PL173758B1

PL173758B1 - Sposób niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni

Info

Publication number: PL173758B1
Application number: PL93307168A
Authority: PL
Inventors: Kenneth L. Rabone; Ziya Haq
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1992-07-22
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 1998-04-30
Also published as: KR100252797B1; DE69324015D1; JP3133336B2; WO1994002022A1; AU4577493A; SK6495A3; HUT70688A; CA2140896A1; CN1086255A; TW272114B; HU9500176D0; EP0652709A1; EP0652709B1; BR9306767A; CZ14595A3; ES2130276T3; JPH07509236A; DE69324015T2; PL307168A1; KR950702386A

Abstract

1. Sposób niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni, znamienny tym, ze: a) traktuje sie powierzchnie pokryta osadzonymi mikroorganizmami kompozycja zawierajaca barwnik wybrany z grupy obejmujacej róz bengalski, erytrozyne B oraz ftalocyjaninosulfomany, który wiaze mikroorganizmy i wywoluje fotodynamiczna dez- aktywacje mikroorganizmów, w ilosci od 1 do 100 ppm; i nastepnie b) eksponuje sie te powierzchnie na swiatlo zabijajac mikroorganizmy osadzone na powierzchni fotodynamiczna dezaktywacja. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni na drodze dezaktywacji.

Sposób niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni według wynalazku polega na tym, że:

a) traktuje się powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami kompozycją zawierającą barwnik wybrany z grupy obejmującej róż bengalski, erytrozynę B oraz ftalocyjaninosulfoniany, który wiąże mikroorganizmy i wywołuje fotodynamiczną dezaktywację mikroorganizmów, w ilości od 1 do 100 ppm; i następnie

b) eksponuje się tę powierzchnię na światło zabijając mikroorganizmy osadzone na powierzchni fotodynamiczną dezaktywacją.

Korzystnie stosuje się barwnik, który wytwarza przy ekspozycji na światło tlen singletowy, albo stosuje się barwnik substatywny w stosunku do mikroorganizmów.

Korzystnym jest również barwnik, który wybiela się przez ekspozycję na światło.

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się kompozycję, która dodatkowo zawiera środek powierzchniowo czynny, korzystnie alkoksylowany środek powierzchniowo czynny albo etoksylowany środek powierzchniowo czynny.

Innym korzystnym środkiem powierzchniowo czynnym jest środek, który jest co najmniej w przeważającym stopniu niejonowy i/lub anionowy.

Korzystnie stosuje się środek powierzchniowo czynny w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,05 do 2,5% wagowych całkowitego ciężaru wagowego kompozycji.

W innym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się kompozycję, która zawiera jeden lub więcej rozpuszczalników, korzystny jest rozpuszczalnik polarny, albo alkohol o 2 do 5 atomach węgla o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.

Korzystnie stosuje się rozpuszczalnik w ilości mieszczącej się w zakresie od 2 do 20% wagowych całkowitego ciężaru wagowego kompozycji.

W innym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku stosuje się kompozycję o wartości pH w zakresie od 3 do 5, korzystnie pH wynosi 4.

W szczególnie korzystnym wykonaniu sposobu nanosi się na powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami kompozycję barwnika wywołującego fotodynamiczną dezaktywację mikroorganizmów oraz środka powierzchniowo czynnego i rozpuszczalnika, albo na powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami nanosi się kwaśną, wodną kompozycję czyszczącą, która zawiera kwaśny barwnik, który jest substatywny w stosunku do białka, rozpuszczalnik mieszający się z wodą oraz alkoksylowany środek powierzchniowo czynny i eksponuje się tę powierzchnię na światło a następnie płucze.

Szczególnie korzystne jest stosowanie barwnika, który po wystawieniu na światło wytwarza singletowy tlen. Poprzez absorpcję energii światła cząsteczka barwnika ulega konwersji, przechodząc z podstawowego elektronowego stanu (So) do stanu (Si). (Spiny elektronów połączone są w pary, tak więc w obrazie spektroskopowym występują one w postaci singletów, mających pojedynczy poziom energii w polu magnetycznym).

