PL175595B1 - Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidis - Google Patents
Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidisInfo
- Publication number
- PL175595B1 PL175595B1 PL93307745A PL30774593A PL175595B1 PL 175595 B1 PL175595 B1 PL 175595B1 PL 93307745 A PL93307745 A PL 93307745A PL 30774593 A PL30774593 A PL 30774593A PL 175595 B1 PL175595 B1 PL 175595B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- polysaccharide
- conjugate
- gcmp
- group
- fragment
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/095—Neisseria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis, stanowiacy polimeryczny nosnik kowalencyjnie sprzezony z polisacharydem meningokoków grupy C lub jego fragmentem, znamienny tym, ze zawiera O-deacetylowany O-acetylododatni polisacharyd meningokoków grupy C lub jego fragment, przy czym stopien O-deacetylacji polisacharydu lub jego fragmentu wynosi powyzej 80%. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis zawierający zmodyfikowane polisacharydy otoczkowe grupy C, sposób jego wytwarzania oraz zawierająca go szczepionka.
Neisseria meningitidis grupy C jest przyczyną procentowo znacznej ilości zachorowań na zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych w świecie. Obecne środki podejmowane w celu zapobiegania tej chorobie opierają się na szczepionkach zawierających oczyszczone polisacharydy otoczkowe grupy C. Szczepionki te są skuteczne u dorosłych, jednakże są słabo immunogenne u dzieci. Słabe rezultaty wśród niemowląt są bardzo niekorzystne, ponieważ ta część populacji wykazuje najwyższy poziom zachorowań na tego typu infekcje.
175 595
Polisacharyd meningokokowy grupy C (GCMP) jest słabym immunogenem, tak więc wiele pracy wkłada się w zwiększenie jego immunogenności w celu zwiększenia możliwości jego stosowania jako szczepionki. Jedną z możliwych metod osiągnięcia tego celu, która wydaje się być obiecująca, jest sprzężenie tych polisacharydów z nośnikiem, takim jak białko.
Wielu badaczy wyizolowało i oczyściło nietknięte polisacharydy oczkowe i kowalencyjnie sprzęgło je z białkami nośnikowymi. Koniugaty te są bardziej immunogenne niż same polisacharydy. Można spotkać wiele przykładów w literaturze, ilustrujących sukces takich skoniugowanych antygenów. Jeden z takich przykładów, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4673574 opisuje stosowanie bakteryjnych polisacharydów otoczkowych sprzężonych z białkami nośnikowymi z utworzeniem związków immunogennych. Inny przykład, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4356170 opisuje immunogenność koniugatów zawierających specyficzny polisacharyd, polisacharyd meningokoków grupy A (GAMP) sprzężony z białkiem nośnikowym. Stosowanie tych koniugatów stanowi ulepszoną metodę dostarczania gospodarzowi efektywnego poziomu antygenu.
Inna obiecująca metoda zwiększenia immunogenności z wykorzystaniem antygenów polisacharydu meningokoków grupy B (GBMP), przedstawiona jest w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4717136. Metoda ta polega na zamianie grup N-acetylowych kwasu siarkowego w polisacharydzie na grupy N-propenylowe, poprzez które następnie sprzęga się zmodyfikowany polisacharyd z białkiem nośnikowym. Koniugaty te stanowią dobre immunogeny i efektywnie reagują krzyżowo z natywnym GBMP. Odkrycie to wykazuje, że dodanie podstawników do antygenu polisacharydowego może spowodować powstanie dodatkowych immunogennych miejsc lub epitopów rozpoznawalnych przez przeciwciała.
Obecnie wytwarzane szczepionki z O-acetylo dodatnich N. meningitidis grupy C są słabo immunogenne. Można spotkać informacje o tym, że szczepionki otrzymane z odmiany O-acetylo ujemnej są immunogenne. Porównaj: Glode i in., The Journal of Infectious Disease, Vol. 139, No. 1, styczeń 1979, str. 52-59; Steinkoff i in., Infections and Immunity, październik 1981, str. 144-145 oraz Arakere i in., Infections and Immunity, grudzień 1991, str. 4349-4356.
Większość szczepów N. meningitidis grupy C wytwarza polisacharyd O-acetylo-dodatni (OAc+), w którym grupy O-acetylowe rozłożone są wyłącznie między pozycjami C-7 a C-8 reszt kwasu siarkowego. Wśród znanych szczepów OAc-ujemnych (OAc-) są bakterie grupy C N. meningitidis MC 19.
Celem obecnego wynalazku jest dostarczenie szczepionki o wysokim poziomie immunogenności, zawierającej zmodyfikowany polisacharyd otoczkowy C. meningitidis grupy C sprzężony z nośnikiem.
Cel ten osiągnięto przez modyfikację chemiczną na drodze O-deacylowania polisacharydu otoczkowego z Neisseria meningitidis grupy C (GCMP), uzyskanego ze szczepów OAC+ oraz sprzężenie deacylowanego polisacharydu z nośnikiem w celu uzyskania materiału o zwiększonej immunogenności.
Przedmiotem wynalazku jest antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis, stanowiący polimeryczny nośnik kowalencyjnie sprzężony z polisacharydem meningokoków grupy C lub jego fragmentem, zgodnie z wynalazkiem charakteryzujący się tym, że zawiera O-deacetylowany O-acetylododatni polisacharyd meningokoków grupy C lub jego fragment, przy czym stopień O-deacetylacji polisacharydu lub jego fragmentu wynosi powyżej 80%.
Korzystnie stopień O-deacetylacji polisacharydu lub jego fragmentu wynosi 100%.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania imantygenowego/munogennego koniugatu do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis, polegający na aktywacji polisacharydu meningokoków grupy C lub jego fragmentu dla potrzeb sprzęgnia oraz sprzęganiu aktywowanego polisacharydu z cząsteczką nośnika, zgodnie z
175 595 wynalazkiem charakteryzujący się tym, że przed etapem aktywacji przeprowadza się deacetylację powyżej 80% grup O-acetylowych polisacharydu lub jego fragmentu.
Korzystnie deacetyluje się 100% grup O-acetylowych.
Korzystnie deactylację prowadzi się w warunkach słabo zasadowych w środowisku wodnym, zwłaszcza wodnym roztworem wodorotlenku amonu lub metalu alkalicznego, korzystnie sodu, o stężeniu 0,01 do 0,5N, korzystnie 0,1N, w temperaturze 0 do 50°C, korzystnie 25°C.
Zwykle deacetylację prowadzi się przez czas 1 do 25 godzin, korzystnie przez Ί6 godzin w 0,1N NaOH.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko infekcji N. meningitidis, zawierająca dopuszczalne farmaceutycznie wehikulum do iniekcji i ewentualnie dopuszczalny fizjologicznie adiuwant, zgodnie z wynalazkiem charakteryzująca się tym, że jako składnik antygenowy/immunogenny zawiera immunogenną ilość, koniugatu polimerycznego nośnika kowalencyjnie sprzężonego z O-acetylododatnim polisacharydem meningokoków grupy C, O-deacetylowanym w stopniu powyżej 80%, lub jego -fragmentem.
Korzystnie szczepionka według wynalazku zawiera koniugat polimerycznego nośnika kowalencyjnie sprzężonego z O-acetylododatnim polisacharydem meningokoków grupy C, O-deacetylowanym w 100%, lub jego fragmentem.
