PL198311B1 - Związki glikopeptydowe, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz ich zastosowanie - Google Patents

Abstract

1. Zwi azek glikopeptydowy o wzorze II: w którym: R 21 oznacza grup e sacharydow a o wzorze: w którym R 15 oznacza -R a -Y-R b -H, i R 16 oznacza atom wodoru lub metyl; R 22 oznacza -OH; R 23 oznacza atom wodoru; ......... PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy nowych pochodnych antybiotyków glikopeptydowych. Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznych zawierających takie pochodne glikopeptydowe oraz zastosowania takich pochodnych glikopeptydowych jako środków przeciwbakteryjnych.

Stan techniki

Glikopeptydy są dobrze znaną, klasą antybiotyków wytwarzanych przez rozmaite mikroorganizmy. Te złożone wielopierścieniowe związki peptydowe są skutecznymi środkami przeciwbakteryjnymi przeciwko dużej części bakterii Gram-dodatnich. Stosowanie glikopeptydów jako antybiotyków przysłoniły jednak półsyntetyczne penicyliny, cefalosporyny i linkomycyna ze względu na obserwowane wyższe poziomy toksyczności glikopeptydów dla ssaków. W ostatnich latach pojawiły się jednakże szczepy bakterii opornych na penicyliny, cefalosporyny itp., czego skutkiem są na przykład wielooporne i oporne na metycylinę infekcje gronkowców (MRS). Glikopeptydy, takie jak wankomycyna, są typowo skuteczne przeciwko takim mikroorganizmom, a wankomycyna stała się lekiem ostatniego ratunku dla MRS i innych infekcji. Glikopeptydy uznaje się za skuteczne przeciwko takim opornym mikroorganizmom, ponieważ mają one inny mechanizm działania niż inne antybiotyki. Uważa się, że glikopeptydy selektywnie hamują inny etap syntezy ściany komórkowej bakterii niż antybiotyki typu penicyliny.

Ściana komórkowa bakterii zbudowana jest z liniowych łańcuchów polisacharydowych usieciowanych krótkimi peptydami. Takie ułożenie usieciowanych polisacharydów stanowi oparcie mechaniczne dla ściany komórkowej, zapobiegające rozerwaniu bakterii pod wpływem wysokiego wewnętrznego ciśnienia osmotycznego. Podczas syntezy bakteryjnej ściany komórkowej sieciowanie polisacharydów ma miejsce po włączeniu połączonych lipidem konstruktów disacharyd-pentapeptyd do liniowych łańcuchów polisacharydowych przez enzym transglikolazę. Następująca potem reakcja sieciowania jest ostatnim etapem syntezy bakteryjnej ściany komórkowej i jest katalizowana przez enzym znany jako transpeptydaza peptydoglikanu.

Jednym ze sposobów wywierania czynności przeciwbakteryjnej przez środki przeciwbakteryjne jest hamowanie enzymu transglikolazy i oddziaływanie przez to na przedostatni etap syntezy bakteryjnej ściany komórkowej. Jakkolwiek nie zamierzamy wiązać się teorią, to należy nadmienić iż uważa się, że antybiotyki glikopeptydowe, takie jak wankomycyna, wiążą się z wysokim powinowactwem i specyficznością z sekwencjami W-terminalnymi (to jest, L-lizylo-D-alanylo-D-alaniną w organizmach wrażliwych na wankomycynę) prekursorów peptydoglikanu (znanego jako pośredni lipid II). Przez związanie i zamaskowanie tych prekursorów wankomycyna zapobiega ich wykorzystaniu w biosyntezie ściany komórkowej. Zatem, wankomycyna hamuje transglikozylazę bakteryjną, odpowiedzialną za addycję podjednostek pośredniego lipidu II do rosnących łańcuchów peptydoglikanowych. Ten etap syntezy bakteryjnej ściany komórkowej poprzedza etap sieciującego transpeptydowania, który jak wiadomo jest hamowany przez antybiotyki beta-laktamowe. Uważa się także, że wankomycyna hamuje transpeptydowanie, w które zaangażowany jest koniec D-alanylo-D-alanina. Jednakże, ponieważ etap ten zachodzi po transglikozylacji, nie obserwuje się bezpośrednio hamowania transpeptydowania.

W technice znanych jest wiele pochodnych wankomycyny i innych glikopeptydów. Patrz na przykład opisy patentowe U.S.A. nr 4,639,433; 4,643,987; 4,497,802; 4,698,327; 5,591,714; 5,840,684; i 5,843,889. Inne pochodne ujawniono w opisach patentowych EP 0 802 199; EP 0 801 075; EP 0 667 353; WO 97/28812; WO 97/38702; WO 98/52589; WO 98/52592; oraz w J. Amer. Chem. Soc., 1996, 118, 13107-13108; J. Amer. Chem. Soc., 1997, 119, 12041-12047; i J. Amer. Chem. Soc., 1994, 116, 4573-4590.

Dalsze związki glikopeptydowe ujawnione są w opisach patentowych EP-A-525499, EP-A-376041, EP-A-182157, EP-A-351597, WO-A-9011300 i WO-A-8806600.

Istnieje jednakże zapotrzebowanie na pochodne glikopeptydowe, mające ulepszoną aktywność, selektywność i zmniejszoną toksyczność dla ssaków. Ponadto, obserwuje się rozwijanie się oporności na wankomycynę niektórych mikroorganizmów, takich jak paciorkowce oporne na wankomycynę (VRE). W związku z tym byłoby wysoce pożądane dostarczenie nowych pochodnych glikopeptydowych, skutecznych przeciwko szerokiemu spektrum bakterii, w tym bakterii opornych, takich jak VRE. Ponadto, byłoby wysoce korzystne dostarczenie nowych pochodnych glikopeptydowych mających ulepszoną czynność przeciwbakteryjną i niską toksyczność dla saków.

PL 198 311 B1

Podsumowanie wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza nowych pochodnych antybiotyków glikopeptydowych mających ulepszone właściwości w stosunku do glikopeptydu niepodstawionego, w tym zwiększoną czynność przeciwbakteryjną, selektywność i zmniejszoną toksyczność dla saków. Na przykład, pewne pochodne wankomycyny według wynalazku wykazują znacznie zwiększoną czynność przeciwbakteryjną w porównaniu z samą wankomycyną. Takie pochodne wankomycyny są także wysoce skuteczne przeciwko opornym na wankomycynę szczepom paciorkowców, wykazują jednocześnie zmniejszoną toksyczność dla saków.

Przedmiotem wynalazku jest związek glikopeptydowy o wzorze II:

II w którym:

R oznacza grupę sacharydową o wzorze:

w którym R¹⁵ oznacza -R^a-Y-R^b-H, i R¹⁶ oznacza atom wodoru lub metyl; ^r22 oznacza -O^H;

R²³ oznacza atom wodoru;

R2⁴ oznacza atom wodoru;

R²5 oznacza izobutyl;

R²6 oznacza metyl;

R²⁷ oznacza atom wodoru;

każdy z R^a niezależnie oznacza grupę alkilenową mającą 2 do 6 atomów węgla; każdy z Rb niezależnie oznacza grupę alkilenową mającą 8 do 12 atomów węgla; Y oznacza atom siarki, -NH, lub -NH-SO2-;

PL 198 311 B1 n oznacza 1;

oraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

Szczególnie korz^ystae gru^py R¹⁵ są w^ybrane z nas^tępuj^ąc^yc^h:

-CH2CH2-NH-(CH2)9CH3;

-CH2CH2CH2-NH-(CH2)8CH3;

-CH2CH2CH2CH2-NH-(CH2)yCH3;

-CH2CH2-NHSO2-(CH2)9CH3;

-CH2CH2-S-(CH2)8CH3;

-CH2CH2-S-(CH2)9CH3;

-CH2CH2-S-(CH2)1qCH3;

-CH2CH2CH2-S-(CH2)8CH3;

-CH2CH2CH2-S-(CH2)9CH3; i

-CH2CH2CH2CH2-S-(CH2)yCH3.

Zwłaszcza ^korz^ysta^{ą g}ru^{pą Rl5}jes^t -^CH2CH2-^NH-(^CH2)⁹C^H3.

Inne ^korz^ystoe ^gru^{py r15} ^zeidstew^no ^poNżej w teteH I.

Związki według wynalazku są wysoce skutecznymi środkami przeciwbakteryjnymi. Zatem, wynalazek może być stosowany do leczenia ssaka cierpiącego na chorobę bakteryjną, poprzez podawanie ssakowi skutecznej terapeutycznie ilości związku glikopeptydowego o wzorze II.

Ponadto, wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznej, zawierającej dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i skuteczną terapeutycznie ilość związku o wzorze II.

Sposoby wytwarzania pochodnych glikopeptydowych są opisane w dalszej części poniżej.

Wynalazek niniejszy dostarcza ponadto związku o wzorze II określonego jak powyżej do stosowania jako lek.

W następnym aspekcie, wynalazek niniejszy dotyczy zastosowania pochodnej glikopeptydowej o wzorze II do wytwarzania preparatu lub leku do leczenia medycznego. Korzystnie, preparat lub lek stosuje się jako środek przeciwbakteryjny.

III

Nr	R15
1	2
1	-CH2CH2-NH-(CH2)gCH3
2	-CH2CH2-N[(CH2)gCH3]2

PL 198 311 B1 cd. tabeli I

1	2
3	-CH2CH2-NH-(CH2)7CH3
4	-CH2CH2-NH-(CH2)5CH3
5	-CH2CH2-NH-CH2Ph
10	-CH2CH2CH2-NH-(CH2)8CH3
11	-CH2CH2CH2CH2-NH-(CH2)7CH3
12	-CH2CH2CH2CH2CH2-NH-(CH2)6CH3
13	-CH2CH2-N(CH3)-(CH2)gCH3
19	-CH2CH2-NH-(CH2)gCH3
20	-CH2CH2-N[(CH2)9CH3]2
21	-CH2CH2-NH-(CH2)gCHg
22	-CH2CH2-NH-(CH2)gCHg
34	-CH2CH2-NHSO2-(CH2)7CH3
36	-CH2CH2-S-(CH2)9CH3
95	-CH2CH2-NH-(CH2)7CH(CH3)2
96	-(CH2)5-NH-(CH2)6CH3
97	-(CH2)3-NH-(CH2)9CH3
98	-(CH2)4-NH-(CH2)9CH3
99	-(CH2)5-NH-(CH2)9CH3
100	-CH2CH2-NH-(CH2)7CH3
102	-CH2CH2-S-(CH2)7CH3
159	-CH2CH2-NHSO2-(CH2)7CH3
164	-CH2CH2-NH-(CH2)11CH3
233	-CH2CH2-S-(CH2)11CH3
234	-CH2CH2-S-(CH2)8CH3
237	-CH2CH2CH2-S-(CH2)8CH3
238	-CH2CH2CH2-S-(CH2)9CH3
240	-CH2CH2CH2CH2-S-(CH2)7CH3
249	-CH2CH2-S-(CH2)10CH3
250	-CH2CH2CH2-S-(CH2)10CH3
260	-CH2CH2CH2-S-(CH2)8CH3

Dokładny opis wynalazku

Wynalazek niniejszy dotyczy nowych pochodnych antybiotyków glikopeptydowych oraz kompozycji farmaceutycznych i sposobów stosowania takich pochodnych glikopeptydowych. Przy opisywa6

PL 198 311 B1 niu związków, kompozycji i sposobów według wynalazku, poniższe terminy mają niżej podane znaczenia, chyba że wskazano inaczej.

Definicje

Termin alkilen odnosi się do dirodnika rozgałęzionego lub nierozgałęzionego nasyconego łańcucha węglowodorowego, mającego wskazaną liczbę atomów węgla. Przykładem tego terminu są grupy takie jak metylen (-CH2-), etylen (-CH2CH2-), izomery propylenu (np., -CH2CH2CH2- i -CH-(CH3)CH2-) itp.

