PL190139B1

PL190139B1 - Diagnostyczny nośnik testowy i sposób oznaczania analitu w pełnej krwi

Info

Publication number: PL190139B1
Application number: PL97321252A
Authority: PL
Inventors: Detlef Thym; Wolfgang-Reinhold Knappe; Rudolf Pachl; Hartmut Merdes; Robert Lorenz
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1996-07-23
Filing date: 1997-07-22
Publication date: 2005-11-30
Also published as: UA44758C2; KR100220659B1; ATE225937T1; SK99197A3; CN1109244C; AU2866197A; HK1008566A1; CN1176389A; AU702224B2; HUP9701272A3; NO973381L; ES2184013T3; NO973381D0; ZA976465B; IL121353A0; HRP970401A2; CA2210770A1; EP0821234A3; US6036919A; DK0821234T3

Abstract

1. Diagnostyczny nosnik testowy do oznaczania analitu w pelnej krwi przy pomocy zawartego w nosniku ukladu reakcyjnego, który zawiera re- agenty tworzace zabarwienie, z polem testowania, na którego strone nanoszenia próbki wprowadza sie próbke krwi, i na którego stronie wykrywania naste- puje wykrywalna optycznie zmiana zabarwienia, i które jest tak zbudowane, ze zawarte w próbce erytrocyty nie dostaja sie na strone wykrywania, znamienny tym, ze pole testowania (1) obejmuje przezroczysta folie (2) i naniesiona na nia pierwsza (3) i znajdujaca sie na niej druga warstwe folii (4), przy czym znajdujaca sie na przezroczystej folii pierwsza warstwa (3) w stanie wilgotnym jest mniej rozpra- szajaca swiatlo niz lezaca na niej druga warstwa (4), oraz ze strona folii, na która naniesiona jest pierwsza warstwa (3), stanowi strone wykrywania (6), a strona drugiej warstwy lezaca po przeciwnej stronie, która druga warstwa (4) styka sie z pierwsza (3), stanowi strone nanoszenia próbki (5). F i g . 1 PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest diagnostyczny nośnik testowy do oznaczania analitu w pełnej krwi przy pomocy zawartego w nośniku testowym układu reakcyjnego, który zawiera reagent tworzący zabarwienie. Nośnik testowy zawiera pole testowania, w którym występuje strona nanoszenia próbki, na którą wprowadza się próbkę krwi i które poza tym posiada stronę wykrywania, na której w wyniku reakcji oznaczanego analitu z układem reakcyjnym ma miejsce wykrywalna optycznie zmiana. Zawarte we krwi erytrocyty nie przenikają na stronę wykrywania. Według wynalazku pole testowania 1 obejmuje przezroczystą folię, na którą naniesione są w tej kolejności leżąca jedna na drugiej pierwsza i druga warstwa folii. Istotne jest to, że znajdująca się na przezroczystej folii pierwsza warstwa jest znacznie mniej rozpraszająca światło niż znajdująca się nad nią druga warstwa. Niepokrytą stronę przezroczystej folii określa się jako stronę wykrywania, a stronę drugiej warstwy, znajdującą się po przeciwnej stronie, którą druga warstwa styka się z pierwszą, określa się jako stronę nanoszenia próbki.

Diagnostyczny nośnik testowy charakteryzuje się również tym, że dodatkowo druga warstwa zawiera pigment o współczynniku załamania światła co najmniej 2,5 w stężeniu co najmniej 25% wagowych, licząc na wysuszoną podwójną warstwę folii.

Korzystnie obie warstwy folii w diagnostycznym nośniku testowym utworzone są z emulsji lub dyspersji polimerycznego materiału błonotwórczego, która w homogenicznym rozprowadzeniu zawiera polimeryczny materiał błonotwórczy i środek spęczniający, przy czym zdolność spęczniania środka spęczniającego jest na tyle wysoka, że optycznie wykrywalna zmiana zabarwienia po stronie wykrywania daje się mierzyć po najwyżej jednej minucie.

Korzystnie warstwy folii jako pigmenty zawierają: pierwsza glinokrzemian sodowy, a druga dwutlenek tytanu.

Korzystnie tym, że obie warstwy folii zdolne są do oddzielania erytrocytów.

Korzystnie łączna grubość pierwszej i drugiej warstwy folii w stanie wysuszonym wynosi maksymalnie 0,20 mm, korzystnie maksymalnie 0,12 mm, a szczególnie korzystnie maksymalnie 0,08 mm.

Korzystnie druga warstwa folii jest 2 do 5 razy grubsza niż pierwsza.

Korzystnie tworzący zabarwienie reagent znajduje się w pierwszej warstwie folii.

Innym wariantem nośnika jest taki, w którym składniki układu reakcyjnego rozdzielone są na obie warstwy folii.

Korzystnie nośnik posiada warstwy folii zawierające niehemolizujące środki zwilżające, przy czym korzystnie co najmniej jedna warstwa folii jako środek zwilżający zawiera N-oktanoilo-N-metylo-glukamid.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania analitu w pełnej krwi przy pomocy diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku. W tym celu na stronę nanoszenia próbki pola testowania nanosi się krew i następnie po stronie wykrywania obserwuje się tworzenie się zabarwienia w reakcji barwnej, przy czym mierzy się intensywność otrzymanego zabarwienia i przelicza na stężenie analitu we krwi.

Korzystnie po stronie wykrywania obserwuje się tworzenie się zabarwienia w sposób ciągły lub z przerwami.

Korzystnie obserwację prowadzi się przy pomocy urządzenia, przy czym dokonuje się szeregu pomiarów intensywności zabarwienia aż do jednokrotnego przekroczenia ustalonej uprzednio absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach.

Korzystnie można również prowadzić obserwację przy pomocy urządzenia, przy czym dokonuje się szeregu pomiarów intensywności zabarwienia, aż do wielokrotnego przekroczenia uprzednio ustalonej absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach.

Korzystnie po jednorazowym lub wielokrotnym przekroczeniu ustalonej absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach intensywności zabarwienia może zachodzić dalsza reakcja następcza.

Korzystnie pomiar intensywności zabarwienia dokonuje się reflektometrycznie, a ostatnią zmierzoną wartość w szeregu pomiarowym stosuje się do matematycznego obliczenia stężenia analitu w analizowanej próbce.

Warstwy folii diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku wytwarza się z dyspersji lub emulsji polimerycznego materiału błonotwórczego. Dyspersje materiału błonotwórczego zawierają mikroskopijne cząstki polimeru nierozpuszczalne w cieczy stanowiącej nośnik (najczęściej w wodzie), które w maksymalnym rozdrobnieniu zdyspergowane są w cieczy, stanowiącej nośnik. Jeśli przy tworzeniu folii ciecz usuwa się przez odparowanie, cząstki zbliżają się i w końcu stykają się. Dzięki występującym przy tym dużym siłom i towarzyszącemu tworzeniu się folii zyskowi energii, cząstki zrastają się w zamkniętą, w dużym stopniu warstwę folii. Alternatywnie może być użyta emulsja materiału błonotwórczego, który jest rozpuszczony w rozpuszczalniku. Rozpuszczony polimer emulguje się w cieczy stanowiącej nośnik, która nie miesza się z rozpuszczalnikiem.