W celu zwiększenia immunogenności polisacharydu otoczkowego meningokoków grupy C (GCMP), wywarza się zmodyfikowany GCMP i kowalencyjnie sprzęga się go z molekułą nośnika. Koniugat polisacharydowy można wytworzyć za pomocą różnorodnych reakcji sprzęgania chemicznego, fizycznego lub enzymatycznego. Stosowana technika sprzęgania zależy od środków sprzęgających, które mogą być stosowane i grup reaktywnych na materiale lub molekule nośnika. Można stosować różne procedury sprzęgania, które znane są fachowcom.
W niniejszym opisie polimeryczny nośnik zdefiniowany jest jako każdy materiał. lub cząsteczka, mające grupy funkcyjne zdolne do sprzężenia z resztą polisacharydową. Nośnikiem polimerycznym może być materiał naturalny lub syntetyczny i może być on rozpuszczalny lub nierozpuszczalny w wodzie. Materiały lub cząsteczki nośnikowe są w swej naturze z reguły proteinopodobne. W przypadku nośnika białkowego, białkiem może być każde fizjologicznie tolerowalne białko mające reaktywne grupy dostępne sprzęganiu. Można stosować dowolny typ nośnika zawierającego pierwszorzędowe lub drugorzędowe grupy aminowe; Reaktywne wolne grupy aminowe mogą być łatwo sprzężone z polisacharydem za pomocą reszt takich jak hydroksylowe, aldehydowe, karboksylowe i tym podobne. Przykładami odpowiednich protein są białka i peptydy naturalne, takie jak albumina z osocza bydlęcego, toksoidy bakteryjne uzyskane z toksyn bakteryjnych przez ich modyfikację syntetyczną, np. toksoid dyfterytu, toksoid tężca, toksyna krztuśca lub toksoid krztuśca, rekombinatowa egzoproteina A pałeczki ropy błękitnej oraz egzotoksyna Clostridium perfringens. Można, również stosować inne proteiny pochodzenia bakteryjnego. Na przykład źródłem bakteryjnym mogą być bakterie Haemophius influenzae, meningokoki, dwoinki zapalenia płuc, /3-hemolityczne paciorkowce i E. coli. Użyteczne też mogą być inne białka zawierające reszty lizynowe, takie jak syntetyczna polilizyna. Inne nośniki białkowe, jak i inne nie-białkowe cząsteczki nośnikowe są znane fachowcom i mogą być wykorzystane jako cząsteczki nośnikowe w obecnym wynalazku. Przykładami nośników nierozpuszczalnych w wodzie są aminoalkilo-Sefarozy, np. aminopropylo- lub aminoheksyloSefaroza oraz aminopropylo-szkło. Mogą być również stosowane inne nośniki po takiej modyfikacji, by zawierały chemicznie przyłączone grupy aminowe. Tego typu nośniki mogą wywodzić się z polisacharydów, do których dołączono grupę aminoalkilową za pomocą wiązania kowalencyjnego.
Zgodnie z wynalazkiem usuwa się selektywnie powyżej 80% grup O-acetylowych w pozycjach 7 i/lub 8 reszt sialowych polisacharydu grupy C ze szczepów OAc+ za pomocą traktowania odpowiednim środkiem. Fachowcom znanych jest wiele środków deacetylujących. Korzystnie deacetylację prowadzi się w warunkach słabo-zasadowych w środowisku wodnym,
175 595 takim jak około 0,01 do 0,5N wodorotlenek sodu, korzystnie 0,1N wodorotlenek sodu w temperaturze około 0 do 50°C, zwłaszcza 25°C. Inne zasadowe roztwory, jak wodorotlenek potasu, wodorotlenek amonu i tym podobne, mogą być stosowane w tej reakcji. Temperaturę reakcji deacetylacji i stężenie zasady stosowanej w reakcji można zmieniać, pamiętając tylko o tym, że należy utrzymywać łagodne warunki reakcji. Warunki reakcji należy kontrolować, tak by uzyskać deacetylację polisacharydu grupy C do pożądanego poziomu. Reakcję O-deacetylacji prowadzi się do uzyskania żądanego jej poziomu, tj. przez około 1 do 25 godzin, zwłaszcza przez około 16 godzin w 0,1 NaOH.
Zmieniając temperaturę i czas reakcji, można zmienić stopień O-deacetylacji polisacharydu, Stopień deacetylacji można kontrolować na przykład za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).
Korzystnie deactyluje się około 100% grup O-acetylowych.
Pożądaną może być również fragmentacja lub depolimeryzacja łańcucha polisacharydu (przez lub po deacetylacji) przed sprzężeniem z cząsteczką nośnika. Polisacharydy są wrażliwe na wiele reagentów i można je zhydrolizować za pomocą słabych kwasów, takich jak kwas octowy lub utlenić za pomocą takich reagentów jak nadjodan. W korzystnej wersji wynalazku deacetylowany polisacharyd podlega zarówno fragmentacji, jak i aktywacji do sprzężenia przez utlenianie nadjodanem.
Fachowcom znane są inne metody osiągnięcia tego etapu reakcji.
W następnych etapach polisacharyd oczyszcza się przez filtrację na żelu, takim jak Superdex 200 prep. grade. Redukcyjną częściową depolimeryzację nadjodanem sodu prowadzi się w celu uzyskania zaktywowanego polisacharydu o wielkości cząsteczki optymalnej z punktu widzenia wywoływanej odpowiedzi immunologicznej. Polisacharyd oczyszcza się przez filtrację na żelu, dializuje w celu usunięcia soli i liofilizuje. Następnie sprzęga się go z odpowiednim białkiem nośnikowym, takim jak toksoid tężca, w reakcji redukcyjnego aminowania. Otrzymane koniugaty oczyszcza się przez filtrację na żelu i analizuje ich immunogenność u myszy FRW Swiss Webster z hodowli niekrewniaczej firmy Charles Rivers.
Antygenowe/immunogenne koniugaty według wynalazku wytwarza się najpierw przez utworzenie końcowych grup redukujących na fragmentach O-deacetylowanego GCMP, a następnie przereagowanie redukujących grup końcowych z grupami aminowymi materiału lub cząsteczki nośnikowej na drodze redukcyjnego aminowania. Końcowe grupy redukujące wytwarza się dowolną odpowiednią metodą, jak hydroliza selektywna, np. za pomocą kwasów lub enzymów albo oksydacyjne rozszczepianie, np. za pomocą metanadjodanów. Sprzęganie przeprowadza się korzystnie przez redukcyjne aminowanie w roztworze wodnym, zawierającym środek redukujący, taki jak aniony cyjanoborowodorkowe. Fachowcom znane są inne metody sprzęgania polisacharydu z cząsteczką nośnika.
Korzystna metoda sprzęgania polega na reakcji w dwóch etapach. Polisacharyd utlenia się metanadjodanem z wytworzeniem reszt aldehydowych, po czym poddaje reakcji w obecności wolnych grup aminowych cząsteczki nośnika i w obecności odpowiedniego czynnika redukującego. Przykładami odpowiednich czynników redukujących są typowo cyjanohorowodorek, borowodorek sodu lub inny czynnik redukujący, który nie powoduje redukcji końcowych grup redukujących, zaangażowanych w procesie sprzęgania, ani nie wpływa niekorzystnie na cząsteczkę lub materiał nośnika. Środek redukujący działa jako selektywny, łagodny czynnik redukujący pośredniej zasady Schiffa utworzonej między grupami karbonylowymi zhydrohzowanego fragmentu GCMP i grupami aminowymi cząsteczki lub materiału nośnika. Typowe warunki reakcji dla tego typu sprzęgania podane są przez Jenningsa i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4356170.
