PL181092B1

PL181092B1 - Związek o obwodowych efektach znieczulających i kompozycja farmaceutyczna o obwodowej aktywności przeciwbólowej

Info

Publication number: PL181092B1
Application number: PL95315947A
Authority: PL
Inventors: William Brown; John Dimaio; Peter Schiller; Renée Martel
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-15
Publication date: 2001-05-31
Also published as: ATE217011T1; ES2176322T3; CZ239196A3; NZ281742A; IS4261A; DE69526577T2; CA2181367A1; FI963252A0; DE69526577D1; CZ288523B6; JPH09509168A; EP0746567B1; FI963252A; HRP950413A2; NO963464L; EP0746567A1; SK93596A3; HU9602281D0; HUT74731A; PL315947A1

Abstract

1. Zwiazek o obwodow ych efektach znieczulajacych o w zorze (1) H-R1 -R2-R3-Q-R4-NH2 (1) w którym Q oznacza wiazanie amidowe; R 1 oznacza reszte tyrozylowa; R 2 oznacza D-seryne, D-arginine, D-norw aline; R 3 oznacza fenyloalanine; R4 oznacza fenyloalanine albo jego farm ace- utycznie akceptowalna sól. 5. Kom pozycja farm aceutyczna o obwodowej aktywnosci przeciwbólowej obejm ujaca sub- stancje czynna i farm aceutycznie akceptowalny nosnik, zn am ien n a tym , ze jako substancje czynna zawiera co najmniej jeden zw iazek wybrany sposród zwiazków o w zorze ( 1 ), H-R1 -R2-R3-Q-R4-NH2 (1) w którym Q oznacza wiazanie amidowe; R 1 oznacza reszte tyrozylowa; R 2 oznacza D-seryne, D -arginine, D -norw aline; R 3 oznacza fenyloalanine; R 4 oznacza fenyloalanine albo jeg o farm ace- utycznie akceptowalna sól. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąnowe związki o obwodowych efektach znieczulających i kompozycja farmaceutyczna o obwodowej aktywności przeciwbólowej.

Wiele endogennych peptydów pochodzących od ssaków i płazów wiąże się ze specyficznymi receptorami opioidów i wywołuje znieczulającą odpowiedź podobną do klastycznych narkotycznych opiatów. Wiele różnych typów receptorów opioidów okazało się współwystępować u zwierząt wyższych. Np., patrz W. Martin i in., J. Pharmacol., Exp. Ther., 197 str. 517(1975); i J. Lord i in., Nature (London), 257, str. 495(1977). Zidentyfikowano 3 różne typy receptorów opioidów. Pierwszy, 8, wykazuje odróżniające go powinowactwo do enkefalinopodobnych peptydów. Drugi, μ, wykazuje polepszoną selektywność wobec morfiny i innych policykłicznych alkaloidów. Trzeci, k, wykazuje jednakowe powinowactwo do obu grup wyżej wymienionych ligandów i preferencyjne powinowactwo do dynorfiny. Ogólnie, receptory μ wydają się być bardziej związane z efektami znieczulającymi. Receptory 8 wydają się mieć do czynienia z efektami behawioralnymi, chociaż receptory δ i kmogą także pośredniczyć w znieczulaniu.

Każdy receptor opioidów, gdy sprzęga się z opiatem, wywołuje specyficzną biologiczną odpowiedź właściwą dla typu receptora. Gdy opiat aktywuje więcej niż jeden receptor, wywiera wpływ na biologiczną odpowiedź każdego receptora, wytwarzając efekty uboczne. Im mniej specyficzny i selektywny jest opiat, tym większa jest możliwość spowodowania zwiększonych efektów ubocznych przy podawaniu opiatu.

Dotychczas opiaty, opioidowe peptydy, i ich analogi, albo nie wykazały, albo wykazały ograniczoną specyficzność i selektywność wobec typu receptora, lub receptorów, z którymi się wiążą.

Pierwszorzędowym miejscem działania znieczulających opioidów jest centralny układ nerwowy (CNS). Konwencjonalne narkotyczne środki znieczulające sąnormalnie dość hydro181 092 fobowe i stąd doskonale nadają się do przenikania lipidowych membran, takich jak bariera krew-mózg. Dzięki fizycznej zdolności, środki znieczulające starają się wiązać z receptorami opioidów w centralnym układzie nerwowym w mózgu. Jednak, niekoniecznie wiążą się z jednakowym podtypem receptorów. Takie wiązanie powoduje występowanie medycznie niepożądanych efektów ubocznych.

