PL195897B1 - Zastosowanie smilageniny - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie smilageniny jako substancji czynnej do wytwarzania srodka do leczenia dys- funkcji czynnosci poznawczych u czlowieka lub istoty zywej innej niz czlowiek. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie smilageniny jako substancji czynnej do wytwarzania środka leczniczego.

Wynalazek opisano przede wszystkim w odniesieniu do leczenia choroby Alzheimera (AD) i demencji starczej typu choroby Alzheimera (SDAT), w których to stanach wykazano niedobór pewnych receptorów. Należy jednakże rozumieć, że wynalazek dotyczy ogólnie leczenia stanów, które można przypisać wewnętrznym stanom patologicznym i/lub ekspozycji na niekorzystne warunki środowiskowe, przy czym stany te charakteryzują się niedoborem liczby lub czynności receptorów związanych z błoną lub upośledzeniem przekaźnictwa na stykach neuronów lub na połączeniach neuronów i komórek efektorowych.

Do stanów typu wspomnianych powyżej należą choroba Parkinsona, demencja Lewiego, podciśnienie ortostatyczne, autyzm, zespół przewlekłego zmęczenia, nużliwość mięśni, choroba Lamberta-Eatona, choroby i problemy związane z zespołem wojny w zatoce, zawodowa ekspozycja na organiczne związki fosforu oraz problemy związane ze starzeniem się.

Choroba Alzheimera (AD) i demencja starcza typu choroby Alzheimera (SDAT) stanowią ważny i narastający problem we wszystkich społecznościach w których, w związku ze wzrostem oczekiwań życiowych oraz opanowaniem chorób zewnątrzpochodnych, profil demograficzny przesuwa się stale w kierunku populacji starszych. Istnieje pilna potrzeba opracowania środków, które mogą leczyć lub pomagać leczyć AD/SDAT.

Upośledzenie pamięci związane z wiekiem (AAMI) jest stanem charakterystycznym dla pacjentów w starszym wieku, którzy pomimo braku psychologicznych i fizycznych odchyleń od normy, uskarżają się na ubytki pamięci. Zespół ten jest słabo zdefiniowany, ale środki skuteczne w leczeniu AD/SDAT mogą również być wartościowe dla tych pacjentów.

Badania nad AD/SDAT prowadzone są tradycyjnymi i konwencjonalnymi metodami stosowanymi w badaniach medycznych i odpowiednich dyscyplinach. W medycynie konwencjonalnej istnieje kilka koncepcji leczenia AD/SDAT. Wiadomo, że za procesy biochemiczne podtrzymujące pamięć w korze mózgowej odpowiedzialne jest (przynajmniej częściowo) przekaźnictwo cholinergiczne. Fachowcom wiadomo, że „mechanizmy pośredniczone cholinergicznie” mogą być bezpośrednio przypisane acetylocholinie działającej na receptory, co stanowi efekty bezpośrednie. Do innych użytecznych klinicznie efektów prowadzić może również zmiana uwalniania acetylocholiny z presynaptycznych zakończeń nerwowych lub zahamowanie aktywności enzymów, które unieczynniają acetylocholinę. Te czynniki modulujące mogą być wydzielane przez neurony, gdy mediator jest niecholinergiczny; nazywa się to działaniami pośrednimi. Niektóre podejścia terapeutyczne skupiły się na roli innych mediatorów, takich jak 5-hydroksytryptamina, będąca mediatorem w innych okolicach mózgowia, na przykład jądrach śródmózgowia. Jednakże, ponieważ włókna biegnące z tych okolic wystają w kierunku kory mózgowej, w której podstawowym przekaźnikiem jest acetylocholina, uwaga badaczy próbujących wynaleźć odpowiednie środki terapeutyczne skupiła się na tym mediatorze.

Cholinergiczne strategie leczenia AD/SDAT skupiły się wokół kilku punktów na drodze powstawania, uwalniania w szczelinie synaptycznej i usuwania uwolnionej acetylocholiny.

Jednym z podejść jest leczenie dużymi dawkami lecytyny i innych prekursorów acetylocholiny. Ma to ograniczone zastosowanie w uzyskiwaniu trwałej poprawy w zakresie czynności poznawczych.

Innym podejściem jest stosowanie leków roślinnych, takich jak ekstrakt z korzenia Polygalae który, jak wykazano, nasila aktywność transferazy cholino-acetylocholinowej (CAT) oraz wydzielanie czynnika wzrostowego nerwu (NGF) w mózgowiu. Doustne podawanie NGF nie wywołuje działania na ośrodkowy układ nerwowy, ponieważ substancja ta jest białkiem o wysokiej masie cząsteczkowej i nie przechodzi przez barierę krew-mózg. Proponowano jednak stosowanie związków zdolnych do przekraczania bariery krew mózg i wywierających stymulujące działanie na syntezę NGF w ośrodkowym układzie nerwowym dla poprawy zachowań związanych z pamięcią.

Wyniki trzeciego podejścia klinicznego, w którym zastosowano inhibitory cholinesterazy, takie jak chlorowodorek takryny, okazały się niewiele lepsze od omówionych powyżej. W badaniach klinicznych, jak również w modelach laboratoryjnych wykazano, że substancje uzyskane z roślin stosowanych w medycynie chińskiej i medycynie zachodniej, np. huperzyna, galantamina i fizostygmina, mają pewne, chociaż ograniczone zalety w leczeniu AD/SDAT. Wszystkie te substancje są inhibitorami acetylocholinoesterazy (AChE). U pacjentów z AD/SDAT może mieć miejsce zmniejszona synteza

PL 195 897 B1 acetylocholiny (ACh), mniejsza skuteczność w uwalnianiu ACh z magazynów presynaptycznych, oraz spadek liczby lub czynności postsynaptycznych receptorów M1. Wykazano również zmniejszenie liczby presynaptycznych receptorów M2. Korzystne działanie inhibitorów AChE przypisuje się podwyższaniu poziomu acetylocholiny w synapsach w mózgu, co dokonuje się poprzez zwalnianie procesu rozkładu uwolnionego przekaźnika.

Wiadomo, że środki modulujące czynność układów cholinergicznych wpływają na procesy pamięci oraz przypominania. Przykładowo nikotyna stymuluje nikotynowe receptory dla acetylochloiny i uważa się, że krótkotrwałe działanie usprawniające pamięć związane z paleniem papierosów wynika z działania nikotyny. Skopolamina, antagonista acetylocholiny, powoduje niepamięć i upośledzenie czynności poznawczych, objawiające się w testach psychomotorycznych jako przedłużenie prostych czasów reakcji, prawdopodobnie w wyniku upośledzenia uwagi, a substancja ta jest stosowana w tym celu jako dodatek do leczenia przeciwbólowego. Działanie skopolaminy upośledzające pamięć można zantagonizować zastosowaniem nikotyny.