Rozumie się jednakże, że sprzężone szczepionki według wynalazku nie są ograniczone do wytworzonych na drodze redukcyjnego aminowania. Tak więc, szczepionki mogą być wytworzone przez sprzęganie polisacharydu z białkiem nośnikowym przy zastosowaniu łącznika dihydrazydu tłuszczowego, jak opisali Schneerson i in., Preparation, Characterization and Immunogenicity of Haemophilus Influenzae Type b Polysaccharide-Protein Conjugates, J. Exp. Med., 1952, 361-476, (1980) oraz Lance K. Gordona w opisie
175 595 patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4644059. Alterantywnie można stosować technikę łączenia dwuskładnikowego, jak opisuje Marburg, S., i in., Biomolecular Chemistry of Macromolecules: Synthesis of Bacterial Polysaccharide Conjugates with Neisseria meningitidis Membrane Protein, J. Am. Chem. Soc., 108, 5282-5287 (1986) lub, możliwa jest metodologia końców redukujących, jak podaje Anderson w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4673574.
Antygenowe/immunogenne koniugaty według wynalazku mogą być formułowane z jedną lub więcej dopuszczalnych farmaceutycznie substancji pomocniczych i ewentualnie innymi składnikami. Farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze muszą być dopuszczalne w sensie zgodności z innymi składnikami preparatu i nieszkodliwości dla biorcy. Preparaty mogą być dogodnie w postaci dawki jednostkowej i mogą być formułowane dowolną dobrze znaną w farmacji metodą.
Sposób wytwarzania szczepionek zawierających jako składniki aktywne koniugaty polisacharydowe jest dobrze znany fachowcom. Typowo szczepionki takie wytwarza się w postaci albo roztworu ciekłego lub zawiesin do zastrzyków: można również wytworzyć postacie stałe odpowiednie do rozpuszczenia lub zawieszenia w cieczy bezpośrednio przed zastrzykiem. Preparat można również emulgować. Składnik czynny immunogennie często miesza się z substancjami pomocniczymi (wehikulum), które są dopuszczalne farmaceutycznie i kompatybilne ze składnikiem czynnym. Odpowiednimi substancjami pomocniczymi są na przykład woda, solanka, glukoza, glicerol, etanol i tym podobne oraz ich mieszaniny. Ponadto, jeśli potrzeba, szczepionka może zawierać mniejsze ilości substancji pomocniczych, takich jak środki zwilżające lub emulgujące, środki buforujące pH lub dodatki zwiększające skuteczność szczepionki. Można stosować każdy odpowiedni adjuwant znany fachowcom. Przykładami odpowiednich adjuwantów są między innymi, stearylo-tyrozyna, wodorotlenek glinu, fosforan glinu i siarczan glinu. Stwierdzono, że szczególną skuteczność wykazują szczepionki wytworzone z wodorotlenkiem glinu. Z reguły szczepionki podawane są pozajelitowo, w zastrzyku, na przykład podskórnie lub domięśniowo.
Szczepionki podaje się w sposób odpowiedni do typu preparatu i w ilości skutecznej terapeutycznie i immunogennie. Ilość, którą należy podać zależy od podmiotu, zdolności jego systemu immunologicznego do wytwarzania przeciwciał i żądanego stopnia ochrony. Dokładne ilości składnika czynnego wymaganego do podania zależą od oceny lekarza i są indywidualne dla każdego pacjenta. Jednakże odpowiednie zakresy dawek są rzędu kilkuset mikrogramów składnika czynnego na pacjenta. Odpowiednie reżimy dla podawania -początkowego i zastrzyków stymulujących są także zmienne, ale polegają na podaniu początkowych, a następnie po przerwach jedno- dwutygodniowych podaje się następny zastrzyk lub inną drogą.
Szczepionka według wynalazku wywołuje u ssaków skuteczne poziomy przeciwciał anty-GCMP. Szczepionka ta może być podawana pod postacią zastrzyku ssakom w każdym wieku i może być wykorzystana do indukowania immunizacji czynnej przeciwko ogólnoustrojowej infekcji spowodowanej Neisseria Meningitidis przez podanie immunogennej ilości koniugatu ssakom narażonym na chorobę.
Generalnie do wywołania odpowiednich poziomów przeciwciał przeciw GCMP u młodych ssaków, odpowiednie są szczepionki zawierające od około 5 do około 100 μ g, zwłaszcza około 10 do 50μg. Dokładna dawka powinna zostać ustalona eksperymentalnie. Należy się spodziewać, że lepsze efekty uzyska się podając serię małych dawek niż wtedy, gdy ta sama ilość koniugatu zostanie podana jednorazowo jako jedna injekcja.
W wyniku immunizacji ssaka szczepionką według wynalazku powstaje frakcja gamma globulin zdolnych do ochrony przed zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych, wywołanym przez N. meningitidis. grupy C. Frakcja ta może być następnie podawana osobnikowi celem ochrony przed lub leczenia zaistniałej infekcji, spowodowanej powyższymi organizmami. Należy więc spodziewać się, że szczepionki zawierające immunogenne koniugaty według wynalazku służyć będą jako źródło terapeutycznej surowicy odpornościowej w
175 595 świetle ich korzystnej immunogenności. Koniugaty według wynalazku będą również użyteczne w produkcji przeciwciał monoklonalnych oraz, ewentualnie, przeciwciał antyidiotypowych.
Krótki opis rysunków
Figura 1. Wpływ O-acetylowania polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na miana serum w teście ELISA. Płytki serologiczne w teście ELISA pokrywano O-acetylo-ujemnymi koniugatami GCMP-HSA.
Figura 2. Wpływ O-acetylowania polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na miana serum w teście ELiSA. Płytki serologiczne w teście ELISA pokrywano O-acetylo-dodatnimi koniugatami GCMP-BSA.
Figura 3. Wpływ O-acetylowania polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na aktywność bakteriobójczą zależną od komplementu. Aktywność bakteriobójczą określano w stosunku do szczepu CH. N.Meningitidis grupy C, będącego szczepem O-acetylo-dodatnim.
Figura 4. Wpływ wielkości łańcucha polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na miana serum w teście ELISA. Płytki serologiczne w teście ELISA pokrywano O-acetyloujemnymi koniugatami GCMP-HSA.
Figura 5. Wpływ wielkości łańcucha polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na miana serum w teście ELISA. Płytki serologiczne w teście ELISA pokrywano O-acetylododatnimi koniugatami GCMP-BSA.
Figura 6. Wpływ wielkości łańcucha polisacharydu w koniugatach GCMP-TT na zależną od komplementu aktywność bakteriobójczą. Aktywność bakteriobójczą określano w stosunku do szczepu C11N. meningitidis grupy C, będącego szczepem O-acetylo-dodatnim.