Na materiały błonotwórcze szczególnie nadają się takie polimery jak poliestry winylowe, polioctany winylowe, poliestry akrylowe, kwas polimetakrylowy, poliwinyloamidy, poliamidy i polistyren. Obok homopolimerów nadają się również polimeryzaty mieszane, na przykład butadienu, styrenu lub estrów kwasu maleinowego.

W polu testowania diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku znajdują się dwie wymienione warstwy folii na folii przezroczystej. Tu wchodzą w rachubę zwłaszcza takie folie z tworzywa sztucznego, które są nieprzepuszczalne dla cieczy. Folie poliwęglanowe okazały się bardzo korzystne.

Obie warstwy foliowe mogą być wytworzone z mas powlekających, które zawierają taki sam polimeryczny materiał błonotwórczy, lub mogą być wytworzone z mas powlekających, które zawierają różne polimeryczne materiały błonotwórcze.

O ile pierwsza warstwa zawiera środek spęczniający i, ewentualnie, słabo rozpraszający światło materiał wypełniający, to warstwa druga wymaga środka spęczniającego i w każdym przypadku co najmniej jednego pigmentu, silnie rozpraszającego światło. Obok tego druga warstwa może zawierać w niewielkich ilościach nieporowate jak i porowate materiały wypełniające takie jak ziemia okrzemkowa, nie stając się dzięki temu przepuszczalną dla erytrocytów. Stosunek wagowy pigmentu do ziemi okrzemkowej powinien wynosić co najmniej 2:1.

Przez dodatek dobrze pęczniejącego środka spęczniającego (to znaczy substancji, która przez pobranie wody powiększa swoją objętość), otrzymuje się nie tylko warstwy, które mogą być stosunkowo szybko penetrowane przez ciecz próbki, ale które oprócz tego działania przepuszczającego środka spęczniającego, posiadają dobre właściwości oddzielania erytrocytów i prócz tego barwników krwi. Właściwości pęcznienia powinny być na tyle dobre, aby dla testu, w którym szybkość tworzenia zabarwienia, jak na przykład, reakcja wykrywania glikozy, w głównej mierze zależnej od penetracji przez ciecz próbki przez warstwę, optycznie wykrywalna reakcja mogła być mierzona po maksimum jednej minucie'. Szczególnie odpowiednie jako środki spęczniające okazały się kopolimer eteru metylowo-winylowego i bezwodnika maleinowego, żywica ksantanowa i kopolimer eteru metylowo-winyłowego i kwasu maleinowego.

Ziemię okrzemkowa określa się również jako pelit diatomowy, diatomit. Chodzi 0 powstające ze szkieletu kwasu krzemowego dwuatomowe złogi, które wydobywa się w różnych miejscowościach. Użyta ziemia okrzemkowa korzystnie ma średnia wielkość średnicy cząstek 5-15 pm, przy czym wartości te określa się laserowym granulometrem typu 715, który pochodzi z firmy Pabisch, Muenchen, Republika Federalna Niemiec.

Udział silnie rozpraszającego światło pigmentu w drugiej warstwie wynosi co najmniej 25% wagowych, licząc na wysuszoną i gotową do użytku podwójną warstwę pola testowania. Ponieważ słabo rozpraszające światło wypełniacze i silnie rozpraszające światło pigmenty w sposób istotny są odpowiedzialne za optyczne właściwości warstw folii, pierwsza 1 druga warstwa folii posiadają różne wypełniacze i pigmenty.

Pierwsza warstwa nie powinna zawierać wypełniaczy lub zawierać takie, których współczynnik załamania leży blisko współczynnika załamania wody. Jako szczególnie nada190 139 jące się do tego okazały się dwutlenek krzemu, krzemiany i glinokrzemiany. Szczególnie korzystny jest glinokrzemian sodu o handlowej nazwie Transpafill®. Ma on średni skład: 66% wagowych SiCty; 26% wagowych AI2O3; 7% wagowych Ńa2O i 1% wagowy SO3. Średnia wielkość ziarna korzystnych cząstek pierwotnych wynosi około 0,06 pm.

Druga warstwa według wynalazku powinna silnie rozpraszać światło. W drugiej warstwie folii idealny współczynnik załamania pigmentu powinien być bliski co najmniej 2,5. Korzystnie w tym celu stosuje się dwutlenek tytanu. Jako szczególnie korzystne okazały się cząstki o średniej wielkości średnicy około 0,2 do 0,8 pm.

Szczególnie korzystne są typy tlenku tytanu, dajace się lekko przetwarzać w modyfikację anatas.

Układy reagentów do wykrywania przez barwną reakcję określonych analizowanych materiałów są znane fachowcom. Możliwe jest, że wszystkie składniki układu reakcyjnego znajdują się w jednej warstwie folii. Możliwe jest jednak też, że składniki układu reakcyjnego są rozdzielone pomiędzy obiema warstwami folii. Tworzący zabarwienie układ reakcyjny korzystnie znajduje się co najmniej częściowo w pierwszej warstwie folii.

W ramach niniejszego wynalazku pod tworzeniem zabarwienia należy rozumieć nie tylko przejście od białego do barwnego, ale też każdą zmianę zabarwienia, przy czym oczywiście szczególnie korzystna jest taka zmiana zabarwienia, przy której ma miejsce możliwie maksymalne przesunięcie linii absorpcji fali (A^aks)·

Dla optymalizacji pola testowania w diagnostycznym nośniku testowym okazało się jako szczególnie korzystne, jeśli obie warstwy folii zawierają niehemolizujacy środek zwilżający. Do tego szczególnie nadają się neutralne, to znaczy nie naładowane, środki zwilżające. Szczególnie korzystny jest N-oktanoilo-N-metylo-glukamid.

W celu wytworzenia pola testowania diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku, zawsze wytwarza się jedną po drugiej warstwy folii z homogenicznej dyspersji wymienionych części składowych. Do tego celu stosuje się jako podkład przezroczystą folię do uformowania masy powlekającej w pierwszą warstwę folii. Po naniesieniu masy powlekającej dla pierwszej warstwy folii o określonej grubości, warstwę suszy się. Następnie na tę warstwę nanosi się masę powlekającą dla drugiej warstwy, również o małej grubości i suszy się. Po wysuszeniu łączna grubość pierwszej i drugiej warstwy powinna wynosić maksymalnie 0,20 mm, korzystnie maksymalnie 0,12 mm, a szczególnie korzystnie maksymalnie 0,08 mm. Wysuszona druga warstwa folii korzystnie powinna być 2 do 5 razy grubsza od pierwszej.

