PL191497B1 - Membrane for directional regeneration of tissue - Google Patents

Abstract

The invention provides a multi-layer membrane comprising a matrix layer predominantly of collagen II and having an open sponge-like texture, and at least one barrier layer having a close, relatively impermeable texture. Such a membrane is particularly suitable for use in guided tissue regeneration, in particular for use in vivo in the reconstruction of bone or cartilage tissue.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie.The present invention relates to a multilayer membrane useful for in vivo bone or cartilage reconstruction, a method of its preparation and its use.

W pracach nad regenerację tkanki szczególne trudności sprawia rekonstrukcja tkanki chrzestnej, np. w ubytkach tkanki chrzestnej. Uszkodzenia tkanki chrzestnej mogą nastąpić w dowolnych stawach, jakkolwiek duże stawy takie jak staw kolanowy czy łokciowy, są najbardziej narażone na uszkodzenia. Uszkodzenia takie mogą być następstwem urazów, schorzeń degeneracyjnych lub zapalenia kości i chrząstki. Uszkodzenia tkanki chrzestnej są głównymi czynnikami patomechanicznymi w rozwoju choroby zwyrodnieniowej stawów. Uwalnianie enzymów prowadzi do powstawania procesów zapalnych w obrębie mazi stawowej, co w rezultacie prowadzi do abrazji tkanki chrzestnej i uszkodzenia powierzchni stawowej. Ostatnio prowadzone próby regeneracji chrząstki stawowej w uszkodzeniach tkanki chrzestnej in vivo obejmowały wstawienie wyhodowanych in vitro, autogennych stawowych chondrocytów (CAC). Technika ta ma jednak ograniczone zastosowania.In works on tissue regeneration, the reconstruction of the cartilage, for example in the defects of cartilage, is particularly difficult. Damage to the cartilage can occur in any joint, although large joints such as the knee and elbow are most vulnerable to damage. Such damage may result from trauma, degenerative diseases or osteoarthritis. Damage to the cartilage is the main pathomechanical factor in the development of osteoarthritis. The release of enzymes leads to the formation of inflammatory processes within the synovial fluid, which in turn leads to abrasion of the cartilage and damage to the articular surface. Recent attempts to regenerate articular cartilage in in vivo cartilage injuries have involved the insertion of in vitro cultured autogenous articular chondrocytes (CACs). However, this technique has limited applications.

Przyjmuje się powszechnie, że do rekonstrukcji tkanki niezbędne jest dostarczenie warstwy macierzowej, która służy do kierowania komórek, wzrastających wzdłuż i pomiędzy włóknami warstwy macierzowej. Ostatnio w celu regeneracji tkanki zaproponowano wykorzystanie komórek CAC umieszczonych w ulegających resorbcji syntetycznych i naturalnych warstwach macierzowych. Jednakże w próbach rekonstrukcji tkanki chrzestnej z wykorzystaniem warstw macierzowych na bazie polikwasu mlekowego, polikwasu glikolowego i kolagenu typu I lub III, koniecznym było nanoszenie chondrocytów in vitro przed wszczepieniem warstw macierzowych. Powodowało to utrudnienia z utrzymaniem sterylności kultury chondrocytów, tzn. istniała możliwość wystąpienia reakcji zapalnej z udziałem komórek olbrzymich i komórek fibroblastowych na powierzchni styku pomiędzy implantem a tkanką.It is generally accepted that tissue reconstruction requires the provision of a matrix layer which serves to guide cells growing along and between the fibers of the matrix layer. Recently, the use of CAC cells embedded in resorbable synthetic and natural matrix layers has been proposed for tissue regeneration. However, in attempts to reconstruct cartilage using matrix layers based on polylactic acid, polyglycolic acid and type I or III collagen, it was necessary to apply chondrocytes in vitro prior to implantation of the matrix layers. This made it difficult to maintain the sterility of the chondrocyte culture, i.e. there was a possibility of an inflammatory reaction involving giant cells and fibroblast cells on the interface between the implant and the tissue.

W zgłoszeniu patentowym WO-A-96/25961 ujawniono wykorzystanie wszczepu opartego na kolagenie typu II, który można wszczepiać w miejsce in vivo i który polega na wzroście natywnych chondrocytów na powierzchni warstwy macierzowej w celu regeneracji tkanki chrzestnej. Jednakże zdolność takiej warstwy macierzowej do spowodowania całkowitej regeneracji tkanki chrzestnej jest ograniczona.Patent application WO-A-96/25961 discloses the use of a type II collagen-based implant which can be implanted in vivo and which relies on the growth of native chondrocytes on the surface of the matrix layer to regenerate cartilage. However, the ability of such a matrix layer to cause complete regeneration of the cartilage is limited.

Istnieje zatem potrzeba wszczepu macierzowego, umożliwiającego skuteczne wrastanie natywnych chondrocytów i tym sposobem regenerację tkanki chrzestnej, po wszczepieniu implantu in vivo. W obecnym wynalazku ujawniono, że tkanka chrzestna i całkowicie nowa tkanka kostna mogą zostać zrekonstruowane przez wykorzystanie membrany macierzowej zbudowanej z kolagenu typu II, która in vivo oddzielona jest nie tylko od otaczającej tkanki łącznej, lecz również od uszkodzonych obszarów kostnych lub chrzestnych. Uznano, że można osiągnąć ten cel poprzez wykorzystanie wielowarstwowej membrany wszczepialnej, zdolnej do zapobiegania niekorzystnemu wzrastaniu dowolnej otaczającej tkanki do warstwy macierzowej lub poprzez chirurgiczne wszczepienie do miejsca uszkodzonego, tak by osiągnąć również wspomniany efekt.There is therefore a need for a matrix implant that allows the effective ingrowth of native chondrocytes and thus regeneration of cartilage, after implantation in vivo. The present invention discloses that cartilage and entirely new bone tissue can be reconstructed by using a type II collagen matrix membrane that is separated in vivo not only from the surrounding connective tissue, but also from damaged bone or cartilage areas. It has been found that this object can be achieved by the use of a multi-layer implantable membrane capable of preventing the unfavorable growth of any surrounding tissue into the matrix layer or by surgical implantation into the damaged site, so as to achieve said effect as well.

Wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera (i) warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz (ii) co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy.The multilayer membrane useful in the in vivo reconstruction of bone or cartilage according to the invention is characterized in that it comprises (i) an open, spongy matrix layer composed mainly of type II collagen, and (ii) at least one boundary layer with a closed or impermeable structure composed mainly of type I and III collagen and it is a boundary layer with the applied and lyophilized type II collagen suspension forming a matrix layer with an open, spongy structure stably attached to this layer.

Korzystnie, membrana obejmuje pojedynczą warstwę graniczną.Preferably, the membrane comprises a single boundary layer.

Korzystnie, warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi.Preferably, the matrix layer is sandwiched between two boundary layers.

Korzystnie, warstwa macierzowa utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki.Preferably, the matrix layer is made of a type II collagen-containing material derived from natural cartilage.

Korzystnie, materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń.Preferably, the type II collagen-containing material is derived from porcine hyaline cartilage.

Korzystnie, materiał zawierający kolagen typu II jest usieciowany.Preferably, the type II collagen material is cross-linked.