Przykład I. O-deaceyylacja poiisachayddu meningokoków grupy C (GCMP)
Natywny polisacharyd meningokoków grupy C (188 mg) rozpuszcza się w 0,1N roztworze wodorotlenku sodu (30 ml). Mieszaninę miesza się przez 16 godzin w temperaturze 25°C. Następnie dializuje się ją w 4°C względem wody i liofibzuje. Spektroskopia XH-NMR (500 MHz) wykazała, że otrzymany w postaci białego, włóknistego ciała stałego polisacharyd (144 mg 77%) jest O-deacetylowany.
Przykład II. O-deacetylowanego poissachay/du meningokoków grupy C (GCMP) - (-)
O-deacetylowany polisacharyd (141 mg) rozpuszczono w roztworze Dulbecco PBS (10 ml) i oczyszczono przez filtrację na kolumnie (2,6 x 100 cm) wypełnionej żelem Superdex 200 czystości preparatywnej. Kolumnę eluowano z szybkością 100 ml/godzinę i zbierano frakcje o objętości 5 ml. Eluat kontrolowano za pomocą refraktrometru różnicowego z detektorem UV (280 nm). Frakcje zawierające pierwszy główny sygnał rejestrowany przy pomocy refraktometru różnicowego i wolne od substancji absorbujących w UV połączono. Po dializie względem wody i liofilizacji, otrzymano oczyszczony GCMP-(-) (108 mg 77%) jako białe, włókniste ciało stałe. Ciało stałe analizowano na zawartość protein metodą Bradforda, a na zawartość kwasów nukleinowych za pomocą absorbancji UV przy 260 nm. Jak pokazuje tabela 1, obecność tych zanieczyszczeń jest znacząco zmniejszona dzięki etapowi oczyszczania. Ponadto analiza GCMP-(-) za pomocą HPLC, przy zastosowaniu kolumny filtracyjnej z żelem Superose 12 (firmy Pharmacia) wykazała, że polisacharyd eluuje się jako wąski pik objętości wolnej, tak jak obserwuje się również w przypadku wyjściowego, naturalnego polisacharydu (GCMP), co wskazuje na to, że oczyszczony polisacharyd obecny jest w postaci o dużej masie cząsteczkowej.
Przykład III. Utlenianie i określanie wielkości cząsteczek oczyszczonego GCMP-(-)
Utlenianie polisacharydu za pomocą nadjodanu sodu służy podwójnemu celowi aktywacji polisacharydu do mającego nastąpić sprzęgania z białkiem oraz rozszczepieniu polisacharydu na mniejsze fragmenty, które wykazują optymalną odpowiedź immunologiczną, jak wykazano uprzednio. Ponieważ uprzednio wykazano również, że polisacharyd pochodzący z różnych partii wymaga różnych warunków utleniania nadjodanem, w celu uzyskania optymalnej długości łańcucha polisacharydu, określa się najpierw te
175 595 warunki, za pomocą reakcji na małą skalę (5 mg), po czym prowadzi się reakcję na większą skalę. Typowo czas reakcji i temperatura są utrzymywane na stałym poziomie, odpowiednio 2 godzin i 25°C, a stężenie nadjodanu sodu waha się między 3 a 12 milimolowym w dejonizowanej wodzie. Stężenie polisacharydu w reakcjach tak na małą jak i dużą skalę utrzymuje się stałe w granicach 6-10 mgiml. Na zakończenie dwugodzinnego okresu reakcji, do roztworu reakcyjnego dodaje się nadmiar (10-krotny) 1,0 M roztworu glikolu etylenowego w celu zniszczenia nieprzereagowanego nadjodanu sodu. Po upływie przynajmniej 30 minut reakcji, roztwory bada się za pomocą HPLC, stosując kalibrowaną kolumnę Superose-12 celem określenia średniej masy cząsteczkowej utlenionego polisacharydu. Warunki reakcji pozwalające otrzymać polisacharyd o średniej masie cząsteczkowej 12000-16000 stosowane są w reakcjach na dużą skalę, jak to ilustruje poniższa reakcja.
Rozpuszcza się oczyszczony GCMP-(-) (63 mg) w dejonizowanej wodzie (4,81 ml). Do tego roztworu dodaje się 21 milimolowy roztwór nadjodanu sodu (4,81 ml) tworząc mieszaninę reakcyjną w dejonizowanej wodzie o stężeniu polisacharydu 6,55 mgiml oraz NaIO410,5 mmol. Pozwala się przebiegać reakcji przez 2 godziny w 25°C w ciemności, po czym zadaje się mieszaninę reakcyjną 1 M glikolem etylenowym (0,96 ml) przez 30 minut. Materiał eluuje się na kolumnie Superose-12 jako szeroki pik odpowiadający średniej masie cząsteczkowej 12800. Objętość roztworu redukuje się do około 5 ml na liofilizatorze i materiał oczyszcza przez filtrację żelową na kolumnie Superdex 200 czystości preparatywnej (2,6 x 100 cm), stosując Dulbecco PBS jako bufor eluujący, zbierając frakcje po 5 ml. Frakcje zawierające materiał o średniej masie cząsteczkowej między 10000 a 18000 łączy się. Po dializie względem zdejonizowanej wody i liofilizacji, otrzymuje się utleniony polisacharyd o masie cząsteczkowej w ustalonym zakresie - [o]-GCMP-(-) (16,0 mg, 23%) w postaci białego, włóknistego ciała stałego, które posiada średnią masę cząsteczkową 14500 daltonów, jak pokazuje FPLC na kolumnie Superose-12.
Tabela 1
Zawartość białek i kwasów nukleinowych w preparatach polisacharydu meningokoków grupy C
Polisacharyd | % białka | % kwasów nukleinowych |
GCMP | 8,3 | 2,7 |
Oczyszczony GCMP-(-) | 0,61 | 0,12 |
[o]-GCMP-(-) | 0,06 | 0,31 |
Przykład IV. Wytwarzanie [o]-GCMP-(+)
Rozpuszcza się naturalny GCMP (350 mg) w 0,02 N NaOH (36 ml) i inkubuje przez 3 godziny w 25°C. Do tego roztworu dodaje się następnie 0,1 M NaIO4 (36 ml) i całość inkubuje dalsze 50 minut w 25°C. Mieszaninę reakcyjną zadaje się następnie 50% glikolem etylenowym (5,3 ml) przez 20 minut, po czym klaruje się mieszaninę wirującją przy 5000 obr/min przez 10 minut. Dializuje się supernatant względem dejonizowanej wody i liofilizuje, uzyskując 300 mg ciała stałego. Materiał przepuszcza się przez kolumnę Bio-Gel A-0,5 m, uzyskując utleniony polisacharyd {[o]-G(CMP-(+)} o żądanej masie cząsteczkowej równej 11500.
Przykład V. Oczyszczanie monomeru białka toksoidu tężca (TT)
Do łagodnie mieszanego roztworu toksoidu tężca (Statens Seruminstitut) [zawierającego 2,1 mgiml proteiny (test Bradforda do analizy protein, przy użyciu ludzkiej IgG jako wzorca)] (75 ml) dodaje się w małych porcjach przez okres 45 minut siarczan amonowy (42,1 g), otrzymując 80% roztwór nasycony. Zmętniały roztwór zostawia się na noc w 4°C celem zakończenia wytrącania się białka. Osad wydziela się przez wirowanie przy 15000 obr/min (23000 g) przez 20 minut, a supernatant zawierający mniej niż 10% oryginalnego białka odrzucą się. Zbity osad powtórnie rozpuszcza się w buforze Dulbecco PBS (10 ml) i frakcjonuje przez filtrację na żelu na kolumnie Bio-Gel A-0,5 m. Główny pik
175 595 odpowiadający monomerowi toksoidu tężca zbiera się, dializuje względem dejonizowanej wody i liofilizuje, otrzymując TT w postaci białego, włóknistego ciała stałego (65,4 mg, 41%).