Stan wzbudzony jest krótkotrwały i może, wieloma sposobami, utracić energię, wracając do stanu podstawowego, np. przez emisję kwantu światła podczas fluorescencji, przez wewnętrzną konwersję i utratę energii podczas ogrzewania, przez zderzenie z cząsteczką innej substancji (wygaszenie fluorescencji).

Nietrwały stan singletowy może również ulec procesowi zwanemu konwersją interkombinacyjną, stając się bardziej trwałym stanem wzbudzonym, stanem tripletowym.

173 758 (Stan ten jest określony jako triplet, ponieważ spin elektronu o wyższym poziomie energetycznym nie jest połączony w parę ze spinem elektronu o niższym poziomie, tak więc stan wzbudzony ma trzy poziomy energii w polu magnetycznym).

Interakcja wzbudzonego stanu tripletowego z cząsteczką tlenu w stanie podstawowym (która normalnie występuje w triplecie) przywraca normalny stan barwnikowi po przekazaniu energii do tlenu, który jest pobudzany do elektronowo wzbudzonego stanu singletowego. Oznacza to, że w idealnych warunkach jedna cząsteczka fotosensybilizatora może wielokrotnie wytwarzać swoje własne skupiska singletowego tlenu.

Pojedynczy atom tlenu jest wysoce reaktywny, a proces fotosensybilizowanego utleniania tą drogą jest znany jako fotoutlenianie typu II. Fotoutlenianie typu II jest niezależne od fotosensybilizatora stosowanego do wytwarzania singletowego tlenu. Ważną cechą fotosensybilizatora jest to, że powinien on mieć wysoką kwantową wydajność tworzenia tripletów (to jest, idealnie, każdy absorbowany foton powinien wytwarzać triplet). Obecność ciężkich atomów w cząsteczce umożliwia konwersję interkombinacyjną do stanu tripletowego.

Fotoutlenianie jakichkolwiek żywotnych składników organizmu może powodować obumarcie komórki (białka, polipeptydów, aminokwasów, lipidów z allilowymi atomami wodoru, tokoferoli, cukrów i celulozy).

Obecnie stosowane korzystne barwniki obejmują róż bengalski (kwaśna czerwień 94, kolor Nr. 45440), erytrozynę B, (kwaśna czerwień 51, kolor Nr. 45430) i ftalocyjaninosulfoniany, takie jak ftalocyjaninosulfoniany glinu (APS) i ftalocyjaninosulfoniany cynku (ZPS). Róż bengalski i erytrozyna B są znanymi barwnikami spożywczymi (róż bengalski jest barwnikiem spożywczym oznaczonym jako czerwień spożywcza nr 105 a erytrozyna B jest oznaczona jako czerwień spożywcza nr 14), przy czym erytrozyna B jest umieszczona na liście EEC jako barwnik dopuszczony do stosowania w produktach kosmetycznych, tak więc obydwa te barwniki są całkowicie odpowiednie do stosowania w kompozycjach przeznaczonych do użytku domowego. Można też stosować mieszaninę barwników, a w niektórych przypadkach byłoby pożądane włączenie do mieszaniny barwnika, który pozostanie widoczny aż do zakończenia procesu fotodynamicznego.

Stężenie barwników w kompozycji nie jest krytyczne i zwykle dochodzi do 100 ppm, ale dobre rezultaty osiąga się przy stężeniach w zakresie 10 ppm do 20 ppm. Niższe stężenia, aż do 1 ppm, również mogą dawać zadowalające efekty.

Tlen w stanie singletowym jest nietrwały, a zatem ma krótki tor dyfuzji, i z tego też względu fotoczuły barwnik wytwarzający singletowy tlen, aby być skutecznym, musi być zbliżony do podstawowego podłoża. Tak więc korzystne barwniki są substantywne w stosunku do mikroorganizmów (to znaczy zdolne do wiązania się z nimi) i zwykle wiążą się z białkiem komórkowym na powierzchni organizmu lub też z innymi składnikami komórkowymi, np. tłuszczami komórki.

Korzystne wymienione powyżej barwniki, po wystawieniu na światło, wytwarzają singletowy tlen i są substantywne w stosunku do białka, a przez to zdolne do wiązania się z mikroorganizmami poprzez białko komórkowe. W ten sposób możliwe jest zamierzone zniszczenie mikroorganizmów, a tym samym działanie bójcze na drobnoustroje.