Korzystnie, warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń.Preferably, the boundary layer or layers are derived from the peritoneal membrane of calves or pigs.

Korzystnie, warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego.Preferably, the matrix layer is impregnated with chondrocytes isolated from articular cartilage, periosteum, periochondral tissue or mesenchymal stem cells from bone marrow.

Korzystnie, warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem.Preferably, the matrix layer and / or the boundary layer or layers are impregnated with glycosaminoglycan.

PL 191 497B1PL 191 497B1

Korzystnie, glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu.Preferably, the glycosaminoglycan is hyaluronic acid, chondroitin-6-sulfate, keratin sulfate or dermatan sulfate.

Korzystnie, warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów.Preferably, the matrix layer and the boundary layer or layers are substantially free of proteoglycans.

Korzystnie, warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.Preferably, the matrix layer and / or boundary layer or boundary layers further comprises chondronectin, laminin, fibronectin, calcium alginate, type II anchorin, growth factors or bone morphogenetic factors.

Sposób wytwarzania wielowarstwowej membrany według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.The method of producing the multilayer membrane according to the invention is characterized in that a type II collagen suspension is applied to the surface of the boundary layer and then freeze-dried to obtain a firmly attached type II collagen matrix layer with an open, spongy structure.

Zastosowanie membrany według wynalazku polega na wytwarzaniu wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.The use of the membrane according to the invention consists in the production of an implant for directed tissue regeneration.

Uznaje się, że skuteczna regeneracja tkanki chrzestnej wymaga szybkiego wrastania nie tylko natywnych komórek tkanek takich jak tkanka łączna, naczynia krwionośne itd., lecz również dowolnej nowej tkanki kostnej w miejscu leczonego uszkodzenia. Efekt ten można uzyskać stosując dwuwarstwową membranę według wynalazku, służącą do odgraniczania z jednej strony warstwy macierzowej zbudowanej z kolagenu od wrastających komórek tkanki natywnej. W czasie chirurgicznego wszczepiania efekt ten można uzyskać łącząc technikę przeszczepu tkanki np. przeszczep okostnowy, efektywnie zapobiegający wrastaniu komórek tkanki natywnej z przeciwnej strony wszczepu. Na przykład przeszczep okostnowy może być wstępnie wszyty w takie miejsce, by zapewniał osłonę od strony uszkodzenia kości lub tkanki chrzestnej. Następnie dwuwarstwowa membrana według wynalazku może zostać wszczepiona w miejsce uszkodzenia tak, by kontaktowała się z przeszczepem, w orientacji takiej, by strona wierzchnia membrany znalazła się na miejscu uszkodzenia. Korzystniej, membrana dwuwarstwowa według wynalazku wszczepiana jest wstępnie w miejsce uszkodzone, w takiej orientacji że warstwa graniczna leży na miejscu uszkodzenia kości lub tkanki chrzestnej. Następnie przeszczep okostnowy umieszczany jest w taki sposób, że kontaktuje się z warstwą macierzową. Przeszczep można przyczepić za pomocą klejów biologicznych, takich jak klej fibrynowy, lub przymocować za pomocą ulegających resorbcji polioctanowych przyczepów, lub jeśli jest to konieczne przyszyć w taki sposób, by stanowił nieprzepuszczalną barierę dla wrastających komórek dowolnej otaczającej tkanki łącznej.It is recognized that successful regeneration of cartilage requires the rapid ingrowth of not only native tissue cells such as connective tissue, blood vessels, etc., but also of any new bone tissue at the site of the injury to be treated. This effect can be obtained by using a two-layer membrane according to the invention, serving to delimit, on one side, the matrix layer made of collagen from ingrown cells of the native tissue. During surgical implantation, this effect can be achieved by combining a tissue transplant technique, e.g. a periosteal graft, effectively preventing native tissue cells from growing from the opposite side of the implant. For example, a periosteal graft may be pre-sutured in place to provide a cover against bone or cartilage damage. Thereafter, the two-layer membrane of the invention may be implanted at the site of the defect to contact the graft in an orientation such that the face of the membrane is positioned at the site of the defect. More preferably, the inventive bilayer membrane is initially implanted into the damaged site, in such an orientation that the boundary layer lies at the site of damage to bone or cartilage. The periosteal graft is then placed in contact with the matrix layer. The graft can be attached with biological adhesives such as fibrin glue, or attached with resorbable polyacetate attachments, or if necessary sutured in such a way as to provide an impermeable barrier to ingrown cells of any surrounding connective tissue.

W alternatywnym zastosowaniu wynalazku sama membrana może w sposób efektywny zapobiegać wrastaniu komórek dowolnej natywnej tkanki. Zatem, w kolejnym zastosowaniu wynalazek dostarcza membrany co najmniej trójwarstwowej, w której warstwa macierzowa zbudowana jest przede wszystkim z kolagenu typu II i posiada gąbczastą budowę otwartą, i jest umieszczona pomiędzy dwiema warstwami granicznymi, o strukturze względnie nieprzepuszczalnej, zamkniętej.In an alternative embodiment of the invention, the membrane itself can effectively prevent cell ingrowth of any native tissue. Thus, in a further application, the invention provides an at least three-layer membrane, wherein the matrix layer is primarily composed of type II collagen and has a spongy open structure, and is sandwiched between two relatively impermeable closed boundary layers.

Warstwa macierzowa zachowuje się jak podłoże do wrastania natywnych chondrocytów, umożliwiając efektywną regenerację tkanki chrzestnej. W celu dalszego wspomożenia regeneracji tkanki łącznej warstwa macierzowa może zostać impregnowana chondrocytami albo przed, albo w trakcie implantacji in vivo. Chociaż warstwę macierzową można impregnować chondrocytami tuż przed wszczepieniem (np. poprzez iniekcję), zasadniczo oczekuje się, że wprowadzenie chondrocytów dokonane będzie bezpośrednio poprzez iniekcję zawiesiny chondrocytów w trakcie implantacji. W ten sposób chondrocyty obecne w warstwie macierzowej membrany zdolne są do efektywnej regeneracji tkanki chrzestnej i zasadniczo nowej tkanki kostnej, podczas gdy membrana zapobiega wrastaniu innych rodzajów komórek z otaczających tkanek.The matrix layer acts as a substrate for the ingrowth of native chondrocytes, enabling effective regeneration of the cartilage. To further assist in regeneration of connective tissue, the matrix layer may be impregnated with chondrocytes either before or during in vivo implantation. Although the matrix layer can be impregnated with chondrocytes just prior to implantation (e.g. by injection), it is generally expected that the introduction of the chondrocytes will be done directly by injection of the chondrocyte suspension during implantation. In this way, chondrocytes present in the matrix layer of the membrane are able to efficiently regenerate cartilage and substantially new bone tissue, while the membrane prevents other types of cells from growing from surrounding tissues.

