący można stosować wszystkie odpowiednie reagenty, które dają w wyniku pożądaną pochodną hydroksyalkiloskrobi o wzorze (IVa)

PL 217 085 B1

Reszta Ra, która jest częścią acylowania, może być metylem. Jako środki acylujące można zastosować bezwodniki kwasów karboksylowych, halogenki kwasów karboksylowych i aktywne estry kwasów karboksylowych.

Stąd ujawniono także pochodne hydroksyalkiloskrobi otrzymywane opisanym wyżej sposobem, przy czym wymieniona pochodna ma budowę o wzorze (IVa).

Acylowanie prowadzi się w temperaturze wynoszącej od 0° do 30°C, korzystnie od 2° do 20°C, a zwłaszcza od 4° do 10°C.

W innych przypadkach może okazać się pożądane stabilizowanie związku o wzorze (IIIb) i jest to szczególny przypadek, w którym związek o wzorze (IIIb) wytwarza się i ewentualnie stosuje w roztworze wodnym. Jako sposób stabilizacji szczególnie korzystna jest redukcja związku o wzorze (IIIb), zwłaszcza w przypadku, gdy R' oznacza wodór. Jako środek redukujący można stosować wszystkie odpowiednie reagenty, które dają w wyniku pożądaną pochodną hydroksyalkiloskrobi o wzorze (IVb)

Jako reagenty redukujące można zastosować borowodorki, takie jak NaCNBH3 albo NaBH4.

Zatem ujawniono także pochodną hydroksyalkiloskrobi otrzymywaną opisanym wyżej sposobem, przy czym wymieniona pochodna ma budowę o wzorze (IVb).

Redukcję prowadzi się w temperaturze wynoszącej od 4° do 100°C, korzystnie od 10° do 90°C, a zwłaszcza od 25° do 80°C.

Ujawniono także mieszaniny związków (IIIa) i (IIIb), (IVa) i (IVb), (IIIa) i (IVa), (IIIa) i (IVb), (IIIb) i (IVa), (IVa) i (IVb) i (IIIa) i (IVa) i (IVb) i (IIIb), przy czym (IIIa) i ewentualnie (IVa) mogą występować niezależnie w konformacji, w której atom N znajduje się w położeniu ekwatorialnym albo aksjalnym i ewentualnie (IIIb) może znajdować się w konformacji E albo Z podwójnego wiązania C-N.

Taki HAS-polipeptyd może być stosowany w sposobie leczenia organizmu ludzkiego albo zwierzęcego.

Poza tym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca HASpolipeptyd według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny rozcieńczalnik, środek wspomagający i ewentualnie nośnik, użyteczne w terapii za pomocą erytropoetyny.

Może on występować w kompozycji farmaceutycznej zawierającej ponadto co najmniej jeden farmaceutycznie akceptowalny rozcieńczalnik, środek wspomagający i ewentualnie nośnik, użyteczne w terapii za pomocą erytropoetyny, który może być użyteczny do leczenia zaburzeń chorobowych związanych z anemią albo krwiotwórczych zaburzeń czynności albo związanych z nimi chorób.

PL 217 085 B1

Wynalazek jest dalej zilustrowany za pomocą następujących figur, tablic i przykładów, które w żadnej mierze nie mają na celu ograniczenia zakresu niniejszego wynalazku.

Krótki opis figur Figura 1

Fig. 1 pokazuje analizę SDS-PAGE dwóch produktów sprzężenia HES-EPO Mw: marker

Pas 1: HES-EPO otrzymany zgodnie z przykładowym protokołem 8: EPO jest sprzężona z hydrazydo-HES 12 KD L

Pas 2: HES-EPO otrzymany zgodnie z protokołem 9: EPO jest sprzężona z hydroksyloaminoHES 12 KD K

C: kontrola (niesprzężona EPO); górne pasmo oznacza dimer EPO.

Figura 2

Figura 2 pokazuje, że HES jest sprzężona z węglowodanowym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego drogą pokazania trawienia modyfikowanych postaci EPO za pomocą HAS za pomocą N-glikozydazy polipeptydu.

Pas 1: HES-EPO otrzymany zgodnie z przykładowym protokołem 8 po trawieniu za pomocą N-glikozydazy

Pas 2: HES-EPO otrzymany zgodnie z przykładowym protokołem 9 po trawieniu za pomocą N-glikozydazy

Pas 3: standard EPO według BRP

Pas 4: standard EPO według BRP po trawieniu za pomocą N-glikozydazy

Mw: marker (Bio-Rad SDS-PAGE Standards Low range Catalog Nr 161-0305, Nio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Figura 3

Figura 3 przedstawia analizę SDS-PAGE produktu sprzężenia HES-EPO, otrzymanego zgodnie z Przykładem 17.1.

Pas A: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17

Pas B: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 17.1

Pas C: materiał wyjściowy EPO.

Figura 4

Fig. 4 przedstawia analizę SDS-PAGE produktu sprzężenia HES-EPO otrzymanego zgodnie z Przykładem 17.3.

Pas A: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 17.3

Pas B: materiał wyjściowy EPO

Pas C: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17.

Figura 5

Fig. 5 przedstawia analizę SDS-PAGE produktu sprzężenia HES-EPO otrzymanego zgodnie z Przykładami 17.4 i 17.5.

Pas A: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17

Pas B: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 17.4

Pas C: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 17.5

Pas D: materiał wyjściowy EPO.

Figura 6

Fig. 6 przedstawia analizę SDS-PAGE produktów sprzężenia HES-EPO, otrzymanych zgodnie z Przykładami 19.1 i 19.2.

Pas A: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17

Pas B: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.4

Pas C: surowy produkt po sprzężeniu według Przykładu 19.1

Pas D: materiał wyjściowy EPO.

Figura 7

Fig. 7 przedstawia analizę SDS-PAGE produktów sprzężenia HES-EPO, otrzymanych zgodnie z Przykładami 19.2, 19.3, 19.5 i 19.6.

PL 217 085 B1

Pas A: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17

Pas B: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.6 w oparciu o Przykład 13.3 b)

Pas C: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.5 w oparciu o Przykład 13.1 b)

Pas D: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.6 w oparciu o Przykład 13.1 a)

Pas E: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.5 w oparciu o Przykład 13.1 a)

Pas F: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.2

Pas G: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.3

Pas K: materiał wyjściowy EPO.

Figura 8

Fig. 8 przedstawia analizę SDS-PAGE produktów sprzężenia HES-EPO, otrzymanych zgodnie z Przykładami 19.7, 19.8, 19.9 i 19.10, 19.11 i 19.12.

Pas A: marker proteinowy Roti®-Mark PRESTAINED (Carl Roth GmbH+Co, Karlsruhe, D), ciężary cząsteczkowe (w kD) markera proteinowego od góry do dołu: 245, 123, 77, 42, 30, 25,4 i 17

Pas B: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.11

Pas C: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.10

Pas D: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.7

Pas E: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.8

Pas E: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19

Pas G: materiał wyjściowy EPO

Pas K: surowy produkt po sprzężeniu zgodnie z Przykładem 19.9.

Figura 9

Analizy SDS-PAGE EPO-GT-1 poddawanego łagodnej obróbce kwasem w ciągu 5 minut = pas 2, 10 minut = pas 3, 60 minut = pas 4 i EPO niepoddana obróbce = pas 1; pokazano przesunięcie ruchliwości EPO po usunięciu N-glikanów (+PNGASE).

Figura 10

Wzorce według HPAEC-PAD oligosacharydów wydzielonych z niepoddanej obróbce EPO i z EPO poddawanej inkubacji w ciągu 5, 10 i 60 minut w warunkach łagodnej hydrolizy kwasowej. Liczby rzymskie I-V wskazują położenie elucji I = odsialowanej struktury dwuantenowej, II = trójsialilowanych struktur trójantenowych (dwa izomery), III = czterosialilowana struktura czteroantenowa + 2 powtórzenia N-acetylolaktozaminowe, IV = czterosialilowana struktura czteroantenowa bez powtórzenia N-acetylolaktozaminowego. Obszar elucji struktur oligosacharydowych bez i z kwasem sialowym 1-4 jest podany w nawiasach.

Figura 11

HPAEC-PAD N-związanych oligosacharydów po odsialowaniu; pokazane jest położenie elucji kwasu N-acetyloneuraminowego; liczby 1-9 wskazują położenie elucji standardowych oligosacharydów: 1 = dwuantenowe, 2 = trójantenowe (izomer 2-4), 3 = trójantenowe (izomer 2-6), 4 = czteroantenowe, 5 = trójantenowe plus 1 powtórzenie, 6 = czteroantenowe plus 1 powtórzenie, 7 = trójantenowe plus 2 powtórzenia, 8 czteroantenowe plus dwa powtórzenia i 9 = czteroantenowe plus 3 powtórzenia. Figura 12

Analiza SDS-PAGE łagodnie potraktowanej i niepotraktowanej EPO, które poddawano nadjodanowemu utlenianiu reszt kwasu sialowego, 1 = utlenione nadjodanem bez obróbki kwasowej, 2 = utlenione nadjodanem z obróbką kwasową w ciągu 5 minut, 3 = utlenione nadjodanem i obróbka kwasowa w ciągu 10 minut, 4 = utlenione nadjodanem bez obróbki kwasowej, 5 = standard EPO według BRP bez nadjodanu i bez obróbki kwasowej.

PL 217 085 B1

Figura 13

Wzorzec HPAEC-PAD naturalnych oligosacharydów wydzielonych z niepoddanej obróbce EPO z EPO poddawanej inkubacji w ciągu 5 minut i 10 minut w warunkach łagodnej hydrolizy kwaśnej, a następnie obróbki nadjodanem. Obszar elucji struktur oligosacharydów bez i z kwasem 1-4-sialowym jest podany w nawiasach 1-5.

Figura 14

Analiza SDS-PAGE czasowego przebiegu modyfikacji EPO-GT-1-A za pomocą HES: 20 ąg podwielokrotności EPO-GT-1-A poddawano reakcji z pochodną HES X modyfikowaną za pomocą hydroksylaminy w ciągu 30 minut, 2, 4 i 17 godzin. Pas 1 = czas reakcji 30 minut, pas 2 = czas reakcji godziny, pas 3 = czas reakcji 4 godziny, pas 4 = czas reakcji 17 godzin, pas 5 = EPO-GT-1-A bez modyfikacji za pomocą HES. Lewa figura pokazuje przesunięcie ruchliwości EPO-GT-1-A z wydłużającym się czasem inkubacji w obecności pochodnej HES modyfikowanej hydroksyloaminą (szybkość przepływu: 1 ml.min^-1) X: pas 1 = czas reakcji 30 minut, pas 2 = czas reakcji 2 godziny, pas 3 = czas reakcji 4 godziny, pas 4 = czas reakcji 17 godzin, pas 5 = EPO-GT-1-A z modyfikacją HES. Figura po prawej stronie pokazuje analizę tych samych próbek po ich potraktowaniu N-glikozydazą.

Figura 15

Analiza SDS-PAGE frakcji za pomocą Q-Sepharose produktów sprzężenia HES-EPO. Każdy 1% przepływu i 1% frakcji eluującej przy wysokich stężeniach soli zatężano w urządzeniu do zatężania Speed Vac i ładowano na żele w buforze próbki. Proteinę EPO barwiono za pomocą odczynnika Coomasie Blue. A = próbka I, B = próbka II, C = próbka III, K = kontrolny EPO-GT-1, A1, B1, C1 i K1 wskazywały frakcję przepływową, A2, B2, C2 i K2 wskazują frakcję wymytą przy wysokim stężeniu soli.

Figura 16a

Analiza SDS-PAGE próbki EPO modyfikowanej za pomocą HES A2 (patrz Fig. 15), kontrolną próbkę EPO K2 i preparat EPO-GT-1-A trawiono w obecności N-glikozydazy w celu usunięcia N-związanych oligosacharydów. Wszystkie próbki EPO wykazywały przesunięcie ruchliwości w kierunku postaci o niskim ciężarze cząsteczkowym, które nie zawierały albo zawierały O-glikan. Niższy stosunek pasma O-glikozylowanej i nieglikozylowanej proteiny obserwowano w przypadku próbki A2 EPO modyfikowanej za pomocą HES po de-N-glikozylacji, a rozmyte pasmo proteiny wykrywano przy około 30 KDa, przypuszczalnie reprezentujące modyfikację HES przy kwasie sialowym reszty O-glikanowej (patrz strzałka zaznaczona gwiazdką).

Figura 16b

Analiza SDS-PAGE po łagodnej hydrolizie próbki A2 EPO modyfikowanej za pomocą HES (patrz Fig. 15), kontrolnej próbki K2 EPO i EPO-GT-1A, których nietraktowano, albo które trawiono w obecności N-glikozydazy w celu usunięcia N-związanych oligosacharydów (patrz Fig. 16a). Zarówno postać A2 o wysokim ciężarze cząsteczkowym przed, jak i A po obróbce N-glikozydazą (patrz nawiasy ze strzałką i bez strzałki) znikały po kwasowej obróbce próbek. Standard EPO ług BRP, który prowadzono dla porównania, nie podlegał łagodnej obróbce kwasowej.

Figura 17

Analiza HPAEC-PAD materiału N-związanego oligosacharydu, uwolnionego z próbki A modyfikowanej za pomocą HES, z EPO-GT-1-A i z kontrolnej próbki EPO poddanej inkubacji z niemodyfikowaną HES (K). Liczby rzymskie I-V wskazują na położenie elucji I = dwusialilowana dwuantenowa struktura, II = trójsialilowane trójantenowe struktury (dwa izomery), III = czterosialilowana czteroantenowa struktura + 2 powtórzenia N-acetylolaktozaminowe, IV = czterosialilowana czteroantenowa struktura + 1 powtórzenie N-acetylolaktozaminowe, V = czterosialilowana czteroantenowa struktura bez powtórzenia N-acetylolaktozaminowego, nawiasy wskazują na obszar elucji dwu-, trój- i czterosialilowanych glikanów, jak podano w legendach Fig. 10 i 13.

Figura 18

Analiza HPAEC-PAD materiału N-związanego oligosacharydu, uwolnionego z próbki A modyfikowanej za pomocą HES, z EPO-GT-1A i z kontrolnej próbki EPO (K) poddanej inkubacji za pomocą niemodyfikowanej HES. Pokazane są czasy retencji mieszaniny standardowych oligosacharydów: liczby 1-9 wskazują położenie elucji standardowych oligosacharydów: 1 = dwuantenowy, 2 = trójantenowy (izomer 2-4), 3 = trójantenowy (izomer 2-6), 4 = czteroantenowy, 5 = trójantenowy plus 1 powtórzenie, 6 = czteroantenowy plus 1 powtórzenie, 7 = trójantenowy plus 2 powtórzenia, 8 = czteroantenowy plus 2 powtórzenia i 9 = czteroantenowy plus 3 powtórzenia.

PL 217 085 B1

Figury 19 do 25

Fig. 19 do 25 przedstawiają widma masowe MALDI/TOF enzymatycznie uwolnionych i chemicznie odsialilowanych N-glikanów wydzielonych z preparatów EPO modyfikowanej za pomocą HES i EPO kontrolnej. Główne sygnały przy m/z 1809.7, 2174.8, 2539.9, 2905.0 i 3270.1 ([M+Na]⁺) odpowiadają N-glikanowym strukturom typu czteroantenowego kompleksu bez powtórzeń, z jednym albo dwoma powtórzeniami N-acetylolaktozaminowymi, którym towarzyszą słabe sygnały na skutek utraty fukozy albo galaktozy, które są spowodowane warunkami hydrolizy kwasowej stosowanymi do desialilacji próbek do analizy MS.