Określenie wankomycyna odnosi się do antybiotyku glikopeptydowego mającego wzór:

Usunięcie ugrupowania disacharydowego przyłączonego do fenolu w wankomycynie poprzez łagodną hydrolizę daje aglikon wankomycyny.

Termin N^van-, stosowany przy opisywaniu pochodnych wankomycyny, wskazuje, że podstawnik jest przyłączony kowalencyjnie do grupy aminowej ugrupowania wankozaminowego wankomycyny. Podobnie, termin N^leu- wskazuje, że podstawnik jest przyłączony kowalencyjnie do grupy aminowej ugrupowania leucynowego wankomycyny.

Substrat enzymu transglikozylazy oznacza cel molekularny enzymu transglikozylazy. Substrat wiąże się z enzymem, co prowadzi do syntezy bakteryjnej ściany komórkowej. Działanie tego enzymu jest hamowane przez domenę ligandu, która wiąże się z substratem enzymu. Ligandy takie jak wankomycyna wiążą się z tym substratem i skutkiem tego „maskują substrat, zapobiegając jego rozpoznaniu przez enzym i późniejszemu wykorzystaniu w budowie bakteryjnej ściany komórkowej.

Siła działania oznacza tu minimalne stężenie, w którym związek lub ligand jest zdolny do wywarcia pożądanego efektu biologicznego lub terapeutycznego. Siła działania związku lub ligandu jest typowo proporcjonalna do jego powinowactwa do jego miejsca wiążącego. W niektórych przypadkach siła działania może być skorelowana nieliniowo z jego powinowactwem.

Terminy obojętny rozpuszczalnik organiczny lub rozpuszczalnik obojętny lub rozcieńczalnik obojętny oznacza rozpuszczalnik lub rozcieńczalnik, który jest zasadniczo obojętny w warunkach reakcji, w których jest stosowany jako rozpuszczalnik lub rozcieńczalnik. Jako reprezentatywne przykłady substancji, które mogą być stosowane jako obojętne rozpuszczalniki lub rozcieńczalniki można podać, dla ilustracji, benzen, toluen, acetonitryl, tetrahydrofuran (THF), dimetyloformamid (DMF), chloroform (CHCh), chlorek metylenu (czyli dichlorometan lub C^Ch), eter dietylowy, octan etylu, aceton, metyloetylo keton, metanol, etanol, propanol, izopropanol, tert-butanol, dioksan, pirydynę, itp.. Jeśli nie wskazano inaczej, rozpuszczalniki stosowane w reakcjach są rozpuszczalnikami obojętnymi.

Termin dopuszczalna farmaceutycznie sól oznacza te sole, które utrzymują skuteczność biologiczną i właściwości związku macierzystego i które nie są biologicznie czy w inny sposób szkodliwe

PL 198 311 B1 w podawanej dawce. Związki według wynalazku są zdolne do tworzenia soli z kwasami i zasadami dzięki obecności odpowiednio grup aminowych i karboksylowych.

Dopuszczalne farmaceutycznie sole addycyjne z zasadami można wytworzyć z zasad nieorganicznych i organicznych. Sole pochodzące od zasad nieorganicznych obejmują, bez ograniczenia do nich, sole sodowe, potasowe, litowe, amonowe, wapniowe i magnezowe. Sole pochodzące od zasad organicznych obejmują, ale bez ograniczenia do nich, sole amin pierwszorzędowych, drugorzędowych i trzeciorzędowych, amin podstawionych, w tym amin podstawionych występujących w naturze, oraz amin cyklicznych, w tym izopropyloaminy, trimetyloaminy, dietyloaminy, trietyloaminy, tripropyloaminy, etanoloaminy, 2-dimetyloaminoetanolu, trometaminy, lizyny, argininy, histydyny, kofeiny, prokainy, hydrabaminy, choliny, betainy, etylenodiaminy, glukozaminy, N-alkiloglukamin, teobrominy, puryn, piperazyny, piperydyny i N-etylopiperydyny. Należy także rozumieć, że w realizacji wynalazku będą także użyteczne inne pochodne kwasów karboksylowych, na przykład amidy kwasów karboksylowych, w tym karboksyamidy, niższe alkilokarboksymidy, di(niższe alkilo)karboksymidy, itp.

Dopuszczalne farmaceutycznie sole z kwasami mogą być wytworzone z kwasów nieorganicznych i organicznych. Sole pochodzące od kwasów nieorganicznych obejmują sole utworzone przez kwas chlorowodorowy, kwas bromowodorowy, kwas siarkowy, kwas azotowy, kwas fosforowy, itp.. Sole pochodzące od kwasów obejmują sole utworzone przez kwas octowy, kwas propionowy, kwas glikolowy, kwas pirogronowy, kwas szczawiowy, kwas malonowy, kwas jabłkowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas cynamonowy, kwas migdałowy, kwas metanosulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas p-toluenesulfonowy, kwas salicylowy, itp.

Związki według wynalazku typowo zawierają jedno lub więcej niż jedno centrum chiralne. Zatem wynalazek obejmuje mieszaniny racemiczne, diasteromery, enancjomery i mieszaniny wzbogacone w jeden lub więcej niż jeden steroizomer. Zakres wynalazku tak jak jest opisany i zastrzegany obejmuje formy racemiczne związków, jak i ich pojedyncze enancjomery i nieracemiczne mieszaniny.

Termin leczenie stosowany jest jako obejmujący wszelkie leczenie medyczne stanu lub choroby u zwierzęcia, szczególnie u ssaka, bardziej szczególnie u człowieka, i obejmuje:

(i) zapobieganie wystąpieniu choroby lub stanu u podmiotu, który może być predysponowany na tę chorobę, ale u którego choroby tej jeszcze nie zdiagnozowano;

(ii) hamowanie choroby lub stanu, to jest zatrzymanie jej postępu; cofnięcie choroby lub stanu, to jest spowodowanie regresji choroby lub stanu; lub cofnięcie stanu spowodowanego przez chorobę, to jest objawów tej choroby.

Termin stan chorobowy który jest poprawiany przez leczenie środkiem przeciwbakteryjnym o szerokim spektrum działania obejmuje wszelkie stany chorobowe, które są generalnie uznawane w sztuce za możliwe do leczenia środkiem przeciwbakteryjnym o szerokim spektrum działania generalnie, i te stany chorobowe, które okazały się możliwe do leczenia za pomocą specyficznych środków przeciwbakteryjnych według wynalazku. Takie stany chorobowe obejmują, ale bez ograniczenia do tego, leczenie ssaka zaatakowanego przez bakterię patogenną, w szczególności gronkowce (wrażliwe i oporne na metycylinę), paciorkowce (wrażliwe i oporne na penicylinę), paciorkowce jelitowe (wrażliwe i oporne na wankomycynę), oraz Clostridium difficile.

Termin ilość skuteczna terapeutycznie odnosi się do ilości, która jest skuteczna do przeprowadzenia leczenia, takiego jak zdefiniowano powyżej, kiedy jest podawana ssakowi potrzebującemu takiego leczenia. Ilość skuteczna terapeutycznie będzie zależeć od leczonego podmiotu i stanu chorobowego, ciężkości choroby i sposobu podawania, i może być ustalona rutynowo przez specjalistę.

Termin grupa zabezpieczająca lub grupa blokująca odnosi się do wszelkich grup, które związane z jedną lub więcej niż jedną z grup hydroksylowych, tiolowych, aminowych, karboksylowych lub innych grup w związkach, zapobiegają przebieganiu na tych grupach niepożądanych reakcji i które mogą być usunięte na drodze konwencjonalnych etapów chemicznych lub enzymatycznych z odtworzeniem grup hydroksylowych, tiolowych, aminowych, karboksylowych lub innych. Konkretna zastosowana usuwalna grupa blokująca nie jest krytyczna, a korzystne usuwalne grupy blokujące obejmują konwencjonalne podstawniki takie jak allil, benzyl, acetyl, chloroacetyl, tiobenzyl, benzylidynyl, fenacyl, t-butylodifenylosilil i wszelkie inne grupy które mogą być wprowadzane chemicznie do funkcji hydroksylowej i później selektywnie usuwane metodami chemicznymi lub enzymatycznymi w łagodnych warunkach stosownych dla rodzaju produktu. Grupy zabezpieczające są ujawnione bardziej szczegó^łowo w ^T.W. ^Greene an^d ΡΌ.Μ. Wu^ Protecriye ^Grou^ps in Or^gamc ^ntteste ^2nd 199T Jo^hn

Wiley and Sons, N.Y.

PL 198 311 B1

Korzystne usuwalne grupy blokujące grupę aminową obejmują konwencjonalne podstawniki takie jak t-butoksykarbonyl (t-BOC), benzyloksykarbonyl (CBZ), fluorenylometoksykarbonyl (FMOC), alliloksykarbonyl (ALOC) itp., które mogą być usunięte w konwencjonalnych warunkach odpowiednich dla rodzaju produktu.

Korzystne grupy zabezpieczające grupę karboksylową obejmują estry, takie jak metyl, etyl, propyl, t-butyl etc., które można usunąć w łagodnych warunkach odpowiednich dla rodzaju produktu.

Efekt biologiczny w stosowanym to znaczeniu obejmuje, ale bez ograniczenia do tego, zwiększenie powinowactwa, zwiększenie selektywności, zwiększenie siły działania, zwiększenie skuteczności, zwiększenie czasu działania, zmniejszenie toksyczności, itp..

Ogólne procedury syntetyczne

Związki glikopeptydowe według wynalazku można wytworzyć z łatwo dostępnych substancji substratów, stosując niżej opisane ogólne metody i procedury. W przypadku kiedy podaje się typowe lub korzystne warunki procesu (to jest temperatury reakcji, czasy, stosunki molowe reagentów, rozpuszczalniki, ciśnienia, etc.), mogą być stosowane także inne warunki procesu, chyba że stwierdzono inaczej. Optymalne warunki reakcji mogą zależeć od konkretnych zastosowanych reagentów lub rozpuszczalników, ale takie warunki mogą być ustalone przez fachowca w rutynowych procedurach optymalizacji.

Ponadto, jak będzie widoczne dla fachowca, mogą być konieczne konwencjonalne grupy zabezpieczające w celu zapobieżenia przed niepożądanymi reakcjami niektórych grup funkcyjnych. Dobór odpowiedniej grupy zabezpieczającej, jak również odpowiednich warunków zabezpieczania i odbezpieczania, są dobrze znane w sztuce. Na przykład, liczne grupy zabezpieczające i ich wprowadzanie są opisane szczegółowo w T. W. Greene and G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991, oraz w cytowanych tam pozycjach literaturowych.