Istnieją dwie grupy podtypów receptorów nikotynowych (receptory a i b), a w każdej grupie występują cztery podgrupy, różniące się swoistością ligandów. Znaczenie receptorów nikotynowych w ośrodkowym układzie nerwowym nie jest dobrze poznane na poziomie molekularnym. Możliwe jest, że środki wiążące się z receptorami nikotynowymi mogą modyfikować szybkość obrotu w miejscach występowania receptorów muskarynowych w mózgowiu. Receptory nikotynowe są bramkowanymi ligandami kanałami jonowymi, a ich aktywacja powoduje gwałtowny (w ciągu milisekund) wzrost przepuszczalności błony komórkowej dla Na⁺ i Ca⁺⁺, depolaryzację i pobudzenie komórki.

Inną grupę receptorów cholinergicznych można stymulować muskaryną. Te receptory muskarynowe (M) są receptorami sprzężonymi z białkiem G. Odpowiedzi receptorów muskarynowych są wolniejsze; może to być pobudzenie lub zahamowanie. Odpowiedzi te niekoniecznie wiążą się ze zmianą przepuszczalności dla jonów. Przez klonowanie receptorów cholinergicznych wyróżniono pięć typów receptorów muskarynowych, oznaczonych jako M1-M5. Działania farmakologiczne związane są z czynnością czterech spośród sklonowanych receptorów, oznaczonych jako M1-M4 w oparciu o właściwości farmakologiczne.

Stosując swoiste białka receptorowe i przeciwciała monoklonalne, możliwe było dalsze zlokalizowanie receptorów muskarynowych w mózgowiu i określenie ich jako M1 (receptory postsynaptyczne) i M2 (receptory presynaptyczne). W sercu receptory M2 są receptorami postsynaptycznymi. Uważa się, że presynaptyczne receptory muskarynowe mają działanie hamujące, a wiązanie ACh z tymi receptorami osłabia dalsze uwalnianie ACh, co stanowi mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego w regulacji uwalniania ACh. Selektywni antagoniści receptorów M2, które są głównie zlokalizowane w mózgowiu, mogą być zatem użyteczni w leczeniu choroby Alzheimera.

Wiadomo, że w takich stanach chorobowych jak AD/SDAT, występuje uogólniony ubytek neuronów i czynności neuronów cholinergicznych. Spekulowano, że wysokie powinowactwo nikotynowych miejsc wiązania w pozostałych przy życiu neuronach cholinergicznych może przekładać się na niskie powinowactwo miejsc wiążących w leczeniu takich chorób, co stymuluje uwalnianie przekaźnika. Poprzez obniżanie powinowactwa nikotynowych miejsc wiążących, możliwe jest uniknięcie szybko postępującego procesu desensytyzacji.

Aktywacja nikotynowych receptorów w mózgowiu przez agonistę cechuje się szybkim początkiem działania oraz szybkim ustąpieniem działania. Mniejsze powinowactwo receptorów nikotynowych osłabi proces desensytyzacji. R. D. Schwarz i inni (J. Neuro Chem 42, (1984), 1495-8) wykazali, że miejsca wiążące nikotynę zlokalizowane są w presynaptycznych zakończeniach aksonów cholinergicznych (a także neuronów wydzielających 5-hydroksytryptaminę i katecholoaminy). Zmiana miejsc wiążących nikotynę o wysokim powinowactwie w AD/SDAT może również wywoływać zmianę działania modulującego, które miejsca wiązania nikotyny mogą wywierać na inne układy przekaźników.

Presynaptyczne mechanizmy cholinergiczne znajdują się również pod hamującym wpływem neuronów GABA-ergicznych i uważa się, że ten proces hamowania jest nasilony w AD/SDAT. Zniesienie lub osłabienie tego hamowania nasila presynaptyczną aktywność cholinergiczną w korze mózgu oraz nasila aktywność procesów poznawczych.

Zarówno interakcje włókien międzyneuronalnych unerwianych poprzez nikotynę (zmniejszanie powinowactwa wiązania) oraz dyshamowanie włókien GABAergicznych zachodzą w miejscach presynaptycznych.

PL 195 897 B1

Stanowi to uproszczony model przekaźnictwa ośrodkowego, który jednakże dostarcza ogólnego schematu koniecznego do zrozumienia wysiłków, jakie zostały podjęte w celu zwiększenia efektywnego stężenia acetylocholiny w synapsach ośrodkowego układu nerwowego. Ilustruje to dokładniej koncepcja działania bezpośredniego i pośredniego. Stosowanie trzech wyżej wymienionych konwencjonalnych metod terapeutycznych w leczeniu AD/SDAT: suplementacja prekursorów ACh, wymiana agoni-stów oraz hamowanie aktywności acetylocholinoesterazy, wykazuje pewne wady. Te podejścia terapeutyczne mogą powodować krótkotrwały wzrost dostępności ACh, mogący aktywować mechanizmy sprzężenia zwrotnego, powodując desensytyzację receptorów postsynaptycznych. Teoretycznie nie można przewidzieć długoterminowych korzyści, a w przypadku przerwania leczenia jakiekolwiek korzyści osiągnięte w leczeniu AD/SDAT oraz AAML mogą zniknąć, a stan chorobowy może nawet ulec zaostrzeniu.

Wykazano, że związek o działaniu agonistycznym w stosunku do receptorów M1 oraz antagonistycznym w stosunku do receptorów M2/M3 poprawia czynności poznawcze u pacjentów z SDAT (Sramak i inni, Life Sciences tom 2, nr 3, 195-202, 1997). Związek ten jednakże powoduje niedopuszczalne cholinergiczne działania, takie jak zmęczenie, biegunka oraz nudności.

Bardziej radykalnym podejściem w leczeniu AD/SDAT oraz AAMI jest próba zwiększenia liczby receptorów postsynaptycznych M1 w mózgowiu. Z chińskiego zgłoszenia patentowego nr CN1096031A wiadomo, że sarsasapogenina (SaG) może wywoływać „regulację w górę” receptorów cholinergicznych M1, a także „regulację w dół” (czyli przywracać normalny poziom) receptorów adrenergicznych b, których liczba może być patologicznie podwyższona w AD/SDAT.

Odkryto szereg saponin i sapogenin, które wywierają działania regulujące liczbę receptorów.