Figura 19

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy A2 HES-modyfikowana EPO.

Figura 20

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1-A.

Figura 21

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO K2.

Figura 22

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1.

Figura 23

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1, poddawane hydrolizie kwasowej w ciągu 5 minut.

Figura 24

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1, poddawane hydrolizie kwasowej w ciągu 10 minut.

Figura 25

Widmo MALDI/TOF: desialilowane oligosacharydy EPO-GT-1, poddawane hydrolizie kwasowej w ciągu 60 minut.

Przykłady P r z y k ł a d 1

Wytwarzanie rekombinacyjnej EPO

A) Wytwarzanie w komórkach ssaków

Rekombinacyjną EPO wytwarzano w komórkach CHO w sposób następujący:

Plazmid zawierający cDNA ludzkiej EPO klonowano do eukariotycznego wektora ekspresji (pCR3, nazywany dalej pCREPO). Mutagenezę skierowaną na centrum prowadzono stosując, jak opisano, standardowe sposoby postępowania (Grabenhorst, Nimtz, Costa et al., 1998, In vivo specificity of human alpha 1,3/4-fucosyltransferases III-VII in the biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewis(x) motifs on complex-type N-glucans - Coexpression studies from BHK-21 cells together with human betatrace protein, J. Biol. Chem., 273 (47), 30985-30994).

Komórki CHO dające ekspresję ludzkiej EPO albo jej odmiany aminokwasowe (na przykład Cys-29--->Ser/Ala, albo Cys-33--->Ser/Ala, Ser-126--->Ala, itd.) wytwarzano sposobem strącania fosforanem wapniowym i selekcjonowano, jak opisano (Grabenhorst et al.) za pomocą siarczanu G418. Trzy dni po transfekcji komórki hodowano w stosunku 1:5 i selekcjonowano w DMEM zawierającym 10% FBS i 1,5 g/litr siarczanu G418.

Stosując ten sposób postępowania selekcyjnego przeżywało zwykle 100-500 klonów, które namnażano w medium selekcyjnym w ciągu dalszego okresu czasu 2-3 tygodnie. Klarowne ciecze znad osadu hodowli komórek konfIuencyjnie rozwijających się pojedynczych warstw analizowano następnie pod względem poziomów ekspresji drogą analizy odcisku Western oraz drogą analizy odcisku lEF/Western.

EPO wytwarzano z trwałych subklonów we flaszkach wirowych albo w 2 I reaktorach perfuzyjnych. Różne glikopostacie EPO z różnymi ilościami NeuAc (na przykład 2-8, 4-10, 8-12 reszt NeuAc) wydzielano zgodnie z opublikowanymi protokołami stosując połączenia różnych chromatograficznych sposobów postępowania, jak opisano niżej.

Literatura:

Grabenhorst, Conradt, 1999, The cytoplasmic, transmembrane, and stem regions of glycosyltransferases specify their in vivo functional sublocalization and stability in the Golgi., J Biol Chem., 274(51), 36107-16; Grabenhorst, Schelenke, Pohl, Nimtz, Conradt, 1999, Genetic engineering of recombinant glycoproteins and the glycosylation pathway in mammalian host cells, Glycoconj J.,

PL 217 085 B1

16(2), 81-97; Mueller, Schelenke, Nimtz, Conradt, Hauser, 1999, Recombinant glycoprotein product quality in proliferationcontrolled BHK-21 cells, Biotechnology and bioengineering, 65(5), 529-536; Schlenke, Grabenhorst, Nimtz, Conradt, 1999, Construction and characterization of stably transfected BHK-21 cells with humantype sialylation characteristic, Cytotechnology, 30(1-3), 17-25.

B) Wytwarzanie w komórkach owadów

Rekombinacyjną ludzką EPO wytwarzano z linii komórek owadów SF9 i SF21 po zainfekowaniu komórek rekombinacyjnym wektorem bakulowirusa, zawierającym ludzki cDNA EPO z kontrolą promotora polihedrynowego, jak opisano w literaturze.

Komórki wyhodowane w medium hodowlanym bez surowicy infekowano przy gęstości komórek 2 x 10⁶ albo x 10⁷ komórek na ml, a miana EPO oznaczano każdego dnia w cieczach znad osadu kultury komórek. EPO oczyszczano drogą chromatografii na Blue sepharose, chromatografii jonowymiennej na Q-sepharose, a wreszcie drogą RP-HPLC na fazie C4.

Czystość produktu sprawdzano drogą SDS-PAGE i N-terminalnej analizy sekwencyjnej. Szczegółową analizę strukturalną węglowodanów (N- i O-glikozylacja) prowadzono zgodnie z opublikowanymi sposobami postępowania.

Literatura:

Grabenhorst, Hoher, Nimts, Jager, Conradt, 1993, Biosynthesis and secretion of human interleukin 2 glycoprotein variants from baculovirusinfected Sf21 cells. Characterization of polypeptides and posttranslational modifications, Eur J Biochem, 215(1), 189-97; Quelle, Caslake, Burkert, Wojchowski, 1989, Highlevel expression and purification of a recombinant human erythropoietin produced using baculovirus vector, Blood, 74(2), 652-7.

P r z y k ł a d 2

Tworzenie reaktywnych pochodnych HES

1. HES reaktywna z SE

1.1 Reakcja EMCH z okso-HES12KD z utworzeniem HES12KD B reaktywnym z SH

0,144 g (0,012 mmola) okso-HES12KD (niemiecki opis patentowy nr DE 196 28 705 A1 dla Freseniusa) rozpuszczono w 0,3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i do mieszaniny dodano po kropli w atmosferze azotu 34 mg (0,15 mmola) ENCH (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) w 1,5 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 19 godzin w temperaturze 60°C mieszaninę reakcyjną dodaje się do 16 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Osad oddziela się drogą wirowania, rozpuszcza ponownie w 3 ml DMSO i strąca ponownie, jak opisano wyżej. HES12KD B reaktywny z SH otrzymywano drogą wirowania i suszenia pod zmniejszonym ciśnieniem. Reakcja sprzęgania z tio-EPO jest opisana w Przykładzie 2, 2.2.

Alternatywy:

W tej reakcji można stosować wszystkie linkery sieciujące, które mają hydrazydową i maleinoimidową grupę funkcyjną oddzieloną odstępnikiem. Dalsze przykłady cząsteczek tej grupy, dostępne w Perbio Science, Deutschland GmbH, Niemcy, są przedstawione w Tabeli 2 i zaznaczone literą „A”.

Ponadto stosować można by także i inną grupę linkerów sieciujących, które mają aktywną dwusiarczkową grupę funkcyjną zamiast maleinoimidowej grupy funkcyjnej.

1.2 Chlorowcoacetamidowe pochodne HES-glikozyloamin 11

a) Tworzenie glikozyloaminy¹ (¹ patrz Manger, Wong, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10733-10740; Manger, Rademacher, Dwek, 1992, Biochemistry, 31, 10724-10732)

PL 217 085 B1

Próbkę 1 mg HES12KD rozpuszczono w 3 ml nasyconego wodorowęglanu amonowego, a następnie dodano dodatkowy stały wodorowęglan amonowy w celu utrzymania nasycenia roztworu w czasie inkubacji w temperaturze 30°C w ciągu 120 godzin. Amino-HES12KD C odsolono drogą bezpośredniej liofilizacji mieszaniny reakcyjnej.

b) Acylowanie glikozyloaminy C bezwodnikiem kwasu chlorooctowego

Próbkę 1 mg amino-HES12KD C rozpuszczono w 1 ml 1M wodorowęglanu sodowego i ochłodzono na lodzie. Do tego roztworu dodano kryształ stałego bezwodnika kwasu chlorooctowego (~5 mg) i pozostawiono mieszaninę reakcyjną do ogrzania się do temperatury pokojowej. Wartość pH kontrolowano i dodawano dodatkową zasadę, jeżeli pH spadało poniżej 7,0. Po dwóch godzinach w temperaturze pokojowej dodano drugą podwielokrotność zasady i bezwodnika. Po sześciu godzinach produkt, chloroacetamido-HES D1 (X = Cl) odsalano drogą przepuszczania nad mieszanymi żywicami jonowymiennymi Amberlite MB-3 (H) (OH).

c) Acylowanie glikozyloaminy bezwodnikiem bromooctowym² (² patrz Black, Kiss, Tull, Withers, 1993,

Carbohydr. Res., 250, 195)

Bezwodnik bromooctowy otrzymywano w sposób opisany przez Thomasa³ (³ Thomas, 1977, Methodes Enzymol., 46, 362). Próbkę 1 mg amino-HES12KD C rozpuszczono w 0,1 ml suchego MDF, ochłodzono na lodzie i dodano 5 mg bezwodnika bromooctowego. Mieszaninę reakcyjną doprowadzano powoli do temperatury pokojowej i mieszano roztwór w ciągu 3 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 1 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu o temperaturze -20°C. Osad oddzielono przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 0,1 ml DMF i strącono ponownie, jak opisano. Bromoacetamido-HES D2 (X = Br) otrzymywano drogą wirowania i suszenia pod zmniejszonym ciśnieniem. Reakcja sprzężenia z tio-EPO jest opisana w Przykładzie 3, 1.2.

d) Odpowiednią pochodną jodową D3 (X = I) syntezowano w sposób opisany dla D2. Zamiast bezwodnika bromooctowego stosowano jodooctan N-sukcynoimidylu, a wszystkie etapy prowadzono w warunkach ciemności.

Alternatywy:

W przypadku acylowania grup aminowych stosować można także i inne aktywne postacie chlorowcokwasów, na przykład

- bromki albo chlorki,

- estry, na przykład ester N-bromosukcyimidu, estry z podstawionymi fenolami (p-nitrofenol, pięciofIuorofenol, trójchlorofenol, itp.).

Ponadto można by stosować wszystkie linkery sieciujące, które mają reaktywną grupę aminową i chlorowco acetylową grupę funkcyjną, oddzielone odstępnikiem. Ich przykładem jest SBAP. Ta i inne cząsteczki są dostępne w Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy. W tabeli 2 są one zaznaczone literą „D”. W przypadku stosowania jako linkerów sieciujących do ligacji amino-HES z tioEPO bez wydzielania pochodnych chlorowcoacetamid-HES należy odnieść się do uwag w przykładzie 3, 1.2.

₁

1.3 Chlorowcoacetamidowe pochodne amino-HES E ¹

a) Reakcja 1,4-dwuaminobutanu z okso-HES12KD do amino-HES12KD E⁴ (⁴ patrz S. Frie, Diplomarbeit, Fachhochschule Hamburg, 1998)

1,44 g (0,12 mmola) okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml suchego sulfotlenku dwumetylu (DMSO), a następnie roztwór dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 1,51 ml (15 mmoli) 1,4-dwuaminobutanu w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 19 godzin w temperaturze 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Osad amino-HES12KD E oddzielono przez filtrację, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

PL 217 085 B1

b) Chloroacetamido-HES12KD F1 otrzymywano w sposób opisany wyżej w 1.3 dla chloroacetamidoHES12KD D1.

c) Bromoacetamido-HES12KD F2 (X = Br) otrzymywano w sposób opisany wyżej w 1.3 dla bromoacetamido-HES12KD D2. Reakcja sprzężenia z tio-EPO jest opisana w Przykładzie 3, 1.2.

d) Odpowiedniej jodopochodnej F3 (X = I) nie wydzielano przed jej reakcją z tio-EPO, a doświadczenie jest opisane w Przykładzie 3, 1.1.

Alternatywy:

Patrz wyżej 1.2

2. HES reaktywna z CHO

2.1 Hydrazydo-HES

a) Reakcja hydrazyny z okso-HES12KD

J

1,44 g (0,12 mmola) okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i roztwór dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 0,47 ml (15 mmoli) hydrazyny w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 19 godzin w temperaturze 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Strącony produkt J oddzielono przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 2 dni względem 0,5% (objętościowo) trójetyloaminy w roztworze wodnym i w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy), i liofilizacji. Reakcja sprzężenia z utlenionym Glyco-EPO jest opisana w Przykładzie 4, 2.2.

b) Reakcja dwuhydrazydu kwasu adypinowego z okso-HES12KD

1,74 g (15 mmoli) dwuhydrazydu adypinowego rozpuszczono w 20 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) w temperaturze 65°C i dodano po kropli w atmosferze azotu 1,44 g (0,12 mmola) okso-HES12KD rozpuszczonego w 3 ml bezwodnego DMSO. Po mieszaniu w ciągu 68 godzin w temperaturze 60°C mieszaninę reakcyjną dodano do 200 ml wody. Roztwór zawierający L poddawano dializie w ciągu 2 dni względem 0,5% objętościowo trójetyloaminy w roztworze wodnym i w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcja sprzężenia utleniony gliko-EPO jest opisana w Przykładzie 4, 2.2.

Alternatywy:

Stosować można ponadto pochodne, w których grupy hydrazydowe są oddzielone odstępnikiem.

3. Dalsze pochodne amino-HES12KD I i H¹

Amonolizę D albo F prowadzono oddzielnie drogą rozpuszczania 1 mg próbki każdego chlorowcoacetamidu w 0,1 ml nasyconego węglanu amonowego. Następnie dodano dodatkowy stały węglan amonowy w celu utrzymania stanu nasycenia roztworu w czasie inkubacji w ciągu 120 godzin

PL 217 085 B1 w temperaturze 30°C. Mieszaninę reakcyjną dodaje się do 1 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu w temperaturze -20°C. Osad zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 0,05 ml wody i, jak opisano, strącono ponownie. Produkt, amino-HES H albo I, otrzymywano drogą wirowania i suszenia pod próżnią. Reakcja sprzęgania z utlenionym gliko-EPO jest opisana w Przykładzie 4, 4.1.

4. HES12KD K modyfikowany hydroksyloaminą

κ

O-[2-(2-Aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę syntezowano w sposób opisany przez Botury55 na et al. w dwóch etapach z materiałów⁵ dostępnych w handlu (⁵ patrz Boturyn, Boudali, Constant,

Defrancq, Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485). 1,44 g (0,12 mmola) okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli w atmosferze azotu do mieszaniny 2,04 g (15 mmoli) O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 48 godzin w temperaturze 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Strącony produkt K zebrano drogą wirowania, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcja sprzężenia z utlenionym gliko-EPO jest opisana w Przykładzie 4, 3.1.

Alternatywy:

Można by stosować ponadto pochodne, w których dwie grupy hydroksylaminowe są oddzielone jakimkolwiek odstępnikiem.

5. Tio-HES12KD

5.1 Addycja z okso-HES12KD

1,44 (0,12 mmola) okso-HES12KD rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli w atmosferze azotu do mieszaniny 1,16 g (15 mmoli) cysteaminy w 15 ml

PL 217 085 B1

DMSO. Po mieszaniu w ciągu 24 godzin w temperaturze 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Strącony produkt M zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 2 dni względem 0,5% objętościowo trójetyloaminy w roztworze wodnym i w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano. Reakcja sprzężenia z utlenionym gliko-EPO jest opisana w Przykładzie 4, 2.1.

Alternatywy:

Można by stosować pochodne, w których grupa aminowa i grupa funkcyjna tio są oddzielone od siebie jakimkolwiek odstępnikiem. Ponadto grupę aminową w pochodnych można by zastąpić hydrazyną, hydrazydem albo hydroksyloaminą. Grupa funkcyjna tio mogłaby być zabezpieczona w postaci na przykład dwusiarczku albo pochodnej trytylowej, przy czym jednak w tym przypadku należy przewidzieć przed sprzęganiem dalszy etap odbezpieczenia, w wyniku czego wydzielałby się składnik analogiczny do M.

