KR100520944B1 - Collagen-based supports for tissue engineering and manufacture of biomaterials - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 한쪽 면은 반드시 콜라겐 젤을 건조하여, 바람직하게는 공기 중이나 가스성 유체에서 건조하여 제조된 콜라겐 피막이나 혹은 고압축 콜라겐 스펀지 중 어느 하나로 구성된 조밀 콜라겐 막이 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 콜라겐 지지체를 형성하는 조성물에 관한 것이다.At least one porous collagen layer covered with a dense collagen membrane composed of either a collagen film prepared by drying the collagen gel, preferably by drying in air or a gaseous fluid, or a high-pressure collagen sponge must be coated on at least one side thereof. It relates to a composition for forming a collagen support comprising.

유리하게는, 두개의 층 즉, 다공질 층 및 조밀막 중 적어도 하나는 청년 혹은 장년 피험자 유래의 정상 생체세포 및 유전적으로 변형된 혹은 악성의 생체세포를 포함한다.Advantageously, at least one of the two layers, the porous layer and the dense membrane, comprises normal living cells from a young or mature subject and genetically modified or malignant living cells.

본 발명은 잠재적 활성물질의 유효성에 대한 시험관 내 시험용 인공피부의 제조를 위한 혹은 생체내 손상피부의 재건을 위한 콜라겐 지지체 형성 조성물을 제공하는 효과가 있다.The present invention has the effect of providing a collagen support forming composition for the production of artificial skin for in vitro test on the effectiveness of a potential active substance or for reconstructing damaged skin in vivo.

Description

인공조직 및 생체재료 제조용 콜라겐 지지체{Collagen-based supports for tissue engineering and manufacture of biomaterials}Collagen-based supports for tissue engineering and manufacture of biomaterials

본 발명은 적어도 한쪽 면은 반드시 콜라겐 젤을 건조하여, 바람직하게는 공기 중이나 가스성 유체에서 건조하여 제조한 콜라겐 피막이나 혹은 고압축 콜라겐 스펀지 중 어느 하나로 구성된 조밀 콜라겐 막이 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 콜라겐 지지체를 형성하는 조성물에 관한 것이다.At least one porous collagen layer covered with a dense collagen film composed of either a collagen film prepared by drying the collagen gel, preferably by drying in air or a gaseous fluid, or a high-pressure collagen sponge, must be coated on at least one side. It relates to a composition for forming a collagen support comprising.

오랫동안 콜라겐은 생체세포를 포함하는 인공조직을 생산하기 위한 귀중한 기질로 알려져 왔다. Collagen has long been known as a valuable substrate for producing artificial tissue, including living cells.

제약분야에서 생체재료의 사용이 점차 증가되고 있으며 그들은 변형세포를 생물체에 도입하여 생존케함으로써 향후 손상된 연결조직의 제조나 혹은 유전자치료용으로 유망하다. The use of biomaterials in the pharmaceutical field is increasing and they are promising for the production of damaged connective tissue or for gene therapy in the future by introducing modified cells into living organisms.

게다가, 특히 동물실험은 화장품 및 피부제약산업에서는 점점 더 사용하지 않게 되었기 때문에, 이들 분야에서는 "시험관 내" 시험용으로써 인공피부의 사용이 점차 증가하고 있다. 이러한 이유로, 전 세계에 걸쳐 몇몇 연구팀들이 피부, 연골, 뼈, 힘줄 혹은 인공각막과 같은 살아있는 인공조직을 생산하기 위한 콜라겐 지지체를 개발시키고자 하였다.In addition, the use of artificial skin as an "in vitro" test in these fields is increasing, especially since animal testing is increasingly used in the cosmetic and dermatological industries. For this reason, several researchers around the world have sought to develop collagen scaffolds to produce living artificial tissues such as skin, cartilage, bones, tendons or artificial corneas.

본 발명이 속한 분야에서 실시되어 온 주요한 연구들은 주로 다음의 팀들에서 주로 이루어져 왔다: Yannas I., Collombel C., Tinois E., Boyce S., Eisenberg Ho., Bell E., Kuroyanagi Y., Maruguchi T., Hanthamrongwit M., Auger F.A. and Osborne C.S.; cf. patent US 5,273,900, for example.The main studies carried out in the field of the present invention have been mainly carried out by the following teams: Yannas I., Collombel C., Tinois E., Boyce S., Eisenberg Ho., Bell E., Kuroyanagi Y., Maruguchi T., Hanthamrongwit M., Auger FA and Osborne C. S .; cf. patent US 5,273,900, for example.

이들 연구자들은 동결건조된 젤이나 혹은 콜라겐 스펀지 중 어느 하나를 사용한다.The researchers use either lyophilized gels or collagen sponges.

WO 99/19005에는 적어도 한쪽 면에 바람직하게는 두 쪽 면에 상대적으로 불침투적인 폐쇄구조로 된 적어도 하나의 장벽층을 포함하는 스펀지 구조로 되어있는 콜라겐 II로 된 기질 층을 포함하는 다층막이 개시되어 있다.WO 99/19005 discloses a multilayer membrane comprising a substrate layer of collagen II in a sponge structure comprising at least one barrier layer of at least one barrier layer, preferably at least one barrier, relatively impermeable to both sides. It is.

상기 명세서에서 장벽층은 천연동물막으로 구성된다(7페이지 23 내지 32 줄, 8페이지 10 내지 30줄).The barrier layer in this specification consists of natural animal films (pages 23 to 32, page 8 and lines 10 to 30).

상기 장벽층의 목적은 이 막이 인공뼈 혹은 특히 인공연골용으로 사용되기 때문에 침투와 천연조직세포의 생장을 방해하고자 한다. 따라서, 다공질층으로 된 물질로써, 연골, 바람직하게는 돼지의 유리질 연골에서 유래한 콜라겐 II를 사용하여야 한다(7페이지 14 내지 16 줄).The purpose of the barrier layer is to prevent infiltration and growth of natural tissue cells because this membrane is used for artificial bone or especially for artificial cartilage. Therefore, as a material of the porous layer, collagen II derived from cartilage, preferably pig's vitreous cartilage, should be used (lines 7 to 14, page 7).

연골세포 혹은 연골은 섬유아세포와 같은 연조직 세포의 재생 속도보다 훨씬 느린 증식 및 재생 속도를 가지므로, 연조직의 빠른 생장으로 인한 세포의 침입을 피하는 한편 그들이 생장할 수 없도록 격리시켜야한다. 상기 문헌에는 연골의 생장을 지지하는 콜라겐 II 세포의 생장을 보호하는 세포에 장벽층을 밀착시킴으로써 상기 문제를 해결하였다(2페이지 15 내지 20줄).Cartilage cells or cartilage have a much slower proliferation and regeneration rate than the rate of regeneration of soft tissue cells such as fibroblasts, so they must be isolated so that they cannot grow while avoiding cell invasion due to rapid growth of soft tissues. This document addresses this problem by adhering the barrier layer to cells that protect the growth of collagen II cells that support the growth of cartilage (pages 2-20, page 2).

이후 개시되는 발명의 주 골격은 이중 층 물질을 우선적으로 제조하며 이중 층의 각 층에는 인간유래의 생체세포가 생장할 수 있어, 종래기술과 비교하여 분명하지는 않으나 전혀 예상치 않았던 해결책을 수립하는 것으로 되어있다.The main skeleton of the invention disclosed hereafter is to produce a bilayer material preferentially, and each layer of the bilayer can grow human-derived living cells, thereby establishing a solution which is not clear but unexpected at all compared to the prior art. have.

문헌 WO 96/08277은 본 출원인의 선행발명을 포함하는 복막재생보철로써의 콜라겐막의 용도에 관한 것이다. 상기 문헌에서, 바람직한 실시예에는 특히 12페이지 및 13페이지의 실시예 II에는 콜라겐 젤이 끼워져 있는 콜라겐 스펀지를 포함하는 혼합막이 있으며, 상기 막은 비독성 가스성 유체에서 콜라겐 젤을 건조하였다.The document WO 96/08277 relates to the use of collagen membranes as a peritoneal regeneration prosthesis comprising the applicant's prior invention. In this document, a preferred embodiment, in particular Example II on pages 12 and 13, has a mixed membrane comprising a collagen sponge fitted with a collagen gel, which membrane has dried the collagen gel in a non-toxic gaseous fluid.

그러나, 실시예 II에서 제조된 스펀지는 150 바의 압력 하에서 15초간 압축되며 상기 압축된 스펀지에 1% 콜라겐의 콜라겐 젤을 올려두어 혼합막을 형성하고, 그 후 상기 젤은 순환하는 공기 중에서 건조된다.However, the sponge prepared in Example II is compressed for 15 seconds under a pressure of 150 bar and a collagen gel of 1% collagen is placed on the compressed sponge to form a mixed membrane, and the gel is then dried in circulating air.

150 바의 압력 하에서 15초간 압축된 스펀지에 따라, 제조된 혼합막은 본 발명과는 다른 구조로 된 사실상 2개의 조밀층으로부터 출발하여 생산된다. 게다가, 본 발명의 경우, 본 발명의 이중 층 구조는 증식뿐만 아니라 보존도 가능하여 적어도 하나의 층에 인간유래의 생체세포를 파종할 수 있음이 뜻하지 않게 발견되었다. According to the sponge compressed for 15 seconds under a pressure of 150 bar, the prepared mixed membrane is produced starting from virtually two dense layers having a structure different from the present invention. In addition, in the case of the present invention, it has been unexpectedly discovered that the bilayer structure of the present invention is capable of proliferation as well as preservation so that human-derived living cells can be seeded in at least one layer.

FR 679 778 문헌에는 동일 출원인의 다른 선행발명이 기재되어 있다.FR 679 778 describes another prior invention of the same applicant.

또한, EP 0 686 402 문헌은 두개의 층을 포함하는 점착방지 후작동용 콜라겐 막, 젤라틴 층으로 완전히 덮여있는 콜라겐을 포함하는 지지체, 동결건조 상태의 혼합물에 관한 동일 출원인의 선행발명이다. 여기서, 젤라틴 층의 주요 목적은 점착성이 없는 막에 끈적끈적한 효과를 주기 위해서이며, 젤라틴은 세포를 넣어주면 37℃에서 빠르게 분해한다.In addition, EP 0 686 402 discloses the same applicant's prior invention with respect to an anti-stick post-operation collagen membrane comprising two layers, a support comprising collagen completely covered with a gelatin layer, and a mixture in a lyophilized state. Here, the main purpose of the gelatin layer is to give a sticky effect on the non-sticky membrane, gelatin decomposes rapidly at 37 ℃ when the cells are added.

L'OREAL의 EP 0 789 074 문헌은 랑게르한스세포를 포함하는 피부대체물에 관한 것이다.EP 0 789 074 to L'OREAL relates to a skin substitute comprising Langerhans cells.

본 출원에서, 3페이지 4번째 단에 있는 지지체는 종래의 일반적인 지지체이다. 지지체는 콜라겐/섬유아세포 혼합물의 격자배열, 탈피 전 진피, 인공막, 콜라겐을 포함하는 피하 대체품, 세포 생존능을 갖게 하는 플라스틱 혹은 다른 지지체에 의해 형성될 수 있다(4번째 단 3 내지 12줄).In the present application, the support in the third page, fourth stage is a conventional general support. The support may be formed by lattice arrangement of the collagen / fibroblast mixture, predermal dermis, artificial membranes, subcutaneous replacements including collagen, plastic or other support to give cell viability (4th only 3-12 lines).

상기 문헌은 피부를 층분리하여 얻은 진피에 종래의 방법에 따라 미리 분리한 인간유래의 각질화세포의 혼합물로 덮고 또한 종래의 방법에 따라 미리 분리한 인간유래의 멜라닌세포와 혼합하여 공존배양한다는 점에서 본 발명과는 다르다. 상기 문헌은 본 발명의 골격 내에 포함되어 있고 인간유래의 생체세포를 파종할 수 있으며, 결정적으로 탈피된 진피와는 명백히 다른 아래쪽 다공질 층과 결합되어 있는 조밀층을 예상하고 있지는 않는다.Said document covers the dermis obtained by layering the skin with a mixture of human-derived keratinocytes previously separated according to a conventional method and co-cultured by mixing with human-derived melanocytes previously separated according to a conventional method. It is different from the present invention. This document does not envisage a dense layer contained within the framework of the present invention and capable of seeding human-derived biological cells and which is associated with the lower porous layer, which is distinctly different from the critically shed dermis.

최근에, WO 91/16010 문헌에서는 섬유아세포가 주입된 상업용으로 판매되는 소의 콜라겐 스펀지 막으로 구성된 생체 피부조성물의 대체물을 기재하고 있다(8페이지, 3번째 및 4번째 단락).Recently, WO 91/16010 describes a replacement of a bioskin composition composed of a commercially available bovine collagen sponge membrane injected with fibroblasts (page 8, paragraphs 3 and 4).

배양 후, 스펀지를 뒤집고 일반적으로 소의 콜라겐에 있는 펩신을 처리하여 위쪽 면을 비공질 콜라겐으로 층분리하였다(8페이지 마지막 단락). 펩신을 처리하는 목적은 텔로펩타이드를 제거하기 위함이다(9페이지, 1번째 단락 4줄). 콜라겐 용액의 pH는 중성 pH로 조정하여 콜라겐이 침전되도록 한다. 콜라겐은 스펀지 상에 얇은 피막을 형성하며 전체 조성물은 37℃에서 60분 동안 배양하였다(9페이지, 1번째 단락 마지막 구).After incubation, the sponge was inverted and the upper side was layered with non-porous collagen, usually treated with pepsin in bovine collagen (last paragraph on page 8). The purpose of the pepsin treatment is to remove telopeptides (page 9, first paragraph 4 lines). The pH of the collagen solution is adjusted to neutral pH to allow collagen to precipitate. Collagen forms a thin film on the sponge and the entire composition is incubated at 37 ° C. for 60 minutes (page 9, last phrase of first paragraph).

그 후, 배양된 각질화세포를 층분리된 층에 주입하고 이를 pH 7.2, 35℃에서 10일 동안 배양하였다. Thereafter, the cultured keratinocytes were injected into the separated layers and cultured for 10 days at pH 7.2, 35 ° C.

이후의 설명에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 골격 내에는, 이중 층 구조가 먼저 형성되고 결정적으로 조밀층으로 덮여있는 콜라겐 스펀지가 제조되며 상기 조밀층은 다음의 설명에서와 같이 예상치 않은 기술적 효과를 제공한다.As can be seen in the following description, within the framework of the present invention, a collagen sponge in which a double layer structure is first formed and which is decisively covered with a dense layer is produced and the dense layer provides an unexpected technical effect as in the following description. do.

살아있는 인공조직을 생산하기 위한 지지체의 생산에 있어서 다음과 같은 극복해야 할 주요한 난점들이 있다: 적당한 기계적인 힘, 37℃ 정도의 온도에 대한 낮은 민감도, 세포 발달 및 대사에 적합한 생물학적인 특징들, 효소적 분해에 대한 낮은 민감도 및, 어떤 응용 특히 재건피부를 위해, 바람직하게는 한 층은 가능한 한 조밀하고 다른 층은 다공질의 이중 층 구조의 필요성.There are major challenges to overcome in the production of scaffolds to produce living tissue: moderate mechanical forces, low sensitivity to temperatures as high as 37 ° C, biological features suitable for cell development and metabolism, enzymes Low sensitivity to degradation and for some applications, especially for reconstructed skin, preferably one layer is as dense as possible and the other layer is a porous double layer structure.

지금까지 연구자들은 상기에서 기록한 모든 제약을 만족스럽게 채울 수 있는 콜라겐 지지체들을 제공하지 못했다.To date, researchers have not been able to provide collagen supports that can satisfactorily fill all the constraints noted above.

