JP5275293B2 - ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法 - Google Patents
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Description
ンを架橋化合物の第一級アミノ基もしくは第二級アミノ基または2つの架橋化合物と反応
させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、
得られたヒドロキシアルキルデンプン誘導体がさらなる化合物の官能基Yと反応可能な少
なくとも1つの官能基Xを有し、この官能基Yがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール
基、アセタール基、またはチオ基である、ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
特に好ましい実施形態によれば、本発明は、ヒドロキシアルキルデンプンを架橋化合物の
第一級または第二級アミノ基と反応させ、得られた反応生成物を、必要に応じて(オプシ
ョナリー)第2の架橋化合物とさらに反応させ、得られたヒドロキシアルキルデンプン誘
導体がさらなる化合物の官能基Yと反応可能な少なくとも1つの官能基Xを有し、この基
Yがアルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチオ基であり、得
られた反応生成物を、ポリペプチド、好ましくはAT III、IFN−β、またはエリ
スロポエチンなどのポリペプチド、特に好ましくはこれらの官能基Yの少なくとも1つを
含むエリスロポエチンと反応させるプロセスによって得ることができるヒドロキシアルキ
ルデンプン誘導体に関する。特に好ましいヒドロキシアルキルデンプンは、ヒドロキシエ
チルデンプンである。本発明によれば、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロ
キシエチルデンプンを、リンカー化合物と必要に応じて反応前に酸化されたその還元末端
で反応させる。
ロポエチンである。
タール基、またはアセタール基を含むさらなる化合物(例えば、ポリペプチド)と化学結
合を形成することができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。好
ましくは、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、またはアセタール基は、さらなる
化合物の炭水化物部分に含まれる。
ドロキシアルキルデンプンが、式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物(L)と反応するステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物(D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物(L)と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法に関する。
つのヒドロキシアルキル基に置換されたデンプン誘導体をいう。したがって、本発明で使
用される、用語「ヒドロキシアルキルデンプン」は、末端炭水化物部分がヒドロキシアル
キル基R1、R2、および/またはR3(簡単にするために式(I)中にこのように示す。
)を含む化合物に限定されないが、末端炭水化物部分および/またはデンプン分子の残り
の部分のどこかに存在する少なくとも1つの水酸基がヒドロキシアルキル基R1、R2、ま
たはR3に置換された化合物(HAS’)をいう。
基であり得る。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、1〜10個の炭素原子、より好ま
しくは1〜6個の炭素原子、より好ましくは1〜4個の炭素原子、さらにより好ましくは
2〜4個の炭素原子を含む。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、ヒドロキ
シエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含
むことが好ましいが、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特
に好ましい。
に含まれる。
得る。好ましい実施形態によれば、HAS中に含まれる少なくとも1つのヒドロキシアル
キル基は、1つの水酸基を含む。
導体も含まれる。この文脈では、HASが水溶性を維持する場合、アルキル基がハロゲン
基、詳細にはフッ素またはアリール基で置換されることが好ましい。さらに、ヒドロキシ
アルキル基の末端水酸基をエステル化またはエーテル化してもよい。
こともできる。
加えて、本発明の文脈では、他のデンプン誘導体を使用することもできる。例えば、エス
テル化水酸基を含む誘導体が有用である。これらの誘導体は、例えば、2〜12個の炭素
原子を有する非置換モノまたはジカルボン酸の誘導体またはその置換誘導体であり得る。
2〜6個の炭素原子を有する非置換モノカルボン酸の誘導体、特に酢酸誘導体が特に有用
である。この文脈では、アセチルデンプン、ブチルデンプン、およびプロピルデンプンが
好ましい。
いることが有用である。さらに、ジカルボン酸のモノアルキルエステル誘導体も本発明の
文脈で適切である。
て上記と同一のものであり得る。
l,Comprehensive Cellulose Chemistry Vol.
2,1998,Whiley−VCH,Weinheim,New York,espe
cially chapter 4.4,Esterification of Cel
lulose(ISBN 3−527−29489−9)を参照)。
である上記方法に関する。
つで記載することが可能である。
1.置換度は、全てのグルコース部分(DS)に関して置換グルコース単量体部分に対し
て相対的に記載することができる。
2.置換度は、グルコース部分あたりのヒドロキシエチル基数を記載する、「モル置換」
(MS)として記載することができる。
各分子が他と異なる多分散系組成物として存在する。したがって、HESは、異なる分子
量の化合物の混合物である。したがって、特定のHES溶液は、統計的平均を使用した平
均分子量によって決定される。この文脈では、分子数に依存する相加平均としてMnを計
算する。あるいは、Mw(重量平均)は、HESの質量に依存する単位を示す。
0kDaであってよく、平均分子量5〜100kDaがより好ましい。ヒドロキシエチル
デンプンは、さらに、ヒドロエチル基に関して0.1〜0.8のモル置換度およびC2:
C6置換比は2〜20の範囲であり得る。
たは化合物(L)と反応可能なままであるならば特に制限されない。好ましい実施形態に
よれば、R1、R2、およびR3は、独立して、水素または1〜10個の炭素原子を有する
ヒドロキシアルキル基、ヒドロキシアリール基、ヒドロキシアラルキル基、またはヒドロ
キシアルカリール基である。水素および1〜6個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル
基が好ましい。アルキル基、アリール基、アラルキル基、および/またはアルカリール基
は直鎖または分岐鎖であってよく、適切に置換されていてもよい。
個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記方法に関する
。
ドロキシブチル基、ヒドロキシプロピル基(1−ヒドロキシプロピル基、2−ヒドロキシ
プロピル基、3−ヒドロキシプロピル基、1−ヒドロキシイソプロピル基、2−ヒドロキ
シイソプロピル基など)、ヒドロキシエチル基(1−ヒドロキシエチル基、2−ヒドロキ
シエチル基など)、またはヒドロキシメチル基であり得る。水素およびヒドロキシエチル
基が好ましく、水素および2−ヒドロキシエチル基が特に好ましい。
ドロキシエチル基である上記方法に関する。
)中にZ1基が含まれる、官能基Z1と還元末端との反応を介してヒドロキシアルキルデン
プンの還元末端と反応させる。
ロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端は反応前に酸化されている
。
、化学反応条件および/または酸化剤に依存して、カルボキシル基を含む非環式構造を有
するヒドロキシアルキルデンプンが誘導される。
プンは、ラクトン基を含む化合物とカルボキシル基を含む化合物との混合物として存在す
る。混合物中で、各化合物は、任意の考え得る比で存在し得る。
シアルキルデンプンの還元末端を酸化させるため、前記ヒドロキシアルキルデンプンが式
(IIa):
方法の組み合わせにしたがって、ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端を酸化させるこ
とができる。
化させることができるが、例えば、第19628705A1号に記載のアルカリヨウ素液
を使用して実施することが好ましい。
法に関する。
ロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させるが、還元末端が反応前に酸化されていな
い。
シアルキルデンプンの還元末端が酸化されていないため、前記ヒドロキシアルキルデンプ
ンが式(I):
デンプンとのいずれかの間の化学結合の形成を、官能基Z1とヒドロキシアルキルデンプ
ンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によって行う。
の化学結合を形成可能な各官能基を使用することができる。
基であり、R’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラル
キル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリ
ール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロ
アルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をNH基に直接結
合させることができるか、別の実施形態によれば、NH基への酸素架橋によって結合する
ことができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、ア
リールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適
切に置換することができる。好ましい置換として、F、Cl、またはBrなどのハロゲン
を挙げることができる。特に好ましい残基R’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基
であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
C原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
記方法に関する。
し、R’’’’は構造単位−NH−および/または構造単位−(C=G)−(GはOまた
はSである)および/または構造単位−SO2−を含むことが好ましい。より好ましい実
施形態によれば、官能基R’’は、
からなる群から選択される。
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される上記方法に関する。
物(D)と、さらなる化合物(M)とを含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を反応生
成物として得るために、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能な官能基Xを含むヒ
ドロキシアルキルデンプン誘導体を提供することにある。
ことができるなら、特に制限されない。
群から選択される場合、官能基Xは、化学構造−NH−を含むことが好ましい。
、およびアセタール基からなる群から選択され、官能基Xが構造−NH−を含む上記方法
に関する。
であり、R’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキ
ル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリー
ル残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロア
ルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基をNH基に直接結合
させることができるか、別の実施形態によれば、NH基への酸素架橋によって結合するこ
とができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリール残基、アラルキル残基、アリ
ールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルアリール残基を適切
に置換することができる。好ましい置換として、F、Cl、またはBrなどのハロゲンを
挙げることができる。特に好ましい残基R’は水素、アルキル基、およびアルコキシ基で
あり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基がさらにより好ましい。
C原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
記方法に関する。
、R’’’’は構造単位−NH−および/または構造単位−(C=G)−(GはOまたは
Sである)および/または構造単位−SO2−を含むことが好ましい。より好ましい実施
形態によれば、官能基R’’は、
からなる群から選択される。
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される上記方法に関する。
からなる群から選択される。
からなる群から選択される上記方法に関する。
させ、得られた反応生成物を化合物(L)とさらに反応させ、化合物(L)と反応生成物
との間の化学結合を、化合物(L)中に含まれる官能基Z2と反応生成物の一部である化
合物(D)中に含まれる官能基Wとの反応によって形成される。
C−C二重結合またはC−C−三重結合または芳香族C−C結合;
チオ基または水酸基;
アルキルスルホン酸ヒドラジド、アリールスルホン酸ヒドラジド;
1,2−ジオール;
1,2−アミノアルコール;
アミノ基−NH2または構造単位−NH−を含むアミノ基の誘導体(アミノアルキ
ル基、アミノアリール基、アミノアラルキル基、またはアルカリールアミノ基など
);
ヒドロキシルアミノ基−O−NH2または構造単位−O−NH−を含むヒドロキシ
ルアミノ基の誘導体(ヒドロキシルアルキルアミノ基、ヒドロキシルアリールアミ
ノ基、ヒドロキシルアラルキルアミノ基、またはヒドロキサルアルカリールアミノ
(hydroxalalkarylamino)基など);
アルコキシアミノ基、アリールオキシアミノ基、アラルキルオキシアミノ基、また
はアルカリールオキシアミノ基(それぞれ構造単位−NH−O−を含む);
カルボニル基、−Q−C(=G)−M(式中、GはOまたはSであり、Mは、例え
ば、
−OHまたは−SH;
アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、またはアルカリー
ルオキシ基;
アルキルチオ基、アリールチオ基、アラルキルチオ基、またはアルカリール
チオ基;
アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、アラルキルカ
ルボニルオキシ基、アルカリールカルボニルオキシ基;
N−ヒドロキシスクシニミドなどのイミド構造または構造単位O−N(式中
、Nはヘテロアリール化合物の一部であるか、G=OおよびQは存在しない
(ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、またはトリクロロフェニ
ル(trochlorophenyl)などの置換アリール残基を有するア
リールオキシ化合物など))を有するヒドロキシルアミンエステルなどの活
性化されたエステル;
であり、Qは存在しないかNHまたはSまたはOなどのヘテロ原子である);
−NH−NH2または−NH−NH−;
−NO2;
ニトリル基;
アルデヒド基またはケト基などのカルボニル基;
カルボキシル基;
−N=C=O基または−N=C=S基;
ヨウ化ビニル基または臭化ビニル基またはトリフラートなどのビニルハライド基;
−C≡C−H;
−(C=NH2Cl)−Oアルキル;
−(C=O)−CH2−Hal基(HalはCl、Br、またはIである);
−CH=CH−SO2−;
構造−S−S−を含むジスルフィド基;
である。)。
。
特定の場合、官能基Wは、好ましくは、
からなる群から選択される。
たは官能基Wが、
からなる群から選択される上記方法に関する。
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択される。この具体例では、官能基WまたはZ2は、それぞれ化学構造−NH−
を含む。
に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官
能基WまたはZ2がそれぞれ化学構造−NH−を含む上記方法に関する。
、構造R’−NH−を有する基であり、R’は水素またはアルキル残基、シクロアルキル
残基、アリール残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基
、またはシクロアルキルアリール残基であり、シクロアルキル残基、アリール残基、アラ
ルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシクロアルキルア
リール残基をNH基に直接結合させることができるか、別の実施形態によれば、NH基へ
の酸素架橋によって結合することができる。アルキル残基、シクロアルキル残基、アリー
ル残基、アラルキル残基、アリールシクロアルキル残基、アルカリール残基、またはシク
ロアルキルアリール残基を適切に置換することができる。好ましい置換として、F、Cl
、またはBrなどのハロゲンを挙げることができる。特に好ましい残基R’は水素、アル
キル基、およびアルコキシ基であり、水素および非置換アルキル基およびアルコキシ基が
さらにより好ましい。
C原子を有する基が好ましい。メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、およびイソプロポキシ基がより好ましい。メチル基
、エチル基、メトキシ基、エトキシ基が特に好ましく、メチル基またはメトキシ基が特に
好ましい。
応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、官能
基WまたはZ2がそれぞれR’−NH−(式中、R’は水素またはメチル基もしくはメト
キシ基である)である上記方法に関する。
’’を有し、R’’は構造単位−NH−および/または構造単位−(C=G)−(GはO
またはSである。)および/または構造単位−SO2−を含むことが好ましい。より好ま
しい実施形態によれば、官能基R’’は、
からなる群から選択される。
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される上記方法に関する。
Wは、所与のさらなる化合物と直接反応することができないが、所望の方法で反応可能な
ように化学修飾することができる基であり得る。
飾されてアルデヒド基またはケト基が形成される1,2−アミノアルコールまたは1,2
−ジオールが挙げられる。
たはN−スクシンイミジルヨードアセテートと反応するアミノ基である。
’−Xを有し、L’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在せず、こ
の構造は、化合物(D)がヒドロキシアルキルデンプンと反応するかどうかに依存する。
ト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択される。
合物(L)として以下の化合物が好ましい。
アルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基、
またはシクロアルキルアリール基であってよく、L’は、N、O、Sなどの少なくとも1
つのヘテロ原子を含んでよく、L’を適切に置換し得る。L’基のサイズを特定の要件に
適合させることができる。分離基L’は、一般に、1〜60個、好ましくは1〜40個、
より好ましくは1〜20個まで、より好ましくは1〜10個、より好ましくは16個、特
に好ましくは1〜4個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は、一般
に、1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含む。本
発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基L’は、1〜4個の酸素原子を含む。分離
基L’は、例えば、5〜7個までの炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖、
アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および/または
環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好まし
い実施形態によれば、分離基は、1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1〜
6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を含むアルキル鎖で
ある。ヘテロ原子が存在する場合、1〜4個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
選択されるこの特定の場合に関して、これらのうち、構造Z1−L’−X(L’が存在す
る)を有する化合物(L)として以下の化合物が好ましい。
、D’は官能基を分離する有機残基であり、且つ必要に応じて存在しない。
化合物(D)として以下の化合物が好ましい。
ロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アリールシクロアルキル基、アルカリール基
、またはシクロアルキルアリール基であってよく、D’は、N、O、Sなどの少なくとも
1つのヘテロ原子を含んでよく、D’を適切に置換し得る。D’基のサイズを特定の要件
に適合させることができる。一般に、分離基D’は、一般に、1〜60、好ましくは1〜
40個、より好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜6
個、特に好ましくは1〜4個の炭素原子を有する。ヘテロ原子が存在する場合、分離基は
、一般に、1〜20個、好ましくは1〜8個、特に好ましくは1〜4個のヘテロ原子を含
む。本発明の特に好ましい実施形態によれば、分離基D’は、1〜4個の酸素原子を含む
。分離基D’は、例えば、5〜7個の炭素原子を有する必要に応じて分岐したアルキル鎖
、アリール基、またはシクロアルキル基を含み得るか、アルキル部分が直鎖および/また
は環状アルキル基であり得るアラルキル基、アルカリール基であり得る。さらにより好ま
しい実施形態によれば、分離基は、1〜20個、好ましくは1〜8個、より好ましくは1
〜6個、より好ましくは1〜4個、特に好ましくは2〜4個の炭素原子を含むアルキル鎖
である。ヘテロ原子が存在する場合、1〜4個の酸素原子を含む鎖が特に好ましい。
)は、以下である。
件にしたがって特定の化合物(L)を使用することができる。
む場合、これらのうち、以下の化合物(L)型が好ましい。
からなる群から選択され、官能基Wはチオ基である場合、これらのうち、以下の化合物(
L)型が好ましい。
る。
えば、F、Cl、Br、またはIなどのハライドである。
合物を所定の部位で容易に切断可能である。
プン誘導体がさらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yと反応可能な官能基Xを含み、
官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基からなる群
から選択される化合物(L)の特に好ましい例は、
プン誘導体が化合物(L)中に含まれる官能基Z2と反応可能な官能基Wを含み、ヒドロ
キシアルキルデンプンと化合物(D)と化合物(L)を含む得られたヒドロキシアルキル
デンプン誘導体がさらなる化合物(M)の官能基Yと反応することができ、官能基Yがチ
オ基である化合物(D)の特に好ましい例は、
されていないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
に依存して、化合物(D)または化合物(L)の反応生成物を、異なる構造を有し得る酸
化していないヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
とも10重量%、好ましくは少なくとも50重量%、より好ましくは少なくとも80重量
%、さらにより好ましくは少なくとも90重量%または最大100重量%の範囲の水を含
む溶媒または溶媒混合物をいう。さらなる溶媒(DMSO、DMF、エタノール、または
メタノールなどの溶媒)が挙げられる。
ルデンプン誘導体は、式(IIIa):
ロキシアルキルデンプン誘導体は、式(IIIa)または式(IIIb):
に依存して、式(IIIa)の化合物は、赤道面または軸方向にN原子と共に存在するこ
とができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
に依存して、式(IIIb)の化合物は、E体またはZ体中にC−N二重結合と共に存在
することができ、両形態の混合物は一定の平衡分布でも存在し得る。
a)と(IIIb)の構造を有する上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
、式(IIIa)の化合物を水溶液中で生成および/または使用する場合である。安定化
方法として、式(IIIa)の化合物のアシル化が特に好ましく、特にR’が水素である
場合に好ましい。アシル化試薬として、式(IVa):
ができる。
である。アシル化試薬として、無水カルボン酸、カルボン酸ハライド、およびカルボン酸
活性エステルを使用することが好ましい。
0℃の範囲の温度でアシル化を行う。
て得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
IIIb)の化合物を水溶液中で生成および/または使用する場合である。安定化方法と