5.2 Modyfikacja amino-HES12KD E, H albo I

a) Modyfikacja za pomocą SATA/SATP

1,44 (0,12 mmola) amino-HES12KD E, H albo I rozpuszczano w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli w atmosferze azotu do mieszaniny 139 mg (0,6 mmola) SATA w 5 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Strącony produkt N zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

Odbezpieczanie prowadzono w 50 mM buforze opartym na fosforanie sodowym, zawierającym 25 mM EDTA i 0,5M hydroksyloaminy, pH 7,5, w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej, a produkt O oczyszczano drogą dializy względem 0,1M buforu opartego na octanie sodowym, pH 5,5, zawierającego 1 mM EDTA. Reakcję odbezpieczania prowadzono bezpośrednio przed reakcją sprzęgania, która jest opisana w Przykładzie 4, 2.1.

b) Modyfikacja za pomocą SPDP

1,44 g (0,12 mmola) amino-HES12KD E, H albo I rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli w atmosferze azotu do mieszaniny 187 mg (0,6 mmola) SPDP

PL 217 085 B1 w 5 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 mieszaniny etanolu i acetonu. Strącony produkt P zebrano drogą wirowania, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

Odbezpieczanie prowadzono w roztworze 12 mg dwutiotreitolu (DTT) na 0,5 ml 100 mM buforu opartego na octanie sodowym, zawierającego 100 mM chlorku sodowego przy pH 4,5 w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej, a produkt Q oczyszczano drogą dializy względem 0,1 M buforu opartego na octanie sodowym, pH 5,5, zawierającego 1 mM EDTA. Reakcję odbezpieczania prowadzono bezpośrednio przed reakcją sprzęgania, co jest opisane w Przykładzie 4, 2.1.

Alternatywy:

W przypadku przemiany grup aminowych w grupy tiolowe, albo w wolnej postaci albo zabezpieczone, dostępne jest kilka reagentów. Po modyfikacji można by wydzielać produkty. Alternatywnie, jak jest to akceptowane przy zastosowaniu linkerów sieciujących, można by je stosować bezpośrednio do reakcji sprzęgania, korzystnie po etapie oczyszczania. W przypadku wydzielania i przechowywania pochodnych tio-HES może okazać się użyteczna synteza pochodnych tio-HES w zabezpieczonej postaci. W tym przypadku można by stosować wszystkie pochodne analogiczne do SATA, które mają aktywną estrową grupę funkcyjną i tioestrową grupę funkcyjną, oddzielone od siebie jakimkolwiek odstępnikiem. SATP, który jest dalszym członem tej grupy, znajduje się w tabeli 2 i jest zaznaczony literą „H”. Pochodne analogiczne do SPDP mogłyby mieć aktywną estrową grupę funkcyjną i dwusiarczkową grupę funkcyjną, oddzielone od siebie jakimkolwiek odstępnikiem.

Dalsze człony tej grupy znajdują się w tabeli 2 i są zaznaczone literą „F”. Dalsze analogiczne pochodne mogłyby mieć aktywną estrową grupę funkcyjną i tiolową grupę funkcyjną, zabezpieczone w postaci pochodnej trytylowej, oddzielone od siebie jakimkolwiek odstępnikiem.

P r z y k ł a d 3

Reakcje sprzęgania z tio-EPO

1. Reakcja tio-EPO z HES reaktywną z SH, modyfikowaną acetamidem

1.1 Przykład - Protokół 1

Sprzęganie tio-EPO z amino-HES12KD (E, H albo I) z linkerem sieciującym zawierającym ester aktywny z NHS i grupę jodoacetamidową, na przykład SIA⁶ (⁶ patrz Cumber, Forrester, Foxwell, Ross, Thorpe, 1985, Methods Enzymol., 112, 207).

Materiały

A. Bufor boranowy. Kompozycja była 50 mM boranem sodowym, pH 8,3, 5 mM EDTA.

B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforanu sodowego, 150 mM NaCl, pH 7,4.

C. AminoHES12KD E, H albo I. Otrzymany w stężeniu 1 mg/ml w buforze boranowym.

D. Roztwór podstawowy linkera sieciującego: 14 mg SIA rozpuszczono w 1 ml DMSO.

E. Kolumny odsalające z dekstranem D-Salt™, objętość złoża 2 x 5 ml (Perbio, Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

F. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

G. Roztwór tio-EPO: 5 mg/ml tio-EPO 1 w buforze boranowym.

Η. Mikrokoncentrator: Microcon ΥΜ-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).

Metoda

100 ąl SIA dodano do 400 ąl roztworu amino-HES12KD E i pozostawiono do reakcji mieszając w ciągu 0,5 godziny w temperaturze pokojowej. Nadmiar linkera sieciującego usuwano drogą wirowania próbki z szybkością 14000 x g w ciągu 60 minut stosując mikrokoncentrator. Po wirowaniu próbkę doprowadzano do swojej początkowej objętości w buforze fosforanowym i ten proces powtarzano jeszcze dwa razy. Pozostały roztwór dodano do 1 ml roztworu tio-EPO i mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru jodoacetamidu przerywano pod koniec okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do stężenia końcowego 10 mM. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny odsalającej zrównoważonej buforem PBS, a zawartość protein we frakcjach kontrolowano odczynnikiem do prób proteinowych Coomasie. Wszystkie frakcje zawierające produkty sprzężenia protein zbierano, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie w ciągu nocy względem wody.

Alternatywy:

W tej reakcji można było stosować wszystkie linkery sieciujące, które mają sukcynimidową albo sulfosukcynimidową grupę funkcyjną i jodoacetamidową grupę funkcyjną, oddzielone od siebie odPL 217 085 B1 stępnikiem. Dalsze przykłady znajdują się w tabeli 2, są zaznaczone literą „C” i są dostępne w Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy.

1.2 Przykład - Protokół 2

Sprzęganie tio-EPO 1 z reaktywnym z SH HES12KDbromoacetamidem D2, F2 albo jodoacetamidem D3⁷ (⁷ patrz de Velasco, Merkus, Anderton, Verheul, Lizzie, Van der Zee, van Eden, Hoffmann, Verhoef, Snippe, 1995, Infect. Immun., 63, 961)

Materiały

A. Bufor fosforanowy. Skład: 100 mM fosforan sodowy, pH 6,1, 5 mM EDTA.

B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

C. Bromoacetamid D2 HES12KD reaktywego z SH, otrzymany przy stężeniu 10 mg/ml w buforze fosforanowym.

D. Kolumny odsalające z dekstranem D-Salt™, objętość złoża 2 x 5 ml (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

E. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy)

F. Roztwór tio-EPO: 5 mg/ml tio-EPO 1 w buforze fosforanowym.

Metoda ml roztworu bromoacetamidu D2 HES12KD reaktywnego z SH i 1 ml roztworu tio-EPO połączono ze sobą i mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 48 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru bromoacetamidu przerywano pod koniec okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny odsalającej zrównoważonej za pomocą buforu PBS. Zawartość protein we frakcjach monitorowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie, przy czym wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia protein zbierano, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy.

Alternatywy:

Zamiast wydzielania bromoacetamidu D2 HES12KD reaktywnego z SH amino-HES12KD (E, H, I) można by wiązać z linkerem sieciującym poprzez sukcynimidową i bromoacetamidową grupę funkcyjną (patrz wyżej 1.1). SBAP jest przedstawicielem tej grupy linkerów sieciujących i znajduje się w tabeli 2, zaznaczony literą „D”.

2. Reakcja tio-EPO z HES reaktywną z HS i modyfikowaną maleinoimidem

2.1 Przykład - Protokół 3 (patrz Snippe, 1995, Infect. Immun, 63, 961)

Sprzęganie tio-EPO z HES12KD z linkerem sieciującym zawierającym hydrazyd i maleinoimidową grupę funkcyjną, na przykład M2C2H.

Materiały

A. Roztwór podstawowy M2C2H: 10 mg/ml LM2C2H w DMSO, świeżo przygotowany.

B. HES12KD: 10 mg/ml w 0,1 M buforze opartym na octanie sodowym, pH 5,5.

C. Roztwór tio-EPO: 5 mg/ml tio-EPO w buforze fosforan/NaCl.

D. Fosforan/NaCl: 0,1 M fosforan sodowy, 50 mM NaCl, pH 7,0.

E. Mikrokoncentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).

F. Kolumna do filtracji żelowej: na przykład Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).

G. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

H. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Metoda

Roztwór M₂C₂H dodano do 400 μl roztworu HES12KD do końcowego stężenia 1 mM i mieszając pozostawiono do reakcji w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Nadmiar linkera sieciującego usuwano drogą wirowania próbki z szybkością 14000 x g w ciągu 60 minut za pomocą mikrokoncentratora. Po wirowaniu próbkę doprowadzano do swojej początkowej objętości w buforze fosforan/NaCl i powtarzano ten proces dwa razy. Do HES12KD modyfikowanego za pomocą M2C2H dodano 0,5 ml roztworu tio-EPO, a mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleinoimidów przerywano pod koniec okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) zrównoważonej za pomocą buforu PBS i zbierano frakcje 1 ml. Zawartość protein we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie. Wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia protein zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy.

PL 217 085 B1

Uwagi proceduralne

Addukt hydrazonowy jest nieznacznie mniej trwały przy skrajnych wartościach pH. W przypadku zastosowań, które mogą polegać na obróbce przy niskim pH, redukowaliśmy hydrazon do hydrazyny drogą traktowania za pomocą 30 mM cyjanoborowodorku sodowego w buforze PBS. W większości zastosowań ten dodatkowy etap nie jest konieczny.

2.2 Przykład - Protokół 4

Sprzęganie tio-EPO z maleinoimido-HES12KD B.

Materiały

A. Maleinoimido-HES12KD B: 10 mg/ml w 0,1 M buforze sodowooctanowym, pH 5,5.

B. Roztwór tio-EPO: 5 mg/ml tio-EPO w buforze fosforan/NaCl.

C. Fosforan/NaCI: 0,1 M fosforan sodowy, 50 mM NaCl, pH 7,0.

D. Kolumna do filtracji żelowej: na przykład Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).

E. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

F. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Metoda ml roztworu HES12KD B reaktywnego z SH i 1 ml roztworu tio-EPO 1 łączono ze sobą i mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleinoimidów przerywano pod koniec okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną umieszczano w kolumnie Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) zrównoważonej za pomocą buforu PBS i zbierano 1 ml frakcje. Zawartość protein we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie. Wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia protein zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy.

2.3 Przykład - Protokół 12

Sprzęganie tio-EPO z amino-HES12KD (E, H, I) z linkerem sieciującym zawierającym ester aktywny z NHS i grupę maleinoimidową, na przykład SMCC.

Materiały

A. Mikrokoncentrator: Microcon YM-10 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).

B. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

C. Amino-HES12KD E, H albo I. Otrzymany przy stężeniu 10 mg/ml w buforze PBS.

D. Roztwór SMCC: 1 mg SMCC rozpuszczono w 50 μΐ DMSO.

E. Kolumny odsalające z dekstranem D-Salt™, objętość złoża 2 x 5 ml (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

E. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

G. Roztwór tio-EPO 1: 5 mg/ml tio-EPO 1 w buforze PBS.

Metoda

Do 50 μl roztworu SMCC dodano 400 μl roztworu aminoHES12KD E i mieszając pozostawiono mieszaninę reakcyjną do reakcji w ciągu 80 minut w temperaturze pokojowej i w ciągu 10 minut w temperaturze 46°C. Nadmiar linkera sieciującego usuwano drogą wirowania mieszaniny reakcyjnej przez mikrokoncentrator z szybkością 14000 x g w ciągu 60 minut. Następnie objętość doprowadzano do 450 μl za pomocą buforu PBS i proces powtarzano jeszcze dwa razy. Po ostatnim wirowaniu pozostały roztwór doprowadzano do 450 μl za pomocą PBS, dodawano go do 1 ml roztworu tio-EPO i mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleinoimidu przerywano pod koniec okresu inkubacji przez dodanie cysteiny do końcowego stężenia 10 mM. Mieszaninę reakcyjną umieszczano w kolumnie odsalającej zrównoważonej za pomocą buforu PBS. Zawartość protein we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie, wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia proteiny zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy. Alternatywy:

W tej reakcji można było stosować wszystkie linkery sieciujące, które mają sukcynimidową albo sulfosukcynimidową grupę funkcyjną, oddzielone od siebie odstępnikiem. Dalsze przykłady tej grupy cząsteczek, dostępne w Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy, znajdują się w tabeli 2 i są zaznaczone literą „E”. Istnieje dalsza grupa linkierów sieciujących, które zamiast maleinoimidowej grupy funkcyjnej mają aktywną dwusiarczkową grupę funkcyjną. Te linkery sieciujące mogłyby być także stosowane do sprzęgania, przy czym jednak wiązanie dwusiarczkowe produktu sprzężenia rozszczepia się w warunkach redukujących. Człony tej grupy są zaznaczon e w tabeli 2 literą „F”. W trzePL 217 085 B1 ciej grupie linkerów sieciujących jako grupę reaktywną z SH zamiast maleinoimidowej grupy funkcyjnej stosuje się grupę winylosulfonową. Człon tej grupy „SVSB” jest zaznaczony w tabeli 2 literą „G”.

P r z y k ł a d 4

Reakcje sprzęgania z utlenioną EPO

1. Utlenianie gliko-EPO

1.1 Utlenianie gliko-EPO za pomocą metanadjodanu sodu: Przykład - Protokół 5

Materiały

A. Roztwór gliko-EPO: 10 mg/ml gliko-EPO w buforze octanowym.

B. Roztwór metanadjodanu sodu: świeżo przygotowany 10 mM albo 100 mM nadjodan sodu w buforze octanowym; przechowywać w ciemności. Stosując te roztwory końcowe stężenie nadjodanu sodu w mieszaninie utleniającej wynosi odpowiednio 1 mM albo 10 mM.

C. Bufor octanowy: 0,1 M bufor oparty na octanie sodowym, pH 5,5.

D. Gliceryna.

E. Mikrokoncentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).

Metoda

Wszystkie etapy prowadzono w ciemności.

Do 1 ml zimnego roztworu gliko-EPO dodano 0,1 ml zimnego roztworu metanadjodanu sodu i pozostawiono mieszaninę utleniającą do reakcji w ciągu 1 godziny w ciemności. Jeżeli utleniany gliko-EPO zawierał reszty kwasu sialowego, to warunki utleniania obejmowały 1 mM nadjodan sodu, 0°C. W przeciwnym razie stosowano 10 mM nadjodan sodu w temperaturze pokojowej. Aby wstrzymać utlenianie dodawano glicerynę do końcowego stężenia 15 mM i prowadzono inkubację w ciągu 5 minut w temperaturze 0°C. Nadmiar reagentów i produkty uboczne usuwano przez wirowanie produktu z szybkością 1400 x g w ciągu 60 minut stosując mikrokoncentrator. Po wirowaniu próbkę doprowadzano do jej początkowej objętości w buforze stosowanym w następnym etapie modyfikacji, na przykład w buforze octanowym. Ten proces powtarzano jeszcze dwa razy.

1.2 Utlenianie enzymatyczne gliko-EPO: Przykład - Protokół 6

Utlenianie enzymatyczne EPO jest opisane w wielu publikacjach (Chamow et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 15916-15922).