Opiaty mogą powodować poważne i potencjalnie śmiertelne efekty uboczne. Efekty uboczne takie jak depresja oddechowa, tolerancja, fizyczne uzależnienie i objaw przyspieszonego odstawienia są spowodowane niespecyficznymi oddziaływaniami z receptorami centralnego układu nerwowego. Patrz K. Budd, w Intemational Encyclopedia of Pharmacology i Therapeutics, wyd. N. E. Williams i H. Wilkinson, Pergammon: (Oxford), 112, str. 51 (1983). Dlatego opioidowe środki znieczulające działające głównie przez receptory opioidów w obwodowym układzie nerwowym nie będą prawdopodobnie powodowały podobnych niechcianych efektów ubocznych jak związane z opioidowymi środkami znieczulającymi działającymi na centralny układ nerwowy. Opioidowe peptydy według wynalazku zasadniczo działają na obwodowy układ nerwowy, a więc przezwyciężają wady niektórych, z konwencjonalnych opiatów zasadniczo zapobiegając wystąpieniu niechcianych efektów ubocznych.

Obecnie, jedną z kilku klas środków znanych z wywierania obwodowych efektów znieczulającąsąniesterydowe środki przeciwzapalne, takie jak aspiryna, ibuprofen i ketorolak. Te środki nie oddziałują z receptorami opioidów, ale wiadomo, że inhibitującyklooksygenazę i osłabiają syntezę prostaglandyny. Te słabe środki znieczulające nie wykazują mediowanych centralnie efektów ubocznych, ale mogą powodować inne efekty uboczne takie jak owrzodzenie dróg żołądkowo-jelitowych. Przedmiotem wynalazku są podobne do opioidów peptydy, działające obwodowo i zasadniczo unikające niechcianych efektów ubocznych związanych z konwencjonalnymi obwodowo działającymi środkami znieczulającymi.

Ostatnio wykazano, że istnieje znacząca obwodowa znieczulająca aktywność opiatowych leków. Patrz A. Barber i R. Gottschlich, Med. Res. Rev., 12, str. 525 (1992) i C. Stein, Anasth. Analg., 76, str. 182 (1993). Czwartorzędowe sole znanych centralnie działających opioidowych alkaloidów stosowano jako farmakologiczne sondy dla odróżniania znieczulających odpowiedzi obwodowych i centralnych. Czwartorzędowe sole silnych opiatów mają trwały dodatni ładunek i wykazują ograniczoną penetrację bariery krew-mózg. Patrz T. W. Smith i in., Life Sei, 31, str. 1205 (1982); T. W. Smith i in., Int. J. Tiss. Reac., 7, str. 61 (1985); B. B. Lorenzetti i S. H. Ferreira, Braz. J. Med. Biol. Res., 15, str. 285 (1982); D. R. Brown i L. I. Goldberg, Neuropharmacol., 24. str. 181 (1985); G. Bianchi i in., Life Sei., 30, str. 1875 (1982); i J. Russel i in., Eur. T. Phannacol., 78, str. 255 (1982). Wytworzono silnie polarne analogi enkefalin i dermorfin zachowujące przeciwnocyceptywną aktywność, ale wykazujące ogramczoną penetrację centralnego układu nerwowego. Patrz R. L. Folienfant i in., Br. T. Pharmacol., 93, str. 85 (1988); G. W. Hardy i in., J. Med. Chem., 32, str. 1108 (1989). Przeciwnie, dotychczas lipofilowe opioidowe peptydy uważano za łatwo penetrujące barierę krew-mózg. Zaskakująco, opioidowe peptydy według wynalazku są silnie lipofilowe, ale nie penetrują znacząco bariery krew-mózg.

W odróżnieniu od konwencjonalnych opiatów, opioidowe peptydy sąhydrofobowe. Ich hydrofobowość zdaje się polepszać szybkość ich usuwania z ciała ssaka. Hydrofobowość zwiększa zdolność tych peptydów do przekraczania nabłonkowych barier. Pomimo tego, podawanie opioidowych peptydów do ciała ssaka okazało się wpływać na centralny układ nerwowy. Włożono dlatego wiele wysiłku w polepszenie absorpcyjnych właściwości tych związków. Badacze starali się zmniejszyć penetrację peptydów w centralny układ nerwowy, szczególnie gdy przedłużone działanie na ciało tych związków mogło spowodować niepożądane efekty uboczne lub nawet działanie toksyczne.

Sądzono, że niepolarne peptydy przechodzą łatwiej do centralnego układu nerwowego niż polarne dzięki przekraczaniu bariery krew-mózg. Opisano, że TAPP (H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂) wykazuje przeciwnocyceptyczne właściwości obwodowo i centralnie (P. Schiller i in., Proceedings of the 20^th European Peptide Symposium 1988). W przeciwieństwie do tego, wynalazcy stwierdzili, że ten tetrapeptyd TAPP (H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NI^) nie działa centralnie. Wynik

181 092 uzyskano dzięki brakowi znieczulającego efektu nawet przy dawkach 100 mg/kg u myszy w teście z gorącąpłytą. Testjest standardowy i znany fachowcom. Test wykrywa związki chemiczne wywierające centralnie mediowaną odpowiedź znieczulającą.