Przykład VI. Sprzęganie O-deacetylowanego polisacharydu meningokoków grupy C {[o]-GCMP-(-)}z toksoidem tężca (TT).
Roztwór zawierający [o]-GCMP-(-) (10 mg), TT (3,3 mg) oraz cyanoborowodorek sodu (6,8 mg) w 0,20 M buforze fosforanowym o pH=7,5 (0,222 ml) utrzymuje się w 37°C. Roztwór reakcyjny rozcieńcza się buforem PBS (0,5 ml) i składniki nierozpuszczalne usuwa -się przez odwirowanie w wirówce Eppendorfa przy 10000 obr/min przez 2 minuty. Supernatant ładuje się do kolumny Bio-Gel A-0,5 m o rozmiarach 1,6 x 100 cm i eluuje za pomocą 0,15 M NaCl + 0,02% thimerosal z szybkością 20 ml/godzinę. Frakcje odpowiadające pikowi eluującemu przy objętości wolnej zbiera się razem, uzyskując koniugat 0-deacetylowany polisacharyd meningokoków grupy C - toksoid tężca [GCMP-(-)-TT]. Zebrany roztwór analizuje się na zawartość protein metodą Bradforda, uzyskując zawartość 2,86 mg białka (87% wydajności). Zawartość polisacharydu w koniugacie ocenia się na podstawie zawartości kwasu sialowego, oznaczanej metodą rezorcynową; zawartość ta wynosiła 0,997 mg polisacharydu (10% wydajności).
Charakterystyka koniugatu podsumowana jest w tabeli 2.
Przykład VII. Sprzęganie O-acetylowanego polisacharydu meningokoków grupy C {[o]-GCMP-(+)} z toksoidem tężca (TT).
Roztwór zawierający [o]-GCmP-(+) (10,2 mg), TT (2,9 mg) oraz cyjanoborowodorek sodu (5,2 mg) w 0,20 M buforze fosforanowym o pH=7,5 (0,20 ml) utrzymuje się w 37°C przez 5 dni. Koniugat oczyszcza się przez filtrację chromatograficzną na żelu i analizuje tak jak podano w Przykładzie VI. Roztwór koniugatu zawiera 2,7 mg białka (93% wydajności) oraz 1,06 mg polisacharydu (10,4% wydajności).
Charakterystyka koniugatu podsumowana jest w tabeli 2.
Tabela 2
Charakterystyka koniugatów GCMP-(-)-TT oraz GCMP-(+)-TT
Koniugat | Polisacharyd | Białko: PS | %Polisacharydu w koniugacie | |
Acetylowanie | Średnia masa cząst. | |||
GCMP-(-)-TT | O-deactylowany | 12500 | 2,9:1 | 26 |
GCMP-(+)-TT | O-acetylowany | 11500 | 2,6:1 | 28 |
Przykład VIIA. Wytwarzanie szczepionki (-)-GCMP-TT
Szczepionki (-)-GCMP-TT wytwarza się w sposób analogiczny do wytwarzania szczepionek GCMP-(-)-TT w powyższych przykładach z tym, że polisacharyd pochodzi ze szczepu MC 19 bakterii N. meningitidSi grupy C. Bakteria ta wytwarza GCMP, który nie posiada reszt O-acetylowych.
Przykład VIII. Wytwarzanie roztworów szczepionek na bazie koniugatów i badania biologiczne
Roztwory koniugatów opisane w Przykładzie VI i VII rozcieńcza się solanką (0,15 M NaCl + 0,02% thimerosal) tak, że stężenie polisacharydu we wszystkich szczepionkach wynosi 10 μ g/ml. Połowa tych szczepionek zawiera także jako adjuwant wodorotlenek glinu w stężeniu 1,0 mg/ml.
Immunogenność tych szczepionek testowano na 4-6 tygodniowych samicach myszy Swiss Webster CFW z hodowli niekrewniaczej. Zwierzętom wstrzykiwano podskórnie 0,2 mil szczepionki dnia 0 14 i 28, a surowice do testu na przeciw ciała zbierano dnia 38.
175 595
Przykład IX. Test immunosorpcji enzymozależnej (ELISA) na przeciwciała mysie przeciwko polisacharydowi Neisseria meningitidis grupy C
Test ELISA przeprowadza się pokrywając płytki do oznaczania miana koniugatem odpowiedniego polisacharydu [GCMP-(-) lub GMCP-(+)] z albuminą surowicy ludzkiej (HSA) z następującym traktowaniem blokującym buforem BSA. Następnie przeprowadza się rozcieńczenie surowic buforem PBS-Tween. Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, płucze i zadaje drugim przeciwciałem [kozia anty-mysia IgG (H+L)-peroksydaza] w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie starannie płucze się płytki buforem PBS-Tween, po czym traktuje się świeżo przygotowanym substratem peroksydazy - TMB, tak jak opisali Kirkegaard & Perry. Po 15 minutach zatrzymuje się reakcję enzymatyczną dodając 1M kwas fosforowy do każdej studzienki i mierzy absorbancję przy użyciu czytnika mikropłytek. Miana z testu ELISA zebrane są w tabeli 3.
Przykład X. Test właściwości bakteriobójczych dla surowicy odpornościowej przeciw Neisseria meningitidis grupy C.
Testowano aktywność bakteriobójczą przez inkubowanie Neisseria meningitidis grupy C (szczep C11) w obecności odpowiednio rozcieńczonych badanych surowic i surowicy młodego królika (źródło dopełniacza), w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. W podobny sposób inkubowano dwie ujemne próby kontrolne: jedną bez badanych surowic, drugą zawierającą zdezaktywowany termicznie dopełniacz. Próbki tych roztworów (50 μΐ) nanoszono następnie na płytki z czekoladowym agarem w duplikatach i inkubowano w temperaturze 35-37°C w 5% CO przez całą noc w celu przeprowadzenia testu przeżywalności. Następnego ranka liczono ilość kolonii na każdej płytce i uśredniono wartości z duplikatami. Bakteriobójcze miano surowicy definiowano jako rozcieńczenie surowicy dające 50% przeżywalność. Aktywności bakteriobójcze różnych surowic podsumowuje tabela 3.
Tabela 3
Szczepionka | Miano w/g ELISA | Miano bakteriobójcze | |
GCMP- (+) | w solance | 230 | brak reakcji |
GCMP (+)-TT | w solance | 12293 | brak reakcji |
GCMP-(+)-TT | w solance z ałunem | 27866 | 2800 |
GCMP-(-)-TT | w solance | 13127 | 2700 |
GCMP-(-)-TT | w solance z ałunem | 25537 | 21000 |
(-)-GCMP-TT | w solance | 10867 | 2700 |
(-)-GCMP-TT | ałun | 27327 | >40000 |
Analiza testem ELISA surowic otrzymanych z grup myszy immunizowanych za pomocą dwu typów koniugatów wykazała obecność wysokich mian antyciała IgG w obu grupach myszy. Dalsza analiza surowic przy zastosowaniu testu bakteriobójczego przeciw szczepowi zmodyfikowanemu dała zaskakujący wynik. Podczas gdy miana ELISA dla surowic otrzymanych z obu szczepionek były podobne, surowice otrzymane z myszy immunizowanych koniugatem zmodyfikowanym wykazały wyższe poziomy przeciwciał bakteriobójczych w porównaniu z surowicami z myszy, którym podano naturalny koniugat jako szczepionkę. Wyniki tych badań sugerują, że skoniugowana szczepionka, według wynalazku wywołuje powstanie klasy przeciwciał o silnej aktywności bakteriobójczej.