2. Sprzęganie z pochodnymi hydrazyny/hydrazydowymi

2.1 Przykład - Protokół 7

Sprzęganie utlenionego gliko-EPO z tio-HES12KD M, O albo Q za pomocą linkera sieciującego zawierającego hydrazyd i maleinoimidową grupę funkcyjną, na przykład M2C2H (Perbio Science, Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

Materiały

A. Roztwór podstawowy M2C2H: świeżo przygotowany 10 mg/ml M2C2H w DMSO.

B. Roztwór utlenionego gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml gliko-EPO w buforze octanowym.

C. Tio-HES12KD M, O albo Q: 10 mg/ml w buforze fosforan/NaCl.

D. Bufor octanowy: 0,1 M bufor oparty na octanie sodowym, pH 5,5.

E. Fosforan/NaCI: 0,1 M fosforan sodowy, 50 mM NaCl, pH 7,0.

F. Mikrokoncentrator: Microcon YM-3 (amicon, Milipore GmbH, Eschborn, Niemcy).

G. Kolumna do filtracji żelowej: na przykład Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).

H. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

I. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Metoda

Roztwór podstawowy M2C2H dodawano do 1 ml utlenionego gliko-EPO do stężenia końcowego 1 mM i mieszając pozostawiono do reakcji w ciągu dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Nadmiar linkera sieciującego usuwano drogą wirowania próbki z szybkością 14000 x g w ciągu 60 minut stosując mikrokoncentrator. Po wirowaniu próbkę doprowadzano do jej początkowej objętości w buforze fosforan/NaCI i ten proces powtarzano jeszcze dwa razy. Do gliko-EPO modyfikowanego za pomocą M2C2H dodano 1 ml roztworu tio-HES12KD M, O albo Q i mieszaninę reakcyjną poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Reaktywność nadmiaru maleinoimidów przerywano pod koniec inkubacji przez dodanie cysteiny. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) zrównoważonej za pomocą PBS i zbierano 1 ml frakcje. Zawartość protein we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie, wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia proteiny zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy.

PL 217 085 B1

Uwagi proceduralne

Addukt hydrazonu jest nieznacznie mniej trwały przy skrajnych wartościach pH. W przypadku zastosowań, które mogą polegać na obróbce przy niskim pH, redukowaliśmy hydrazon do hydrazyny drogą traktowania za pomocą 30 mM cyjanoborowodorku sodowego w buforze PBS. W większości zastosowań ten dodatkowy etap nie jest konieczny.

2.2 Przykład - Protokół 8

Bezpośrednie sprzęganie utlenionego gliko-EPO z hydrazydo-HES12KD L albo J Materiały

A. Roztwór utlenionego gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml gliko-EPO w buforze octanowym.

B. Hydrazydo-HES12KD L albo J: 10 mg/ml w buforze octanowym.

C. Bufor octanowy: 0,1 M bufor oparty na octanie sodowym, pH 5,5.

D. Kolumna do filtracji żelowej: na przykład Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).

E. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

F. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Metoda ml roztworu hydrazydo-HES12KD L albo J i 1 ml roztworu utlenionego gliko-EPO połączono ze sobą i mieszaninę reakcyjną pozostawiono mieszając do reakcji w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny Sephadex® G-200 (1,5 x 45) zrównoważonej za pomocą PBS i zbierano 1 ml frakcje. Zawartość protein we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych Coomasie, wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia proteiny zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy. Wynik sprzężenia jest przedstawiony na Fig. 24. Zaobserwowane przesunięcie molekularne wskazuje, że sprzężenie przebiegło z powodzeniem. Rozmazanie wynika z niejednorodności HES. Fig. 25 wskazuje, że HES jest sprzężona z węglowodanowym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

Uwagi proceduralne

Addukt hydrazonu jest nieznacznie mniej trwały przy skrajnych wartościach pH. W przypadku zastosowań, które mogą polegać na obróbce przy niskim pH, redukowaliśmy hydrazon do hydrazyny drogą obróbki za pomocą 30 mM cyjanoborowodorku sodowego w buforze PBS. W większości zastosowań ten dodatkowy etap nie jest konieczny.

3. Sprzęganie z pochodnymi⁸ hydroksyloaminy (patrz Rose, 1994, Am. Soc., 116, 30)

3.1 Przykład - Protokół 9

Sprzęganie utlenionego gliko-EPO z hydroksyloamino-HES12KD K Materiały

A. Roztwór utlenionego gliko-EPO z 6.1.1: 5 mg/ml gliko-EPO w buforze octanowym.

B. Hydroksyloamino-HES12KD K: 10 mg/ml w buforze octanowym.

C. Bufor octanowy: 0,1 M bufor sodowooctanowy, pH 5,5.

D. Kolumna do filtracji żelowej: na przykład kolumna Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm).

E. Odczynnik do prób proteinowych Coomasie® (Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy).

F. PBS, roztwór soli buforowany fosforanem: 10 mM fosforan sodowy, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Metoda ml roztworu hydroksyloamino-HES12KD K i 1 ml roztworu utlenionego gliko-EPO łączono ze sobą i mieszaninę reakcyjną pozostawiono do reakcji mieszając w ciągu 16 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną stosowano do kolumny Sephadex® G-200 (1,5 x 45 cm) zrównoważonej za pomocą PBS i zbierano 1 ml frakcje. Zawartość proteiny we frakcjach kontrolowano za pomocą odczynnika do prób proteinowych, wszystkie frakcje zawierające produkt sprzężenia proteiny zbierano razem, a produkt sprzężenia otrzymywano drogą liofilizacji po dializie względem wody w ciągu nocy. Wynik sprzężenia jest przedstawiony na Fig. 24. Zaobserwowane przesunięcie molekularne na pasie 2 wskazuje, że sprzężenie było udane. Rozmycie wynika z niejednorodności HES. Fig. 25 wskazuje, że HES jest sprzężona z węglowodanowym ugrupowaniem węglowodanowego łańcucha bocznego.

P r z y k ł a d 5

Charakteryzacja N-glikanów EPO potraktowanej oksydazą galaktozy

Postacie rekombinacyjnej EPO albo częściowo odsialilowanej EPO (otrzymane drogą ograniczonej łagodnej hydrolizy kwasowej) poddawano inkubacji z oksydazą galaktozy w obecności katalazy w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut do 4 godzin w temperaturze 37°C w 0,05 M buforze opartym

PL 217 085 B1 na fosforanie Na, pH 7,0. Postęp reakcji kontrolowano drogą pobierania 50 pg podwielokrotności EPO, a następnie obróbki proteiny za pomocą N-glikanazy polipeptydu.

Uwolnione N-związane oligosacharydy (kontrolowane drogą detekcji SDS-PAGE od-Nglikozylowanego polipeptydu) poddawano odwzorowaniu HPAEC-PAD, jak opisano w literaturze (Grabenhorst et al., 1999, Nimtz et al., 1993/1994; Schlenke et al., 1999) przed i po usunięciu kwasów sialowych. Ocenę ilościową utlenionych reszt galaktozy prowadzono drogą typowego przesunięcia obserwowanego w HPAEC-PAD i sprawdzano także za pomocą MALDI/TOF MS mieszanin oligosacharydów.

P r z y k ł a d 6

Charakteryzacja EPO modyfikowanej za pomocą HAS

Oddzielenie postaci EPO modyfikowanej za pomocą HAS od nieprzereagowanej EPO i cząsteczek prekursorów HAS uzyskiwano drogą filtracji żelowej stosując na przykład Ultrogel Ac44/54 albo podobne media do filtracji żelowej. Alternatywnie nieprzereagowaną HAS usuwano drogą oddzielania EPO drogą wykorzystywania powinowactwa immunologicznego na 4 ml kolumnie zawierającej przeciwciało monoklonalne sprzężone z Affigel (BioRad), a następnie oddzielania niezmodyfikowanej EPO drogą filtracji żelowej (stosując na przykład osnowę umożliwiającą oddzielanie protein globularnych o względnej masie cząsteczkowej od 20 do 200 kDa).

EPO modyfikowane za pomocą HAS identyfikowano drogą analizy SDS-PAGE (stosując 12,5 albo 10% żele akryloamidowe) poprzez wykrywanie ich wyższego ciężaru cząsteczkowego w porównaniu z niemodyfikowaną EPO po barwieniu żelów za pomocą Coomasie Brillant Blue. Wyższy ciężar cząsteczkowy polipeptydów EPO modyfikowanej za pomocą HAS identyfikowano także drogą analizy odcisku Western próbek stosując przeciwciało poliklonalne aktywne względem rekombinacyjnej ludzkiej EPO.

N-glikanową modyfikację postaci EPO wykazywano drogą ich udanego usunięcia z proteiny EPO za pomocą N-glikanazy polipeptydu (rekombinacyjna N-glikozydaza od Roche, Niemcy, stosowanie 25 jednostek/mg proteiny EPO w temperaturze 37°C w ciągu 16 godzin), a analiza drogą SDSPAGE dała w wyniku typowe przesunięcie proteiny EPO do położenia migracji niemodyfikowanej EPO potraktowanej N-glikozydazą o wielkości w przybliżeniu 20 KDa.

Modyfikacja O-glikanu EPO z pojedynczym odsialilowaniem i potraktowanej oksydazą galaktozy w Ser 126 została wykazana drogą migracji w SDS-PAGE od-N-glikozylowanego produktu przez wykrywanie jego położenia migracji w porównaniu z nieprzereagowaną od-N-glikozylowaną EPO. Jeżeli było to konieczne, to przed analizą SDS-PAGE modyfikowaną EPO frakcjonowano drogą RP-HPLC na fazie C8. Modyfikację HAS O-glikanu EPO analizowano także drogą eliminacji β O-glikanu i wykrywania od-O-glikozylowanej postaci EPO w odciskach Western stosując przeciwciało poliklonalne aktywne względem rekombinacyjnej ludzkiej EPO.

P r z y k ł a d 7

Ocena ilościowa postaci EPO i modyfikowanej EPO

Postacie EPO, w których ocenę ilościową prowadzono drogą pomiarów UV, jak opisano w Ph.Eur. (2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, 780-785) i porównywano z międzynarodowym standardem EPO według BRP. Alternatywnie stężenia EPO oznaczano drogą próby RP-HPLC stosując kolumnę RP-C4 i absorpcję przy 254 nm stosując do kalibracji 20, 40, 80 i 120 pg preparatu standardu EPO według BRP.

P r z y k ł a d 8

Aktywność biologiczna in vitro rekombinacyjnej ludzkiej EPO modyfikowanej za pomocą HES

Oczyszczoną EPO modyfikowaną za pomocą HES badano na aktywność stosując próbę aktywności biologicznej erytropoetyny, opisanej przez Krystala (Krystal, 1984, Exp. Haematol., 11,

649-660).

Anemię wywoływano u mysz NMRI drogą potraktowania chlorowodorkiem fenylohydrazyny, a komórki śledziony wykorzystywano w sposób opisany przez Fibi (Fibi et al., 1991, Blood, 77, 1203 ₅ ff). Rozcieńczenia EPO poddawano inkubacji z 3 x 10⁵ komórek/dołek w płytkach do mikromiana z 96 dołkami. Po 24 godzinach w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze (5% CO2) komórki zna₃ kowano w ciągu 4 godzin za pomocą 1 pCi ³H-tymidyny na dołek. Wprowadzoną promieniotwórczość oznaczano drogą zliczania za pomocą cieczowego licznika scyntylacyjnego. Dla porównania stosowano międzynarodowy standard EPO według BRP.

Alternatywnie, aktywność biologiczną EPO mierzono za pomocą próby in vitro stosując linię TF-1 komórek wrażliwych na EPO (Kitamura et al., (J. Cell Phys, 140.323-334)). Komórki rozmnażają44

PL 217 085 B1 ce się wykładniczo przemywano bez czynników wzrostu i poddawano inkubacji w obecności serii rozcieńczeń EPO w ciągu dalszych 48 godzin. Namnażanie się komórek stwierdzono stosując próbę redukcji MTT, opisaną przez Mosmanna (Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods, 65, 55-63).

P r z y k ł a d 9

Oznaczanie in vivo aktywności EPO i postaci EPO modyfikowanych za pomocą HAS

Oznaczanie aktywności in vivo prowadzono u mysz z prawidłowymi krwinkami czerwonymi drogą pomiaru wzrostu retykulocytów po 4 dniach po otrzymaniu przez zwierzęta przewidzianej dawki EPO albo modyfikowanych postaci EPO. Próby prowadzono stosując standard EPO według BRP, który kalibrowano względem standardu EPO według WHO w próbie z myszą z prawidłowymi krwinkami czerwonymi. Próbki EPO rozcieńczano w roztworze soli buforowanym fosforanem, zawierającym 1 mg/ml albuminy z surowicy krwi bydlęcej (Sigma).

0,5 ml badanego roztworu EPO w buforowanym roztworze soli Dulbecco (odpowiadającym równoważnikowi proteiny EPO 100, 80, 40 albo 20 lU/ml EPO według standardu BRP) infekowano podskórnie na jedno zwierzę. Próbki krwi pobierano po 4 dniach po zastrzyku, a retykulocyty barwiono za pomocą oranżu akrydynowego. Ocenę ilościową retykulocytów prowadzono drogą cytometrii przepływowej zliczając ogółem 30000 komórek krwi w ciągu 5 godzin po pobraniu próbki krwi (patrz Ph. Eur, 2000, Erythropoietini solutio concentrata, 1316, strony 780-785, i European Pharmacopoeia, 1996/2000, załącznik 2002).

P r z y k ł a d 10

Oznaczanie czasu półtrwania in vivo

Królikom wstrzykiwano dożylnie specyficzne ilości postaci EPO niemodyfikowanych albo modyfikowanych za pomocą HAS. Próbki krwi otrzymywano w specyficznych okresach czasu i przygotowywano surowicę. Poziomy erytropoetyny w surowicy oznaczano drogą próby biologicznej in vitro albo za pomocą specyficznego dla EPO programu handlowego ELISA.

P r z y k ł a d 11

Farmakokinetyka in vivo

U mysz: Każde zwierzę otrzymywało podskórnie 300 IU EPO/kg. 7 dni po leczeniu oznaczano hematokryty u każdego zwierzęcia. Znaczny wzrost hematokrytów obserwowano u wszystkich zwierząt leczonych za pomocą modyfikowanej EPO, to jest wynik przewidywany z punktu widzenia stosunkowo krótkiego czasu półtrwania niepotraktowanej EPO. Średnia zmiana hematokrytów w grupie leczonej za pomocą modyfikowanej EPO znacznie różniła się od zmiany w grupie z niepotraktowaną EPO i zmianą w grupie kontrolnej.

U królików: Króliki leczono pojedynczą dawką EPO niemodyfikowanej albo modyfikowanej za pomocą HAS, odpowiadającą 200 albo do 800 ng/kg ciężaru ciała. Po 2, 6, 12, 16, 24 i 48 godzinach próbki krwi analizowano stosując dostępny w handlu program ELISA specyficzny dla EPO w celu oznaczenia stężeń w osoczu. Oznaczano średnie stężenia EPO w osoczu, a średnie początkowe czasy półtrwania (faza a) i końcowe czasy półtrwania (faza β) obliczano z wartości według ELISA, jak opisano w literaturze (Zettlmissl et al., 1989, J. Biol. Chem., 254, 21153-21159).

Literatura:

Sytkowski, Lunn, Risinger and Davis, 1999, An Erythropoietin Fusion Protein Comprised of Identical Repeating Domains Exhibits Enhanced Biological Properties, J. Biol. Chem., 274, 24773-24778.

P r z y k ł a d 12

Ocena aktywności biologicznej in vitro rekombinacyjnej ludzkiej IL-2 modyfikowanej za pomocą HES

Modyfikowaną IL-2 uzyskuje się drogą filtracji żelowej na Ultrogel AcA 54. Podwielokrotności odpowiedniej frakcji filtrowano sterylnie, a aktywność biologiczną IL2 oznaczano stosując zależną od IL2 linię komórkową CTLL mysz (Gillis, Ferm, On i Smith, 1978, J. Immunol., 120, 2027-2032). Aktywność była odniesiona do standardowego preparatu IL2 według odnośnika międzynarodowego.