Tak wytworzone pole testowania, dla łatwiejszego wykorzystania, może być umocowane na warstwie nośnej, przy czym na taką warstwę szczególnie nadają się takie materiały, które nie przyjmują badanej cieczy. Są to tak zwane materiały nie nasączające się, przy czym szczególnie korzystne są folie z tworzywa sztucznego, na przykład z polistyrenu, polichlorku winylu, poliestru, poliwęglanu lub poliamidu. Możliwe jest jednak też impregnowanie materiałów nasączających się takich jak na przykład drewno, papier lub tektura, środkami odpychającymi wodę lub powlekanie odporną na wodę folią przy czym jako środki hydrofobizujące mogą być stosowane silikony lub twarde tłuszcze, a jako materiały błono twórcze, na przykład nitroceluloza lub octany celulozy. Jako dalsze materiały nośne nadają się folie metalowe lub szkło.

W celu określenia w ciekłej próbce materiału, w konkretnym przypadku pełnej krwi, ale też oczywiście pochodzących z krwi próbek jak plazma czy surowica, jak też innych wodnych cieczy, analizowane materiały do wykrycia muszą być widoczne przez warstwę nośną w diagnostycznym nośniku testowym według wynalazku po stronie wykrywania, którą obserwuje się na tworzenie zabarwienia i mierzy się. Możliwe jest też, aby warstwa nośna była perforowana i przykryta po stronie wykrywania polem testowania. Przez tę perforację widoczna jest strona wykrywania. W korzystnej postaci wykonania diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku, w warstwie nośnej, pod stroną wykrywania pola testowania, znajduje się otwór, przez który może być obserwowana strona wykrywania pola testowania. Otwór ma nieco mniejszą średnicę niż najmniejsze wydłużenie pola testowania tak, że pole testowania poza otworem leży na warstwie nośnej i może być tam zamocowane.

Ze względu na konstrukcję pola testowania, a zwłaszcza na właściwość obu warstw folii nie przepuszczania erytrocytów na stronę wykrywania, do określania analizowanego matę8

190 139 riału niezbędne są tylko bardzo niewielkie objętości. Przy wielkości pola testowego 5x6 mm, wystarczają już, na przykład, 3 μ1 pełnej krwi do określenia glikozy w tej cieczy. Aby przy stosowaniu próbek o większej objętości, około 15-20 μ1 móc mimo to wygodnie pracować i uniknąć wypływu cieczy z nośnika testowego, okazało się szczególnie przydatne wbudowanie pola testowania w diagnostycznym nośniku testowym w taki sposób, aby nośnik testowy posiadał warstwę nośną z umiejscowionym na niej polem testowania, które przykryte jest siatką, która jest większa niż pole testowania i poza nim umocowana jest na warstwie nośnej. Siatka takiego szczególnie korzystnego diagnostycznego nośnika testowego jest hydrofitowa, ale sama nie jest kapilarnie aktywna. Nad obszarem siatki wchodzącym poza pole testowania, to jest obszarem siatki nie leżącym na polu testowania, znajduje się neutralne pokrycie z materiału nieprzenikalnego dla próbki tak usytuowane, że na obszarze siatki leżącym nad polem testowania pozostaje wolna powierzchnia do nanoszenia próbek.

Siatka tego szczególnie korzystnego diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku sama nie powinna być kapilarnie aktywna czy nasączalna, aby ciecz próbki była możliwie w całości dostępna dla pola testowania. Jako odpowiednie okazały się takie siatki, które po pionowym zanurzeniu w wodzie umożliwiają podnoszenie się wody w siatce na wysokość mniejszą niż 2 mm. Korzystnie jako siatki stosuje się rzadko tkane tkaniny z pojedynczego włókna, które są hydrofitowe. Do tego celu sam materiał tkaniny może być hydrofitowy, lub może być przekształcony w hydrofitowy, na przykład przez obróbkę materiałem zwilżającym. Jako szczególnie korzystny materiał na siatkę stosuje się poliester, przy czym siatka z takiego materiału może być użyta po obróbce środkiem zwilżającym.

Grubość siatki musi być tak dobrana, aby leżące na niej pokrycie i znajdująca się pod nią warstwa znajdowały się w takiej odległości od siebie, aby ciecz pozostająca ponad nasyconym polem testowania i wypełnionymi oczkami siatki, siłą kapilarną była zasysana do obszaru pod pokryciem i była odprowadzana od miejsca nanoszenia próbki. Z reguły do tego przydatna jest siatka o grubości 50 - 400 pm.

Siatka musi mieć oczka o wystarczającej wielkości aby ciecz przez siatkę dostawała się do pola testowania. Ze względu na właściwości siatki ciecz nie rozpływa się poziomo po powierzchni siatki, ale spływa pionowo przez siatkę na pole testowania.

W opisanym tu szczególnie korzystnym diagnostycznym nośniku testowym według wynalazku, siatka pokrywająca pole testowania jest większa niż położone niżej pole testowania. Część siatki, wystająca poza pole testowania jest umocowana na warstwie nośnej. Umocowanie może być dokonane sposobem znanym fachowcom z zakresu technologii nośników testowych. Na przykład umocowanie może być wykonane przy pomocy zgrzewania klejowego lub kleju utwardzającego się. Korzystne okazały się również obustronnie klejące taśmy. W każdym przypadku ważne jest takie umocowanie siatki na warstwie nośnej, aby z pola testowania, dzięki siłom kapilarnym, możliwy był transport cieczy w tej części siatki, która jest umocowana na warstwie nośnej. Taki transport dzięki aktywności kapilarnej musi być możliwy zwłaszcza wtedy, gdy pole testowania jest nasycone cieczą. Do przetworzenia szczególnie nadaje się taśma klejąca z naturalnym lub syntetycznym kauczukiem. Jest szczególnie korzystne, gdy środek służący do umocowania siatki na warstwie nośnej, ma grubość zbliżoną do grubości pola testowania. Służy on wtedy jakby jako regulator odległości aby siatkę, również poza obszarem pola testowania, utrzymać w całości na równoległym poziomie.

Nad siatką tego szczególnie korzystnego diagnostycznego nośnika testowego znajduje się pokrycie z nieprzenikalnego dla próbki, z reguły nieprzenikalnego dla wody, materiału, tak usytuowane, że pokryty jest obszar siatki poza polem testowania. Najkorzystniej, jeśli pokrycie sięga jeszcze poza obszar pola testowania. W każdym przypadku pozostaje jeszcze wolna znaczna część siatki, która przykrywa pole testowania. Tę wolną część siatki określa się jako punkt nanoszenia próbki.

Jako materiał na pokrycie szczególnie odpowiednie okazały się folie z tworzywa sztucznego. Jeśli pokrycie i siatka mają różne kolory, na przykład biały i żółty, lub biały i czerwony, czyni to bardziej wyraźnym miejsce, na które powinna być naniesiona badana próbka.