Fachowcom znany jest związek istniejący pomiędzy saponinami i ich sapogeninami, oraz wiadomo, że pożądane działania sapogenin można osiągnąć u pacjentów poprzez podawanie odpowiadających im saponin, lub też mieszaniny tych substancji. W przewodzie pokarmowym zachodzi hydroliza co najmniej części saponin. Fachowcom wiadomo również, że w warunkach hydrolizy kwasowej zachodzi proces epimeryzacji pewnych sapogenin.

Nie wszystkie saponiny i/lub ich aglikony są substancjami użytecznymi w leczeniu AD/SDAT, a niektóre, takie jak saponiny i sapogeniny pochodne naparstnicy, wywierają silne działanie inotropowe na mięsień sercowy. Wydaje się, że ta grupa saponin nie wywiera działania na ośrodkowy układ nerwowy, które mogłoby mieć znaczenie terapeutyczne w AD/SDAT; siła działania oraz toksyczność tych związków po zastosowaniu w dużych dawkach również wyklucza takie zastosowanie.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że smilagenina cechuje się poniżej opisanym działaniem, dzięki któremu jest użyteczna w poprawianiu czynności poznawczych u ludzi lub zwierząt.

Wynalazek dotyczy zastosowania smilageniny jako substancji czynnej do wytwarzania środka do leczenia dysfunkcji czynności poznawczych u człowieka lub istoty żywej innej niż człowiek.

Korzystnie stosuje się dwie substancje czynne, smilageninę i sarsasapogeninę.

Zgodnie z wynalazkiem smilageninę ewentualnie w połączeniu z sarsasapogeniną stosuje się do wytwarzania środka do leczenia człowieka cierpiącego na chorobę Alzheimera lub demencję starczą typu choroby Alzheimera, chorobę Parkinsona, demencję Lewiego, podciśnienie ortostatyczne, autyzm, zespół przewlekłego zmęczenia, nużliwość mięśni, chorobę Lamberta-Eatona, zespół wojny w zatoce, zawodową ekspozycję na organiczne związki fosforu, a także człowieka w starszym wieku.

Niektóre z głównych sapogenin to związki o poniższym ogólnym wzorze:

W odniesieniu to tego wzoru ogólnego, strukturę pewnych sapogenin wskazano w tabeli 1

PL 195 897 B1

Ta bel a 1

Związek	Pierścień A/B cis/trans nienasycenie	Stereochemia metylu przy C25 (R lub S)	Grupa(-y) hydroksylowa(-e) w pierścieniu spirostanu
Sarsasapogenina	cis	S	3b-OH
Smilagenina	cis	R	3b-OH
Anzurogenina D	trans	R	3b-OH, 5a-OH, 6b-OH
Sizalgenina	trans	S	3b-OH (C=O przy C12)
Tygogenina	trans	R	3b-OH
Diosgenina	D5	R	3b-OH
Ruskogenina	D5	R	1b-OH, 3b-OH

Różnorodność właściwości farmakologicznych i farmakodynamicznych różnych typów sapogenin czyni potrzebnym dobór takich związków, które są najbardziej użyteczne w leczeniu AD/SDAT. Odkrycie nowych faktów dotyczących działania SaG umożliwiło ustalenie, które substancje są najbardziej użyteczne w leczeniu AD/SDAT i podobnych chorób.

Saponiny i sapogeniny, stanowiące główny przedmiot zainteresowania w pewnych aspektach wynalazku, występują w naturze w szeregu gatunków roślin, głównie z rodzajów Smilax, Asparagus, Anemarrhena, Yucca i Agave. Gatunki najbardziej obecnie interesujące to Smilax regelii Kilip i Morton, znany pod potoczną nazwą Honduran sarsaparilla, Smilax aristolo-chiaefolia Miller, znany pod potoczną nazwą Mexican sarsaparilla; Smilax ornata Hooker, znany pod potoczną nazwą Jamaican sarsaparilla, Smilax aspera, znany pod potoczną nazwą Spanish sarsaparilla, Smilax glabra Roxburgh, Smilax febrifuga Kunth, znany pod potoczną nazwą Ecuadorian lub Peruvian sarsaparilla; Anemarrhena asphodeloides Bunge; Yucca schidigera Roezl ex Ortigies; oraz Yucca brevifolia Engelm. Potencjalnie interesujące saponiny i sapogeniny występują również w naturze w innych rodzajach roślin, np. Dioscorea, Trillium, Solanum, Strophanthus, Digitalis oraz Trigonella. Jak wskazano powyżej, niektóre saponiny i sapogeniny pochodzące z tych źródeł mają niepożądane właściwości, a więc nie zaleca się ich stosowania zgodnie z wynalazkiem.

Dzięki wynalazkowi możliwe jest wytworzenie środka farmaceutycznego zawierającego skuteczną ilość smilageniny jako substancji czynnej, o działaniu poprawiającym czynności poznawcze. Smilagenina stosowana jako substancja czynna jest steroidową sapogeniną nie wywołującą działania estrogenowego.

Środki farmaceutyczne opisane powyżej znajdują konkretne zastosowanie. Tak więc możliwe jest poprawianie czynności poznawczych w wyniku podawania ludziom lub zwierzętom skutecznej dawki środka farmaceutycznego wytworzonego zgodnie z wynalazkiem.

Sposób poprawiania czynności poznawczych u ludzi lub zwierząt, możliwy dzięki wynalazkowi, polega na podawaniu skutecznej dawki smilageniny jako substancji czynnej.

Stosowane tutaj pojęcie „czynności poznawcze” odnosi się do takich czynności jak myślenie, rozumowanie, zapamiętywanie, wyobraźnia i uczenie się.

Do wytwarzania środka leczniczego w połączeniu z opisaną powyżej substancją czynną, smilageniną, można także stosować jeden lub większą liczbę związków wybranych z grupy obejmującej astragalozyd, tygogeninę, hekogeninę i diosgeninę.

Stwierdzono również, że gdy sarsasapogenina zostanie połączona z pewnymi innymi sapogeninami, uzyskuje się nieoczekiwane działanie synergistyczne.

Środek do leczenia stanów charakteryzujących się niedoborem liczby lub upośledzeniem czynności receptorów postsynaptycznych związanych z błoną, takich jak stany chorobowe wymienione powyżej oraz problemy związane ze starzeniem się, może zawierać smilageninę również w połączeniu z innymi substancjami czynnymi, takimi jak prazerigenina, astragalozyd, tygogenina, ruskogenina, hekogenina lub diosgenina.

Substancje czynne stosowane zgodnie z wynalazkiem nie mają wyraźnego działania estrogenowego i/lub androgennego i/lub anabolicznego u pacjentów. Niemniej jednak w niektórych przypadkach występuje niewielka suplementacja estrogenowa i/lub androgenowa.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że znakowana radioaktywnie SaG ulega koncentracji w wyizolowanych jądrach komórek mózgowia szczurów, oraz że poziomy mRNA receptorów M są podwyższone

PL 195 897 B1 u szczurów, którym podawano SaG. Bez wiązania się żadną teorią, uważa się, że SaG wywiera działania opisane w chińskim zgłoszeniu patentowym nr CN1096031A poprzez modulację ekspresji DNA.

Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że SaG jest wewnątrzkomórkowym agonistą receptorów steroidowych, być może receptora estrogenowego, lub też czynnika transkrypcyjnego czy promotora. Istnieją chemiczne podobieństwa w strukturze steroidów i SaG; możliwe jest zatem, że mechanizm transportu SaG z cytoplazmy do jądra jest taki sam jak w przypadku steroidów. W związku z tym po dyfuzji przez błonę komórkową SaG wiąże się z receptorem steroidowym znajdującym się w cytoplazmie i stymuluje zmianę konformacji receptora w taki sposób, że kompleks jądrowy o wysokim powinowactwie dostarczany jest do miejsca odpowiedzi na kompleksie białka jądrowego DNA. W tym miejscu nasila on proces transkrypcji mRNA, który z kolei przedostaje się z jądra do rybosomów, w wyniku czego dochodzi do nasilonej produkcji receptorów muskarynowych.

Drugą możliwością jest to, że SaG wywiera działanie agonistyczne w stosunku do nieznanego receptora, co powoduje wzrost ekspresji mRNA poprzez wiązanie z kompleksem DNA-białko w jądrze komórkowym oraz działanie jako promotor.

W każdym przypadku wiązanie kompleksu SaG-receptor do DNA może powodować wzrost ekspresji mRNA kodującego receptory cholinergiczne, dopaminergiczne lub adrenergiczne, lub też inne receptory związane z błoną.

Alternatywnie, wiązanie kompleksu SaG-receptor do DNA może powodować wzrost wytwarzania związanych białek, takich jak białko G, lub hamować ich rozkład, lub wpływać na późniejsze wiązanie pomiędzy takimi białkami a odpowiadającymi im receptorami, powodując wtórne zmiany liczby receptorów.

Działanie SaG może być pośredniczone poprzez wzrost poziomu jednego lub większej liczby czynników neurotropowych, np. czynnika wzrostowego nerwu (NGF).

Wiadomo również, że poza mechanizmami synaptycznymi pośredniczonymi przez neurony i cholinergicznie, możliwe jest, że substancje, takie jak tlenek azotu (NO) oraz agoniści niecholinergiczni mogą wywierać działanie modulujące na transmisję cholinergiczną.

Niezależnie od konkretnego rodzaju składnika komórkowego, z jakim wiąże się SaG dla wywarcia swojego działania, omawiane zjawiska dostarczają wiedzy, w jaki sposób ukierunkować można potencjalne sposoby leczenia AD/SDAT, AAMI i tym podobnych stanów.

Wykazano, że SaG powoduje wzrost poziomu mRNA związanych z błoną receptorów, a zwłaszcza mRNA receptora M1. Możliwe jest zatem, że receptor lub promotor cytoplazmatyczny lub jądrowy po aktywacji powoduje w tkance, narządzie, określonym rodzaju komórek lub organelli wzrost wytwarzania cząsteczek mRNA kodującego receptory związane z błoną, lub powoduje w tkance, narządzie, określonym rodzaju komórek lub organelli spowolnienie rozkładu cząsteczek mRNA kodującego receptory związane z błoną.

Ponadto receptor cytoplazmatyczny lub jądrowy może po aktywacji powodować w tkance, narządzie, określonym rodzaju komórek lub organelli wzrost transkrypcji cząsteczek mRNA kodującego receptory związane z błoną.

Jak wspomniano powyżej, receptory nikotynowe mogą modulować liczbę i/lub obrót receptorów związanych z błoną. Zatem przykładowo działanie receptora cytoplazmatycznego lub jądrowego może być modulowane poprzez podawanie substancji będącej co najmniej częściowym agonistą receptorów nikotynowych.

Obecnie korzystne jest, żeby działanie receptorów cytoplazmatycznych lub jądrowych było modulowane podawaniem substancji, która jest co najmniej ich częściowym agonistą.

Receptor może znajdować się w cytozolu komórek w tkance, narządzie, danym rodzaju komórek lub organelli, a po aktywacji migrować do jądra komórkowego. Możliwe jest również, że receptor znajduje się w jądrze komórek w tkance, narządzie, danym rodzaju komórek lub organelli, a agonista dyfunduje do jądra lub jest tam transportowany drogą innego mechanizmu.

W leczeniu możliwym dzięki wynalazkowi nie jest istotne, aby podawana substancja działała bezpośrednio na sam cytoplazmatyczny lub jądrowy receptor. Działanie może zachodzić w miejscu przed receptorem cytoplazmatycznym lub jądrowym bądź promotorem lub za nim na szlaku wiodącym do aktywacji. W związku z tym działanie cytoplazmatycznego lub jądrowego receptora można modulować poprzez podawanie substancji, która nasila w tkance, narządzie, danym rodzaju komórek lub organelli ekspresję cząsteczek mRNA kodującego receptory związane z błoną.

Znaczenie estrogenów i związków pochodnych jako opcji terapeutycznych w SDAT było szeroko badanie. W pracach, w których badano działanie inhibitora cholinoesterazy, takryny, na czynności poznawcze pacjentów z SDAT, wtórna analiza sugerowała, że cała obserwowana widoczna poprawa

PL 195 897 B1 następowała u pacjentek otrzymujących hormonalną (estrogenową) terapię zastępczą (ERT). Dane epidemiologiczne również sugerują, że ERT może chronić przed rozwojem SDAT. Intensywne badania prowadzone na szczurach sugerują, że wycięcie jajników powoduje spadek czynności poznawczych, oraz że ten efekt można odwrócić, przynajmniej częściowo, przez podawanie estrogenu. Działaniem estrogenu w tym modelu może być zwiększanie powinowactwa wychwytu choliny w pewnych okolicach mózgowia, zwłaszcza w hipokampie, co powoduje poprawę przekaźnictwa cholinergicznego. W tym samym modelu, dzięki zastosowaniu odpowiednich metod hybrydyzacji in situ (Singh 1995) wykazano, że podawanie estrogenu powoduje wzrost poziomu mRNA dla mózgopochodnego czynnika neurotropowego (BDNF).