P r z y k ł a d 13

Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi drogą aminowania redukcyjnego nieutlenionego redukującego końca P r z y k ł a d 13a

Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,3-dwuamino-2-hydroksypropanem

PL 217 085 B1

a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi HES18/04 (c.cz. = 18000 D, DS = 0,4) w 5 ml wody dodano 0,83 mmola 1,3-dwuamino-2-hydroksypropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego. Otrzymaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze 80°C w ciągu 17 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad oddzielono drogą wirowania, poddawano go dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

b) Możliwa była także inkubacja mieszaniny otrzymanej przez dodanie 0,83 mmola 1,3-dwuamino-2-hydroksypropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi i doprowadzanie do temperatury 25°C w ciągu 3 dni.

P r z y k ł a d 13.2 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,2-dwu-hydroksy-3-aminopropanem

a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS. 0,4) w 5 ml wody dodano 0,83 mmola 1,2-dwuhydroksy-3-aminopropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego. Otrzymaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze 80°C w ciągu 17 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad oddzielono przez wirowanie i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano. Reakcję 1,2-dwuhydroksy-3-aminopropanu z HES potwierdzano pośrednio drogą ilościowej oceny formaldehydu pojawiającego się z oksydacyjnego odszczepienia 1,2-diolu w produkcie reakcyjnym przez nadjodan, jak zostało to opisane przez G. Avigad, Anal. Biochem. 134 (1983) 449-504.

b) Możliwa była także inkubacja mieszaniny otrzymanej z dodawania 0,83 mmola 1,2-dwuhydroksy-3-aminopropanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi i prowadzono ją w temperaturze 25°C w ciągu 3 dni.

P r z y k ł a d 13.3 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-dwuamino-butanem

a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) w 5 ml wody dodano 0,83 mmola 1,4-dwuaminobutanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3. Otrzymaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze 80°C w ciągu 17 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad oddzielono przez wirowanie, poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja

3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

b) Możliwa była także inkubacja mieszaniny otrzymanej z dodawania 0,83 mmola 1,4-dwuaminobutanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi i prowadzono ją w temperaturze 25°C w ciągu 3 dni.

P r z y k ł a d 13.4 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1-merkapto-2-aminoetanem

a) Do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) w 5 ml wody dodano 0,83 mmola 1-merkapto-2-aminoetanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3. Otrzymaną mieszaninę poddawano inkubacji w temperaturze 80°C w ciągu 17 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad oddzielo46

PL 217 085 B1 no przez wirowanie, poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

b) Możliwa była także inkubacja mieszaniny otrzymanej z dodawania 0,83 mmola 1-merkapto-2-aminoetanu i 50 mg cyjanoborowodorku sodowego NaCNBH3 do roztworu 200 mg hydroksyetyloskrobi i prowadzono ją w temperaturze 25°C w ciągu 3 dni.

P r z y k ł a d 14 Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi drogą sprzęgania z nieutlenionym redukującym końcem

P r z y k ł a d 14.1 Reakcja hydroksyetyloskrobi z karbohydrazydem

0,96 g HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) rozpuszczono w 8 ml 0,1 M wodnego buforu sodowooctanowego, pH 5,2, i dodano 8 mmoli karbohydrazydu (Sigma Aldrich, Taufkirchen, D). Po mieszaniu w ciągu 18 godzin w temperaturze 25°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt oddzielono przez wirowanie, rozpuszczono ponownie z 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 3 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 14.2 Reakcja hydroksyetyloskrobi z dwuhydrazydem adypinowym

0,96 g HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) rozpuszczono w 8 ml 0,1 M wodnego buforu sodowooctanowego, pH 5,2, i dodano 8 mmoli dwuhydrazydu adypinowego (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D). Po mieszaniu w ciągu 18 godzin w temperaturze 25°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt oddzielono przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 3 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano. P r z y k ł a d 14.3 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydem

0,96 g HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) rozpuszczono w 8 ml 0,1 M wodnego buforu sodowooctanowego, pH 5,2, i dodano 8 mmoli 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydu (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D). Po mieszaniu w ciągu 18 godzin w temperaturze 25°C do mieszaniny reakcyjnej dodano 8 ml wody i zawiesinę wirowano w ciągu 15 minut z szybkością 4500 obrotów na minutę, a następnie dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 3 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

PL 217 085 B1

P r z y k ł a d 14.4 Reakcja hydroksyetyloskrobi z O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminą

O-[2-(2-Aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę syntezowano w sposób opisany przez Boturyna et al., Tetrahedron 53 (1997), str. 5485-5492, w dwóch etapach z materiałów dostępnych w handlu.

0,96 g HES18/0,4 (c.cz. 18000 D, DS 0,4) rozpuszczono w 8 ml wodnego 0,1 M buforu sodowooctanowego, pH 5,2, i dodano 8 mmoli O-[2-(2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy. Po mieszaniu w ciągu 18 godzin w temperaturze 25°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 3 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15 Tworzenie pochodnych hydroksyetyloskrobi drogą reakcji z utlenionym redukującym końcem

P r z y k ł a d 15.1 Reakcja hydroksyetyloskrobi karbohydrazydem

0,12 mmola okso-HES10/0,4 (c.cz. 10000 D, DS 0,4), otrzymanego zgodnie z niemieckim opisem patentowym nr DE 196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 15 mmoli karbohydrazydu (Sigma Aldrich, D) w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 88 godzin w temperaturze 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad oddzielono przez wirowanie i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15.2 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-fenyleno-bis-3-tiosemikarbazydem

0,12 mmola okso-HES10/0,4 (c.cz. 10000 D, DS 0,4), otrzymanego zgodnie z niemieckim opisem patentowym nr DE 196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 15 mmoli 1,4-fenyleno-bis-(3-tiosemikarbazydu) (Lancaster Synthesis, Frankfurt/Main, D) w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 88 godzin w temperaturze 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml zimnej 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Osad zebrano przez wirowanie i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15.3 Reakcja hydroksyetyloskrobi z hydrazyną

1,44 g (0,12 mmola) okso-HES10/0, 4 (c.cz. 10000 D, DS 0,4), otrzymanej zgodnie z niemieckim opisem patentowym nr DE 196 28 705 A1), rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 0,47 ml (15 mmoli) hydrazyny w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 19 godzin w temperaturze 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem 0,5% objętościowo trój48

PL 217 085 B1 etyloaminy w roztworze wodnym i w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja

3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15.4 Reakcja hydroksyetyloskrobi z hydroksyloaminą

O-[2-[2-Aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminę syntezowano w sposób opisany przez Boturyna et al. w 2 etapach z dostępnych w handlu materiałów (Boturyn, Boudali, Constant, Fefrancq,

Lhomme, 1997, Tetrahedron, 53, 5485).

1,44 g (0,12 mmola) okso-HES10/0,4 (c.cz. 10000 D, DS 0,4), otrzymanej zgodnie z niemieckim opisem patentowym nr DE 196 28 705 Al), rozpuszczono w 3 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) i dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 2,04 g (15 mmoli) O-[2-[2-aminooksyetoksy)etylo]hydroksyloaminy w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 48 godzin w temperaturze 65°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 (objętościowo) mieszaniny acetonu i etanolu. Strącony produkt zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15.5 Reakcja hydroksyetyloskrobi z dwuhydrazydem adypinowym

1,74 (15 mmoli) dwuhydrazydu adypinowego rozpuszczono w 20 ml bezwodnego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) w temperaturze 65°C i dodano po kropli pod azotem 1,44 (0,12 mmola) okso-HES 10/0,4 (c.cz. 10000, DS 0,4, otrzymanej zgodnie z DE 196 28 705 A1) rozpuszczonej w 3 ml bezwodnego DMSO. Po mieszaniu w ciągu 68 godzin w temperaturze 60°C mieszaninę reakcyjną dodano do 200 ml wody. Roztwór zawierający produkt reakcji poddawano dializie w ciągu 2 dni względem 0,5% wagowo trójetyloaminy w roztworze wodnym i w ciągu 2 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 15.6 Reakcja hydroksyetyloskrobi z 1,4-dwuaminobutanem

1,44 (0,12 mmola) okso-HES10/0,4 (c.cz. = 10000 D, DS = 0,4, otrzymanej zgodnie z DE 196 28 705 A1) rozpuszczono w 3 ml suchego sulfotlenku dwumetylu (DMSO) w temperaturze 65°C i dodano po kropli pod azotem do mieszaniny 1,51 ml (15 mmoli) 1,4-dwuaminobutanu w 15 ml DMSO. Po mieszaniu w ciągu 19 godzin w temperaturze 40°C mieszaninę reakcyjną dodano do 160 ml 1:1 (objętościowo) mieszaniny etanolu i acetonu. Osad amino-HES10KD/0,4 zebrano przez wirowanie, rozpuszczono ponownie w 40 ml wody i poddawano dializie w ciągu 4 dni względem wody (rurki do dializy SnakeSkin, frakcja 3,5 KD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, Niemcy) i liofilizowano.

P r z y k ł a d 16 Utlenianie erytropoetyny

Utlenioną erytropoetynę wytwarzano w sposób opisany w Przykładzie 20. Jako utlenioną erytropoetynę stosowano EPO-GT-1A, jak opisano w Przykładzie 20.11(c) (EPO-GT-1 bez hydrolizy kwasowej, poddana łagodnemu utlenianiu nadjodanem).

P r z y k ł a d 17 Sprzęganie pochodnych hydroksyetyloskrobi z utlenioną erytropoetyną z Przykładu 4 P r z y k ł a d 17.1 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.1

Utlenioną EPO (1055 μg/μl) w 20 mM buforu PBS nastawiono na pH 5,3 za pomocą 5 M buforu sodowooctanowego, pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO dodano 18 μl roztworu pochodnej HES wytworzonej według Przykładu 14.1 (c.cz. 18 kD, 18,7 μ0/μ w 0,1M buforze sodowooctanowym, pH 5,2) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jak opisano w instrukcjach opisanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

PL 217 085 B1

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 3. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Zwiększona szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 17.2 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.3

Utlenioną EPO (1,055 pg/pl) w 20 mM buforu PBS nastawiono na pH 5,3 za pomocą 5M buforu sodowooctanowego, pH 5,2. Do 19 pl roztworu EPO dodano 18 pl roztworu pochodnej HES wytworzonej według Przykładu 14,3 (c.cz. 18 kD, 18,7 pg/pl w 0,1M buforze sodowooctanowym, pH, 5,2) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen.

P r z y k ł a d 17.3 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.4

Utlenioną EPO (1,055 pg/pl) w 20 mM buforu PBS nastawiono na pH 5,3 za pomocą 5M buforu sodowooctanowego, pH 5,2. Do 19 μl roztworu EPO dodano 18 pl roztworu pochodnej HES wytworzonej według Przykładu 14,4 (c.cz. 18 kD, 18,7 pg/pl w 0,1M buforze sodowooctanowym, pH, 5,2) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 4. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Zwiększona szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 17.4 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.1

Utlenioną EPO (1,055 pg/pl) w 20 mM buforu PBS nastawiono na pH 5,3 za pomocą 5M buforu sodowooctanowego, pH 5,2. Do 19 pl roztworu EPO dodano 18 pl roztworu pochodnej HES wytworzonej według Przykładu 15,1 (c.cz. 10 kD, 18,7 pg/pl w 0,1M buforze sodowooctanowym, pH, 5,2) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% bufor żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 5. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 17.5 Reakcja utlenionej erytropoetyny z produktem reakcji 15.2

Utlenioną EPO (1,055 pg/pl) w 20 mM buforu PBS nastawiono na pH 5,3 za pomocą 5M buforu sodowooctanowego, pH 5,2. Do 19 pl roztworu EPO dodano 18 pl roztworu pochodnej HES wytworzonej według Przykładu 15.1 (c.cz. 10 kD, 18,7 pg/pl w 0,1M buforze sodowooctanowym, pH, 5,2) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/-MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 5. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 18 Tworzenie tio-EPO drogą redukcji erytropoetyny

241,5 pg erytropoetyny (EPO-GT-1, patrz Przykład 20) w 500 pl 0,1M buforu sodowoboranowego, 5 mM EDTA, 10 mM DTT (Lancaster, Morcambe, UK), pH, 8,3, poddawano inkubacji w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. DTT usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 10 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) przy szybkości 13000 obrotów na minutę, przemywając następnie 3 razy buforem boranowym i dwa razy buforem fosforanowym (0,1M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2).

P r z y k ł a d 19: Sprzęganie pochodnych hydroksyetyloskrobi z erytropoetyną stosując związek sieciujący

PL 217 085 B1

W każdym z następujących przykładów jako związek sieciujący stosowano ester N-(alfamaleimidoacetoksy)sukcynimidowy.

P r z y k ł a d 19.1 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.1 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 14.1 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.2) dodano 10 μl roztworu

2,5 μmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 8 0 minut w temperaturze 25°C i 20 minut W temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji z wirowaniem za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 μg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 μg/μl) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 6. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.2 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.2 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 14.2 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 μl roztworu

2,5 μmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji z wirowaniem za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 μg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 μ0/μ! w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris/MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 7. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.3 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.3 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 14.3 i rozpuszczonej w 200 μl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 μl roztworu

2,5 μmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji z wirowaniem za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVAPL 217 085 B1

SCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 7. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.4 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 14.4 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 14.4 i rozpuszczonej w 200 ąl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 ąl roztworu

2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji z wirowaniem za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 6. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.5 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 13.1 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 13.1, w warunkach inkubacji 80°C i 17 godzin oraz w temperaturze 25°C i w ciągu 3 dni, i rozpuszczonej w 200 ąl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2), dodano 10 ąl roztworu 2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 7. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.6 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 13.3 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 13.3, w warunkach inkubacji 80°C i 17 godzin oraz w temperaturze 25°C i w ciągu 3 dni, i rozpuszczonej w 200 ąl 0,1M buforu sodowofosforanowego (0,1 Μ, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 ąl roztworu 2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO. Klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE,

PL 217 085 B1

Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 7. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.7 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.1 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.1 i rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. Pozostały AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO otrzymanego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.8 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.2 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.2 i rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9.15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl roztworu 2,5 pmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.9 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.3 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.3 i rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl roztworu 2,5 pmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę, przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

PL 217 085 B1

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 7. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.7 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z przykładu 15.1 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.1 i rozpuszczonej w 200 ąl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 ąl roztworu 2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę I przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.8 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.2 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.2 i rozpuszczonej w 200 ąl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 ąl roztworu 2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę i przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.9 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.3 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.3 i rozpuszczonej w 200 ąl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 ąl roztworu 2,5 ąmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO, a klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę i przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 ąg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 ąg/ąl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest

PL 217 085 B1 spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.10 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.4 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.4 rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl roztworu 2,5 pmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO i klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę i przemywania 4 razy i w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.11 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.5 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.5 i rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl roztworu 2,5 pmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO i klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę i przemywania 4 razy w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

P r z y k ł a d 19.12 Reakcja tio-erytropoetyny z produktem reakcji z Przykładu 15.6 i związkiem sieciującym

Do 50 nmoli pochodnej HES otrzymanej według Przykładu 15.6 i rozpuszczonej w 200 pl buforu fosforanowego (0,1 M, 9,15 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,2) dodano 10 pl roztworu 2,5 pmola AMAS (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Niemcy) w DMSO i klarowny roztwór poddawano inkubacji w ciągu 80 minut w temperaturze 25°C i 20 minut w temperaturze 40°C. AMAS usuwano drogą filtracji przez wirowanie za pomocą 0,5 ml koncentratora VIVASPIN, 5 KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, Niemcy) z szybkością 13000 obrotów na minutę i przemywania 4 razy i w ciągu 30 minut buforem fosforanowym.