Termin „specyficzność” użyty w tym zgłoszeniu odnosi się do konkretnego lub definitywnego wiązania opiatu lub opioidu do jednego konkretnego receptora opioidów w porównaniu z innym receptorem opioidów. Specyficzność opioidowego peptydu jest wskazywana przez stałą inhibicji wiązania, Kj. Termin „selektywność” odnosi się do zdolności opiatu lub opioidowego peptydu do rozróżnienia pomiędzy kilku receptorami opioidów i do wiązania tylko z jednym szczególnym receptorem. Selektywność opioidowego peptydu wobec receptora μ wskazywana jest przez stosunek stałych inhibicji wiązania. Na przykład, stosunek stałych inhibicji wiązania, Κ^δ/Κ,^μ, jest wartością, której można użyć do pomiaru selektywności. Stosunek ten reprezentuje zależność powinowactw do wiązania do receptorów μ i δ. Wyższa wartość tego stosunku wskazuje na większąpreferencję ligandu do wiązania się z receptorem μ niż δ. Jeden z konwencjonalnych analogów opioidowych peptydów, H-Tyr-D-Ala-Gli-Phe(NMe)-Gli-ol (DAGO), jest znany jako jeden z najbardziej selektywnych wobec μ analogów opioidowych peptydów. Peptyd ten wykazuje wartość Ki/K^ 1050. Leuenkefalina, z drugiej strony, wykazuje wartość Κ,δΚ^μ 0,2. Ta ułamkowa wartość odzwierciedla wyraźne powinowactwo do receptora ów porównaniu z μ.

Peptyd musi mieć pewne atrybuty farmakologicznej przydatności. Po pierwsze, peptyd powinien być odporny na degradację. Po drugie, peptyd powinien wywoływać polepszoną odpowiedź biologiczną. Po trzecie, peptyd musi być bezpieczny przy spożywaniu przez człowieka. Po czwarte, peptyd powinien być możliwy do zsyntetyzowania w ilościach dostatecznie dużych do zastosowania w badaniach klinicznych na toksyczność i później w produkcj i przemysłowej . W niniejszym przypadku, mniejsza rozpuszczalność w lipidach i większa w wodzie są też pożądanymi właściwościami dla peptydów, aby zapobiegać przenikaniu przez barierę krewmózg i umożliwiać szybkie wydalanie nadmiaru podanego peptydu i jego metabolitów. Następnie, dla peptydu byłoby pożądane wywoływanie selektywnej i specyficznej aktywności wiązania receptorów, w celu minimalizacji potencjalnych efektów ubocznych.

Istnieje zapotrzebowanie na peptydy, działające na jeden specyficzny receptor opioidów, konkretnie receptor μ. Byłoby pożądane znalezienie peptydów o mniejszej rozpuszczalności w lipidach niż konwencjonalne opiaty, aby nie była przekraczana bariera krew-mózg. Ponadto, peptydy o dużej polamości będązwykle lepiej rozpuszczalne w wodnych środowiskach o fizjologicznym pH. Ułatwiając wydalanie ich i ich metabolitów. Przedmiotem wynalazku jest nowy związek o obwodowych efektach znieczulających o wzorze (1)

H-Rl-R2-R3-Q-R4-NH2 (1) w którym Q oznacza wiązanie amidowe; Rj oznacza resztę tyrozylową; R₂ oznacza D-serynę, D-argininę, D-norwalinę; R3 oznacza fenyloalaninę; R₄ oznacza fenyloalaninę albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól.

Przedmiotem wynalazkujest także kompozycja farmaceutyczna o obwodowej aktywności przeciwbólowej obejmująca substancję czynnąi farmaceutycznie akceptowalny nośnik, w której substancję czynną stanowi co naj mniej j eden związek wybrany spośród związków według wynalazku albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól.

Związki według wynalazku są selektywne i specyficzne zasadniczo wobec jednego receptora opioidów. Związki te wykazuj ąpreferencyjną selektywność i specyficzność wobec receptora μ opioidów. Oddziaływująone przede wszystkim z receptorami opioidów na zakończeniach obwodowych nerwów i nie przekraczające zasadniczo bariery krew-mózg. Pozwalają więc na zredukowanie ostrości i ilości efektów ubocznych w porównaniu z efektami ubocznymi związanych z konwencjonalnymi opiatami i opioidowymi peptydami znanymi dotychczas.