して、式(IIIa)の化合物の還元が特に好ましく、特にR’が水素である場合に好ま
しい。還元剤として、式(IVb):
ができる。
H4などのホウ化水素を使用する。
から80℃の範囲の温度で還元を行う。
て得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
Ia)と(IVa)、(IIIa)と(IVb)、(IIIb)と(IVa)、(III
b)と(IVb)、(IIIa)と(IIIb)と(IVa)、(IIIa)と(III
b)と(IVb)、(IVa)と(IVb)と(IIIa)、および(IVa)と(IV
b)と(IIIb)の構造を有し、(IIIa)および/または(IVa)は、赤道面ま
たは軸方向にN原子が存在する構造中に独立して存在することができ、および/または(
IIIb)はE体またはZ体中にC−N二重結合と共に存在し得る化合物の混合物に関す
る。
されたヒドロキシアルキルデンプンの還元末端と反応させる。
性溶媒を使用する。そのうちで好ましい非プロトン性溶媒は、DMSOまたはDMFであ
る。ヒドロキシアルキルデンプンの酸化された還元末端と反応する官能基の化学的性質お
よび他の反応条件に依存して、好ましい反応温度範囲の例は、20℃(室温)から65℃
、反応時間は、一般に、1分から数時間までおよび数日までの範囲である。
ン誘導体は、式(Va):
得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
物(M)との反応が考慮される限り、全ての可能な配列が本発明に含まれる。
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L
)と反応させ、得られた反応生成物を化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M
)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる上記方法に
関する。
シアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と
反応させ、化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物(L
)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらな
る化合物(M)と反応させる上記方法に関する。
まれる官能基Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末
端との反応を介して化合物(D)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
が得られ、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中に含まれる
官能基Z2と、化合物(D)中に含まれる官能基Wとの反応を介して化合物(L)と反応
させて第2のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる上記方法に関する。
(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさ
らなる化合物(M)と反応させる後者の方法に関する。
まれる官能基Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末
端との反応を介して化合物(D)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
が得られ、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(D)中に含まれる
官能基Wと、化合物(L)中に含まれる官能基Z2との反応を介して化合物(L)と反応
させ、化合物(L)を、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化
合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介し
てさらなる化合物(M)と反応させる上記方法に関する。
混合物などの全てのパラメーターを、反応させるべき化合物の特定の要件および化学的性
質に適合することができる。
他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくとも1つの他の溶媒として、DMSO、DMF
、メタノール、およびエタノールが挙げられる。水以外の好ましい溶媒は、DMSO、D
MF、メタノール、およびエタノールである。この実施形態では、ヒドロキシアルキルデ
ンプンを、酸化されていない還元末端を介して反応させることが好ましい。
せ、且つ化合物(D)または化合物(L)がヒドロキシルアミンまたはヒドロアジドであ
る場合、反応温度は、好ましくは5〜45℃の範囲、より好ましくは10〜30℃の範囲
、特に好ましくは15〜25℃の範囲である。
せ、且つ反応が還元的アミノ化である場合、温度は、好ましくは最大100℃の範囲、よ
り好ましくは70〜90℃の範囲、特に好ましくは75〜85℃の範囲である。
本質的に一定に保持することができる。
の要件に適合することができ、一般に、1時間〜7日の範囲である。
反応時間は、好ましくは1時間〜3日、より好ましくは2時間〜48時間の範囲である。
ノ化である場合、反応時間は、好ましくは2時間〜7日の範囲である。
値を、反応物質の化学的性質などの特定の要件に適合することができる。
pH値は、好ましくは4.5〜6.5の範囲である。
ノ化である場合、pH値は、好ましくは8〜12の範囲である。
の適切なpHを調整することができる。好ましい緩衝液のうち、酢酸ナトリウム緩衝液、
リン酸緩衝液、またはホウ酸緩衝液が挙げられる。
と化合物(L)との反応前、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応
生成物と化合物(L)との反応前に、少なくとも1つの官能基Xを、少なくとも1つの適
切な保護基で保護することができる。これに関して、保護された化合物(L)が、少なく
とも1つの官能基Xを介して反応することを妨げる、全ての考え得る保護基が可能である
。したがって、例えば、反応が行われる溶媒または反応混合物のpHから保護すべき官能
基Xの化学的性質に依存して、保護基を選択することができる。これらのうちで、好まし
い保護基は、ベンジルオキシカルボニル基、tert−ブトキシカルボニル基、メトキシ
フェニル基、2,4−ジメトキシフェニル基、トリアリールメチル基、トリチル基、モノ
メトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、モノメチルトリチル基、ジメチルトリチル
基、トリフルオロアセチル基、フタリミン(phthalimin)化合物、2−(トリ
アルキルシリル)エトキシカルボニル化合物、Fmoc、tert−ブチル基、またはト
リアルキルシリル基である。
護することができる一方で、少なくとも1つの他の基を保護しないままにすることができ
る。
知の従来の方法などの適切な方法によって除去することができる。2つの異なる官能基X
を適切な保護基によって保護する場合、少なくとも1つのさらなる化合物(M)とのさら
なる反応に利用可能な少なくとも1つの官能基Xを形成するために少なくとも1つの保護
基を除去し、化合物(L)を含む反応生成物をさらなる化合物(M)と反応させるまで、
少なくとも1つの他の官能基を保護したままにすることが可能である。その後、なおさら
なる化合物(M)との反応に利用可能な官能基Xを残すために、保護されたままの官能基
の保護基を除去することができる。
した化合物(L)または化合物(D)(すなわち、複数のHAS置換化合物(L)または
(D))を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を生成する反応の防止に重要であり得
る。しかし、ヒドロキシアルキルデンプンと過剰な化合物(L)または(D)との反応に
よって同一の結果を得ることができる。過剰量の化合物(L)または(D)を本発明のプ
ロセスで使用する場合、化合物(L)または(D)とヒドロキシアルキルデンプンとのモ
ル比は、好ましくは2〜100の範囲である。
な方法によって反応混合物から単離することができる。必要に応じて、少なくとも1つの
適切な方法によって反応生成物を単離前に沈殿させることができる。
と反応混合物中に存在する溶媒または溶媒混合物以外の少なくとも1つの溶媒または溶媒
混合物とを接触させることが可能である。溶媒として水系を使用する本発明の特に好まし
い実施形態によれば、反応混合物を、好ましくは−20℃から+50℃の範囲、特に好ま
しくは0℃から25℃の範囲の温度でエタノールとアセトンとの混合物(好ましくは同体
積である1:1混合物)に接触させる。
できる。本発明の好ましい実施形態によれば、例えばエタノール−アセトン混合液を用い
て遠心分離または濾過などの適切な方法によって、第1のステップでは、反応生成物を反
応混合物または反応混合物から分離する。第2のステップでは、分離した反応生成物を、
透析、遠心分離濾過または加圧濾過、イオン交換クロマトグラフィ、HPLC、MPLC
、ゲル濾過、および/または凍結乾燥のような後処理などのさらなる処理に供することが
できる。さらにより好ましい実施形態によれば、分離した反応生成物を、最初に好ましく
は水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反応生成物の溶媒含有量が十
分に低くなるまで凍結乾燥させる。20〜35℃、好ましくは25〜30℃の温度で凍結
乾燥させることができる。
むヒドロキシアルキルデンプン誘導体、またはヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D
)と化合物(L)を含むヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、少なくとも1つの官能基
Yを含むさらなる化合物(M)とさらに反応させる。
M)としてポリペプチドを使用する。しかし、他の化合物(M)(ポリマー、オリゴマー
、もしくは単分子化合物、またはこれらの2つ以上の混合物)も可能である。
−(C=O)−NH−を有する結合)を介して結合した少なくとも2つのアミノ酸を含む
化合物をいう。ポリペプチドは、天然に存在する化合物または天然に存在しないポリペプ
チドであってよく、後者には、天然に存在するアミノ酸および/または天然に存在しない
少なくとも1つのアミノ酸が含まれる。ポリペプチドの骨格(ポリペプチド鎖)は、少な
くとも1つの適切な置換基と置換され、それにより少なくとも1つの側鎖を有する。少な
くとも1つの官能基Yは、ポリペプチド骨格の一部または骨格の少なくとも1つの置換基
の一部であってよく、具体的には、ポリペプチド骨格の一部である少なくとも1つの官能
基およびポリペプチド骨格の少なくとも1つの置換基の一部である少なくとも1つの官能
基を含む実施形態が可能である。
、制限はない。前記官能基Yを、ポリペプチド骨格または骨格の側鎖の一部に直接結合さ
せることができる。側鎖もしくは官能基Yのいずれか一方またはその両方は、天然に存在
するポリペプチドの一部であり得るか、官能基Xとの反応前に天然に存在するポリペプチ
ドまたは少なくとも一部が天然に存在しないポリペプチドに導入することができる。
。好ましい実施形態では、ポリペプチドはヒト供給源に由来する。
ンチトロンビン(AT)、インターロイキン、詳細には、インターロイキン2、IFN−
β、INF−α、G−CSF、CSF、インターロイキン6、および治療用抗体であり得
る。
AT III(Levy JH,Weisinger A,Ziomek CA,Ech
elard Y,Recombinant Antithrombin:Product
ion and Role in Cardiovascular Disorder,
Seminars in Thrombosis and Hemostasis 27
,4(2001)405−416;Edmunds T,Van Patten SM,
Pollock J,Hanson E,Bernasconi R,Higgins
E,Manavalan P,Ziomek C,Meade H,McPherson
J,Cole ES,Transgenically Produced Human
Antithrombin:Structural and Functional
Comparison to Human Plasma−Derived Antit
hrombin,Blood 91,12(1998)4661−4671;Minne
ma MC,Chang ACK,Jansen PM,Lubbers YTP,Pr
att BM,Whittaker BG,Taylor FB,Hack CE,Fr
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flammatory responses in baboons lethally
chal−lenged with Escherichia coli,Blood
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le ES,McPherson JM,Edmunds T,Oxidation o
f Methionine Residues in Antithrombin,J.
Biol.Chemistry 274,15(1999)10268−10276)で
ある。
1a(Avonex(登録商標)、REBIF(登録商標)を参照のこと)およびIFN
−β1b(BETASERON(登録商標)を参照のこと)である。
例えば、Nagata et al.,The chromosomal gene s
tructure and two mRNAs for human granulo
cyte colony−stimulating factor,EMBO J.5:
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man granulocyte colony−stimulating facto
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stability of NeupogenR(Filgrastim),a rec
ombinant hu−man granulocyte−colony stimu
lating factor,in:Formulalion,characteriz
ation,and stability of protein drugs,Rod
ney Pearlman and Y.John Wang,eds.,Plenum
Press,New York,1996,303−328を参照。
ペプチドは以下において異なり得る。例えば、分子量、アミノ酸の数および/または配列
、置換基の数および/または化学的性質、またはジスルフィド結合などの適切な化学結合
によって結合したポリペプチド鎖数。
反応生成物、または化合物(L)とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合
物(D)との反応生成物を、好ましくは少なくとも1つの上記プロセスにしたがって単離
し、その後少なくとも1つの官能基Yを有するポリペプチドと反応させる。本発明の好ま
しい実施形態によれば、官能基Yは、ポリペプチドの炭水化物部分に含まれる。
ケトンおよびその化学修飾物をいう(Rompp Chemielexikon,Thi
eme Verlag Stuttgart,Germany,9th edition
1990,Volume 9,pages 2281−2285およびその参考文献を
参照)。さらに、炭水化物部分はまた、グルコース、ガラクトース、マンノース、シアル
酸などの天然に存在する炭水化物部分の誘導体をいう。この用語には、化学的に酸化され
た天然に存在する炭水化物部分も含まれる。酸化された炭水化物部分の構造は、環状また
は直鎖であり得る。
化物部分は、炭水化物側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側
鎖の末端部分である。
、好ましくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下
記の末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、ヒドロキシアルキルデンプンと化合
物(L)との反応生成物、またはさらに化合物(L)と反応させるヒドロキシアルキルデ
ンプンと化合物(D)との反応生成物中に含まれる官能基Xとの反応に提供することがで
きる。
成物、またはさらに化合物(L)と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D
)との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖の末端シア
ル酸残基に連結する。
での処理が挙げられる(Chamow et al.,1992,J.Biol.Che
m.,267,15916−15922)。
化することが可能である。しかし、厳しい条件(10mM過ヨウ素酸塩にて室温で1時間
)と対照的な穏やかな条件(1mM過ヨウ素酸塩、0℃)の選択により、好ましくは、炭
水化物側鎖の末端シアル酸を酸化することが可能である。
当分野で公知であり、例えば、ガラクトースの場合、酵素はガラクトースオキシダーゼで
ある。末端ガラクトース部分の酸化を意図する場合、例えば、炭水化物鎖にシアル酸を結
合させることができるように遺伝子操作された哺乳動物細胞中もしくは細胞中で炭水化物
鎖にシアル酸を結合させることができる細胞中でポリペプチドが産生された場合に、最終
的に末端シアル酸(部分または全部)を除去する必要がある。化学的または酵素的シアル
酸除去方法は当分野で公知である(Chaplin and Kennedy(eds.
),1996,Carbohydrate Analysis:a practical
approach,especially Chapter 5 Montreuil
l,Glycoproteins,pages 175−177;IRL Press
Practical approach series(ISBN 0−947946−
44−3))。
がって、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)との反応生成物、または化合物(L
)とさらに反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成物を、S
原子が、ポリペプチド中に含まれる任意のチオ基に由来し得るチオエーテル基を介してポ
リペプチドに結合することができる。
ンと化合物(D)との反応生成物をポリペプチドと反応させることが特に好ましい。
プンと化合物(D)との反応生成物をポリペプチド中に含まれるチオ基を介してポリペプ
チドと反応させる上記方法に関する。
プンと化合物(D)との反応生成物を、酸化された炭水化物部分およびポリペプチド中に
含まれるチオ基を介してポリペプチドと反応させる上記方法に関する。
プチドにチオ基を導入することが可能である。特に、化学的方法が挙げられる。ポリペプ
チド中にジスルフィド結合が存在する場合、チオ基を得るために−S−S−構造を還元す
ることが可能である。アミノ基を介したポリペプチドと少なくとも2つの異なる官能基(
そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がSH基またはSH基の前駆体で
ある)を有する化合物との反応によって、ポリペプチド中に存在するアミノ基をSH基に
変換することも可能である。アミノ基のこの修飾を、最初にタンパク質を少なくとも2つ
の異なる官能基(そのうちの一方がアミノ基と反応することができ、他方がSH基である
)を有する化合物(L)と反応させ、次いで、得られた反応生成物を例えば、HASおよ
び化合物(D)を含むHAS誘導体(SH基と反応可能な官能基を含む)と反応させる例
と見なすことができる。システインまたは適切なSH官能アミノ酸のポリペプチドへの導
入、またはポリペプチド中の別のシステインがジスルフィド結合を形成することをできな
くするためのポリペプチドからのシステインの除去などによるポリペプチドの変異によっ
てSHを導入することも可能である。
。
,An improved method for the purification
of human erythropoietin with high in vi
vo activity from the urine of anemic pat
ients,Biol.Pharm.Bull.17(2),180−4;Miyake
,Kung,Goldwasser,1977,Purification of hu
man erythropoietin.,J.Biol.Chem.,252(15)
,5558−64を参照のこと)または別の哺乳動物供給源に由来し得るか、ヒトの腎臓
、ヒト胚肝臓または動物、好ましくはサルの腎臓のような天然に存在する供給源からの精
製によって得ることができる。さらに、表現「エリスロポエチン」または「EPO」は、
1つ以上のアミノ酸(例えば、1〜25個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜
5個、より好ましくは1個または2個)が他のアミノ酸と交換されており、且つエリスロ
ポエチン活性を示すEPO変異型も含む(例えば、EP640619B1号を参照)。エ
リスロポエチン活性の測定は当分野で説明されている(インビトロでの活性の測定につい
ては、例えば、Fibi et al.,1991,Blood,77,1203 ff
;Kitamura et al,1989,J.Cell Phys.,140,32
3−334を参照のこと;インビボでのEPO活性の測定については、Ph.Eur.2
001,911−917;Ph.Eur.2000,1316 Erythropoie
tini solutio concentrata,780−785;Europea
n Pharmacopoeia(1996/2000);European Phar
macopoeia,1996,Erythropoietin concentrat
ed solution,Pharmaeuropa.,8,371−377;Fibi
,Hermentin,Pauly,Lauffer,Zettlmeissl.,19
95,N− and O−glycosylation muteins of rec
ombinant human erythropoietin secreted f
rom BHK−21 cells,Blood,85(5),1229−36を参照;
(1日目、2日目、および3日目にEPOおよび修飾EPO形態(タンパク質50ng/
マウスと等量)を雌NMRIマウスに注射し、4日目に血液サンプルを採取し、網状赤血
球を決定した)。EPO活性の測定を試験したさらなる刊行物は、Barbone,Ap
aricio,Anderson,Natarajan,Ritchie,1994,R
eticulocytes measurements as a bioassay
for erythropoietin,J.Pharm.Biomed.Anal.,
12(4),515−22;Bowen,Culligan,Beguin,Kenda
ll,Villis,1994,Estimation of effective a
nd total erythropoiesis in myelodysplasi
a using serum transferrin receptor and e
rythropoietin concentrations,with automa
ted reticulocyte parameters,Leukemi,8(1)
,151−5;Delorme,Lorenzini,Giffin,Martin,J
acobsen,Boone,Elliott,1992,Role of glyco
sylation on the secretion and biological
activity of erythropoietin,Biochemistry
,31(41),9871−6;Higuchi,Oheda,Kuboniwa,To
monoh,Shimonaka,Ochi,1992;Role of sugar
chains in the expression of the biologic
al activity of human erythropoietin,J.Bi
ol.Chem.,267(11),7703−9;Yamaguchi,Akai,K
awanishi,Ueda,Masuda,Sasaki,1991,Effects
of site−directed removal of N−glycosyla
tion sites in human erythropoietin on it
s production and biological properties,J
.Biol.Chem.,266(30),20434−9;Takeuchi,Ino
ue,Strickland,Kubota,Wada,Shimizu,Hoshi,
Kozutsumi,Takasaki,Kobata,1989,Relations
hip between sugar chain structure and bi
ological activity of recombinant human e
rythropoietin produced in Chinese hamste
r ovary cells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85(
20),7819−22;Kurtz,Eckardt,1989,Assay met
hods for erythropoietin,Nephron.,51(1),1
1−4(German);Zucali,Sulkowski,1985,Purifi
cation of human urinary erythropoietin o
n controlled−pore glass and silicic acid
,Exp.Hematol.,13(3),833−7;Krystal,1983,P
hysical and biological characterization
of erythroblast enhancing factor(EEF),a
late acting erythropoietic stimulator in
serum distinct from erythropoietin,Exp.