Chondrocyty do zastosowania według wynalazku można uzyskać z takich źródeł komórek, jak komórki autogeniczne lub allogeniczne wyizolowane z chrząstki stawowej, okostnej lub tkanki okołochrzęstnej i komórki mezenchymalne (zrębowe) komórki pnia ze szpiku kostnego. Ponieważ komórki allogeniczne niosą ze sobą potencjał immunogenny i zapalny, korzystne jest izolowanie chondrocytów ze źródeł autogenicznych, szczególnie z autogenicznych tkanek chrzestnych stawów. Sposoby uzyskiwania komórek są dobrze znane i obejmują enzymatyczne trawienie i hodowanie komórek in vitro. Zebrane komórki są hodowane in vitro przed ponownym wprowadzeniem do organizmu. Ogólnie, co najmniej 10⁶, korzystniej co najmniej 10⁷ komórek należy wprowadzić do warstwy macierzowej membrany w celu uzyskania optymalnej regeneracji tkanki chrzestnej.Chondrocytes for use in the present invention may be obtained from cell sources such as autogenous or allogeneic cells isolated from articular cartilage, periosteum or periochondral tissue, and mesenchymal (stromal) stem cells from bone marrow. Since allogeneic cells carry immunogenic and inflammatory potential, it is advantageous to isolate chondrocytes from autogenous sources, especially from autogenous cartilage tissues. Methods for obtaining cells are well known and include enzymatic digestion and culturing the cells in vitro. The harvested cells are cultured in vitro before being reintroduced into the body. Generally, at least 10 ⁶ , more preferably at least 10 ⁷ cells should be introduced into the matrix layer of the membrane to achieve optimal regeneration of the cartilage.

Ogólnie korzystne jest, by warstwa macierzowa membrany według wynalazku zawierała glikozo-aminoglikany (GAG), takie jak kwas hialuronowy, chondroityno-6-siarczan, siarczan keratyny, siarczanIt is generally preferred that the matrix layer of the membrane of the invention comprises glycosaminoglycans (GAGs) such as hyaluronic acid, chondroitin-6-sulfate, keratin sulfate, sulfate

PL 191 497 B1 dermatanu itd., które tworzą naturalne warunki wzrostu dla chondrocytów. Możliwe jest wprowadzenie do warstwy kolagenowej glikozoaminoglikanów z różnych źródeł, o składzie niekoniecznie identycznym i różnych co do masy cząsteczkowej i własności fizjologicznych w porównaniu do glikozamino-glikanów z tkanki chrzestnej, to jednak korzystnymi glikozoaminoglikanami są te, wyizolowane z tkanki chrzestnej. Ogólnie, warstwa macierzowa zawiera korzystnie od 1 do10% (wagowo) glikozamino-glikanów, na przykład od 2 do 6% (wagowo). Jakkolwiek warstwa nieprzepuszczalna może zawierać niektóre glikozoaminoglikany, to większa ich część obecna jest w warstwie macierzowej.PL 191 497 B1 of dermatan etc. which create natural growth conditions for chondrocytes. It is possible to introduce into the collagen layer glycosaminoglycans from different sources, with not necessarily identical composition and with different molecular weight and physiological properties as compared to cartilage glycosaminoglycans, however the preferred glycosaminoglycans are those isolated from cartilage. Generally, the matrix layer preferably comprises from 1 to 10% (by weight) of glycosamine glycans, for example from 2 to 6% (by weight). Although the impermeable layer may contain some glycosaminoglycans, most of them are present in the matrix layer.

W natywnej tkance kolagenowej, GAG występują, co najmniej w jej części, jako składniki proteo-glikanów (PG). Zastosowanie GAG w postaci proteoglikanów jest niepożądane ze względu na możliwe problemy z odpowiedzią immunologiczną, którą mogą wywołać białkowe składniki PG. Korzystnie, warstwa macierzowa jest zatem zasadniczo pozbawiona dowolnych proteoglikanów. Można to łatwo osiągnąć przygotowując warstwę macierzową z mieszaniny oczyszczonego, pozbawionego telopeptydu kolagenu typu II i glikozoaminoglikanów.In native collagen tissue, GAGs are present, at least in part, as proteo-glycan (PG) components. The use of GAGs in the form of proteoglycans is undesirable due to possible problems with the immune response that the protein components of PG may induce. Preferably, the matrix layer is thus substantially free of any proteoglycans. This can easily be achieved by preparing the matrix layer from a mixture of purified, telopeptide-free type II collagen and glycosaminoglycans.

W warstwie macierzowej mogą być obecne również inne substancje dodatkowe, na przykład chondronektyna, laminina, fibronektyna, alginian wapnia lub anchoryna typu II, w celu zwiększenia przylegania chondrocytów do włókien kolagenu typu II oraz czynniki wzrostowe, takie jak czynnik indukujący wzrost tkanki chrzestnej (CIF), insulino-podobny czynnik wzrostowy (IGF), czynnik transformujący beta (TGFβ) obecny jako homo- lub heterodimery oraz czynnik morfogenetyczny tkanki kostnej (BMP), taki jak natywny lub rekombinowany ludzki BMP-2, BMP-3 (osteogenina), BMP-4 i BMP-7 (OP-1, białko 1 osteogenetyczne). BMP-2 wpływa niezależnie na dwa szlaki tworzenia kości - bezpośrednie tworzenie kości, jak również tworzenie tkanki chrzestnej, która jest następnie usuwana i zastępowana tkanką kostną. Kompozycje różnych BMP i kolagenu zawierające macierz kostną uzyskaną poprzez ekstrakcję z warstwy korowej różnych kości lub z demineralizowanych kości obejmują 90% kolagenu i 10% białek niekolagenowych (NCP) dla zapewnienia aktywności BMP lub aktywności chondrogennej BMP/NCP. Niektóre czynniki wzrostowe mogą być obecne również w warstwie nieprzepuszczalnej. Jednakże większa ich część obecna jest w warstwie macierzowej.Ogólnie, membrana zawiera od 100 μg do 5 mg czynników wzrostowych.Other additives such as chondronectin, laminin, fibronectin, calcium alginate or type II anchorin may also be present in the matrix layer to increase chondrocyte adherence to type II collagen fibers, and growth factors such as cartilage induction factor (CIF) , insulin-like growth factor (IGF), transforming factor beta (TGFβ) present as homo- or heterodimers, and bone tissue morphogenetic factor (BMP) such as native or recombinant human BMP-2, BMP-3 (osteogenin), BMP- 4 and BMP-7 (OP-1, osteogenic protein 1). BMP-2 independently affects two pathways of bone formation - direct bone formation as well as the formation of cartilage, which is then removed and replaced with bone tissue. Various BMP and collagen compositions containing bone matrix obtained by extraction from the cortical layer of various bones or from demineralized bones include 90% collagen and 10% non-collagen proteins (NCP) to provide BMP activity or BMP / NCP chondrogenic activity. Some growth factors may also be present in the impermeable layer. However, most of them are present in the matrix layer. In general, the membrane contains 100 μg to 5 mg of growth factors.

Jak wskazano powyżej, membrana obejmuje co najmniej dwie warstwy o różnej strukturze. Korzystnie, warstwa graniczna membrany zbudowana jest zasadniczo z kolagenu typu I i III. Alternatywnie może obejmować materiał syntetyczny np. syntetyczny, ulegający resorbcji polimer, fakultatywnie pokryty materiałem kolagenowym, takim jak kolagen typu I i/lub kolagen typu III.As indicated above, the membrane comprises at least two layers of different structure. Preferably, the boundary layer of the membrane consists essentially of type I and III collagen. Alternatively it may comprise a synthetic material, e.g. a synthetic, resorbable polymer, optionally covered with a collagen material such as type I collagen and / or type III collagen.