Tablice i figury

Tablica 1 wylicza aktywność in vivo i in vitro hydrofobowych spokrewnionych z dermorfinami tetrapeptydów.

181 092

Figura lpokazuje przebieg czasowy znieczulającego efektu morfiny (10 mg/kg) (fig. A) i przykładowych badanych związków (fig. B: BCH2463; C: BCH2462; D. BCH2687).

Figura 2 pokazuje krzywe odpowiedzi na dawkę dla BCH2463 w teście indukowanych fenylochinonem spazmów (u myszy, podskórnie) ED50 = 0,5 mg/kg w 20 minut po podaniu.

Figura 3 pokazuje porównanie przebiegów czasowych znieczulania dla BCH1774 i BCH2463 w teście indukowanych fenylochinonem spazmów (u myszy, podskórnie)

Następujące pospolite skróty użyto w opisie i w zastrzeżeniach:

Abu - kwas aminomasłowy

Aib - kwas aminoizomaslowy

Ala - alanina

Chi - cyklohomolecyna

Arg - arginina

Cle - cykkkucyna

Cys(Bzl) - cysteina (benzylo)

Dmt - 2'6'-dimetylotyrozyl

Phe - fenykaainiina

Gin - gluam-mra

Glu - kwas ghthrniowy

Gli - giicyna

GPI - krętnica świnki nno:ri^liiej

His - histydyna

Hph - homofenyloalanina

Ile - izokucyna

Leu - kucyna

Met - metionina

MVD - naskniowód mysy

Nal -Γ- kb 2-^r^c^^klk^nn^a

Nie - norłeucyna

Nva - noiwaima

PBQ -fenylo-p-^errizochrnon

Phg - et^n^^k^glic^^i^a

Ser - seiyna

Tic - kwas tetrahydroizochinolino-3-karboksylowy

Tre - treonina

Trp - tryptoaan

Tyr - tyrozyna

TAPP - H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂

TSPP - H-Tyt-D-Set-Phe-Phe-NH2

Termin „ED₅0” występujący w tabeli 1 dla testu spazmów PBQ jest zdefiniowany jako dawka leku, indukuj ąca 5 0% zmniejszenie liczby obserwowanych spazmów w porównaniu z grupą kontrolną. Termin „ED50” użyty w teście gorącej płyty jest zdefiniowanyjako dawka leku wymagana do dwukrotnego zwiększenia czasu utajenia odpowiedzi w porównaniu z grupą kontrolną i określono go metodą analizy linii równoległych.

Termin „K,” oznacza stałą inhibicji wiązania. Termin „K^/K/¹” oznacza wartość, którą można użyć do mierzenia selektywności. Stosunek ten reprezentuje zależność powinowactw opioidowych peptydów do wiązania z receptorami μ i δ.

Wytworzono pewnąliczbę tetrapeptydów i ocenionojejako ligandy receptorów opioidów i systemowo działające środki znieczulające. Te związki wymieniono w tabeli 1 w raz z ich odpowiednimi stałymi inhibicji wiązania i stosunkami selektywności receptorów.

Wiele związków wymienionych w tabeli 1 wykazuje dobre wiązanie receptora μ, ale słaby efekt znieczulający w teście spazmów u myszy. Taka anomalia może być spowodowana gwałtownąproteolizą, gwałtownym rozcięciem, lub obydwoma. Np., gdy prototypowy lipofi6

181 092 lowy peptyd dermorfinowy TAPP (BCH1774) zetknięto z membranami rąbka szczoteczkowego nerki, zauważono jego szybką degradację w ciągu 15-30 minut. Spośród peptydów wymienionych w tabeli 1, trzy korzystne związki inne niż sam TAPP wykazują podwyższone działanie znieczulające in vivo. Te trzy związki to H-Tyr-D-Nva-Phe-Phe-NH₂ (BCH2462), H-Tyr-D-Ser-Phe-Phe-NH₂ (BCH2463) i H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH₂ (BCH2687). BCH2462, BCH2463 i BCH2687 jak pokazano, wykazują właściwości obwodowego działania przeciwbólowego. Nie zaobserwowano centralnego efektu znieczulającą dla tych trzech peptydów nawet przy dawkach 100 mg/kg w teście gorącej płyty u myszy.

Jak pokazano w tabeli 1, wartość ED₅₀ dla TAPP (BCH1774) wynosi 1,4. Odpowiednie wartości dla H-Tyr-D-Nva-Phe-Phe-NH2 (BCH2462), H-Tyr-D-Ser-Phe-Phe-NH (BCH2463) i H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH2 (BCH2687) wynoszą odpowiednio 2,7,0,5 i 0,5. Wartości ED₅0 dla pozostałych związków w tabeli 1 sąwyższe od tych liczb. Chociaż wartość ED₅₀BCH2813 wynosiła tylko 0,15, okazał się on działać centralnie przy dawkach około 40 mg/kg w teście gorącej płyty u myszy.