W poniższych schematach reakcji związki glikopeptydowe są przedstawione w uproszczonej formie jako prostokąt G, na którym pokazano koniec karboksylowy oznaczony [C], koniec wankozaminowy oznaczony [V], nie-sacharydowy koniec aminowy (ugrupowanie aminowe leucyny) oznaczony [N], i ewentualnie ugrupowanie rezorcyny oznaczone [R], jak pokazano poniżej:

W jednej z korzystnych realizacji związki glikopeptydowe według wynalazku wytwarza się przez redukcyjne alkilowanie glikopeptydu zgodnie z następującą reakcją:

gdzie A oznacza. R^a minus jeden atom węgla, a R^a, R^b, i Y mają znaczenia tu zdefiniowane. Reakcję tę typowo prowadzi się najpierw kontaktując jeden równoważnik glikopeptydu, takiego jak wankomycyna, z nadmiarem, korzystnie od 1,1 do 1,3 równoważników, żądanego aldehydu w obecności nadmiaru, korzystnie około 2,0 równoważników, aminy trzeciorzędowej, takiej jak diizopropyloetyloamina (DIPEA) itp.. Reakcję tę typowo prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak

PL 198 311 B1

DMF, w temperaturze otoczenia przez około 1 do 2 godzin do zasadniczo zakończenia tworzenia odpowładającej iminy i/lub hemiaminalu. Uzyskana amina i/lub hemiaminal zwykle nie jest wyodrębniana, ale jest in situ poddawana reakcji ze środkiem redukującym - wodorkiem metalu, takim jak cyjanoborowodorek sodu, z wytworzeniem odpowiadającej aminy. Reakcję tę typowo prowadzi się przez kontaktowanie iminy i/lub hemiaminalu z około 1 do 1,2 równoważników środka redukującego w temperaturze otoczenia w metanolu w obecności nadmiaru, korzystnie około 3 równoważników, kwasu trifluorooctowego. Uzyskany alkilowany produkt oczyszcza się łatwo za pomocą typowych procedur, takich jak HPLC w układzie faz odwróconych. Nieoczekiwanie, przez utworzenie iminy i/lub hemiaminalu w obecności trialkiloaminy, znacznie zwiększa się selektywność redukcyjnego alkilowania, to jest redukcyjne alkilowanie grupy aminowej sacharydu (np. wankozaminy) jest faworyzowane względem redukcyjnego alkilowania N-końca (np. grupy leucynylowej) w stosunku co najmniej 10:1, bardziej korzystnie 20:1.

W razie potrzeby, związki glikopeptydowe według wynalazku można także wytwarzać w procesie etapowym, w którym do glikopeptydu najpierw przyłącza się prekursor grupy -R^a-Y-R^b-H przez redukcyjne alkilowanie, a następnie przerabia się przyłączony prekursor stosując konwencjonalne reagenty i procedury z wytworzeniem grupy -R^a-Y-Rb-H, jak zilustrowano poniżej. Ponadto, w opisanej wyżej reakcji redukcyjnego alkilowania można także zastosować ketony, otrzymując α-podstawione aminy.

W tych reakcjach redukcyjnego alkilowania można zastosować dowolny glikopeptyd mający grupę aminową. Takie glikopeptydy są dobrze znane w sztuce i są albo dostępne w handlu albo mogą być wyizolowane przy użyciu standartowych procedur. Odpowiednie glikopeptydy ujawniono na przykład w opisach patentowych USA o numerach 3067099; 3338786; 3803306; 3928571; 3952095;

4029769; 4051237; 4066233; 4122166; 4239751; 4303666; 4^^^^^^^; 4378348; 4497802; 4504467;

4542018; 4547488; 4^^^^^^^; 4558994; 4552700; 4558008; 4639433; 4643987; 4661470; 4694069;

4698327; 4782042; 4916168; 4935223; 4946944; 4999555; 4^^^11^^; 5187082; 5192742; 5312738;

5451570; 5591714; 5541630; 5^£^1^ίj1^1^; i Korzzstnie, jako glikoopptyd w ppwyyszej reakcji stosuje się wankomycynę.

Aldehydy i ketony stosowane w reakcji redukcyjnego alkilowania są także dobrze znane w sztuce i są albo dostępne w handlu albo mogą być wytworzone przy użyciu standartowych procedur przy użyciu dostępnych w handlu substratów i typowych reagentów. Typowo, substancje takie wytwarza się przez typowe sprzęganie, na przykład funkcjonalizowanych acetali, mających podstawnik aminowy, tiolowy, hydroksylowy, chlorowcowy lub inny, z odpowiednim związkiem pośrednim, mającym dopełniającą grupę funkcyjną, z wytworzeniem sulfidów, eterów, amin, sulfonamidów itp.. Późniejsza hydroliza acetalu daje odpowiadający aldehyd. Reakcje takie są dobrze znane w sztuce i są opisane, na przykład w March, Advanced Organie Chemistry, Fourth Edition, John Wiley & Sons, New York (1992), oraz w odnośnikach tam cytowanych. Reprezentatywna synteza związków aldehydowych jest zilustrowana na Schematach 1-5:

PL 198 311 B1

na których R oznacza -R^b-H lub -(R^b minus jeden atom węgla)-H (gdzie R^b ma znaczenia tu zdefiniowane).

Dla ilustracji przedstawiono poniższe schematy, które ilustrują syntezę reprezentatywnych substratów i związków według wynalazku. Przykładowo, schemat A ilustruje metodę wytwarzania Fmocaminoaldehydu 5 z odpowiadającego aminoalkoholu 3, gdzie A ma znaczenie tu zdefiniowane. W tej reakcji, aminoalkohol zabezpiecza się typowymi technikami, na przykład przez działanie chloromrówczanem 9-fluorenylometylu w obecności zasady, z wytworzeniem Fmoc-zabezpieczonego aminoalkoholu 4. Utlenianie za pomocą znanych technik daje aldehyd 5.

Schemat B ilustruje alternatywną drogę do F-moc-zabezpieczonego aminoaldehydu 5. Dalsze szczegóły tej drogi są opisane w Sasake, Y., Abe, J. Chem. Pharm. Bull. (1997), 45(1), 13-17.

Fmoc-zabezpieczony aminoaldehyd o wzorze 5 można następnie poddać reakcji z glikopeptydem, na przykład wankomycyną, jak pokazano na Schemacie C.

PL 198 311 B1

gdzie B oznacza -(R^b minus jeden atom węgla)-H, gdzie R^b ma znaczenie takie jak tu zdefiniowano.

Reakcję tę prowadzi się w warunkach redukcyjnego alkilowania, otrzymując pośredni glikopeptyd 11. Odbezpieczenie 11 piperydyną daje odpowiadający glikopeptyd 12, mający pierwszorzędową grupę aminową. Reakcja 12 z aldehydem 13 w standardowych warunkach reakcji redukcyjnego alkilowania daje pochodną glikopeptydu 14 i odpowiadający bis-addukt 15, które rozdziela się typowymi technikami, takimi jak HPLC.

Schemat D ilustruje metodę wytwarzania Fmoc-zabezpieczonego aminoaldehydu 24. Zgodnie z tym schematem, reakcja chlorku kwasowego 19 z aminoestrem 20 w zwykłych warunkach sprzęgania amidowego daje amidoester 21. Redukcja grup estrowej i amidowej za pomocą wodorku metalu jako środka redukującego, takiego jak wodorek litowo glinowy (LAH), daje aminoalkohol 22. Po zabezpieczeniu i utlenieniu, zgodnie ze schematem A, otrzymuje się aldehyd o wzorze 24.

PL 198 311 B1

Alternatywnie, aldehyd 24 można wytworzyć w sposób przedstawiony na schemacie D'. W tej reakcji bezpośrednie alkilowanie aminoalkoholu 3 w zwykłych warunkach alkilowania amin daje aminoalkohol 22, który można następnie wykorzystać tak jak opisano powyżej na Schemacie D.

Schemat D'

Schemat E ilustruje alternatywną metodę wytwarzania aldehydu 24. W reakcji tej aminoacetal 6 poddaje się redukcyjnemu alkilowaniu z wytworzeniem 25. Późniejsze zabezpieczenie grupy aminowej i hydroliza acetalu w zwykłych warunkach daje aldehyd 24.

Schemat F ilustruje inną metodę redukcyjnego alkilowania glikopeptydu. Zgodnie z tym schematem, Fmoc-zabezpieczony aldehyd 24, wytworzony jak opisano powyżej, poddaje się reakcji z glikopeptydem 10, takim jak wankomycyna, w warunkach redukcyjnego alkilowania, z wytworzeniem pochodnej glikopeptydu 27. Po odbezpieczeniu piperydyną otrzymuje się pochodną glikopeptydu 14.

Schemat G ilustruje konwersję grupy karboksylowej pochodnej glikopeptydu, takiej jak wankomycyna, do amidu. W reakcji tej amina 28 reaguje z pochodną glikopeptydu, taką jak 27, w standardowych warunkach sprzęgania peptydowego, na przykład PyBOP i HOBT w DMF, z wytworzeniem po odbezpieczeniu amidu 29.

PL 198 311 B1

Schemat G

Schemat H ilustruje wprowadzanie aminoalkilowego łańcucha bocznego do ugrupowania rezorcynolowego glikopeptydu, takiego jak wankomycyna, na drodze reakcji Mannicha. W reakcji tej amina 30 i aldehyd, taki jak formalina (źródło formaldehydu), reagują z glikopeptydem w warunkach zasadowych, dając pochodną glikopeptydu 31.

Podobnie, Schemat I ilustruje wprowadzanie podstawnika o wzorze -R^a-Y-R^b-H do ugrupowania rezorcynolowego glikopeptydu za pomocą reakcji Mannicha. W reakcjach tych nadmiar aldehydu, takiego jak formaldehyd, może reagować, dając scyklizowane związki o wzorze VIIa i/lub VIIb.

PL 198 311 B1

Schemat J ilustruje syntezę pochodnej glikopeptydu przy zastosowaniu kilku reakcji opisanych powyżej. Zgodnie z tym schematem, pochodną glikopeptydu 27 derywatyzuje się na ugrupowaniu rezorcynolowym, stosując reakcję Mannicha opisaną na Schemacie H, otrzymując pochodną glikopeptydu 40. Odbezpieczenie i sprzęganie amidowe grupy karboksylowej, opisane na schemacie G, daje pochodną glikopeptydu 42.

Schemat K ilustruje reakcję wielokrotnego redukcyjnego alkilowania pochodnej glikopeptydu 27 z wytworzeniem pochodnej glikopeptydu 44a.

Dalsze szczegóły i inne metody wytwarzania związków według wynalazku są opisane poniżej w przykładach.

Kompozycje farmaceutyczne

Wynalazek niniejszy obejmuje także kompozycje farmaceutyczne, zawierające nowe związki glikopeptydowe według niniejszego wynalazku. Zatem, związek glikopeptydowy, korzystnie w formie dopuszczalnej farmaceutycznie soli, może być formułowany do podawania doustnego lub pozajelitowego do leczenia lub profilaktyki infekcji bakteryjnych.

PL 198 311 B1

Dla ilustracji, związek glikopeptydowy może być zmieszany z typowymi nośnikami farmaceutycznymi i stosowany w postaci tabletek, kapsułek, eliksirów, zawiesin, syropów, wafli, itp.. Takie kompozycje farmaceutyczne będą od około 0,1 do około 90% wagowych związku czynnego, a bardziej ogólnie od około 10 do około 30%. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać zwykłe nośniki i substancje pomocnicze, takie jak skrobia kukurydziana lub żelatyna, laktoza, sacharoza, celuloza mikrokrystaliczna, kaolin, mannitol, fosforan diwapniowy, chlorek sodu i kwas alginowy. Do substancji rozsadzających typowo stosowanych w preparatach według wynalazku należą kroskarmeloza, celuloza mikrokrystaliczna, skrobia kukurydziana, skrobi glikolan sodu i kwas alginowy.

Kompozycję ciekłą generalnie będzie stanowić zawiesina lub roztwór związku lub jego dopuszczalnej farmaceutycznie soli w odpowiednim nośniku ciekłym, na przykład etanolu, glicerynie, sorbitolu, rozpuszczalniku niewodnym, takim jak glikol polietylenowy, oleje lub w wodzie, z dodatkiem środka utrzymującego w zawiesinie, konserwanta, środka powierzchniowo czynnego, środka zwilżającego, środka smakowo-zapachowego lub barwnika. Alternatywnie, preparat ciekły może być wytworzony z proszku do rekonstytucji.