190 139

Na pokryciu może być, na przykład, przy pomocy wydrukowanej jednej lub kilku strzałek, wyraźniej określona strona, którą diagnostyczny nośnik testowy według wynalazku powinien być włożony lub wsunięty do aparatu pomiarowego.

Punkt nanoszenia próbki może być szczególnie łatwo udostępniony przez zdjęcie dwóch taśm z tworzywa sztucznego, czym zostaje uwolniony obszar w postaci taśmy siatki pokrywającej pole testowania. Folie użyte do pokrycia są umocowane na siatce i ewentualnie na warstwie nośnej. Do takiego umocowania nadają się kleje topliwe lub taśmy klejące, jeśli folie same nie są klejące. W każdym przypadku należy zwracać uwagę, aby podczas odkrywania pozostała kapilarna szczelina, przez którą można by odprowadzić nadmiar cieczy badanej z nasyconego cieczą pola testowania. Punkt nanoszenia próbki korzystnie znajduje się nad otworem w warstwie nośnej, przez który można obserwować tworzenie się zabarwienia w polu testowania.

W celu przeprowadzenia oznaczenia analitu w pełnej krwi przy pomocy diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku krew nanosi się po stronie nanoszenia próbki pola testowania i obserwuje się tworzenie się zabarwienia po stronie wykrywania. Dotąd jedną z głównych przyczyn błędnych odczytów wartości pomiarowych przy monitorowaniu cukrzycy, to znaczy przy regularnej kontroli krwi chorego na cukrzycę, była zbyt mała objętość próbek. Dla diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku, przy wielkości pola testowania 5x6 mm wystarczają już 3 μ 1 pełnej krwi aby móc dokonać wizualnej oceny wyniku badania. Dzięki temu, że druga warstwa folii pola testowania jest silnie rozpraszająca światło, natomiast pierwsza słabo rozprasza światło, powstałe zabarwienie po stronie wykrywania jest dostrzegane jako wyraziste i intensywne. Umożliwia to dokładne określenie, wynikających z małej objętości próbki, niewielkich ilości oznaczanego analitu.

Oczywiście przeprowadzenie oznaczania analitu w pełnej krwi przy pomocy diagnostycznego nośnika testowego może być dokonane aparaturowe. Dla uzyskania możliwie dokładnych danych ilościowych takie postępowanie jest korzystne. W tym celu po stronie wykrywania obserwuje się w sposób ciągły lub z przerwami refleksję światła zależną od intensywności powstającego zabarwienia. Pomiary refleksji światła dokonywane są odbicia po stronie wykrywania pola testowania i odczytuje się je w postaci szeregu pomiarowego. Po jednorazowym lub wielokrotnym przekroczeniu ustalonej absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach intensywności zabarwienia i ewentualnie zajściu dalszej reakcji następczej pomiar kończy się. Ostatni pomiar refleksji w szeregu pomiarowym stosuje się do matematycznego wyliczenia stężenia analitu.

Ponieważ badanie to prowadzi się z jednym, istotnym kryterium do przerwania szeregu pomiarowego i nie wymaga określania momentu naniesienia próbki, naniesienie próbki może mieć miejsce poza aparatem pomiarowym. Wystarcza przy tym włożyć do aparatu taśmę w dowolnym momencie, ale w określnym przedziale czasu po naniesieniu próbki.

W takim przypadku oznaczanie przy wartości hematokrytu od 20 do ponad 60% można uznać jako nie podlegające jego wpływowi i niezależne od hematokrytu, jeśli badanie prowadzi się przy pomocy aparatu według niniejszego sposobu. Przy określaniu wizualnym, należy odczekać 2-3 minuty zanim możliwe stanie się odczytanie wartości niezależnej od hematokrytu.

Wynalazek przedstawiony jest schematycznie na rysunkach fig. 1-9

Figura 1 przedstawia przekrój pola testowania diagnostycznego nośnika według wynalazku;

Figura 2 przedstawia widok perspektywiczny szczególnie korzystnego diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku;

Figura 3 przedstawia widok dolnej strony diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku przedstawionego na fig. 2;

Figura 4 przedstawia przekrój diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku przedstawionego na fig. 2, wzdłuż linii A-A;

Figura 5 przedstawia powiększenie części przekroju przedstawionego na fig. 4;

Figura 6-9 przedstawiają krzywe kalibrowania 1-4, których wyniki bliżej wyjaśniono w przykładzie 2.

Podane na rysunkach znaki odniesienia oznaczają:

pole testowania, przezroczysta folia, pierwsza warstwa,

190 139 druga warstwa, strona nanoszenia próbki, strona wykrywania, diagnostyczny nośnik testowy, warstwa nośna, siatka, pokrycie, obszar siatki zachodzący na pole testowania, punkt nanoszenia próbki, otwór, taśma klejąca dla pola testowania, podkładka dystansowa, kapilarnie aktywna szczelina, ciecz próbki, otwór sytuujący.

Przedstawiony na rysunku fig. 1 przekrój pola testowania 1 diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku pokazuje przezroczystą folię 2, na którą naniesiona jest pierwsza warstwa folii 3. Pierwsza warstwa folii 3 jest przykryta drugą warstwą folii 4. Sposób wytwarzania pola testowania 1 nośnika testowego, a mianowicie powlekanie przezroczystej folii 2 wilgotną masą powlekającą dla pierwszej warstwy folii 3 i następne powleczenie wysuszonej pierwszej warstwy folii 3 wilgotną masą powlekającą dla drugiej warstwy folii 4, powoduje, że warstwy pomiędzy sobą i pierwsza warstwa folii 3 są na folii przezroczystej 2 w pełni płasko połączone ze sobą. Krew badaną na zawarte w niej substancje nanosi się po stronie nanoszenia 5 pola testowania 1 nośnika testowego według wynalazku. W przypadku obecności w próbce analizowanego materiału, po stronie wykrywania 6 pola testowania 1 nośnika testowego według wynalazku daje się zaobserwować tworzenie się zabarwienia, którego intensywność zależna jest od ilości analizowanego materiału w próbce.

Pokazany na fig. 2 perspektywicznie i na fig. 4 w przekroju, szczególnie korzystny diagnostyczny nośnik testowy 7 ma postać taśmy testowej. Na warstwie nośnej 8 znajduje się pole testowania 1 pokryte większą siatką 9. W pobliżu pola testowania 1 siatka 9 umocowana jest na warstwie nośnej 8 przy pomocy podkładki dystansowej 15. Podkładki dystansowe 15 mogą stanowić powierzchnie z kleju topliwego lub obustronnie klejącej taśmy, które mocują siatkę 9 na warstwie nośnej 8.