Przykłady użytecznych materiałów syntetycznych obejmują poliestry, polikwasy glikolowy i mlekowy (PLA) w postaci homopolimerów i kopolimerów, kopolimery glikolidowe i laktydowe, poliortoestry i poli-kaprolaktony. Wiele z wymienionych substancji jest łatwo dostępnych np. z firmy Boehringer Ingelheim w zakresie RESOMER. Korzystne jest użycie polimerów PLA, takich jak wosk o użytecznej masie cząsteczkowej ok. 650-1200 i nie ulegających zbyt szybkiej degradacji. Szczególnie użytecznym, ulegającym biodegradacji polimerem jest polikwas D,L-mlekowy, w którym proporcja D-laktydów do L-laktydów wynosi ok. 70:30. Korzystną cechą takich materiałów syntetycznych jest fakt, iż posiadają one wysoką stabilność mechaniczną, umożliwiającą rozciąganie implantu membranowego naokoło uszkodzenia kostnego bez obcierania tkanki. Materiały takie nadają się również do zszywania.Examples of useful synthetic materials include polyesters, polyglycolic and lactic (PLA) homopolymers and copolymers, glycolide and lactide copolymers, polyorthoesters and poly-caprolactones. Many of the substances mentioned are readily available e.g. from Boehringer Ingelheim in the RESOMER field. It is preferable to use PLA polymers such as wax with a useful molecular weight of about 650-1200 and not degrading too quickly. A particularly useful biodegradable polymer is poly D, L-lactic acid, in which the ratio of D-lactides to L-lactides is about 70:30. The advantage of such synthetic materials is that they have high mechanical stability, allowing the membrane implant to stretch around the bone damage without abrasion of the tissue. Such materials are also suitable for sewing.

Korzystnie, warstwa graniczna składa się z długich włókien kolagenowych, które przylegają tak mocno, by substancje o dużej masie cząsteczkowej nie mogły przez nie przenikać. Długie włókna nadają ponadto wysoką odporność na rozciąganie i odporność na ścieranie, tak że materiał jest nie tylko membraną rozdzielającą lecz może być łatwo przyszyty. W praktyce chirurgicznej istotne jest by membrana wszczepialna mogła być łatwo przyszyta lub przyczepiona we właściwej pozycji, i wiele z dotychczas zaprojektowanych membran nie spełniało tego warunku. Membrana według wynalazku wykazuje stabilność mechaniczną, wystarczającą do manipulacji chirurgicznych niezbędnych do implantacji.Preferably, the boundary layer consists of long collagen fibers which adhere so tightly that substances of high molecular weight cannot pass through them. The long fibers furthermore impart high tensile strength and abrasion resistance, so that the material is not only a partition membrane but can be sewn easily. It is essential in surgical practice that the implantable membrane can be easily sutured or attached in the correct position, and many of the membranes designed so far have failed to do so. The membrane according to the invention has a mechanical stability sufficient for the surgical manipulations necessary for implantation.

Warstwa macierzowa jest wysoce porowata i posiada masę specyficzną nawet tak niską jak 0,02, co umożliwia bardzo łatwe wrastanie w nią komórek. Ta warstwa membrany, zawierająca zwykle glikozo-aminoglikany, znacznie pęcznieje i może zgromadzić nawet 5000% płynu. Idealnie, warstwa macierzowa powinna dostarczyć struktury porowatej (stopień porowatości i rozmiary porów), umożliwiającej przyleganie komórek oraz powinna umożliwiać utrzymanie przez zasiedlone chondrocyty właściwego im fenotypu, charakteryzowanego przez zdolność do syntezy białek specyficznych dla tkanki chrzestnej.Wielkość porów zależy od procesu zamrażania i suszenia wykorzystywanego w produkcji kolagenu typu II warstwy macierzowej i można oczekiwać iż zawiera się w zakresie od 10 do 120 μm, np. od 20 do 100 μm. Fakultatywnie wielkość porów powinna wynosić około 85 μm. Taką wielkość porów możnaThe matrix layer is highly porous and has a specific mass as low as 0.02, which allows cells to grow into it very easily. This membrane layer, usually containing glycosaminoglycans, swells considerably and can store up to 5,000% of fluid. Ideally, the matrix layer should provide a porous structure (degree of porosity and pore size) that allows the cells to adhere, and should allow the settled chondrocytes to maintain their inherent phenotype, characterized by their ability to synthesize cartilage-specific proteins. The pore size depends on the freezing and drying process used. in the production of type II collagen of the matrix layer and can be expected to be in the range from 10 to 120 μm, e.g. from 20 to 100 μm. Optionally, the pore size should be about 85 µm. This pore size can be

PL 191 497B1 łatwo uzyskać poprzez wolne zamrażanie od -5 do -10°C przez około 24 godziny, a następnie liofilizację lub przez dodanie dwuwęglanu amonowego do papki przed liofilizacją.PL 191 497B1 is easily obtained by slowly freezing from -5 to -10 ° C for about 24 hours followed by lyophilization or by adding ammonium bicarbonate to the slurry prior to lyophilization.

Warstwa macierzowa membrany zawiera korzystnie materiał kolagenu typu II uzyskany z chrząstki, korzystnie z chrząstki szklistej świni.The matrix layer of the membrane preferably comprises type II collagen material obtained from cartilage, preferably hyaline porcine cartilage.

Podczas gdy pożądana grubość warstwy macierzowej zależy od natury kości lub uszkodzenia chrząstki, ogólnie zawiera się pomiędzy 2 a 10 mm, np. od 4 do 6 mm. Grubość warstwy granicznej korzystnie wynosi od 0,2 do 2 mm, np. od 0,2 do 0,7 mm.While the desired thickness of the matrix layer depends on the nature of the bone or cartilage damage, it is generally between 2 and 10 mm, e.g. 4 to 6 mm. The thickness of the boundary layer is preferably 0.2 to 2 mm, e.g. 0.2 to 0.7 mm.

Warstwa graniczna może obejmować zwierzęcy materiał naturalny obejmujący kolagen typu I iIII. Ponieważ jest uzyskana z naturalnego źródła, ulega całkowitej resorbcji w organizmie i nie tworzy toksycznych produktów degradacji. Membrany takie wykazują również wysoką odporność na ścieranie, w stanie zarówno mokrym jak i suchym, tak że można je mocować sposobami chirurgicznymi. Materiał wilgotny jest bardzo elastyczny, co umożliwia rozciąganie i pokrywanie powierzchni nieregularnych defektów kostnych.The boundary layer may include natural animal material including type I and III collagen. As it is obtained from a natural source, it is completely reabsorbed in the body and does not form toxic degradation products. Such membranes also exhibit high abrasion resistance, both wet and dry, so that they can be attached surgically. The wet material is very flexible, which allows it to stretch and cover the surfaces of irregular bone defects.