Wyniki te wskazują, że związki BCH1774, BCH2462 i BCH2463 wciąż podlegająproteolizie, ale mają dłuższy czas półtrwania, i są skuteczniejsze jako środki znieczulające. Na fig. 6, porównano czas trwania znieczulającego efektu in vivo wywołanego przez BCH1774 (TAPP) i BCH2463 (TSPP). Przy stosowaniu 30 mg/kg, podskórnie, BCH2463 i 20 mg/kg, podskórnie, BCH1774, fig. 3 wskazuje, że znieczulający efekt BCH1774 trwał dłużej niż dla BCH2463, wskazując prawdopodobnie na nieco przyspieszonąproteolizę in vivo BCH2463 w porównaniu z BCH1774.

Figura 1A-D pokazuje efekt działania morfiny, BCH2463 (TSPP), BCH2462 (TNPP) i BCH2687 u myszy określając reakcję myszy w teście gorącej płyty. Jak pokazano na fig. 1A, czas reakcji myszy potraktowanych 10 mg/kg morfiny wynosi około 17 s. Czas reakcji myszy potraktowanych 100 mg/kg BCH2463 (fig. 1B) wynosi około 9 s w porównaniu z kontrolną wartością około 7 s. Te wyniki wskazują, że podczas gdy morfina inhibituje termiczny nocyceptywny bodziec, BCH2463 nie czyni tego; ale BCH2463 jest silnym znieczulającym środkiem, jak pokazuje inhibicja chemicznie indukowanych spazmów (fig. 2). Czas reakcji myszy potraktowanych BCH2462 i BCH2687 (fig. 1C, 1D) wynosi około 8 s, co wskazuje na podobne wyniki, jak dla BCH2463.

Zbadano efekty inhibicji proteolitycznego metabolizmu BCH2463 inhibitora DL-Tiorfan i metabolicznego rozpadu BCH2463 mediowanego membranami rąbka szczoteczkowego nerki. Otrzymane dane wskazują, że nerka może być głównym miejscem pozbywania się i metabolizmu związku BCH2463. Z fig. 2 wynika, że endopeptydaaaEC24-11, inhibitowana przez DL-tiorfan, jest wstępnym mediatorem proteolizy BCH2463 przez ekstrakt rąbka szczoteczkowego nerki.

BCH1774 (TAPP) i BCH2463 (TNPP) wykazały letalne działanie na myszy przy podawaniu 1-5 mg/kg dożylnie w jednej dawce leku. W przeciwieństwie do tego BCH2463 (TSPP) niespodziewanie nie wykazał żadnego letalnego działania przy dawkach do 20 mg/kg dożylnie. Ponadto, peptydy były bezpieczne, gdy podawano je podskórnie przy dawkach większych niż 100 mg/kg. Tak więc właściwym sposobem podawania tych związków jest podawanie podskórne. Układ strukturalny przykładowego BCH1774 można zmodyfikować zachowując omijanie centralnego układu nerwowego nawet przy dawkach tak dużychjak 100 mg/kg podskórnie, i obniżając szkodliwą dożylną toksyczność. Tak więc BCH2463 nie jest letalny dla myszy przy dawkach co najmniej tak dużych jak 20 mg/kg¹ dożylnie.

Farmaceutycznie dopuszczalne sole peptydów według wynalazku można wytwarzać konwencjonalnie w reakcji z właściwym kwasem. Dogodne sole addycyjne kwasów można wytwarzać przez dodanie kwasów takich jak chlorowodorowy, bromowodorowy, fosforowy, octowy, fumarowy, salicylowy, cytrynowy, mlekowy, migdałowy, winowy, szczawiowy, metanosulfonowy i inne odpowiednie kwasy znane fachowcom.

Sposób uśmierzania bólu u zwierząt, takichjak ssaki, w tym ludzkie, obejmuje etapy podawania pacjentowi farmaceutycznie skutecznej ilości peptydu o wzorze 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli. Można też stosować kompozycję farmaceutyczną opisaną powyżej.

181 092

Następujące przykłady służą do lepszego opisania wynalazku. Przykłady te mają na celu tylko zilustrowanie, a nie ograniczenie wynalazku.