W idealnym przypadku podkładki dystansowe mają taką samą grubość jak pole testowania 1. Warstwy 10, służące jako przykrycie, umocowane są na warstwie nośnej 8 i na siatce 9. Są one tak usytuowane, że przykrywają obszar siatki 9, wystający poza pole testowania 1. Pokrycia 10 wystają nieznacznie jeszcze poza pole testowania 1. Pozostawiają one jednak niepokrytą większą część siatki 9, która przykrywa pole testowania 1. Obszar ten stanowi punkt nanoszenia próbki 12. Tu nanosi się ciecz próbki 17. Otwór sytuujący 18, w przypadku aparaturowego, na przykład, reflektometrycznego pomiaru, służy do utrzymania taśmy testowej w dokładnie określonym miejscu w aparacie. Może to nastąpić, na przykład, przez włożenie do otworu sytuującego 18 sztyftu, który utrzymuje nośnik testowy 7 w ściśle określonym miejscu. Na lewym pokryciu 10 znajdują się nadrukowane strzałki, pokazujące użytkownikowi, którym końcem nośnik testowy 7 ma być wsunięty lub włożony do aparatu pomiarowego.

Fig. 5 pokazuje powiększony przekrój szczególnie korzystnego diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku, który przedstawiono na rysunkach fig. 2 i 4. Na figurze tej należało by objaśnić jak przebiega określanie analizowanego materiału w ciekłej próbce, na przykład glikozy w pełnej krwi. Do takiego określenia krew nanosi się na miejsce nanoszenia próbki 12 siatki 9. Ciecz kieruje się pionowo przez siatkę 9 na pole testowania 1. Tam z krwi, jako ciekłej próbki, zostają zatrzymane erytrocyty, podczas gdy plazma i surowica kierują się do warstw 3 i 4 pola testowania 1. Jeśli ciekła próbka w postaci pełnej krwi została naniesiona w dostatecznej ilości, plazma lub surowica rozprzestrzenia się w pierwszej i drugiej warstwie folii 3 i 4 na całej powierzchni pola testowania 1. Przy bardzo małej objętości cieczy pole testowania 1 może odessać nawet do sucha znajdującą się nad nim siatkę 9, ponieważ sama siatka 9 nie jest kapilarnie aktywna. Przy średniej do dużej objętości cieczy na190 139 pełniająsię najpierw oczka siatki 9 ponad polem testowania 1, a na koniec kapilarne pory pokrycia 10. Dla prawidłowego działania tych kapilarnych porów konieczne jest aby pokrycia 10 przynajmniej częściowo przykrywały obszar pola testowania 1 pod siatką 9. Przez otwór 13 może być obserwowana strona wykrywania pola testowania 1. W tym aspekcie na fig. 3 przedstawiono widok dolnej strony diagnostycznego nośnika testowego według fig. 2, 4 i 5.

W przypadku obecności analizowanego materiału w naniesionej ciekłej próbce zmieni się zabarwienie po stronie wykrywania 6 pola testowania 1. Tworzy się zabarwienie, którego intensywność jest miarą ilości analizowanego materiału w ciekłej próbce.

Ponadto wynalazek objaśniają bliżej poniższe przykłady.

Przykład 1

Wytwarzanie diagnostycznego nośnika testowego według wynalazku.

Wytwarzanie nośnika testowego według fig. 2 przebiega w następujących etapach:

Na zawierającą dwutlenku, tytanu poliestrową warstwę nośną nanosi się obustronnie klejącą taśmę klejącą o szerokości 5 mm (nośnik poliestrowy i syntetyczny klej kauczukowy). Połączenie to, dla uzyskania otworów pomiarowych, sprasowuje się przy odległości otworów 6 mm. Następnie z obustronnie klejącej taśmy zrywa się papier ochronny.

W celu wytworzenia pola testowania, które składa się z 2 warstw folii, postępuje się następująco:

A. W zlewce miesza się następujące składniki jako substancje czyste lub w postaci roztworów pierwotnych według następującego składu:

woda 822,0 g kwas cytrynowy-1-wodzian 2,5 g chlorek wapnia-2-wodzian 0,5 g wodorotlenek sodu 1 /1 g żywica ksantanowa 3,4 g chlorek tetraelyloamoniowy 2,0 g

N-oktanoilo-N-metylo-glukamid 2,1 g poliwinylopirolidon (c.cząst. 25 000) 3,5 g

Transpafill® (glinokrzemian sodu) 62,1 g dyspersja polipropionianu winylu (50% wagowych w wodzie) 60,8 g chlorek bis-(2-hydroksyetylo)-(4-hydroksyiminocykloheksa-2,5-dienylideno)amomowy T2 g sól sześciosodowa kwasu 2,18-foforomolibdenowego 16,1 g chinon pirolochinolinowy 32 mg glikozodehydrogenaza uzyskana z Acineto-bacter calcoaceticus 1,7 MU

EC 1.1.99.17 (2,4 g) heksanol-1 1,6 g

1-metoksy-propanol-2 2C^/^ g

Przy pomocy NaOH wartość pH całej masy doprowadza się do 6, po czym nanosi się na folię poliwęglanową o grubości 125 μ z gęstością powierzchniowa 89 ©π? i suszy się.

B. Do zlewki wprowadza się następujące składniki jako czyste substancje lub jako macierzyste roztwory w następującym składzie i miesza się:

woda	579,7 g
wodorotlenek sodu	3,4 g
Gantrez® (kopolimer eteru metylowo-
winylowego i kwasu maleinowego)	13,8 g
N-oktanoilo-N-metylo-glukamid	3,6 g
chlorek tetraetyloamoniowy	9,7 g
poliwinylopirolidon (c.cząst. 25000)	20,2 g
dwutlenek tytanu	177,1 g
ziemia okrzemkowa	55,3 g
dyspersja polipropionianu winylu
(50% wagowych w wodzie)	70,6 g
sól sześciosodowa kwasu 2,18-
fosforo-molibdenowego	44,3 g

190 139 żelazicyjanek (HI) potasu heksanol-1 l -metoksy-propanol-2

0,3 g 1,6 g

20,4 g

Przy pomocy NaOH wartość pH ccłej masy doprowadza się do około 6),oozzmnnappisaną w p. A folię poliwęglanową nanosi się z gęstościąpowjerecłnriową KM g/m² i suszysiz·

Pasek o szerokości 5 mm tak wytworzonej warstwy wykrywania od strony folii nakleja się pasując dokładnie na sprasowaną z warstwą nośną dwustronnie klejącą taśmę.

Bezpośrednio na folii nośnej, odgraniczając warstwę wykrywania, po obu stronach nakleja się jako podkładki dystansowe obustronnie klejące paski (nośnik PCW i klej z naturalnego kauczuku). W niniejszym przykładzie jedna z podkładek dystansowych ma szerokość 6 mm, a druga 9 mm. Następnie z obu dwustronnie klejących taśm klejących ściąga się folię ochronną.

Na to połączenie nakłada się impregnowaną środkiem zwilżającym żółtą, jednonitkową tkaninę poliestrową o dużych oczkach Scrynel PE 280 HC (Zuericher Beuteltuchfabrik, Rueschlikon, Szwajcaria) i skleja się przez prasowanie.