Hematol.,11(1),18−31である。
、好ましくは哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞、またはEPOの組換え産生
に都合の良い任意の他の細胞型が含まれる。さらに、EPOを、トランスジェニック動物
(例えば、ミルク、血液などの体液)、トランスジェニックトリの卵(特に、家禽類、好
ましくはニワトリ)、またはトランスジェニック植物中に発現することができる。
ターでの宿主細胞のトランスフェクション、ポリペプチドの産生および宿主細胞からのポ
リペプチドの精製が可能な条件下での宿主細胞の培養が含まれる。詳細な情報については
、例えば、Krystal,Pankratz,Farber,Smart,1986,
Purification of human erythropoietin to
homogeneity by a rapid five−step procedu
re,Blood,67(1),71−9;Quelle,Caslake,Burke
rt,Wojchowski,1989,High−level expression
and purification of a recombinant human
erythropoietin produced using a baculov
irus vector,Blood,74(2),652−7;EP 640 619
B1 and EP 668 351 B1を参照。
48605B2号を参照のこと)。
わち、EPOはグリコシル化されている)、1つ以上の炭水化物側鎖、好ましくは1〜1
2個、より好ましくは1〜9個、さらにより好ましくは1〜6個、特に1〜4個、特に好
ましくは4個の炭水化物側鎖を含み得る。通常、EPOが真核細胞中で産生される場合、
ポリペプチドは翻訳後にグリコシル化される。したがって、炭水化物側鎖を、哺乳動物細
胞(特にヒト細胞)、昆虫細胞、または酵母細胞中での生合成時にEPOに結合させるこ
とができた。グリコシル化EPOの構造および特性は、当分野で広く研究されている(欧
州特許428267B1号;欧州特許第640619B1号;Rush,Derby,S
mith,Merry,Rogers,Rohde,Katta,1995,Micro
heterogeneity of erythropoietin carbohyd
rate structure,Anal Chem.,67(8),1442−52;
Takeuchi,Kobata,1991,Structures and func
tional roles of the sugar chains of huma
n erythropoietins,Glycobiology,1(4),337−
46(Review)を参照)。
とも1個、好ましくは1〜12個、より好ましくは1〜9個、さらにより好ましくは1〜
6個、特に好ましくは1〜4個のHAS分子を含み得る。EPO分子あたりのHAS分子
数を、生成物の加水分解および得られた単糖の誘導体化後のGC−MSを使用した定量的
炭水化物組成分析によって決定することができる(Chaplin and Kenne
dy(eds.),1986,Carbohydrate Analysis:a pr
actical approach,IRL Press Practical app
roach series(ISBN 0−947946−44−3),especia
lly Chapter 1,Monosaccharides,page 1−36;
Chapter 2,Oligosaccharides,page 37−53,Ch
apter 3,Neutral Polysaccharides,page 55−
96を参照のこと)。
側鎖の一部である。より好ましくは、炭水化物部分は、炭水化物側鎖の末端部分である。
さらに好ましい実施形態では、炭水化物部分は、炭水化物側鎖のガラクトース残基、好ま
しくは炭水化物側鎖の末端ガラクトース残基である。このガラクトース残基を、下記のよ
うに末端シアル酸の除去およびその後の酸化による、化合物(I)と化合物(II)との
反応生成物との反応に提供することができる。さらに好ましい実施形態では、化合物(I
)と(II)との反応生成物を、炭水化物側鎖のシアル酸残基、好ましくは炭水化物側鎖
の末端シアル酸残基に結合させる。シアル酸は、下記のように酸化される。
よる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)との反応生成物、またはさらに化合物
(L)と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成物との官能
基Xを介した反応に提供することができる。
ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)との反応生成物、またはさらに化合物(L)
と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成物との官能基Xを
介した反応に提供することができる。
らに化合物(L)と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成
物を、EPO中に含まれるチオ基と反応させる。
)と反応させるヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成物を、チオ基お
よび炭水化物部分(これらはそれぞれ少なくとも1つのさらなる化合物、好ましくはポリ
ペプチド、より好ましくはエリスロポエチン中に含まれる)と反応させることも可能であ
る。
誘導体(例えば、2−(アミノオキシ)エチルメルカプタンヒドロクロリド)の使用(B
auer L.et al.,1965,J.Org.Chem.,30,949)また
はヒドラジン誘導体(例えば、チオグルコール酸ヒドラジド)の使用(Whitesid
es et al.,1977,J.Org.Chem.,42,332)によって酸化
された炭水化物部分に結合させることができる。
部分、より好ましくはEPOの酸化された炭水化物側鎖の一部である酸化された炭水化物
部分に導入する。
より好ましくは、EPOは、ヒトEPOのアミノ酸配列を有し、天然に存在するシステイ
ンはシステイン29および/または33である。より好ましい実施形態では、ヒドロキシ
アルキルデンプンと化合物(L)との反応生成物、またはさらに化合物(L)と反応させ
るヒドロキシアルキルデンプンと化合物(D)との反応生成物をシステイン29と反応さ
せ、システイン33を別のアミノ酸と置換する。あるいは、ヒドロキシアルキルデンプン
と化合物(L)との反応生成物、またはさらに化合物(L)と反応させるヒドロキシアル
キルデンプンと化合物(D)との反応生成物をシステイン33と反応させ、システイン2
9を別のアミノ酸と置換する。
生型ポリペプチド中に存在しないシステイン残基を含むことを示す。
たさらなるアミノ酸であり得る。
換することによって付加システインを付加することができた。好ましくは、本発明のこの
態様の文脈では、EPOはヒトEPOであり、置換アミノ酸残基はセリン126である。
D)、さらなる化合物(M)との反応に関する反応条件については特定の制限はなく、反
応条件を特定の要件に調整することができる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、
溶媒として水を単独または少なくとも1つの他の溶媒と組み合わせて使用する。少なくと
も1つの他の溶媒として、DMSO、DMF、メタノール、またはエタノールが挙げられ
る。水以外の好ましい溶媒は、メタノールおよびエタノールである。他の好ましい実施形
態によれば、DMSO、DMF、メタノール、もしくはエタノール、またはこれらの2つ
またはそれ以上の混合物を溶媒として使用する。
、ヒドロキシエチルデンプンをデンプンの酸化されていない還元末端の反応を介してO−
[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンなどのヒドロキ
シルアミンと反応させるような場合、且つ反応生成物を、アルデヒド基、ケト基、アセタ
ール基、またはヘミアセタール基を介してポリペプチド、好ましくはエリスロポエチンと
さらに反応させる場合、反応温度は、好ましくは4〜37℃、より好ましくは10〜30
℃、特に好ましくは15〜25℃の範囲である。
含む反応生成物を、天然および組換えEPOの精製のための公知の手順(例えば、サイズ
エクスクルージョンクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、RP−HPLC、
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、またはそ
の組み合わせ)の使用によって単離することができる。1つ以上のステップを含み得る適
切なプロセスによって、反応生成物を単離することができる。本発明の好ましい実施形態
によれば、第1ステップにおいて、遠心分離または濾過などの適切な方法によって、エタ
ノール−アセトン混合液を用いて反応生成物を反応混合物または反応混合物との混合物か
ら分離する。第2ステップでは、分離した反応生成物を、透析、遠心分離濾過または加圧
濾過、イオン交換クロマトグラフィ(例えば、Q−sepharoseを含むカラムなど
による)、HPLC、MPLC、ゲル濾過、および/または凍結乾燥のような後処理など
のさらなる処理に供することができる。1つの好ましい実施形態によれば、分離した反応
生成物を、最初に好ましくは水に対して透析し、生成物の所望のスペックにしたがって反
応生成物の溶媒含有量が十分に低くなるまで凍結乾燥させる。20〜35℃、好ましくは
25〜30℃の温度で凍結乾燥させることができる。別の好ましい実施形態によれば、反
応生成物を含む反応混合物をQ−Sepharoseを含むカラムに供して、例えば遠心
分離濾過によって濃縮された溶離物が得られる。
プン誘導体を提供することにある。
とができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体において、前記ヒドロキシアルキルデンプ
ンが、式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物(L)と反応するステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物(D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物(L)と反応するステップとを含んでなり、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
は直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘
導体に関する。
素または2−ヒドロキシエチル基である上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関す
る。
シエチルデンプンである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
ミアセタール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記官能基Xが、構造−
NH−を含む上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
り、Rはメチルである。)
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
が、
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
であり、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
活性化されたエステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシ
ル基からなる群から選択され、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
り、Rはメチルである。)
からなる群から選択される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
、化合物(D)または化合物(L)との反応前に酸化されていないため、前記ヒドロキシ
アルキルデンプンが、式(I):
端が、化合物(D)または化合物(L)との反応前に酸化されているため、前記ヒドロキ
シアルキルデンプンが、式(IIa):
て酸化される上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を
介して化合物(L)と反応させ、得られた反応生成物を化合物(L)中に含まれる官能基
Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応
させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を
介して化合物(L)と反応させ、化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの
反応前に、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yと
の反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる上記のヒドロキシアルキルデンプン誘
導体に関する。
(D)中に含まれる官能基Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化
された還元末端との反応を介して化合物(D)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体を得て、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中
に含まれる官能基Z2と、化合物(D)中に含まれる官能基Wとの反応を介して化合物(
L)と反応させて第2のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を得る上記のヒドロキシアル
キルデンプン誘導体に関する。
を、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応
を介してさらなる化合物(M)と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体
に関する。
(D)中に含まれる官能基Z1と、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化
された還元末端との反応を介して化合物(D)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体が得られ、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(D)
中に含まれる官能基Wと、化合物(L)中に含まれる官能基Z2との反応を介して化合物
(L)と反応させ、化合物(L)を、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との
反応前に、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yと
の反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、上記のヒドロキシアルキルデンプン
誘導体に関する。
ポリペプチドである上記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
記のヒドロキシアルキルデンプン誘導体に関する。
必要に応じて化合物(D)、およびエリスロポエチンとの反応によって形成されるヒドロ
キシアルキルデンプン誘導体は、接合前のエリスロポエチンと比較した場合に改良された
生体安定性を示すという利点を有する。さらに、標準的なBRP−EPOよりも高い生物
活性を示す。これは、主に、このヒドロキシアルキルデンプン誘導体が肝臓および腎臓の
除去系によってあまりまたは全く認識されないため、より長期間循環系に存在し続けると
いう事実に起因する。さらに、HASは結合部位特異的であるので、HASのEPOへの
接合によるEPOのインビボ生物活性の破壊リスクが最小になる。
HAS−EPO接合体は、組換え未変性EPOと本質的に同一のインビトロ生物活性を示
し得る。インビトロ生物活性の決定方法は、当分野で公知である。
ないPO)よりも高いインビボ活性を示す。インビボ生物活性の決定方法は、当分野で公
知である。
は、110〜500%、好ましくは300〜400%、または好ましくは110〜300
%、より好ましくは110〜200%、より好ましくは110〜180%、または110
%〜150%、最も好ましくは110〜140%のインビボ活性を示し得る。
、高シアリル化EPOのインビボ活性を100%とした場合、HAS−EPOは、高シア
リル化EPOのインビボ活性の好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも
70%、さらにより好ましくは少なくとも85%、または少なくとも95%、少なくとも
150%、少なくとも200%、または少なくとも300%を示す。より好ましくは、高
シアリル化EPOのインビボ活性の少なくとも95%を示す。
識が低く、且つより高い分子量により腎臓クリアランスが減少するので、HAS−EPO
接合体が非接合体化EPOよりも長く循環系に保持されるという事実に由来する。循環系
中のEPOのインビボ半減期の決定方法は、当分野で公知である(Sytkowski,
Lunn,Davis,Feldman,Siekman,1998,Human er
ythropoietin dimers with markedly enhanc
ed in vivo activity,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,95(3),1184−8)。
S−EPO接合体が得られることが本発明の大きな利点である。標準的なEPO製剤が少
なくとも3日毎に投与しなければならないのに対して、本発明のHAS−EPO接合体は
、好ましくは1週間に2回、より好ましくは1週間に1回投与される。
含まない(例えば、インビボ生物活性が低いか全くないことが公知の低シアリル化EPO
形態を精製する必要がない)ので、有効なEPO誘導体を低コストで生成することができ
るという利点を有する。詳細には、実施例8.11(d)は、低修飾工程で精製されたH
ES−EPOが標準BRP EPOの3倍の活性を示すことを証明している。
組成物を提供することにある。
AS−EPO接合体、より好ましくはHES−EPO接合体を含む薬学的組成物に関する
。好ましい実施形態では、薬学的組成物は、エリスロポエチン治療で有用な少なくとも1
つの薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバント、および/またはキャリアをさらに含む。
得ることができる治療有効量のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物に
おいて、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物(L)と反応するステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンとその必要に応じて酸化された還元末端での化
合物(D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物(L)と反応するステップを含んでなり、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択され、
前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプン、
化合物(L)、および必要に応じて化合物(D)を含む反応生成物をさらなる化合物(M
)と反応させるステップを更に含み、
前記少なくとも1つのさらなる化合物がポリペプチドである、
薬学的組成物に関する。
調製のための上述のヒドロキシアルキルデンプン誘導体の使用に関する。
T IIIである上記薬学的組成物に関する(Levy JH,Weisinger A
,Ziomek CA,Echelard Y,Recombinant Antith
rombin:Production and Role in Cardiovasc
ular Disorder,Seminars in Thrombosis and
Hemostasis 27,4(2001)405−416;Edmunds T,
Van Patten SM,Pollock J,Hanson E,Bernasc
oni R,Higgins E,Manavalan P,Ziomek C,Mea
de H,McPherson J,Cole ES,Transgenically
Produced Human Antithrombin:Structural a
nd Functional Comparison to Human Plasma
−Derived Antithrombin,Blood 91,12(1998)4
661−4671;Minnema MC,Chang ACK,Jansen PM,
Lubbers YTP,Pratt BM,Whittaker BG,Taylor
FB,Hack CE,Friedman B,Recombinant human
antithrombin III improves survival and
attenuates inflammatory responses in bab
oons lethally challenged with Escherichi
a coli,Blood 95,4(2000)1117−1123;Van Pat
ten SM,Hanson EH,Bernasconi R,Zhang K,Ma
navaln P,Cole ES,McPherson JM,Edmunds T,
Oxidation of Methionine Residues in Anti
thrombin,J.Biol.Chemistry 274,15(1999)10
268−10276)。
βである薬学的組成物に関する。
記の薬学的組成物に関する。
一般式Z1−L’−Xの化合物であり、前記官能基Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
からなる群から選択され、L’はZ1およびXと架橋する有機鎖であるか、L’は存在し
ない、上記の薬学的組成物に関する。
タール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物(L)が一般式Z1
−L’−Xの化合物であり、前記官能基Z1が、
り、R’は、メチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、L’はZ1およびXと架橋する有機鎖であるか、L’は存在し
ない、上記の薬学的組成物に関する。
式Z1−D’−Wの化合物であり、前記化合物(L)が一般式Z2−L’−Xの化合物であ
り、前記官能基Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
からなる群から選択され、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が−SHであり、前記官能
基Z2または前記官能基Wが、
からなる群から選択されるか、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が上記の活性化された
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択され、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記D’がZ1およびWと架橋する有機鎖であるか、D’は存
在せず、前記L’がZ2およびXと架橋する有機鎖であるか、前記L’は存在しない、上
記の薬学的組成物に関する。
タール基、およびアセタール基からなる群から選択され、前記化合物(D)が一般式Z1
−D’−Wの化合物であり、前記化合物(L)が一般式Z2−L’−Xの化合物であり、
前記官能基Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が−SHであり、前記官能
基Z2または前記官能基Wが、
からなる群から選択されるか、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が上記の活性化された
エステルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる
群から選択され、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記D’がZ1およびWと架橋する有機鎖であるか、前記D’
は存在せず、前記L’がZ2およびXと架橋する有機鎖であるか、前記L’は存在しない
、上記の薬学的組成物に関する。
:
関する。
素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
化し、その後反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する上記の薬学的組成物に関する。
に基づいて生成されたヒドロキシアルキルデンプン誘導体を含む薬学的組成物を除く。
特に適切である。
得られる量をいう。エリスロポエチンイソ型の投与は、非経口経路によることが好ましい
。選択した特定の経路は、治療を受ける病態に依存する。適切なキャリア(ヒト血清アル
ブミンなど)、適切な希釈剤(緩衝化生理食塩水など)、および/または適切なアジュバ
ントを含む処方物の一部としてエリスロポエチンイソ型の投与を行うことが好ましい。必
要な投薬量は、患者のヘマトクリット値を上昇させるのに十分な量であり、治療を受ける
病態の重症度および使用する投与方法などに依存して変化する。
中ヘモグロビン値の増加である。これのために、薬学的組成物を、ヘモグロビン値が0.