Przykłady

Opioidową aktywność peptydów oceniono in vitro stosując preparat podłużnego mięśnia krętnicy świnki morskiej (GPI) i ich przeciwnocyceptywną aktywność określono in vivo na modelach spazmów indukowanych PBQ (obwodowa aktywność) i w teście gorącej płyty (centralna aktywność) u gryzoni. Antagonizm przeciwnocycepcji obwodowego antagonisty opioidu N-metylonalorfiny i z porównania aktywności w testach spazmów i gorącej płyty wykazał, że znieczulające efekty były głównie mediowane w części obwodowej. Obwodowe działanie przeciwbólowe ujawnione dzięki silnemu działaniu w teście spazmów sprzężono z małą siłą w teście gorącej płyty.

Spazmy indukowane u myszy PBQ (fenylo-p-benzochinonem) jest potwierdzeniem zarówno centralnego, jak i obwodowego działania znieczulającego. Protokoły doświadczeń patrz Sigmund i in., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 95, str. 729 (1957), dołączany niniejszym jako odnośnik literaturowy. Centralne działanie znieczulające określono z inhibicji odpowiedzi w teście gorącej płyty u myszy. Protokoły doświadczeń patrz G. Woolfe i A. Macdonald, T. Pharmacol. Exp. Ther., 80, str. 300 (1944) dołączany niniejszym jako odnośnik literaturowy. Testy mierzące powinowactwa wiązania receptorów opioidów dla receptorów μ i δ, a także testy GPI i MVD wykonano zgodnie z protokołami doświadczeń podanymi w Schiller i in., Biophys. Res. Commun., 85, str. 1322 (1975) dołączanym niniejszym jako odnośnik literaturowy.

Związki według niniejszego wynalazku wytworzono stosując syntezę w fazie stałej opisaną poniżej i ogólnie znaną fachowcom.

Przykład 1. Synteza w fazie stałej opioidowych peptydów

Syntetyczne peptydy wytworzono stosując żywicę Rink (znak handlowy), żywicę 4-(2',4'-dimetok.sy-ffnylo-Fmoc-aminometylo)-ffnoksylową(Novabiochem of Advanced Chemtech) i odpowiednią C-terminalną resztę kwasu Na-Fmoc-L-aminowego każdego syntetyzowanego peptydu.

Wszystkie L- i D-aminokwasy (Novabίcchem od Advanced Chemtech) miały zabezpieczone Fmoc (9-flucreoylo-metokyykarbonylem) grupy a i następujące grupy zabezpieczające boczne łańcuchy: eter t-butylowy (tBu) dla seryny, t^^oniny i tyrozyny; ester t-butylowy (OtBu) dla kwasu aspartowego i gluOamowegc·; 0-butylokyykarbcnyl (tBoc) dla lizyny i 2,2,5,7,8-peotametylochromaoo-6-yulfonyl (pmc) dla argmmy i trityl (trt) dla cysteiny.

Dimetyloformamid (Anachemia) bez dimetyloaminy potraktowano aktywowanymi sitami molekularnymi 4A. Piperydynę (Advanced Chemtech) użyto bez dalszego oczyszczania. DCC (dicykloheksylokarbodilmid) i HOBt (hydroksybeozotriazol) otrzymano odpowiednio z Fluka i Advanced Chemtech.

Syntezę w fazie stałej peptydu prowadzono ręcznie na żywicy Rink (znak handlowy). Obciążenie wynosiło około 0,6 mmol/g. Kondensację peptydów prowadzono stosując: 1) sprzęganie: 2 równoważniki Fmoc-aminokwas, HOBt i DCC w DMF na 1 -4 godziny w temperaturze pokojowej. 2) rozprzęganie: 1 równoważnik Fmoc-amiookway, HOBt i DCC. 3) acetylowanie: 20% (objętościowo) (CH₃CO)₂O/DCM przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 4) odbezpieczenie N-a-Fmoc: 20% (objętościowo) piperydyny w DMF przez 25 minut.

Usuwanie bocznołańcuchowych grup zabezpieczających (tBu, Boc, Trt, Pmc) i odcinanie peptydu z żywicy prowadzono w mieszaninie zawierającej TFA (objętościowo) 55/5/40 TFA/αni:z-l/DCM przez 90 minut w temperaturze pokojowej podN2. Peptyd wytrącono z eteru dietylowego, przesączono i osuszono. Surowy peptyd oczyszczono i zanalizowano metodą HPLC na kolumnie z odwróconymi fazami z gradientowąelucją0,06% TFA/H2O i 0,06% TFA/acetonitry1.

Przykład 2. Test gorącej płyty

Pomiar aktywności znieczulającej

Dla celów testu użyto samce myszy CD #1 ważące pomiędzy 20 i 25 g.

Myszy zważono, oznakowano i podzielono na grupy po 10. Myszom zastrzyknięto podskórnie związek (lub wzorzec lub środowisko) przy' objętości równoważnej 0,1 ml/10 g po posiłku (10 ml/kg).