Na przykład proszek zawierający związek czynny, środek utrzymujący w zawiesinie, sacharozę i środek słodzący można rekonstytuować wodą otrzymując zawiesinę, a syrop można otrzymać z proszku zawierającego związek czynny, sacharozę i środek słodzący.

Kompozycję w formie tabletki można wytworzyć stosując wszelkie odpowiednie nośniki farmaceutyczne, rutynowo stosowane do wytwarzania kompozycji stałych. Do przykładów takich nośników należą stearynian magnezu, skrobia, laktoza, sacharoza, celuloza mikrokrystaliczna i środki wiążące, na przykład poliwinylopirolidon. Tabletka może być także zaopatrzona w barwną powłoczkę, lub też barwnik może być zawarty jako część nośnika(ów). Ponadto, związek czynny może być formułowany w postaci dawkowania o kontrolowanym uwalnianiu, jak tabletka zawierająca matrycę hydrofobową lub hydrofilową.

Kompozycja w formie kapsułki może być wytworzona przy użyciu rutynowych procedur kapsułkowania, na przykład przez inkorporację związku czynnego i środków pomocniczych do twardej kapsułki żelatynowej. Alternatywnie, można wytworzyć półstałą matrycę związku czynnego i wysokocząsteczkowego glikolu polietylenowego, którą napełnia się twarde kapsułki żelatynowe, lub można wytworzyć roztwór związku czynnego w glikolu polietylenowym lub jego zawiesinę w oleju jadalnym, na przykład ciekłej parafinie lub frakcjonowanym oleju kokosowym i napełniać nią miękkie kapsułki żelatynowe.

Środkami wiążącymi do tabletek są guma akacjowa, metyloceluloza, karboksymetyloceluloza sodowa, poliwinylopirolidon (Povidone), hydroksypropylometyloceluloza, sacharoza, skrobia i etyloceluloza. Jako środki smarne mogą być użyte stearynian magnezu lub inne stearyniany metali, kwas stearynowy, oleje silikonowe, talk, woski, olej i krzemionka koloidalna.

Mogą być także stosowane środki smakowo-zapachowe, takie jak olejek miętowy, olejek wintergrinowy, aromat wiśniowy lub podobne. Ponadto, może być pożądane dodanie środka barwiącego w celu nadania formie dawkowania bardziej atrakcyjnego wyglądu lub ułatwienia identyfikacji produktu.

Związki według wynalazku i ich dopuszczalne farmaceutycznie sole które są czynne po podaniu pozajelitowym mogą być formułowane do podawania domięśniowego, dokanałowego lub dożylnego.

Typową kompozycję do podawania domięśniowego lub dokanałowego stanowi zawiesina lub roztwór składnika czynnego w oleju, na oleju arachidowym lub oleju sezamowym. Typową kompozycję do podawania dożylnego lub dokanałowego stanowi izotoniczny jałowy roztwór, zawierający na przykład składnik czynny i dekstrozę lub chlorek sodu, lub mieszaninę dekstrozy i chlorku sodu. Inne przykłady to mleczanowany płyn Ringera, mleczanowany płyn Ringera plus roztwór dekstrozy do iniekcji, Normosol M i dekstroza, Isolyte E, acylowany płyn Ringera, itp.. Formulacja może ewentualnie zawierać ko-rozpuszczalnik, na przykład glikol polietylenowy, środek chelatujący, na przykład kwas etylenodiaminotetraoctowy, i przeciwutleniacz, na przykład pirosiarczyn sodowy. Alternatywnie, roztwór może być liofilizowany i następnie rekonstytuowany w odpowiednim rozpuszczalniku bezpośrednio przed podaniem.

Związki według wynalazku i ich dopuszczalne farmaceutycznie sole które są czynne po podaniu doodbytniczym mogą być formułowane jako czopki. Typowy czopek generalnie składa się ze składnika czynnego i środka wiążącego i/lub środka smarnego, takiego jak żelatyna lub masło kakaowe lub inne niskotopliwe roślinne lub syntetyczne woski lub tłuszcze.

Związki według wynalazku i ich dopuszczalne farmaceutycznie sole które są czynne po podaniu miejscowym mogą być formułowane jako kompozycje transdermalne lub urządzenia do podawania

PL 198 311 B1 transdermalnego (plastry). Takie kompozycje obejmują, na przykład, podkładkę, zbiornik związku czynnego, membranę regulującą, wyłożenie i kontaktowy środek klejący. Takie plastry transdermalne mogą być stosowane dla uzyskania ciągłej lub nieciągłej infuzji związków według wynalazku w regulowanych ilościach. Budowa i zastosowanie plastrów transdermalnych do dostarczania środków farmaceutycznych są dobrze znane. Patrz np. opis patentowy USA nr U.S. 5023252, opublikowany 11 czerwca 1991. Takie plastry mogą być zbudowane tak, aby dostarczać środki farmaceutyczne ciągle, w sposób pulsowy lub na żądanie.

Związek czynny jest skuteczny w szerokim zakresie dawek i jest generalnie podawany w ilości skutecznej farmaceutycznie. Należy jednak rozumieć, że ilość związku rzeczywiście podawana będzie ustalana przez lekarza prowadzącego z uwzględnieniem istotnych okoliczności, w tym leczonego stanu, wybranej drogi podawania, podawanego związku i jego względnej aktywności, wieku, wagi i reakcji indywidualnego pacjenta, ciężkości objawów u pacjenta, itd.

Odpowiednie dawki generalnie są zawarte w zakresie 0,01-100 mg/kg/dzień, korzystnie 0,1-50 mg/kg/dzień. Dla człowieka o średniej wadze 70 kg, dawka ta wynosić będzie od 0,7 mg do 7 g na dzień, lub korzystnie 7 mg do 3,5 g na dzień.

Inne odpowiednie formulacje do stosowania w niniejszym wynalazku można znaleźć w Remington^ Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985).

Poniższe przykłady formulacji ilustrują reprezentatywne kompozycje farmaceutyczne według wynalazku.

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i A

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego związku według wynalazku:

Składnik llośćna tabletkę (mg)

Związek czynny 200

Laktoza, suszona rozpyłowo 148

Stearynian magnezu 2

Powyższe składniki miesza się i wprowadza do twardej kapsułki żelatynowej.

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i B

Ten przykład ilustruje wytwarzanie innej reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego związku według wynalazku:

Składniki Ilość na tabletkę (mg)

Związek czynny 400

Skrobia kukurydziana 50

Laktoza 145

Stearynian magnezu 5

Powyższe składniki miesza się dokładnie i kompresuje na tabletki jednokrotnie dzielone.

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i C

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej do podawania doustnego związku według wynalazku.

Sporządzono zawiesinę doustną o następującym składzie.

Składniki

Związek czynny	1,000 g
Kwas fumarowy	0,500 g
Chlorek sodu	2,000 g
Metyloparaben	0,100 g
Cukier granulowany	25,500 g
Sorbitol (roztwór 70%	12,850 g
Veegum K (Vanderbilt Co.)	1,000 g
Aromat	0,035 ml
Barwnik	0,500 mg
Woda destylowana	q.s. do 100 ml

PL 198 311 B1

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i D

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek według wynalazku.

Sporządzono preparat do iniekcji buforowany do pH 4 o następującym składzie:

Składniki

Związek czynny 0,2 g

Roztwór buforowy octanu sodu (0,4 M) 2,0ml

HCl (1N) C|.s . dopH4

Woda (destylowana, jałowa) q.s. do 02 ml

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i E

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej do iniekcji związku według wynalazku.

Roztwór do rekonstytucji sporządzono przez dodanie 20 ml jałowej wody do 1 g związku według wynalazku. Przed użyciem roztwór rozcieńcza się 200 ml płynu do iniekcji dożylnych, zgodnego ze związkiem czynnym. Takie płyny wybiera się z 5% roztworu dekstrozy, 0,9% chlorku sodu lub mieszaniny 5% dekstrozy i 0,9% chlorku sodu. Inne przykłady to mleczanowany płyn Ringera, mleczanowany płyn Ringera plus 5% dekstroza do iniekcji, Normosol-M i 5% dekstroza, Isolyte E, i acylowany płyn Ringera

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i F

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej związku według wynalazku do stosowania miejscowego.

Składniki

Związek czynny 0,2-10

Span 60 2

Tween 60 2

Olej mineralny 5

Wazelina 10

Metyloparaben 0,15

Propyloparaben 0,05

BHA (butylowany hydroksyanizol) 0,01

Woda q.s. do 100

Wszystkie powyższe składniki, poza wodą, łączy się i mieszając ogrzewa do 60°C. Następnie w temperaturze 60°C dodaje się, energicznie mieszając, odpowiednią ilość wody do zemulgowania składników, po czym dodaje się wodę w ilości uzupełniającej do 100 g.

P r z y k ł a d f o r m u l a c j i G

Ten przykład ilustruje wytwarzanie reprezentatywnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej związek według wynalazku.

Sporządza się czopek o masie całkowitej 2,5 grama o następującym składzie:

Składniki

Związek czynny 000 mg

Witepsol H-15* do bilansu (*triglicerydy nasyconego kwasu tłuszczowego; produkt firmy Riches-Nelson, Inc., New York, N.Y.)

Użyteczność

Związki glikopeptydowe według wynalazku i ich dopuszczalne farmaceutycznie sole są użyteczne w leczeniu metodami medycznymi i wykazują czynność biologiczną, w tym czynność przeciwbakteryjną, która może być wykazana w testach opisanych w przykładach. Takie testy są dobrze znane specjalistom i są powołane i opisane w Lorian Antibiotics w Laboratory Medicine, Fourth Edition, Williams i Wilkins (1991).

Zgodnie z tym, związki według wynalazku znajdą zastosowanie w sposobach leczenia chorób infekcyjnych, zwłaszcza chorób powodowanych przez mikroorganizmy Gram-dodatnie, u zwierząt.

PL 198 311 B1

Związki według wynalazku są szczególnie użyteczne w leczeniu chorób spowodowanych przez gronkowce oporne na metycylinę. Związki są także użyteczne w leczeniu infekcji powodowanych przez paciorkowce jelitowe, w tym paciorkowce jelitowe oporne na wankomycynę (VRE). Przykładami takich chorób są ciężkie infekcje gronkowcowe, na przykład gronkowcowe zapalenie mięśnia sercowego i posocznica gronkowcowa. Zwierzę może być albo podatne na mikroorganizm albo zainfekowane mikroorganizmem. Sposób leczenia polega na podawaniu zwierzęciu związku według wynalazku w ilości, która jest skuteczna do tego celu. Generalnie, skuteczna ilość związku według wynalazku jest to dawka między około 0,5 do około 100 mg/kg. Korzystna dawka to od około 1 do około 60 mg/kg związku czynnego. Typowa dawka dzienna dla dorosłego człowieka wynosi od około 50 mg do około 5 g.

Realizując ten sposób można podawać antybiotyk w jednej dawce dziennej lub w wielu dawkach dziennie. Reżim leczenia może wymagać podawania w dłuższych okresach czasu, na przykład przez kilka dni lub przez jeden do sześciu tygodni. Ilość w podawanej dawce lub łączna podawana ilość będą zależeć od takich czynników jak rodzaj i ciężkość infekcji, wiek i ogólny stan zdrowia pacjenta, tolerancja pacjenta na antybiotyk oraz rodzaju mikroorganizmu lub mikroorganizmów powodujących infekcję.

Spośród innych właściwości, związki według wynalazku okazały się także bardziej stabilne chemicznie w porównaniu z N-acylowanymi pochodnymi glikopeptydów. W szczególności zaobserwowano, że acylowanie grupy aminowej w ugrupowaniu wankozaminy zwiększa szybkość hydrolizy ugrupowania disacharydowego. W przeciwieństwie do tego, kiedy związki według wynalazku są podstawione na grupie aminowej ugrupowania wankozaminowego grupą -R^a-Y-R^b-H, nie obserwuje się wzrostu szybkości hydrolizy ugrupowania disacharydowego.