6mmol/l/週〜1.6mmol/l/週との間に増加する方法で投与することがで
きる。ヘモグロビン値が8.7mmol/lを超える場合、好ましくは、ヘモグロビン値
が8.1mmol/l未満になるまで治療を中断するべきである。
使用する。これのために、適切な賦形剤およびキャリアは、例えば、注射用のリン酸二水
素ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、塩素酸ナトリウム、ポリソルベート80、H
SA、および水である。組成物を、1週間に3回、好ましくは1週間に2回、より好まし
くは1週間に1回、最も好ましくは2週間毎に投与することができる。
重、0.1〜1μg/kg体重、または0.2〜0.9μg/kg体重、最も好ましくは
0.3〜0.7μg/kg体重、最も好ましくは0.4〜0.6μg/kg体重の量の薬
学的組成物を投与する。
gの投薬量を投与する。
プチドに関する。
調製のための本発明のHAS−EPO接合体の使用に関する。
はR体もしくはS体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し得る。
合物(D)はR体もしくはS体中または各キラル中心に関するラセミ化合物として存在し
得る。
明の範囲を決して制限しない。
誘導体の形成
実施例1.1 ヒドロキエチルデンプンと1,3−ジアミノ−2−ヒドロキシプロパンと
の反応
0D、DS=0.4))を含む5ml水溶液に、0.83mmolの1,3−ジアミノ−
2−ヒドロキシプロパン(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)
および50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を添加した。得られ
た混合物を、80°Cで17時間インキュベートした。160mlのアセトンとエタノー
ルの冷1:1混合液(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収
し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ
、Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)
、凍結乾燥させた。
ミノ−2−ヒドロキシプロパンおよび50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaC
NBH3)の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを25
℃で3日間行った。
の反応
0D、DS=0.4))を含む5ml水溶液に、0.83mmolの1,2−ジヒドロキ
シ−3−アミノプロパン(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)
および50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を添加した。得られ
た混合物を、80°Cで17時間インキュベートした。160mlのアセトンとエタノー
ルの冷1:1混合液(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収
し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ
、Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)
、凍結乾燥させた。
キシ−3−アミノプロパンおよび50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNB
H3)の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを25℃で
3日間行った。
Anal.Biochem.134(1983)449−504に記載の過ヨウ素酸塩に
よる反応生成物中の1,2−ジオールの酸化的切断に起因するホルムアルデヒドの定量に
よって間接的に確認した。
0D、DS=0.4))を含む5ml水溶液に、0.83mmolの1,4−ジアミノブ
タン(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)および50mgのシ
アノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を添加した。得られた混合物を、80°
Cで17時間インキュベートした。160mlのアセトンとエタノールの冷1:1混合液
(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して4日
間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio S
cience Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥させた。
ブタンおよび50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)の添加によっ
て得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを25℃で3日間行った。
D、DS=0.4))を含む5ml水溶液に、0.83mmolの1−メルカプト−2−
アミノエタン(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)および50
mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)を添加した。得られた混合物を
、80°Cで17時間インキュベートした。160mlのアセトンとエタノールの冷1:
1混合物(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対
して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perb
io Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥
させた。
−2−アミノエタンおよび50mgのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaCNBH3)
の添加によって得られた混合物をインキュベートすることもでき、これを25℃で3日間
行った。
実施例2.1 ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)に溶解し、8mmolのカルボヒドラジド
(Sigma Aldrich,Taufkirchen,D)を添加した。25℃で1
8時間の撹拌後、160mlのアセトンとエタノールの冷1:1混合液(v/v)に反応
混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、40mlの水に再溶解し、水
に対して3日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Pe
rbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結
乾燥させた。
ihydrazide)との反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)に溶解し、8mmolのアジピン酸ジヒド
ラジド(Lancaster Synthesis,Frankfurt/Main,D
)を添加した。25℃で18時間の撹拌後、160mlのアセトンとエタノールの冷1:
1混合液(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、4
0mlの水に再溶解し、水に対して3日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3
.5KDカットオフ、Perbio Science Deutschland Gmb
H,Bonn,D)、凍結乾燥させた。
ルバジドとの反応
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)に溶解し、8mmolの1,4−フェニレ
ン−ビス−3−チオセミカルバジド(Lancaster Synthesis,Fra
nkfurt/Main,D)を添加した。25℃で18時間の撹拌後、反応混合物に8
mlの水を添加し、懸濁液を4,500rpmで15分間遠心分離した。透明な上清を捨
て、その後160mlのアセトンとエタノールの冷1:1混合液(v/v)に添加した。
遠心分離によって沈殿生成物を回収し、40mlの水に再溶解し、4,500rpmで1
5分間遠心分離した。透明な上清を、水に対して3日間透析し(SnakeSkin透析
チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science Deutschla
nd GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥させた。
−エチル]−ヒドロキシルアミンとの反応
5−5492に記載のように、市販の材料から2工程でO−[2−(2−アミノオキシ−
エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを合成した。
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)に溶解し、8mmolのO−[2−(2−
アミノオキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを添加した。25℃で18時
間の撹拌後、160mlのアセトンとエタノールの冷1:1混合液(v/v)に反応混合
物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、40mlの水に再溶解し、水に対
して3日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perb
io Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥
させた。
実施例3.1 ヒドロキシエチルデンプンとカルボヒドラジドとの反応
0.4、ドイツ特許第196 28 705 A1号にしたがって調製)を3mlの無水
ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、15mmolのカルボヒドラジド(Sig
ma Aldrich,Taufkirchen,D)を含む15ml DMSOの混合
物に窒素下で滴下した。65℃で88時間の撹拌後、160mlのアセトンとエタノール
の冷1:1混合液(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し
、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、
Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn,D)、
凍結乾燥させた。
ルバジドとの反応
0.4、ドイツ特許第196 28 705 A1号にしたがって調製)を3mlの無水
ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、15mmolの1,4−フェニレン−ビス
−3−チオセミカルバジド(Lancaster Synthesis,Frankfu
rt/Main,D)を含む15ml DMSOの混合物に窒素下で滴下した。65℃で
88時間の撹拌後、160mlのアセトンとエタノールの冷1:1混合液(v/v)に反
応混合物を添加した。遠心分離によって沈殿物を回収し、水に対して4日間透析し(Sn
akeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science
Deutschland GmbH,Bonn,D)、凍結乾燥させた。
0 D、DS=0.4、ドイツ特許第196 28 705 A1号にしたがって調製)
を3mlの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、0.47ml(15mmo
l)のヒドラジドを含む15ml DMSOの混合物に窒素下で滴下した。40℃で19
時間の撹拌後、160mlのエタノールとアセトンの1:1混合液(v/v)に反応混合
物を添加した。遠心分離によって沈殿生成物を回収し、40mLの水に再溶解し、0.5
%(v/v)トリエチルアミン水溶液に対して2日間および水に対して2日間透析し(S
nakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science
Deutschland GmbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた。
2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを合成した(Botur
yn,Boudali,Constant,Defrancq,Lhomme,1997
,Tetrahedron,53,5485)。
0 D、DS=0.4、ドイツ特許第196 28 705 A1号にしたがって調製)
を3mlの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、2.04g(15mmol
)のO−[2−(2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを含む
15ml DMSOの混合物に窒素下で滴下した。65℃で48時間の撹拌後、160m
lのエタノールとアセトンの1:1混合液(v/v)に反応混合物を添加した。遠心分離
によって沈殿生成物を回収し、40mLの水に再溶解し、水に対して4日間透析し(Sn
akeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science
Deutschland GmbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた。
thesis,Frankfurt/Main,D)を65℃の20mlの無水ジメチル
スルホキシド(DMSO)に溶解し、1.44g(0.12mmol)のオキソ−HES
10/0.4(分子量10,000 D、DS=0.4、ドイツ特許第196 28
705 A1号にしたがって調製)を3mlの無水DMSOに溶解し、窒素下で滴下した
。60℃で68時間の撹拌後、200mlの水に反応混合物を添加した。反応生成物を含
む溶液を、0.5%(v/v)トリエチルアミン水溶液に対して2日間および水に対して
2日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio
Science Deutschland GmbH,Bonn,Germany)、
凍結乾燥させた。
0 D、DS=0.4、ドイツ特許第196 28 705 A1号にしたがって調製)
を3mlの乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、1.51ml(15mmo
l)の1,4−ジアミノブタン(Sigma Aldrich,Taufkirchen
,D)を含む15ml DMSOの混合物に窒素下で滴下した。40℃で19時間の撹拌
後、160mlのエタノールとアセトンの1:1混合液(v/v)に反応混合物を添加し
た。遠心分離によって沈殿物(Amino−HES10KD/0.4)を回収し、40m
Lの水に再溶解し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5
KDカットオフ、Perbio Science Deutschland GmbH,
Bonn,Germany)、凍結乾燥させた。
実施例8に記載のように酸化エリスロポエチンを生成した。酸化エリスロポエチンとし
て、実施例8.11(c)に記載のEPO−GT−1を使用した(酸加水分解していない
、マイルド過ヨウ素酸塩酸化したEPO−GT−1)。
体化
実施例5.1 酸化エリスロポエチンと実施例2.1の反応生成物との反応
酸化EPO(1.055μg/μl)を含む20mM PBS緩衝液を、5M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。19μlのEPO溶液、実施例2
.1で生成された18μlのHES誘導体溶液(分子量18kD;18.7μg/μlを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))を添加し、混合物を25℃で16時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitrogenによって提供さ
れた説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tris Gels/MOP
S緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS
−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Rot
h,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
酸化EPO(1.055μg/μl)を含む20mM PBS緩衝液を、5M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。19μlのEPO溶液、実施例2
.3で生成された18μlのHES誘導体溶液(分子量18kD;18.7μg/μlを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))を添加し、混合物を25℃で16時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitrogenによって提供さ
れた説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tris Gels/MOP
S緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS
−Pageによって分析した。
酸化EPO(1.055μg/μl)を含む20mM PBS緩衝液を、5M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。19μlのEPO溶液、実施例2
.4で生成された18μlのHES誘導体溶液(分子量18kD;18.7μg/μlを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))を添加し、混合物を25℃で16時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitrogenによって提供さ
れた説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tris Gels/MOP
S緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS
−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Rot
h,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
酸化EPO(1.055μg/μl)を含む20mM PBS緩衝液を、5M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。19μlのEPO溶液、実施例3
.1で生成された18μlのHES誘導体溶液(分子量10kD;18.7μg/μlを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))を添加し、混合物を25℃で16時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitrogenによって提供さ
れた説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tris Gels/MOP
S緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS
−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Rot
h,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
酸化EPO(1.055μg/μl)を含む20mM PBS緩衝液を、5M酢酸ナト
リウム緩衝液(pH5.2)でpH5.3に調整した。19μlのEPO溶液、実施例3
.1で生成された18μlのHES誘導体溶液(分子量10kD;18.7μg/μlを
含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2))を添加し、混合物を25℃で16時
間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitrogenによって提供さ
れた説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tris Gels/MOP
S緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS
−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Rot
h,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
241.5μgのエリスロポエチン(EPO−GT−1、実施例8を参照のこと)を含
む500μlの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、5mM EDTA、10mM DTT
(Lancaster,Morcambe,UK)(pH8.3)を37℃で1時間イン
キュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(10 KD MWCO(VIV
ASCIENCE,Hannover,D))を使用した13,000rpmでの遠心分
離濾過によってDTTを除去し、その後ホウ酸緩衝液で3回およびリン酸緩衝液で2回洗
浄した(0.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))。ゲル
を、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一
晩染色する。
ンとの接合体化
以下の各実施例では、架橋化合物としてN−(α−マレイミドアセトキシ)スクシンイ
ミドエステル(AMAS)
反応
実施例2.1にしたがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0
.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50n
molのHES誘導体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Al
drich,Taufkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、
25℃で80分間および40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.
5ml濃縮機(5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))
を使用した13,000rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リ
ン酸緩衝液で4回および30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,CA,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲル
を、Roti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一
晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例2.2にしたがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0
.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50n
molのHES誘導体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Al
drich,Taufkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、
25℃で80分間および40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.
5ml濃縮機(5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))
を使用した13,000rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リ
ン酸緩衝液で4回および30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、R
oti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色
する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例2.3にしたがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0
.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50n
molのHES誘導体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Al
drich,Taufkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、
25℃で80分間および40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.
5ml濃縮機(5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))
を使用した13,000rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リ
ン酸緩衝液で4回および30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、R
oti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色
する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例2.4にしたがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0
.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50n
molのHES誘導体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Al
drich,Taufkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、
25℃で80分間および40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.