181 092

Jeśli stosowano związki antagonistyczne, takie jak Nalakson lub N-metylo-Lewalorfan, podawano je dootrzewnowo na 20 minut przed związkiem (lub wzorcem, lub środowiskiem). Objętość zastrzyku wynosiła 0,1 ml/10 g po posiłku. Dawka antagonisty wynosiła 10 mg/kg.

Myszy indywidualnie oceniono na czas reakcji na gorącej płycie. Temperaturę gorącej płyty (Sorel, model D537) ustawiono na 55°C. Mysz obserwowano szukając oznak niewygody takichjak lizanie lub otrząsanie łap, próby ucieczki (zeskakiwanie z płyty) lub drżenie. Czas reakcji przyjmowano, gdy pojawił się któryś z tych znaków i odnotowywano w „sekundach”. Każdą mysz obserwowano przez okres najwyżej 30 sekund, aby nie uszkadzać jej tkanki łap. Myszy obserwowano w różnych odstępach czasu po podaniu związku (lub środowiska, lub wzorca). Odstępy czasu mogły wynosić 30,60 lub 120 minut (lub być inne).

Dla każdego odczytu czasu, średni czas reakcji dla grupy kontrolnej mnożono przez 1,5. Czas reOkcji każdej potraktowanej myszy porównywano za „średniąkontrolnąx 1,5”. Jeśli czas reakcji był niższy od „średniej kontrolnej x 1,5”, mysz uważano za nie odczuwającą znieczulającego efektu. Jeśli czas reakcji był większy od „średniej kontrolnej x 1,5” mysz uważano za odczuwającą znieczulający efekt. Liczba znieczulonych myszy w grupie określała procent znieczulenia dla związku w tym odczycie. Jeśli procent znieczulenia był niższy niż 30%, związek uważano za nieaktywny.

Przykład 3. Test spazmów

Pomiar skręceń

Test prowadzono na samcach myszy CD #1 ważących pomiędzy 18 i 22 g. Myszy zważono i oznakowano. Myszom zastrzyknięto dootrzewnowo 0,3 ml/20 g roztworem fenylochinonu w stężeniu 0,02%. Zliczano skręcenia, które pojawiło się w czasie 15 minut po zastrzyku. Fenylochinon wstrzykiwano w odstępach czasowych 5,20 lub 60 minut po podaniu związku (lub środowiska, lub wzorca) podskórnie. Wstrzykiwano go w odstępach 60 minut po podaniu związku (lub środowiska, lub wzorca) doustnie.

Roztwór 0,02% fenylochinonu (2-fenylo-1,4-benzochinon (Sigma) wytworzono w następujący sposób. 20 mg fenylochinonu rozpuszczono w 5 ml etanolu 90% (Sigma, reagent, alkohol). Rozpuszczony fcnylochinon powoli dodano do 95 ml destylowanej wody wytrząsanej i wstępnie ogrzanej (bez gotowania). Roztwór fenylochinonu był przez cały czas zabezpieczony przed światłem i nowy roztwór wytwarzano każdego dnia testu. Wskazane jest odczekanie 2 godzin przed zastosowaniem roztworu fenylochinonu.

Test można prowadzić na 5 myszach jednocześnie. Każda grupa zwykle zawierała 10 myszy. Jeśli stosowano związki antagonistyczne, takie jak Nalakson, podawano je dootrzewnowo na 20 minut przed związkiem (lub wzorce, lub środowiskiem).

Tabela 1

BCH#	Sekwencja	k μ [nM]	κ,δκ,^μ [nM]	GPI (ICsc) [nM]	ED5o(PBQ) mg/kg (20 min)	Gorąca płyta mg/kg
1	2	3	4		56	7
1774	H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2	1,53	409	3	1,4	>100
753	H-Tyr-D-Phe-Phe-Phe-NH2	3,63	37,7	247	>20
754	H-Tyr-Aib-Phe-Phe-NH2			73	>20
755	H-Tyr-D-Nle-Phe-Phe-NH2	0,968	373	15	2,5 (5 min.)
756	H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2	4,10	182	15	>20
757	H-Tyr-D-Ala-Phe-2'-Nal-NH2	0,655	119	2	1,1 (5 min.)
758	H-Tyr-D-Ala-2'-Nal-1'-Nal-NH2	5,61	102	-	>20
1775	H-Tyr-D-Ala-D-Phe-Phe-NH2	26,0	82,7	925
1776	H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe(4-NO2)-NH2	0,509	129	8	4
1777	H-Tyr-D-Ala-Phe(4-NO2>-Phe(4-NQ2)-NH2	0,826	570	6	>20