Możliwe mechanizmy leżące u podłoża działań estrogenów badano w doświadczeniach prowadzonych w warunkach in vitro. Badania podjęto z zastosowaniem linii komórkowej neuroblastoma oraz odpowiedzi komórek na usunięcie surowicy lub działania frakcji amyloidu b (BA). Ten drugi czynnik stymulujący uważany jest za odgrywający szczególne znaczenie ze względu na obecność płytek amyloidowych w późnych stadiach SDAT. Zarówno usunięcie surowicy, jak i BA indukowały śmierć komórek. Wykazano, że 17-b estradiol chroni komórki przed śmiercią wywołaną usunięciem surowicy lub BA. To działanie ochronne nie zostało zniesione wówczas, gdy 17-b estradiol badano w obecności agonisty estrogenu, tamoksyfenu. Enancjomer pozbawiony działania estrogenowego, 17-a estradiol, był równie skuteczny w hamowaniu śmierci komórek. Późniejsze prace sugerowały, że ochronne działania tych związków zależą od obecności całkowicie de-nasyconego fenolowego pierścienia A i niezablokowanej grupy hydroksylowej w pozycji trzy (Simpkins 1997; Green 1997). W hodowlach komórkowych neuroblastoma wykazano, że związki o działaniu estrogenowym nasilają uwalnianie czynnika wzrostowego nerwów. Znaczenie tych odkryć dla działań estrogenu w SDAT nie jest jasne.

Opublikowano zgłoszenia patentowe, w których zastrzegano użyteczność szeregu sapogenin steroidowych o strukturze spirostanu, furo-spirostanu, spirosolanu lub solanidyny, w leczeniu chorób, w tym SDAT. Dwiema publikacjami zgłoszeń patentowych o szczególnym znaczeniu są: chińskie zgłoszenie patentowe nr CN1096031A, w którym ujawniono dwukierunkowe działania regulatorowe sapogeniny o strukturze spirostanu, sarsasapogeniny, względem receptorów adrenergicznych b i receptorów cholinergicznych M. Ujawnienie w tym dokumencie jest jednakże powierzchowne. Innym dokumentem o dużym znaczeniu jest niemieckie zgłoszenie patentowe nr DE 4303214A1, w którym zastrzeżono zastosowanie całego szeregu saponin i sapogenin w leczeniu wielu chorób, które zdaniem autorów mają podłoże wirusowe. Ujawnienie to jednakże ma wątpliwą wartość, ponieważ wiadomo, że element infekcyjny jest nieobecny w wielu stanach charakteryzujących się upośledzeniem przekaźnictwa synaptycznego, a zatem główna przesłanka domniemanego wynalazku jest wątpliwa. Ponadto, autorzy nie przedstawiają żadnych danych, pozwalających fachowcom wybrać korzystny związek z szeregu tych, które objęte są zastrzeżeniami.

W procesie identyfikacji związków, które mogłyby mieć zastosowanie w leczeniu SDAT i innych chorób charakteryzujących się zmniejszeniem liczby receptorów lub upośledzeniem przekaźnictwa synaptycznego, rozważano potrzebę identyfikacji związków wywierających pożądane działanie, ale pozbawionych działań estrogenowych, ponieważ są one niedopuszczalne, zwłaszcza u pacjentów płci męskiej. Szereg związków zastrzeżonych w niemieckim zgłoszeniu patentowym nr DE4303214A1 jako związki aktywne wykazuje wyraźne działanie estrogenowe i z tego względu są one niedopuszczalne. Dane te przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Estrogenowe działanie sapogenin steroidowych i wybranych triterpenoidów

Związek	Aktywność estrogenowa
Diosgenina	dodatnia
Anzurogenina D	ujemna
Ruskogenina	dodatnia
Sarsasapogenina	ujemna
Tygogenina	ujemna
Astragalozyd	ujemna
Smilagenina	ujemna

PL 195 897 B1

Ponadto związki te badano wobec innych receptorów steroidowych, ponieważ uważano, że związki mające zastosowanie kliniczne nie powinny wywierać działania wobec innych receptorów steroidowych. Nie stwierdzono, aby którykolwiek z tych związków wykazywał aktywność w stosunku do któregokolwiek z poniższych receptorów: progesteronu, glukokortykoidu lub testosteronu.

Tak więc związki, które, jak wykazano, nie wywierają działania w stosunku do receptora estrogenowego, są również nieaktywne w stosunku do innych ważnych receptorów steroidowych.

Aktywność wybranych związków badano w szeregu prób in vitro. Próby lub eksperymenty, uważane za mające kluczowe znaczenie w ustaleniu możliwej aktywności w kierunku podwyższania liczby receptorów związanych z błoną, były następujące:

1. Komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) transfekowano fragmentem DNA kodującym receptor muskarynowy. W większości eksperymentów stosowano linię komórek, w których ekspresji ulegał receptor M2.

2. Badano wpływ ekspresji receptorów muskarynowych w hodowlach linii komórkowych pochodzenia neuronalnego.

3. Hodowano komórki mięśnia sercowego pozyskane od noworodków szczurów SpragueDawley. W komórkach mięśnia sercowego ekspresji ulegają receptory muskarynowe, zwykle M2. Poziom tych receptorów spada po długotrwałej hodowli, a badano działanie interesujących związków w zapobieganiu spadkowi liczby tych receptorów.

Sposoby i wyniki przeprowadzonych doświadczeń zostaną teraz opisane po kolei.

1. Eksperymenty z zastosowaniem linii komórkowej CHO

Badano działanie różnych związków na ekspresję receptorów M2 w komórkach CHO transfekowanych DNA dla receptora M2. Liczbę receptorów oceniano z zastosowaniem wiązania trytowanego QNB oraz po odjęciu nieswoistego wiązania. Związki rozpuszczano w DMSO, a DMSO stosowano jako kontrolę. Związki badano przy wielu końcowych stężeniach. Związki badano również w obecności i bez tamoksyfenu dla odróżnienia mechanizmów mediowanych przez receptor estrogenowy. Uzyskane wyniki podano w tabeli 3.

T a b el a 3

Wpływ związków na ekspresję receptorów M2 w komórkach CHO

Związek	Stężenie molowe związku	Wpływ na ekspresje receptora - podany jako % wzrostu w porównaniu z kontrolą (wartości ujemne w nawiasach)
Sarsasapogenina	10-5	34
10'6	(14)
Anzurogenina D	10-5	22
10-6	(26)
Sizalgenina	10-5	ns
10-6	ns
Smilagenina	10-5	57
10-6	18
Diosgenina	10-5	ns
10-6	ns
Ruskogenina	10-5	(22)
10-6	ns
Tygogenina	10-5	ns
10-6	ns

ns - wpływ nie znaczący

Eksperymenty wykazały zatem, że pewne związki były zdolne do zwiększania liczby receptorów muskarynowych, ulegających ekspresji na powierzchni komórek CHO hodowanych in vitro. Działaniu temu nie zapobiegał tamoksyfen, co wskazuje, że w mechanizmie działania nie brał udziału receptor

PL 195 897 B1 estrogenowy. W przeciwieństwie do pracy opublikowanej przez Simpkina i innych stwierdzono, że nie było potrzeby nietkniętego pierścienia fenolowego A. Równa część związków będących sapogeninami steroidowymi nie wykazywała aktywności. Ponadto dalsze eksperymenty wykazały, że b-estradiol wywierał podobne działanie w zwiększaniu ekspresji receptorów po zastosowaniu w stężeniu 10^-5M.