Oprócz kolagenu, naturalne membrany zwierzęce zawierają inne biomateriały, które należy usunąć. Znane są sposoby traktowania takich membran enzymami, rozpuszczalnikami lub innymi odczynnikami chemicznymi w celu oczyszczenia dla dalszego zastosowania w medycynie. Większość z takich materiałów jest zwykle zbyt cienka i nie zawsze łatwa do użycia. Włókna kolagenowe tracą swój naturalny charakter, tak że wspomniane membrany wykazują niewystarczającą odporność mechaniczną, gdy mają być użyte jako materiał nadający się do szycia chirurgicznego. Ponadto nie wykazują właściwości pęcznienia pod wpływem wody i nie pozwalają na rozróżnienie pomiędzy gładką, granularną powierzchnią, a powierzchnią odkostną, włóknistą. Forma włóknista oczyszczonego, wolnego od telopeptydu kolagenu typu I lub II, jako że mniej rozpuszczalna i ulegająca biodegradacji, jest najkorzystniejszym materiałem nośnikowym.In addition to collagen, natural animal membranes contain other biomaterials that need to be removed. Methods of treating such membranes with enzymes, solvents or other chemical reagents for purification for further use in medicine are known. Most of these materials are usually too thin and not always easy to use. Collagen fibers lose their natural character, so that said membranes show insufficient mechanical resistance when they are to be used as a material suitable for surgical suturing. Moreover, they do not swell under the influence of water and do not allow to distinguish between a smooth, granular surface and a boned, fibrous surface. The fibrous form of purified, telopeptide-free type I or II collagen, being less soluble and biodegradable, is the most preferred carrier material.

Membrany tworzące warstwę graniczną według wynalazku obejmują błony otrzewnowe z cieląt lub świni, utrzymujące naturalną strukturę kolagenową. Membrany otrzewnowe z młodych świń w wieku 6-7 tygodni (o masie 60-80 kg) są szczególnie korzystne.The boundary layer membranes of the invention include calf or porcine peritoneal membranes which maintain the natural collagen structure. Peritoneal membranes from young pigs 6-7 weeks of age (weighing 60-80 kg) are particularly preferred.

Warstwa graniczna powinna korzystnie obejmować czysty, natywny (nie zdenaturowany) kolagen i może być przygotowana sposobem ujawnionym w zgłoszeniu patentowym WO-A-95/18638. Membrana naturalna może być wpierw potraktowana zasadą, na przykład wodnym roztworem NaOH w stężeniu 0,2 -5% (wagowo). Powoduje to zmydlenie wszystkich tłuszczy i białek wrażliwych na zasady. W drugim etapie materiał traktowany jest kwasem, zwykle nieorganicznym, takim jak HCl, w celu usunięcia rozpuszczalnych w kwasie zanieczyszczeń. Materiał jest następnie przemywany, aż do uzyskania pH w zakresie 2,5-3,5. Membrana posiada na tym etapie powierzchnię gładką lub granularną oraz powierzchnię mniej zwartą, fibrylarną. Niekiedy korzystne jest sieciowanie membrany, poprzez ogrzanie do 100-120°C.The boundary layer should preferably comprise pure, native (non-denatured) collagen and may be prepared as disclosed in WO-A-95/18638. The natural membrane may first be treated with an alkali, for example 0.2-5% (w / w) aqueous NaOH solution. This saponifies all alkaline-sensitive fats and proteins. In a second step, the material is treated with an acid, usually an inorganic acid, such as HCl, to remove acid-soluble impurities. The material is then washed until the pH is in the range of 2.5-3.5. At this stage, the membrane has a smooth or granular surface and a less dense, fibrous surface. It is sometimes advantageous to cross-link the membrane by heating to 100-120 ° C.

Kolagen typu II stosowany do warstwy macierzowej membrany można uzyskać z chrząstki, w podobny sposób jak podano powyżej dla warstwy granicznej, obejmującej zasadniczo kolagen typu I i III. Korzystne jest usunięcie wody z chrząstki przez potraktowanie jej acetonem, a następnie ekstrakcja tłuszczu rozpuszczalnikiem węglowodorowym, takim jak n-heksan, choć można stosować alkanole, takie jak alkohol etylowy, etery takie jak eter dietylowy lub chlorowane węglowodory, takie jak chloroform lub ich mieszaniny. Odtłuszczony materiał jest następnie traktowany zasadą, zmydlającą pozostałe resztkowe tłuszcze i degradującą niektóre z białek. Ostatecznie materiał traktowany jest kwasem, powodującym dalszą degradację białek. Następnie materiał pęcznieje w wodzie i poddawany jest homogenizacji w młynku do otrzymania jednolitej papki.Type II collagen used for the matrix layer of the membrane can be obtained from cartilage in a similar manner as described above for a boundary layer consisting essentially of type I and III collagen. It is preferable to remove water from the cartilage by treating it with acetone followed by extracting the fat with a hydrocarbon solvent such as n-hexane, although alkanols such as ethyl alcohol, ethers such as diethyl ether or chlorinated hydrocarbons such as chloroform or mixtures thereof may be used. The skimmed material is then treated with an alkali which saponifies the remaining residual fats and degrades some of the proteins. Eventually, the material is treated with acid, causing the proteins to degrade further. The material is then swelled in water and homogenized in a mill until a homogenous slurry is obtained.

W celu wytworzenia wielowarstwowej membrany, miękka papka zawierająca kolagen typu II nakładana jest na powierzchnię włóknistą gładkiej membrany przygotowanej na przykład zgodnie z WO-A-95/18638. Zwykle membrana umieszczana jest na powierzchni gładkiej, powierzchnią granularną do dołu, tak że papka kolagenu typu II może być łatwo nałożona na nią np. poprzez rozprowadzanie i wcieranie w stronę włóknistą membrany. Papka tworzy następnie warstwę o pożądanej grubości, przylegającą ściśle do membrany kolagenowej. Utworzona tak dwuwarstwowa membrana poddawana jest następnie zamrażaniu i liofilizacji w celu uzyskania struktury gąbczastej, posiadającej pory o pożądanej wielkości. Jeżeli jest to konieczne część warstwy macierzowej może zostać usunięta w celu zapewnienia dwuwarstwowej membranie jednolitej grubości. W celu wytworzenia trójwarstwowej membrany, kolejna gładka membrana umieszczana jest na powierzchni warstwy macierzowej, swą stroną włóknistą do warstwy macierzowej.To form a multilayer membrane, a type II collagen-containing soft pulp is applied to the fibrous surface of a smooth membrane prepared, for example, according to WO-A-95/18638. Typically the membrane is placed on a smooth surface, with the granular surface downwards, so that type II collagen slurry can be easily applied thereto by e.g. spreading and rubbing towards the fibrous membrane. The pulp then forms a layer of the desired thickness, adhering tightly to the collagen membrane. The thus formed two-layer membrane is then subjected to freezing and freeze-drying in order to obtain a spongy structure having the desired pore size. If necessary, a portion of the matrix layer may be removed to provide the double-layer membrane with a uniform thickness. To form a three-layer membrane, another smooth membrane is placed on the surface of the matrix layer with its fiber side facing the matrix layer.

PL 191 497 B1PL 191 497 B1

Papka kolagenu typu II która nakładana jest na membranę zawiera zasadniczo 1,0-4,0% wagowych kolagenu, korzystnie 2-3% wagowe. Użytecznie, wartość pH tej mieszaniny powinna zostać doprowadzona do 2,5-4,5, korzystnie od 3,0 do 4,0.Type II collagen slurry that is applied to the membrane comprises essentially 1.0-4.0% by weight of collagen, preferably 2-3% by weight. Usefully, the pH of this mixture should be adjusted to 2.5-4.5, preferably from 3.0 to 4.0.