Do pozostałego roztworu dodano 15 pg tio-EPO wytworzonego według Przykładu 18 (1 pg/pl w buforze fosforanowym) i mieszaninę poddawano inkubacji w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°C. Po liofilizacji surowy produkt analizowano drogą SDS-PAGE z 10% buforem żele Bis-Tris /MOPS NuPAGE (Invitrogen, Carlsbad, USA), jak opisano w instrukcjach podanych przez Invitrogen. Żel barwi się w ciągu nocy za pomocą odczynnika barwiącego Roti-Blue Coomasie (Roth, Karlsruhe, Niemcy).

Wynik doświadczenia jest przedstawiony na Fig. 8. Udane sprzężenie jest wskazywane przez migrację pasma proteiny do wyższych ciężarów cząsteczkowych. Większa szerokość pasma jest spowodowana rozkładem ciężarów cząsteczkowych zastosowanych pochodnych HES i liczbą pochodnych HES związanych z proteiną.

PL 217 085 B1

P r z y k ł a d 20 Preparatywne otrzymywanie produktów sprzężenia HES-EPO

Podsumowanie

Produkty sprzężenia HES-EPO syntezowano drogą sprzęgania (średni ciężar cząsteczkowy 18000 daltonów, stopień podstawienia hydroksylami 0,4) do częściowo (łagodny nadjodan) utlenionych reszt kwasu sialowego na oligosacharydowych łańcuchach rekombinacyjnej ludzkiej EPO. W oparciu o analizę budowy węglowodanów wprowadzone modyfikacje nie wpływały na strukturalną integralność łańcuchów rdzeniowych oligosacharydów ponieważ MALDI/TOF-MS glikanów modyfikowanych za pomocą HES drogą obróbki łagodnym kwasem ujawniły nienaruszone obojętne łańcuchy typu N-acetyloIaktozoaminy, które były nieodróżnialne od łańcuchów obserwowanych w produkcie niemodyfikowanej EPO. Uzyskane wyniki wskazują, że co najmniej 3 reszty niemodyfikowanej HES są przyłączone poprzez cząsteczkę EPO w przypadku otrzymywania EPO, którą poddawano modyfikacji bez uprzedniego częściowego usunięcia kwasu sialowego. Wariant EPO pozbawiony około 50% reszt kwasu sialowego poprzedniej proteiny wykazywał podobną pozorną ruchliwość ciężaru cząsteczkowego w SDS-PAGE (60-110 KDa względem 40 KDa dla standardu EPO według BRP). EPO modyfikowana za pomocą HES jest trwała w standardowych warunkach chromatografii jonowymiennej w temperaturze pokojowej przy pH 3-10.

Próba biologiczna EPO w normohemolitycznym układzie myszy wskazuje, że EPO modyfikowana za pomocą HES ma 2,5-3,0 razy wyższą aktywność właściwą (lU/mg) w tej próbie w porównaniu z międzynarodowym standardem EPO według BRP w oparciu o oznaczanie protein korzystając z wartości absorpcji UV z Farmakopei Europejskiej i metody oznaczania proteiny EPO drogą RP-HPLC, skalibrowanej względem standardowego preparatu EPO według BRT.

P r z y k ł a d 20.1 Materiały i metody (a) Uwalnianie N-związanych oligosacharydów drogą trawienia za pomocą N-glikozydazy

Próbki poddawano w ciągu nocy w temperaturze 37°C inkubacji z 25 jednostkami (zgodnie ze specyfikacją producenta, Roche Diagnostics, Niemcy) rekombinacyjnej PNGazy F. Całkowite trawienie kontrolowano specyficznym przesunięciem ruchliwości proteiny w SDS-PAGE. Wydzielone N-glikany oddzielano od polipeptydu drogą dodania 3 objętości zimnego 100% etanolu i inkubacji w temperaturze -20°C w ciągu co najmniej 2 godzin (Schroeter S et al., 1999). Strąconą proteinę usuwano drogą wirowania w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C z szybkością 13000 obrotów na minutę. Następnie pastylkę poddawano dwóm dodatkowym przemywaniom za pomocą 500 μl ochłodzonego lodem 75% etanolu. Oligosacharydy w zebranych klarownych cieczach znad osadu suszono drogą wirowania próżniowego (koncentrator Speed Vac, Savant Instruments Inc., USA). Przed użyciem próbki glikanów odsalano za pomocą wkładów Hypercarb (25 mg albo 100 mg HyperCarb) w sposób następujący: kolumny przemywano za pomocą 3 x 500 μl 80% (objętościowo) acetonitrylu w 0,1% TFA, a następnie drogą przemywania za pomocą 3 x 500 μl wody. Próbki rozcieńczano wodą do końcowej objętości 300-600 μl przed załadowaniem do wkładu, który następnie energicznie przemywano wodą. Oligosacharydy wymywano za pomocą 1,2 ml (wkłady 25 mg, 1,8 ml w przypadku wkładów 100 mg) 25% acetonitrylu w wodzie zawierającej 0,1% objętościowo kwasu trójfIuorooctowego. Wymyte oligosacharydy zobojętniano za pomocą 2M NH4OH i suszono w koncentratorze Speed Vae. W niektórych przypadkach odsalanie oligosacharydów wydzielonych za pomocą N-glikozydazy prowadzono drogą adsorpcji mieszaniny trawiącej z próbek < 100 μg ogólnych (gliko)protein na 100 mg wkładach Hypercarb.

(b) Analiza oligosacharydów drogą wspomaganej osnową laserowej desorpcyjno/jonizacyjnej spektrometrii masowej z czasem przelotu (MALDI/TOF/TOF-MS)

Stosowano przyrząd Bruker ULTRAFLEX z czasem przelotu (TOF/TOF). Naturalne, odsialilowane oligosacharydy analizowano stosując kwas 2,5-dwuhydroksybenzoesowy jako materiał pochłaniający UV w trybie zarówno dodatnich, jak i ujemnych jonów stosując w obydwóch przypadkach odbicie. W przypadku analiz MS-MS wybrane jony macierzyste poddawano dysocjacji indukowanej laserem (LID), a otrzymane fragmenty jonów oddzielano za pomocą drugiego stopnia TOF (LIFT) przyrządu. Roztwory próbek o objętości 1 μl i przybliżonym stężeniu 1-10 pmol^l mieszano z równymi ilościami danej osnowy. Tę mieszaninę lokalizowano na tarczy ze stali nierdzewnej i przed analizą suszono w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 20.2 Otrzymywanie i charakteryzacja rekombinacyjnej ludzkiej EPO (EPO-GT-1)

EPO poddawano ekspresji z rekombinacyjnych komórek CHO, jak opisano w literaturze (Mueller PP et al., 1999, Dorner AJ et al., 1984), a preparaty charakteryzowano zgodnie ze sposobami opisanymi w Eur. Phar. (Ph. Eur. 4, Monography 01/2002:1316: Erythropoietin concentrated solution).

PL 217 085 B1

Produkt końcowy miał zawartość kwasu sialowego 12 nmoli (+/- 1,5 nmola) na nmol proteiny. Struktury N-związanych oligosacharydów oznaczano drogą HPAEC-PAD i MALDI/TOF-MS, jak opisano w literaturze (Nimtz et al., 1999, Grabenhorst, 1999). Otrzymane preparaty EPO zawierały dwu-, tróji czterosialilowane oligosacharydy (odpowiednio 2-12%, 15-28% i 60-80%, a siarczanowane i pięciosialilowane łańcuchy występowały w małych ilościach. Ogólne cechy charakterystyczne glikozylowania preparatów EPO były podobne do cech preparatu międzynarodowego standardu EPO według BRT.

Izoelektryczny wzór ogniskowania rekombinacyjnej EPO był porównywalny do wzoru preparatu międzynarodowego standardu EPO według BRT, wykazującego odpowiednie izopostacie. U 25% protein EPO nie występowała O-glikozylacja na Ser126 łańcucha polipeptydowego.

P r z y k ł a d 8.3 Otrzymywanie częściowo odsialilowanych postaci EPO

Proteinę EPO GT-1 (2,84 mg/ml) ogrzewano do temperatury 80°C w 20 mM buforze sodowofosforanowym, pH 7,0, a następnie dodano 100 μl 1N H₂SO₄ na 1 ml roztworu EPO. Inkubację kontynuowano odpowiednio w ciągu 5, 10 i 60 minut otrzymując preparaty EPO o różnym stopniu sialilowania. Ocenę ilościową oligosacharydów z 0-4 kwasami sialowymi prowadzono po uwolnieniu oligosacharydów za pomocą N-glikozydazy polipeptydów, a wydzielanie N-związanych łańcuchów prowadzono drogą odsalania stosując wkłady Hypercarb (25 mg HyperSep Hypercarb, Thermo-HypersilKeystone, UK). Preparaty EPO zobojętniano przez dodanie 1N NaOH, zamrażano w ciekłym N2 i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu dalszego wykorzystania.

P r z y k ł a d 20.4 Utlenianie sialilowanych postaci EPO nadjodanem

Do 10 mg EPO niepoddanej obróbce albo potraktowanej łagodnym kwasem, rozpuszczonej w 3,5 ml 20 mM buforu sodowofosforanowego, pH 7,0, dodano 1,5 ml 0,1M buforu sodowooctanowego, pH 5,5, i ochłodzono mieszaninę do temperatury 0°C na łaźni lodowej. Następnie dodano 500 μl 10 mM nadjodanu sodu i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w ciemności w ciągu 60 minut w temperaturze 0°C. Z kolei dodano 10 μl gliceryny i inkubację kontynuowano w ciągu dalszych 10 minut w ciemności. Częściowo utlenione postacie EPO oddzielano od reagentów drogą odsalania stosując koncentratory VIVASPIN (10000 MWCO, PES Viva-science AG, Hannover, Niemcy) zgodnie z zaleceniem producenta przy szybkości 3000 obrotów na minutę w wirówce laboratoryjnej wyposażonej w wirnik pod ustalonym kątem. Po zamrożeniu w ciekłym azocie preparaty EPO przechowywano w końcowej objętości 4 ml w temperaturze -20°C.

100 μg podwielokrotności preparatu częściowo utlenionej EPO poddawano obróbce za pomocą N-glikozydazy, a oligosacharydy wydzielano stosując wkłady Hypercarb, jak opisano poprzednio. Oligosacharydy poddawano odsialilowaniu drogą traktowania łagodnym kwasem i analizowano drogą HPAEC-PAD, a czasy ich retencji porównywano z czasami retencji oryginalnych standardowych oligosacharydów, jak opisano w literaturze (Nimtz et al., 1990 i 1993).

P r z y k ł a d 20.5 Redukcja dwusiarczków EPO za pomocą dwutioerytreitolu mg EPO-GT-1 poddawano inkubacji w 5 ml 0,1M buforu Tris/HCl, pH 8,1, w obecności 30 mM dwutioerytreitolu (DTT) w temperaturze 37°C w ciągu 60 minut. Usuwanie DTT prowadzono stosując koncentrator Vivaspin w temperaturze 4°C i 4 cykle wymiany buforowej. Końcowy preparat zredukowanej EPO zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -20°C w 50 mM buforu sodowooctanowego, pH 5,5.

P r z y k ł a d 20.6 Oznaczanie proteiny EPO

Ilościowe oznaczanie proteiny EPO prowadzono drogą pomiaru absorpcji przy 280 nm zgodnie z Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316: erythropoietin concentrated solution) w kuwecie o długości drogi 1 cm. Poza tym EPO oceniano ilościowo korzystając z metody RP-HPLC i stosując kolumnę RP-C4 (Vydac Protein 04, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US). Metodę HPLC kalibrowano stosując odnośną normę erytropoietyny 1 według BRP (European Pharmacopeia, Conseuil de l'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1).

P r z y k ł a d 20.7 Utlenianie odsialilowanej EPO za pomocą oksydazy galaktozy

4,485 mg całkowicie odsialilowanej EPO poddawano inkubacji w 20 mM buforze sodowofosforanowym, pH 6,8, w obecności 16 μl katalazy (6214 jednostek/200 ml) i 80 μl oksydazy galaktozy (2250 jednostek/ml z Dactylium dendroides (Sigma-Aldrich, Stenheim, Niemcy). Inkubację w temperaturze 37°C prowadzono w ciągu nocy, 2 razy po 20 μl oksydazy galaktozy dodawano po 4 godzinach i po 8 godzinach po rozpoczęciu inkubacji.

P r z y k ł a d 20.8 Przygotowywanie próbek EPO do prób biologicznych

Oczyszczanie EPO z inkubacji preparatów proteiny EPO z aktywną HES, utlenionej za pomocą oksydazy galaktozy

PL 217 085 B1

Oczyszczanie próbek EPO (usuwanie nieprzereagowanych pochodnych HES) prowadzono w temperaturze pokojowej. Mieszaniny po inkubacji EPO (w przybliżeniu 5 mg proteiny EPO) rozcieńczano do 1:10 buforem A (20 mM kwas N-morfolinopropanosulfonowy [MOPS/NaOH] w roztworze H2O, pH 8,0) i stosowano do kolumny zawierającej 3 ml Q-Sepharose HF (Pharmacia kod nr 17-1014-03, partia nr 220211), zrównoważonej za pomocą 10 objętości kolumny (CV) buforu A stosując szybkość przepływu 0,5 ml/min. Kolumnę przemywano za pomocą 6-8 CV buforu A (szybkość przepływu = 0,8 ml/min), a wymywanie prowadzono stosując bufor B (20 mM kwas morfolinoetanosulfonowy [MES/NaOH], 0,5M NaCl w roztworze H2O, pH 6,5) z szybkością przepływu 0,5 ml/min. EPO wykrywano drogą absorpcji przy długości fali 280 nm i wymywano w około 6 ml. Kolumnę regenerowano stosując 3 CV buforu C (20 mM MES, 1,5M NaCl w H2O nastawionej na pH 6,5) i równoważono ponownie stosując 10 CV buforu A (szybkość przepływu = 0,7 ml/min).

Wymianę buforową eluatów EPO otrzymanych z etapu Q-Sepharose prowadzono stosując koncentratory Vivaspin i roztwór soli buforowany fosforanem (PBS) z 3 cyklami wirowania na próbkę każdy. Próbki nastawiano na 2 ml za pomocą PBS i przechowywano w temperaturze -20°C.

Tylko < 25% częściowo odsialilowanych, a następnie utlenionych łagodnym nadjodanem postaci EPO, które poddawano modyfikacji za pomocą HES, otrzymywano z eluatu Q-Sepharose, ponieważ w stosowanych warunkach zasadowe postacie EPO nie wiązały się z Q-Sepharose i występowały w przepływie razem z nieprzereagowanymi pochodnymi HES.