Na żółtą siatkę nakleja się dwie jednostronnie klejące taśmy jako pokrycie (nośnik PCW i klej z naturalnego kauczuku) tak, aby podkładki dystansowe były całkowicie pokryte i co najmniej nieco zachodziły jeszcze na region reakcyjny. W ten sposób kończy się wytwarzanie wyrobu w postaci taśmy.

Taśmę tnie się na nośniki testowe o szerokości 6 mm tak, aby otwór pomiarowy w nośniku testowym znajdował się po środku.

Przykład 2

Niezależność od hematokrytu nośnika testowego według wynalazku

Nośniki z przykładu 1 można poddać pomiarowi w fotometrze refleksyjnym. Wartości remisji, które są miarą intensywności zabarwienia, w oparciu o krzywą kalibrowania mogą być przeliczone na stężenia glikozy. W przypadku użycia terminu „względna remisja”, odnosi się on do suchego nośnika testowego.

A. Krzywe kalibrowania uzyskuje się w taki sposób, że poddaje się pomiarowi dużą liczbę krwi naczyniowej o różnych stężeniach glikozy. Z wartości remisji i wykrytych metodą porównawczą stężeń glikozy w tych próbkach krwi można wykreślić krzywą kalibrowania.

W pierwszym wariancie kalibrowania 10 pi krwi naczyniowej nanosi się na nośnik testowy według przykładu 1 i po 21 sekundach odczytuje się remisję. Z uśrednionych remisji z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi, drogą rachunku regresyjnego, ustala się krzywą kalibrowania 1 (fig. 6).

W drugim wariancie kalibrowania na nośniki według przykładu 1, nanosi się również 10 pi krwi naczyniowej i po 30 sekundach odczytuje się remisję. Z uśrednionych remisji z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi, drogą rachunku regresyjnego, ustala się krzywą kalibrowania 2 (fig. 7).

W trzecim wariancie kalibrowania na nośniki testowe według przykładu 1 nanosi się również 10 pi krwi naczyniowej i odczytuje się remisję w odstępach 3 sekundowych. Pomiar przerywa się kiedy różnice remisji dwukrotnie kolejno będą mniejsze niż 0,3, a wartość remisji przyjmuje się do obliczenia. Z uśrednionych remisji z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi, drogą rachunku regresyjnego, ustala się krzywą kalibrowania 3 (fig. 8).

W czwartym wariancie kalibrowania na nośniki testowe według przykładu 1 nanosi się również 10 pl krwi naczyniowej i odczytuje się remisję w odstępach 3 sekundowych. Pomiar przerywa się kiedy różnice remisji dwukrotnie kolejno będą mniejsze niż 0,9, a wartość remisji przyjmuje się do obliczenia. Z uśrednionych remisji z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi, drogą rachunku regresyjnego, ustala się krzywą kalibrowania 4 (fig. 9).

B. W wariancie pomiaru 1 na nośniki testowe według przykładu 1 nanosi się 10 pi krwi naczyniowej i odczytuje się remisje po 21 sekundach. Poszczególne remisje przelicza się na stężenia glikozy z odpowiadającymi krzywej kalibrowania z fig. 6. Z uśrednionych stężeń z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi ustala się prawidłowość odchyleń, co przedstawia tabela 1.

W wariancie pomiaru 2 na nośniki według przykładu 1 nanosi się również 10 pl krwi naczyniowej i odczytuje się remisję po 30 sekundach. Poszczególne remisje przelicza się na stężenia glikozy z odpowiadającymi krzywej kalibrowania według fig. 7. Z uśrednionych stę190139 żeń z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi ustala się prawidłowość odchyleń, co przedstawia tabela 2.

W wariancie pomiaru 3 według wynalazku na nośniki testowe według przykładu 1 nanosi się również 10 pl krwi naczyniowej i odczytuje się remisję w odstępach 3 sekundowych. Pomiar przerywa się kiedy różnice remisji dwukrotnie kolejno będą mniejsze niż 0,3 i wartość remisji przyjmuje się do obliczenia. Poszczególne remisje przelicza się z odpowiadającymi z krzywej kalibrowania według fig. 8 na stężenia glikozy. Z uśrednionych stężeń z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi ustala się prawidłowość odchyleń, co przedstawia tabela 3.

W wariancie pomiaru 4 według wynalazku na nośniki testowe według przykładu 1 nanosi się również 10 pl krwi naczyniowej i odczytuje się remisję w odstępach 3 sekundowych. Pomiar przerywa się kiedy różnice remisji dwukrotnie kolejno będą mniejsze niż 0,9 i wartość remisji przyjmuje się do obliczenia. Poszczególne remisje z odpowiadającymi z krzywej kalibrowania według fig. 9 przelicza się na stężenia glikozy. Z uśrednionych stężeń z 10 nośników testowych i wartości porównawczych próbek krwi ustala się prawidłowość odchyleń, co przedstawia tabela 4.

Tabela 1

Zależność od hematokrytu w wariancie pomiaru 1

Krew z 30% hematokrytu	Krew z 57% hematokrytu
zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 1	procentowe odchylenie od wartości porównawczej	zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 1	procentowe odchylenie od wartości porównawczej
50,1	88,5	7,3	61,6	56,3	-31,5
44,2	111,0	4,9	54,3	75,3	-17,1
37,8	143,2	3,9	45,8	104,4	-20,4
30,1	197,4	2,9	36,6	150,6	-20,7
21,1	294,7	4,6	28,3	213,8	-20,5

Tabela 2

Zależność od hematokrytu w wariancie pomiaru 2

Krew z 30 % hematokrytu	Krew z 57 % hematokrytu
zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 2	procentowe odchylenie od wartości porównawczej	zmierzona względna remisja \|%1	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 2	procentowe odchylenie od wartości porównawczej
45,6	85,8	4,0	54,8	60,5	-25,6
39,7	107,6	1,6	48,3	77,6	-24,5
33,6	137,2	-0,5	39,0	110,4	-15,8
25,4	193,4	0,9	30,0	159,1	-16.2
16,3	295,9	5,0	22,0	226,3	-15,9

190 139

Tabela 3

Kompensacja zależności od hematokrytu przez wariant pomiaru 3 według wynalazku

Krew z 30% hematokrytu	Krew z 57% hematokrytu
zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 3	procentowe odchylenie od wartości porównawczej	zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 3	procentowe odchylenie od wartości porównawczej
43,3	82,3	- 0,2	46,7	72,4	1,0
37,5	102,6	-3,0	40,6	91,3	0,6
30,6	134, 1	-2,7	29,6	139,4	6,2
10,8	274,6	-2,5	11,7	265,8	-1,2

Tabela 4

Kompensacja zależności od hematokrytu przez wariant pomiaru 4

Krew z 30% hematokrytu	Krew z 57% hematokrytu
zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 4	Procentowe odchylenie od wartości porównawczej	zmierzona względna remisja [%]	wyliczone stężenie według krzywej kalibrowania 4	procentowe odchylenie od wartości porównawczej
44,2	84,1	1,9	48,8	70,3	-2,0
38,6	104,6	-1,2	42,8	88,8	-2,2
32,2	133,6	-3,1	33,3	128,1	-2,4
22,6	195,5	2,0	22,8	194,3	2,3
13,5	296,4	5,2	15,4	269,7	0,3