175 595
Synteza koniugatów polisacharydu meningokoków grupy C z toksoidem tężca (GCMP-TT)
Oczyszcza się polisacharyd meningokoków grupy C izolowany ze szczepów O-acetylo-dodatnich i częściowo lub całkowicie deacetyluje rozcieńczoną zasadą. O-deacetylowany polisacharyd jak również partie nie traktowane zasadą poddaje się częściowej depolimeryzacji, aktywacji i oczyszczaniu. Zakres oraz miejsce O-acetylowania oczyszczonych i aktywowanych partii polisacharydu określa się za pomocą spektroskopii atomowego rezonansu magnetycznego (NMR) (600 MHz) o wysokiej rozdzielczości, natomiast średnią masę cząsteczkową przez chromatografię na kolumnie filtracyjnej z żelem. Patrz podsumowanie tych wyników w tabeli 4. Sprzężenie (4) zaktywowanych polisacharydów z białkiem toksoidu tężca dało koniugaty GCMP-TT przedstawiono w tabeli 5, gdzie podsumowana jest także procentowa zawartość polisacharydów w koniugatach GCMP-TT.
Wytwarzanie roztworów szczepionek i badania biologiczne
Roztwory koniugatu GCMP-TT rozcieńczono solanką zawierającą 0,01% thimerosalu i stosowano bezpośrednio do immunizacji myszy (solanka) lub adsorbowano na wodorotlenku glinu (Al adjuwant) lub stearylotyrozynie (St adjuwant). Każdy finalny roztwór lub mieszanina 'szczepionki zawierała 10 μ g/ml koniugatu wyrażoną jako zawartość polisacharydu koniugatu. Wszystkie preparaty szczepionek wraz z próbkami kontrolnymi zawierającymi toksoid tężca oraz polisacharyd, testowano w grupach 10 samic myszy (4-6 tygodniowych) przez wstrzyknięcie podskórne 0,2 ml roztworów lub mieszanin szczepionki dnia 0,14 oraz 28. Surowice pobierano dnia 38 i przechowywano zamrożone aż do analizy testem ELISA lub aktywności bakteriobójczej.
Badania serologiczne
Odpowiedzi immunologiczne na polisacharyd meningokoków grupy C, zawarty w koniugatach, wyrażone są jako ich miana w teście ELISA. Każda surowica analizowana była dwiema metodami. W pierwszej, pokrywający antygen [koniugat GCMP-ludzka albumina z osocza] zawierał polisacharyd O-acetylo-ujemny, natomiast w drugiej pokrywający antygen [koniugat GCMP-bydlęca albumina z osocza] zawierał polisacharyd O-acetylododatni. Wyniki testu ELISA przedstawione są na rysunkach 1, 2, 4 oraz 5. Surowice z prób kontrolnych; które zawierały wolne białko toksoidu tężca, polisacharyd O-acetylododatni oraz O-acetylo-ujemny nie dały mian w teście ELISA w najniższych analizowanych rozcieńczeniach (1/1000). Wszystkie surowice badano także pod względem zależnej od dopełniacza aktywności bakteriobójczej względem O-acetylo-dodatniego szczepu C11
N. meningitidis grupy C. Miana bakteriobójcze przedstawione na rysunkach 3 i 6 odpowiadają rozcieńczeniom surowic powodującym 50% przeżywalność. Żadne z surowic z prób kontrolnych nie wykazała aktywności bakteriobójczej w najniższych analizowanych rozcieńczeniach (1/1000).
Wyniki i ich omówienie
Odpowiedź immunologiczną wszystkich koniugatów wytworzonych w opisanych badaniach oceniano dla trzech różnych preparatów szczepionek, stosując zarówno test ELISA jak i test zależnych od dopełniacza właściwości bakteriobójczych. Preparatami były solankowe roztwory koniugatów, lub mieszaniny zaadsorbowane na wodorotlenku glinu lub stearylotyrozynie. Testy ELISA dla wszystkich surowic ze wszystkich koniugatów . zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu wykazują zasadniczo wyższą odpowiedź immunologiczną, a najniższą, gdy podane one były w postaci roztworów solankowych (patrz figury 1, 2, 4 oraz 5). Koniugaty osadzone na stearylotyrozynie dawały we wszystkich przypadkach wyższe odpowiedzi immunologiczne niż roztwory solankowe, jednakże były one we wszystkich przypadkach parokrotnie niższe niż dla koniugatów zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu.
175 595
Test właściwości bakteriobójczych wykazał ten sam trend dla trzech preparatów szczepionki (patrz figury 3 i 6).
Miana z testu ELISA dla koniugatów GCMP-TT, w których średnia masa cząsteczkowa polisacharydu w koniugacie jest podobna (12000-14800, patrz tabela 1), są przedstawione na rysunkach 1 i 2. Na Fig. 1, miana ELISA otrzymano dla przypadku antygenu pokrywającego (GCMP-HSA) zawierającego polisacharyd O-acetylo-ujemny. Dla tego antygenu istnieje odwrotna zależność między mianami ELISA i stopniem O-acetylacji polisacharydu w koniugacie, tak, że najwyższe miana uzyskano dla najmniej O-acetylowanego polisacharydu. Całkowicie odmienny obraz przedstawiono na Fig. 2, która przedstawia miana otrzymane w przypadku antygenu pokrywającego (GCMP-BSA) zawierającego polisacharyd O-acetylo-dodatni. W tym przypadku miana ELISA rosną ze wzrostem stopnia O-acetylacji, jednakże różnice między koniugatami mającymi najmniejszy stopień O-acetylacji oraz największy nie są tak duże jak to obserwowano w przypadku stosowania pokrywającego antygenu O-acetylo-ujemnego (patrz Fig. 1). Zależność między stopniem O-acetylacji i zależnej od dopełniacza aktywności bakteriobójczej przeciw szczepowi C11 meningokoków grupy C (szczep O-acetylo-dodatni) przedstawia Fig. 3. Obserwuje . się znaczące zmniejszenie aktywności bakteriobójczej ze wzrostem stopnia O-acetylacji. Tak więc aktywność bakteriobójcza ściśle koreluje z mianami ELISA otrzymanymi dla pokrywającego antygenu O-acetylo-ujemnego (patrz Fig. 1). W przypadku koniugatów zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu, zarówno w testach ELISA jak i aktywności bakteriobójczej obserwuje się w przybliżeniu trzykrotne zmniejszenie mian ze wzrostem O-acetylacji z 5 do 70%. Jak pokazano na figurach 1-3, trzy preparaty szczepionki wykazują te same tendencje w każdym z trzech testów. Zależności pokazane na figurach 1-3 obserwuje się również dla wielokrotnie powtarzanych analiz surowic.