5ml濃縮機(5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))
を使用した13,000rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リ
ン酸緩衝液で4回および30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、R
oti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色
する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
80℃で17時間および25℃で3日間のインキュベーション条件で実施例1.1にし
たがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、25℃で80分間お
よび40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5K
D MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))を使用した13,0
00rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回お
よび30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、R
oti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色
する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
80℃で17時間および25℃で3日間のインキュベーション条件で実施例1.3にし
たがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加した。透明な溶液を、25℃で80分間お
よび40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5K
D MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,D))を使用した13,0
00rpmでの遠心分離濾過によって残存するAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回お
よび30分間洗浄した。
むリン酸緩衝液)を添加し、混合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後
、粗生成物を、Invitrogenによって提供された説明書に記載のように、NuP
AGE 10%Bis−Tris Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,
Carlsbad,USA)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、R
oti−Blueクーマシー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色
する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例3.1にしたがって生成し、200μlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(0
.1M、9.15M NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50n
molのHES誘導体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Al
drich,Taufkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、2
5℃で80分間および40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5
ml濃縮機(5KD MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germ
any))を使用した13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、
リン酸緩衝液で4回および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例3.2にしたがって生成し、200μlのリン酸緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、25℃で80分間およ
び40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5KD
MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germany))を使用し
た13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回
および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
反応
実施例3.3にしたがって生成し、200μlのリン酸緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、25℃で80分間およ
び40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5KD
MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germany))を使用し
た13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回
および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
の反応
実施例3.4にしたがって生成し、200μlのリン酸緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、25℃で80分間およ
び40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5KD
MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germany))を使用し
た13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回
および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
の反応
実施例3.5にしたがって生成し、200μlのリン酸緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、25℃で80分間およ
び40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5KD
MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germany))を使用し
た13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回
および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
の反応
実施例3.6にしたがって生成し、200μlのリン酸緩衝液(0.1M、9.15M
NaCl、50mM EDTA(pH7.2))に溶解した50nmolのHES誘導
体に、10μlの2.5μmol AMAS溶液(Sigma Aldrich,Tau
fkirchen,D)を含むDMSOを添加し、透明な溶液を、25℃で80分間およ
び40℃で20分間インキュベートした。VIVASPIN 0.5ml濃縮機(5KD
MWCO(VIVASCIENCE,Hannover,Germany))を使用し
た13,000rpmでの遠心分離濾過によってAMASを除去し、リン酸緩衝液で4回
および30分間洗浄した。
合物を25℃で16時間インキュベートした。凍結乾燥後、粗生成物を、Invitro
genによって提供された説明書に記載のように、NuPAGE 10%Bis−Tri
s Gels/MOPS緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA,US
A)を使用したSDS−Pageによって分析した。ゲルを、Roti−Blueクーマ
シー染色試薬(Roth,Karlsruhe,D)で一晩染色する。
い接合体化が示される。バンド幅の増加は、使用したHES誘導体の分子量分布およびタ
ンパク質に結合したHES誘導体数に起因する。
まとめ
組換えヒトEPOのオリゴサッカリド鎖上の酸化シアル酸残基への部分的な(マイルド
過ヨウ素酸塩)HES誘導体(平均分子量18,000ダルトン;ヒドロキシエチル置換
度0.4)のカップリングによってHES−EPOを合成した。炭水化物構造分析に基づ
いて、マイルド酸処理HES修飾グリカンのMALDI/TOF−MSによって未修飾E
PO生成物で見出される鎖と区別不可能なインタクトな中性N−アセチルラクトサミン鎖
型が明らかとなったので、導入された修飾はコアオリゴサッカリド鎖の構造の完全性に影
響を与えなかった。得られた結果は、事前にシアル酸を部分的に除去しない修飾に供した
EPO調製物の場合、EPO分子あたり少なくとも3つの修飾HES残基が結合すること
を示す。前者タンパク質の約50%のシアル酸残基を欠くEPO変異型は、SDS−PA
GEにおいて類似の見かけ上の高分子量への移動度を示した(BRP EPO標準につい
て40kDaに対して60〜110kDa)。HES修飾EPOは、室温、pH3〜10
での標準的なイオン交換クロマトグラフィ条件下で安定である。
は、欧州薬局方のUV吸収値を使用したタンパク質測定およびBRP EPO標準調製物
に対して較正したRP−HPLC EPOタンパク質測定法に基づく国際BRP EPO
参照標準と比較した場合、このアッセイおいてHES修飾EPOの比活性(IU/mg)
が2.5〜3.0倍であることを示す。
(a)N−グリコシダーゼでの消化によるN結合オリゴサッカリドの遊離
サンプルを、25単位(製造者の説明書に従う、Roche Diagnostics
,Germany)の組換えPNGアーゼFと37℃で一晩インキュベートした。SDS
−PAGE中のタンパク質の特定の移動度シフトによって完全な消化をモニタリングした
。3倍体積の冷100%エタノールの添加および−20℃で少なくとも2時間のインキュ
ベーションによって遊離したN−グリカンをポリペプチドから分離した(Schroet
er S et al.,1999)。沈殿したタンパク質を、4℃、13000rpm
で10分間の遠心分離によって取り出した。次いで、ペレットを、500μlの氷冷75
%エタノールを含む2つのさらなる洗浄に供した。プールした上清中のオリゴサッカリド
を真空遠心分離機(Speed Vac濃縮機、Savant Instruments
Inc.,USA)で乾燥させた。Hypercarbカートリッジ(25mgまたは
100mgのHyperCarb)を以下のように使用して、使用前にグリカンサンプル
を脱塩した。カラムを3×500μlの80%アセトニトリル(v/v)を含む0.1%
TFAで洗浄およびその後3×500μlの水で洗浄した。サンプルを前に水で最終体積
300μl〜600μlに希釈し、その後カートリッジにロードし、水で強く洗浄した。
0.1%トリフルオロ酢酸(v/v)を含む1.2ml(25mgカートリッジ;100
mgカートリッジの場合、1.8ml)の25%アセトニトリル水でオリゴサッカリドを
溶離した。溶離したオリゴサッカリドを、2M NH4OHで中和し、Speed Va
c濃縮機で乾燥させた。いくつかの場合、100μg未満の総(糖)タンパク質サンプル
由来の消化混合物の100mg Hypercarbカートリッジへの吸着によってN−
グリコシダーゼ遊離オリゴサッカリドを脱塩した。
/TOF−MS)によるオリゴサッカリドの分析
Bruker ULTRAFLEX飛行時間型(TOF/TOF)装置を使用した。陽
イオンモードおよび陰イオンモード(両方の場合、反射を使用する)におけるUV吸収材
料として2,5−ジヒドロキシ安息香酸を使用して未変性脱シアリル化オリゴサッカリド
を分析した。MS−MS分析のために、選択した親イオンを、レーザー誘起解離(LID
)に供し、得られたフラグメントイオンを装置の第2のTOFステージ(LIFT)によ
って分離した。1μlで概算濃度1〜10pmolμl-1のサンプル溶液を、等量の各マ
トリックスと混合した。この混合物を、ステンレススチール製の標的にスポッティングし
、分析前に室温で乾燥させた。
記載のようにEPOを組換えCHO細胞から発現させ(Mueller PP et
al.,1999,Dorner AJ et al.,1984)、欧州薬局方に記載
の方法にしたがって調製物を特徴付けた(Ph.Eur.4,Monography 0
1/2002:1316:Erythropoietin concentrated
solution)。タンパク質nMolあたりの最終生成物のシアル酸含有量は、12
nMol(+/−1.5nMol)であった。N結合オリゴサッカリドの構造を、記載の
ようにHPAEC−PADおよびMALDI/TOF−MSによって決定した(Nimt
z et al.,1999,Grabenhorst,1999)。得られたEPO調
製物は、ジ、トリ、およびテトラシアリル化オリゴサッカリド(それぞれ、2〜12%、
15〜28%、および60〜80%であり、硫酸化およびペンタシアリル化鎖が少量存在
していた)を含んでいた。EPO調製物の全体的なグリコシル化特性は、国際BRP E
PO標準調製物の特性と類似していた。
O標準調製物のパターンと類似していた。25%のEPOタンパク質は、ポリペプチド鎖
のSer126にO−グリコシル化を欠いていた。
EPO GT−1タンパク質(2.84mg/ml)を、20mMリン酸ナトリウム緩
衝液(pH7.0)中で80℃に加熱し、1mlのEPO溶液あたり100μlの1N
H2SO4を添加し、それぞれ5分間、10分間、および60分間インキュベーションし続
け、異なるシアリル化度のEPO調製物を得た。ポリペプチドN−グリコシダーゼでのオ
リゴサッカリドの遊離後に0〜4個のシアル酸を有するオリゴサッカリドを定量し、Hy
percarbカートリッジ(25mg HyperSep Hypercarb;Th
ermoHypersil−Keystone,UK)を使用した脱塩によってN結合鎖
を単離した。1N NaOHの添加によってEPO調製物を中和し、液体N2中で凍結し
、さらなる使用まで−20℃で保存した。
3.5mlの20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中に溶解した10mgの
未処理またはマイルド酸処理EPOに、1.5mlの0.1N酢酸ナトリウム緩衝液(p
H5.5)を添加し、混合物を氷浴中で0℃に冷却した;500μlの10mM過ヨウ素
酸ナトリウムを添加し、反応混合物を、暗所にて0℃で60分間保持した。次いで、10
μlのグリセロールを添加し、インキュベーションを暗所でさらに10分間継続した。固
定角ローターを具備した実験用遠心分離機における製造者の説明書にしたがった3000
rpmでVIVASPIN濃縮機(10,000 MWCO,PES Vivascie
nce AG,Hannover,Germany)を使用した脱塩によって部分酸化E
PO型を試薬から分離した。液体窒素中での凍結後、EPO調製物を最終体積4mlで−
20℃にて保存した。
載のようにHypercarbカートリッジを使用してオリゴサッカリドを単離した。オ
リゴサッカリドをマイルド酸処理によって脱シアリル化し、HPAEC−PADによって
分析し、記載のようにその保持時間を信頼のおける標準オリゴサッカリドの保持時間と比
較した(Nimtz et al.,1990 and 1993)。
5mgのEPO−GT−1を、30mMジチオエリトリトール(DTT)の存在下で5
mlの0.1M Tris/HCl緩衝液(pH8.1)中にて37℃で60分間インキ
ュベートし、4℃のVivaspin濃縮機を使用し、緩衝液を4サイクル交換してDT
Tを除去した。最終還元EPO調製物を液体窒素中で凍結し、−20℃の50mM酢酸ナ
トリウム緩衝液(pH5.5)中で保存した。
欧州薬局方(European Pharmacopeia 4,Monograph
y 01/2002:1316:erythropoietin concentrat
ed solution)にしたがった1cm光路のキュベット中での280nmでのU
V吸収の測定によって、EPOタンパク質を定量的に測定した。さらに、RP−C4カラ
ムを使用したRP−HPLC法の適用によってEPOを定量した(Vydac Prot
ein C4,カタログ番号214TP5410,Grace Vydac,Ca,US
);エリスロポエチンBRP1参照基準を使用して、HPLC法を較正した(Europ
ean Pharmacopeia,Conseil de l’Europe B.P
.907−F67029,Strasbourg Cedex 1)。
4.485mgの完全に脱シアリル化されたEPOを、16μlカタラーゼ(6214
単位/200ml)および80μlのガラクトースオキシダーゼ(ドクティリウム・デン
ドロイダス由来の2250単位/ml(Sigma−Aldrich,Steinhei
m,Germany))の存在下で20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.8)中で
インキュベートした;37℃で一晩インキュベートした;インキュベーション開始から4
時間後およ8時間後に20μlのガラクトースオキシダーゼを2回添加した。
過ヨウ素酸塩またはガラクトースオキシダーゼ酸化EPOタンパク質調製物の活性化さ
れたHESとのインキュベーション物からのEPOの精製
EPOサンプルの精製(未反応HES誘導体の除去)を室温で行った。EPOインキュ
ベーション混合物(約5mgのEPOタンパク質)を、緩衝液A(20mM N−モルホ
リンプロパンスルホン酸[MOPS/NaOH]を含む蒸留水(pH8.0))で10倍
希釈し、流速0.5ml/分で10カラム体積(CV)の緩衝液Aで平衡化した3ml
Q−SepharoseHP(Pharmaciaコード番号17−1014−03、ロ
ット番号220211)を含むカラムにアプライした。6〜8CVの緩衝液A(流速=0
.8ml/分)でカラムを洗浄し、流速0.5ml/分で緩衝液B(20mMモルホリン
エタンスルホン酸[MES/NaOH]、0.5M NaClを含む蒸留水(pH6.5
))の使用によって溶離した。280nmのUV吸収によってEPOを検出し、約6ml
で溶離した。3CVの緩衝液C(pH6.5に調整した20mM MES、1.5M N
aClを含む蒸留水)の使用によってカラムを再生し、10CVの緩衝液Aの使用によっ
て再平衡化した(流速0.7ml/分)。
よびリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を使用して、Q−Sepharose工程から得
たEPO溶離物の緩衝液交換を行った;サンプルをPBSで2mlに調整し、−20℃で
保存した。
導体と共に通過したので、HES修飾に供した25%未満の部分脱シアリル化およびその
後マイルド過ヨウ素酸塩酸化EPO形態のみがQ−Sepharose溶離物から得られ
た。
ラフィー(HPAEC−PAD)
精製未変性および脱シアリル化オリゴサッカリドを、パルスドアンペロメトリー検出器
(PAD)と組み合わせたCarboPac PA1カラム(0.4×25cm)を備え
たDionex BioLCシステム(Dionex,USA)を使用した高pH陰イオ
ン交換(HPAE)クロマトグラフィによって分析した(Schroter et al
.,1999;Nimtz et al.,1999)。検出器のポテンシャル(E)お
よびパルス幅(T)は、以下であった。E1:+50mV、T1:480ms;E2:+
500mV,T2:120ms;E3:−500mV,T3:60ms、および出力範囲
は500〜1500nAであった。次いで、オリゴサッカリドを、100%溶媒Aで平衡
化したCarboPac PA1カラムに注入した。脱シアリル化オリゴサッカリドのた
めに、40分間の溶媒Bの直線勾配(0〜20%)およびその後の5分間の20〜100
%の溶媒Bの直線的増加の適用によって溶離した(流速:1ml/分)。溶媒Aは0.2
M NaOHを含む蒸留水であり、溶媒Bは0.6M NaOAcを含む溶媒Aからなる
。未変性オリゴサッカリドのために、カラムを100%溶媒C(0.1M NaOHを含
む蒸留水)で平衡化し、48分間の溶媒Dの直線的勾配(0〜35%)およびその後の1
0分間の35〜100%の溶媒Dの直線増加の適用によって溶離した(流速:1ml/分
)。溶媒Dは、0.6M 酢酸ナトリウムを含む溶媒Cからなる。
Oタンパク質のモノサッカリド組成分析
メタノリシス、N−再アセチル化、およびトリメチルシリル化後の対応するメチルグリ
コシドとしてモノサッカリドをGC/MSによって分析した(Chaplin,M.F.
(1982)A rapid and sensitive method for t
he analysis of carbohydrate.Anal.Biochem
.123,336−341)。30mDB5キャピラリーカラムを具備した陽イオンEI
モードで運転するFinniganGCQイオントラップ質量分析器(Finnigan
MAT corp.,San Jose,CA)によって分析を行った。温度プログラ
ム:80℃の等温で2分間、その後10℃/分で300度まで。
ていない電子的ピーク積分結果を定量に使用した。フラノイド型およびピラノイド型のア
ノメリシティ(anomericity)および/または存在に起因する1つを超えたピ
ークが得られたモノサッカリドを、全ての主なピークの付加によって定量した。内部標準
化合物として0.5μgのミオイノシトールを使用した。
実施例8.11(a)マイルド酸処理(部分脱アシル化)EPO−GT−1のN−グリカ
ンの特徴づけ
5分間、10分間、または60分間のマイルド酸処理に供したEPO−GT−1調製物
を、図7に示すN−グリコシダーゼとのインキュベーションによるN結合オリゴサッカリ
ドの遊離前および遊離後のSDS−PAGEによって分析した。N結合オリゴサッカリド
を、HPAEC−PADオリゴサッカリドマッピングに供した(図8)。未処理EPO−
GT−1が3個または4個のシアル酸残基を有する90%を超えるN結合オリゴサッカリ
ドを含む一方で、マイルド酸の存在下での5分間のインキュベーション後では40%未満
の炭水化物鎖が3個または4個のシアル酸残基を有していた。脱シアリル化N−グリカン
のHPAEC−PADにより、未処理EPO−GT−1について検出された中性オリゴサ
ッカリドの比が明らかとなり、5分間、10分間、または60分間の酸処理に供した調製
物では安定なままである。脱シアリル化グリカンのMALDI/TOF−MSにより、タ
ンパク質のマイルド酸処理後に90%を超える近位フコースが存在することが明らかとな
った。
予め酸に5分間および10分間供したマイルド過ヨウ素酸処理EPO形態または処理し
ていないEPO形態のSDS−PAGE移動度を図10で比較する。シアル酸の過ヨウ素
酸塩活性化に使用した条件は、EPO調製物のSDS−PAGEパターンを変化させなか
った(図7と比較)。HPAEC−PAD分析によるシアル酸の酸化により、オリゴサッ
カリドがより早い溶離時間にシフトされた(図8および11の比較)。
(aa)実施例2.4にしたがって生成されたヒドロキシルアミン修飾HES誘導体Xで
のEPO−GT−1−AのHES修飾の保持時間
400μgのヒドロキシルアミン修飾HES誘導体Xを20μgのEPO−GT−1−
A(マイルド過ヨウ素酸塩酸化前に酸加水分解されていないマイルド過ヨウ素酸塩酸化E
PO)を含む20μLの0.5M NaOAc緩衝液(pH5.5)に添加し、30分後
、2時間後、4時間後、および17時間後に液体窒素中でのサンプルの凍結によって反応
をそれぞれ停止させた。その後サンプルをさらなる分析まで−20℃で保存した。
アプライした。図12に示すように、インキュベーション時間の増加により、タンパク質
のより高い分子量へのシフトが増加した。ヒドロキシルアミン修飾HES誘導体Xの存在
下での17時間のインキュベーション後、分子量標準の位置に基づいて、60kDaと1
1kDaとの間の領域に移動したクーマシー染色タンパク質バンドの拡散が検出された(
図12の左部を参照のこと)。N−グリコシダーゼでの処理中、ほとんどのタンパク質が
脱Nグリコシル化EPOの位置に向かってシフトした(図12の右のゲルを参照のこと;
矢印AはN−グリコシダーゼの移動位置を示し、矢印Bは脱N−グリコシル化EPOの移
動位置を示す;28KDaと36KDaとの間の分子量標準領域中に認められる拡散タン
パク質バンドは、おそらくHESおよび分子のO−グリコシル化部位によって修飾された
EPO形態を示す)。N−グリコシダーゼの特異性を考慮して、この結果から、HES修
飾が実際にEPOタンパク質のグリカンの過ヨウ素酸塩酸化シアル酸残基で起こると結論
付けた。
HES−EPO接合体I(マイルド過ヨウ素酸塩酸化後のEPO−GT−1(すなわち
、EPO−GT−1−A)を起源とする)、II(5分間の酸加水分解およびマイルド過
ヨウ素酸塩酸化に供したEPO−GT−1に由来する)、III(10分間の酸加水分解
およびマイルド過ヨウ素酸塩酸化に供したEPO−GT−1に由来する)を、上記のよう
に合成した。コントロールインキュベーション(K)は、等量の未修飾HESを添加した
同一の緩衝液条件下で未修飾EPO−GT−1を含んでいた。インキュベーション混合物
を、HES−EPO誘導体のその後の生化学分析のためのさらなる精製に供した。
ントロールインキュベーションKを、イオン交換カラムでを通過すると予想される過剰な
未反応のHES試薬を除去するために、「材料と方法」(実施例8.8)に記載のQ−S
epharose精製工程に供した。前に酸処理したサンプルIIおよびIII中に含ま
れる大量の塩基性EPO形態のために、本発明者らは、これらのインキュベーション由来
の大量の修飾EPO生成物が通過すると予想した。図13に示すように、サンプルI由来
のほとんど全てのEPO材料がQ−Sepharoseカラムに保持される一方で、高塩