P r z y k ł a d 20.9 Chromatografia anionowymienna przy wysokim pH z impulsowym wykrywaniem amperometrycznym (HPAEC-PAD)

Oczyszczone naturalne i odsialilowane oligosacharydy analizowano drogą chromatografii anionowymiennej przy wysokim pH (HPAE) stosując układ Dionex BioLC (Dionex, USA) wyposażony w kolumnę CarboPac PA1 (0,4 x 24 cm) w połączeniu z impulsowym detektorem amperometrycznym (PAD) (Schroter et al., 1999; Nimtz et al., 1999). Potencjały detektora (E) i czasy trwania impulsów (T) były jak następuje: E1: +50 mV, T1: 480 ms; E2: +500 mV, T2: 120 ms; E3: -500 mV, T3: 60 ms i zakres uzysku 500-1500 nA. Następnie oligosacharydy wstrzykiwano do kolumny CarboPac PA1, którą równoważono za pomocą 100% rozpuszczalnika A. W przypadku oligosacharydów odsialilowanych elucję (szybkość przepływu: 1 ml/min) prowadzono stosując gradient liniowy (0-20%) rozpuszczalnika B w ciągu okresu czasu 40 minut, a następnie liniowy wzrost 20-100% rozpuszczalnika B w ciągu 5 minut. Rozpuszczalnikiem A był 0,2M NaOH w dwukrotnie destylowanej wodzie, a rozpuszczalnik B składał się z 0,6M NaOAc w rozpuszczalniku A. W przypadku oligosacharydów naturalnych kolumnę równoważono za pomocą 100% rozpuszczalnika C (0,1M NaOH w dwukrotnie destylowanej wodzie), a elucję (szybkość przepływu: 1 ml/min) prowadzono stosując gradient liniowy (0-35%) rozpuszczalnika D w ciągu okresu czasu 48 minut, a następnie liniowy wzrost 35-100% rozpuszczalnika D w ciągu 10 minut. Rozpuszczalnik D składał się z 0,6M NaAc w rozpuszczalniku C.

P r z y k ł a d 20.10 Analiza monosacharydowego składu N-glikanów, N-glikanów modyfikowanych za pomocą HES i proteiny EPO drogą GC-MS

Monosacharydy analizowano drogą GC/MS jako odpowiednie metyloglikozydy po metanolizie, ponownym N-acetylowaniu i trójmetylosililowaniu (Chaplin, M.F. (1982) A rapid and sensitive method for the analysis of carbohydrate. Anal. Biochem. 123, 336-341). Analizy prowadzono na spektrometrze masowym z wychwytywaniem jonów Finnigan GCQ (Finnigan MAT Corp., San Jose, CA) z przechodzeniem do trybu EI jonów dodatnich, wyposażonego w 30 m kolumnę kapilarną DB5. Program temperaturowy: 2 min izotermicznie w temperaturze 80°C, a następnie 10 stopni/min do 300°C.

Monosacharydy identyfikowano ich czasem retencji i charakterystycznym wzorcem fragmentacji. Do oceny ilościowej wykorzystywano nieskorygowane wyniki elektronicznej integracji maksimów. Monosacharydy, które dają więcej niż jedno maksimum na skutek anomeryczności i ewentualnie obecności postaci furanoidowej i piranoidowej oceniano ilościowo drogą dodawania wszystkich mniejszych maksimów. Jako związek standardu wewnętrznego stosowano 0,5 ąg mioinozytolu.

P r z y k ł a d 20.11 Wyniki

P r z y k ł a d 20.11(a) Charakteryzowanie N-glikanów EPO-GT-1 potraktowanej łagodnym kwasem (częściowo odsialilowanej)

Preparaty EPO-GT-1 poddawane obróbce łagodnym kwasem w ciągu 5, 10 albo 60 minut analizowano drogą SDS-PAGE przed i po uwolnieniu N-związanych oligosacharydów drogą inkubacji z N-glikozydazą, jak przedstawiono na Fig. 9. N-związane oligosacharydy podawano odwzorowaniu oligosacharydów drogą HPAEC-PAD (Fig. 10). Niepotraktowana EPO-GT-1 zawierała > 90% N-związanych oligosacharydów z 3 albo 4 resztami kwasu sialowego, natomiast po 5 minutach inkubacji

PL 217 085 B1 w obecności łagodnego kwasu < 40% łańcuchów węglowodanowych miało 3 albo 4 reszty kwasu sialowego. HPAEC-PAD odsialilowanych N-glikanów ujawniła stosunek obojętnych oligosacharydów, które wykrywano w przypadku niepotraktowanej EPO-GT-1 i pozostawały trwałe w preparatach poddawanych obróbce kwasowej w ciągu 5, 10 albo 60 minut. MALDI/TOF-MS odsialilowanych glikanów ujawniła, że po obróbce proteiny łagodnym kwasem było obecne < 90% bliskiej fukozy.

P r z y k ł a d 20.11(b) Charakteryzacja EPO-GT-1 potraktowanej nadjodanem

Ruchliwość w SDS-PAGE postaci EPO potraktowanych łagodnym nadjodanem, które były uprzednio poddawane 5- i 10-minutowemu traktowaniu kwasem albo nie były traktowane, jest porównywana na Fig. 12. Warunki stosowane przy utlenianiu nadjodanem kwasów sialowych nie zmieniły wzorca SDS-PAGE preparatów EPO (porównaj Fig. 9). Utlenianie kwasów sialowych dawało w wyniku przesunięcie oligosacharydów w analizie HPAEC-PAD do wcześniejszych czasów elucji (porównaj Fig. 10 i 13).

P r z y k ł a d 20.11(c) Charakteryzacja pochodnych EPO modyfikowanej za pomocą HES (aa) Przebieg czasowy modyfikacji EPO-GT-1-A za pomocą HES za pomocą pochodnej HES X modyfikowanej hydroksyloaminą, wytwarzanej według przykładu 14.4

400 pg modyfikowanej hydroksyloaminą pochodnej HES X dodano do 20 pg EPO-GT-1-A (EPO utleniona łagodnym nadjodanem, niepoddawana hydrolizie kwasowej przed utlenianiem łagodnym nadjodanem) w 20 pl 0,5M buforu NaOAc, pH 5,5, a reakcję zatrzymywano odpowiednio po 30 minutach, 2, 4 i 17 godzinach drogą zamrażania próbek w ciekłym azocie. Następnie próbki przechowywano w temperaturze -20°C do czasu dalszej analizy.

Następnie dodano próbki buforu SDS-PAGE, ogrzewano je do temperatury 90°C i nakładano na żele SDS. Jak przedstawiono na Fig. 14, wydłużanie czasów inkubacji dawało w wyniku większe przesunięcie do wyższego ciężaru cząsteczkowego proteiny. Po 17 godzinach inkubacji w obecności modyfikowanej hydroksyloaminą pochodnej HES X wykrywano rozmyte pasmo proteiny zabarwionej odczynnikiem Coomasie, migrujące w obszarze pomiędzy 60 i 11 KDa, w oparciu o położenie wzorców ciężarów cząsteczkowych (patrz lewa część na Fig. 14). Po potraktowaniu N-glikozydazą większość proteiny przesunęła się w kierunku położenia od-N-glikozylowanej EPO (patrz Fig. 14, prawy żel, strzałka A wskazuje na położenie migracji N-glikozydazy, strzałka B wskazuje na położenie migracji od-N-glikozylowanej EPO, a rozmyte pasmo proteiny widoczne w obszarze pomiędzy wzorcami ciężarów cząsteczkowych 28 KDa i 36 KDa oznacza przypuszczalnie postacie EPO, które są modyfikowane przez HES, i miejsce O-glikozylacja cząsteczki. Z punktu widzenia specyficzności N-glikozydazy wnioskujemy na podstawie tego wyniku, że faktycznie modyfikacja przez HES ma miejsce w utlenionych nadjodanem resztach kwasu sialowego glikanów proteiny EPO.

(bb) Charakteryzacja produktów sprzężenia HES-EPO

Produkty sprzężenia HES-EPO I (pochodzące z EPO-GT-1 po łagodnym utlenianiu nadjodanem, to jest z EPO-GT-1-A), II (pochodzące z EPO-GT-1 poddanej 5-minutowej hydrolizie kwasowej i łagodnemu utlenianiu nadjodanem), III (pochodzące z EPO-GT-1 poddanej 10-minutowej hydrolizie kwasowej i łagodnemu utlenianiu nadjodanem) syntezowano w sposób opisany poprzednio. Włączono także inkubację kontrolną (K) obejmującą niemodyfikowaną EPO-GT-1 w tych samych warunkach buforowych, do której dodano równoważną ilość niemodyfikowanej HES. Mieszaniny inkubacyjne poddawano dalszemu oczyszczaniu dla dalszej biochemicznej analizy pochodnych HES-EPO.

Inkubacje produktów sprzężenia I, II I III oraz inkubację kontrolną K poddawano etapowi oczyszczania na Q-Sepharose, jak opisano w sekcji „Materiał i metody” (Przykład 20.8), w celu usunięcia nadmiaru nieprzereagowanego reagenta HES, którego spodziewano się w przepływie przez kolumnę jonowymienną. Dzięki wysokim ilościom zasadowych postaci EPO zawartych w potraktowanych uprzednio kwasem próbkach II I III oczekiwaliśmy z tych inkubacji w przepływie znacznych ilości produktu w postaci modyfikowanej EPO. Jak przedstawiono na Fig. 15, prawie cały materiał EPO z próbek I był zatrzymywany przez kolumnę Q-Sepharose, natomiast w przybliżeniu tylko 20-30% próbek III i II odzyskiwano we frakcji eluującej przy wysokim stężeniu soli. Cały materiał proteinowy z inkubacji z pochodnymi HES X, zarówno w przepływie, jak i frakcjach eluujących z wysokim stężeniem soli, miał pozornie wyższy ciężar cząsteczkowy w SDS-PAGE w porównaniu z kontrolną EPO.

W celu bardziej szczegółowego scharakteryzowania EPO zmodyfikowanej przez HES próbki A i K (patrz Fig. 13) porównywano z postacią EPO-GT-1-A utlenioną nadjodanem. Próbki poddawano traktowaniu N-glikozydazą i, jak przedstawiono na Fig. 16a i 16b, wydzielanie N-glikanów dawało w wyniku dwa pasma o niskim ciężarze cząsteczkowym w położeniu O-glikozylowanej i nieglikozylowanej postaci EPO standardowego preparatu EPO. W przypadku próbki A wykrywano dalsze pasmo migrujące w położeniu 28 KDa wzorca ciężarów cząsteczkowych, co sugeruje modyfikację przez HES

PL 217 085 B1 w O-glikanie tego wariantu EPO (porównaj Przykład 20.11(c) (aa)). To pasmo (a także wysoko cząsteczkowa postać N-glikozylowanej EPO, trudno modyfikująca się przez HES, patrz Fig. 16a i 16b) znikało po poddaniu próbek łagodnej hydrolizie, co jest zgodne z poglądem, że w utlenionych nadjodanem resztach kwasu sialowego erytropoetyny miała miejsce modyfikacja przez HES.

Podwielokrotności mieszanin po inkubacji z N-glikozydazą poddawano hydrolizie stosując warunki umożliwiające całkowite usunięcie reszt kwasu sialowego (a także pochodnej HES związanej z kwasem sialowym) z oligosacharydów. Po zobojętnieniu absorbowano następnie mieszaniny na małych kolumnach Hypercarb w celu ich odsolenia. Kolumny przemywano starannie wodą, a następnie wymywano związane obojętne oligosacharydy za pomocą 40% acetonitrylu w wodzie zawierającej 0,1% kwasu trójfIuorooctowego. Otrzymane oligosacharydy poddawano MALDI/TOF-MS. Widma odsialilowanych frakcji oligosacharydowych z próbki A, EPO-GT-1-A i próbki K wykazywały identyczne masy dla oligosacharydów typu kompleksu przy m/z = 1810 Da (dwuantenowe), 2175 = trójantenowe, 2540 = czteroantenowe, 2906 = czteroantenowe plus i powtórzenie N-acetylo-laktozaminowe i 3271 = czteroantenowe plus 2 powtórzenia N-acetylolaktozaminowe. Wykrywano małe sygnały odpowiadające brakowi fukozy (-146) i galaktozy (minus 162), co można przypisać warunkom hydrolizy kwasowej stosowanym przy usuwaniu kwasu sialowego (patrz MALDI, Fig. 19, 20 i 21).

W równoległym doświadczeniu mieszaninę po trawieniu N-glikozydazą absorbowano na 1 ml wkładzie RP-C18 (bez uprzedniej kwasowej hydrolizy oligosacharydów), a wymywanie prowadzono za pomocą 5% acetamidu w wodzie zawierającej 0,1% TFA. W tych warunkach proteina EPO była całkowicie zatrzymywana na materiale RP, a oligosacharydy wymywano z kolumny za pomocą 5% acetonitrylu w wodzie zawierającej 0,1% TFA. Od-N-glikozylowaną proteinę EPO wymywano za pomocą 70% acetonitrylu w wodzie zawierającej 0,1% TFA. Frakcje oligosacharydowe z etapu RP-C18 próbki A potraktowanej N-glikozydazą, EPO GT-1-A i próbki K zobojętniano i poddawano odsalaniu stosując wkłady Hypercarb, jak opisano poprzednio. Wydzielone oligosacharydy poddawano odwzorowaniu HPAEC-PAD przed (patrz Fig. 17) i po potraktowaniu łagodnym kwasem w warunkach umożliwiających ilościowe usunięcie kwasów sialowych z glikanów (patrz Fig. 18).

Profil HPAEC-PAD naturalnego materiału otrzymanego z próbki A modyfikowanej przez HES wykazywał tylko zaniedbywalne sygnały oligosacharydów, natomiast oligosacharydy pochodzące z EPO GT-1-A wykazywały ten sam profil glikanów jak profil pokazany na Fig. 13 (próbka oznaczona jako EPO-GT-1 po łagodnym potraktowaniu nadjodanem). Profil wymywania oligosacharydów otrzymanych z kontrolnej próbki EPO (K) dawał oczekiwany wzorzec (porównaj profil na Fig. 10). Dla porównania profil naturalnych oligosacharydów międzynarodowej normy EPO według BRT jest tu włączony dla porównania i jako norma wzorcowa.

Po łagodnej hydrolizie kwasowej wszystkie preparaty oligosacharydowe wykazywały identyczny profil wymywania obojętnych struktur oligosacharydowych (patrz Fig. 18) z oczekiwanym jakościowym i ilościowym składem dwu-, trój- i czteroantenowych łańcuchów węglowodanowych typu kompleksu, jak opisano w sekcji „Metody” dla preparatu EPO, który stosowano w niniejszych badaniach jako materiał wyjściowy. Ten wynik wskazuje, że modyfikacja przez HES próbki EPO daje w wyniku wiązanie kowalencyjne pochodnej HES, która jest odrywana od proteiny EPO przez N-glikozydazę i jest nietrwała wobec kwasów, ponieważ jest usuwana z N-glikanów przy stosowaniu łagodnych warunków obróbki kwasowej, znanych przy odsialilowaniu węglowodanów (patrz Fig. 16a + b).

(cc) Analiza monosacharydowego składu HES-EPO i N-glikanów HES-EPO drogą GC-MS

W celu dalszego potwierdzenia modyfikacji EPO przez HES w N-glikanach cząsteczki próbki EPO trawiono za pomocą N-glikozydazy, a proteiny EPO adsorbowano na wkładach RP-C 18, natomiast materiał oligosacharydowy wymywano, jak opisano wyżej. Jak przedstawiono w Tabeli 3, pochodne glukozy i hydroksyetyloglukozy wykrywano tylko w proteinie EPO, która była poddawana modyfikacji przez HES na resztach cysteinowych i w oligosacharydowych frakcjach próbki EPO A2.

P r z y k ł a d 20.11(d) Próba in vivo biologicznej aktywności EPO modyfikowanej przez HES

Próbę biologiczną EPO w normocytowym układzie myszy prowadzono zgodnie ze sposobami postępowania opisanymi w European Pharmacopeia. Laboratorium, które prowadziło próbę EPO stosowało standardowy preparat według międzynarodowej normy EPO według BRP. W przypadku preparatu A2 EPO modyfikowanej przez HES oznaczono średnią wartość aktywności właściwej 294600 jednostek na mg proteiny EPO, co wskazuje w przybliżeniu na 3-krotnie wyższą aktywność właściwą w porównaniu ze standardowym preparatem EPO według międzynarodowej normy BRP, który został dołączony do próbek wysłanych do prób aktywności.