Korzystne jest także stosowanie barwnika, który ulega wybielaniu wskutek wystawienia na światło. Stosowanie wybielającego się pod wpływem światła i substantywnego w stosunku do mikroorganizmów barwnika daje możliwość uzyskania widocznego wskaźnika obecności mikroorganizmów. Proces fotodynamiczny przebiega wraz z wybielaniem barwnika, powodując śmierć lub inną dezaktywację mikroorganizmów. Stwierdzono, że w przypadku niższego poziomu światła, zarówno wybielanie jak i działanie fotodynamiczne zachodzą wolniej, podczas gdy silniejsze światło intensyfikuje obydwa te procesy, i postępują one znacznie szybciej. Tak więc, w zależności od względnych szybkości wybielania i czynności fotodynamicznej, obecność widocznego barwnika wskazuje użytkownikowi, że fotodynamiczna dezaktywacja wszelkich występujących mikroorganizmów nie została ukończona.

173 758

Fotodynamiczna dezaktywacja mikroorganizmów w zawiesinie za pomocą barwnika, takiego jak róż bengalski, jest znana. Patrz, na przykład Journal of Applied Bacteriology 1985, [58], str. 391-400, Photochemistry and Photobiology 1988, [48] str. 607-612 (Neckers i wsp.) i Shokuhin Eiseigaku Zasshi 1962, 10(5), str. 344-347. Jednakże, stwierdzono obecnie, że odpowiednie barwniki są zdolne do fotodynamicznej dezaktywacji mikroorganizmów na powierzchniach i to właśnie stanowi podstawę obecnego wynalazku. Jak wiadomo, mikroorganizmy są znacznie bardziej wrażliwe na środki bójcze, gdy pozostają w stanie planktonu bądź zawiesiny: są natomiast znacznie trudniejsze do dezaktywacji, gdy powierzchnia, do której są przyłączone stanowi ich naturalne bądź korzystne podłoże. Zwykle mikroorganizmy przebywają na powierzchni w postaci biofilmów, osadzonych w matrycy substancji pozakomórkowej. Ta substancja pozakomórkowa jest czasami określana w literaturze jako adhezyna. Tak więc nie jest oczywiste, czy proces, który oddziaływuje na mikroorganizmy w stanie planktonu, bez konieczności modyfikacji będzie skuteczny wobec organizmów przyłączonych do powierzchni. Przebywające na powierzchniach mikroorganizmy stanowią ważne i zasadnicze źródło zanieczyszczenia w domach, instytucjach i środowisku przemysłowym, a obecny wynalazek może umożliwić osiągnięcie zamierzonego działania bój czego na drobnoustroje.

Sposoby dezaktywacji mikroorganizmów za pomocą barwników opisano np. w publikacjach EP-81 462, EP-286 524, DE-281 22 61. W żadnej z tych publikacji nie przedstawiono wyników efektywności opisanych kompozycji w stosunku do mikroorganizmów osadzonych na powierzchni, przeprowadzane testy aktywności odpowiadają testom zawiesinowym stosowanym do badania mikroorganizmów występujących na powierzchni w postaci zawiesiny.

W odróżnieniu od znanych sposobów dezaktywacji mikroorganizmów za pomocą barwników, przedstawiony w niniejszym zgłoszeniu sposób niszczenia mikroorganizmów za pomocą barwników wybranych z grupy obejmującej róż bengalski, erytrozynę B oraz ftalocyjaninosulfoniany dotyczy niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni.

W trakcie badań stwierdzono, że istnieją istotne różnice między niszczeniem mikroorganizmów osadzonych na powierzchni a niszczeniem mikroorganizmów występujących na powierzchni w postaci zawiesiny. W zależności od sposobu występowania mikroorganizmów na badanej powierzchni stosuje się różne metody testowania biocydów, tj.:

test zawiesinowy - dla testowania środków na ogranizmach występujących na badanej powierzchni w postaci zawiesiny; oraz test powierzchniowy - dla testowania mikroorganizmów osadzonych na badanej powierzchni. Przykłady takich testów opisano między innymi w następujących publikacjach: D. S. Dhaliwal, J. L. Cordier i L. J. Cox Impedimetric evaluation of the efficiency of disinfectants against biofilms w Letters in Applied Microbiology 1992, 15, 217-221; J. T. Holah, C. Higgs, S. Robinson, D. Worthington i H. Spenceley 'A conductance-based surface disinfection test for food hygiene w Letters in Applied Microbiology 1990, 11, 255-259; czy P. Maris Development of a micro-organism carrier-surface method w Science Des Aliments 1992, 12, 721-728.