도 1은 조직학적 염색 후, 실시예 6의 조건 하에서 공기 중에서 콜라겐 젤을 건조하여 제조한 콜라겐 피막으로 구성된 조밀한 위쪽 콜라겐 막이 상부 쪽을 덮고있고 아래쪽은 소의 콜라겐으로 된 다공질 층으로 되어 있는 본 발명에 따른 조성물의 단면도를 나타낸 것이다.1 is a dense upper collagen membrane composed of a collagen membrane prepared by drying a collagen gel in air under the condition of Example 6 after histological staining, covering the upper side, and the lower side of the present invention having a porous layer of bovine collagen. It shows a cross-sectional view of the composition according to.

도 2는 덮개가 없는 것을 제외하고는 실시예 1의 조건 하에서 같은 소의 콜라겐 젤로 제조된 단순한 다공질 기질에서 얻은 유사한 단면을 보여주는 것으로, 표면으로 한정하지 않고 각질화세포가 깊숙이 포함되어 있음을 보여준다.Figure 2 shows a similar cross section obtained from a simple porous substrate made of the same bovine collagen gel under the conditions of Example 1, except that there is no cover, and shows that keratinocytes are deeply contained, not limited to the surface.

도 3은 기증자의 나이에 대한 영향을 보여주고자 25 내지 35세 기증자의 세포로부터 얻은 어린 재건피부와 55세 이상의 기증자의 세포에서 얻은 성숙하거나 늙은 재건피부 각각에 대한 재건피부용 배양배지의 라미닌 함량을 막대그래프로 나타낸 것이다. 세로축의 라미닌 생성량은 대조군에 대한 비율로 나타냈다(YRS=어린 재건피부, young reconstructed skin).Figure 3 shows the laminin content of culture medium for reconstructed skin for each young reconstructed skin obtained from cells of donors 25 to 35 years old and mature or old reconstructed skin obtained from cells of donors 55 years of age or older to show the effect on the age of donors. It is represented by a bar graph. Laminin production in the vertical axis was expressed as a ratio with respect to the control group (YRS = young reconstructed skin).

도 4는 상표명 BASALINE?(프랑스 꼴레띠까사 제품)을 사용하여 발효 엿기름 추출물의 성숙 재건피부에서의 라미닌 생성에 대한 유도 효과를 나타낸 것이다. 라미닌 생성량은 대조군에 대한 비율로 나타내었다.4 is the trade name BASALINE ? (French Corticaca) was used to show the effect of fermented malt extract on laminin production in mature reconstructed skin. Laminin production was expressed as a ratio with respect to the control.

도 5는 같은 발효 엿기름 추출물 혹은 BASALINE?의 보상효과를 나타낸 것이다. 세로축의 라미닌의 함량은 대조군에 대한 비율로써 나타내었다.5 is the same fermented malt extract or BASALINE ? It shows the reward effect. The laminin content in the vertical axis is expressed as a ratio with respect to the control.

도 6은 진피등가물에서 정상인간유래의 섬유아세포의 증식을 나타낸 것이다. 가로축은 시간(일)으로 나타내며, 세로축은 최적밀도 X 1000로 나타내며 100단위로 증가한다. 마름모형을 포함하는 곡선은 지지체로써 수산물 유래의 콜라겐 다공질 기질, 여기서는 어류을 사용하여 얻은 결과를 나타낸 것이며, 네모형을 포함하는 곡선은 소의 콜라겐에서 얻었다.Figure 6 shows the proliferation of fibroblasts derived from normal humans in dermal equivalents. The horizontal axis represents time (days) and the vertical axis represents optimal density X 1000 and increases by 100 units. The curve containing the rhombus shows the results obtained using a collagen porous substrate derived from aquatic products, here fish, as the support, and the curve containing the square was obtained from bovine collagen.

도 7은 진피등가물에서 섬유아세포의 증식과 유사한 곡선을 나타낸 것이다. 가로축은 시간(일)으로 나타내며, 세로축의 형광강도는 국제단위로 나타내며 15,000 단위에서 시작하여 10,000 단위로 증가한다. 마름모형을 포함한 곡선은 시험예 1에서 얻은 형광도를, 네모형을 포함한 곡선은 시험예 2에서 얻은 형광도를, 빈 삼각형을 포함한 곡선은 시험예 3에서, 십자형을 포함한 곡선은 시험예 4에서 얻은 형광도를 나타낸 것이다.Figure 7 shows a curve similar to the proliferation of fibroblasts in the dermis equivalent. The horizontal axis represents time (days), and the fluorescence intensity on the vertical axis is expressed in international units and starts at 15,000 units and increases to 10,000 units. The curve containing the rhombus is the fluorescence obtained in Test Example 1, the curve containing the square is the fluorescence obtained in Test Example 2, the curve containing the empty triangle is in Test Example 3, and the curve containing the cross is The obtained fluorescence is shown.

본 발명의 목적은 기술적 산업적 견지에서 보류되어 왔던 상기와 같은 문제들을 해결코자 한다.An object of the present invention is to solve the above problems that have been withheld from a technical and industrial standpoint.

본 발명은 이들 기술적 문제들 특히 산업적으로 응용할 수 있는 특히 화장품, 피부약학 및 약학산업상 적용할 수 있는 간단하고 저 비용의 방식으로 해결하는 효과가 있다.The present invention has the effect of solving these technical problems in a simple and low cost way, particularly in the industrial application, in particular in the cosmetic, dermatological and pharmaceutical industries.

일 특징에 따르면, 본 발명은 적어도 한쪽 면은 반드시 콜라겐 젤을 건조하여, 바람직하게는 공기 중이나 가스성 유체에서 건조하여 제조한 콜라겐 피막이나 혹은 고압축 콜라겐 스펀지 중 어느 하나로 구성된 조밀 콜라겐 막으로 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 콜라겐 지지체를 형성하는 신규한 조성물을 제공한다.According to one aspect of the invention, at least one side of the collagen gel is preferably at least one surface covered with a dense collagen membrane composed of either a collagen film prepared by drying the collagen gel, preferably in air or a gaseous fluid, or a high-pressure collagen sponge. A novel composition for forming a collagen support comprising one porous collagen layer is provided.

본 발명 조성물의 다른 유리한 특징에 따르면, 콜라겐 스펀지는 적어도 약 50 바(약 50.105 파스칼(Pa)에 해당함), 바람직하게는 50 바(50.105 Pa) ~ 200 바(200.105 Pa) 의 압력 하에서 압축되며, 선택적으로 상기 압축은 20 ~ 80℃에서, 바람직하게는 40 ~ 60℃에서 실시한다.According to another advantageous feature the composition of the present invention, the collagen sponge has a pressure of at least about 50 bar (corresponding to about 50.10 5 Pascal (Pa)), preferably 50 bars (50.10 5 Pa) ~ 200 bars (200.10 5 Pa) Compression, optionally the compression is carried out at 20 to 80 ° C, preferably at 40 to 60 ° C.

본 발명 조성물의 유리한 특징에 따르면, 콜라겐 생성물은 콜라겐 및 다당류가 결합된 콜라겐 혼합물, 특히 글리코스아미노글리칸, 키토산 혹은 그것의 유도체, 셀룰로오스 혹은 그것의 유도체, 덱스트란 혹은 그것의 유도체, 알기네이트 혹은 그것의 유도체 혹은 카라지넌으로부터 선택된다.According to an advantageous feature of the composition of the invention, the collagen product is a collagen mixture in which collagen and polysaccharide are bound, in particular glycosaminoglycans, chitosan or derivatives thereof, cellulose or derivatives thereof, dextran or derivatives thereof, alginate or Its derivatives or carrageenans.

본 발명 조성물의 다른 유리한 특징에 따르면, 후자의 두 층 즉, 다공질 층과 조밀막 중 적어도 하나는 특히 청년 혹은 장년 피험자 유래의 정상 생체세포 및 유전적으로 변형되거나 악성의 생체세포를 포함한다.According to another advantageous feature of the composition of the invention, at least one of the latter two layers, the porous layer and the dense membrane, comprises in particular normal living cells from young or elderly subjects and genetically modified or malignant living cells.

유리한 변형 실시예에서, 생체세포는 섬유아세포, 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 혈액유래의 내피세포, 혈액세포, 특히 대식세포 혹은 림프구, 지방세포, 피지선세포, 연골세포, 골세포, 조골세포 및 혈액유래의 상피성촉각세포로부터 선택되며, 상기 세포는 정상세포 및 유전적으로 변형되거나 혹은 악성 세포이다.In an advantageous variant embodiment, the living cells are fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, blood-derived Langerhans cells, blood-derived endothelial cells, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, adipocytes, sebaceous gland cells, chondrocytes, bone cells , Osteoblasts and blood-derived epithelial tactile cells, which are normal cells and genetically modified or malignant cells.

다른 유리한 특징에 따르면, 조성물은 다공질 층에 정상 섬유아세포 및 유전적으로 변형된 혹은 악성 섬유아세포를 포함하며, 조밀막의 표면에는 정상생체세포 및 유전적으로 변형되거나 혹은 악성의 생체세포를 포함하며, 상기 세포들은 특히 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 피지선세포, 혈액유래의 세포 및 신경세포로부터 선택된다.According to another advantageous feature, the composition comprises normal fibroblasts and genetically modified or malignant fibroblasts in the porous layer, wherein the surface of the dense membrane comprises normal and genetically modified or malignant living cells, the cells They are especially selected from keratinocytes, melanocytes, blood-derived epithelial tactile cells, blood-derived Langerhans cells, sebaceous gland cells, blood-derived cells and neurons.

본 발명의 다른 유리한 구체예에서, 바람직하게는 전적으로 청년에서 얻은 세포를 이용한 "어린" 재건피부나 전적으로 장년에서 얻은 세포로부터 얻은 "성숙한" 재건피부 중 어느 하나를 제조하는 것이다. 이들 모델들은 피부노화과정을 잘 알 수 있게 하며 이 과정 중 활성제의 영향을 연구할 수 있는 효과가 있다.In another advantageous embodiment of the present invention, it is preferred to prepare either "young" rebuilt skin using cells obtained entirely from adolescents, or "mature" rebuilt skin obtained entirely from mature cells. These models provide a good understanding of the skin aging process and can be used to study the effects of active agents during this process.

본 발명의 다른 유리한 구체예에서, 조밀막은 다공질 층과 결합되기 전에 제조되며 바람직하게는 콜라겐 스펀지를 포함하며, 특히 상기 조성물을 얻기 위해 전체 조성물을 동결건조하기 전에 콜라겐 젤에 상기 제조된 막을 침적함으로써 제조된다.In another advantageous embodiment of the invention, the dense membrane is prepared prior to bonding with the porous layer and preferably comprises a collagen sponge, in particular by immersing the prepared membrane in collagen gel before lyophilizing the entire composition to obtain the composition. Are manufactured.

본 발명에 따른 조성물의 다른 구체예에서, 상기 조성물의 콜라겐 스펀지 및/또는 콜라겐 피막 및/또는 콜라겐 막은 포유동물 특히 소의 콜라겐을 포함한다.In another embodiment of the composition according to the invention, the collagen sponge and / or collagen coating and / or collagen membrane of the composition comprise mammalian, in particular bovine collagen.

본 발명에 따른 조성물의 다른 구체예에서, 콜라겐 스펀지 및/또는 콜라겐 피막 및/또는 콜라겐 막은 해양생물, 바람직하게는 경골어류의 피부, 보다 바람직하게는 무색소 피부 부분을 갖는 어류, 가장 바람직하게는 가자미 류, 예를 들어 서대, 문치가자미, 터봇, 브릴과 같은 산업상으로 이용되는 어류, 쉽게 분리될 수 있는 복부의 무색소 피부에서 유래한 콜라겐을 포함한다. 본 발명에 따라 이용할 수 있는 콜라겐 추출원으로써 바람직한 어류의 피부는 서대의 피부이다. 어류의 피부로부터 유래한 콜라겐의 제조는 특히 당업자라 할 수 있는 출원인의 EP 0 592 586 =US-A-5,420,248의 선행자료에 기재되어 있다. 특히, 해양생물, 바람직하게는 경골어류의 콜라겐으로부터 얻은 그러한 콜라겐 스펀지 및/또는 콜라겐 피막 및/또는 콜라겐 막은 인공피부의 제조에 사용되는 인간유래의 생체세포에 생체적합할 수 있으며 이들 인간유래의 생체세포는 살아있을 수 있을 뿐만 아니라 증식할 수도 있다.In another embodiment of the composition according to the invention, the collagen sponge and / or the collagen coating and / or the collagen membrane are marine fish, preferably fish with a skin portion of a tibia fish, more preferably a fish with a pigmentless skin portion, most preferably flounder And industrially used fish, such as seodae, flounder, turbot, and brill, and collagen derived from colorless skin of the abdomen, which can be easily separated. Preferred skin of fish as a collagen extraction source that can be used according to the present invention is skin of the scallop. The preparation of collagen derived from the skin of fish is described in the prior art of EP 0 592 586 = US-A-5,420,248, in particular to those skilled in the art. In particular, such collagen sponges and / or collagen coatings and / or collagen membranes obtained from collagen of marine organisms, preferably tibial fish, may be biocompatible with human-derived living cells used in the manufacture of artificial skin, and these human-derived organisms. The cells can not only live but also proliferate.

본 발명의 다른 유리한 구체예에 따르면, 향후 제조공정에서 기재될 것인 바, 포유동물의 콜라겐, 특히 소, 혹은 바람직하게는 해양생물 특히 경골어류 피부의 콜라겐은 화학적으로 혹은 물리적으로 가교결합될 수 있다. 특히, 그러한 가교결합은 향후 인공피부의 제조공정에서 사용되는 인간세포에 생체적합한 생체재료의 제조에서 사용될 수 있다.According to another advantageous embodiment of the invention, as will be described later in the manufacturing process, the collagen of mammals, in particular bovine, or preferably the collagen of the skin of marine life, especially tibia fish, may be chemically or physically crosslinked. have. In particular, such crosslinking may be used in the manufacture of biomaterials that are biocompatible with human cells for use in the manufacturing process of artificial skin in the future.

본 발명에서 "생체적합한"은 생체재료가 인간유래의 생체세포에 대해 독성이 없으며 또한 생장이나 증식할 수 있도록 함을 의미한다. 일반적으로, 가교결합은 생체적합하지 않은 물질을 제조하는 데 효과가 있으므로 생체세포에 대해 독성을 띠어 세포가 생장할 수 없다.In the present invention, "biocompatible" means that the biomaterial is not toxic to human-derived living cells and can also grow or proliferate. In general, cross-linking is toxic to living cells because cross-linking is effective in producing non-biocompatible materials, and cells cannot grow.

본 발명에 따른 조성물의 다른 유리한 구체예에서, 상기 조성물의 두개 층 중 적어도 하나는 가용성 콜라겐과 불용성 콜라겐의 혼합물, 예를 들어 섬유 형태를 포함하는 콜라겐 젤로부터 생산된다.In another advantageous embodiment of the composition according to the invention, at least one of the two layers of the composition is produced from a collagen gel comprising a mixture of soluble collagen and insoluble collagen, for example in the form of fibers.

본 발명에 따른 조성물의 경우에, 콜라겐은 콜라겐 타입 I 및/또는 타입 III일 수 있다.In the case of the composition according to the invention, the collagen may be collagen type I and / or type III.