Oprócz stopnia O-acetylacji i rodzaju preparatu, również wielkość łańcucha polisacharydu w skoniugowanych szczepionkach znacząco wpływa na odpowiedź immunologiczną. Pokazane jest to na figurach 4-6 dla koniugatów GCMP-TT, w których polisacharyd O-acetylowany jest w 61-65%. Takie same tendencje obserwuje się w dwóch testach ELISA (figury 4 i 5). Najwyższe miana ELISA obserwuje się dla skoniugowanych szczepionek, w których polisacharyd ma średnią masę cząsteczkową 12000 w preparatach z wodorotlenkiem glinu i stearylotyrozyną, aczkolwiek, różnice są szczególnie duże w przypadku koniugatów zaadsorbowanych na wodorotlenku glinu. W przeciwieństwie do obu testów ELISA, miana bakteriobójcze dla preparatów z wodorotlenkiem glinu i stearylotyrozyną są najwyższe dla polisacharydu o masie 6000 i maleją ze wzrostem długości łańcuchu polisacharydu (patrz Figura 6).
Tabela 4
Średnie masy cząsteczkowe (śr. m. cz.) i miejsce O-acetylowania oczyszczonych i zaktywowanych próbek polisacharydu
Numer próbki | Śr. m. cz. | % O-acetylowania | ||
7-OAc | 8-OAc | (7+8)-OAc | ||
1 | 6600 | 40 | 23 | 63 |
2 | 12000 | 34 | 27 | 61 |
3 | 12800 | 31 | 4 | 35 |
4 | 13000 | 41 | 27 | 68 |
5 | 14000 | - | - | 6 |
6 | 14800 | 40 | 26 | 66 |
7 | 40000 | 36 | 29 | 65 |
175 595
Procent O-acetylowania określany jest za pomocą spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości przez porównanie całek protonów metynowych w pozycjach 7 i 8 z pochodzącym od protonów w pozycji 3 reszt kwasu sialowego.
Tabela 5
Podsumowanie procentowych zawartości polisacharydu w koniugatach GCMP-TT
Numer koniugatu | Numer próbki polisacharydu | % polisacharydu w koniugacie |
1 | 1 | 35 |
2 | 2 | 34 |
3 | 3 | 41 |
4 | 4 | 48 |
5 | 5 | 38 |
6 | 6 | 40 |
7 | 7 | 30 |
Zrozumiałym jest, że przykłady i odmiany opisane tutaj służą jedynie ilustracji i że możliwe rozliczne modyfikacje i zmiany, nasuwające się fachowcom w świetle powyższego, będą objęte istotą i zakresem niniejszego wynalazku oraz zakresem załączonych zastrzeżeń patentowych.
FIG. 2
175 595
Miana w teście bakteriobójczym
FIG. 3
175 595
Miana w teście ELISA
FIG. 4
175 595
Miana w teście ELISA
FIG. 5
175 595
FIG. 6 ie bakteriobó.jcz
Średnia masa cząsteczkowa policukru
175 595
MIANA w teście ELISA
FIG. I
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 4,00 zł.
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis, stanowiący polimeryczny nośnik kowalencyjnie sprzężony z polisacharydem meningokoków grupy C lub jego fragmentem, znamienny tym, że zawiera O-deacetylowany O-acetylododatni polisacharyd meningokoków grupy C lub jego fragment, przy czym stopień O-deacetylacji polisacharydu lub jego fragmentu wynosi powyżej 80%.
- 2. Koniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień O-deacetylacji polisacharydu lub jego fragmentu wynosi 100%.
- 3. Sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N. meningitidis, polegający na aktywacji polisacharydu meningokoków grupy C lub jego fragmentu dla potrzeb sprzęgania oraz sprzęganiu aktywowanego polisacharydu z cząsteczką nośnika, znamienny tym, że przed etapem aktywacji przeprowadza się deacetylację powyżej 80% grup O-acetylowych polisacharydu lub jego fragmentu.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że deacetyluje się 100% grup O-acetylowych.
- 5. Sposób według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że deacetylację prowadzi się w warunkach słabo zasadowych w środowisku wodnym.
- 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że deacetylację prowadzi się wodnym roztworem wodorotlenku amonu lub metalu alkalicznego, korzystnie sodu, o stężeniu 0,01 do 0,5N, korzystnie 0,1N, w temperaturze 0 do 50°C, korzystnie 25°C.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że deacetylację prowadzi się przez czas 1 do 25 godzin, korzystnie przez 16 godzin w 0,1N NaOH.
- 8. Szczepionka przeciwko infekcji N. meningitidis, zawierająca dopuszczalne farmaceutycznie wehikulum do iniekcji i ewentualnie dopuszczalny fizjologicznie adiuwant, znamienna tym, że jako składnik antygenowy/immunogenny zawiera immunogenną ilość koniugatu polimerycznego nośnika kowalencyjnie sprzężonego z O-acetylododatnim polisacharydem meningokoków grupy C, O-deacetylowanym w stopniu powyżej 80%, lub jego fragmentem.
- 9. Szczepionka według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera koniugat polimerycznego nośnika kowalencyjnie sprzężonego z O-acetylododatnim polisacharydem meningokoków grupy C, O-deacetylowanym w 100%, lub jego fragmentem.* * *
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/938,367 US5425946A (en) | 1992-08-31 | 1992-08-31 | Vaccines against group C Neisseria meningitidis |
US6450193A | 1993-05-19 | 1993-05-19 | |
PCT/US1993/008155 WO1994005325A1 (en) | 1992-08-31 | 1993-08-30 | Vaccines against group c neisseria meningitidis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL307745A1 PL307745A1 (en) | 1995-06-12 |
PL175595B1 true PL175595B1 (pl) | 1999-01-29 |
Family
ID=26744584
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL93307745A PL175595B1 (pl) | 1992-08-31 | 1993-08-30 | Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidis |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0658118B1 (pl) |
JP (2) | JP4097691B2 (pl) |
AT (1) | ATE212233T1 (pl) |
AU (1) | AU4841693A (pl) |
CA (1) | CA2142981C (pl) |
DE (1) | DE69331495T2 (pl) |
DK (1) | DK0658118T3 (pl) |
ES (1) | ES2171418T3 (pl) |
NO (1) | NO323616B1 (pl) |
PL (1) | PL175595B1 (pl) |
PT (1) | PT658118E (pl) |
WO (1) | WO1994005325A1 (pl) |
Families Citing this family (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5780606A (en) * | 1995-06-07 | 1998-07-14 | Connaught Laboratories Limited | Neisseria meningitidis capsular polysaccharide conjugates |
GB9713156D0 (en) * | 1997-06-20 | 1997-08-27 | Microbiological Res Authority | Vaccines |
US6413520B1 (en) | 1997-06-24 | 2002-07-02 | Chiron Corporation | Methods of immunizing adults using anti-meningococcal vaccine compositions |
US7749511B2 (en) | 2000-04-18 | 2010-07-06 | Endobiologics, Incorporated | Anti-sepsis conjugate vaccine |
WO2001078787A2 (en) * | 2000-04-18 | 2001-10-25 | Endobiologics, Incorporated | Lipopolysaccharide-conjugate vaccine for sepsis treatment |
ES2388848T3 (es) | 2001-01-23 | 2012-10-19 | Sanofi Pasteur Inc. | Vacuna meningocócica polivalente preparada con un conjugado de polisacárido y proteína |
BRPI0411815A (pt) * | 2003-06-23 | 2006-08-08 | Baxter Int | vacinas contra neisseria meningitidis do tipo y e suas combinações meningocócicas |