2. Wpływ związków na przeżywalność komórek

Inne próby in vitro stosowano dla rozróżnienia związków aktywnych od nieaktywnych. W szczególności hodowano in vitro linie komórkowe neuroblastoma, w tym komórki SKN-SN i SH-SY5Y, jak również linie komórkowe nowotworu chromochłonnego (phaeochromocytoma) w obecności fragmentów amyloidu b lub bez surowicy. Zastosowano szereg technik dla wykazania ochrony hodowanych komórek. Do technik tych należał test wydalania błękitu Trypanu, chemiluminescencja oraz uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej. Najbardziej interesująca była obserwacja, że hodowanie komórek, w szczególności komórek PC12 wraz z amyloidem b, zmniejszyło liczbę receptorów muskarynowych, mierzonych z zastosowaniem technik wiązania znakowanego radioaktywnie ligandu. Odkryto, że to zmniejszenie liczby receptorów jest łagodzone przez czynne związki.

3. Wpływ związków na hodowane komórki mięśnia sercowego

Komórki mięśnia sercowego wyizolowano z mięśnia komór nowonarodzonych szczurów Sprague-Dawley, z zastosowaniem standardowych technik. Komórki hodowano in vitro, a receptory muskarynowe ulegające ekspresji na powierzchniach fragmentów błon komórkowych, zbierane po homogenizacji w różnych punktach czasowych, oznaczano z zastosowaniem swoistego wiązania trytowanego QNB. Wstępne doświadczenia wykazały, że liczba ulegających ekspresji receptorów wykazywała tendencję do zmniejszania się po 10 dniach hodowli. Tak więc eksperymenty miały na celu zbadanie wpływu różnych związków na hamowanie tego spadku liczby receptorów.

Wyniki tych eksperymentów podano w tabeli 4.

Tabela 4

Wpływ różnych związków na ekspresję receptorów muskarynowych na hodowanych komórkach mięśnia sercowego

Związek	Stężenie związku wywołujące istotny wzrost liczby receptorów ulegających ekspresji w komórkach mięśnia sercowego noworodków po 10 dniach hodowli in vitro
Diosgenina	ns
Anzurogenina D	10-6 M
Ruskogenina	ns
Sarsasapogenina	10-5 M
Tygogenina	ns
Astragalozyd	10-5 M
Smilagenina	10-6 M

ns - wpływ nie znaczący

Nieoczekiwanie stwierdzono, że sapogeniny ulegają preferencyjnej koncentracji w jądrach komórek hodowanych in vitro. Jest to nieoczekiwane ponieważ, jak omówiono powyżej, sarsasapogenina (SaG) i pewne inne związki, które, jak wykazano, zwiększają liczbę receptorów muskarynowych, nie wiążą się ze znanymi receptorami steroidowymi. Ponadto zdumiewające jest, że SaG jest preferencyjnie pobierana przez jądra, ponieważ działanie tych związków można obserwować w układach do prób in vitro, w których ekspresji ulegają receptory muskarynowe, ale gdzie DNA dla receptora został transfekowany do cytoplazmy, a więc nie podlega normalnej kontroli przez jądro komórkowe.

SaG i inne związki, które badano i wykazano, że regulują one „w górę” poziom receptorów, nie wiążą się bezpośrednio z żadną z głównych grup receptorów związanych z błoną. Można zatem przypuszczać, że obserwowane efekty prawdopodobnie nie wynikają, np. z działania na receptor nikotynowy i związanego z tym wzrostu liczby receptorów muskarynowych. Wyjaśnienie to wydaje się być mniej prawdopodobne (chociaż nie można go wykluczyć) jeżeli uwzględni się, że wykazano, iż pewne związki powodują wzrost liczby receptorów adrenergicznych b, ulegających ekspresji na limfocytach krwi obwodowej. Zatem wydaje się, że mechanizm polega na bardziej uogólnionym działaniu na regulację receptorów związanych z błoną.

PL 195 897 B1

Przypuszcza się, że działanie opisanych tu związków czynnych może zachodzić poprzez działanie na białko G, oraz że działanie na liczbę receptorów może być wtórne do działania na białko G. Gdy związany z błoną i połączony z białkiem G receptor ulega stymulacji, rozpoczynają się dwa szeregi zjawisk: odpowiedź efektorowa; oraz internalizacja receptora. Następujące przywracanie receptora do stanu, w którym ponownie znajduje się on na powierzchni błony komórkowej lub na powierzchni innej błony, gdzie może zajść interakcja z kolejnym ligandem receptora wydaje się zależeć od szeregu czynników. Część z tych czynników lub mechanizmów wydaje się być związana z białkiem G. Istnieją dowody, że aktywacja receptorów m3 może mieć wpływ na ekspresję lub poziom białka G. Przypuszcza się, że działanie opisanych tu związków może wynikać z interakcji w procesach regeneracji receptorów, wiązaniu z białkiem G lub homeostazie białka G.

Zgodnie z alternatywną hipotezą związki nasilają syntezę, uwalnianie lub zmniejszają szybkość rozkładu czynników neurotropowych, takich jak mózgopochodny czynnik wzrostowy i/lub czynnik wzrostowy nerwu. Te działania na czynniki wzrostowe mogą wynikać z działania związków na cytoplazmatyczny lub jądrowy receptor, albo wiązania związku z regionem promotora, co powoduje wywarcie bezpośredniego wpływu na szybkość wytwarzania mRNA czynnika wzrostowego, względnie wskutek nasilonej produkcji innego czynnika materialnego, takiego jak białko G, albo też końcowe działania mogą być wtórne w stosunku do działania na procesy przetwarzania receptora lub białka G.