Z przeprowadzonych badań wynika, że mikroorganizmy osadzone na powierzchni są trudniejsze do usunięcia np. nie można ich usunąć przez spłukanie i przetarcie powierzchni, a ponadto takie mikroorganizmy są bardziej odporne na biocydy (od 10 do 500 razy odporniejsze w zależności od rodzaju testowanego biocydu).

Nieoczekiwanie okazało się, że dzięki zastosowaniu sposobu według wynalazku polegającego na traktowaniu powierzchni kompozycją zawierającą wybrany barwnik i eksponowaniu jej na światło można spowodować fotodynamiczną dezaktywację mikroorganizmów osadzonych na powierzchni.

Sposób według wynalazku jest szczególnie odpowiedni do stosowania w domach i w zakładach przemysłowych, na twardych powierzchniach, takich jak szkło, tworzywa sztuczne, ceramika i powierzchnie metalowe. Szczególnie skutecznie kompozycje stosuje

173 758 się na powierzchniach, które mogą być siedliskiem brudu i oddziaływują one na zanieczyszczenia bakteriologiczne w załomach, złączeniach i na innych stosunkowo ograniczonych obszarach.

Kompozycje korzystnie są kwasowe i mają pH np. w zakresie od 3 do 5, np. o pH około 4, ponieważ stwierdzono, że kompozycje kwasowe, w porównaniu z kompozycjami obojętnymi, mają zasadniczo zwiększoną skuteczność przeciwko mikroorganizmom Gram-ujemnym (G-). Skuteczność przeciwko mikroorganizmom Gram-dodatnim (G+) wydaje się nie być w zasadniczy sposób zależna od pH. Dogodnie kompozycje zakwasza się stosując względnie łagodny kwas organiczny, taki jak kwas octowy.

Neckers i wsp. (powyżej) rozpatrują sprzeczny pogląd, iż samo przenikanie barwnika różu bengalskiego przez ścianę komórkową jest zasadnicze dla procesu dezaktywacji. Zgodnie z ich sugestią, wyniki ich badań potwierdzają hipotezę o przenikaniu barwnika, przede wszystkim w oparciu o różnice w dezaktywacji gatunków G+ i G-. Powłoczka bakterii G- zawiera dodatkową przeponę zasadniczo zbudowaną z lipopolisacharydu, która według Neckers’a i wsp. służy jako zapora dla potencjalnych substancji toksycznych. Alternatywną interpretację może stanowić fakt, iż ilość obecnych w ścianach komórkowych białek z powinowactwem wiązania w stosunku do barwnika jest bardzo różna dla gatunków G+ i G-, a wyższa dla G+ niż dla G-, i zmienia się ona wraz z pH. Stężenie barwnika związanego ze ścianą komórkową, byłoby zatem funkcją pH. Taka interpretacja potwierdzałaby nasze spostrzeżenia dotyczące zależności szybkości zabijania od pH (jednak nie w przypadku szczególnej oporności G+ gatunków B. subtilis i B. megaterium).

Nie ma różnicy pomiędzy wrażliwością na fotodynamiczne działanie różu bengalskiego tworzących endospory gatunków B. subtilis i nie tworzących zarodników S. aureus, kiedy endospory nie występują. Oczywiste różnice wykazane w naszych badaniach przypuszczalnie są związane z obecnością endospor zarówno B. subtilis jak i B. megaterium, które wyraźnie są bardziej oporne wobec singłetowego tlenu niż same bakterie. Zarodniki wystawione na róż bengalski i światło pozostają żywe i dalej kiełkują, tworząc policzalne kolonie. Wiadomo, że spory są trudne do zabarwienia i przypuszczalnie, niezależnie od stosowanych warunków, nie wykazują powinowactwa do różu bengalskiego. Toksyczność singletowego tlenu w stosunku do spor nie jest w literaturze dostatecznie udokumentowana. Badania jednak wykazują, że pod tym względem singletowy tlen ma oddziaływanie na znacznie mniej oporne conidia Neurospora crassa (Photochem. Photobiol., 33, 349, (1981)).