Poniższe przykłady syntetyczne i biologiczne przedstawiono dla ilustracji i nie należy ich interpretować jako ograniczenia zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d y

W poniższych przykładach następujące skróty mają następujące znaczenia. Wszelkie skróty nie zdefiniowane mają swoje ogólnie akceptowane znaczenia. Jeśli nie wskazano inaczej, wszystkie temperatury podano w stopniach Celsjusza.

BOC, Boc

DIBAL-H

DIPEA

DMF

DMSO ^eq.

Et

EtOAc

Fmoc

HOBT

Me

PyBOP TEMPO TFA THF TLC, tle tert-butoksykarbonyl wodorek diizobutyloglinowy diizopropyloetyloamina dimetyloformamid dimetylosulfotlenek równowaznik etyl octan etylu

9-fluorenylometoksykarbonyl wodzian 1-hydroksybenzotriazolu metyl heksafluorofosforan benzotriazol-1-iloksytris(pirolidyno)fosfonium 2,2,6,6-tetrametylopiperydynyloksyl, wolny rodnik kwas trifluorooctowy tetrahydrofuran chromatografia cienkowarstwowa

W poniższym przykładzie użyto semihydrat chlorowodorku wankomycyny, nabyty w firmie Alpharma, Inc. Fort Lee, NJ 07024 (Alpharma AS, Oslo Norwegia). Inne reagenty są dostępne w firmie Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53201.

Procedura ogólna A

Redukcyjne alkilowanie wankomycyny

Do mieszaniny wankomycyny (1 eq.) i odpowiedniego aldehydu (1,3 eq.) w DMF dodaje się DIPEA (2 eq.). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny, monitorując za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych. Do roztworu dodaje się metanol i NaCNBH3 (1 eq.) a następnie TFA (3 eq.). Kontynuuje się mieszanie w temperaturze pokojowej przez następną godzinę. Po zakończeniu reakcji usuwa się metanol pod próżnią. Pozostałość wytrąca się acetonitryPL 198 311 B1 lem. Po filtracji otrzymuje się produkt, który następnie oczyszcza się metodą HPLC w układzie faz odwróconych.

Za pomocą tej procedury można wytworzyć inne glikopeptydy.

Procedura ogólna B

Procedura I alkilowania aglikonu

Białą zawiesinę soli TFA aglikonu wankomycyny (1,0 eq.), Cs2CO3 (3,5 eq.) w DMF miesza się w temperaturze pokojowej przez 30 min. Dodaje się halogenek alkilowy (1,1 eq.). Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się przez 5-24 h, po czym kończy reakcję dodając kwas octowy. Uzyskany brązowy roztwór wylewa się do wody, otrzymując biały osad. Po filtracji otrzymuje się surowy monoalkilowany produkt, który można oczyścić w razie potrzeby za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych.

Procedura ogólna C

Procedura II alkilowania aglikonu

W atmosferze azotu sól trifluorooctanową aglikonu wankomycyny (1 eq) rozpuszcza się w DMF i miesza energicznie w temperaturze pokojowej przez godzinę z węglanem potasu (8-10 eq). Dodaje się halogenek alkilowy (1 eq) i mieszaninę miesza energicznie do następnego dnia. Surowy produkt zbiera się przez strącenie do eteru dietylowego, przemywa acetonitrylem i zadaje 10% wodnym roztworem kwasu octowego. Po oczyszczeniu metodą HPLC w układzie faz odwróconych otrzymuje się produkt monoalkilowany.

Procedura ogólna D

Wytwarzanie amino-podstawionych aldehydów

Roztwór aminoacetalu (1 eq), takiego jak acetal dimetylowy 2-aminoacetaldehydu, aldehydu (1,05 eq), i NaCNBH3 (1 eq) w CH2C3 miesza się w temperaturze pokojowej przez 1-4 godziny. Postęp reakcji śledzi się za pomocą TLC. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się FmocCl (1 eq) i DIPEA (2 eq) w temperaturze 0°C. Mieszanie w temperaturze pokojowej kontynuuje się przez 1-2 godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną przemywa się 0,1 N HCl, wodą i solanką. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią, a pozostałość oczyszcza się przez chromatografię flash, otrzymując amino-podstawiony acetal.

Do roztworu powyższego amino-podstawionego acetalu w acetonie dodaje się 6N HCl (1,5 eq). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 5-16 godzin. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i pozostałość suszy się pod wysoką próżnią, otrzymując surowy aminopodstawiony aldehyd, który typowo stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Procedura ogólna E

Wytwarzanie tio-podstawionych aldehydów

Roztwór bromoacetalu (1 eq), takiego jak acetal dimetylowy 2-bromoacetaldehydu i jodek sodu (1 eq) w DMF miesza się w temperaturze pokojowej przez 0,5 h. Do roztworu dodaje się podstawiony tiol (1 eq), taki jak n-decylotiol, następnie węglan potasu (1 eq). Mieszaninę miesza się w temperaturze 25-80°C przez 4-16 godzin. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się octan etylu, przemywa dwa razy wodą i raz nasyconym NaCl. Warstwę organiczną suszy się nad MgSO4 i rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią. Po oczyszczeniu przez chromatografie flash (heksan:octan etylu = 8:1) otrzymuje się odpowiadający tio-podstawiony acetal.

Do roztworu tio-podstawionego acetalu w acetonie dodaje się 6N HCl (1,5 eq). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 5-16 godzin. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią, a pozostałość suszy się pod wysoką próżnią, otrzymując surowy tio-podstawiony aldehyd, który typowo stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Procedura ogólna F

Wytwarzanie tio-podstawionych aldehydów

Mieszaninę estru tiolu (1 eq), takiego jak tioglikolan metylu, jodku sodu (1 eq), bromku alkilu (1 eq) i węglanu potasu (1 eq) w DMF miesza się w temperaturze pokojowej przez 4-16 godzin. Mieszaninę reakcyjną przenosi się do octanu etylu i przemywa wodą i solanką. Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu i rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią. Po oczyszczeniu przez chromatografię flash otrzymuje się tio-podstawiony ester.

Na tio-podstawiony ester w suchym eterze działa się DIBAL-H (1M roztwór w cykloheksanie, 1,3 eq) w temperaturze -78°C. Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze -78°C przez 2-4 godziny. Do śledzenia postępu reakcji stosuje się TLC. Po zakończeniu dodaje się mrówczan etylu (0,5 eq) w celu zgaszenia mieszaniny reakcyjnej. Następnie mieszaninę reakcyjną prze20

PL 198 311 B1 mywa się 10% kwasem octowym, wodą i solanką. Warstwę organiczną suszy się nad siarczanem magnezu i usuwa rozpuszczalnik, otrzymując surowy tio-podstawiony aldehyd, który typowo stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Procedura ogólna G

Wytwarzanie alkoksy-podstawionych aldehydów

Na roztwór hydroksyacetalu (1 eq), takiego jak acetal dimetylowy 2-hydroksyacetaldehydu, w THF działa się wodorkiem sodu (1 eq) w temperaturze 0°C. Po ustaniu wydzielania się wodoru, dodaje się bromek alkilu w temperaturze 0°C. Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 1-4 godziny. Mieszaninę reakcyjną przenosi się do octanu etylu i przemywa wodą i solanką. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i pozostałość oczyszcza typowo przez chromatografię flash, otrzymując alkoksy-podstawiony acetal.

Do roztworu alkoksy-podstawionego acetalu w acetonie dodaje się 6N HCl (1,5 eq). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 5-16 godzin. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i pozostałość suszy się pod wysoką próżnią, otrzymując surowy alkoksy-podstawiony aldehyd, który typowo stosuje się bez dalszego oczyszczania.

Procedura ogólna H

Wytwarzanie sulfonamido-podstawionych aldehydów

Na roztwór aminoacetalu (1 eq), takiego jak acetal dimetylowy 2-aminoacetaldehydu i diizopropyloetyloaminy (2 eq) w THF działa się chlorkiem sulfonylu (1 eq) w temperaturze 0°C. Następnie mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 1-4 godziny. Mieszaninę reakcyjną przenosi się następnie do octanu etylu i przemywa 0,1N HCl, wodą i solanką. Rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i pozostałość oczyszcza przez chromatografię flash, otrzymując sulfonamido-podstawiony acetal.

Do roztworu sulfonamido-podstawionego acetalu w acetonie dodaje się 6N HCl (1,5 eq). Mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 5-16 godzin. Następnie rozpuszczalnik usuwa się pod próżnią i pozostałość suszy się pod wysoką próżnią, otrzymując surowy sulfonamido-podstawiony aldehyd, który typowo stosuje się bez dalszego oczyszczania.

P r z y k ł a d A

Wytwarzanie Fmoc-aminoacetaldehydu

Fmoc-zabezpieczony aminoetanol wytworzono z aminoetanolu stosując typowe techniki (np. takie jak opisane poniżej w przykładach B i C).

Do mieszaniny Fmoc-aminoetanolu (37,64 g, 133 mmoli, 1,0 eq), TEMPO (0,008M w CH₂Cl₂, 332,5 ml, 2,66 mmoli, 0,02 eq), KBr (0,5M roztwór wodny, 53,2 ml, 26,6 mmoli, 0,2 eq) i octanu etylu (1500 ml), w temperaturze 0°C, dodano NaOCl (0,35 M, buforowany do pH 8,6 przez NaHCO3, 760 ml, 266 mmoli, 2,0 eq). Dla zapewnienia dostatecznego mieszania zastosowano mieszadło mechaniczne. Mieszaninę reakcyjną monitorowano za pomocą TLC. Po 20 minutach rozdzielono dwie warstwy. Warstwę wodną ekstrahowano octanem etylu (2 x 250 ml), połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym Na₂S₂O3, wodą i solanką, wysuszono nad Na₂SO4, przesączono i zatężono do około 400 ml. Dodano heksan (1600 ml), otrzymując biały osad. Po odsączeniu zebrano Fmoc-aminoacetaldehyd (25,2 g, 67%) w postaci białego proszku.

P r z y k ł a d B

Wytwarzanie N-Fmoc-2-(n-decylamino)acetaldehydu

Do roztworu chlorku n-dekanoilu (2,7 ml, 13 mmoli, 1,0 eq) w chlorku metylenu (20 ml) w łaźni suchy lód/aceton wkroplono mieszaninę chlorowodorku estru metylowego glicyny (2,0 g, 16 mmoli, 1,2 eq) i DIPEA (5,1 ml, 29 mmoli, 2,2 eq) w chlorku metylenu (20 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez dalsze 60 minut po zakończeniu wkraplania, po czym przemyto dwukrotnie 3N kwasem chlorowodorowym (50 ml), następnie nasyconym wodorowęglanem potasu (50 ml). Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 2-decylamidooctan metylu (3,0 g, 12 mmoli, 95%), który użyto w następnym etapie bez dalszego oczyszczania.

2-(n-Decylamido)octan metylu (3,0 g, 12 mmoli, 1,0 eq) w atmosferze azotu rozpuszczono w bezwodnym tetrahydrofuranie (25 ml) i oziębiono w łaźni lodowej. Ostrożnie dodano roztwór wodorku litowo-glinowego (1N, 25 ml, 25 mmoli, 2,0 eq). Uzyskany roztwór ogrzewano do wrzenia pod azotem do następnego dnia, po czym oziębiono w łaźni lodowej. Dodano tetra-hydrofuran (50 ml), a następnie powoli dodawano dziesięciowodzian siarczanu sodu aż do ustania pienienia się. Mieszaninę pozostawiono

PL 198 311 B1 do dojścia do temperatury pokojowej, przesączono, po czym zatężono pod próżnią. Otrzymano 2-(n-decyloamino)etanol (2,3 g, 11 mmoli, 93%), który używano bez dodatkowego oczyszczania.