Nasilenie ekspresji i/lub nieprawidłowe przetwarzanie prekursorowego białka amyloidu (APP) wiąże się z wytwarzaniem płytek amyloidowych oraz odkładaniem złogów amyloidu w naczyniach mózgowia, co stanowi podstawową morfologiczną cechę choroby Alzheimera. Szczególnie interesujące są procesy regulujące proteolityczny rozkład APP, w wyniku którego powstają fragmenty amyloidogenne i nie-amyloidogenne. Rozkład APP poprzez enzym sekretazę a w białkowej sekwencji amyloidu b powoduje powstanie nie-amyloidogennego fragmentu C-końcowego oraz rozpuszczalnego fragmentu APPsa; wykazano, że ten drugi fragment wykazuje aktywność neurotropową i neuroochronną, jak również nasila procesy pamięci u myszy po iniekcji do komór mózgowia (ICV). Przeciwnie, przetwarzanie APP przez sekretazę b eksponuje N-końcowy fragment amyloidu b, uwalniany poprzez działanie sekretazy g w zmiennym fragmencie C-końcowym. Wykazano, że powstające peptydy amyloidu b, zawierające po 39-43 aminokwasy, mają (C1-C2)alkil właściwości neurotoksyczne i ulegają akumulacji w płytkach, co ma wpływ na połączenia międzyneuronalne.

Szereg badań wykazało, że stymulacja połączonych z kinazą białkową (PKC) receptorów muskarynowych M1 i M3 powoduje wzrost aktywności sekretazy a. Wskutek tego nasila się przetwarzanie APP do APPsa o działaniu neuroochronnym. Równocześnie zmniejsza się przetwarzanie APP przez sekretazy b i g, co powoduje powstawanie mniejszej ilości amyloidu b. Inne przekaźniki, takie jak czynnik wzrostowy nerwu (NGF) oraz mózgopochodny czynnik wzrostowy (BDNF), a także bradykinina i wazopresyna, mogą wywierać podobne działania, zwiększając proporcję APP przetworzonego w APPsa. W działaniach NGF zaangażowanych może być szereg czynników, do których należeć mogą: wiązanie czynnika z receptorem kinazy tyrozynowej (TrkA) oraz stymulacja fosfolipazy Cg z następną fosforylacją i aktywacją kinazy białkowej C (PKC) i wzrostem względnej aktywności sekretazy a.

Zatem można oczekiwać, że interwencje nasilające aktywność kinazy białkowej C selektywnie w mózgowiu będą miały zastosowanie w leczeniu choroby Alzheimera. Aż do niedawna niedostępne były substancje o selektywnym działaniu agonistycznym w stosunku do receptora M1. Należało spodziewać się, że nieselektywni agoniści wywoływaliby stymulację presynaptycznych receptorów M2, co powodowałoby ujemne sprzężenie zwrotne, a więc dalej znacznie upośledzało przekaźnictwo muskarynowe. Obecnie dostępne stają się substancje o selektywnym działaniu agonistycznym w stosunku do receptora M1 (talsaklidyna) i badana jest ich przydatność w leczeniu choroby Alzheimera. Istnieje jednakże znaczne ryzyko, że, podobnie jak w przypadku długotrwałego podawania jakiegokolwiek agonisty receptora, korzyści kliniczne zostaną szybko ograniczone poprzez zmniejszenie liczby receptorów lub zmniejszenie wrażliwości, jak również z uwagi na działania niepożądane z powodu braku swoistości receptorowej. Tak więc można spodziewać się, że opisane tu związki selektywnie zwiększające liczbę receptorów muskarynowych M1, prawie nie wywierające wpływu na liczbę receptorów M2 w mózgowiu, byłyby pozbawione niekorzystnych działań obserwowanych dla agonistów receptorów muskarynowych, a zatem byłyby bardzo użyteczne. Istotnie, obserwuje się korzyści w trzech opisanych poniżej przypadkach:

1. Selektywny wzrost liczby receptorów M1 prowadzący do nasilenia przekaźnictwa synaptycznego. Długotrwałe podawanie selektywnego agonisty w najlepszym przypadku nie wywiera niekorzystnego wpływu na przekaźnictwo;

PL 195 897 B1

2. Wtórnie do wzrostu liczby receptorów, wzrost stymulacji PKC i w konsekwencji wzrost aktywności sekretazy a, prowadzący do:

2.1 Zmniejszonego wytwarzania amyloidu b i w rezultacie zmniejszonego tworzenia płytek i mniejszych ubytków neuronalnych;

2.2 Wzrostu aktywności APPsa i w rezultacie poprawy funkcji mózgowia, o czym świadczy poprawa pamięci długo- i krótkoterminowej.

W końcu powyżej omówiono wpływ układu GABA w modulacji transmisji. Dobrze wiadomo, że na receptorze GABA znajduje się miejsce wiązania steroidów, różne od miejsc wiązania benzodiazepiny, chlorku i GABA. Wiadomo, że w tym miejscu wiąże się szereg związków o działaniu terapeutycznym, stosowanych w obniżaniu poziomu świadomości. Spekuluje się, że długotrwałe podawanie częściowego agonisty działającego w tym miejscu może prowadzić do nasilenia przekaźnictwa.

Wynalazek zostanie dalej opisany w poniższym przykładzie.

Przykład. Badanie poziomów mRNA z zastosowaniem hybrydyzacji in situ

20-miesięczne samce szczurów SD z czystej hodowli podzielono losowo na dwie grupy. Szczury w jednej grupie otrzymywały po 3 mg sarsasapogeniny dziennie, zmieszanej z normalnym dziennym pożywieniem. Szczury z grupy kontrolnej otrzymywały normalne pożywienie i wodę. Cztery miesiące później, mózgi wykorzystywano w doświadczeniach z zastosowaniem techniki hybrydyzacji, przy czym 4-6 miesięczne szczury stosowano jako młodą grupę kontrolną. Szczury z innych grup karmiono w identycznym schemacie.

Zsyntetyzowano łańcuch cDNA, odpowiadający odpowiednio mRNA oraz zarówno M1, jak i M2. M1 odpowiada sekwencji aminokwasów 3-18 białka receptorowego, to znaczy TGG TGC CAA GAC AGT GAT GTT GGG ACT GAC AGC AGG GGG CAC TGA GGT, a M₂ odpowiada sekwencji aminokwasów 1-16, to znaczy ATG AAT AAC TCA ACA AAC TCC TCG AAC AAT GGC TTG GCT ATT ACC AGT. cDNA wyznakowano z użyciem zestawu odczynników reagujących z fragmentem

3^końcowym z wykorzystaniem a-³⁵S-dATP (8,9 Tbq/nmol) jako substancji znakującej. Po zakończeniu reakcji następowało oczyszczanie w kolumnie nukleotydowej. Oszacowano swoistą aktywność

35 partii (16,67-33,34) x 10⁸ MBq/mg. a-³⁵S-dATP, zestaw odczynników reagujących z fragmentem 3'-końcowym oraz kolumnę nukleotydową otrzymano z Du Pont Co., USA.