Kompozycja może ewentualnie zawierać inne składniki, takie jak jeden lub więcej środków powierzchniowo czynnych (do czyszczenia) i/lub jeden lub więcej rozpuszczalników.

Środki powierzchniowo czynne są korzystnie alkoksylowane, bardziej korzystnie etoksylowane, np. występują w postaci etoksylowanych alkoholi. Alkohol zawiera korzystnie 4 do 15 atomów węgla, występuje w konfiguracji prostego bądź rozgałęzionego łańcucha i ma wartość HLB (równoważnik hydrofilowo-lipofilowy) w zakresie 10 do 14, np. 12.

W handlu dostępnych jest wiele odpowiednich środków powierzchniowo czynnych, jednym z nich jest środek dostępny pod handlową nazwą Imbentin 91-35, firmy Kolb, który jest niejonowym etoksylowanym alkoholem C9.11, zawierającym średnio 5 moli tlenku etylenu na mol alkoholu.

Również stosowane być mogą pierwszorzędowe etoksysiarczany.

W razie potrzeby można stosować mieszaniny środków powierzchniowo czynnych.

Korzystnie środek powierzchniowo czynny jest niejonowy lub anionowy, lub stanowi mieszaninę obydwu tych typów.

Korzystne anionowe środki powierzchniowo czynne obejmują pierwszorzędowe alkilosiarczany (PAS), korzystnie dodecylosiarczan sodu (SDS). Szczególnie korzystne

173 758 są dostępne w handlu mieszaniny o znacznej zawartości siarczanu dodecylu (np. Empicol LX). Dodecylosiarczan jest znanym środkiem denaturującym białko, jest skuteczny w usuwaniu białka z powierzchni i ma działanie biocydowe.

Kompozycja jest korzystnie zasadniczo pozbawiona kationowego środka powierzchniowo czynnego, ale może zawierać małą ilość kationowego środka bakteriobójczego.

Środek powierzchniowo czynny korzystnie występuje w ilości w zakresie 0,05 do 2,5% wagowych całkowitego ciężaru kompozycji, a zwykle od 0,5% do 1,5% wagowych, np. 0,7% wagowych niejonowego z ewentualną zawartością do 0,2% wagowych anionowego środka powierzchniowo czynnego.

Korzystnym rozpuszczalnikiem jest rozpuszczalnik polarny i korzystnie jest to alkohol o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym zawierającym 2 do 5 atomów węgla, taki jak etanol, butanol, izopropanol, (propan-2-ol) (IPA), N-butoksypropan-2-ol (eter nbutylowy glikolu propylenowego), 2-butoksyetanol (eter monobutylowy glikolu etylenowego). Korzystnym rozpuszczalnikiem jest IPA.

Można również stosować dwuwodorotlenowy alkohol, taki jak glikol etylenowy, oraz mieszające się z wodą etery, takie jak dimetoksyetan.

W razie potrzeby można stosować mieszaninę rozpuszczalników, np. mieszaninę etanolu i N-butoksypropan-2-olu.

Korzystnie, ilość rozpuszczalnika zawiera się w zakresie 2 do 20% wagowych w przeliczeniu na całkowity ciężar wagowy kompozycji.

Przynajmniej niektóre z powyższych rozpuszczalników, np. etanol, osłabiają ściany komórkowe mikroorganizmów, czyniąc je bardziej przepuszczalnymi, a przez to bardziej wrażliwymi na przenikanie singletowego tlenu. Dzięki temu efekt niszczenia mikroorganizmów przez barwnik jest wzmocniony.