두 번째 특징에 따르면, 본 발명은 또한 적어도 한쪽 면이 조밀 콜라겐 막으로 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 조성물의 제조공정을 포함한다. 단:According to a second aspect, the invention also includes a process for the preparation of a composition comprising at least one porous collagen layer on at least one side covered with a dense collagen membrane. only:

a) 우선 1차 콜라겐 젤을 건조하거나, 바람직하게는 공기 중에서 혹은 가스성 유체에 의해 건조하거나, 혹은 콜라겐 젤의 동결-건조를 통해 얻은 콜라겐 스펀지를 압축하여 조밀 콜라겐 막을 제조하고;a) preparing a dense collagen membrane by first drying the primary collagen gel, preferably in air or by gaseous fluid, or by compressing the collagen sponge obtained through freeze-drying of the collagen gel;

b) 2차 콜라겐 젤을 따로 제조하고;b) preparing a second collagen gel separately;

c) 조밀막을 2차 콜라겐 젤에 침적시키거나, 혹은 2차 콜라겐 젤을 조밀막에 붓고; 및 마지막으로c) dipping the dense membrane onto the secondary collagen gel, or pouring the secondary collagen gel onto the dense membrane; And finally

d) 전체를 동결건조하여 상기 조성물을 얻음.d) lyophilization of the whole to obtain the composition.

상기 공정의 유리한 다른 방법에서, 조밀막을 제조하기 위해 사용하는 콜라겐 스펀지는 적어도 50 바(약 50.105 Pa), 바람직하게는 50 바(50.105 Pa) ~ 200 바(200.105 Pa)의 압력 하에서 압축된다.Collagen sponge in a decent other methods of the process, used to make a film density of at least 50 bar (about 50.10 5 Pa), preferably 50 bars (50.10 5 Pa) ~ 200 bar compression at a pressure of (200.10 5 Pa) do.

유리하게는 압축 단계는 20 ~ 80℃, 바람직하게는 40 ~ 60℃의 온도 하에서 실시한다.Advantageously the compression step is carried out at a temperature of 20 to 80 ° C, preferably 40 to 60 ° C.

상기 공정의 다른 유리한 구체예에서, 콜라겐 스펀지 및/또는 콜라겐 피막 및/또는 콜라겐 막은 콜라겐이나 혹은 다당류가 결합된 콜라겐 혼합물, 특히 글리코스아미노글리칸, 키토산 혹은 그것의 유도체, 셀룰로오스 및 그것의 유도체, 덱스트란 혹은 그것의 유도체, 알기네이트 혹은 그것의 유도체 혹은 카라지넌 중 어느 하나를 사용하여 제조된다.In another advantageous embodiment of the process, the collagen sponge and / or collagen coating and / or collagen membrane is a collagen or polysaccharide-linked collagen mixture, in particular glycosaminoglycans, chitosan or derivatives thereof, cellulose and derivatives thereof, Prepared using dextran or derivatives thereof, alginates or derivatives thereof or carrageenan.

공정의 변형 실시예에서, 두 층 중 적어도 어느 하나 혹은 두 층 모두 가교결합된다.In a variant embodiment of the process, at least either or both of the two layers are crosslinked.

한 유리한 변형 실시예에서, 상기 가교결합은 물리적 가교결합, 특히 진공 하에서 열 건조(TDH) 혹은 화학적 가교결합, 특히 디페닐포스포릴아자이드(DPPA), 글루타알데히드와 같은 알데히드, 석신이미드와 같은 카보디이미드와의 가교결합이다.In one advantageous variant, the crosslinking is combined with physical crosslinking, in particular thermal drying (TDH) or chemical crosslinking under vacuum, in particular with aldehydes such as diphenylphosphoryl azide (DPPA), glutaaldehyde, succinimide Crosslinking with the same carbodiimide.

상기 공정의 유리한 변형 실시예에서, 세포 발달을 위한 물질, 특히 생장인자 특히 사이토카인 혹은 케모카인이 제조동안 첨가된다.In an advantageous variant of the process, substances for cell development, in particular growth factors, in particular cytokines or chemokines, are added during manufacture.

본 발명에 따른 공정의 다른 유리한 구체예에서, 정상 생체세포 및 유전적으로 변형되거나 악성의 생체세포를 두 층 중 적어도 하나에 도입하는 단계를 포함한다.In another advantageous embodiment of the process according to the invention, the method comprises introducing normal living cells and genetically modified or malignant living cells into at least one of the two layers.

한 유리한 변형 실시예에서, 상기 생체세포는 섬유아세포, 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 혈액유래의 내피세포, 혈액세포, 특히 대식세포 혹은 림프구, 연골, 골세포 특히 조골세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 피지선세포, 지방세포 및 신경세포로 구성된 군으로부터 선택된다.In one advantageous variant embodiment, the living cells are fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, blood-derived Langerhans cells, blood-derived endothelial cells, blood cells, in particular macrophages or lymphocytes, cartilage, bone cells, especially osteoblasts, blood Epidermal tactile cells, sebaceous gland cells, adipocytes and neurons derived.

본 발명의 특히 유리한 구체예에서, 제조공정에는 섬유아세포를 다공질 층에 도입함이 포함된다.In a particularly advantageous embodiment of the invention, the manufacturing process includes introducing fibroblasts into the porous layer.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 제조공정에는 조밀막의 표면에 생체세포를 침적시키는 것이 포함되며, 상기 세포는 특히 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 피지선세포, 혈액유래의 세포 및 신경세포로부터 선택된다.In a more preferred embodiment of the present invention, the manufacturing process includes depositing living cells on the surface of the dense membrane, the cells are keratinocytes, melanocytes, blood-derived epithelial tactile cells, blood-derived Langerhans cells, sebaceous glands Cells, blood-derived cells, and neurons.

본 발명 공정의 변형 실시예에서, 생체세포는 순차배양이나 혹은 다른 타입 세포들의 공존배양 중 어느 하나로부터 제공되며, 이들 세포들은 배양이나 생검에서 유래한다.In a variant embodiment of the process of the invention, the living cells are provided from either sequential culture or co-culture of other type cells, which cells are from culture or biopsy.

세 번째 특징에 따르면, 본 발명은 또한 상기에서 기재하거나 혹은 상기 공정으로부터 얻거나 혹은 기능과 보편성에 있어서 종래기술과 비교하여 신규한 것으로 보이는 모든 특징, 잠재적 활성물질의 유효성에 대한 시험관 내 실험용 인공피부의 제조 혹은 생체내 손상된 피부의 재건과 관련하여 특히 실시예에 대한 다음의 설명에서 나오는 콜라겐 지지체를 형성하는 조성물의 용도를 포함한다.According to a third aspect, the present invention also provides in vitro experimental artificial skin for the effectiveness of any feature, potential active substance described above or obtained from the process or which appears novel in comparison to the prior art in function and universality. The use of a composition to form a collagen support, particularly in the following description of the examples, in connection with the preparation of or reconstruction of damaged skin in vivo.

한 유리한 특징에 따르면, 인공피부는 전적으로 유세포나 혹은 전적으로 성숙세포 중 어느 하나로부터 얻을 수 있으며, 특히 조직노화과정, 특히 피부노화과정을 연구하기 위해 그리고 선택적으로 상기 공정의 활성물질의 유효성을 시험하기 위해 사용될 수 있다.According to one advantageous feature, artificial skin can be obtained entirely from either flow cells or entirely mature cells, in particular to study the process of tissue aging, in particular skin aging and optionally to test the effectiveness of the active substances of the process. Can be used for

그리하여, 본 발명은 상기 기술적 문제점들에 대한 해결책을 제공하고 있다.Thus, the present invention provides a solution to the above technical problems.

가장 강력한 콜라겐 물질을 얻기 위해, 본 발명자는 1994년 7월 19일자로 등록된 미국특허 제 5 333 092호에서 기재된 보다 특별한 공정을 실시하였다. 상기 기술은 기계적 측면에서 매우 강력하고 효소적 분해에 대해 매우 내성이 큰 가용성 콜라겐 및 불용성 타입 I과 타입 III의 천연 콜라겐의 혼합물을 제공한다. 이러한 두 가지 특징들은 어떠한 가교결합 기술이나 혹은 콜라겐과 강하게 상호작용하는 물질을 첨가함으로써 선택적으로 개선될 수 있을 것이며 세포에 대해 독성을 나타내지 않는다. 게다가, 상기 콜라겐 생산 공정은 세균, 바이러스 혹은 프리온으로 인한 생물학적 오염의 위험을 사실상 제거하는 효과가 있다.To obtain the most potent collagen material, the inventors carried out the more specific process described in US Pat. No. 5,333,092, registered July 19, 1994. The technique provides a soluble collagen and a mixture of insoluble type I and type III natural collagen which is very strong in mechanical terms and very resistant to enzymatic degradation. These two features can be selectively improved by any crosslinking technique or by adding substances that interact strongly with collagen and are not toxic to cells. In addition, the collagen production process has the effect of virtually eliminating the risk of biological contamination from bacteria, viruses or prions.

재건피부용 지지체의 경우, 본 발명자는 우선 보다 조밀한 층을 생산하고 나서 다공질 스펀지를 생산함으로써 이중 층 물질을 제조하고자 하였다. 이러한 방법은 지금까지 기재된 것들 보다 훨씬 더 조밀한 표면층을 얻는 장점이 있다. 특히, 고 압축에 의해 조밀해진 스펀지나 피막이 다공질 기질에 고정될 수 있다.In the case of a reconstituted skin support, the inventors sought to produce a double layer material by first producing a denser layer and then a porous sponge. This method has the advantage of obtaining a much denser surface layer than those described so far. In particular, sponges or coatings densified by high compression can be fixed to the porous substrate.

인공조직에 적용하기 위해 상기 지지체를 사용할 경우 생체세포나 혹은 유전적으로 변형된 세포의 도입을 수반하며, 이는 세포가 콜라겐 지지체 내에서 혹은 그것의 표면에서 발달할 수 있게 한다.The use of the support for application to artificial tissues involves the introduction of living cells or genetically modified cells, which allow the cells to develop within or on the surface of the collagen support.

이러한 방식으로 얻은 재건된 생체조직은 다음과 같이 수많은 화장품, 피부약학 혹은 약학산업분야에서 사용될 수 있다:Rebuilt biological tissue obtained in this way can be used in numerous cosmetic, dermatological or pharmaceutical industries, such as:

ㆍ원료나 혹은 보다 복잡한 제제의 유효성 및 독성을 평가하기 위해 세포 대사에 대한 구성성분의 효과를 유도하기 위한 "시험관 내" 모델;• “in vitro” models for inducing the effect of components on cellular metabolism to assess the effectiveness and toxicity of raw materials or more complex agents;

ㆍ손상된 조직의 결핍을 극복할 수 있는 재건조직: 연골, 뼈, 건, 각막; 혹은• reconstructed tissues that can overcome the lack of damaged tissues: cartilage, bone, tendon, cornea; or

ㆍ특히 유전자 치료분야에서 생물체의 어떤 결핍을 극복할 수 있는 변형세포를 포함하는 생체 이식체.In vivo transplants comprising transformed cells capable of overcoming any deficiency of the organism, particularly in the field of gene therapy.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 본 발명의 다양한 실시예를 참조하여 다음의 상세한 설명에서 명백하게 드러날 것이며, 단순히 실례로써 제공되지만 본 발명의 범위로 한정하지는 않는다. 앞서 언급했듯이, 종래기술과 비교하여 신규한 것으로 보이는 실시예의 어떤 특징은 실시예의 내용과는 별도로 기능과 보편성의 측면에서 주장된다. 더욱이, 실시예 6 내지 13은 콜라겐 지지체를 형성하는 본 발명에 따른 조성물의 바람직한 구체예로 되어있다. 실시예 14는 잠재적 활성물질의 유효성에 대한 시험관 내 실험용 인공피부의 제조를 위해 혹은 손상된 피부의 재건을 위해 콜라겐 지지체로써 본 발명에 따른 조성물의 가치를 입증하는 비교실험을 언급하고 있다.Other objects, features and advantages of the present invention will become apparent in the following detailed description with reference to various embodiments of the present invention, which are merely provided as examples and are not intended to limit the scope of the present invention. As mentioned above, certain features of embodiments that appear to be novel in comparison with the prior art are claimed in terms of functionality and universality apart from the content of the embodiments. Moreover, Examples 6 to 13 are preferred embodiments of the compositions according to the invention to form collagen supports. Example 14 refers to comparative experiments demonstrating the value of a composition according to the invention as a collagen support for the preparation of in vitro experimental artificial skin on the effectiveness of potential active substances or for the reconstruction of damaged skin.

실시예 1: 미국특허 제 5 331 092호의 기술에 따른 천연 콜라겐으로 된 다공질 기질의 제조Example 1 Preparation of a Porous Substrate of Natural Collagen According to the Technique of U.S. Patent No. 5 331 092

A. 천연 콜라겐의 제조A. Preparation of Natural Collagen

2시간 동안 미리 씻어놓은 송아지 껍질로부터 젤을 제조하며, 250 mL의 물에 400g의 껍질(고형분 함량: 약 30%)을 넣고 석회/황화물의 혼합물(석회: 3.5%, 황화물: 2.5%)을 넣어 털을 뽑았다. 상기 배스를 4 rpm으로 회전시키면서 30분 간 놓아두었고, 총 탈모시간은 36시간이었다. 그 후, 염화암모늄(3%)과 소듐 메타비설파이트(0.5%)를 포함한 50 mL의 배스에 400 g의 껍질을 넣고 2시간 30분 동안 놓아두어 석회를 제거하였다. 상기 100g의 조직을 200 mL의 물로 15분씩 두 번 연속 세척하여 염을 제거하였다. 마쇄된 껍질을 pH7.8의 인산염 완충액(포타슘 디하이드로겐포스페이트 0.78g/L, 다이소듐 모노하이드로겐포스페이트 21.7 g/L)으로 마쇄물 1kg 당 5L의 완충액의 비율로 1시간 동안 교반하면서 세척하였다. 마쇄물 1kg 당 5L의 연수로 두 번 연속 세척하고 4,000 rpm(Rousselet 원심분리기)으로 원심분리하여 인산염을 제거하였다. 콜라겐에 대한 아세트산 함량이 5%가 되도록(즉, 최종 몰농도는 약 0.08 M이 됨) 10%의 아세트산을 마쇄물에 처리하여 산화시켰다. 그 후, 마쇄물을 1시간 동안 말라세이트(malaxate)하여 가루로 만들었다. 상기 가루를 초음파 처리 장치인 UTL T/-6에 계속적으로 통과시켜 젤을 얻었다. 상기 젤은 콜라겐 농도가 0.7 ~ 2%이며 산용해성 콜라겐의 비율은 불용성 콜라겐에 대해 10 ~ 20% 였다. Prepare gel from calf crust prewashed for 2 hours, add 400 g of shell (solid content: about 30%) to 250 mL of water and add a mixture of lime / sulfide (lime: 3.5%, sulfide: 2.5%) I pulled my hair. The bath was left for 30 minutes while rotating at 4 rpm and the total hair loss time was 36 hours. Thereafter, 400 g of shells were placed in a 50 mL bath containing ammonium chloride (3%) and sodium metabisulfite (0.5%), and the lime was removed for 2 hours and 30 minutes. The 100 g of tissue was washed twice successively with 200 mL of water for 15 minutes to remove salt. The ground shell was washed with phosphate buffer (potassium dihydrogen phosphate 0.78 g / L, disodium monohydrogen phosphate 21.7 g / L) at pH 7.8 with stirring at a rate of 5 L buffer per kg of ground material for 1 hour. . The phosphate was removed by two consecutive washes with 5 L of soft water per kg of grinding material and centrifugation at 4,000 rpm (Rousselet Centrifuge). 10% acetic acid was treated and oxidized to give 5% acetic acid content to collagen (ie, final molar concentration of about 0.08 M). The grounds were then malated for 1 hour to powder. The powder was continuously passed through a UTL T / -6 ultrasonic treatment device to obtain a gel. The gel had a collagen concentration of 0.7-2% and the ratio of soluble collagen was 10-20% with respect to insoluble collagen.