2-(n-Decylamino)etanol (2,3 g, 11 mmoli, 1,1 eq) i DIPEA (2,0 ml, 11 mmoli, 1,1 eq) rozpuszczono w chlorku metylenu (15 ml) i oziębiono w łaźni lodowej. Dodano chloromrówczan 9-fluorenylometylu (2,6 g, 10 mmoli, 1,0 eq) w chlorku metylenu (15 ml), mieszaninę mieszano przez 30 minut, po czym przemyto dwukrotnie 3N kwasem chlorowodorowym (50 ml) i nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (50 ml). Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem. N-Fmoc-2-(decylamino)etanol (4,6 g, 11 mmoli, 108%) wykorzystywano bez dalszego oczyszczania.

N-Fmoc-2-(n-decylamino)etanol (4,6 g, 11 mmoli, 1,0 eq) i DIPEA (7,6 ml, 44 mmoli, 4,0 eq) rozpuszczono w chlorku metylenu (30 ml) i oziębiono w łaźni suchy lód/aceton. Dodano roztwór pirydynowego kompleksu tritlenku siarki (6,9 g, 43 mmoli, 4,0 eq) w dimetylosulfotlenku (30 ml) i roztwór mieszano przez 20 minut. Dodano pokruszony lód i mieszaninę podzielono. Fazę organiczną przemyto dwukrotnie 3N kwasem chlorowodorowym, nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu i nasyconym roztworem chlorku sodu, wysuszono nad chlorkiem magnezu, i zatężono pod próżnią. N-Fmoc-2-(n-decyloamino)acetaldehyd (3,4 g, 8 mmoli, 74%) wykorzystywano bez dalszego oczyszczania (patrz przykład 5).

P r z y k ł a d C

Wytwarzanie 2-(decyloamino)etanolu

Roztwór aminoetanolu (30,5 g, 500 mmoli, 30,1 ml) i 1-bromodekanu (27,65 g, 125 mmoli, 26 ml) w etanolu mieszano w temperaturze 65°C przez 4 godziny. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozcieńczono EtOAc (800 ml) i roztwór organiczny przemyto H2O (2 x 200 ml), nasyconym roztworem wodnym NaHCO₃ (200 ml) i nasyconą solanką (200 ml). Fazę organiczną wysuszono nad bezwodnym Na₃SO4 i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany surowy produkt, 2-(decyloamino)etanol, wykorzystywano bez dalszego oczyszczania.

P r z y k ł a d D

Wytwarzanie N-Fmoc-2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu ó-ans-4-Decenal (7,2 g, 46,6 mmoli) zmieszano z 40 ml (0,37 moli) dimetylowego acetalu aminoacetaldehydu w 400 ml metanolu i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodano NaCNBH₃ (2,9 g, 46,6 mmoli), mieszaninę reakcyjną oziębiono w łaźni lodowej i wkroplono 27 ml (0,35 moli) TFA w ciągu 5 minut. Następnie usunięto łaźnię lodową i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 70 minut w temperaturze pokojowej, zatężono do jednej trzeciej jej objętości i podzielono między octan etylu (250 ml) i 1N NaOH (200 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą (3 x 75 ml), wysuszono nad MgSO4, przesączono i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 11,1 g (45,6 mmoli) acetalu dimetylowego 2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu w postaci żółtego oleju, który użyto bezpośrednio w następnym etapie.

Acetal dimetylowy 2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu (10,5 g, 43,2 mmoli) zmieszano z dichlorometanem (300 ml) i dodano porcjami 7,5 ml (43,2 mmoli) diizopropyloetyloaminy i 11,2 g (43,2 mmoli) FMOCCl. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i po czym wylano do 10% roztworu KHSO4 (200 ml). Warstwę organiczną przemyto wodą (200 ml), wysuszono nad MgSO4, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany olej chromatografowano na żelu krzemionkowym w 10% EtOAc/heksany, otrzymując 16,1 g (34,6 mmoli) acetalu dimetylowego N-Fmoc-2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu w postaci klarownego oleju, który użyto bezpośrednio w następnym etapie.

Acetal dimetylowy N-Fmoc-2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu (5 g, 10,7 mmoli) zmieszano z 30 ml TFA i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną wylano do wody (140 ml) i odwirowano, otrzymując klarowny olej. Supernatant zdekantowano i zmieszano olej z 40 ml wody i ponownie odwirowano. Supernatant zdekantowano ponownie i rozpuszczono olej w dichlorometanie (100 ml), wysuszono nad MgSO4, przesączono, i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 5,2 g (12,3 mmoli) N-Fmoc-2-(/rans-dec-4-en-1-yloamino)acetaldehydu w postaci klarownego oleju.

P r z y k ł a d E

Wytwarzanie związku o wzorze V (poza zakresem wynalazku)

PL 198 311 B1

gdzie R²² oznacza OH a R²³ oznacza -CH2-N-(N-CH3-D-glukamina

Wankomycynę (9,0 g, 5,16 mmoli) dodano do roztworu N-metylo-D-glukaminy (5,03 g, 25,8 mmoli) i 37% formaldehydu (0,43 ml, 5,4 mmoli) w 50% wodnym acetonitrylu (60 ml) pod azotem i mieszano w temperaturze pokojowej. Po 4 godzinach acetonitryl usunięto pod próżnią, dodano wodę (30 ml) i ustawiono wartość pH na ~4 za pomocą 10% kwasu trifluorooctowego. Roztwór oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych. Frakcje zawierające żądany produkt zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, połączono i liofilizowano, otrzymując związek tytułowy w postaci białego proszku. Ten półprodukt można dalej derywatyzować stosując procedury opisane w niniejszym zgłoszeniu.

P r z y k ł a d F.

Wytwarzanie związku o wzorze IV (poza zakresem wynalazku)

^gdzⁱe ^{r15 i r16} oznaczaj^{ą H}, ^r22 oznacza ^OH a ^r27 oznacza -C^H2^CH2-^NH-^Fmoc

PL 198 311 B1

Chlorowodorek wankomycyny (4,00 g, 2,60 mmoli) zawieszono w 40 ml 1,3-dimetylo-3,4,5,6tetrahydro-2(1H)-pirymidynonu i ogrzewano do 70°C przez 15 minut. Dodano W-(9-fluorenylometoksykarbonylo)-aminoacetaldehyd (720 mg, 2,6 mmoli) i mieszaninę ogrzewano w temperaturze 70°C przez jedną godzinę. Dodano cyjanoborowodorek sodu (160 mg, 2,5 mmoli) w 2 ml metanolu i mieszaninę ogrzewano w temperaturze 70°C przez 2 godziny, po czym oziębiono do temperatury pokojowej. Mieszaninę reakcyjną wkroplono do 20 ml acetonitrylu, otrzymując osad, który zebrano przez odwirowanie. Osad oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych na kolumnie Ranin C18 Dynamax (2,5 cm x 25 cm, wielkość cząstek 8 ąm), przy szybkości przepływu 10 ml/min, stosując 0,045% TFA w wodzie jako bufor A i 0,045% TFA w acetonitrylu jako bufor B (gradient HPLC 10-70% B w ciągu 90 minut), co dało tytułowy związek pośredni w postaci soli trifluorooctanowej. MS obliczone: MH+, 1715; znalezione, 1715.

Związek ten można odbezpieczyć i dalej derywatyzować, na przykład poprzez redukcyjne alkilowanie, jak opisano w opisie.

P r z y k ł a d 1 ^Synteza zw^iąz^ku o wzorze III (^gdzte ^r15 oznacza -^CH2^CH2-N^H-(^CH2)ci^CH3)

Do wysuszonej w suszarce kolby okrągłodennej o pojemności 1000 ml, wyposażonej w mieszadło magnetyczne, dodano wankomycynę (34,1 g, 23 mmoli, 1 eq), N-Fmoc-aminoacetaldehyd (6,5 g, 23 mmoli, 1 eq), DIPEA (8,5 ml, 46 mmoli, 2 eq) i DMF (340 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, monitorując za pomocą HPLC. Gdy mieszanina reakcyjna stała się jednorodna, zaobserwowano ~90% konwersję do iminy. Do roztworu dodano metanol (340 ml) i NaCNBH3 (4,3 g, 69 mmoli, 3 eq), następnie TFA (5,2 ml, 69 mmoli, 3 eq). Kontynuowano mieszanie przez dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji metanol usunięto pod próżnią. Pozostałość zawierającą surowy produkt i DMF wylano powoli do kolby o pojemności 5 l i zmieszano z acetonitrylem (3,5 l). Utworzył się biały osad. Zawiesinę pozostawiono do ustania się w temperaturze pokojowej i zdekantowano supernatant. Biały osad przesączono i roztarto z eterem (2 l). Po odsączeniu surowy produkt suszono pod wysoką próżnią do następnego dnia.

W kolumnie 8 x 26 cm upakowano oktadecylowy silikażel. Kolumnę przemyto 800 ml 90% rozpuszczalnika B [acetonitryl w wodzie, 0,1% TFA] i równowagowano 800 ml 10% rozpuszczalnika B. Surowy produkt (10 g) rozpuszczono w 30% rozpuszczalniku B (150 ml, zawierający 2 ml 3N HCl) i załadowano na kolumnę. Następnie wymywano 10%B (800 ml x 2), 40%B (800 ml x 3) i 90%B (800 ml). Frakcje sprawdzano za pomocą analitycznej HPLC. Po liofilizacji otrzymano N^van-Fmocaminoetylowankomycynę jako sól TFA.

Nvan-Fmoc-aminoetylowankomycynę odbezpieczono, otrzymując sól tri-TFA Nvan-aminoetylowankomycyny, stosując typowe procedury (np. takie jak opisano w przykładach 2 i 3).

Do roztworu soli tri-TFA N^raminoetylowankomycyny (15,5 mg, 8,4 mikromoli) w mieszaninie metanol:DMF:THF (2:1:1, 1,6 ml) dodano dekanal (92 mikrolitra, 59 mikromoli) i cyjanoborowodorek sodu (0,1M w metanolu, 45 mikrolitra, 4,5 mikromoli). Po 45 minutach usunięto rozpuszczalniki pod próżnią, i pozostałość oczyszczono przez preparatywną HPLC. Odpowiednie frakcje połączono i liofilizowano, otrzymując Nvan-2-(n-decyloamino)etylowankomycynę (2,4 mg) w postaci białego proszku. Wyizolowano także Nv^an,Nv^an-bis-2-(n-decyloamino)etylowankomycynę (2,9 mg).

P r z y k ł a d 2

Synteza związku o wzorze III (^gdzie R¹⁵ oznacza -^CH2^CH2-^NH-(^CH2)₉ ^CH3)

Chlorowodorek wankomycyny (12 g, 7,7 mmoli, 1,0 eq), N-Fmoc-2-(n-decyloamino)acetaldehyd (3,2 g, 7,6 mmoli, 1,0 eq) i DIPEA (2,6 ml, 14,9 mmoli, 2,0 eq) mieszano w temperaturze pokojowej w DMF (120 ml) przez 90 minut. Dodano cyjanoborowodorek sodu (1,4 g, 22 mmoli, 3,0 eq), następnie metanol (120 ml), po czym kwas trifluorooctowy (1,8 ml, 23 mmoli, 3,0 eq). Mieszaninę mieszano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, po czym usunięto metanol pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany roztwór dodano do 600 ml eteru dietylowego, otrzymując osad który przesączono, przemyto eterem i wysuszono pod próżnią. Surowy produkt oczyszczono na kolumnie w układzie flash w układzie faz odwróconych, eluując 10, 20, 30% acetonitrylem w wodzie (zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego) w celu usunięcia polarnych zanieczyszczeń (takich jak pozostałości wankomycyny), po czym produkt eluowano 70% acetonitrylem w wodzie (zawierającym 0,1% kwasu trifluorooctowego), otrzymując 9 g Nvan-(N-Fmoc-2-n-decyloaminoetylo)wankomycyny w postaci soli trifluorooctanowej (4,3 mmoli, 56%).