Stwierdzono, że obecność środka powierzchniowo czynnego może zmniejszać fotodynamiczne oddziaływanie barwnika (prawdopodobnie przez rozpuszczanie barwnika i tym samym zapobieganie adsorpcji na ścianach komórkowych) i obecność rozpuszczalnika również może redukować takie oddziaływanie (przypuszczalnie jako konkurencyjnego dla singletowego tlenu). Stwierdzono jednakże, że w przypadku sporządzenia trójskładnikowej kompozycji, zawierającej barwnik, środek powierzchniowo czynny i rozpuszczalnik, redukcja fotodynamicznego oddziaływania barwnika jest mniejsza niż należałoby się spodziewać na podstawie połączonego działania środka powierzchniowo czynnego i rozpuszczalnika. Środek powierzchniowo czynny i rozpuszczalnik mają razem działanie synergistyczne, którego rezultatem jest obniżenie poziomu redukcji fotodynamicznego oddziaływania barwnika.

Kompozycja może zawierać wiele dodatkowych składników, a mianowicie:

1. Wzmacniacze detergentu, korzystnie środki chelatujące metal, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Środki chelatujące metal (łącznie z EDTA) są również, jak stwierdzono, zdolne do przenikania ścian komórkowych, powodując, że mikroorganizmy stają się bardziej wrażliwe w stosunku do środków bójczych.

2. Elektrolity, takie jak bufor bądź sól, np. Na2SOą, które uczestniczą w wiązaniu barwnika z białkiem, wspomagając jego przemieszczanie się z fazy wodnej do soli białka. Elektrolit jest zazwyczaj obecny w rozmaitych, dostępnych w handlu, kompozycjach barwników, aczkolwiek można, w razie potrzeby, dodać dodatkowego elektrolitu. Całkowita zawartość elektrolitu w kompozycji zwykle będzie mieściła się w zakresie 0 do 1% wagowego, korzystnie około 0,1%.

3. Substancje zapachowe

4. Środki zagęszczające

Środek jest w postaci izotropowej jednofazowej kompozycji i szczególnie jest używany jako środek bakteriobójczy (również z możliwym działaniem czyszczącym) na powierzchniach twardych, znajdując zastosowanie w szerokim kontekście, łącznie z zastosowaniem w domu, np. na powierzchniach w kuchni i łazience, łącznie z muszlami

173 758 toaletowymi, w instytucjach, takich jak szkoły, szpitale itd., a także w lokalach handlowych, takich jak fabryki, biura, hotele itd.

Do użytku domowego, kompozycja korzystnie jest sporządzana jako produkt przeznaczony do rozpylania i dogodnie pakowana jest w odpowiednie pojemniki, np. pojemnik do rozpylania z zapadką uruchamianą ręcznie lub urządzenie dozujące aerozol. Korzystnie pojemnik jest nieprzepuszczalny dla światła.

Kompozycja jest nakładana na powierzchnię, która ma być traktowana, dowolnym dogodnym sposobem, np. przez rozpylanie z odpowiedniego dozownika, wycieranie za pomocą nośnika, takiego jak szmatka lub gąbka, lub wylewanie z pojemnika itd. Następnie, powierzchnię taką wystawia się na działanie źródła światła, np. źródła światła białego, takie jak kwarcowa lampa halogenowa lub fluorescencyjne źródło światła dziennego. (Sposób ten może być alternatywny wobec stosowanego niebezpiecznego promieniowania działającego bójczo na drobnoustroje, np. z niskociśnieniowej lampy rtęciowej, emitującej promieniowanie rezonansowe przy 254 nm. Takie promieniowanie jest szkodliwe dla niezabezpieczonych oczu). W razie potrzeby, można następnie stosować etap przemywania, np. przez wycieranie za pomocą nośnika, bądź zastosowanie strumienia bieżącej wody itd.