B. 상기 콜라겐 젤을 포함하는 다공질 기질의 제조B. Preparation of Porous Substrate Comprising the Collagen Gel

20 g/cm2의 콜라겐 젤(고형분 함량=0.75%)을 동결건조용 접시에 놓고 -30℃에서 냉각하고 32℃ 이상에서 가열하여 동결건조하였다. 총 동결건조 시간은 400 마이크로바의 압력 하에서 16시간 동안 실시하였다. 상기 동결건조물을 물리적 방법(열 건조)에 따라 가교결합하였고, 상기 동결건조물은 110℃에서, 400 마이크로바의 압력 하에서 오븐에 넣고 10시간 동안 놓아두었다.20 g / cm 2 of collagen gel (solid content = 0.75%) was placed in a lyophilized dish and cooled at -30 ° C and heated at 32 ° C or higher to lyophilize. Total lyophilization time was carried out for 16 hours under pressure of 400 microbar. The lyophilisate was crosslinked according to physical method (thermal drying), and the lyophilisate was placed in an oven at 110 ° C. under a pressure of 400 microbars and left for 10 hours.

실시예 2Example 2

1996년 7월 24일자로 등록된 유럽특허 제 466829호에 기재된 기술에 따라 디페닐포스포릴아자이드(DPPA)로 가교결합된 다공질 기질의 제조Preparation of a porous substrate crosslinked with diphenylphosphoryl azide (DPPA) according to the technique described in European Patent No. 466829, filed July 24, 1996

콜라겐 동결건조물을 100 mL의 디메틸포름아마이드(DMF)에 콜라겐 g 당 5 ~ 250㎕의 DPPA를 첨가한 용액에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 100 mL의 DMF로 콜라겐을 세척하여 DPPA를 제거하고 100 mL의 붕산염 완충액(0.04 M 소듐 테트라보레이트, 0.04 M 붕산, pH8.9) 으로 세척하여 DMF를 제거하였다.The collagen lyophilisate was added to 100 mL of dimethylformamide (DMF) in a solution containing 5 to 250 μl of DPPA per g of collagen and incubated for 24 hours. The collagen was then washed with 100 mL of DMF to remove DPPA and washed with 100 mL of borate buffer (0.04 M sodium tetraborate, 0.04 M boric acid, pH8.9) to remove DMF.

마지막으로, 콜라겐을 동일한 붕산염 완충액에서 밤새도록 배양하고 나서, 연수로 6시간 동안 계속 세척하여 붕산염 완충액을 제거하였다. Finally, the collagen was incubated overnight in the same borate buffer and then washed continuously with soft water for 6 hours to remove the borate buffer.

실시예 3Example 3

카보디이미드와 N-하이드록시-석신이미드로 가교결합된 다공질 기질의 제조 Preparation of Porous Substrate Crosslinked with Carbodiimide and N-hydroxy-succinimide

콜라겐 g 당 0.23 ~ 0.69 g의 EDC(에틸디메틸아미노프로필카보디이미드)와 콜라겐을, 그리고 콜라겐 g 당 0 ~ 0.42 g의 NHS(N-하이드록시석신이미드)와 콜라겐을 각각 가교결합 시켰다. 연수로 세척한 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다. 0.23 to 0.69 g of EDC (ethyldimethylaminopropylcarbodiimide) and collagen per g of collagen and 0 to 0.42 g of NHS (N-hydroxysuccinimide) and collagen per g of collagen were crosslinked, respectively. After washing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 4 Example 4

글루타알데히드로 가교결합된 다공질 기질의 제조Preparation of Glutaaldehyde Crosslinked Porous Substrate

콜라겐을 0.6 ~ 1%의 GTA를 포함하는 용액에서 20℃에서 24 ~ 96시간 동안 가교결합 시켰다. 연수로 세척한 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다. Collagen was cross-linked for 24 to 96 hours at 20 ℃ in a solution containing 0.6 ~ 1% GTA. After washing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 5Example 5

1991년 5월 29일자로 등록된 유럽 특허 제 296078호에 따른 실시예 1의 천연 콜라겐과 키토산 및 글리코스아미노글리칸을 결합시켜 제조한 다공질 기질Porous substrate prepared by combining the natural collagen of Example 1 according to European Patent No. 296078, registered on May 29, 1991, with chitosan and glycosaminoglycans

256 mL의 물과 1.9 mL의 아세트산에 2.5g의 키토산을 녹인 용액과 400 mL의 연수에 1g의 콘드로이친 4-설페이트를 녹인 용액을 600 g의 1.5% 콜라겐 젤에 첨가하였다. 약 pH4.0인 상기 혼합물을 교반하고 나서, 동결건조하였다. 이로부터 얻은 스펀지를 열 건조로 가교결합시켰다. A solution of 2.5 g chitosan dissolved in 256 mL of water and 1.9 mL of acetic acid and 1 g of chondroitin 4-sulfate in 400 mL of soft water was added to 600 g of 1.5% collagen gel. The mixture, about pH 4.0, was stirred and then lyophilized. The sponge obtained therefrom was crosslinked by thermal drying.

실시예 6Example 6

콜라겐 피막이 덮여있는 실시예 1의 다공질 기질Porous Substrate of Example 1 Covered with Collagen Coating

A. 피막 제조A. Film Manufacturing

0.3 ~ 0.8%의 고형분 함량을 포함하는 콜라겐 젤을 30℃ 오븐에서 혹은 접시 cm2 당 0.5 g의 젤의 비율로 후드에서 건조시켰다. 10 ~ 40%의 글리세롤을 콜라겐 젤에 첨가할 수 있다. 이들 조건 하에서 건조된 콜라겐은 투명한 피막을 형성한다.Collagen gels containing a solids content of 0.3-0.8% were dried in a hood at 30 ° C. in an oven or at a rate of 0.5 g of gel per cm 2 of dish. 10-40% glycerol can be added to the collagen gel. Collagen dried under these conditions forms a transparent coating.

B. 상기 다공질 기질과 피막의 결합B. Binding of the Porous Substrate to the Film

0.75%의 고형분 함량을 포함하는 실시예 1의 콜라겐 젤 0.5g/cm2를 동결건조용 접시에 놓고 콜라겐 피막을 상기 젤에 올려놓은 다음, 상기 혼합물을 동결건조하였다. 그로부터 얻은 동결건조물을 열 건조로 가교결합 시켰다.0.5 g / cm 2 of the collagen gel of Example 1, containing a solid content of 0.75%, was placed in a lyophilized dish and the collagen coating was placed on the gel, and the mixture was lyophilized. The lyophilisate obtained therefrom was crosslinked by thermal drying.

실시예 7Example 7

산용해성 콜라겐 젤로 제조되고 콜라겐 피막이 덮여있는 다공질 기질Porous substrate made of soluble collagen gel and covered with collagen coating

본 공정은 실시예 6에 따라 실시하나, 젤 원액을 피막에 붓는 것이 서로 다르며, 종래기술로 제조된 산용해성 콜라겐으로 구성된다. This process is carried out in accordance with Example 6, but pouring the gel stock solution into the coating is different from each other, it is composed of acid-soluble collagen prepared by the prior art.

실시예 8Example 8

아텔로콜라겐 젤로 제조되고 콜라겐 피막이 덮여있는 다공질 기질Porous substrate made of atelocollagen gel and covered with collagen coating

본 공정은 실시예 6에 따라 실시하나, 젤 원액을 피막에 붓는 것이 서로 다르며, 아텔로콜라겐 즉, 종래기술로 제조된 텔로펩타이드가 없는 콜라겐으로 구성된다. This process is carried out in accordance with Example 6, but the pouring of the gel stock solution into the coating is different from each other, and composed of atelocollagen, that is, collagen-free collagen produced in the prior art.

실시예 9Example 9

키토산과 글리코스아미노글리칸이 결합된 콜라겐으로 구성되며 콜라겐 피막이 덮여있는 다공질 기질Porous substrate consisting of collagen combined with chitosan and glycosaminoglycans and covered with a collagen coating

본 공정은 젤을 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸으로 구성된 콜라겐 피막에 붓는 점을 제외하고는 실시예 6에 따라 실시한다. 상기 젤의 제조는 실시예 5에 기재되어 있다. This process is carried out in accordance with Example 6 except that the gel is poured into the collagen coating consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycans. Preparation of the gel is described in Example 5.

실시예 10Example 10

콜라겐 피막이 덮여있는 상기의 모든 다공질 기질들은 실시예 2, 3 및 4에 기재되어 있는 기술에 따라 가교결합될 수 있다. All of the porous substrates covered with the collagen coating can be crosslinked according to the techniques described in Examples 2, 3 and 4.

실시예 11Example 11

실시예 1에 따른 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 콜라겐만으로 된 다공질 기질Collagen-only porous substrate covered with compressed collagen sponge according to Example 1

A. 압축 스펀지의 제조A. Preparation of Compression Sponge

0.3 ~ 1.5%의 고형분을 포함하는 실시예 1에서 제조된 콜라겐 젤을 동결건조하여 0.5 ~ 2 g/cm2 무게의 스펀지를 얻었다.The collagen gel prepared in Example 1 containing 0.3 to 1.5% solids was lyophilized to obtain a sponge weighing 0.5 to 2 g / cm 2 .

동결건조물을 20 ~ 60℃에서 50 ~ 200 바(50 내지 200.105 Pa)의 압력 하에서 5 ~ 60초간 압축하였다.The lyophilisate was compressed at 20-60 ° C. under pressure of 50-200 bar (50-200.10 5 Pa) for 5-60 seconds.

B. 압축된 스펀지와 다공질 기질의 결합B. Combination of Compressed Sponge and Porous Substrate

실시예 1에 기재된 콜라겐 젤을 0.5g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 놓고 압축된 스펀지를 상기 젤에 올려놓은 다음, 전체를 동결건조하여 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 다공질 콜라겐 스펀지를 얻었다.The collagen gel described in Example 1 was placed on a lyophilized dish at a rate of 0.5 g / cm 2 , the compressed sponge was placed on the gel, and the whole was lyophilized to obtain a porous collagen sponge covered with the compressed collagen sponge. .

실시예 12Example 12

실시예 5에 따른 압축된 스펀지가 덮여있는 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸으로 구성된 다공질 기질Porous substrate consisting of collagen, chitosan and glycosaminoglycans covered with a compressed sponge according to Example 5

실시예 5의 공정에 따라 제조된 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸 젤을 0.5 g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 올려놓고, 압축된 스펀지를 상기 젤에 올려놓은 다음, 전체를 동결건조하였다. 동결건조물을 실시예 1에 따라 열 건조로 가교결합시켰다.Collagen, chitosan and glycosaminoglycan gel prepared according to the process of Example 5 were placed on a lyophilized dish at a rate of 0.5 g / cm 2 , a compressed sponge was placed on the gel, and the whole was frozen. Dried. The lyophilisate was crosslinked by thermal drying according to Example 1.

실시예 13Example 13

압축된 콜라겐 스펀지로 덮여있는 상기의 다공질 기질들은 실시예 2, 3 및 4에 기재된 기술에 따라 가교결합될 수 있다. The porous substrates covered with the compressed collagen sponge can be crosslinked according to the techniques described in Examples 2, 3 and 4.

실시예 14Example 14

본 발명에 따른 조밀막이 덮여있는 다공질 콜라겐 층을 포함하는 조성물과 덮개 없이 다공질 콜라겐 층 만을 포함하는 조성물을 서로 비교하기 위해, 실시예 2에 기재된 DPPA와 가교결합된 다공질 기질 혹은 전체가 DPPA와 가교결합되어 있는 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 실시예 2의 DPPA와 가교결합된 다공질 기질 중 어느 하나로부터 재건피부를 제조하였다.In order to compare the composition comprising the porous collagen layer covered with the dense membrane according to the present invention and the composition comprising only the porous collagen layer without a cover, the porous substrate or whole crosslinked with DPPA described in Example 2 is crosslinked with DPPA. The reconstructed skin was prepared from either of the DPPA crosslinked porous substrate of Example 2 covered with a compressed collagen sponge.

재건피부의 제조Manufacture of rebuilt skin

a) 정상인간유래의 섬유아세포의 배양a) Culture of fibroblasts derived from normal humans

장년 혹은 청년 피험자에서 임의로 얻은 정상인간유래의 섬유아세포를 종래에 알려진 방법대로 6 내지 10회까지 계대배양하였다. 다공질 기질 1cm2 당 250,000 세포수의 비율로 접종하고, 상기 다공질 기질은 실시예 2의 DPPA가 가교결합되어 있는 다공질 기질만을 포함하는 조성물 혹은 전체가 실시예 13에 따른 DPPA가 가교결합되어 있는 압축된 콜라겐 스펀지로 덮여있는 실시예 2의 DPPA가 가교결합되어 있는 다공질 기질을 포함하는 본 발명의 조성물 중 어느 하나이다.Normal human-derived fibroblasts randomly obtained from elderly or young subjects were passaged up to 6 to 10 times according to a conventionally known method. Inoculated at a rate of 250,000 cells per cm 2 of porous substrate, wherein the porous substrate comprises only a porous substrate having DPPA crosslinked in Example 2 or a whole compressed with DPPA crosslinked according to Example 13. The composition of the present invention comprises a porous substrate crosslinked with DPPA of Example 2 covered with a collagen sponge.

배양배지는 10%의 우태반혈청, 100 IU/mL의 페니실린, 25 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B 및 50 ㎍/mL의 비타민 C가 50/50(v/v)으로 첨가된 DMEM/HAM F12로 구성되어 있다.The culture medium contained 50/50 (v / v) of 10% fetal placental serum, 100 IU / mL penicillin, 25 μg / mL gentamicin, 1 μg / mL amphotericin B and 50 μg / mL vitamin C. ) And DMEM / HAM F12 added.

3주 동안 배양하며, 일주일에 세 번 배지를 바꿔주었다. Incubate for 3 weeks and change the medium three times a week.

b) 정상인간유래의 각질화세포의 배양b) Culture of keratinocytes derived from normal humans

청년 혹은 장년 피험자로부터 임의로 얻은 정상인간유래의 각질화세포를 종래의 배양기술에 따라 1회 내지 3회 계대배양하였다. Normal human-derived keratinocytes, optionally obtained from young or elderly subjects, were passaged one to three times according to conventional culture techniques.

1 cm2의 표면적 당 250,000 세포수의 비율로 접종하며, 상기 표면은 실시예 2의 DPPA가 가교결합되어 있는 다공질 기질의 표면이거나 혹은 실시예 13에 따라 전체가 DPPA로 가교결합되어 있는 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 실시예 2의 DPPA가 가교결합되어 있는 다공질 기질을 포함하는 본 발명 조성물의 표면 중 어느 하나이다. 각질화세포의 경우, 반드시 조밀 콜라겐 막의 표면에 접종한다.Inoculated at a rate of 250,000 cells per 1 cm 2 surface area, the surface being the surface of a porous substrate crosslinked with DPPA of Example 2 or compressed collagen crosslinked with DPPA entirely according to Example 13 One of the surfaces of the composition of the present invention comprising a porous substrate crosslinked with a DPPA of Example 2 covered with a sponge. In keratinocytes, the surface of the dense collagen membrane must be inoculated.