190 139

CO • rH c

CO

O

Ch _D

CO ro >5

N

In v

190 139

CM ro ł

c fD

O .o co je

CO

N

U

Sć

190 139

Krzywa kalibrowania

190 139

Krzywa kalibrowania

Az

o o

CD

O o

U·} o

o

CN

O

O o

o co

Cl· e

c ω

fN o?

m eCsimaa eupS-[6zM

190 139

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Diagnostyczny nośnik testowy do oznaczania analitu w pełnej krwi przy pomocy zawartego w nośniku układu reakcyjnego, który zawiera reagenty tworzące zabarwienie, z polem testowania, na którego stronę nanoszenia próbki wprowadza się próbkę krwi, i na którego stronie wykrywania następuje wykrywalna optycznie zmiana zabarwienia, i które jest tak zbudowane, że zawarte w próbce erytrocyty nie dostają się na stronę wykrywania, znamienny tym, że pole testowania (1) obejmuje przezroczystą folię (2) i naniesioną na nią pierwszą (3) i znajdującą się na niej drugą warstwę folii (4), przy czym znajdująca się na przezroczystej folii pierwsza warstwa (3) w stanie wilgotnym jest mniej rozpraszająca światło niż leżąca na niej druga warstwa (4), oraz że strona folii, na którą naniesiona jest pierwsza warstwa (3), stanowi stronę wykrywania (6), a strona drugiej warstwy leżąca po przeciwnej stronie, którą druga warstwa (4) styka się z pierwszą (3), stanowi stronę nanoszenia próbki (5).
2. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1, znamienny tym, że druga warstwa (4) zawiera pigment o współczynniku załamania co najmniej 2,5 w stężeniu co najmniej 25% wagowych, licząc na wysuszoną podwójną warstwę folii.
3. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1, znamienny tym, że obie warstwy folii utworzone są z emulsji lub dyspersji polimerycznego materiału błonotwórczego, która w homogenicznym rozprowadzeniu zawiera polimeryczny materiał błonotwórczy i środek spęczniający, przy czym zdolność spęczniania środka spęczniającego jest na tyle wysoka, że optycznie wykrywalna zmiana zabarwienia po stronie wykrywania daje się mierzyć po najwyżej jednej minucie.
4. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 2, znamienny tym, że obie warstwy folii utworzone są z emulsji lub dyspersji polimerycznego materiału błonotwórczego, która w homogenicznym rozprowadzeniu zawiera polimeryczny materiał błonotwórczy i środek spęczniający, przy czym zdolność spęczniania środka spęczniającego jest na tyle wysoka, że optycznie wykrywalna zmiana zabarwienia po stronie wykrywania daje się mierzyć po najwyżej jednej minucie.
5. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że warstwy folii jako pigmenty zawierają: pierwsza (3) glinokrzemian sodowy, a druga (4) dwutlenek tytanu.
6. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że obie warstwy (3, 4) folii zdolne są do oddzielania erytrocytów.
7. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 5, znamienny tym, że obie warstwy (3,4) folii zdolne są do oddzielania erytrocytów.
8. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 7, znamienny tym, że łączna grubość pierwszej (3) i drugiej warstwy (4) folii w stanie wysuszonym wynosi maksymalnie 0,20 mm, korzystnie maksymalnie 0,12 mm, a szczególnie korzystnie maksymalnie 0,08 mm.
9. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 6, znamienny tym, że łączna grubość pierwszej (3) i drugiej warstwy (4) folii w stanie wysuszonym wynosi maksymalnie 0,20 mm, korzystnie maksymalnie 0,12 mm, a szczególnie korzystnie maksymalnie 0,08 mm.
10. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 8, znamienny tym, że druga warstwa (4) folii jest 2 do 5 razy grubsza niż pierwsza (3).
11. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 9, znamienny tym, że druga warstwa (4) folii jest 2 do 5 razy grubsza niż pierwsza (3).
12. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 7, albo 10, albo 11, znamienny tym, że tworzący zabarwienie reagent znajduje się w pierwszej (3) warstwie folii.
13. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 8, znamienny tym, że tworzący zabarwienie reagent znajduje się w pierwszej (3) warstwie folii.

190 139
14. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 7, albo 10, albo 11, albo 13, znamienny tym, że składniki układu reakcyjnego rozdzielone są na obie (3, 4) warstwy folii.
15. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 12, znamienny tym, że składniki układu reakcyjnego rozdzielone są na obie (3, 4) warstwy folii.
16. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 14, znamienny tym, że warstwy folii zawieraaąniehemolizujące środki zwilżające.
17. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 7, albo 10, albo 11, albo 13, albo 15, znamienny tym, że warstwy folii zawierają niehemolizujące środki zwilżające.
18. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 7, albo 10, albo 11, albo 13, albo 15, albo 16, znamienny tym, że co najmniej jedna warstwa folii jako środek zwilżający zawiera N-oktanoilo-N-metylo-glukamid.
19. Diagnostyczny nośnik testowy według zastrz. 17, znamienny tym, że co najmniej jedna warstwa folii jako środek zwilżający zawiera N-oktanoilo-N-metylo-glukamid.
20. Sposób oznaczania analitu w pełnej krwi przy pomocy nośników testowych z polem testowania, znamienny tym, że krew doprowadza się na stronę nanoszenia próbki pola testowania nośnika określonego w zastrz. 1 i następnie po stronie wykrywania obserwuje się tworzenie się zabarwienia w reakcji barwnej, przy czym mierzy się intensywność otrzymanego zabarwienia i przelicza na stężenie analitu we krwi.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że po stronie wykrywania obserwuje się tworzenie się zabarwienia w sposób ciągły lub z przerwami.
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obserwację prowadzi się aparaturowo, przy czym dokonuje się szeregu pomiarów intensywności zabarwienia aż do jednokrotnego przekroczenia ustalonej uprzednio absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach.
23. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że obserwację prowadzi się aparaturowo, przy czym dokonuje się szeregu pomiarów intensywności zabarwienia, aż do wielokrotnego przekroczenia uprzednio ustalonej absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach.
24. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że po jednorazowym lub wielokrotnym przekroczeniu ustalonej absolutnej lub procentowej różnicy w następujących po sobie pomiarach intensywności zabarwienia, następuje dalsza reakcja następcza.
25. Sposób według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że pomiar intensywności zabarwienia dokonuje się reflektometrycznie, a ostatnią zmierzoną wartość w szeregu pomiarowym stosuje się do matematycznego obliczenia stężenia analitu w analizowanej próbce.
26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że pomiar intensywności zabarwienia dokonuje się reflektometrycznie, przy czym ostatnią zmierzona wartość w szeregu pomiarowym stosuje się do matematycznego obliczenia stężenia analitu w analizowanej próbce.