Aby zilustrować wynalazek, będzie on poniżej opisany za pomocą następujących przykładów i odnoszących się do nich rysunków, na których:

Figura 1 przedstawia dwusłupkowe wykresy wartości log (redukcja) ilustrujących śmiertelne oddziaływanie różu bengalskiego i św:i^itła na różne mikroorganizmy w zawiesinie o wartości pH 4 i pH 7; fig. la ukazuje wyniki dla mikroorganizmów Gramdodatnich, a fig. 1b dla organizmów Gram-ujemnych i dla drożdży;

Figura 2 jest parą wykresów log (redukcja) ukazujących biocydowy wpływ różu bengalskiego i światła na 5. aureus i E. coli jako funkcję wartości pH; fig. 2a ukazuje wyniki po 20-minutowej ekspozycji na światło, a fig. 2b przedstawia wyniki po 60-minutowej ekspozycji;

Figura 3 stanowi parę wykresów, jak na fig. 2, uzyskanych po zastosowaniu erytrozyny B zamiast różu bengalskiego;

Figura 4 - dwusłupkowy wykres log (redukcja), ilustrujący fotohigieniczne oddziaływanie różnych połączeń różu bengalskiego (RB), Imbentin’u C91-35 (AE), izopropanolu (IPA) i Empicol’u LX (PAS); fig. 4a obrazuje wyniki uzyskane bez ekspozycji na światło, a fig. 4b po ekspozycji na światło;

Figura 5 jest wykresem adsorpcji różu bengalskiego przez E. coli, którego zaadsorbowaną ilość (nanomole) przeciwstawiono wyrównoważonemu stężeniu (mikromole/1), dla wyników przy pH 4 przedstawionych za pomocą kwadracików i przy pH 7 zaznaczonych krzyżykami;

Figura 6 jest parą wykresów, podobnie jak fig. 5, ukazujących oddziaływanie elektrolitu; na fig. 6a przedstawiono wyniki uzyskane przy pH 4, a na fig. 6b przy pH 7, z wynikami osiągniętymi bez substancji dodatkowej zaznaczonymi kwadracikami, z siarczanem sodu (1%) zaznaczonymi krzyżykami i siarczanem sodu (5%) zaznaczonymi podwójnymi krzyżykami;

Figura 7 stanowi parę wykresów, podobnie jak fig. 5, przedstawiających oddziaływanie środka powierzchniowo czynnego; na fig. 7a pokazano rezultaty przy pH 4, a na fig. 7b przy pH 7, z wynikami osiągniętymi dla niejonowego środka powierzchniowo czynnego (0,7%) (NI) zaznaczonymi krzyżykami i dla PAS (0,7%) zaznaczonymi podwójnymi krzyżykami;

Figura 8 jest wylkresem, podobnie jak fig. 5, przedstawiającym oddziaływanie rozpuszczalnika przy pH 4, z rezultatami uzyskanymi bez stosowania substancji dodatkowej zaznaczonymi małymi kwadracikami, dla 10% IPA zaznaczonymi krzyżykami, dla 0,7% Imbentin zaznaczonymi podwójnymi krzyżykami oraz dla 10% IPA i 0,7% Imbentinu zaznaczonymi większymi kwadratami;

173 758

Figura 9 jest wykresem log (redukcja) czasu ekspozycji (minuty), ukazującym wpływ pH na szybkość niszczenia E. coli przez róż bengalski, z wynikami przy pH 4 zaznaczonymi kwadracikami i przy pH 7 zaznaczonymi krzyżykami, oraz

Figura 10 jest wykresem podobnym do fig. 9 przedstawiającym wpływ elektrolitu przy pH 7 na szybkość niszczenia E. coli przez róż bengalski, z rezultatami bez stosowania elektrolitu zaznaczonymi kwadracikami i osiągniętymi dla siarczanu sodu zaznaczonymi krzyżykami.

W opisie, przykładach i na schematach stosuje się następujące skróty:

- róż benaalski;

- Imbeniin C91-35;

- izopropanol;

- Empicol 1X5;

- niej’o nowy środek powierzchmowo

RB AE IPA PAS NI

Stosowane środki pomocnicze zawierają następujące substancje aktywne:

Empicol LX Imbentin C91-35 Dowanol PnB Lialet 111 siarczan sodowolauryJowy;

- e-oksyJowany alkohol łb^zczoNy o D-H atomach wwęga;

- N-butoksy propan-2-ol;

- e-oksyJowany alkoho l o 11 otomacw w;gia i średnim stopniu etoksylacji 3.