Korzystnie, materiał kolagenu typu II można poddać sieciowaniu po etapie liofilizacji w celu stabilizacji warstwy macierzowej. Etap ten służy jednocześnie zwiększaniu stabilności mechanicznej warstwy macierzowej i zmniejszaniu stopnia resorbcji w organizmie. Idealnie stopień sieciowania powinien być taki, by tempo degradacji warstwy macierzowej odpowiadało tempu regeneracji tkanki. Fizyczne, sieciowanie można prowadzić poprzez ogrzewanie, lecz proces ten należy prowadzić ostrożnie w celu uniknięcia niepożądanej utraty zdolności do resorbcji. Korzystne jest ogrzewanie w temperaturze 100-120°C przez okres od 30 minut do 5 godzin. Bardziej korzystnie sieciowanie można prowadzić poprzez naświetlanie UV z wykorzystaniem lampy UV np. przez okres 8 godzin.Advantageously, the type II collagen material may be cross-linked after a lyophilization step to stabilize the matrix layer. At the same time, this step serves to increase the mechanical stability of the matrix layer and reduce the degree of resorption in the body. Ideally, the degree of cross-linking should be such that the rate of matrix layer degradation corresponds to the rate of tissue regeneration. Physical cross-linking can be accomplished by heating, but the process must be carried out carefully to avoid undesirable loss of absorbability. Heating at 100-120 ° C for 30 minutes to 5 hours is preferred. More preferably, cross-linking can be carried out by UV irradiation using a UV lamp, e.g. for a period of 8 hours.

Materiał kolagenu typu II zawiera korzystnie glikozoaminoglikany. Glikozoaminoglikany reagują z kolagenem typu II w reakcji częściowego sieciowania, dając nierozpuszczalny w wodzie produkt. Jeżeli jest to konieczne, można poprawić efektywność dalszego sieciowania poprzez ogrzewanie lub naświetlanie światłem UV, jak podano to powyżej. Reakcję pomiędzy glikozoaminoglikanami i kolagenem można prowadzić w temperaturze pokojowej, przy pH w zakresie 2,5-3,5. Ilość glikozoaminoglikanów może wahać się od 1 do 10% wagowych. Materiał można zamrażać i liofilizować bezpośrednio po reakcji.The type II collagen material preferably comprises glycosaminoglycans. Glycosaminoglycans react with type II collagen in a partial cross-linking reaction to give a water-insoluble product. If necessary, the efficiency of the further crosslinking can be improved by heating or irradiation with UV light as mentioned above. The reaction between glycosaminoglycans and collagen can be carried out at room temperature, with a pH in the range of 2.5-3.5. The amount of glycosaminoglycans may vary from 1 to 10% by weight. The material can be frozen and lyophilized immediately after the reaction.

Alternatywnie, tworzenie papki można prowadzić poprzez zwiększanie pH masy kolagenowej typu II. Ten sposób polega na schłodzeniu masy do około 4°C i powolnym podnoszeniu pH poprzez dodawanie zimnego roztworu NaOH w 4°C do wartości pH 6,5-7,5. Następnie masa przetrzymywana jest w temperaturze pokojowej przez 15-25 godzin. W tym czasie tworzy się papka, a po jej utworzeniu masa może być zamrażana i liofilizowana.Alternatively, slurry formation can be accomplished by increasing the pH of the type II collagen mass. This method consists in cooling the mass to about 4 ° C and slowly raising the pH by adding cold NaOH solution at 4 ° C to a pH of 6.5-7.5. Then the mass is kept at room temperature for 15-25 hours. During this time, a slurry is formed, and after it is formed, the mass can be frozen and lyophilized.

Innym sposobem jest neutralizacja masy kolagenu typu II do pH o wartości od 6,8 do 7,4, a następnie usuwanie powietrza. Mieszanina umieszczana jest w formie i inkubowana przez 15-20 godzin w temperaturze 37°C. Tworzy się delikatna papka która może być następnie zamrażana i liofilizowana.Another way is to neutralize the mass of type II collagen to a pH of 6.8 to 7.4 and then remove the air. The mixture is placed in a mold and incubated for 15-20 hours at 37 ° C. A delicate paste is formed which can then be frozen and freeze-dried.

Zastosowanie jednego z wymienionych wyżej sposobów zależy od właściwości pożądanego produktu. Pierwszy sposób pozwala uzyskać najbardziej stabilny produkt. Jednakże precypitacja może powodować powstawanie zgęstnień materiału, dlatego należy prowadzić ją bardzo ostrożnie. Drugi sposób daje produkt delikatny i jednorodny, jest on jednak bardziej rozpuszczalny niż produkt otrzymany pierwszym sposobem.The use of one of the above-mentioned methods depends on the properties of the desired product. The first way allows you to get the most stable product. However, precipitation may cause thickening of the material, so it should be carried out very carefully. The second method gives a fine and homogeneous product, but it is more soluble than the product obtained from the first method.

W procesie wytwarzania papki możliwe jest dodatkowe wprowadzanie innych pożądanych substancji, takich jak substancji leczniczych np. antybakteryjnych takich jak taurolidyny lub antybiotyków, takich jak gentamycyny.It is possible to additionally incorporate other desired substances such as medicinal substances e.g. antibacterials such as taurolidines or antibiotics such as gentamicins in the process of producing the slurry.

Po nałożeniu papki na membranę materiał jest zamrażany. W celu uzyskania powtarzalnej wielkości porów proces zamrażania musi być dokładnie kontrolowany, zarówno pod względem szybkości, jak i czasu zamrażania, wartości pH oraz wielkości cząsteczek. W celu uzyskania bardzo małych porów materiał powinien być gwałtownie zamrożony do bardzo niskiej temperatury.After the slurry is applied to the membrane, the material is frozen. In order to obtain a reproducible pore size, the freezing process must be carefully controlled, both in terms of freezing speed and time, pH value and particle size. In order to obtain very small pores, the material should be rapidly frozen to a very low temperature.

Zamrożona membrana poddawana jest następnie liofilizacji i ogrzewaniu do 110-130°C. W ten sposób dochodzi do sprzęgania. Następnie liofilizowana biomembrana może być doprowadzona do pożądanej grubości, tak by grubość warstwy macierzowej wynosiła zwykle 2 mm. Podwójna membrana jest następnie sterylizowana, na przykład poprzez naświetlenie promieniami gamma lub poprzez działanie tlenkiem etylenu. Sterylizacja poprzez wysokoenergetyczne naświetlenie np. ⁶⁰Co w dawkach 25 kGy może dezaktywować BMP. W takim przypadku wysterylizowaną już membranę można impregnować BMP w sterylnym roztworze przed implantacją.The frozen membrane is then lyophilized and heated to 110-130 ° C. This is how coupling occurs. Then, the freeze-dried biomembrane can be brought to the desired thickness, such that the thickness of the matrix layer is typically 2 mm. The double membrane is then sterilized, for example by gamma irradiation or by treatment with ethylene oxide. Sterilization by high-energy irradiation, eg ⁶⁰ Co in doses of 25 kGy, can deactivate BMP. In this case, the already sterilized membrane can be impregnated with the BMP in a sterile solution prior to implantation.