Z każdej grupy w każdym punkcie czasowym pobierano po jednym szczurze i wykonywano równoległe doświadczenia. Szczury dekapitowano, a mózgi usuwano w postaci nienaruszonej. Z użyciem mikrotomu o stałym mrożeniu (kriomikrotom AS-600, Anglia Scientific Co, Wielka Brytania) mózg pocięto na plastry o grubości 15 mm. Plastry pobierano z różnych okolic (identycznych miejsc od każdego szczura) i umieszczano na skrawkach pokrytych polilizyną, suszono w strumieniu zimnego powietrza, utrwalano w roztworze 4% paraformaldehydu (zawierającym 1 x fizjologiczny roztwór soli buforowany fosforanem, pH 7,0) na 5 minut przed dwukrotnym płukaniem fizjologicznym roztworem soli buforowanym fosforanem. Skrawki następnie umieszczano w 0,25% roztworze bezwodnika octowego (zawierającym 0,1M chlorowodorku trietanoloaminy, pH 8,0, oraz 0,9% chlorku sodu) na 10 minut, odwadniano w 70%, 80%, 95% i 100% alkoholu etylowym przez 1minutę, odtłuszczano w chloroformie przez 5 minut, oraz w końcu traktowano kolejno 100% i 95% alkoholem etylowym przez 1minutę.

Skrawki stosowane jako negatywne kontrole pobierano, odwadniano w alkoholu etylowym itd., jak szczegółowo opisano powyżej, ale traktowano je uprzednio 100 mg/ml RNAzy i 2 x roztworem SSC (roztwór sól/cytrynian sodu, zawierający 300 mmoli/l chlorku sodu i 45 mmoli/l cytrynianu sodu) przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

W celu hybrydyzacji, płynną macierz do hybrydyzacji połączono ze świeżo 50% dejonizowanym formamidem, 4 x SSC, 10% siarczanem dekstranu, 250 mg/ml tRNA drożdży, 5 x roztworem Denharda, 500 mg/ml denaturacyjnej protaminy DNA, 10 mmol/l ditiotreitolu. Na koniec dodano sondę oligonukleoty35 dową [(16,67-33,34) x 10 MBq/50 ml] znakowaną ³⁵S oraz dokładnie zmieszano. Na każdy ze skrawków nakroplono 50 ml macierzy, po czym na skrawkach ściśle ułożono szklaną pokrywę, unikając wytworzenia pęcherzyków powietrza. Skrawki następnie umieszczono w skrzynce hybrydyzacyjnej z 2 x SSC na dnie dla zapobieżenia dostania się do nich wilgoci i prowadzono inkubację w temperaturze 37°C przez 18-24 godziny.

Po hybrydyzacji skrawki nasączano roztworem 1x SSC i łagodnie wstrząsano w celu spłukania szklanej pokrywy. Skrawki płukano pobieżnie roztworem 1x SSC, następnie łagodnie wstrząsano w 2 x SSC zawierającym 50% formamid w temperaturze 37°C przez 20 minut, czterokrotnie zmieniając roztwór, po czym przeniesiono do roztworu 1x SSC i wstrząsano w temperaturze panującej w laboratorium przez 30 minut (dwukrotnie powtarzając). Wkońcu skrawki spłukano dwukrotnie destylowaną wodą, odwodniono 70%, a następnie 95% alkoholem etylowym iwysuszono na powietrzu.

PL 195 897 B1

Autoradiogramy wytworzono w zaciemnionym pomieszczeniu, gdzie próbkę i hiperfilm beta max ściśnięto razem z zastosowaniem metody kontaktowej i umieszczono w kasecie zawierającej środek osuszający, eksponowanej na temperaturę 4°C przez 2-3 tygodnie. Kasety wywołano (D196) i utrwalono (F5). Ostatecznie autoradiogramy analizowano z zastosowaniem skomputeryzowanego analizatora obrazów (analizator obrazów VIDAS, Kontron, Niemcy).

Sonda M2 nie wykazała zlokalizowanej aktywności. Sonda M1 wykazała aktywność w jądrze zębatym, korze mózgowia oraz prążkowiu. Porównanie tych trzech okolic w różnych grupach zwierząt podano w tabeli 5.

Ta bel a 5

Porównanie
Okolica	Wiek w stosunku do młodych	SaG w stosunku do starych
Kora	-5,14 ± 2,68 (23)	5,77 ± 3,82 (20)
Hipokamp	-3,18 ±2,87 (12)	0,96 ±4,26 (10)
Prążkowie	-12,2 ±3,6*	15,71 ± 3,27* (10)

Wartości dodatnie oznaczają wzrost w stosunku do odpowiednika * p < 0,01. Liczby w nawiasach = liczba skrawków.

Wystąpiło znaczące zmniejszenie ekspresji mRNA dla receptorów M1 w prążkowiu starych szczurów w porównaniu z młodymi szczurami stanowiącymi kontrolę. Podawanie SaG spowodowało znaczący wzrost mRNA dla receptora M1 w tej samej okolicy mózgowia, gdy szczury leczone porównano ze starymi szczurami stanowiącymi kontrolę.

Claims (13)

1. Zastosowanie smilageniny jako substancji czynnej do wytwarzania środka do leczenia dysfunkcji czynności poznawczych u człowieka lub istoty żywej innej niż człowiek.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stosuje się dwie substancje czynne, smilageninę i sarsasapogeninę.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, do wytwarzania środka do piącego na chorobę Alzheimera lub demencję starczą typu choroby Alzheimera.

eczenia człowieka cier

4. Zastosowanie według zastrz piącego na chorobę Parkinsona.

5. Zastosowanie według zastrz piącego na demencję Lewiego.

6. Zastosowanie według zastrz piącego na podciśnienie ortostatyczne.

7. Zastosowanie według zastrz piącego na autyzm.

8. Zastosowanie według zastrz piącego na zespół przewlekłego zmęczenia.

9. Zastosowanie według zastrz piącego na nużliwość mięśni.

10. Zastosowanie według zastrz piącego na chorobę Lamberta-Eatona.

11. Zastosowanie według zastrz piącego na zespół wojny w zatoce.

12. Zastosowanie według zastrz

1 albo 2, do wytwarzania środka do

1 albo 2, do wytwarzania środka do

1 albo 2, do wytwarzania środka do

1 albo 2, do wytwarzania środka do

1 albo 2, do wytwarzania środka do nia.

1 albo 2, do wytwarzania środka do 1 albo 2, do wytwarzania środka do 1 albo 2, do wytwarzania środka do eczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka ciereczenia człowieka cier1 albo 2, do wytwarzania środka do piącego na zawodową ekspozycję na organiczne związki fosforu,

13. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, do wytwarzania środka do leczenia człowieka w star-