濃度で溶離した画分中には約20〜30%のサンプルIIIおよびIIしか回収されなか
った。高塩濃度での通過物および溶離画分中のHES誘導体Xとのインキュベーション由
来の全てのタンパク質材料は、コントロールEPOと比較した場合、SDS−PAGEに
おいて見かけ上より高い分子量を示した。
のこと)を、過ヨウ素酸塩酸化形態EPO−GT−1−Aと比較した。サンプルを、N−
グリコシダーゼ処理に供し、図14aおよび14bに示すように、N−グリカンの遊離に
より、標準EPO調製物のO−グリコシル化および非グリコシル化EPO形態の位置に2
つの低分子量バンドが得られた。サンプルAの場合、28KDaの分子量標準の位置に移
動したさらなるバンドが検出され、このEPO変異型のO−グリカンでのHES修飾が示
唆される(実施例8.11(c)(aa)を参照のこと)。このバンド(およびN−グリ
コシル化EPOの高HES修飾高分子量形態、図14aおよび14bを参照のこと)は、
サンプルのマイルド酸加水分解後に消失し、これは、エリスロポエチンの過ヨウ素酸塩酸
化シアル酸残基でHES修飾が起こるという見解と一致する。
シアル酸残基(およびシアル酸結合HES誘導体)を完全に除去することができる条件下
で加水分解し、中和後混合をその脱塩のために小Hypercarbカラムに吸着させた
。カラムを水で強く洗浄し、その後結合した中性オリゴサッカリドを0.1%のトリフル
オロ酢酸を含む40%アセトニトリル水で溶離した。得られたオリゴサッカリドを、MA
LDI/TOF−MSに供した。サンプルA,EPO−GT−1−A、およびサンプルK
由来の脱シアリル化オリゴサッカリド画分のスペクトルにより、m/z=1810Da(
2触角型)、2175=3触角型、2540=4触覚型、2906=4触角型+1N−ア
セチルラクトサミン反復、および3271=4触角型+2N−アセチルラクトサミン反復
での複合体型のオリゴサッカリドについて同一の分子量が示された;シアル酸除去に供し
た酸加水分解条件に寄与するフコース(−146)およびガラクトース(−162)の消
失に対応する小シグナルが検出された(MALDI−図17、18、および19を参照の
こと)。
に吸着させ(オリゴサッカリドを事前に酸加水分解しない)、0.1%TFAを含む5%
アセトニトリル水で溶離した;これらの条件下で、EPOタンパク質はRP−材料上に完
全に保持され、オリゴサッカリドを、0.1%TFAを含む5%アセトニトリル水でカラ
ムから洗浄した。脱N−グリコシル化EPOタンパク質を、0.1%TFAを含む70%
アセトニトリル水で溶離した。N−グリコシダーゼ処理サンプルA、EPO−GT−1−
A、およびサンプルKのRP−C18工程由来のオリゴサッカリド画分を中和し、上記の
Hypercarbカートリッジを使用した脱塩に供した。単離オリゴサッカリドを、グ
ルカンからシアル酸を定量的に除去することができる条件下でのマイルド酸処理前(図1
5を参照のこと)および処理後にHPAEC−PADマッピングに供した(図16を参照
のこと)。
により、オリゴサッカリドについては僅かなシグナルしか示さなかったが、EPO−GT
−1−A誘導オリゴサッカリドは図11と同一のグリカンプロフィールを示した(マイル
ド過ヨウ素酸塩処理後にEPO−GT−1と名づけたサンプル)。コントロールEPOサ
ンプル(K)から得たオリゴサッカリドの溶離プロフィールにより、予想パターンが得ら
れた(図8中のプロフィールと比較)。比較のために、比較および参照標準として、国際
BRP−EPO標準の未変性オリゴサッカリドプロフィールが含まれる。
用したEPO調製物についての方法に記載の2、3、および4触角複合物型炭水化物鎖の
予想される定性的および定量的組成を有する中性オリゴサッカリド構造(図16を参照の
こと)と同一の溶離プロフィールを示した。この結果は、EPOサンプルのHES修飾に
よりN−グリコシダーゼによるEPO−タンパク質から脱離されたHES誘導体の共有結
合が得られ、脱シアリル化炭水化物に公知のマイルド酸処理条件を使用してN−グリカン
を除去するので酸に不安定であることを証明する(図14a+bを参照のこと)。
ッカリド組成分析
分子のN−グリカンでのEPOのHES修飾をさらに確認するために、EPOサンプル
をN−グリコシダーゼで消化し、EPOタンパク質をRP−C18カートリッジに吸着さ
せる一方で、上記のようにオリゴサッカリド材料を洗浄した。表2に示すように、システ
イン残基のHES修飾に供したEPOタンパク質およびEPOサンプルA2のオリゴサッ
カリド画分のみでグルコースおよびヒドロキシエチル化グルコース誘導体が検出された。
欧州薬局方に記載の手順にしたがって正赤血球症マウス系指標におけるEPO−バイオ
アッセイを行った;EPOアッセイを行った実験では、国際BRP EPO参照基準調製
物を使用した。HES修飾EPOA2調製物のために、294,600単位/mgEPO
タンパク質の比活性平均値が測定され、これは、活性アッセイのために得たサンプル中に
含まれる国際BRP EPO参照基準調製物と比較した場合に約3倍の比活性を示す。
Nimtz M,Noll G,Paques EP,Conradt HS.
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.
J Biol Chem.1999 Oct.15;274(42):29862−73
(A)哺乳動物細胞での産生
以下のようにCHO細胞中に組換えEPOを産生した。
ヒトEPOcDNAを保有するプラスミドを、真核生物発現ベクター(pCR3および
その後pCREPOと呼ぶ)にクローン化した。記載の標準的な手順を使用して部位特異
的誘発を行った(Grabenhorst,Nimtz,Costa et al.,1
998,in vivo specificity of human alpha 1
,3/4−fucosyltransferases III−VII in the
biosynthesis of Lewis(x) and sialyl Lewi
s(x) motifs on complex−type N−glycans −C
oexpression studies from BHK−21 cells to
gether with human beta−trace protein,J.B
iol.Chem.,273(47),30985−30994)。
ys−29→Ser/AlaまたはCys−33→Ser/Ala、Ser−126→A
laなど)を安定に発現するCHO細胞を作製し、記載のように硫酸G418を使用して
選択した(Grabengorst et al.)。トランスフェクションから3日後
、細胞を1:5で継代し、10%FBSおよび1.5g/リットル硫酸G418を含むD
MEMで選択した。
週間選択培地で増殖させた。コンフルエントまで成長した単層の細胞培養上清を、ウェス
タンブロット分析およびIEF/ウェスタンブロット分析によってEPO発現レベルを分
析した。
産生された。公開されたプロトコールにしたがって下記の種々のクロマトグラフィ手順の
組み合わせを使用して、異なる量のNeuAc(例えば、2〜8個、4〜10個、8〜1
2個のNeuAc残基)を有するEPOの異なる糖形態を単離した。
Grabenhorst,Conradt,1999,The cytoplasmi
c,transmembrane,and stem regions of glyc
osyltransferases specify their in vivo f
unctional sublocalization and stability
in−the Golgi.,J Biol Chem.,274(51),36107
−16;Grabenhorst,Schlenke,Pohl,Nimtz,Conr
adt,1999,Genetic engineering of recombin
ant glycoproteins and the glycosylation
pathway in mammalian host cells,Glycocon
j J.,16(2),81−97;Mueller,Schlenke,Nimtz,
Conradt,Hauser,1999,Recombinant glycopro
tein product quality in proliferation−co
ntrolled BHK−21 cells,Biotechnology and
bioengineering,65(5),529−536;Schlenke,Gr
abenhorst,Nimtz,Conradt,1999,Constructio
n and characterization of stably transfe
cted BHK−21 cells with human−type sialyl
ation characteristic,Cytotechnology,30(1
−3),17−25。
上記文献に記載の多面体(polyhedrin)プロモーターの調節下でのヒトEP
OcDNAを含む組換えバキュロウイルスベクターでの細胞の感染後に、昆虫細胞株SF
9およびSF21から組換えヒトEPOを産生した。
で感染させ、細胞培養上清中のEPO力価を毎日決定した。Blueセファロースクロマ
トグラフィ、Q−Sepharoseでのイオン交換クロマトグラフィ、および最後にC
4相でのRP−HPLCによってEPOを精製した。
た手順にしたがって、詳細な炭水化物の構造分析(NおよびO−グリコシル化)を行った
。
Grabenhorst,Hofer,Nimtz,Jager,Conradt,1
993,Biosynthesis and secretion of human
interleukin 2 glycoprotein variants from
baculovirus−infected Sf21 cells.Charact
erization ofpolypeptides and posttransla
tional modifications,Eur J Biochem.,215(
1),189−97;Quelle,Caslake,Burkert,Wojchow
ski,1989,High−level expression and purif
ication of a recombinant human erythropo
ietin produced using a baculovirus vecto
r,Blood,74(2),652−7。
1.SH反応性HES
1.1 SH反応性HES12KD Bを形成するためのEMCHとオキソ−HES12
KDとの反応
に付与されたドイツ特許第19628705A1号)を、0.3mLの無水ジメチルスル
ホキシド(DMSO)に溶解し、窒素下で34mg(0.15mmol)のEMCH(P
erbio Science,Deutschland GmbH,Bonn,Germ
any)を含む1.5mLのDMSOの混合物に滴下した。60℃で19時間の撹拌後、
反応混合物を16mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に添加した。記載のよう
に沈殿物を遠心分離によって回収し、3mL DMSO中に溶解し、再度沈殿させた。遠
心分離および真空乾燥によってSH反応性HES12KD Bを得た。チオ−EPOとの
接合反応を、実施例11の2.2に記載する。
この反応では、スペーサーによって分離されたヒドラジドおよびマレイミド官能基を示
す全ての架橋剤を使用することができる。Perbio Science,Deutsc
hland GmbH,Bonn,Germanyから市販されているこの分子群のさら
なる例を表1に示す;「A」で示す。さらに、マレイミド官能基の代わりに活性化された
ジスルフィド官能基を示す別の架橋剤群も使用することができる。
a)グリコシルアミン形成1
1mgのHES12K Dサンプルを、3mLの飽和重炭酸アンモニウムに溶解した。
次いで、30℃で120時間のインキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さ
らなる固体重炭酸アンモニウムを添加した。アミノ−HES12KD Cを、反応混合物
の直接凍結乾燥によって脱塩した。
emistry,31,10733−10740;Manger,Rademacher
,Dwek,1992,Biochemistry,31,10724−10732)
1mgのアミノ−HES12KD Cサンプルを、1mLの1M重炭酸ナトリウムに溶
解し、氷上で冷却した。これに無水クロロ酢酸結晶(約5mg)を添加し、反応混合物を
室温に加温した。pHをモニタリングし、pHが7.0未満に低下した場合にさらなる塩
基を添加した。室温で2時間後、塩基の第2のアリコートおよび無水物を添加した。6時
間後、生成物クロロアセトアミド−HESD1(X=Cl)を、混合ベッドAmberl
ite MB−3(H)(OH)イオン交換樹脂への通過によって脱塩した。
無水ブロモ酢酸をThomas3に記載のように調製した。1mgのアミノ−HES1
2KD Cサンプルを0.1mLの乾燥DMFに溶解し、氷上で冷却し、5mg無水ブロ
モ酢酸を添加した。反応混合物をゆっくり室温にし、溶液を3時間撹拌した。反応混合物
を、−20℃の1mLのエタノールとアセトンとの1:1混合液に添加した。記載のよう
に沈殿物を遠心分離によって回収し、0.1mL DMFに再溶解し、再度沈殿させた。
遠心分離および真空乾燥によってブロモアセトアミド−HESD2(X=Br)を得た。
チオ−EPOとの接合反応は、実施例11の1.2に記載されている。
.Res.,250,195; 3Thomas,1977,Methodes Enz
ymol.,46,362)
ロモ酢酸の代わりに、N−スクシンイミジルヨードアセテートを使用し、全ての工程を暗
所で行った。
アミノ基のアシル化のために、例えば、
−ブロミドまたはクロリド
−エステル(例えば、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、置換フェノールを有する
エステル(p−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、トリクロロフェノールな
ど))などの他の活性形態のハロゲン酸を使用することができる。
有する全ての架橋剤を使用することができる。その例は、SBAPである。この分子およ
び他の分子は、Perbio Science,Deutschland GmbH,B
onn,Germanyから市販されている。これらを、表1で「D」で示す。ハロゲン
アセトアミド−HES誘導体を単離しないチオ−EPOでのアミノ−HESのライゲーシ
ョンのための架橋剤としての使用については、実施例11、12の備考を参照。
a)アミノ−HES12KD Eを得るための1,4−ジアミノブタンとオキソ−HES
12KDとの反応4
1.44g(0.12mmol)のオキソ−HES12KDを3mLの乾燥ジメチルス
ルホキシド(DMSO)に溶解し、窒素下で1.51mL(15mmol)の1,4−ジ
アミノブタンを含む15mLのDMSOの混合物に滴下した。40℃で19時間の撹拌後
、反応混合物を160mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に添加した。沈殿物
(アミノ−HES12KD E)を遠心分離によって回収し、40mLの水に溶解し、水
に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Pe
rbio Science Deutschland GmbH,Bonn,Germa
ny)、凍結乾燥させた。
burg,1998)
セトアミド−HES12KD F1を調製した。
セトアミド−HES12KD F2(X=Br)を調製した。チオ−EPOでの接合反応
は、実施例11の1.2に記載されている。
い。実験は、実施例11の1.1に記載されている。
上記1.2を参照のこと。
2.1 ヒドラジド−HES
オキソ−HES12KDを、3mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、
窒素下で0.47mL(15mmol)のヒドラジンを含む15mLのDMSOの混合物
に滴下した。40℃で19時間の撹拌後、反応混合物を160mLのエタノールとアセト
ンとの1:1混合物に添加した。沈殿生成物Jを遠心分離によって回収し、40mLの水
に溶解し、0.5%(v/v)のトリエチルアミン水溶液に対して2日間および水に対し
て2日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbi
o Science Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
、凍結乾燥させた。酸化グリコ−EPOとの接合反応は、実施例12の2.2に記載され
ている。
1.74g(15mmol)のアジピン酸ジヒドラジドを65℃の20mLの無水ジメ
チルスルホキシド(DMSO)に溶解し、3mL無水DMSOに溶解した1.44g(0
.12mmol)のオキソ−HES12KDを、窒素下で滴下した。60℃で68時間の
撹拌後、反応混合物を200mLの水に添加した。Lを含む溶液を、0.5%(v/v)
のトリエチルアミン水溶液に対して2日間および水に対して2日間透析し(SnakeS
kin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Science Deut
schland GmbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた。酸化グリコ
−EPOとの接合反応は、実施例12の2.2に記載されている。
さらに、2つのヒドラジド基が任意のスペーサーによって分離されている、誘導体を使
用することができる。
0.1mLの飽和炭酸アンモニウム中の1mgの各ハロゲンアセトアミドサンプルの溶
解によってDまたはFのアンモニア分解を個別に行った。次いで、30℃で120時間の
インキュベーション中の溶液の飽和を維持するために、さらなる固体炭酸アンモニウムを
添加した。反応混合物を、−20℃の1mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に
添加した。記載のように沈殿物を遠心分離によって回収し、0.05mLの水に溶解し、
再度沈殿させた。遠心分離および真空乾燥によって生成物アミノHES HまたはIを得
た。酸化グリコ−EPOとの接合反応は、実施例12の4.1に記載されている。
Boturyn et al.に記載のように、市販の材料から2工程でO−[2−(
2−アミノオキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを合成した5。1.44
g(0.12mmol)のオキソ−HES12KDを、3mL無水ジエチルスルホキシド
(DMSO)に溶解し、窒素下で2.04g(15mmol)のO−[2−(2−アミノ
オキシ−エトキシ)−エチル]−ヒドロキシルアミンを含む15mLのDMSOの混合物
に滴下した。65℃で48時間の撹拌後、反応混合物を160mLのエタノールとアセト
ンとの1:1混合物に添加した。沈殿生成物Kを遠心分離によって回収し、40mLの水
に溶解し、水に対して4日間透析し(SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカッ
トオフ、Perbio Science Deutschland GmbH,Bonn
,Germany)、凍結乾燥させた。酸化グリコ−EPOとの接合反応は、実施例12
の3.1に記載されている。
me,1997,Tetrahedron,53,5485)
さらに、2つのヒドロキシルアミン基が2つのスペーサーによって分離されている誘導
体を使用することがきでる。
5.1 オキソ−HES12KDへの添加
スルホキシド(DMSO)に溶解し、窒素下で1.16g(15mmol)のシステアミ
ンを含む15mLのDMSOの混合物に滴下した。40℃で24時間の撹拌後、反応混合
物を160mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に添加した。沈殿生成物Mを遠
心分離によって回収し、40mLの水に溶解し、0.5%(v/v)のトリエチルアミン
水溶液に対して2日間および水に対して2日間透析し(SnakeSkin透析チューブ
、3.5KDカットオフ、Perbio Science Deutschland G
mbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた。酸化グリコ−EPOとの接合反
応は、実施例12の2.1に記載されている。
アミノ基およびチオ官能基が任意のスペーサーで分離されている誘導体を使用すること
ができる。さらに、誘導体中のアミノ基を、ヒドラジン、ヒドラジド、またはヒドロキシ
ルアミンに置換することができる。チオ官能基を、例えば、ジスルフィドまたはトリチル
誘導体の形態で保護することができる。しかし、この場合、接合体化の前にMに類似の化
合物を遊離させるさらなる脱保護工程を行わなければならない。
a)SATA/SATPの修飾
1.44g(0.12mmol)のアミノ−HES12KD E、H、またはIを、3
mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、窒素下で139mg(0.6m
mol)のSATAを含む5mLのDMSOの混合物に滴下した。室温で24時間の撹拌
後、反応混合物を160mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に添加した。沈殿
生成物Nを遠心分離によって回収し、40mLの水に溶解し、水に対して2日間透析し(
SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Scienc
e Deutschland GmbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた
。
ム緩衝液(pH7.5)中にて室温で2時間脱保護を行い、生成物Oを、1mM EDT
Aを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)に対する透析によって精製した。
実施例12の2.1に記載の接合反応の直前に脱保護反応を行った。
1.44g(0.12mmol)のアミノ−HES12KD E、H、またはIを、3
mLの無水ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、窒素下で187mg(0.6m
mol)のSPDPを含む5mLのDMSOの混合物に滴下した。室温で24時間の撹拌
後、反応混合物を160mLのエタノールとアセトンとの1:1混合物に添加した。沈殿
生成物Pを遠心分離によって回収し、40mLの水に溶解し、水に対して2日間透析し(
SnakeSkin透析チューブ、3.5KDカットオフ、Perbio Scienc
e Deutschland GmbH,Bonn,Germany)、凍結乾燥させた
。
4.5)あたり12mgのジチオスレイトール(DTT)を含む溶液にて室温で30分間
脱保護を行い、生成物Qを、1mM EDTAを含む0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(p
H5.5)に対する透析によって精製した。実施例12の2.1に記載の接合反応の直前
に脱保護反応を行った。
遊離形態または保護形態のいずれかでのアミノ基からチオ基への変換のために、いくつ
かの試薬が利用可能である。修飾後、生成物を単離することができる。あるいは、架橋剤
の使用が許容されているので、好ましくは精製工程後に接合反応のためにこれらを直接使
用することができる。チオ−HES誘導体の単離および保存のために、保護形態でのチオ
−HES誘導体の合成は有用であり得る。これについて、任意のスペーサーで分離された
活性エステル官能基およびチオエステル官能基を有するSATAに類似する全ての誘導体
を使用することができる。この群のさらなるメンバーであるSATPは表1で見出され、
「H」で示す。SPDPに類似の誘導体は、任意のスペーサーによって分離された活性エ
ステル官能基およびジスルフィド官能基を有し得る。これらの基のさらなるメンバーは、
表1に見出され、「F」で示す。さらなるアナログ誘導体は、任意のスペーサーによって
分離されたトリチル誘導体として保護された活性エステル官能基およびチオ官能基を有し
得る。
1.チオ−EPOとハロゲンアセトアミド修飾SH反応性HESとの反応
1.1 例示的プロトコール1
NHS活性エステルおよびヨードアセトアミド基(例えば、SIA)を含む架橋剤を使
用した、チオEPOとアミノ−HES12KD(E、H、またはI)の接合6
985,Methods Enzymol.,112,207)
A.ホウ酸緩衝液。組成は、50mMホウ酸ナトリウム(pH8.3)、5mM EDT
Aであった。
B.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)。
C.アミノHES12KD E、H、またはI。1mg/mLを含むホウ酸緩衝液として
調製した。
D.架橋剤ストック溶液:14mgSIAを、1mL DMSOに溶解した。
E.D−Salt(商標)デキストラン脱塩カラム(2×5mLベッド体積)(Perb
io Science Deutschland GmbH,Bonn,Germany
)。
F.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
G.チオEPO溶液:5mg/mLのチオEPO1を含むホウ酸緩衝液。
H.微量濃縮機:MicroconYM−3(amicon,Milipore Gmb
H,Eschborn,Germany)
100μLのSIA溶液を、400μLのアミノHES12KD E溶液に添加し、室
温で0.5時間震盪しながら反応させた。微量濃縮機を使用した14000×gで60分
間のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをホウ
酸緩衝液でその元の体積まで増加させ、このプロセスを2回以上繰り返した。残りの溶液
を、1mLのチオEPO溶液に添加し、反応混合物を室温で16時間インキュベートした
。過剰なヨードアセトアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度10mMの
システインの添加によって停止させた。反応混合物を、PBS緩衝液で平衡化した脱塩カ
ラムにアプライし、クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含
有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一
晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
この反応では、スペーサーによって分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスク
シンイミド官能基およびヨードアセトアミド官能基を有する全ての架橋剤を使用すること
ができる。さらなる例は、表1で見出される。これらを「C」で示し、Perbio S
cience Deutschland GmbH,Bonn,Germanyから市販
されている。
チオEPO1とSH反応性HES12KDブロモアセトアミドD2、F2、またはヨー
ドアセトアミドD3との接合7
材料
A.リン酸緩衝液。組成は、100mMリン酸ナトリウム(pH6.1)、5mM ED
TAであった。
B.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)。
C.SH反応性HES12KDブロモアセトアミドD2。10mg/mLを含むリン酸緩
衝液として調製した。
D.D−Salt(商標)デキストラン脱塩カラム(2×5mLベッド体積)(Perb
io Science Deutschland GmbH,Bonn,Germany
)。
E.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
F.チオEPO溶液:5mg/mLのチオEPO1を含むリン酸緩衝液。
zio,Van der Zee,van Eden,Hoffmann,Verhoe
f,Snippe,1995,Infect.Immun.,63,961)
1mLのSH反応性HES12KDブロモアセトアミドD2溶液および1mLのチオE
PO溶液を合わせ、反応混合物を室温で48時間インキュベートした。過剰なブロモアセ
トアミドの反応を、インキュベーション終了時に最終濃度10mMのシステインの添加に
よって停止させた。反応混合物を、PBS緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライし、
クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリング
した。タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾
燥によって接合体を得た。
SH反応性HES12KD−ブロモアセトアミドD2の単離の代わりに、アミノHES
12KD(E、H、I)を、スクシンイミド官能基およびブロモアセトアミド官能基を介
して架橋剤と結合させることができる(上記1.1を参照のこと)。SBAPは、この架
橋剤群のメンバーであり、表1で見出される(「D」で示す)。
2.1 例示的プロトコール4
チオ−EPOとマレイミド−HES12KD Bとの接合体化
材料
A.マレイミド−HES12KD B:10mg/mLを含む0.1M酢酸ナトリウム緩
衝液(pH5.5)
B.チオEPO溶液:5mg/mLのチオEPOを含むリン酸/NaCI緩衝液
C.リン酸/NaCI:0.1Mリン酸ナトリウム、50mM NaCI(pH7.0)
D.ゲル濾過カラム:例えば、Sephadex(登録商標)G−200(1.5×45
cm)
E.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
F.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)
1mLのSH反応性HES12KD B溶液および1mLのチオEPO1溶液を合わせ
、反応混合物を室温で2時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュ
ベーション終了時に最終濃度10mMのシステインの添加によって停止させた。反応混合
物を、PBS緩衝液で平衡化したSephadex(登録商標)G−200(1.5×4
5cm)にアプライし、1mLの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を
使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングした。タンパク質接合体を含む全ての
画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
NHS活性化エステルおよびマレイミド基(例えば、SMCC)を含む架橋剤を使用し
たチオEPOとアミノHES12KD(E、H、I)との接合体化
材料
A.微量濃縮機:MicroconYM−10(amicon,Milipore Gm
bH,Eschborn,Germany)
B.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)
C.アミノHES12KD(E、H、またはI)。10mg/mLを含むPBS緩衝液と
して調整する。
D.SMCC溶液:1mg SMCCを50μLのDMSOに溶解した。
E.D−Salt(商標)デキストラン脱塩カラム(2×5mLベッド体積)(Perb
io Science Deutschland GmbH,Bonn,Germany
)。
F.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
G.チオEPO1溶液:5mg/mLのチオEPO1を含むリン酸緩衝液。
50μLのSMCC溶液に400μLのアミノHES12KD E溶液を添加し、反応
混合物を撹拌しながら室温で80分間および46℃で10分間反応させた。14000×
gで60分間の微量濃縮機による反応混合物の遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した
。PBS緩衝液で体積を450μLにし、プロセスを2回以上繰り返した。最後の遠心分
離後、残りの溶液をPBSで450μLにし、1mLのチオEPO溶液に添加し、反応混
合物を室温で16時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーシ
ョン終了時に最終濃度10mMのシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、
PBS緩衝液で平衡化した脱塩カラムにアプライした。クーマシータンパク質アッセイ試
薬を使用して、画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全て
の画分をプールし、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
この反応では、スペーサーで分離されたスクシンイミド官能基またはスルホスクシンイ
ミド官能基、およびマレイミド官能基を有する全ての架橋剤を使用することができる。P
erbio Science Deutschland GmbH,Bonn,Germ
anyから市販されているこの分子群のさらなる例は、表1で見出され、これらを「E」
で示す。マレイミド官能基の代わりに活性化されたジスルフィド官能基を有するさらなる
架橋剤群が存在する。接合体化にこれらの架橋剤を使用することもできる。しかし、接合
体のジスルフィド結合は、還元条件下で切断可能である。この群のメンバーを、表1で「
F」を使用して示す。第3の架橋剤群は、SH反応基としてマレイミド官能基の代わりに
ビニルスルホン官能基を使用する。この「SVSB」群のメンバーを、表1で「G」を使
用して示す。
1.グリコ−EPOの酸化
1.1 メタ過ヨウ素酸ナトリウムでのグリコ−EPOの酸化:例示的プロトコール5
材料
A.グリコ−EPO溶液:10mg/mLのグリコ−EPOを含む酢酸緩衝液。
B.メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液:新たに調製した10mMまたは100mMの過ヨウ
素酸ナトリウムを含む酢酸緩衝液。暗所に保持。これらの溶液を使用して、酸化混合物中
の過ヨウ素酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ1mMまたは10mMである。
C.酢酸緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
D.グリセロール
E.微量濃縮機:MicroconYM−3(amicon,Milipore Gmb
H,Eschborn,Germany)
全ての工程を暗所で行った。
1mLの冷グリコ−EPO溶液に、0.1mLの冷メタ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添
加し、暗所で1時間酸化反応を進行させた。酸化すべきグリコ−EPOがシアル酸残基を
含む場合、酸化条件は、1mM過ヨウ素酸ナトリウム、0℃である。さもなければ、10
mMの過ヨウ素酸ナトリウムを室温で使用する。酸化を停止させるために、最終濃度15
mMのグリセロールを添加し、0℃で5分間インキュベートした。過剰な試薬および副生
成物を、微量濃縮機を使用した14000×gで60分間の生成物の遠心分離によって除
去した。遠心分離後、サンプルを次の修飾工程で使用する緩衝液(例えば、酢酸緩衝液)
でその元の体積までにした。このプロセスを2回以上繰り返した。
EPOの酵素酸化を本発明のいずれかに記載されている(Chamow et al.
,1992,J.Biol.Chem.,267,15916−15922)。
2.1 例示的プロトコール7
ヒドラジドおよびマレイミド官能基を含む架橋剤(例えば、M2C2H(Perbio
Science,Deutschland GmbH,Bonn,Germany))を
使用した酸化グリコ−EPOとチオ−HES12KD M、O、またはQとの接合体化
A.M2C2Hストック:新たに調製した10mg/mL M2C2Hを含むDMSO
B.6.1.1.由来の酸化グリコ−EPO溶液:5mg/mLのグリコ−EPOを含む
酢酸緩衝液
C.チオ−HES12KD M、O、またはQ:10mg/mLを含むリン酸/NaCI
緩衝液。
D.酢酸緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
E.リン酸/NaCI:0.1Mリン酸ナトリウム、50mM NaCl(pH7.0)
F.微量濃縮機:MicroconYM−3(amicon,Milipore Gmb
H,Eschborn,Germany)
G.ゲル濾過カラム:例えば、Sephadex(登録商標)G−200(1.5×45
cm)
H.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
I.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)
M2C2Hストック溶液を、1mLの酸化グリコ−EPOに最終濃度1mMまで添加し、
撹拌しながら室温で2時間反応させた。微量濃縮機を使用した14000×gで60分間
のサンプルの遠心分離によって過剰な架橋剤を除去した。遠心分離後、サンプルをリン酸
/NaCI緩衝液で元の体積にし、このプロセスを2回以上繰り返した。M2C2H修飾グ
リコ−EPOに1mLのチオ−HES12KD M、O、またはQ溶液を添加し、反応混
合物を室温で16時間インキュベートした。過剰なマレイミドの反応を、インキュベーシ
ョン終了時のシステインの添加によって停止させた。反応混合物を、PBSで平衡化した
Sephadex(登録商標)G−200(1.5×45cm)にアプライし、1mLの
画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタンパク質含有
量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に対する一晩の
透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。
ヒドラゾン付加物は、極端なpHであまり安定ではない。低pHでの処理を含む適用の
ために、ヒドラジンの30mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むPBSでの処理によ
りヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である
。
酸化グリコ−EPOとヒドラジド−HES12KD Lとの直接接合体化
材料
A.6.1.1.由来の酸化グリコ−EPO溶液:5mg/mLのグリコ−EPOを含む
酢酸緩衝液
B.ヒドラジド−HES18KD LまたはJ:10mg/mLを含む酢酸緩衝液
C.酢酸緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
D.ゲル濾過カラム:例えば、Sephadex(登録商標)G−200(1.5×45
cm)
E.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
F.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)
1mLのヒドラジド−HES12KD L溶液および1mLの酸化グリコ−EPO溶液
を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で16時間反応させた。反応混合物を、PBS
で平衡化したSephadex(登録商標)G−200(1.5×45cm)にアプライ
し、1mLの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、画分のタ
ンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプールし、水に
対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図24に示す。認
められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。スメアは、HESの
異種性に起因する。図25は、HESが炭水化物側鎖の炭水化物部分に接合したことを証
明する。
ヒドラゾン付加物は、極端なpHであまり安定ではない。低pHでの処理を含む適用の
ために、ヒドラジンの30mMシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含むPBSでの処理によ
りヒドラゾンを還元した。ほとんどの適用については、この付加的な工程は不必要である
。
3.1 例示的プロトコール9
酸化グリコ−EPOとヒドロキシルアミノ−HES12KD Kとの接合体化
材料
A.6.1.1.由来の酸化グリコ−EPO溶液:5mg/mLのグリコ−EPOを含む
酢酸緩衝液
B.ヒドロキシルアミノ−HES12KD K:10mg/mLを含む酢酸緩衝液
C.酢酸緩衝液:0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)
D.ゲル濾過カラム:例えば、Sephadex(登録商標)G−200(1.5×45
cm)
E.Coomassie(登録商標)タンパク質アッセイ試薬(Perbio Scie
nce Deutschland GmbH,Bonn,Germany)
F.PBS(リン酸緩衝化生理食塩水):10mMリン酸ナトリウム、150mM Na
Cl(pH7.4)
1mLのヒドロキシルアミノ−HES12KD K溶液および1mLの酸化グリコ−E
PO溶液を合わせ、反応混合物を撹拌しながら室温で16時間反応させた。反応混合物を
、PBSで平衡化したSephadex(登録商標)G−200(1.5×45cm)に
アプライし、1mLの画分を回収した。クーマシータンパク質アッセイ試薬を使用して、
画分のタンパク質含有量をモニタリングし、タンパク質接合体を含む全ての画分をプール
し、水に対する一晩の透析後の凍結乾燥によって接合体を得た。接合化の結果を図24に
示す。レーン2の認められた分子シフトにより、接合体化が成功したことが証明された。
スメアは、HESの異種性に起因する。図25は、HESが炭水化物側鎖の炭水化物部分
に接合したことを証明する。
組換えEPOまたは部分脱シアリル化EPO形態(制限されたマイルド酸加水分解によ
って作製)を、カタラーゼの存在下にて37℃で30分間ガラクトースオキシダーゼとイ
ンキュベートし、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)中にて37℃で4時
間インキュベートした。50μgアリコートのEPOを取り出し、その後ポリペプチドN
−グリカナーゼでのタンパク質の処理によって反応の進行をモニタリングした。
によってモニタリングする)を、シアル酸の除去の前後に上記のHPAEC−PADマッ
ピングに供した(Grabenhorst et al.,1999,Nimtz et
al.,1993/1994;Schlenke et al.,1999)。HPA
EC−PADで認められた典型的なシフトによって各EPOオリゴサッカリド中の酸化ガ
ラクトース残基の定量を行い、オリゴサッカリド混合物のMALDI/TOF MSによ
っても評価した。
未反応EPOおよびHAS−前駆体分子からのHAS修飾EPO形態の分離を、例えば
、Ultrogel AcA44/54または類似のゲル濾過媒体を使用したゲル濾過に
よって行った。あるいは、Affigel(BioRad)に結合させたモノクローナル
抗体を含む4mLカラムでのEPOの免疫親和性単離およびその後のゲル濾過による未修
飾EPOの分離(例えば、20kDaと200kDaとの間の相対分子量の球状タンパク
質を分離することができるマトリックスを使用する)によって、未反応のHASを除去し
た。
の検出によるSDS−PAGE分析(12.5または10%アクリルアミドゲルを使用)
によってHAS修飾EPOを同定した。組換えヒトEPOに対して惹起したポリクローナ
ル抗体を使用したサンプルのウェスタンブロット分析によっても、HAS修飾EPOポリ
ペプチドのより高い分子量が同定された。
、EPO形態のN−グリカン修飾が証明された(37℃で16時間25単位/mgEPO
タンパク質を使用したRoche,Germanyから市販されている組換えN−グリコ
シダーゼ);SDS−PAGEによる分析により、約20kDaのN−グリコシダーゼ処
理未修飾EPOの移動位置へEPOタンパク質が典型的にシフトした。
ル化生成物のSDS−PAGE移動度によって、Ser126での1脱シアリル化および
ガラクトースオキシダーゼ処理EPO O−グリカンの修飾が証明された。必要に応じて
、修飾EPOを、SDS−PAGE分析前にC8相でのRP−HPLCによって分画した
。組換えヒトEPOに対して惹起したポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット
におけるO−グリカンのβ消失およびEPOの脱O−グリコシル化形態の検出によっても
EPOのHAS O−グリカン修飾を分析した。
EPO形態を、欧州薬局方に記載のUV測定(2000,Erythropoieti
ni solutio concentrata,1316,780−785)によって
定量し、国際BRP参照EPO標準と比較した。あるいは、RP−C4カラムならびに較
正のための20、40、80、および120μgのBRP標準EPO参照調製物を使用し
た254nmでの吸光度を使用したRP−HPLCによってEPO濃縮物を測定した。
Krystalに記載のエリスロポエチン生物活性アッセイを使用して、活性について
精製HES修飾EPOを試験した(Krystal,1984,Exp.Heamato
l.,11,649−660)。
回収し、記載のように使用した(Fibi et al.,1991,Blood,77
,1203 ff.)。EPOの希釈物を、3×105細胞/ウェルと共に96ウェルマ
イクロタイタープレート中でインキュベートした。加湿雰囲気下(5%CO2)における
37℃で24時間後、細胞を、1μCiの3H−チミジン/ウェルで4時間標識した。組
み込まれた放射能を、液体シンチレーションカウンティングによって測定した。比較のた
めに国際参照EPO標準(BRP標準)を使用した。
O生物活性を測定した(Kitamura et.al.,J.cell Phys.,
140.323−334)。指数関数的に成長した細胞を無成長因子で洗浄し、EPOの
連続希釈物の存在下でさらに48時間インキュベートした。Mosmannに記載のMT
T還元アッセイの使用によって細胞増殖を評価した(Mosman,1983,J.Im
munol.Methods,65,55−63)。
上記用量のEPOまたは修飾EPO形態を投与した動物の4日後の網状赤血球の増加の
測定によって、正赤血球症マウスにおけるインビボ活性測定を行った。赤血球増加症マウ
スアッセイにおいてWHO EPO標準に対して較正したBRP EPO標準を使用して
アッセイを行った。EPOサンプルを、1mg/mlのウシ血清アルブミン(Sigma
)を含むリン酸緩衝化生理食塩水で希釈した。
、または20IU/mlのBRP標準EPOに等価なEPOタンパク質に対応する)を、
動物に皮下感染させた。注射から4日後に血液サンプルを採取し、アクリジンオレンジで
網状赤血球を染色し、血液サンプル採取から5時間以内の30,000個の総血球の計数
によるフローサイトメトリーによって網状赤血球を定量した(Ph.Eur,2000,
Erythropoietini solutio concentrata,1316
,pages 780−785)および欧州薬局方(1996/2000,attach
ment 2002)を参照のこと)。
ウサギに所定量の未修飾またはHAS修飾EPO形態を静脈内注射した。所定の時間で
血液サンプルを採取し、血清を調製した。インビトロバイオアッセイまたは市販のEPO
特異的ELISAによって血清エリスロポエチンレベルを測定した。
マウス:各動物に、300IU EPO/kgを皮下投与した。処置から7日後、各動
物のヘマトクリットを測定した。修飾EPOで処置した全動物のうちの9匹でヘマトクリ
ットの実質的な増加が認められ、未処理EPOの比較的短い半減期に照らして予想される
結果であった。修飾EPO処置群のヘマトクリット変化の平均は、未処理EPO群および
コントロール群のそれと有意に異なっていた。
POの単回用量でウサギを処置した。2、6、16、24、および48時間後、血漿濃度
の測定のための市販のEPO特異的ELISAの使用によって血液サンプルを分析した。
Zettlmissl et al.,1989,J.Biol.Chem.,264,
21153−21159に記載のように、平均血漿EPO濃度を測定し、平均初期半減
期(α期)および最終半減期(β期)を、記載のELISA値から計算した。
Sytkowski,Lunn,Risinger,and Davis,1999,A
n Erythropoietin Fusion Protein Comprise
d of Identical Repeating Domains Exhibit
is Enhanced Biological Properites,J.Biol
.Chem.,274,24773−24778。
Ultrogel AcA54でのゲル濾過によって修飾IL2を回収した。対応する
画分のアリコートを滅菌濾過し、IL2依存性マウスCTLL−2細胞株の使用によって
IL2生物活性を測定した(Gillis,Ferm,On,and Smith,19
78,J.Immunol.,120,2027−2032)。活性を、国際参照IL2
標準調製物と比較した。
〔請求項1〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、該ヒドロキシアルキルデンプ
ンが、下記式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端において化
合物(L)と反応するステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端における化
合物(D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合
物(L)と反応するステップを含んでなり、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、およびチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法。
〔請求項2〕
R1、R2およびR3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル
基である請求項1に記載の方法。
〔請求項3〕
R1、R2およびR3が、独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項2
に記載の方法。
〔請求項4〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項1〜3の
いずれかに記載の方法。
〔請求項5〕
前記官能基Z1が、構造−NH−を含む請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
〔請求項6〕
前記Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される請求項5に記載の方法。
〔請求項7〕
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記官能基Xが、構造−NH−を含む請求項1〜6のいずれかに記
載の方法。
〔請求項8〕
前記Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される請求項7に記載の方法。
〔請求項9〕
前記官能基Yが、−SHであり、前記官能基Xが、
からなる群から選択される請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
〔請求項10〕
前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、−SHであり、前記官能基Z2または前記官能基
Wが、
からなる群から選択される請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
〔請求項11〕
前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性
化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Z2
または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
〔請求項12〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(D)または化合物(L)との