181 092

Tabela - ciąg dalszy

1	2	3	4	5	6	7
1778	H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe(4-N₃)-NH2	1,49	107	50
1779	H-Tyr-D-Ala-Phe(4-NO₂)-Phe-NH2	56,8	24,3	77
1780	H-Tyr-D-Ala-Phe-Tic-NH₂	12,7	279	-
1781	H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe(NMe)-NH₂	22,6	215	241
1782	H-Tyr-D-Ala-Phe-1'-Nal-NH2	0,981	174	2	>20
1783	H-Tyr-D-Ala-1'-Nal-1 'NaI-NH2	2,88	410	-	>20
1784	H-Tyr-D-Ala-Trp-Phe-NH2	3,57	238	20	>20
1785	H-Tyr-D-Ala-Phe-Trp-NH2	2,21	214	16	>20
1786	H-Tyr-D-Ala-Trp-Trp-NH2	0,833	783		10
1787	H-Tyr-VAla-Phe-Phe-NH2				10
2202	PCH2Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH2				>10
2208	H-Tyr-D-Nle-Phe-Trp-NH2				>3
2211	H-Tyr-D-Nle-Phe-2'-Nal-NH2				>10
2212	H-Tyr-D-Nle-Trp-Phe-NH2				>10
2213	H-Tyr-D-Ala-Trp-2'-Nal-NH2				>5
2214	H-Tyr-D-Nle-Trp-2'-Nal-NH2				15
2217	H-Tyr-D-Nle-Trp-Trp-NH2				>5
2462	H-Tyr-D-Nva-Phe-Phe-NH2				2,7	>100
2463	H-Tyr-D-Ser-Phe-Phe-NH2	2,2		13	0,5	>100
2464	H-Tyr-D-Val-Phe-Phe-NH2				>10
2465	H-Tyr-D-Leu-Phe-Phe-NH2				>10
2473	H-Tyr-D-Ile-Phe-Phe-NH2				>10
2577	H-Tyr-D-Abu-Phe-Phe-NH2				>10
2578	H-Tyr-Chl-Phe-Phe-NH2				>10
2579	H-Tyr-Cle-Phe-Phe-NH2				>10
2687	H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH2	0,88	2480	8,71	0,5	>100
2690	H-Tyr-D-Cys-Phe-Phe-NH2				6,2	>100
2811	H-Tyr-D-Thr-Phe-Phe-NH2				12
2813	H-Dmt-D-Ser-Phe-Phe-NH2				0,15	-40
3237	H-Dmt-D-Ala-Phe-Phe-NH2	0,16	26,4	0,34
3238	H-Dmt-D-Ala-Phe-Phe-NH2	71,8	3,1
3240	H-Tyr-D-Ala-Phe-Cys(Bz 1)NH2	5,3	57,3	9,16
3241	H-Tyr-D-Arg-Phe-Cys(Bzl)NH2	6,95	46,8	33,05

181 092

FscfiA

Wpływ morfiny 10' mg/kg podskórnie na reakcje na gorącą płytę u myszy

Czas reakcji (s) _Czas reakcji (s)

1	- kontrolna N=10 ·	• - morfina lo mg,/kg
-

-
30	60	/20	/30

Czas spędzony na gorącej płycie po zastrzyku (minuty) ib

Wpływ BCH 2463 100 mg/kg podskórnie na reakcje na gorącą płytę u myszy 17 sierpnia 1993

Czas spędzony na gorącej płycie po zastrzyku (minuty)

181 092

Czas reakcji (s)

Czas spędzony na gorącej płycie po zastrzyku

Czas spędzony na gorącej płycie po zastrzyku (minuty)

181 092

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Związek o obwodowych efektach znieczulających o wzorze (1)

H-Ri-R₂-R3-Q-R4-NH2 (1) w którym Q oznacza wiązanie amidowe; R_t oznacza resztę tyrozylową; R₂ oznacza D-serynę, D-argininę, D-norwalinę; R₃ oznacza fenyloalaninę; IR oznacza fenyloalaninę albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól.
2. Związek o wzorze (1) według zastrz. 1, w którym R₂ oznacza D-norwalinę.
3. Związek o wzorze (1) według zastrz. 1, w którym R2 oznacza D-serynę.
4. Związek o wzorze (1) według zastrz. 1, w którym R2 oznacza D-argininę.
5. Kompozycja farmaceutyczna o obwodowej aktywności przeciwbólowej obejmująca substancję czynnąi farmaceutycznie akceptowalny nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera co najmniej jeden związek wybrany spośród związków o wzorze (1),

H-Ri-R₂-R3-Q-R4-NH2 (1) w którym Q oznacza wiązanie amidowe; R, oznacza resztę tyrozylową; R2 oznacza D-serynę, D-argininę, D-norwalinę; R3 oznacza fenyloalaninę; R4 oznacza fenyloalaninę albo jego farmaceutycznie akceptowalna sól.