PL 198 311 B1

N^van-(N-Fmoc-2-n-decyloaminoetylo)wankomycynę (100 mg) rozpuszczono w 1 ml DMF (1 ml) i działano piperydyną (200 μΙ) przez 30 minut. Mieszaninę wytrącono do eteru, odwirowano i przemyto acetonitrylem. Po preparatywnej chromatografii HPLC w układzie faz odwróconych (10-70% acetonitryl w wodzie zawierający 0,1% kwasu trifluorooctowego w ciągu 120 minut) otrzymano Nvan-2-(n-decyloamino)etylowankomycynę jako sól TFA.

P r z y k ł a d 3

Synteza związku o wzorze III (poza zakresem wynalazku) (^gdzie R¹⁵ oznacza -^CH2C^H2-^NH-(^CH2)₉ ^CH3, R¹⁷ oznacza ^{H i} R²² oznacza -^N-(D-^glu^kozamⁱn^ę)

Nvan-(N-Fmoc-2-n-decyloaminoetylo)wankomycynę (100 mg, 48 μί^Ν, 1,0 eq) rozpuszczono w 1 ml DMF i dodano chlorowodorek glukozaminy (31 mg, 144 μmoli, 3,0 eq). Mieszaninę mieszano energicznie przez 30 minut (chlorowodorek glukozaminy nie rozpuścił się całkowicie), dodano DIPEA (60 μΙ, 344 μί^Ν, 7,2 eq) i mieszaninę mieszano energicznie przez dalsze 30 minut. Przygotowano roztwór heksafluorofosforanu benzo-triazol-1-yloksy-tris-pirolidyno-fosfoniowego (PyBOP, 50 mg, 96 μί^Ν, 2,0 eq) i 1-hydroksybenzotriazolu (14 mg, 104 μί^Ν, 2,2 eq) w 500 μl DMF. Roztwór PyBOP dodano w 5 porcjach po 60 μl w odstępach co 5 minut do energicznie mieszanej zawiesiny pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez dodatkowe 30 minut, po czym wytrącono do acetonitrylu. Osad zebrano przez odwirowanie, przeniesiono do 1 ml W,W-dimetyloformamidu i działano przez 30 minut 200 μl piperydyny. Wytrącono do eteru, następnie odwirowano i przemyto osad acetonitrylem. Po preparatywnej HPLC w układzie faz odwróconych (10-70% acetonitryl w wodzie zawierający 0,1% kwasu trifluorooctowego w ciągu 120 minut) otrzymano związek o wzorze III gdzie R¹5 oznacza -CH2CH2-NH-(CH2)9CH3 a R22 oznacza -N-(D-glukozaminę) jako jego sól trifluorooctanową.

P r z y k ł a d 4

Synteza związku o wzorze III (poza zakresem wynalazku) (gdzie R¹5 oznacza -CH2CH2-NH-(CH2)9CH a R22 oznacza -NH-CH(COOH)C^COOH)

HOBt (1,47 g, 10,9 mmoli), PyBOP (7,57 g, 14,6 mmoli) i ester bis-fluorenylometylowy kwasu L-asparaginowego (TFA, 6,26 g, 10,4 mmoli) dodano do dobrze mieszanego roztworu Nvan-(N-Fmoc-2-n-decyloamino-etylo)wankomycyny (20 g, 10,4 mmoli) i DIPEA (5,44 ml, 31,2 mmoli) w DMF (440 ml). Po 1 godzinie stwierdzono za pomocą MS zakończenie reakcji. Mieszaninę wytrącono do CH3CN (4 l) i odwirowano. Supernatant zdekantowano, a peletkę rozpuszczono w DMF (440 ml). Dodano piperydynę (44 ml) i mieszaninę reakcyjną monitorowano za pomocą MS. Po 1 godzinie reakcja była zakończona. Strącono osad przez wkraplanie do Et2O (4 l) przy ciągłym mieszaniu do następnego dnia. Osad zebrano przez odsączenie i wysuszono pod próżnią. Uzyskany osad roztarto następnie z CH3CN i zebrano przez odsączenie i wysuszono pod próżnią, otrzymując żądany produkt jako brudno-biały osad, który oczyszczono przez HPLC w układzie faz odwróconych.

P r z y k ł a d 5

Synteza związku o wzorze V (poza zakresem wynalazku) (^gdzie R¹⁵ oznacza ^H a ^r23 oznacza -^CH2-^NH-^CH2^CH2-^NH-(^CH2)£>^CH3)

Do 50% wodnego acetonitrylu (1,0 ml) dodano diaminoetan (30 mg, 0,5 mmoli), 37% formalinę (7,6 μΙ, 0,20 mmoli) i chlorowodorek wankomycyny (140 mg, 0,10 mmoli). Mieszano przez 3 h, po czym produkt strącono przez dodanie acetonitrylu (12 ml). Osad wydzielono przez odwirowanie, po czym przemyto eterem (12 ml). Uzyskany osad wysuszono pod próżnią i oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych (5-15% B w ciągu 40 min przy prędkości przepływu 50 ml/min). Frakcje zawierające żądany produkt zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, połączono i liofilizowano, otrzymując związek o wzorze V gdzie r23 oznacza -CH2-NH-CH2CH2NH2 (85 mg) w postaci białego proszku. MS obliczono (MH+), 1520; znaleziono, 1520.

Do roztworu związku z powyższego etapu (80 mg, 0,040 mmoli) w etanolu (1,0 ml) i DMF (1,0 ml) dodano n-dekanal (6,3 mg, 0,040 mmoli) i mieszaninę mieszano przez 45 minut. Następnie dodano cyjanoborowodorek sodu (0,1 M w metanolu, 400 μΙ, 0,040 mmoli) i mieszaninę mieszano przez 3 godziny. Rozpuszczalniki usunięto pod próżnią, i pozostałość oczyszczono za pomocą preparatywnej HPLC. Frakcje zawierające żądany produkt zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, połączono i liofilizowano, otrzymując związek tytułowy w postaci białego proszku. MS obliczono (MH+), 1661; znaleziono, 1661.

P r z y k ł a d 6

Synteza związku o wzorze V (poza zakresem wynalazku)

PL 198 311 B1 (gdzie R¹⁵ oznacza -CH2-NH-CH2CH2-NH-(CH2)9CH3, R²² oznacza -N-(D-glukozaminę) a R²³ oznacza -CH2-N-(N-CH4-D-glukaminę))

Do 50% wodnego acetonitrylu (10 ml) dodano kolejno N-metylo-D-glukaminę (975 mg, 5,0 mmoli), 37% formalinę (84 μ|, 1,1 mmoli), DIPEA (348 μ|, 2,0 mmoli) i N^van-(N-Fmoc-2-n-de-cyloaminoetylo)wankomycynę (2,15 g, 1,030 mmoli). Mieszano przez 16h, po czym produkt strącono przez dodanie acetonitrylu (80 ml). Osad wydzielono przez odwirowanie, po czym przemyto acetonitrylem (80 ml). Osad rozpuszczono w DMF (6,0 ml) i piperydynie (2,0 ml). Po 30 minutach produkt strącono przez dodanie acetonitrylu (80 ml). Osad wydzielono przez odwirowanie, po czym przemyto eterem (80 ml). Uzyskany osad wysuszono pod próżnią i oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych (10-35%B) w ciągu 40 min przy prędkości przepływu 50 ml/min. Frakcje zawierające żądany produkt zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, połączono i liofilizowano, otrzymując związek o wzorze V gdzie R¹5 oznacza -CH²-^NH-^CH2C^H2-^NH-(^CH2)⁹C^H3 a ^r23 oznacza -CHrN-CN-CHrD-gfokamtaę) (^{1,34 g}) w piostad Małego proszku. MS obliczono (MH+), 1839; znaleziono, 1839.

Powyższy związek (tetrasól TFA) (150 mg, 0,065 mmoli) rozpuszczono w DMF. Do tego roztworu dodano kolejno chlorowodorek D-glukozaminy (35 mg, 0,16 mmoli), DIPEA (65 μΙ, 0,32 mmoli), i roztwór PyBOP i HOBt w DMF (po 3,85 ml 0,02M roztworów, 0,077 mmoli każdy). Po 30 minutach produkt wytrącono przez dodanie acetonitrylu (40 ml). Osad wydzielono przez odwirowanie, po czym przemyto acetonitrylem (40 ml). Uzyskany osad wysuszono pod próżnią i oczyszczono za pomocą HPLC w układzie faz odwróconych (10-35%B w ciągu 40 min przy prędkości przepływu 50 ml/min). Frakcje zawierające żądany produkt zidentyfikowano za pomocą spektrometrii masowej, połączono i liofilizowano do związku tytułowego w postaci białego proszku. MS obliczono (MH+), 2000; znaleziono, 2000.

P r z y k ł a d 7

Synteza związku o wzorze IV (poza zakresem wynalazku) (^gdzie R¹⁵ oznacza -^CH2-^NH-^CH2^CH2-^NH-(^CH2)^9CH3 ^r22 oznacza -^OH a ^r27 oznacza -CH₂C-(O)OCH₂CHa)

Na roztwór monochlorowodorku wankomycyny (3,72 g, 2,5 mmoli) w DMF (35 ml) działano diizopropyloetyloaminą (0,87 ml, 5,0 mmoli) następnie N-Fmoc-n-decyloaminoacetaldehydem (1,05 g, 2,5 mmoli). Uzyskaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Dodano glioksylan etylu (2,5 mmoli, 50% roztwór w toluenie) i mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 50°C przez 6 godzin. Mieszaninę reakcyjną oziębiono do temperatury pokojowej i działano NaCNBH3 (0,376 g, 6,0 mmoli), następnie roztworem TFA (0,58 ml, 7,5 mmoli) w MeOH (35 ml). Po 20 minutach MeOH usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i surowy produkt wytrącono acetonitrylem (400 ml). Osad zebrano przez filtrację. Surowy osad oczyszczono za pomocą preparatywnej HPLC, otrzymując związek tytułowy. MS (M + H) 1939,2 (M+, obliczono 1938,7)

P r z y k ł a d 8

Synteza związku o wzorze IV (^gdzie R¹⁵ oznacza -^CH2-^C(^O)^{OCH3, r22} oznacza -^OH a ^r27 oznacza -^CH2^C(^O)^OCH3)

Na roztwór chlorowodorku wankomycyny (7,43 g, 5,0 mmoli) w DMSO (100 ml) działano diizopropyloetyloaminą (1,74 ml, 10,0 mmoli) następnie bromooctanem metylu (0,842 g, 5,5 mmoli) w temperaturze pokojowej. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Surowy produkt wytrącono za pomocą acetonitrylu (1000 ml). Surowy produkt zebrano i oczyszczono za pomocą preparatywnej HPLC, otrzymując produkt tytułowy. MS (M + H) 1522,0 (M+, obliczono 1519,45).