反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式(I):
〔請求項13〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(D)または化合物(L)との
反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式(IIa):
〔請求項14〕
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項13に記載の方法
。
〔請求項15〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
得られた反応生成物を、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含ま
れる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項1〜9および12〜14のいずれかに記載の方法。
〔請求項16〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物(L)中に含
まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物
(M)と反応させる、
請求項1〜9および12〜14のいずれかに記載の方法。
〔請求項17〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物(D)中に含まれる官能基Z1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(D
)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中に含まれる官能基Z
2と、化合物(D)中に含まれる官能基Wとの反応を介して化合物(L)と反応させて第
2のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
〔請求項18〕
前記第2のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中に含まれる官能基X
と、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応さ
せる、請求項17に記載の方法。
〔請求項19〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物(D)中に含まれる官能基Z1と、前記ヒ
ドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(
D)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(D)中に含まれる官能基W
と、化合物(L)中に含まれる官能基Z2との反応を介して化合物(L)と反応させ、
化合物(L)を、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物
(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさ
らなる化合物(M)と反応させる、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
〔請求項20〕
前記少なくとも1つのさらなる化合物(M)が、ポリペプチドである請求項1〜19の
いずれかに記載の方法。
〔請求項21〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項20に記載の方法。
〔請求項22〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体であって、ヒドロキシアルキルデンプンが、式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物(
L)を反応させるステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端で化合物(
D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と化合物(L
)を反応させるステップを含み、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択される、
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項23〕
R1、R2およびR3が、独立して、水素または直鎖もしくは分岐状ヒドロキシアルキル
基である請求項22に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項24〕
R1、R2およびR3が、独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項2
3に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項25〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項22〜2
4のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項26〕
前記官能基Z1が、構造−NH−を含む請求項22〜25のいずれかに記載のヒドロキ
シアルキルデンプン誘導体。
〔請求項27〕
前記Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される請求項26に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項28〕
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記官能基Xが、構造−NH−を含む請求項22〜27のいずれか
に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項29〕
前記Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される請求項28に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項30〕
前記官能基Yが、−SHであり、前記官能基Xが、
からなる群から選択される請求項22〜27のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデン
プン誘導体。
〔請求項31〕
前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、−SHであり、前記官能基Z2または前記官能基
Wが、
からなる群から選択される請求項22〜30のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデン
プン誘導体。
〔請求項32〕
前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、活性化されたエステルまたは必要に応じて活性
化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群から選択され、前記官能基Z2
または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択される、請求項22〜30のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデ
ンプン誘導体。
〔請求項33〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(D)または化合物(L)との
反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式(I):
。
〔請求項34〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(D)または化合物(L)との
反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、式(IIa):
。
〔請求項35〕
前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項34に記載のヒド
ロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項36〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
得られた反応生成物を化合物(L)中に含まれる官能基Xと、化合物(M)中に含まれ
る官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項22〜30および請求項33〜35のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプ
ン誘導体。
〔請求項37〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの
必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物(L)中に含
まれる官能基Xと、さらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらな
る化合物(M)と反応させる、
請求項22〜30および33〜35のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導
体。
〔請求項38〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物(D)中に含まれる官能基Z1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(D
)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中に含まれる官能基Z
2と化合物(D)中に含まれる官能基Wとの反応を介して化合物(L)と反応させて第2
のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られる、
請求項22〜35のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項39〕
前記第2のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(L)中に含まれる官能基X
と化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させ
る、請求項38に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項40〕
前記ヒドロキシアルキルデンプンを、化合物(D)中に含まれる官能基Z1と前記ヒド
ロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(D
)と反応させて第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体が得られ、
前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体を、化合物(D)中に含まれる官能基W
および化合物(L)中に含まれる官能基Z2との反応を介して化合物(L)と反応させ、
化合物(L)を、前記第1のヒドロキシアルキルデンプン誘導体との反応前に、化合物
(L)中に含まれる官能基Xと化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさら
なる化合物(M)と反応させる、
請求項22〜35のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項41〕
前記少なくとも1つのさらなる化合物(M)が、ポリペプチドである請求項22〜40
のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
〔請求項42〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項41に記載のヒドロキシアルキル
デンプン誘導体。
〔請求項43〕
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができるヒドロキシア
ルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、該ヒドロキシアルキルデ
ンプンが、式(I)
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物(
L)を反応させるステップ、または
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端と化合物(
D)との反応によって得ることができるヒドロキシアルキルデンプン誘導体と、化合物(
L)を反応させるステップを含んでなり、
前記化合物(D)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元
末端と反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、少なくとも1つの官能基Wを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの
官能基Z1、または前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体中に含まれる官能基Wと反応
可能な少なくとも1つの官能基Z2を含み、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能
な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、アセタール基、またはチ
オ基からなる群から選択され、
前記ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法が、ヒドロキシアルキルデンプンと
、化合物(L)と、必要に応じて化合物(D)を含む反応生成物をさらなる化合物(M)
と反応させるステップをさらに含んでなり、少なくとも1つの前記さらなる化合物がポリ
ペプチドである、薬学的組成物。
〔請求項44〕
前記ポリペプチドが、AT IIIである請求項43に記載の薬学的組成物。
〔請求項45〕
前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項43に記載の薬学的組成物。
〔請求項46〕
前記官能基Yが、−SHであり、前記化合物(L)が、一般式Z1−L’−Xの化合物
であり、前記官能基Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
からなる群から選択され、L’はZ1およびXと架橋する有機鎖であるか、またはL’は
存在しない、請求項43〜45のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項47〕
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記化合物(L)が、一般式Z1−L’−Xの化合物であり、前記
官能基Z1が、
り、Rは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、アリールシクロアルキル
、アルカリール、またはシクロアルキルアリールである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、L’はZ1およびXと架橋する有機鎖であるか、またはL’は
存在しない、請求項43〜45のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項48〕
前記官能基Yが、−SHであり、前記化合物(D)が、一般式Z1−D’−Wの化合物
であり、前記化合物(L)が、一般式Z2−L’−Xの化合物であり、前記官能基Z1が、
り、Rはメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
からなる群から選択され、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、−SHであり、前記官
能基Z2または前記官能基Wが、
からなる群から選択されるか、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、活性化されたエス
テルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群か
ら選択され、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記D’が、Z1およびWと架橋する有機鎖であるか、または
前記D’は存在せず、前記L’が、Z2およびXと架橋する有機鎖であるか、または前記
L’が存在しない、請求項43〜45のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項49〕
前記官能基Yが、アルデヒド基、ケト基、ヘミアセタール基、およびアセタール基から
なる群から選択され、前記化合物(D)が、一般式Z1−D’−Wの化合物であり、前記
化合物(L)が、一般式Z2−L’−Xの化合物であり、前記官能基Z1が、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Xが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、−SHであり、前記官
能基Z2または前記官能基Wが、
からなる群から選択されるか、前記官能基Wまたは前記官能基Z2が、活性化されたエス
テルまたは必要に応じて活性化されたエステルに変換されるカルボキシル基からなる群か
ら選択され、前記官能基Z2または前記官能基Wが、
り、R’はメチルである。)
からなる群から選択され、前記D’が、Z1およびWと架橋する有機鎖であるか、または
前記D’は存在せず、前記L’が、Z2およびXと架橋する有機鎖であるか、または前記
L’は存在しない、請求項43〜45のいずれかに記載の薬学的組成物。
〔請求項50〕
前記ヒドロキシエチルデンプンを、水性媒体中で下記式:
学的組成物。
〔請求項51〕
前記エリスロポエチンを前記反応前に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する請求項50に記
載の薬学的組成物。
〔請求項52〕
前記エリスロポエチンを部分的に脱シアリル化し、その後前記反応前に過ヨウ素酸ナト
リウムで酸化する請求項50に記載の薬学的組成物。
Claims (22)
- ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)とさらなる化合物(M)を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(I)
の構造を有し、
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を化合物(L)と反応させるステップを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、チオ基であり、
前記官能基Xが、
からなる群から選択され、
化合物(L)と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、前記官能基Z1が、
からなる群から選択され、
前記さらなる化合物(M)が、ポリペプチドである
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法。 - R1、R2およびR3が、独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項1に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(L)との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(I):
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(L)との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(IIa):
- 前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項5に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
得られた反応生成物を、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、さらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させるが、
ここで、化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、さらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項1に記載の方法。
- ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)とさらなる化合物(M)を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(I)
の構造を有し、該製造方法が、
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を化合物(L)と反応させるステップを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能な少なくとも1つの官能基Xを含み
前記官能基Yが、チオ基であり、
前記官能基Xが、
からなる群から選択され、
化合物(L)と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、
前記官能基Z1が、
からなる群から選択され、
前記さらなる化合物(M)が、ポリペプチドである
ヒドロキシアルキルデンプン誘導体。 - R1、R2およびR3が、独立して、水素または2−ヒドロキシエチル基である請求項10に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンが、ヒドロキシエチルデンプンである請求項10または請求項11に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(L)との反応前に酸化されておらず、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(I):
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンの還元末端が、化合物(L)との反応前に酸化されており、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(IIa):
- 前記還元末端が、アルカリヨウ素溶液によって酸化されている請求項14に記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
- 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させ、
得られた反応生成物を、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、さらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項10〜15のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。 - 前記ヒドロキシアルキルデンプンを、官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応を介して化合物(L)と反応させるが、
ここで、化合物(L)を、前記ヒドロキシアルキルデンプンとの反応前に、化合物(L)中に含まれる官能基Xと、さらなる化合物(M)中に含まれる官能基Yとの反応を介してさらなる化合物(M)と反応させる、
請求項10〜15のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。 - 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項10〜17のいずれかに記載のヒドロキシアルキルデンプン誘導体。
- ヒドロキシアルキルデンプン誘導体の製造方法によって得ることができる、ヒドロキシアルキルデンプンと化合物(L)とさらなる化合物(M)を反応させて得られるヒドロキシアルキルデンプン誘導体を治療有効量含む薬学的組成物であって、前記ヒドロキシアルキルデンプンが、下記式(I):
の構造を有し、該製造方法が、
式(I)のヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端を化合物(L)と反応させるステップを含み、
前記化合物(L)が、前記ヒドロキシアルキルデンプンと反応可能な少なくとも1つの官能基Z1と、さらなる化合物(M)の官能基Yと反応可能な少なくとも1つの官能基Xを含み、
前記官能基Yが、チオ基であり、
前記官能基Xが、
からなる群から選択され、
化合物(L)と前記ヒドロキシアルキルデンプンとの結合の形成が、前記官能基Z1と前記ヒドロキシアルキルデンプンの必要に応じて酸化された還元末端との反応によってなされ、
前記官能基Z1が、
からなる群から選択され、
前記さらなる化合物(M)が、ポリペプチドである
薬学的組成物。 - 前記ポリペプチドが、AT IIIである請求項19に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドが、エリスロポエチンである請求項19に記載の薬学的組成物。
- 前記官能基Yが、−SHであり、前記化合物(L)が、一般式Z1−L’−Xの化合物であり、L’はZ1およびXと架橋する有機鎖であるか、またはL’は存在しない、請求項19〜21のいずれかに記載の薬学的組成物。
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