PL 217 085 B1

Wyniki badań są zebrane w Tabeli 4.

Referencje dla Przykładów 13 do 20:

Nimtz M, Noll G, Paques EP, Conradt HS.

Carbohydrate structures of a human tissue plasminogen activator expressed in recombinant Chinese hamster ovary cells.

FEBS Lett. 1990 Oct., 1; 271(1-2): 14-8.

Domer AJ, Wasley LC, Kaufman RJ.

Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucoseregulated proteins in butyratetreated Chinese hamster ovary cells.

J Biol Chem. 1989 Dec. 5; 264(34): 20602-7.

Mueller PP, Schlenke P, Nimtz Μ, Conradt HS, Hauser H Recombinant glycoprotein quality in proliferationcontrolled BHK-21 cells.

Biotechnol Bioeng. 1999 Dec. 5; 65(5): 529-36.

Nimtz M, Martin W, Wray V, Kloppel KD, Augustin J, Conradt HS.

Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant

BHK-21 cells.

Eur J Biochem. 1993 Apr. 1; 213(1): 39-56.

Hermentin P, Witzel R, Vliegenhart JF, Kamerling JP, Nimtz M, Conradt HS.

Strategy for the mapping of N-glycans by high-ph anionexchange chromatography with pulsed amperometric detection.

Anal Biochem. 1992 Jun; 203(2): 281-9.

Schroter S, Derr P, Conradt HS, Nimtz M, Hale G, Kirchhoff C. Male specific modification of human CD52.

J Biol Chem. 1999 Oct. 15; 274 (42): 29862-73.

T a b e l a 1

Rodzaj linkera	Grupa funkcyjna 1: reakcja z polipeptydem, a zwłaszcza z EPO	Grupa funkcyjna 2: reakcja z HES
A	Hydrazyd (reaktywny z aldehydem)	Maleinoimid (reaktywny z HS)
B	Hydrazyd (reaktywny z aldehydem)	Pirydylodwutio (reaktywny z SH)
C	Jodoalkil (reaktywny z SH)	Ester N-sukcynimidu (reaktywny z aminą)
D	Bromoalkil (reaktywny z SH)	Ester N-sukcynimidu (reaktywny z aminą)
E	Maleinoimid (reaktywny z HS)	Ester N-sukcynimidu (reaktywny z aminą)
F	Pirydylodwutio (reaktywny z SH)	Ester N-sukcynimidu (reaktywny z aminą)
G	Winylosulfon (reaktywny z SH)	Ester N-sukcynimidu (reaktywny z aminą)

Skrót	Nazwa chemiczna	Rodzaj
1	2	3	4
AMAS	Ester N-(a-maleinoimido- acetoksy)sukcynimidu	E	r-Co o
BMPH	N-Hydrazyd kwasu (β-maleinoimidopropionowego) .TFA	A	? £ .Jt Μ, 0

PL 217 085 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
BMPS	Ester N-(β-maleinoimido- propyloksy)sukcynimidu	E	°\ νΛ, °
EMCH	N-Hydrazyd kwasu ε-maleino- imidokapronowego	A	0 o O
EMCS	Ester N-(s-maleinoimidokaproiloksy)sukcynimidu	E	o P i'...............'iV> 0 0
GMBS	Ester N-y-maleinoimidobutyryloksysukcynimidu	E	/0 ox €A.AX> Ó 0
KMUH	N-Hydrazyd kwasu κ-maleinoimidoundekanowego	A	,O /Ύ V 0 ό
LC- SMCC	4-(N-maleinoimidometylo)cyklo- heksano-1-karboksy-(6-amido- kapronian)sukcynimidylu	E	G rf° i \-Υ Y-Z Γ & Π ο ο 0
LC-SPDP	6-(3'-[2-pirydylodwutio]propion- amido)pentanokarboksylan sukcynimidylu	F
MBS	Ester m-maleinoimidobenzoilo-N-hydroksysukcynimidu	E	,0 °Υ A-ο Α ΑΟ 0 θ v=y

PL 217 085 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
M2C2H	Hydrazyd kwasu 4-(N-maleinoimidometylo)-cykloheksano-1-karboksylowego.HCl.1/2 dioksan	A	0 aW\ J α .1/2 ΟΛΟ, ο
MPBH	Hydrazyd kwasu 4-(4-N-maleinoimidofenylo)masłowego.HCl	A	0. uXY cr+HahK A X Α 0
SATA	S-Acetylotiooctan N-sukcynomidylu	H	/° /'A ρ Υ^οΛ^γ' 0 0
SATP	S-Acetylotiopropionian S-sukcynimidylu	H	,0 <Α............Α 0
SBAP	3-(Bromoacetamido)propionian sukcynimidylu	D	ζ° 0
SIA	Jodooctan N-sukcynimidylu	C	/° 0
SIAB	(4-Jodoacetylo)aminobenzoesan N-sukcynimidylu	C	0 Λ- i ζγγζΤ° 0 0 \=J
SMCC	4-(N-Maleinoimidometylo)- cykloheksano-1-karboksylan sukcynimidylu	E	Ρ ςχγγΜ ο ο —2

PL 217 085 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
SMBP	4-(p-Maleinoimidofenylo)maślan sukcynimidylu	E	0. /Ύ° > t 0
SMPH	5-(β-Maleinoimidopropion- amido)pentanokarboksylan sukcynimidylu	E	o ęj> o o 0 0
SMPT	4-Sukcynimidyloksykarbonylo- metylo-a-(2-pirydylodwutio)- toluen	F	I? O Q γ/=\Λ5 o o s'
SPDP	3-(2-Pirydylotio)propionian N-sukcynimidylu	F	%
Sulfo- EMCS	Ester N-(s-maleinoimidokapro- iloksy)sulfosukcynimidu	E	......'-7rYVh ν-Λχ o z9^-/ 0' Na+ ^0 0
Sulfo- GMBS	Ester N-y-maleinoimidobutyryloksysulfosukcynimidu	E	O 0 ......·Ί5 U θ θζ
Sulfo- KMUS	Ester N-(K-maleinoimidoundekanoiloksy)sulfosukcynimidu	E	/° 9.........................................Μ · · 0 0 6 Na+ 0
Sulfo-LC- SPDP	5-(3'-[2-pirydylodwutio]propion- amido)pentanokarboksylan	F	tW 9 η Ϊ s μ j 0 °

PL 217 085 B1 cd. tabeli

1	2	3	4
Sulfo- MBS	Ester m-maleinoimidobenzoilo-N-hydroksysulfosukcynimidu	E	“ΑΧ d o o xf
Sulfo- SIAB	(4-Jodoacetylo)aminobenzoesan sulfosukcynimidylu	C	„Na+o~ o .—j °-ó 7 // / Nt+d» o o '—J
Sulfo- SMCC	4-(N-maleinoimidometylo)cyklo- heksanokarboksylansulfo- sukcynimidylu	E	Na*P‘ 0 0Xd ^dd L/ddd^^0 0 0 '-‘
Sulfo- SMPB	4-(p-Maleinoimidofenylo)maślan sulfosukcynimidylu	E	o ftW p jT^ C '5' 0 0 A 0
Sulfo-LC- SMPT	5-(a-Metylo-a-[2-pirydylotio]tolu- amido)pentanokarboksylan sulfosukcynimidylu	F	Q f? 4-<vs——.y, o Τ'3
SVSB	(4-Winylosulfonylo)benzoesan N-sukcynimidylu	G	3xd 0%

PL 217 085 B1

T a b e l a 3

Analiza monosacharydowego składu glikanów z EPO modyfikowanej przez HES i próbek kontrolnych

**Monosacharyd	I. Glikany z A2	II. Glikany z EPO- GT-1A	III. Glikany z A2	III. Glikany z A2	IV. Glikany z EPO- GT-1A	V. Glikany z K2	VI. proteina EPO modyfikowana cysteiną
Fukoza	1935	3924	2602	2246	4461	2601	2181
Mannoza	6028	11020	9198	6379	11668	6117	6260
Galaktoza	8886	19935	14427	10570	16911	11555	10386
Glukoza	17968	---	---	21196	ślady	ślady	33021
GlcNAc	7839	21310	14440	11360	15953	10503	10498
GlcHe1	5583	---	---	5926	---	---	14857
GlcHe2	1380	---	---	1552	---	---	3775
NeuNAc	5461	822	4504	3895	4871	13562	13003
Inozytol	1230	2310	1620	2050	1320	1134	1087
* Równoważnik proteiny EPO modyfikowanej przez Cys-HES poddawano analizie składu; proteinę EPO wydzielano z mieszaniny po inkubacji z HES drogą chromatografii na kolumnie Q-Sepharose, jak opisano wyżej, i odsalano drogą wirowania stosując urządzenie do rozdzielania Vivaspin 5. ** Oznaczenia monosacharydów prowadzono na podstawie prostych przebiegów GC pertrójmetylosililowanych metyloglikozydów; wartości elektronicznej integracji maksimów podaje się bez poprawki na utratę w czasie postępowania przy otrzymywaniu pochodnych i odzyskiwaniu każdego związku.

T a b e l a 4

Nr próbki	Opis próbki	Obliczona aktywność właściwa próbki EPO (w oparciu o A280 nm i oznaczanie RP-HPLC)
850247	1. EPO A2 modyfikowana przez HES	344000 U/mg
850248	2. EPO-GT-1-A	82268 U/mg
850249	3. Kontrolna EPO K2	121410 U/mg
850250	4. Standard EPO według BRP	86702 U/mg
850251	1. rozcieńczona 4 objętościami PBS	309129 U/mg
850252	2. rozcieńczona 4 objętościami PBS	94500 U/mg
850253	3. rozcieńczona 4 objętościami PBS	114100 U/mg
850254	4. rozcieńczona 4 objętościami PBS	81200 U/mg
850255	1. rozcieńczona 4 objętościami PBS	230720 U/mg

Zastrzeżenia patentowe

Claims (25)

1. Koniugat hydroksyalkiIoskrobi (HAS) i polipeptydu dalej jako HAS-polipeptyd, znamienny tym, że zawiera jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym polipeptyd zawiera jeden lub więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu poprzez N- lub O-związaną glikozylację lub N- i O-związaną glikozylację i każda HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią tych węglowodanowych łańcuchów bocznych, przy czym HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez cząsteczkę linkera i

PL 217 085 B1

HAS i cząsteczka linkera są połączone poprzez koniec redukujący HAS, przy czym HAS jest modyfikowana przez cząsteczkę linkera w taki sposób, że zawiera wolną hydrazydową, hydroksyloaminową, tiolową albo semikarbazydową grupę funkcyjną.

2. HAS-polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd jest pochodzenia ludzkiego.

3. HAS-polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z erytropoetyny (EPO), interleukin, zwłaszcza interleukiny-2, IFN-β, IFN-alfa, CSF, interleukiny-6 i przeciwciał terapeutycznych.

4. HAS-polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że węglowodanowe łańcuchy boczne zostały przyłączone do polipeptydu w czasie jego wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzi, owadów albo drożdży.

5. HAS-polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że HAS jest sprzężona z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią węglowodanowych łańcuchów bocznych i które jest utlenione.

6. HAS-polipeptyd według zastrz. 5, znamienny tym, że HAS jest sprzężona z resztą galaktozową węglowodanowych łańcuchów bocznych.

7. HAS-polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że zawiera 1-12, korzystnie 1-6 albo 1-3, a zwłaszcza 1-4 cząsteczek HAS na cząsteczkę polipeptydu.

8. HAS-polipeptyd według któregokolwiek z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że HAS jest wybrana z grupy składającej się z hydroksyetyloskrobi, hydroksypropyloskrobi i hydroksybutyloskrobi.

9. HAS-polipeptyd według zastrz. 8, znamienny tym, że HAS jest hydroksyetyloskrobią (HES).

10. HAS-polipeptyd według zastrz. 9, znamienny tym, że HES ma masę cząsteczkową od 1 do 300 kDa, korzystnie od 5 do 100 kDa.

11. HAS-polipeptyd według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że HES wykazuje molowy stopień podstawienia od 0,1 do 0,8 i stosunek podstawienia C2:C6 w zakresie 2-20 w stosunku do grup hydroksyetylowych.

12. Sposób wytwarzania koniugatu hydroksyalkiloskrobi (HAS) i polipeptydu dalej jako HASpolipeptyd, znamienny tym, że obejmuje etapy w których:

a) dostarcza się polipeptyd, wspomniany polipeptyd zawiera jeden lub więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych przyłączonych do polipeptydu poprzez N- lub O-związaną glikozylację lub N- i O-związaną glikozylację,

b) dostarcza się zmodyfikowaną HAS, przy czym HAS jest modyfikowany na swoim końcu redukującym za pomocą cząsteczki linkera, w taki sposób, iż obejmuje wolną hydrazydową, hydroksyloaminową, tiolową albo semikarbazydową grupę funkcyjną i

c) poddaje się reakcji polipeptyd z etapu a) z HAS z etapu b), wytwarzając HAS-polipeptyd zawierający jedną albo więcej cząsteczek HAS, przy czym każda HAS jest sprzężona poprzez cząsteczkę linkera z polipeptydem poprzez ugrupowanie węglowodanowe, które jest częścią węglowodanowych łańcuchów bocznych.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd pochodzenia ludzkiego.

14. Sposób według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że polipeptyd wybiera się z grupy składającej się z erytropoetyny (EPO), interleukin, zwłaszcza interleukiny-2, ΙΡΝ-β, IFN-alfa, CSF, interleukiny-6 i przeciwciał terapeutycznych.

15. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 12 do 14, znamienny tym, że polipeptyd wytwarza się na drodze rekombinacji.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że węglowodanowe łańcuchy boczne zostały przyłączone do polipeptydu w czasie jego wytwarzania w komórkach ssaków, a zwłaszcza ludzi, owadów albo drożdży.

17. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w etapie a) polipeptyd modyfikuje się drogą utleniania co najmniej jednego ugrupowania węglowodanowego, korzystnie co najmniej jednej końcowej jednostki cukrowej, korzystniej galaktozy, jednego albo więcej węglowodanowych łańcuchów bocznych polipeptydu.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że końcową jednostkę cukrową utlenia się po częściowym albo całkowitym (enzymatycznym i/lub chemicznym) usunięciu końcowego kwasu sialowego.

19. Sposób według zastrz. 17 albo 18, znamienny tym, że w etapie c) zmodyfikowaną HAS sprzęga się z utlenioną końcową jednostką cukrową.

PL 217 085 B1

20. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 12 do 19, znamienny tym, że etap c) prowadzi się w medium reakcyjnym zawierającym co najmniej 10% wagowych H2O.

21. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 12 do 20, znamienny tym, że HAS jest hydroksyetyloskrobią (HES), hydroksypropyloskrobią albo hydroksybutyloskrobią, korzystnie hydroksyetyloskrobią (HES).

22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że HAS ma właściwości jak określono w którymkolwiek z zastrz. 10 albo 11.

23. HAS-polipeptyd określony w zastrz. 1 do 11, do stosowania w sposobie leczenia organizmu ludzkiego lub zwierzęcego.

24. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca HAS-polipeptyd określony w którymkolwiek z zastrz. 1 do 11.

25. Kompozycja według zastrz. 24, znamienna tym, że dodatkowo zawiera co najmniej jeden farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.