Membranę według wynalazku można wykorzystywać w medycynie w następujący sposób:The membrane according to the invention can be used in medicine as follows:

Jako materiał do kierowanej regeneracji tkanek. Wzrost komórek wspierany jest przez warstwę macierzową. Warstwa graniczna hamuje wzrost niepożądanych komórek.As a material for guided tissue regeneration. Cell growth is supported by the matrix layer. The boundary layer inhibits the growth of unwanted cells.

Jako materiał do naprawy uszkodzeń tkanki chrzestnej takich jak ubytki nie penetrujące poniżej warstwy płytki chrzestnej lub w naprawie uszkodzeń kostno-chrzęstnych.As a material for repairing damage to the cartilage, such as non-penetrating cavities below the layer of the god plate or in the repair of osteochondral damage.

Wynalazek dostarcza również wielowarstwowej membrany kolagenowej jak przedstawiono to powyżej, do kierowanej regeneracji tkanki. Zawartość kolagenu typu II w membranie jest szczególnie użyteczna w regeneracji tkanki chrzęstnej lecz również jest użyteczna w regeneracji innych rodzajów tkanek.The invention also provides a multi-layer collagen membrane as outlined above for targeted tissue regeneration. The type II collagen content of the membrane is particularly useful in regenerating cartilage tissue but is also useful in regenerating other types of tissue.

Wynalazek dostarcza w kolejnym aspekcie membrany opisanej powyżej jako wszczep do kierowanej regeneracji tkanek.The invention provides in a further aspect a membrane as described above as an implant for directed tissue regeneration.

Poniższe przykłady stanowią jedynie ilustrację wynalazku. W poniższych przykładach wszystkie etapy wykonywano w warunkach aseptycznych, np. w sterylnych pomieszczeniach.The following examples are merely illustrative of the invention. In the examples below, all steps were performed under aseptic conditions, e.g. in sterile rooms.

PL 191 497B1PL 191 497B1

Przykład 1 (A) Membrany otrzewnowe uzyskane z młodych cieląt czyszczono całkowicie z pozostałości mięsa i tłuszczu sposobami mechanicznymi, przemyto pod bieżącą wodą i traktowano 2% roztworem NaOH przez 12 godzin. Membrany następnie przemyto pod bieżącą wodą i zakwaszano 0,5% HCl. Po zakwaszeniu materiału na całej jego grubości (co trwało około trzech godzin) materiał przemyto do osiągnięcia pH 3,5. Materiał następnie obkurczano w 7% roztworze soli, neutralizowano 1% roztworem NaHCO₃ i przemyto pod bieżącą wodą. Materiał następnie odwodniono acetonem i odtłuszczono n-heksanem.Example 1 (A) Peritoneal membranes obtained from young calves were cleaned completely of meat and fat residues by mechanical means, washed under running water and treated with a 2% NaOH solution for 12 hours. The membranes were then washed under running water and acidified with 0.5% HCl. After the material was acidified throughout its thickness (which took about three hours), the material was washed until the pH was 3.5. The material was then shrunk in 7% saline solution, neutralized with 1% NaHCO ₃ solution and washed under running water. The material was then dehydrated with acetone and degreased with n-hexane.

(B) Zamrożone chrząstki uzyskane ze świeżo zabitych świń moczono w zimnej wodzie, dokładnie opłukano i oczyszczono mechanicznie od pozostałości mięsa, kości i twardych części. Następnie materiał przemywano przez 30 minut pod bieżącą wodą.(B) Frozen cartilage obtained from freshly killed pigs was soaked in cold water, thoroughly rinsed and mechanically cleaned of meat, bones and hard parts. The material was then washed for 30 minutes under running water.

Następnie materiał homogenizowano w homogenizatorze. Wielkość cząsteczek po homogenizacji wyniosła około 8 mm.Then the material was homogenized in a homogenizer. The particle size after homogenization was about 8 mm.

Fragmenty chrząstki następnie odwadniano przez płukanie 4 razy w acetonie, za każdym razem przez 8 godzin. Chrząstkę następnie odtłuszczano stosując czterokrotną ekstrakcję n-heksanem. Każda ekstrakcja trwała co najmniej 8 godzin. Stosunek heksanu do chrząstki wynosił 1:10.The cartilage pieces were then dehydrated by rinsing 4 times in acetone for 8 hours each. The cartilage was then degreased using n-hexane extraction four times. Each extraction lasted at least 8 hours. The ratio of hexane to cartilage was 1:10.

Po odtłuszczeniu chrząstkę spęczniano w wodzie pitnej. Stosunek wody:materiału wynosił 10:1. Pęcznienie prowadzono przez 24 godziny.After degreasing, the cartilage was swollen in drinking water. The water: material ratio was 10: 1. The swelling was carried out for 24 hours.

Materiał następnie traktowano przez 32 godziny roztworem NaOH (5% wagowo), gdzie stosunek chrząstki do płynu wynosił 1:4. W czasie traktowania kawałki chrząstki dokładnie mieszano. Wyjściowe pH wynoszące 14, w ten sposób zmniejszyło się do 9-11. Rozpuszczalne zanieczyszczenia przemyto i oddzielono od chrząstki. Płyn powstający w trakcie traktowania zasadą zebrano i odzyskano z niego glikozoaminoglikan.The material was then treated for 32 hours with a NaOH solution (5% by weight) where the cartilage to fluid ratio was 1: 4. During the treatment, the pieces of cartilage were thoroughly mixed. The starting pH of 14 thus decreased to 9-11. Soluble impurities were washed and separated from the cartilage. The base fluid was collected and glycosaminoglycan was recovered therefrom.

Zebrany materiał traktowano następnie przez 4-6 godzin silnym kwasem HCl (około 3% wagowo) wstępnie przy pH poniżej 1,0.The harvested material was then treated for 4-6 hours with strong HCl acid (about 3% by weight) initially at a pH below 1.0.

Następnie materiał przemywano zimną wodą aż do czasu uzyskania wartości pH w granicach 3-3,5. Wszystkie zanieczyszczenia usunięto, tak że produkt stanowił pozbawioną soli masę kolagenową, użyteczną do produkcji gąbki lub innego materiału kolagenowego. W tym celu, masę chrząstkową można, zależnie od zamierzonych celów, odgazować, zamrozić i liofilizować.The material was then washed with cold water until the pH was between 3-3.5. All impurities were removed so that the product was a salt-free collagen mass useful for the production of a sponge or other collagen material. For this purpose, the cartilage mass may, depending on the intended purposes, be degassed, frozen and lyophilized.

Ekstrakt otrzymany po traktowaniu zasadą jak podano wyżej zawierał glikozoaminoglikan, zasadę, skażone białka i sole. Ekstrakt neutralizowano HCl, tak by wartość pH spadła do około 6. Ekstrakt traktowano następnie pomocniczym materiałem filtracyjnym, a mianowicie ziemią okrzemkową, usuwającą skażone białka. Do ekstraktu wprowadzono 0,5% wagowo ziemi okrzemkowej i następnie oddzielono przez filtrację razem ze skażonymi białkami.The extract obtained after treatment with the base as described above contained glycosaminoglycan, base, denatured proteins and salts. The extract was neutralized with HCl so that the pH dropped to about 6. The extract was then treated with a filter aid, diatomaceous earth, to remove the contaminated proteins. 0.5% by weight of diatomaceous earth was introduced into the extract and then separated by filtration together with the contaminated proteins.