섬유아세포와 각질화세포 둘 다를 접종한 이들 조성물은 다음의 성분이 첨가된 DMEM 배지로 구성된 Green의 배지에서 배양하였다:These compositions inoculated with both fibroblasts and keratinocytes were cultured in Green's medium consisting of DMEM medium with the following ingredients added:

30%의 HAM F1230% HAM F12

10%의 우태반 혈청10% fetal placental serum

100 IU/mL의 페니실린100 IU / mL penicillin

100 ㎍/mL의 스트렙토마이신100 μg / mL streptomycin

1 ㎍/mL의 암포테리신 B1 μg / mL of amphotericin B

2 μmol/mL의 L-글루타민2 μmol / mL L-glutamine

10 ng/mL의 EGF(표피생장인자)10 ng / mL EGF (epidermal growth factor)

0.12 IU/mL의 인슐린 제품(UMULINE?)0.12 IU / mL insulin product (UMULINE ? )

400 ng/mL의 하이드로코르티손400 ng / mL hydrocortisone

10-12 mol/mL의 콜레라 톡신10 -12 mol / mL cholera toxin

5 ㎍/mL의 트랜스페린 5 μg / mL transferrin

2.10-9 M의 트리오도티로닌2.10 -9 M triodothyronine

1.8.10-7 mol/mL의 아데닌1.8.10 -7 mol / mL adenine

50 ㎍/mL의 비타민 C.50 μg / mL of vitamin C.

상기 배양은 일주일 동안 실시하였으며 매일 배지를 바꿔주었다. The culture was carried out for a week and the medium was changed daily.

c) 본 발명의 조성물과 덮개가 없는 다공질 층 비교군의 배양c) Cultivation of the composition of the present invention and the coverless porous layer comparison group

b) 단계의 배양을 일주일 동안 실시하였고 매일 배지를 바꿔주었으며, 각질화세포를 포함하는 표면층이 기체와 액체의 접경에서 나타나도록 하고, 섬유아세포를 포함하는 층은 잠기게 하여 다음의 성분들로 구성된 출현배지에서 3주 동안 배양하였다:b) culture was carried out for a week and the medium was changed daily, the surface layer containing keratinocytes appeared at the border of the gas and liquid, and the layer containing fibroblasts was submerged so that the following components appeared Incubated for 3 weeks in the medium:

10%의 우태반 혈청10% fetal placental serum

100 IU/mL의 페니실린100 IU / mL penicillin

100 ㎍/mL의 스트렙토마이신100 μg / mL streptomycin

1 ㎍/mL의 암포테리신 B1 μg / mL of amphotericin B

2 μmol/mL의 L-글루타민2 μmol / mL L-glutamine

10 ng/mL의 EGF10 ng / mL EGF

0.12 IU/mL의 인슐린 제품(UMULINE?)0.12 IU / mL insulin product (UMULINE ? )

400 ng/mL의 하이드로코르티손400 ng / mL hydrocortisone

50 ㎍/mL의 비타민 C가 첨가된 EMEM. EMEM with 50 μg / mL of vitamin C added.

a)에서 c) 단계에 이르는 총 7주간의 배양동안 재건된 진피로 구성된 재건피부를 얻었으며, 섬유아세포는 3차원적 콜라겐 기질에 모이며, 상기 진피는 여러층의 표피로 덮여있다.Reconstructed skin consisting of the reconstructed dermis was obtained during a total of seven weeks of incubation from steps a) to c), fibroblasts gathered on three-dimensional collagen matrix, and the dermis is covered with multiple layers of epidermis.

진피와 표피의 경계면에는 기저막이 보이며 면역학적 표지법을 사용하여 라미닌-1, 라미닌-5, 콜라겐 타입 IV과 타입 VII의 유무를 확인할 수 있다.The basement membrane is visible at the interface between the dermis and the epidermis and immunological labeling can be used to determine the presence of laminin-1, laminin-5, collagen type IV and type VII.

그리하여, 3주 동안 진피등가물을 제조한 후, 본 발명에 따른 조성물을 얻기 위해 조밀막으로 다공질 기질을 덮음으로써 진피화 전에 콜라겐 기질의 표면에 보다 많은 양의 섬유아세포가 모이게 한다.Thus, after preparing dermal equivalents for 3 weeks, a larger amount of fibroblasts are collected on the surface of the collagen matrix before dermalization by covering the porous substrate with a dense membrane to obtain a composition according to the present invention.

다공질 기질의 경우 즉, 덮개가 없는 경우 만약 섬유아세포의 표면층이 완전히 접촉하지 않는다면, 각질화세포는 진피대체물의 아래로 침투할 수 있고 각질화세포 섬을 형성하여 총체적으로 비정상적인 특징들을 나타낸다.In the case of porous substrates, i.e. without the cover, if the surface layer of fibroblasts is not in full contact, keratinocytes can penetrate under the dermal substitute and form keratinocyte islets, resulting in totally abnormal characteristics.

따라서, 종래기술에서 사용할 수 있는 것들보다 조밀한 층을 사용하는 본 발명은 각질화세포의 침투에 대해 보다 안전한 것으로 보인다.Thus, the present invention, which uses a denser layer than those available in the prior art, appears to be safer against infiltration of keratinocytes.

명세서에서 DMEM은 Dulbecco Modified Eagle's Medium의 약자를 나타낸 것이다. In the specification, DMEM stands for Dulbecco Modified Eagle's Medium.

실시예 15: 라미닌 생성에 대한 활성물질의 유효성을 측정하기 위해 본 발명에 따른 조성물을 이용한 청년 기증자의 세포로부터 재건된 피부와 장년 기증자의 세포로부터 재건된 피부의 비교 연구Example 15 Comparative Study of Skin Reconstructed from Cells of Young Donors and Skin Reconstructed from Mature Donor Cells Using the Compositions According to the Present Invention to Determine the Effectiveness of Active Substances for Laminin Production

본 실시예는 DPPA가 가교결합되어 있는 다공질 콜라겐 층이나 혹은 실시예 13에 따라 전체가 DPPA와 가교결합되어 있는 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 실시예 2에 기재된 기질을 포함하는 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 실시예 14에 따라 배양하였다. 그 과정은 다음과 같다:This example comprises a composition according to the invention comprising a porous collagen layer crosslinked with DPPA or a substrate as described in Example 2 covered with a compressed collagen sponge which is entirely crosslinked with DPPA according to Example 13. And cultured according to Example 14. The process is as follows:

1) 재건피부의 제조1) Preparation of reconstructed skin

어린 재건피부는 청년 기증자에서, 즉 25세 내지 35세 기증자의 섬유아세포와 각질화세포를 제외하고는 실시예 14에 따라 제조하였다. 또한, 늙은 혹은 성숙한 재건피부는 55세 이상의 장년 기증자의 섬유아세포 혹은 각질화세포를 사용하여 얻었다.Young reconstructed skin was prepared according to Example 14 except for fibroblasts and keratinocytes from young donors, ie 25-35 year old donors. In addition, aged or mature reconstructed skin was obtained using fibroblasts or keratinocytes of elderly donors aged 55 and older.

a) 시료 및 방법a) samples and methods

실시예 14의 a) 단계에 기재된 바와 같이, 우선 어린 세포군이나 혹은 성숙하거나 늙은 세포군 중 어느 하나로부터 유래한 정상인간유래의 진피의 섬유아세포를 본 발명 조성물의 다공질 기질에 접종하고 실시예 14의 a) 단계의 조건 하에서 21일 동안 배양하였다.As described in step a) of Example 14, first, normal human-derived dermal fibroblasts derived from either a young cell population or a mature or old cell population were inoculated into the porous substrate of the composition of Example 14 and a Cultured for 21 days under the conditions of step).

b) 상기 배양 후, 어린 세포군이나 혹은 성숙세포군 중 어느 하나로부터 유래한 각질화세포로부터 각각 준비된 표피층을 본 발명 조성물의 치밀 콜라겐 막의 표면에 접종하고, 실시예 14의 b) 단계의 조건 하에서 14일 동안 배양하였다. b) after the incubation, epidermal layers prepared from keratinocytes derived from either a young cell group or a mature cell group are inoculated on the surface of the dense collagen membrane of the composition of the present invention, and for 14 days under the conditions of step b) of Example 14; Incubated.

2) 라미닌의 정량2) Determination of Laminin

섬유아세포-각질화세포 조성물을 14일 동안 배양한 후, 어린 혹은 성숙 재건피부의 배양배지에 포함된 라미닌을 ELISA 키트(일본, 타카라사 제품)를 사용하여 정량하였다. After culturing the fibroblast-keratinocyte composition for 14 days, laminin contained in the culture medium of young or mature reconstructed skin was quantified using an ELISA kit (manufactured by Takara Corporation, Japan).

도 3에 그 결과를 나타내었다. 3 shows the result.

도 3에 도시된 바와 같이, 성숙 재건피부는 100% 대조군인 어린 재건피부(YRS)에 비해 약 50%의 라미닌을 포함하고 있다.As shown in FIG. 3, mature reconstructed skin contains about 50% laminin compared to young reconstructed skin (YRS), which is a 100% control.

3) 꼴레띠까사에서 판매하는 발효 엿기름 추출물인 BASALINE?와 같은 활성물질의 어린 재건피부 및 성숙 재건피부의 라미닌 생성에 대한 유도효과의 측정3) Determination of the inducible effect of laminin production on young and reconstructed skin of active substances such as BASALINE®, a fermented malt extract sold by Colletti Casa

이와 같은 비교실험은 각질화세포를 14일 동안 배양하는 것을 제외하고는 상기에서 기재한 과정에 따라 실시하였다; 어린 재건피부 혹은 성숙 재건피부를 프랑스의 꼴레띠까사에서 판매하는 발효 엿기름 추출물인 BASALINE?을 0.5% 처리하거나 혹은 처리하지 않고(대조군) 14일 동안 배양하였다.This comparative experiment was carried out according to the procedure described above except for culturing keratinocytes for 14 days; BASALINE ®, a fermented malt extract sold by Colletti Casa in France, for young and mature skin . Were incubated for 14 days with or without 0.5% treatment (control).

상기 실시예에서 기재한 바와 같이, 배양 말에 배양 배지에 포함된 라미닌을 ELISA를 사용하여 정량하였다.As described in the above examples, laminin contained in the culture medium at the end of the culture was quantified using ELISA.

도 4에 그 결과를 나타내었다.4 shows the result.

성숙 재건피부(ARS)에서의 라미닌의 비율을 100% 대조군으로 하였다.The percentage of laminin in mature reconstructed skin (ARS) was the 100% control.

도 4에 도시된 바와 같이, 발효 엿기름에서 추출한 활성물질 혹은 BASALINE?은 성숙 재건피부에서 라미닌의 생성을 유도할 수 있었다. 같은 조건 하에서, 발효 엿기름에서 추출한 활성물질 혹은 BASALINE?은 도 5에 나타난 바와 같이 어린 재건피부에서의 라미닌 생성을 의의있게 바꾸지는 못하였다.As shown in Figure 4, the active material extracted from fermented malt or BASALINE ? Could induce the production of laminin in mature reconstructed skin. Under the same conditions, the active material extracted from fermented malt or BASALINE ? 5 did not significantly alter laminin production in young reconstructed skin.

따라서, 발효 엿기름에서 추출한 활성물질 혹은 BASALINE?은 성숙 재건피부에서의 라미닌 생성을 65%로 증가시켰다.Therefore, the active material extracted from fermented malt or BASALINE ? Increased laminin production to 65% in mature reconstructed skin.

마찬가지로, 이 활성물질은 어린 재건피부에서의 라미닌 생성의 조절과 관련된 생리과정에는 영향을 미치지 않았다.Likewise, this active substance did not affect the physiological processes associated with the regulation of laminin production in young reconstructed skin.

이들 실험들을 통해 상기 활성물질이 어린 재건피부와 성숙 재건피부에서 라미닌의 생성에서 나타난 상대적 차이를 줄일 수 있음을 입증함으로써 발효 엿기름 추출물 혹은 BASALINE?의 보상 효과의 정도를 평가할 수 있다.These experiments demonstrate that the active substance can reduce the relative differences in the production of laminin in young and mature reconstituted skin, thereby reducing fermented malt extract or BASALINE ? Evaluate the degree of reward effect.

도 5에 도시된 바와 같이, 어린 재건피부와 성숙 재건피부에서 라미닌 생성의 차이는 0.5%의 활성물질을 사용하였을 때 65%로 줄일 수 있었다. As shown in FIG. 5, the difference in laminin production in young reconstructed skin and mature reconstructed skin was reduced to 65% when 0.5% of the active substance was used.

실시예 16: 수산물의 천연 콜라겐으로 된 다공질 기질의 제조Example 16: Preparation of a Porous Substrate of Natural Collagen from Aquatic Products

1994년 7월 19일자로 등록된 미국특허 제 5331092의 기술에 따라 콜라겐을 얻었다.Collagen was obtained according to the technique of US Pat. No. 5331092, registered July 19, 1994.

A. 수산물의 천연 콜라겐의 제조A. Preparation of Natural Collagen of Seafood

서대의 복부껍질을 마쇄하고 상기 마쇄물 1kg 당 5L의 인산염 완충액(0.78g/L의 포타슘 디하이드로겐포스페이트, 21.7 g/L의 다이소듐 모토하이드로겐포스페이트, pH7.8)을 넣고 1시간 동안 교반하면서 세척하였다. 그 후, 연수로 두 번 연속 세척하여 인산염을 제거하고, 마쇄물 1kg 당 5L의 물을 넣고 4,000 rpm(Rousselet 원심분리기)에서 연속적으로 원심분리를 실시하였다. 상기 마쇄물 1kg 당 10L의 0.25 M 아세트산을 넣고 산성화시킨 후, 상기 젤을 4,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이로부터 얻은 상층액을 사용하여 0.5 ~ 2%의 콜라겐을 포함하는 콜라겐 젤을 제조하였다.Grind the abdominal shell of the seodae and add 5 L of phosphate buffer (0.78 g / L potassium dihydrogen phosphate, 21.7 g / L disodium motohydrogen phosphate, pH7.8) per 1 kg of the grinding. Washing while. Thereafter, the phosphate was removed by washing twice with soft water, and 5 L of water per 1 kg of grinding material was added thereto, followed by continuous centrifugation at 4,000 rpm (Rousselet centrifuge). After acidifying with 10 L of 0.25 M acetic acid per kg of the grinding material, the gel was centrifuged at 4,000 rpm for 5 minutes. The supernatant obtained therefrom was used to prepare a collagen gel containing 0.5-2% of collagen.

B. 상기 콜라겐 젤로부터 다공질 기질의 제조B. Preparation of Porous Substrate from the Collagen Gel

상기 젤을 20g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 붓고 -30℃에서 냉각시킨 다음 32℃ 이상에서 가열한 후 400 마이크로바의 압력 하에서 16시간 동안 동결건조시켰다. 그로부터 얻은 기질을 열 건조(thermal dehydration)하여 가교결합시켰다. 상기 열 건조 과정은 400 마이크로바의 진공 하에서 110℃에서 16시간 동안 가열하는 과정으로 구성된다.The gel was poured into a lyophilized dish at a rate of 20 g / cm 2 , cooled at −30 ° C., heated at 32 ° C. or higher, and lyophilized for 16 hours under a pressure of 400 microbars. The resulting substrate was crosslinked by thermal dehydration. The thermal drying process consists of heating at 110 ° C. for 16 hours under a vacuum of 400 microbars.