Stosując powyższe procedury i odpowiednie substraty wytworzono związki przedstawione w tabeli I. Dane spektrometrii masowej tych związków są następujące:

Nr związku	MW (wolna zasada)	Obserwowana MH+
1	2	3
1	1632,6	1632,7
2	1772,9	1774,5
3	1604,6	1605,6
4	1576,5	1577,5

PL 198 311 B1 cd. tabeli

1	2	3
5	1582,5	1583,4
10	1632,6	1634,0
11	1632,6	1633,1
12	1632,6	1634,0
13	1646,6	1647,2
19	1716,8	1718,2
20	1857,0	1859,2 (M+2H)
21	1793,8	1794,9
22	1747,7	1747,4
34	1668,6	1667,4
36	1649,7	1648,7
95	1632,6	1633,7
96	1632,6	1634,0
97	1646,6	1646,9
98	1660,7	1661,9
99	1674,7	1675,7
100	1604,6	1605,6
102	1621,6	1620,6
159	1696,7	1696,4
164	1660,7	1661,5
233	1677,7	1679,0
234	1635,6	1636,7
237	1649,7	1649,5
238	1663,7	1663,5
240	1649,7	1650,7
249	1663,7	1664,5
250	1667,7	1678,9
260	1665,7	1665,8

P r z y k ł a d 11

Oznaczanie czynności przeciwbakteryjnej

A. Oznaczanie czynności przeciwbakteryjnej in vitro

1. Oznaczanie minimalnych stężeń hamujących (MIC)

Szczepy bakteryjne uzyskano z American Type Tissue Culture Collection (ATCC), Stanford University Hospital (SU), Kaiser Permanente Regional Laboratory w Berkeley (KPB), Massachusetts General Hospital (MGH), Centers for Disease Control (CDC), San Francisco Veterans' Administration

PL 198 311 B1

Hospital (SFVA) lub University of California San Francisco Hospital (UCSF). Paciorkowce jelitowe oporne na wankomycynę oznaczono jako fenotypy Van A lub Van B w oparciu o ich wrażliwość na teicoplanin. Niektóre paciorkowce jelitowe oporne na wankomycynę oznaczone jako fenotypy Van A, Van B, Van Cl lub Van C2 otrzymano z Mayo Clinic.

Minimalne stężenia hamujące (MIC) mierzono stosując procedurę mikrorozcieńczeń pożywki zgodnie z zaleceniami NCCLS. Rutynowa procedura polegała na kolejnych rozcieńczeniach związków w pożywce Mueller-Hinton w 96-studzienkowych płytkach do mikrooznaczeń. Całonocne kultury szczepów bakteryjnych rozcieńczano w oparciu o absorbancję przy 600 nm tak, aby końcowe stężenie w każdej ze studzienek było równe 5 x 105 cfu/ml. Płytki wstawiano do inkubatora o temperaturze 35°C. Następnego dnia (lub po 24 godzinach w przypadku szczepów paciorkowców jelitowych), oznaczano MIC przez wizualne zbadanie płytek. Szczepami rutynowo badanymi w początkowym teście przesiewowym były Staphylococcus aureus wrażliwy na metycylinę (MSSA), Staphylococcus aureus oporny na metycylinę, Staphylococcus epidermidis (MSSE), Staphylococcus epidermidis oporny na metycylinę (MRSE), Enterococcus faecium wrażliwy na wankomycynę (VSE Fm), Enterococcus faecalis wrażliwy na wankomycynę (VSE Fs), oporny na wankomycynę Enterococcus faecium oporny także na teicoplanin (VRE Fm Van A), oporny na wankomycynę Enterococcus faecium wrażliwy na teicoplanin (VRE Fm Van B), oporny na wankomycynę Enterococcus faecalis oporny także na teicoplanin (VRE Fs Van A), oporny na wankomycynę Enterococcus faecalis wrażliwy na teicoplanin (VRE Fs Van B), enterococcus gallinarium o genotypie Van A (VRE Gm Van A), enterococcus gallinarium o genotypie Van C-1 (VRE Gm Van C-1), enterococcus casseliflavus o genotypie Van C-2 (VRE Cs Van C-2), enterococcus flavescens o genotypie Van C-2 (VRE Fv Van C-2), wrażliwy na penicylinę Streptococcus pneumoniae (PSSP) i oporny na penicylinę Streptococcus pneumoniae (PSRP). Ponieważ PSSP i PSRP nie wzrastają dobrze na pożywce Mueller-Hinton, MIC dla tych szczepów oznaczano stosując pożywkę TSA supplementowaną defibrynowaną krwią lub płytki agarowe z krwią. Związki które miały znaczącą czynność przeciwko szczepom wymienionym powyżej testowano następnie na szerszej grupie izolatów klinicznych, obejmujących szczepy wymienione powyżej oraz nieokreślone Staphylococcus reagujące negatywnie na koagulazę, zarówno wrażliwe jak i oporne na metycylinę (MS-CNS i MR-CNS). Ponadto oznaczano ich MIC przeciwko organizmom gram-ujemnym, takim jak Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa.

2. Oznaczanie czasu zabijania

Eksperymenty w celu oznaczenia czasu wymaganego do zabicia bakterii prowadzono w sposób opisany w Lorian, Antibiotics w Laboratory Medicine, Fourth Edition, Williams i Wilkins (1991). Eksperymenty te zwykle prowadzono zarówno ze szczepami paciorkowców jak i gronkowców.

W skrócie, na płytkach agarowych wyselekcjonowano kilka kolonii i namnażano w temperaturze 35°C w warunkach stałego mieszania aż do uzyskania zmętnienia około 1,5 x 108 CFU/ml. Następnie próbkę rozcieńczono do około 6 x 106 CFU/ml i inkubowano w temperaturze 35°C, kontynuując stale mieszanie. Pobierano próbki po różnych okresach czasu i przeprowadzano po pięć 10-krotnych rozcieńczeń. Dla oznaczenia liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) stosowano metodę posiewania na płytkę.

Związki według wynalazku były czynne w powyższych testach in vitro i wykazywały szerokie spektrum czynności.

B. Oznaczanie czynności przeciwbakteryjnej in vivo

1. Badania tolerowalności ostrej na myszach

W badaniach tych związek według wynalazku podawano dożylnie lub podskórnie i obserwowano myszy przez 5-15 minut. Jeśli nie było działań ubocznych, dawkę dla drugiej grupy myszy zwiększano. Zwiększanie dawki kontynuowano aż do wystąpienia śmierci lub dawkę maksymalizowano. Generalnie dawkowanie rozpoczynano od 20 mg/kg i zwiększano za każdym razem o inkrementy 20 mg/kg aż do osiągnięcia maksymalnej tolerowanej dawki (MTD).

2. Badania biodostępności na myszach

Związek według wynalazku podawano myszom dożylnie lub podskórnie w dawce terapeutycznej (generalnie około 50 mg/kg). Grupy zwierząt umieszczano w klatkach metabolicznych aby można było zbierać mocz i kał do analizy. Grupy zwierząt (n=3) poświęcano po różnych okresach czasu (10 min, 1 godzina i 4 godziny). Pobierano krew przez punkcję serca i pobierano następujące narządy, płuca, wątrobę, serce, mózg, nerki i śledzionę. Tkanki ważono i preparowano do analizy HPLC. Do oznaczenia stężenia związku testowanego wykorzystywano analizę HPLC homogenatów tkankowych i płynów. Oznaczano także produkty metaboliczne powstające w wyniku przemian związku testowanego.

PL 198 311 B1

3. Mysi model posocznicy

W tym modelu myszom podawano dootrzewnowo odpowiednio zjadliwy szczep bakterii (najczęściej S. aureus lub E. Faecalis lub E. Faecium) (N=5 do 10 myszy na grupę). W celu zwiększenia zjadliwości bakterie łączono ze świńską mucyną żołądkową. Stosowano dawkę bakterii (zwykle 105-107) wystarczającą do wywarcia efektu śmiertelnego na wszystkie myszy w okresie trzech dni. W jedną godzinę po podaniu bakterii podawano dożylnie lub podskórnie pojedynczą dawkę związku według wynalazku. Każdą z dawek podawano grupom liczącym 5 do 10 myszy, typowo w zakresie dawek od maksymalnie około 20 mg/kg do minimalnie poniżej 1 mg/kg. W każdym z eksperymentów podawano kontrolę pozytywną (normalnie wankomycynę ze szczepami wrażliwymi na wankomycynę). Jako wynik obliczano dawkę, przy której ratowano około 50% zwierząt.

4. Udowy model neutropenii

W modelu tym badano czynność przeciwbakteryjną związku według wynalazku w stosunku do odpowiednio zjadliwego szczepu bakterii (najczęściej S. aureus, lub E. Faecalis lub E. Faecium, wrażliwe lub oporne na wankomycynę). Na początku wywoływano u myszy neutropenię przez podanie cyklofosfamidu w dawce 200 mg/kg w dniu 0 i dniu 2. 4 dnia lewe tylne udo myszy infekowano przez wstrzyknięcie domięśniowe pojedynczej dawki bakterii. Następnie w jedną godzinę po bakteriach myszom podawano związek testowy i po różnych okresach czasu (zwykle 1, 2,5, 4 i 24 godziny) myszy poświęcano (po 3 na punkt czasowy), udo wycinano, homogenizowano i obliczano liczbę CFU (jednostek tworzących kolonie) przez posiewanie. Posiewano także krew w celu oznaczenia CFU we krwi.

5. Badania farmakokinetyczne

Szybkość usuwania związku według wynalazku z krwi można oznaczać na szczurach lub myszach. W badaniu na szczurach zwierzętom wstawia się kaniulę do żyły szyjnej. Testowany związek podawano poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, i po różnych okresach czasu (zwykle 5, 15, 30, 60 minut i 2, 4, 6 i 24 godzin) pobierano krew przez kaniulę. W badaniach na myszach testowany związek podawano także poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej, i po różnych okresach czasu. Krew pobierano normalnie przez punkcję serca. Stężenie pozostałego związku testowanego oznaczano przez HPLC.

Związki według wynalazku były czynne w powyższych testach in vivo i wykazywały szerokie spektrum czynności.

Claims (6)

1. Związek glikopeptydowy o wzorze II:

w którym:

PL 198 311 B1

R²¹ oznacza grupę sacharydową o wzorze:

w którym R¹⁵ oznacza -R^a-Y-R^b-H, i R¹⁶ oznacza atom wodoru lub metyl;

R²² oznacza -O^H;

R2³ oznacza atom wodoru;

R2⁴ oznacza atom wodoru; r25 oznacza izobutyl; r26 oznacza metyl;

R2⁷ oznacza atom wodoru;

każdy z R^a niezależnie oznacza grupę alkilenową mającą 2 do 6 atomów węgla; każdy z Rb niezależnie oznacza grupę alkilenową mającą 8 do 12 atomów węgla;

Y oznacza atom siarki, -NH, lub -NH-SO2-;

n oznacza 1;

oraz ich dopuszczalne farmaceutycznie sole.

2. Związek według zastrz. 1, w którym grupa R¹5 jest wybrana z:

-CH2CH2-NH-(CH2)gCH3;

-CH2CH2CH2-NH-(CH2)8CH3;

-CH2CH2CH2CH2-NH-(CH2)yCH3;

-CH2CH2-NHSO2-(CH2)gCH3;

-CH2CH2-S-(CH2)8CH3;

-CH2CH2-S-(CH2)₉CH3;

-CH2CH2-S-(CH2)1₀CH3;

-CH2CH2CH2-S-(CH2)8CH3;

-CH2CH2CH2-S-(CH2)9CH3; i -CH2CH2CH2CH2-S-(CH2)yCH3.

3. ^Zw^iąze^k we^dłu^g zaskz. ^1, w l^tórym ^r15 oznacza -^CH2^CH2-^NH-(^CH2)^9CH3.

4. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i skuteczną terapeutycznie ilość związku glikopeptydowego określonego w zastrz. 1 albo 2, albo 3.

5. Związek określony w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do stosowania jako lek.

6. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 albo 2, albo 3 do wytwarzania leku do leczenia ssaka mającego chorobę pochodzenia bakteryjnego.