Supernatant poddano następnie ultrafiltracji z wykorzystaniem membrany nieprzepuszczalnej dla cząsteczek o masie powyżej 10,000 daltonów. W ten sposób usunięto sole, a pozostawiono czysty glikozoaminoglikan.The supernatant was then subjected to ultrafiltration using a membrane impermeable to molecules above 10,000 daltons. In this way, the salts were removed, leaving pure glycosaminoglycan.

Tak uzyskany roztwór glikozoaminoglikanu zmieszano z materiałem kolagenu przedstawionym powyżej, do utworzenia macierzy kolagenu typu II zawierającej glikozoaminoglikan.The thus obtained glycosaminoglycan solution was mixed with the collagen material shown above to form a type II collagen matrix containing glycosaminoglycan.

Uzyskano następujące właściwości masy kolagenowej typu II:The following properties of type II collagen mass were obtained:

TG = 2,8% wagowoTG = 2.8% by weight

GAG = 3% wagowo (wyliczone na podstawie zawartości kolagenu) pH = 3,5 (C) Świeżo przygotowaną membranę otrzewnową przygotowaną jak podano w punkcie (A) przemyto równomiernie wodą i pozostawiono na równej płytce szklanej stroną włóknistą do góry. Następnie membranę dokładnie zwilżono masą kolagenu typu II przygotowaną jak podano w punkcie (B). Membranę następnie rozciągano równomiernie we wszystkich kierunkach, tak by dokładnie przylegała do płytki. Masę kolagenu typu II następnie dokładnie wcierano w membranę.GAG = 3 wt.% (Calculated on the collagen content) pH = 3.5 (C) A freshly prepared peritoneal membrane prepared as in (A) was evenly washed with water and left on a flat glass plate with the fiber side up. The membrane was then thoroughly wetted with a mass of type II collagen prepared as stated in (B). The membrane was then stretched evenly in all directions to adhere exactly to the plate. A mass of type II collagen was then thoroughly rubbed into the membrane.

Membranę następnie obciążono z góry dużą masą i pozostawiono w ten sposób przez noc w lodówce w temperaturze około 4°C. W tym czasie tworzyła się papka.The membrane was then loaded with a heavy weight in advance and thus left overnight in a refrigerator at about 4 ° C. A mush was forming during this time.

Papkę zamrożono w następujących warunkach: temperatura = -12°C czas = 40 minutThe pulp was frozen under the following conditions: temperature = -12 ° C time = 40 minutes

Następnie zamrożoną papkę liofilizowano i ogrzewano do 125°C.The frozen slurry was then lyophilized and heated to 125 ° C.

Czas liofilizacji = 14 godzin.Freeze-drying time = 14 hours.

Warstwę macierzową kolagenu typu II następnie dzielono na fragmenty grubości 1 mm.The type II collagen matrix layer was then divided into 1 mm thick fragments.

PL 191 497 B1PL 191 497 B1

Przykład 2Example 2

Świeżo przygotowaną membranę otrzewnową uzyskaną jak podano w przykładzie 1(A) nałożono na płytkę szklaną i wcierano w nią grubą warstwę masy kolagenu typu II, o własnościach jak podano w przykładzie 1.50 g masy kolagenu typu II rozpuszczono w 100 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszano. W czasie mieszania wolno dodawano 100 ml roztworu glikozoaminoglikanu. Kolagen wytrącił się w postaci masy wraz z GAG. Po wytrąceniu masę homogenizowano i zawiesinę rozprowadzano na membranie. Papka wytworzyła się przez noc i membranę traktowano dalej jak podano w przykładzie 1.A freshly prepared peritoneal membrane obtained as in Example 1 (A) was placed on a glass plate and rubbed into it with a thick layer of type II collagen mass, with the characteristics as given in Example 1.50 g of type II collagen mass was dissolved in 100 ml of distilled water and mixed thoroughly. While stirring, 100 ml of glycosaminoglycan solution was slowly added. Collagen mass precipitated with the GAG. After precipitation, the mass was homogenized and the suspension was spread over the membrane. A mush formed overnight and the membrane was further treated as outlined in Example 1.

Claims (14)

1. Wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzestnej in vivo, znamienna tym, że zawiera (i) warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowiezbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz (ii) co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy.1.A multilayer membrane useful for in vivo use in bone or cartilage reconstruction comprising (i) an open, spongy matrix layer composed primarily of type II collagen, and (ii) at least one closed, relatively impermeable boundary layer. structure composed mainly of type I and III collagen and is a boundary layer with the applied and lyophilized suspension of type II collagen forming a matrix layer with an open, spongy structure, stably attached to this layer. 2. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmujepojedynczą warstwę graniczną.2. The membrane according to claim 1 The method of claim 1, comprising a single boundary layer. 3. Membrana według zastrz. 1, znamienna tym, że warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi.3. The membrane according to claim 1 The method of claim 1, wherein the matrix layer is sandwiched between two boundary layers. 4. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki.4. The membrane according to claim 1 The method of claim 1, 2 or 3, characterized in that the matrix layer is made of a type II collagen-containing material derived from natural cartilage. 5. Membrana według zastrz. 4, znamienna tym, że materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń.5. The membrane according to claim 1 The method of claim 4, wherein the type II collagen-containing material is derived from porcine hyaline cartilage. 6. Membrana według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, żemateriał zawierający kolagen typu II jest usieciowany.6. The membrane according to claim 1 The method of claim 4 or 5, characterized in that the type II collagen-containing material is cross-linked. 7. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń.7. The membrane according to claim 1 The boundary layer or layers are derived from the peritoneal membrane of calves or pigs. 8. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego.8. The membrane according to claim 1 A method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the matrix layer is impregnated with chondrocytes isolated from articular cartilage, periosteum, periosteal tissue or mesenchymal stem cells from bone marrow. 9. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem.9. The membrane according to claim 1 The method of claim 1, 2 or 3, characterized in that the matrix layer and / or the boundary layer or layers are impregnated with glycosaminoglycan. 10. Membrana według zastrz. 9, znamienna tym, że glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu.10. The membrane according to claim 1 9. The composition of claim 9, wherein the glycosaminoglycan is hyaluronic acid, chondroitin-6-sulfate, keratin sulfate or dermatan sulfate. 11. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów.11. The membrane according to claim 1 3. The matrix as claimed in claim 1, wherein the matrix layer and the boundary layer or layers are substantially free of proteoglycans. 12. Membrana według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.12. The membrane according to claim 1 5. The matrix of claim 1, 2 or 3, characterized in that the matrix layer and / or boundary layer or boundary layers further comprises chondronectin, laminin, fibronectin, calcium alginate, type II anchorin, growth factors or bone morphogenetic factors. 13. Sposób wytwarzania wielowarstwowej membrany określonej w zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej określonej w zastrz. 1, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.13. A method for producing a multi-layer membrane as defined in claim 1; A method according to claim 1, characterized in that the type II collagen suspension is applied to the surface of the boundary layer as defined in claim 1. 1, followed by lyophilization to obtain a firmly attached type II collagen matrix with an open, spongy structure. 14. Zastosowanie membrany określonej w zastrz. 1 do wytwarzania wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.14. Use of the membrane according to claim 1 1 for producing an implant for guided tissue regeneration.