실시예 17: 1996년 7월 24일자 유럽특허 제 466 829호에 기재된 기술에 따라 디페닐포스포릴아자이드(DPPA)가 가교결합되어 있는 다공질 기질의 제조Example 17 Preparation of a Porous Substrate Crosslinked with Diphenylphosphoryl Azide (DPPA) According to the Technique Described in European Patent No. 466 829 of 24 July 1996

100 mL의 디메틸포름아마이드(DMF)에 콜라겐 g 당 5 ~ 250㎕의 DPPA을 넣은 용액에 실시예 1의 콜라겐 기질을 넣고 24시간 동안 배양한 다음, 상기 콜라겐을 100 mL의 DMF로 세척하여 DPPA를 제거하였다. 그 후, 100 mL의 붕산염 완충액(0.04 M 소듐 테트라보레이트, 0.04 M 붕산, pH8.9)으로 세척하여 DMF를 제거하였다. 마지막으로, 상기 콜라겐을 같은 붕산염 완충액에서 밤새도록 배양하고 연수로 6시간 동안 계속 세척하여 붕산염 완충액을 제거하였다. 100 mL of dimethylformamide (DMF) was added to the collagen substrate of Example 1 in a solution containing 5 to 250 μl of DPPA per gram of collagen and incubated for 24 hours, and then the collagen was washed with 100 mL of DMF to obtain DPPA. Removed. Thereafter, DMF was removed by washing with 100 mL of borate buffer (0.04 M sodium tetraborate, 0.04 M boric acid, pH8.9). Finally, the collagen was incubated overnight in the same borate buffer and washed continuously with soft water for 6 hours to remove the borate buffer.

실시예 18: 카보디이미드 및 N-하이드록시석신이미드가 가교결합되어 있는 다공질 기질의 제조Example 18 Preparation of a Porous Substrate Crosslinked with Carbodiimide and N-hydroxysuccinimide

실시예 1의 해양생물의 콜라겐 기질을 콜라겐 g 당 0.23 ~ 0.69 g의 EDC(에틸디메틸아미노프로필카보디이미드)에, 그리고 콜라겐 g 당 0.42 g의 NHS(N-하이드록시석신이미드)에 가교결합시켰다. 연수로 세척한 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다. Crosslink the collagen matrix of the marine organism of Example 1 to 0.23-0.69 g of EDC (ethyldimethylaminopropylcarbodiimide) per gram of collagen and 0.42 g of NHS (N-hydroxysuccinimide) per gram of collagen I was. After washing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 19: 글루타알데히드가 가교결합되어 있는 다공질 기질의 제조Example 19 Preparation of a Porous Substrate Crosslinked with Glutaaldehyde

실시예 1의 해양생물의 콜라겐의 다공질 기질을 0.6 ~ 1% GTA를 포함하는 용액에 놓고 20℃에서 96시간 동안 가교결합 시켰다. 연수로 세척한 후, 콜라겐을 다시 동결건조하였다. The porous substrate of collagen of marine organisms of Example 1 was placed in a solution containing 0.6-1% GTA and crosslinked at 20 ° C. for 96 hours. After washing with soft water, the collagen was lyophilized again.

실시예 20: 1991년 5월 29일자로 등록된 유럽특허 제 296078호에 따른 키토산 및 글리코스아미노글리칸과 실시예 16의 수산물 천연 콜라겐이 결합된 다공질 기질의 제조Example 20 Preparation of a Porous Substrate Combining Chitosan and Glycosaminoglycans According to European Patent No. 296078, Registered May 29, 1991, and the Natural Collagen of the Aquatic Product of Example 16

356 mL의 물과 1.9 mL의 아세트산에 2.5 g의 키토산을 녹인 용액과 400 mL의 연수에 1 g의 콘드로이친 4-설페이트를 녹인 용액을 600 g의 1.5% 콜라겐 젤에 첨가하였다. 약 pH 4.0인 상기 혼합물을 교반하고 동결건조한 다음, 상기로부터 얻은 스펀지를 열 건조하여 가교결합 시켰다. A solution of 2.5 g of chitosan in 356 mL of water and 1.9 mL of acetic acid and a solution of 1 g of chondroitin 4-sulfate in 400 mL of soft water were added to 600 g of 1.5% collagen gel. The mixture, about pH 4.0, was stirred and lyophilized, and the sponge obtained above was thermally dried to crosslink.

실시예 21: 콜라겐 피막이 덮여있는 실시예 16의 다공질 기질Example 21 Porous Substrate of Example 16 Covered with Collagen Coating

A. 피막의 제조A. Preparation of Film

0.3 ~ 0.8%의 고형분을 포함하는 콜라겐 젤을 30℃ 오븐에서 건조시키거나 혹은 접시 cm2 당 0.5 g의 젤의 비율로 후드에서 건조시켰다. 10 ~ 40%의 글리세롤을 상기 콜라겐 젤에 첨가할 수 있다. 이들 조건 하에서 건조된 콜라겐은 투명한 피막을 형성한다.Collagen gels containing 0.3-0.8% solids were either dried in a 30 ° C. oven or in a hood at a rate of 0.5 g of gel per cm 2 of dish. 10-40% glycerol may be added to the collagen gel. Collagen dried under these conditions forms a transparent coating.

B. 상기 다공질 기질과 피막의 결합B. Binding of the Porous Substrate to the Film

0.5 ~ 2%의 고형분을 포함하는 수산물의 천연 콜라겐을 0.5g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 놓고 상기 콜라겐 피막을 젤에 올려놓은 다음, 전체를 동결건조하였다. 그로부터 얻은 동결건조물을 열 건조하여 가교결합 시켰다.Natural collagen of aquatic products containing 0.5 to 2% solids was placed on a lyophilized dish at a rate of 0.5 g / cm 2 , and the collagen coating was placed on a gel, and then the whole was lyophilized. The lyophilisate obtained therefrom was thermally dried to crosslink.

실시예 22: 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 실시예 16의 콜라겐만으로 된 다공질 기질Example 22 Porous Substrate of Collagen Only Example 16 Covered with Compressed Collagen Sponge

A. 압축 스펀지의 제조A. Preparation of Compression Sponge

0.3 ~ 1.5%의 고형분을 포함하는 실시예 1에서 제조된 콜라겐 젤을 동결건조하여 0.5 ~ 2 g/cm2 무게의 스펀지를 얻었다. 동결건조물을 20 ~ 60℃, 50 ~ 200 바(20 ~ 200.105 Pa)의 압력 하에서 5 ~ 60 초간 압축하였다.The collagen gel prepared in Example 1 containing 0.3 to 1.5% solids was lyophilized to obtain a sponge weighing 0.5 to 2 g / cm 2 . The lyophilisate was compressed at 20-60 ° C., 50-200 bar (20-200.10 5 Pa) for 5-60 seconds.

B. 다공질 기질과 압축 스펀지의 결합B. Combination of Porous Substrate and Compression Sponge

실시예 1의 콜라겐 젤을 0.5 g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 놓고 압축 스펀지를 상기 젤에 올려놓은 다음, 전체를 동결건조하여 압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 다공질 콜라겐 스펀지를 얻었다. 이를 실시예 1에 따라 열 건조하여 가교결합 시켰다.The collagen gel of Example 1 was placed on a lyophilized dish at a rate of 0.5 g / cm 2 , a compressed sponge was placed on the gel, and the whole was lyophilized to obtain a porous collagen sponge covered with a compressed collagen sponge. This was cross-linked by heat drying according to Example 1.

실시예 23: 압축 스펀지가 덮여있고 실시예 20에 따른 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸으로 구성된 다공질 기질Example 23 A porous substrate covered with a compressed sponge and composed of collagen, chitosan and glycosaminoglycans according to example 20

실시예 20에 따라 제조된 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸 젤을 0.5g/cm2의 비율로 동결건조용 접시에 놓고 압축 스펀지를 상기 젤에 올려놓은 다음, 전체를 동결건조하였다. 그 후, 동결건조물을 실시예 16에 따라 열 건조하여 가교결합 시켰다.Collagen, chitosan and glycosaminoglycan gel prepared according to Example 20 were placed on a lyophilized dish at a rate of 0.5 g / cm 2 , and a compressed sponge was placed on the gel, and then the whole was lyophilized. Thereafter, the lyophilisate was thermally dried in accordance with Example 16 to crosslink.

실시예 24Example 24

압축된 콜라겐 스펀지가 덮여있는 상기의 모든 다공질 기질들은 실시예 17, 18 및 19에 기재된 기술에 의해 가교결합될 수 있다. All of the above porous substrates covered with the compressed collagen sponge can be crosslinked by the techniques described in Examples 17, 18 and 19.

실시예 25 ~ 27: 소와 수산물의 콜라겐 기질의 세포 대사에 대한 비교실험Examples 25-27: Comparative experiments on cell metabolism of collagen matrix of bovine and aquatic products

실시예 25: 섬유아세포의 세포 생존능 실험Example 25 Cell Viability of Fibroblasts

I. 진피등가물의 제조 I. Preparation of dermal equivalents

본 비교실험을 위해, 우선 실시예 17에 따라 DPPA가 가교결합되어 있는 수산물 유래의 다공질 기질을 제조하였다.For this comparative experiment, first, a porous substrate derived from aquatic products crosslinked with DPPA was prepared according to Example 17.

비교를 위해, 다공질 기질의 비교군, 즉 DPPA가 가교결합되어 있는 소의 기질은 실시예 17에 따라 소 유래의 콜라겐으로 제조하였다.For comparison, a comparative group of porous substrates, ie, substrates of cattle cross-linked with DPPA, was prepared from collagen derived from cattle according to Example 17.

7회 계대배양한 청년 기증자군에 얻은 정상인간유래의 섬유아세포를 수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질 각각에 증식과 단백질 합성 연구의 경우에는 250,000 cells/cm2의 비율로, 조직학적 연구를 위해서는 300,000 cells/cm2의 비율로 접종하였다.Normal human-derived fibroblasts from the young donor group, which were passaged seven times, were propagated to aquatic-derived and bovine-derived substrates at 250,000 cells / cm 2 for protein synthesis and histological studies. Inoculated at a rate of 300,000 cells / cm 2 .

이들 수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질을 10%의 우태반 혈청, 100 IU/mL의 페니실린, 25 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B, 50 ㎍/mL의 비타민 C가 50/50(v/v)의 비율로 DMEM/HAM F12에 첨가되어 있는 배지에서 한달 동안 배양하였고 배양배지는 일주일에 세 번 바꿔주었다.Substrates derived from these seafood and bovine-derived substrates contained 10% fetal placental serum, 100 IU / mL penicillin, 25 μg / mL gentamicin, 1 μg / mL amphotericin B, and 50 μg / mL vitamin C. Was incubated for one month in a medium added to DMEM / HAM F12 at a ratio of 50/50 (v / v) and the culture medium was changed three times a week.

II-분석II-analysis

1) MTT 반응을 통한 세포 생존능의 측정1) Measurement of cell viability through MTT reaction

1%의 MTT(3-(4-(디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드)를 배양배지에 첨가하고 37℃에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 전환물질(포마잔 블루)을 DMSO에서 용해시키고 550 nm에서 흡광도를 읽는다. 1% of MTT (3- (4- (dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) was added to the culture medium and incubated for 2.5 hours at 37 ° C. After incubation The conversion material (formazan blue) is dissolved in DMSO and the absorbance is read at 550 nm.

흡광도는 밝은 노란색의 테트라졸리움염, 즉 MTT를 푸른색의 포마잔 결정으로 전환시킬 수 있는 석시네이트 디하이드로게나아제의 활성에 비례한다. Absorbance is proportional to the activity of the bright yellow tetrazolium salt, succinate dehydrogenase, which can convert MTT into blue formazan crystals.

세포 생존능은 배양 시 1, 5, 7, 22, 30 일째에 측정하였다.Cell viability was measured at 1, 5, 7, 22, 30 days of culture.

평균값을 측정하기 위해 각 기질 당 6개의 시료를 준비하였다.Six samples were prepared for each substrate to determine the mean value.

일Work 수산물 유래의 기질Substrate derived from aquatic products 평균 표준편자Average standard deviation 소 유래의 기질Substrate derived from cattle 평균 표준편차Mean standard deviation 1One 487487 2424 403403 4040 55 604604 1919 393393 5959 77 520520 5656 398398 6464 2222 608608 3030 680680 4040

또한 상기 결과를 도 6의 곡선 그래프로 나타내었다.In addition, the results are shown in the curve graph of FIG.

마름모형 곡선은 수산물 유래의 기질로부터 얻은 결과이며 네모형 곡선은 소 유래의 기질에서 얻은 결과를 나타낸 것이다.The rhombus curve is the result obtained from the substrate derived from aquatic products and the square curve is the result obtained from the substrate derived from bovine.

도 6에 나타난 바와 같이, 놀랍게도 수산물 유래의 기질은 정상인간유래의 섬유아세포의 생존뿐만 아니라 이들 정상인간유래의 섬유아세포의 증식도 가능한 지지체인 한편, 심지어 같은 시간대에 처음 3주 동안은 배양된 지지체가 더 낫다.As shown in FIG. 6, surprisingly, the aquatic product-derived substrate is a support capable of not only the survival of fibroblasts derived from normal humans but also the proliferation of these fibroblasts derived from normal humans, while being cultured for the first three weeks at the same time. Is better

따라서, 상기 실험들로부터 수산 콜라겐이 특히 인공조직용 지지체의 생산에, 특히 시험관 내 적용에 그리고 심지어 생체내 생체세포 특히 바람직하게는 인간의 생체세포를 포함하는 생체재료의 형성에 적합하다 할 수 있겠다.Thus, it can be said from the above experiments that hydroxycollagen is particularly suitable for the production of scaffolds for artificial tissues, in particular for in vitro applications and even for the formation of biomaterials comprising in vivo living cells, particularly preferably human living cells. .

2) 단백질 합성의 측정2) Measurement of Protein Synthesis

우태반 혈청을 첨가하지 않은 배양배지에서 3일 이상 분비되어 있는 단백질의 합성은 진피등가물의 제조시 상기에서 기재한 조건 하에서 배양 한 달 후에 얻을 때 진피등가물의 성숙분열 한 달 후에 Pierce의 microBCA를 사용하여 분석하였다.Synthesis of proteins secreted for 3 days or more in culture medium without fetal placenta serum was obtained after one month of culture under the conditions described above in the preparation of dermal equivalents, using Pierce microBCA after one month of maturation of dermal equivalents. The analysis was carried out.

세포 밀도는 상기에서 기재한 조건 하에서 MTT 시험을 통해 평가하였다. Cell density was assessed via MTT test under the conditions described above.

세포 밀도 단위 당 단백질 함량에 해당하는 비교 단백질의 함량은 흡광도, 즉 OD로 표시하였으며, 예상 세포 농도는 유사하였다. 표 2에 그 결과를 나타내었다.The content of the comparative protein corresponding to the protein content per unit cell density was expressed as absorbance, OD, and the expected cell concentration was similar. Table 2 shows the results.

지지체의 콜라겐Collagen of Support 수산물 유래의 기질Substrate derived from aquatic products 소 유래의 기질Substrate derived from cattle 평균Average ** 평균Average ** 세포 밀도(OD)Cell density (OD) 2.122.12 0.090.09 1.911.91 0.130.13 단백질(㎍/mL)Protein (μg / mL) 494494 4848 499499 3232 상대 단백질의 함량Relative Protein Content 233233 1818 262262 2323

*: 평균 표준편차*: Mean standard deviation

표 1에서와 같이 6개의 시료를 준비하였다.Six samples were prepared as shown in Table 1.

3) 조직학적 실험3) Histological Experiment

21일 동안 수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질을 배양한 후 얻은 진피등가물을 2%의 파라포름알데히드 용액으로 고정하고 나서 오스뮴 테트록사이드 용액에서 재고정한 다음 탈수시키고 Epon에 넣은 후 절단하여 CMEAGB(프랑스 라이온사)의 투과전자현미경(Jeol 1200) 하에서 관찰하였다.Cultivation of the dermal equivalent obtained after incubating the substrate derived from aquatic products and the substrate derived from bovine for 21 days was fixed with 2% paraformaldehyde solution, re-determined in osmium tetroxide solution, dehydrated, put into Epon, and cut into CMEAGB ( Observation under a transmission electron microscope (Jeol 1200) of Lion, France.