SI1961426T1 (sl) | 2003-10-02 | 2011-10-28 | Novartis Ag | Kombinirana cepiva proti meningitisu |
GB0323103D0 (en) | 2003-10-02 | 2003-11-05 | Chiron Srl | De-acetylated saccharides |
GB0406013D0 (en) | 2004-03-17 | 2004-04-21 | Chiron Srl | Analysis of saccharide vaccines without interference |
MXPA06011994A (es) | 2004-04-30 | 2007-01-25 | Chiron Srl | Vacunacion con conjugado de meningococos. |
GB0409745D0 (en) | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Compositions including unconjugated carrier proteins |
GB0500787D0 (en) | 2005-01-14 | 2005-02-23 | Chiron Srl | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
GB0605757D0 (en) | 2006-03-22 | 2006-05-03 | Chiron Srl | Separation of conjugated and unconjugated components |
US20080026002A1 (en) | 2006-03-22 | 2008-01-31 | Lisa Danzig | Regimens for immunisation with meningococcal conjugates |
JP5637848B2 (ja) | 2007-06-04 | 2014-12-10 | ノバルティス アーゲー | 髄膜炎ワクチンの製剤化 |
CN101951949B (zh) | 2007-10-19 | 2013-10-02 | 诺华股份有限公司 | 脑膜炎球菌疫苗制剂 |
GB0822634D0 (en) | 2008-12-11 | 2009-01-21 | Novartis Ag | Meningitis vaccines |
GB0822633D0 (en) | 2008-12-11 | 2009-01-21 | Novartis Ag | Formulation |
WO2010070453A2 (en) | 2008-12-17 | 2010-06-24 | Novartis Ag | Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor |
MX2011006756A (es) * | 2008-12-22 | 2011-10-06 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Prueba de bacteremia de proteccion pasica ex-vivo. |
CN102438649A (zh) | 2009-03-24 | 2012-05-02 | 诺华有限公司 | 脑膜炎球菌h因子结合蛋白和肺炎球菌结合糖的组合物 |
PT2411048T (pt) | 2009-03-24 | 2020-07-14 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Proteína de ligação ao fator h meningocócica com adjuvante |
GB201003922D0 (en) | 2010-03-09 | 2010-04-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Conjugation process |
EP2585106A1 (en) | 2010-06-25 | 2013-05-01 | Novartis AG | Combinations of meningococcal factor h binding proteins |
JP6191082B2 (ja) | 2011-03-02 | 2017-09-06 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | より低用量の抗原および/またはアジュバントを有する混合ワクチン |
US9149541B2 (en) | 2011-07-08 | 2015-10-06 | Novartis Ag | Tyrosine ligation process |
MX354924B (es) | 2011-11-07 | 2018-03-22 | Novartis Ag | Molecula portadora que comprende un antigeno spr0096 y un spr2021. |
EP2797624A1 (en) | 2011-12-29 | 2014-11-05 | Novartis AG | Adjuvanted combinations of meningococcal factor h binding proteins |
CN104159603A (zh) | 2012-03-08 | 2014-11-19 | 诺华股份有限公司 | 带有tlr4激动剂的联合疫苗 |
US9526776B2 (en) | 2012-09-06 | 2016-12-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Combination vaccines with serogroup B meningococcus and D/T/P |
CA2894260A1 (en) | 2012-12-18 | 2014-06-26 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Conjugates for protecting against diphtheria and/or tetanus |
KR20160040556A (ko) | 2013-07-11 | 2016-04-14 | 노파르티스 아게 | 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 리신-특이적 화학효소적 단백질 변형 |
MY186874A (en) * | 2014-02-25 | 2021-08-26 | Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt Ltd | A novel downstream process for purifying polysaccharides |
US20180064801A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccines for neisseria gonorrhoeae |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5097020A (en) * | 1983-07-05 | 1992-03-17 | The University Of Rochester | Immunogenic conjugates |
FR2682388B1 (fr) * | 1991-10-10 | 1995-06-09 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'un oligoside par depolymerisation d'un polyoside issu d'un agent pathogene, oligoside ainsi obtenu et son utilisation notamment comme agent vaccinal. |
-
1993
- 1993-08-30 ES ES93921251T patent/ES2171418T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-30 AT AT93921251T patent/ATE212233T1/de active
- 1993-08-30 CA CA002142981A patent/CA2142981C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-30 AU AU48416/93A patent/AU4841693A/en not_active Abandoned
- 1993-08-30 DK DK93921251T patent/DK0658118T3/da active
- 1993-08-30 JP JP50737294A patent/JP4097691B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-30 WO PCT/US1993/008155 patent/WO1994005325A1/en active IP Right Grant
- 1993-08-30 DE DE69331495T patent/DE69331495T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-30 PT PT93921251T patent/PT658118E/pt unknown
- 1993-08-30 EP EP93921251A patent/EP0658118B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-08-30 PL PL93307745A patent/PL175595B1/pl unknown
-
1995
- 1995-02-27 NO NO19950739A patent/NO323616B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-09-19 JP JP2007242721A patent/JP2008044955A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO323616B1 (no) | 2007-06-18 |
AU4841693A (en) | 1994-03-29 |
NO950739L (no) | 1995-04-26 |
PT658118E (pt) | 2002-05-31 |
DE69331495T2 (de) | 2002-10-31 |
DK0658118T3 (da) | 2002-05-06 |
EP0658118A4 (en) | 1995-09-13 |
ES2171418T3 (es) | 2002-09-16 |
CA2142981A1 (en) | 1994-03-17 |
CA2142981C (en) | 2007-10-23 |
JP4097691B2 (ja) | 2008-06-11 |
ATE212233T1 (de) | 2002-02-15 |
EP0658118A1 (en) | 1995-06-21 |
EP0658118B1 (en) | 2002-01-23 |
WO1994005325A1 (en) | 1994-03-17 |
JP2008044955A (ja) | 2008-02-28 |
DE69331495D1 (de) | 2002-03-14 |
JPH08500607A (ja) | 1996-01-23 |
NO950739D0 (no) | 1995-02-27 |
PL307745A1 (en) | 1995-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
PL175595B1 (pl) | Antygenowy/immunogenny koniugat do wytwarzania szczepionki przeciwko infekcji N.meningitidis, sposób wytwarzania antygenowego/immunogennego koniugatu oraz szczepionka przeciwko infekcji N.meningitidis | |
US5425946A (en) | Vaccines against group C Neisseria meningitidis | |
EP0939647B2 (en) | Neisseria meningitidis serogroup b glycoconjugates and methods of using the same | |
US6284884B1 (en) | Antigenic group B streptococcus type II and type III polysaccharide fragments having a 2,5-anhydro-D-mannose terminal structure and conjugate vaccine thereof | |
US5773007A (en) | Vaccine compositions | |
AU2005316864B2 (en) | Glycoconjugate vaccines containing peptidoglycan | |
US20020192205A1 (en) | Immunogenic compositions of low molecular weight hyaluronic acid and methods to prevent, treat and diagnose infections and diseases caused by group A and group C streptococci | |
WO2005044861A1 (en) | Polysaccharides of helicobacter pylori | |
AU2002342321A1 (en) | Immunogenic conjugates of low molecular weight hyaluronic acid with polypeptide toxins |