Wynalazek dotyczy diagnostycznego nośnika testowego i sposobu oznaczania przy pomocy zawartego w nośniku testowym układu reagentów, który obejmuje reagenty tworzące zabarwienie, z polem testowania, które posiada stronę podawania próbek, na którą wprowadza się próbkę krwi, i stronę wykrywania, na której wskutek reakcji analizowanego materiału z układem reagentów ma miejsce optycznie wykrywalna zmiana, i które jest tak uformowane, że zawarte w próbce erytrocyty nie przechodzą na stronę wykrywania.

Do jakościowego i ilościowego oznaczania składników płynów ustrojowych, zwłaszcza krwi, często stosuje się tak zwane związane z nośnikiem testy. Występują w nich reagenty lub odpowiednie warstwy stałego nośnika testowego, które doprowadza się do kontaktu z próbką. Reakcja ciekłej próbki i reagentów prowadzi do powstania wykrywalnego sygnału, zwłaszcza do zmiany zabarwienia, który daje się ocenić wizualnie lub przy pomocy przyrządu, najczęściej drogą fotometrii refleksyjnej.

190 139

Nośniki testowe najczęściej są uformowane jako taśmy testowe, które składają się głównie z wydłużonej warstwy nośnej z tworzywa sztucznego i naniesionych na nią pól testowania z jedną lub wieloma warstwami wykrywania. Znane są jednak również nośniki testowe, uformowane jako kwadratowe lub prostokątne płytki.

Związane z nośnikiem testy charakteryzują się zwłaszcza prostotą posługiwania się nimi. Niestety, w wielu znanych nośnikach testowych krew jako ciecz badana nie może być bezpośrednio stosowana jako krew pełna. W wielu przypadkach konieczne jest oddzielenie czerwonych ciałek krwi (erytrocytów) w celu uzyskania bezbarwnej plazmy względnie surowicy. Zwykle robi się to przez wirowanie. Związane jest to jednak z dodatkowymi etapami czynności, które wymagają stosunkowo znacznych ilości krwi i kosztownej aparatury.

Nie brakowało prób opracowania nośników testowych, które umożliwiałyby oznaczania analitu bezpośrednio z krwi. Można przy tym wyróżnić dwie zasadniczo różne grupy rozwiązań.

W pierwszej grupie rozwiązań wizualna lub aparaturowa ocena zmiany zabarwienia następuje na tej samej stronie, na którą nanoszona jest próbka. Pole testowania jest przy tym tak uformowane, że analizowany materiał z próbki przez górną powierzchnię pola testowania kieruje się do reagentów, podczas gdy erytrocyty zostają zatrzymane. Po określonym czasie próbkę krwi spłukuje się lub zmywa się z górnej powierzchni pola testowania i obserwuje się zmianę zabarwienia. Przykłady takich nośników testowych opisane są w US-A-3 630 957 i w EP-A-0 217 246.

W drugiej grupie rozwiązań próbkę nanosi się na jedną stronę nośnika testowego (strona nanoszenia próbki), a zmianę zabarwienia rejestruje się na drugiej stronie (stronie wykrywania). Wyraźna zaleta tego sposobu postępowania polega na tym, że nie ma potrzeby spłukiwania lub zmywania krwi. Stąd takie nośniki testowe określa się również jako niezmywalne nośniki testowe.

Ze zmywaniem wiąże się nie tylko uciążliwy etap postępowania, ale również możliwe źródło błędów, które może wynikać stąd, że moment kiedy krew musi być usunięta nie jest dokładnie przestrzegany, a z drugiej strony ta grupa rozwiązań jest szczególnie trudna do realizacji. Konieczny jest filtr erytrocytów, który z jednej strony zatrzymywałby niezawodnie intensywnie zabarwione składniki krwi, a z drugiej strony pozwalałby na całkowite i szybkie przechodzenie analizowanego materiału. Okazało się wyjątkowo trudne opracowanie konstrukcji pola testowania, które spełniałoby takie wymagania.

Z EP-A-0 045 476 znane jest zastosowanie w nośnikach testowych włókien szklanych do odzyskiwania surowicy lub plazmy. Rozwiązanie to jest wprawdzie dość uniwersalne do stosowania, jednak wymagany jest odpowiedni sposób nanoszenia na nośnik testowy warstw włókna szklanego. Wynika stąd stosunkowo skomplikowana budowa nośnika testowego, a sposób wytwarzania jest kosztowny. Poza tym warstwa włókna szklanego absorbuje ciecz, która jest już nieobecna w warstwie wykrywania. Powoduje to zapotrzebowanie na stosunkowo duże objętości próbek.

W EP-A-0 302 287 przedstawiono pole testowania, stanowiące połączenie warstw, które tworzy się przez pokrywanie na mokro warstwy wykrywania, zawierającej reagenty tworzące zabarwienie, na stronie nanoszenia próbek zwróconej do warstwy podstawowej. Warstwa podstawowa zawiera polimeryczny materiał błonotwórczy, ziemię okrzemkową i pigment. Warstwa wykrywania zawiera polimeryczny materiał błonotwórczy, który przy pokrywaniu na mokro częściowo wnika w warstwę podstawową i tworzy strefę przejściową, w której erytrocyty są zatrzymywane. Jak wynika z przykładów, warstwa zawierająca pigment jest jednak dziesięciokrotnie grubsza niż warstwa wykrywania. Ma to znaczący wpływ na objętość takiego pola testowania.

Ponieważ strefa przejściowa pomiędzy warstwą zawierającą pigment i warstwą wykrywania służy jako strefa zatrzymywania erytrocytów, musi to być warstwa o stosunkowo dużej objętości (warstwa zawierająca pigment) wypełnionej cieczą, zanim warstwa wykrywania zostanie napełniona cieczą.

Ponieważ żaden z wcześniej znanych nośników testowych NW, z oddzielaniem erytrocytów nie wykazuje pod jakimkolwiek względem zadowalających właściwości, w znajdującym się na rynku rozwiązaniu takiego nośnika testowego zrezygnowano całkowicie z oddzielania ery190 139 trocytów, a zakłócenia wywołane przez intensywnie czerwone zabarwienie skompensowano techniką pomiarową przez pomiar przy dwóch różnych długościach fali. Prowadzi to jednak do znacznego wzrostu kosztów, przy czym nie jest możliwa wizualna kontrola zmian barwy.

Zadaniem wynalazku jest dostarczenie prostego w wytwarzaniu nośnika testowego, przy pomocy którego możliwe byłoby proste i szybkie oznaczanie, analitu w pełnej krwi. Takie oznaczanie powinno być przeprowadzane z próbką krwi o możliwie najmniejszej objętości, ale powinno być wszakże niezależne od hematokrytu. Takie proste oznaczanie, powinno obejmować wizualną ocenę stężenia oznaczania analitu.