상기 결과로부터 3차원적 기질은 수산물이든 소이든 상관없이 세포의 군체형성이 좋음을 알 수 있다. 3주 배양한 후, 세포 밀도는 두 가지 기질 타입 다 유사하였다. 그러나, 배양 첫 주에 증식 연구에 보다시피 수산물 유래의 기질이 실험 초에는 세포접착이 더 좋은 것 같다. 따라서, 단기간의 배양에는 세포의 군체형성이더 낫다.From the above results, it can be seen that the three-dimensional substrate has good colonization of cells regardless of whether it is aquatic products or cows. After 3 weeks of culture, cell density was similar for both substrate types. However, as shown in the proliferation study in the first week of culture, aquatic substrates seem to have better cell adhesion at the beginning of the experiment. Thus, colonization of cells is better for short-term culture.

단백질 합성에 관하여, 섬유아세포의 합성능(비교 단백질의 함량)은 배양 한 달 후에는 유사하였다.With regard to protein synthesis, the ability of fibroblasts to synthesize (content of comparative protein) was similar after one month of culture.

이들 결과로부터 수산물 유래의 콜라겐 기질은 질 좋은 진피등가물을 제조할 수 있는 효과가 있으며, 이들 기질로부터 얻은 결과들은 소의 콜라겐 유래의 기질의 결과에 필적할 만 하다.From these results, aquatic-derived collagen substrates have the effect of producing high quality dermal equivalents, and the results obtained from these substrates are comparable to those of bovine collagen-derived substrates.

투과전자현미경 결과에서, 섬유아세포는 소 유래의 기질과 수산물 유래의 기질에서 관찰할 수 있었다. 두 가지 기질 타입에서, 새로이 합성된 다량의 세포외 기질이 발견되었다. 새로이 합성된 세포외 기질은 최초 스펀지로 된 3차원적 기질을 형성하는 콜라겐 군과 비교하여 침적된 콜라겐 섬유의 간헐적인 가는 홈 때문에 구별가능하다. In transmission electron microscopy results, fibroblasts were observed on substrates derived from bovine and those derived from aquatic products. In both substrate types, large amounts of newly synthesized extracellular matrix were found. The newly synthesized extracellular matrix is distinguishable due to the intermittent thin grooves of the collagen fibers deposited compared to the collagen group that forms the first sponge three-dimensional substrate.

실시예 26: 세포 생존능에 대한 수산물 유래의 콜라겐 기질의 가교결합 타입에 따른 효과Example 26 Effect of Cross-linking Type of Collagen Substrate from Aquatic Products on Cell Viability

다음의 실험은 세포 생존능에 대한 수산물 유래의 콜라겐 기질의 가교결합 타입에 따른 효과를 연구하기 위해 실시하였다:The following experiments were conducted to study the effect of cross-linking type of collagen matrix from aquatic products on cell viability:

I) 진피등가물의 제조I) Manufacture of dermis equivalents

a) 지지체 혹은 기질a) support or substrate

다공질 층 혹은 기질용 콜라겐 젤의 콜라겐 비율을 달리하고 선택적으로 다른 가교결합제제를 사용하여 다음과 같이 다양한 콜라겐 지지체 혹은 기질을 제조하였다:Various collagen supports or substrates were prepared by varying the collagen ratio of the collagen gel for the porous layer or substrate and optionally using other crosslinking agents:

1) 시험 1 1) Test 1

본 실험을 위해, 1.3%의 수산 콜라겐으로부터 제조된 수산물 유래의 콜라겐 젤로부터 다공질 스펀지의 형태로 다공질 기질을 생산하고 이를 -80℃에서 냉각하고 실시예 17에 따라 일반적인 동결건조를 실시한 다음 스펀지 g 건량 당 250 ㎕의 DPPA로 가교결합시켰다.For this experiment, a porous substrate was produced in the form of a porous sponge from a collagen gel derived from aquatic products prepared from 1.3% of hydroxylated collagen, cooled at −80 ° C. and subjected to general lyophilization according to Example 17, followed by g dry sponge. 250 μl of DPPA was crosslinked.

2) 시험 22) test 2

본 실험을 위해, 0.7%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산물 유래의 콜라겐 젤로부터 수산물 유래의 스펀지의 형태로 다공질 지지체를 제조하고 -80℃에서 냉각하고 나서 일반적인 동결건조를 실시한 다음 시험 1에 따라 스펀지 g 건량 당 250 ㎕의 DPPA로 가교결합시켰다.For this experiment, a porous support was prepared from aquatic product-derived collagen gel containing 0.7% of collagen hydroxide in the form of a sponge derived from aquatic products, cooled at -80 ° C and subjected to general lyophilization, followed by sponge g according to test 1. Crosslinked with 250 μl DPPA per dry weight.

3) 시험 33) Trial 3

본 실험을 위해, 실시예 2에 따라 스펀지 g 건량 당 0.46g의 EDC로 가교결합시키는 것을 제외하고는 시험 1에 따라 실시하였다.For this experiment, it was carried out according to test 1 except for crosslinking with 0.46 g of EDC per gram of dry sponge according to Example 2.

4) 시험 44) Test 4

1.1%의 수산 콜라겐을 포함하는 수산물 유래의 콜라겐 젤로부터 얻은 수산의 콜라겐 스펀지를 포함하는 다공질 지지체를 제조하고 이를 -80℃에서 냉각하고 나서 일반적인 동결건조를 실시한 다음 시험 2에 따라 스펀지 g 건량 당 250 ㎕의 DPPA로 가교결합시키나, 1.1%의 수산 콜라겐인 것이 다르다.Prepare a porous support comprising a collagen sponge of oxalic acid obtained from an aquatic product-derived collagen gel containing 1.1% of collagen oxalate, cool it at -80 ° C, then carry out normal lyophilization and then 250 per g dry matter according to test 2. Crosslinked with [mu] l of DPPA, but differs from 1.1% collagen hydroxyl.

상기 시험들에서 수산 콜라겐은 실시예 17의 서대의 복부껍질에서 유래한 것을 사용하였다.In the above tests, the collagen oxalate was derived from the abdominal shell of the stool of Example 17.

b) 이들 기질에서 섬유아세포의 배양 b) culture of fibroblasts on these substrates

정상인간유래의 섬유아세포는 실시예 25의 것을 사용하지만 8회 계대배양한 것을 얻었다.Normal human-derived fibroblasts were obtained in the same manner as in Example 25 but subcultured eight times.

275,000 cells/cm2의 비율로 세포를 접종하였다.Cells were seeded at a rate of 275,000 cells / cm 2 .

배양배지는 10% 우태반 혈청, 100 IU/mL의 페니실린, 25 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B, 50 ㎍/mL의 비타민 C가 50/50(v/v)로 첨가된 DMEM/HAM F12로 구성된다.Culture medium contains 50/50 (v / v) of 10% fetal placental serum, 100 IU / mL penicillin, 25 μg / mL gentamicin, 1 μg / mL amphotericin B, and 50 μg / mL vitamin C. Consisting of DMEM / HAM F12 added.

배양은 한 달 동안 실시하였으며 배지는 일주일에 세 번 바꿔주었다.The culture was carried out for one month and the medium was changed three times a week.

각 시험 당 4개의 기질을 사용하여 평균값과 평균 표준편차를 측정하였다.Four substrates per test were used to determine the mean and mean standard deviation.

II) 분석II) analysis

알라마 블루(산화환원 마커) 반응을 통한 세포 생존능의 측정Measurement of Cell Viability through the Alamar Blue (Redox Marker) Reaction

배양배지에서 얻은 시료에 대한 세포 생존능을 측정하고자 할 경우 알라마 블루를 배양배지 무게 당 2%로 첨가한다.To determine cell viability for samples obtained from the culture medium, add Alamar Blue at 2% per culture medium weight.

37℃에서 2시간 30분 동안 배양한 후, 530 nm의 여기 파장과 590 nm의 방출파장에서 형광강도를 읽는다.After incubation at 37 ° C. for 2 hours 30 minutes, the fluorescence intensity is read at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm.

상기에서 얻은 형광강도는 세포의 대사활성에 비례한다.The fluorescence intensity obtained above is proportional to the metabolic activity of the cells.

세포 생존능은 배양 시 1, 4, 6, 11, 17일째에 10개의 시료로 측정하였다.Cell viability was measured with 10 samples at 1, 4, 6, 11, 17 days in culture.

시간 당 국제단위의 형광강도로 그 결과를 나타내었다.The results are shown in fluorescence intensity in international units per hour.

시간(일)Hours 시험 1Test 1 시험 2Test 2 시험 3Test 3 시험 4Test 4 평균Average SD*SD * 평균Average SD*SD * 평균Average SD*SD * 평균Average SD*SD * 1One 21,73421,734 11841184 30,53530,535 18881888 25,52925,529 68206820 28,46128,461 38053805 44 31,61131,611 920920 35,62335,623 35443544 36,40436,404 35703570 45,12645,126 29302930 66 43,14443,144 25002500 35,24435,244 20952095 37,81937,819 41704170 41,25441,254 33963396 1111 42,80842,808 14811481 38,53238,532 25372537 42,44242,442 31123112 44,50844,508 23292329 1717 45,48445,484 24262426 45,09445,094 14701470 43,96343,963 82858285 43,93943,939 45214521 번호number 1One 22 33 44

표 3의 결과는 도 7에 나타내었다.The results in Table 3 are shown in FIG.

이들은 진피등가물에서 섬유아세포의 증식 곡선을 도시하고 있다.These show the proliferation curves of fibroblasts in dermal equivalents.

까만색 마름모형 곡선은 시험 1의 결과이며, 까만색의 네모형 곡선은 시험 2의 결과이며, 삼각형 곡선은 시험 3의 결과이고 십자형 곡선은 시험 4의 결과를 나타낸 것이다.The black rhombus curve is the result of test 1, the black square curve is the result of test 2, the triangle curve is the result of test 3 and the cross curve is the result of test 4.

가로축은 시간(일)으로 하고, 세로축의 형광강도는 IU로 표시하며 15,000에서 55,000까지로 하여 10,000 단위로 증가한다. The horizontal axis represents time (days), and the fluorescence intensity on the vertical axis is expressed in IU and is increased by 10,000 units from 15,000 to 55,000.

상기 결과에 따르면, 상기에서 제조된 기질 타입 모두 배양 17일 후 섬유아세포의 생장이 좋았다. 수산물 콜라겐 기질의 제조와는 상관없이, 섬유아세포는 3차원적 지지체에 잘 고착하며 매우 빠르게 분열하여 기질에 집중하였다.According to the above results, all of the substrate types prepared above had good growth of fibroblasts after 17 days of culture. Irrespective of the preparation of the aquatic collagen matrix, fibroblasts adhere well to the three-dimensional support and divide very quickly and concentrate on the substrate.

증식 타입은 기질마다 약간씩 다르지만 제조공정에 관계없이 섬유아세포의 밀도는 배양 17일에는 필적할 만 하다.The type of proliferation varies slightly from substrate to substrate, but the density of fibroblasts is comparable at 17 days of culture regardless of the manufacturing process.

DPPA 혹은 EDC로 실시된 가교결합의 타입은 달랐지만 세포 재생에는 영향을 끼치지 않는 것 같다. 실제로 배양 3주 후, 기질의 안정성은 매우 우수하였으며 소화와 축소는 거의 없었다. The types of crosslinks performed with DPPA or EDC were different but do not seem to affect cell regeneration. Indeed, after 3 weeks of culture, the stability of the substrate was very good and there was little digestion or reduction.

실시예 27: 새로이 합성된 인간유래 콜라겐의 동정 및 분석시 수산 콜라겐의 장점을 입증하기 위한 실험Example 27 Experiments to Demonstrate the Advantages of Hydroxyl Collagen in the Identification and Analysis of Newly Synthesized Human-Derived Collagen

본 실험은 조직학적 실험이 면역적 표지법으로 실시된다는 점을 제외하고는 실시예 25와 유사하다.This experiment is similar to Example 25, except that histological experiments are performed by immunological labeling.

1) 진피등가물의 제조1) Manufacture of dermis equivalents

실시예 25의 진피등가물을 사용하며, 실시예 25의 조건 하에서 배양하였다.The dermal equivalent of Example 25 was used and cultured under the conditions of Example 25.

따라서, 상기 배양은 3주 동안 실시되었으며, 배지는 일주일에 세 번 바꿔주었고, 정상인간유래의 섬유아세포는 실시예 25와 같이 300,000 cells/cm2의 비율로 접종하였다.Therefore, the culture was carried out for three weeks, the medium was changed three times a week, fibroblasts derived from normal humans were inoculated at a rate of 300,000 cells / cm 2 as in Example 25.

2) 조직학적 실험2) Histological Experiment

a) 일반적인 조직학적 실험a) general histological experiment

4%의 파라포름알데히드에서 고정한 다음 이를 탈수시키고 파라핀에 넣었다. 그 후, 파라핀을 제거하고 재수화(rehydration) 시킨 다음 7㎛ 의 단편을 제조하고 말로리 하이덴하인 염색(Mallory Haidenhain staining)을 실시하였다.It was fixed in 4% paraformaldehyde and then dehydrated and placed in paraffin. Subsequently, paraffin was removed, rehydrated, 7 μm fragments were prepared, and Mallory Haidenhain staining was performed.

b) 면역적 표지법b) immunological labeling

4%의 파라포름알데히드에서 고정한 다음, 이를 Tissue Tek OCT 화합물, 즉 미국 인디아나주 엘카르트 마일즈사의 봉입액에 넣고 저온 하에서 7㎛의 단편을 제조하였다.After fixation in 4% paraformaldehyde, it was placed in a Tissue Tek OCT compound, ie, Inc., El Carter Miles Inc., USA, to prepare 7 μm fragments under low temperature.

면역적 표지는 다음과 같이 실시하였다:Immune labeling was performed as follows:

일차 항체(토끼 유래의 항-인간의 콜라겐 타입 I 항체, rabbit anti-human type I collagen antibody(1/40으로 희석함)와 이차 항체(FITC가 결합된 항토끼 항체, anti-rabbit antibody coupled with FITC(Fluorescein IsoThioCyanate)(1/160으로 희석함)를 사용하였으며, DAPI(4'6-디아미디노-2-페닐인돌 디락테이트)를 역염색제로 사용하였다.Primary antibody (anti-human collagen type I antibody derived from rabbit, rabbit anti-human type I collagen antibody (diluted to 1/40)) and secondary antibody (anti-rabbit antibody coupled with FITC) (Fluorescein IsoThioCyanate) (diluted to 1/160) was used, and DAPI (4'6-diimidino-2-phenylindole dilactate) was used as a backstain.

3) 결과3) results

수산물 유래의 기질과 소 유래의 기질로 구성된 지지체는 섬유아세포가 점착하기에 다소 헐렁한 구멍을 형성하는 것으로 나타났다.The support consisting of aquatic-derived and bovine-derived substrates appeared to form somewhat loose pores for fibroblasts to adhere to.

섬유아세포는 표면에 보다 많이 관찰되었으며, 재건피부의 생산을 위한 진피등가물을 덮기에 바람직하다. 섬유아세포의 분포는 수산물 및 소 유래의 스펀지에서 유사하였다.More fibroblasts were observed on the surface and are preferred for covering dermal equivalents for the production of reconstructed skin. The distribution of fibroblasts was similar in aquatic and bovine derived sponges.

면역적 표지에서, 소의 콜라겐으로 형성된 기질을 항-인간의 콜라겐 타입 I 항체(anti-human type I collagen antibody)(crossing)로 표지하였다.In immunological labeling, substrates formed from bovine collagen were labeled with anti-human type I collagen antibody (crossing).

반면에, 수산물 유래의 기질은 항-인간의 콜라겐 항체(anti-human collagen antibody)에 의해 단지 매우 약하게 표지된다.In contrast, aquatic-derived substrates are only very weakly labeled by anti-human collagen antibodies.

따라서, 수산 콜라겐으로 구성된 스펀지를 사용하는 것이 새로이 합성된 세포외 기질을 동정하는 데 바람직하다.Therefore, it is desirable to use a sponge composed of collagen oxalate to identify newly synthesized extracellular matrix.

이들 결과들은 다른 항원과 다른 항체와의 반응에 대한 Hartmann 교수의 연구에서 설명될 수 있으며, 면역적 표지 후 흡광도를 측정하여 표 4 혹은 Hartmann의 표로 나타내었다.These results can be explained in Professor Hartmann's study of the reaction of different antigens with other antibodies, which are shown in Table 4 or in Hartmann's table by measuring absorbance after immunolabelling.

항원항체          Antibody Antibodies 서대의 콜라겐 타입 ICollagen type I 인간의 콜라겐 타입 IHuman Collagen Type I 소의 콜라겐 타입 IBovine Collagen Type I 20111(225)20111 (225) 1/251/501/1001/2001/4001/251/501/1001/2001/400 190210734356190210734356 >>1233605326>> 1233605326 815548234136165815548234136165 50121(03)50121 (03) 1/251/501/1001/2001/4001/251/501/1001/2001/400 1801301589610918013015896109 1550109453630521515501094536305215 >>>967728>>> 967728 50171(01)50171 (01) 1/251/501/1001/2001/251/501/1001/200 1880104357152318801043571523 641935151641935151 7332338773323387

>: 흡광도가 2000 보다 큰 경우>: If absorbance is greater than 2000

이들 결과는 OD X 103(흡광도 λ=450 nm)로 나타내었다.These results are expressed in OD X 103 (absorbance λ = 450 nm).

20111(225): 항-인간의 콜라겐 타입 I(anti-human type I collagen)20111 (225): anti-human type I collagen

50121(03): 항-소의 콜라겐 타입 I(anti-bovine type I collagen)50121 (03): anti-bovine type I collagen

50171(01): 항-어류(서대)의 콜라겐 타입 I(anti-fish(sole) type I collagen)50171 (01): anti-fish (sole) type I collagen

표 4에 따르면, 면역적 표지에서 항체에 관계없이(anti-human type I collagen, anti-bovine type I collagen, anti-sole type I collagen), 인간의 콜라겐과 서대의 콜라겐간의 차이점은 인간의 콜라겐과 소의 콜라겐과의 차이보다 훨씬 더 크다. 결과적으로, 어류의 콜라겐 기질에서 인간 유래의 섬유아세포에 의해 합성된 콜라겐이 훨씬 쉽게 동정될 것 같다. 이는 특히 예상치 않은 본 발명의 유리한 결과로써 어류의 콜라겐 기질에서 합성된 콜라겐을 항-인간의 콜라겐 타입 I 항체(anti-human type I collagen antibody)로 면역적 표지하여 얻은 상기 결과를 입증하는 것이다. According to Table 4, the differences between collagen in humans and collagen in the ileum, regardless of antibodies in immunological markers (anti-human type I collagen, anti-bovine type I collagen, anti-sole type I collagen), Much greater than the difference with bovine collagen. As a result, collagen synthesized by human fibroblasts in the collagen matrix of fish is likely to be identified much more easily. This is an unexpected and particularly advantageous result of the present invention, which demonstrates the above results obtained by immunolabeling collagen synthesized in collagen substrates of fish with an anti-human type I collagen antibody.

본 발명은 적어도 한쪽 면은 반드시 콜라겐 젤을 건조하여, 바람직하게는 공기 중이나 가스성 유체에서 건조하여 제조된 콜라겐 피막이나 혹은 고압축 콜라겐 스펀지 중 어느 하나로 구성된 조밀 콜라겐 막이 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 콜라겐 지지체를 형성하는 조성물에 관한 것이다.At least one porous collagen layer covered with a dense collagen membrane composed of either a collagen film prepared by drying the collagen gel, preferably by drying in air or a gaseous fluid, or a high-pressure collagen sponge must be coated on at least one side thereof. It relates to a composition for forming a collagen support comprising.

본 발명은 잠재적 활성물질의 유효성에 대한 시험관 내 시험용 인공피부의 제조를 위한 혹은 생체내 손상피부의 재건을 위한 콜라겐 지지체를 형성하는 조성물을 제공하는 효과가 있다.The present invention has the effect of providing a composition for forming a collagen support for the preparation of in vitro test artificial skin for the effectiveness of potential active substances or for the reconstruction of damaged skin in vivo.

Claims (28)

적어도 한쪽 면은 a) 다공질 콜라겐 막과 별도로 콜라겐 젤을 건조하여 제조된 콜라겐 피막이나 b) 적어도 50바(bar)의 압력으로 콜라겐 스펀지의 압축에 의해 제조된 콜라겐 막으로 구성된 조밀 콜라겐 막이 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함함을 특징으로 하는 콜라겐 지지체 형성 조성물.At least one side is covered with a dense collagen membrane composed of a) a collagen membrane prepared by drying the collagen gel separately from the porous collagen membrane, or b) a collagen membrane prepared by compression of the collagen sponge at a pressure of at least 50 bar. Collagen support forming composition, characterized in that it comprises one porous collagen layer. 제 1항에 있어서, 상기 콜라겐 지지체는 콜라겐 및 다당류가 결합되어 있는 콜라겐 혼합물, 키토산 혹은 그것의 유도체, 셀룰로오스 혹은 그것의 유도체, 덱스트란 혹은 그것의 유도체, 알기네이트 혹은 그것의 유도체 혹은 카라지넌으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.The method of claim 1, wherein the collagen support is selected from a collagen mixture, chitosan or derivatives thereof, cellulose or derivatives thereof, dextran or derivatives thereof, alginate or derivatives thereof or carrageenan to which collagen and polysaccharide are bound. Composition characterized in that the. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 두개의 층 즉, 다공질 층과 조밀막 중 적어도 하나는 생체에서 분리된 정상, 유전적으로 변형된, 또는 악성 생체세포를 포함함을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1 or 2, wherein at least one of the two layers, the porous layer and the dense membrane, comprises normal, genetically modified, or malignant living cells isolated from the living body. 제 3항에 있어서, 상기 세포는 청년에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 3, wherein the cells are derived from young men. 제 3항에 있어서, 상기 세포는 장년에서 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.4. The composition of claim 3, wherein said cells are derived from mature. 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 다공질 층에는 정상 섬유아세포 및 유전적으로 변형된 혹은 악성 섬유아세포 및 조밀막의 표면에는 정상 생체세포 및 유전적으로 변형된 혹은 악성 생체세포를 포함하며, 상기 세포는 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 피지선세포, 혈액유래의 세포 및 신경세포로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.4. The composition of claim 3, wherein the composition comprises normal fibroblasts and genetically modified or malignant fibroblasts and genetically modified or malignant biological cells on the surface of the dense membrane in the porous layer, wherein the cells are keratinocytes. , Melanocytes, blood-derived epithelial tactile cells, blood-derived Langerhans cells, sebaceous gland cells, blood-derived cells and neurons. 제 1항에 있어서, 콜라겐 스펀지는 50 바(50.105 Pa) ~ 200 바(200.105 Pa) 에서 압축되며, 상기 압축은 20 ~ 80℃ 사이에서 압축됨을 특징으로 하는 조성물.The method of claim 1, wherein the collagen sponge has a composition characterized in that is compressed at 50 bar (50.10 5 Pa) ~ 200 bars (200.10 5 Pa), the compression is compressed between 20 ~ 80 ℃. 제 1항에 있어서, 조밀막은 다공질 층과 결합하기 전에 제조되며, 콜라겐 스펀지를 포함하며, 상기 조성물을 제조하기 위해 혼합물을 동결건조하기 전에, 막을 제조하여 그것을 콜라겐 젤에 침적함을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the dense membrane is prepared prior to bonding with the porous layer, comprises a collagen sponge, and prior to lyophilizing the mixture to prepare the composition, the membrane is prepared and deposited on the collagen gel. . 제 1항에 있어서, 콜라겐 스펀지 또는 콜라겐 피막 또는 콜라겐 막은 포유동물 및 해양동물의 콜라겐에서 선택된 콜라겐을 포함함을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the collagen sponge or collagen coating or collagen membrane comprises collagen selected from collagen of mammals and marine animals. 제 9항에 있어서, 상기 해양동물의 콜라겐은 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)에서 선택된 어류의 피부의 콜라겐임을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 9, wherein the collagen of the marine animal is collagen of the skin of a fish selected from a sole, a dab, a turbot, and a brill. 제 1항에 있어서, 콜라겐은 타입 I 또는 타입 III 콜라겐임을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the collagen is type I or type III collagen. a) 먼저 다공질 콜라겐 층과 별도로 콜라겐 젤을 건조하거나, 혹은 콜라겐 젤의 동결-건조를 통해 얻은 콜라겐 스펀지를 적어도 50바(bar)의 압력으로 압축하여 조밀 콜라겐 막을 제조하고;a) preparing a dense collagen membrane by first drying the collagen gel separately from the porous collagen layer or by compressing the collagen sponge obtained through freeze-drying of the collagen gel to a pressure of at least 50 bar; b) 2차 콜라겐 젤을 따로 제조하고;b) preparing a second collagen gel separately; c) 조밀막을 2차 콜라겐 젤에 침적시키거나, 혹은 2차 콜라겐 젤을 조밀막에 붓고; 및c) dipping the dense membrane onto the secondary collagen gel, or pouring the secondary collagen gel onto the dense membrane; And d) 전체를 동결건조하여 상기 조성물을 얻음을 특징으로 하는 적어도 한쪽 면은 반드시 조밀 콜라겐 막으로 덮여있는 적어도 하나의 다공질 콜라겐 층을 포함하는 조성물의 제조공정.d) lyophilizing the whole to obtain the composition, wherein at least one side comprises at least one porous collagen layer necessarily covered with a dense collagen membrane. 제 12항에 있어서, 조밀막을 제조하기 위해 사용된 콜라겐 스펀지는 50 바(50.105 Pa) ~ 200 바(200.105 Pa) 에서, 20 ~ 80℃ 에서 압축됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.13. The method of claim 12, wherein the collagen sponge is 50 bar (50.10 5 Pa) ~ 200 bar manufacturing process of the composition of that the compressed characteristic of the speech in the (200.10 5 Pa), 20 ~ 80 ℃ used to prepare dense film. 제 13항에 있어서, 콜라겐 스펀지 또는 콜라겐 피막 또는 콜라겐 막은 콜라겐 혹은 다당류가 결합되어 있는 콜라겐의 혼합물, 키토산 혹은 그것의 유도체, 셀룰로오스 혹은 그것의 유도체, 덱스트란 혹은 그것의 유도체, 알기네이트 혹은 그것의 유도체, 혹은 카라지넌 중 어느 하나를 사용하여 제조됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.The method of claim 13, wherein the collagen sponge or collagen coating or collagen membrane is a mixture of collagen, chitosan or derivatives thereof, cellulose or derivatives thereof, dextran or derivatives thereof, alginate or derivatives thereof, to which collagen or polysaccharide is bound. Or or carrageenan. 제 14항에 있어서, 상기 콜라겐은 포유동물의 콜라겐 및 해양동물의 콜라겐에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.15. The process of claim 14, wherein the collagen is selected from mammalian collagen and marine animal collagen. 제 15항에 있어서, 상기 해양동물의 콜라겐은 서대(sole), 문치가자미(dab), 터보트(turbot), 브릴(brill)에서 선택된 어류의 피부의 콜라겐임을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.16. The process of claim 15, wherein the collagen of the marine animal is collagen of the skin of a fish selected from a sole, a dab, a turbot, and a brill. 제 16항에 있어서, 두개의 층 중 적어도 하나는 물리적 가교결합, 진공 하에서의 열 건조(TDH, Thermal Dehydration) 및 화학적 가교결합에서 선택된 가교결합에 따라 가교결합됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.17. The process of claim 16, wherein at least one of the two layers is crosslinked according to a crosslink selected from physical crosslinking, thermal dehydration (TDH) and chemical crosslinking under vacuum. 제 17항에 있어서, 상기 화학적 가교결합은 디페닐포스포릴아자이드(DPPA, Diphenylphosphorylazide), 글루타알데히드, 카보디이미드 및 석신이미드에서 선택된 가교결합제로 수행됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.18. The process according to claim 17, wherein the chemical crosslinking is carried out with a crosslinking agent selected from diphenylphosphoryl azide (DPPA, Diphenylphosphorylazide), glutaraldehyde, carbodiimide and succinimide. 제 12항에 있어서, 제조공정 동안 성장인자 및 사이토카인 혹은 케모카인과 같은 세포 발달을 촉진하는 물질을 첨가함을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.13. The process of claim 12, wherein a growth factor and a substance that promotes cell development, such as cytokines or chemokines, are added during the manufacturing process. 제 12항에 있어서, 두개의 층 중 적어도 하나에 생체에서 분리된 정상, 유전적으로 변형된, 또는 악성의 생체세포를 도입하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.13. The process of claim 12, comprising introducing a normal, genetically modified, or malignant living cell isolated from the living body into at least one of the two layers. 제 20항에 있어서, 상기 세포는 청년에서 유래한 것임을 특징으로 하는 조성물의 제조공정. 21. The process of claim 20, wherein said cell is derived from a young man. 제 20항에 있어서, 상기 세포는 장년에서 유래한 것임을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.21. The process of claim 20, wherein said cells are derived from mature. 제 20항에 있어서, 상기 생체세포는 섬유아세포, 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 혈액유래의 내피세포, 혈액세포, 대식세포, 림프구, 연골세포, 골세포, 조골세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 피지선세포, 지방세포 및 신경세포로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.The method of claim 20, wherein the living cells are fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, blood-derived Langerhans cells, blood-derived endothelial cells, blood cells, macrophages, lymphocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, blood-derived The process for producing a composition, characterized in that it is selected from the group consisting of epithelial tactile cells, sebaceous gland cells, adipocytes and neurons. 제 12항에 있어서, 섬유아세포는 다공질 층으로 도입됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.13. The process of claim 12, wherein the fibroblasts are introduced into the porous layer. 제 12항에 있어서, 생체세포는 조밀막의 표면에 침적되며, 상기 세포는 각질화세포, 멜라닌세포, 혈액유래의 상피성촉각세포, 혈액유래의 랑게르한스세포, 피지선세포, 혈액세포 및 신경세포로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.The method of claim 12, wherein the living cells are deposited on the surface of the dense membrane, the cells are selected from keratinocytes, melanocytes, blood-derived epithelial tactile cells, blood-derived Langerhans cells, sebaceous gland cells, blood cells and neurons Process for producing a composition characterized by. 제 12항에 있어서, 생체세포는 순차배양 혹은 타입이 다른 세포들의 공존배양 중 어느 하나에 의해 제공되며, 이들 세포들은 배양이나 혹은 생검으로부터 유래함을 특징으로 하는 조성물의 제조공정.The process of claim 12, wherein the living cells are provided by either sequential culture or co-culture of cells of different types, wherein the cells are from culture or biopsy. 잠재적 활성물질의 유효성에 대한 시험관 내에서 수행이나 혹은 생체내 손상 피부의 재건을 위한 청구항 1의 조성물을 포함하는 인공피부.An artificial skin comprising the composition of claim 1 for performing in vitro or reconstructing injured skin in vivo for the effectiveness of a potentially active substance. 조직노화과정을 연구하기 위해, 전적으로 유세포 및 전적으로 성숙세포에서 선택된 세포를 포함하는 청구항 1의 조성물을 포함하는 인공피부.To study the tissue aging process, artificial skin comprising the composition of claim 1 comprising cells selected entirely from flow cells and entirely mature cells.
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