Przygotowanie inoculum

W opisanych doświadczeniach stosowano następujące mikroorganizmy [uzyskane zarówno z National Collection of Type Cultures (NCTC), jak i American Type Culture Collection (ATCC)]:

Bakterie:

Staphylrcoccul aureus	NTCT 6538	(Gram-dodatnie)
Escherichia coli	NCTC 8196	(Gram-ujemne)
Pseudomonim aeruniaosa	NTCT 5940	(Gram-ujemne)
Enterobacter sp.	NTCT 3281	(Gram-ujemne)
Klebsiella sp.	ATCC 11677	(Gram-ujemne)
Bacillus subtilis	NCTC 6432	(Gram-dodatnie)
Bacillus megaterium	NCTC 7581	(Gram-dodatnie)

Drożdże:

Cindida albicans

Organizmy wzrastały w ciągu całonocnej inkubacji w pożywce bulionowej w temperaturze 37°C dla bakterii (28°C dla Ps. aerugiaosa) lub w bulionie SABS (SABS jest dekstrozowym agarem Sabouranda, z płynnym podłożem w przypadku bulionu SABS, z firmy Oxoid Ltd) i w temperaturze 28°C dla drożdży. Kultury oddzielono przez filtrację próżniową, stosując filtr 0,45 um Millipore, i przemyto roztworem Ringera o ćwierciokrotnie mniejszej mocy, po czym ponownie zawieszono w roztworze Ringera (10 ml). Organizmy w zawiesinie policzono przez seryjne rozcieńczenia i umieszczenie ni płytkach z pożywką agarową (bakterie) i agarem SABS (drożdże), wyrażając całkowitą ilość żywotnych organizmów (TVC) jako logarytm dziesiętny liczby tworzących kolonie jednostek (cfu) na ml.

Jeżeli nie określono inaczej, doświadczenia prowadzone były przy pH 7.

1) Metoda dyfuzyjno-krążkowa w agarze

Przygotowano roztwory wodne zawierające 100 ppm barwnika. Podwielokrotność (10 ml) każdego roztworu barwnika wyjałowiono w standardowych szklanych fiolkach z nakrętką. Wyjałowiono również krążki do antybiogramów (13 mm, prod. przez BDH). Wszystkie organizmy wzrastały w ciągu nocy w pożywce lub bulionie SABS (10 ml).

173 758

Dla każdego mikroorganizmu, na dwóch płytkach z pożywką agarową posiano w ciągu nocy kulturę (10 ul), uzyskując rozlewający się wzrost na całej płytce. Krążek zanurzono, stosując aseptyczne techniki, w roztworze pierwszego barwnika i umieszczono na powierzchni posianej płytki z agarem. To samo powtórzono z dwoma innymi roztworami barwnika, otrzymując po trzy krążki na każdej z podwójnych płytek.

Jedną z każdej pary podwójnych płytek natychmiast ulokowano w inkubatorze w odpowiedniej temperaturze i przy minimalnej ekspozycji na światło. Pozostałe płytki na 3 godziny umieszczono na górze oświetlonej skrzynki. Oświetlenie skrzynki stanowiło rozproszone białe światło o średnim natężeniu 4000 luksów, pochodzące ze świetlówki fluorescencyjnej emitującej światło dzienne (2 x 15 watów, produkcji Exal X-ray Accesories Ltd, Hemel Hempstead). Za pomocą światłomierza Megatron DA10 zmierzono natężenia światła na powierzchni dyfuzora. Po ekspozycji, płytki inkubowano przez noc i następnie badano strefy zahamowania wokół krążka.

Stosując powyższy sposób, uzyskano następujące rezultaty:

Przykład 1. (Metoda krążkowa)

W tabeli 1 zestawiono wyniki uzyskane w agarze dla wodnych roztworów barwników: różu bengalskiego, erytrozyny B i ftalocyjaninosulfonianu glinu (APS) (100 ppm) przy pH i po 180-minutowej ekspozycji na światło, jak opisano powyżej. Wyniki w tabeli wyażono jako różnicę (w milimetrach) pomiędzy promieniem wyraźnej strefy hamowania (jest to obszar bez wzrostu bakterii na pokrytej agarem płytce) a promieniem krążka. Im wyższa jest ta wartość, tym większe zabicie bakterii.

Zgodnie z metodą dyfuzyjno-krążkową w agarze, róż bengalski sytuuje się jako bardziej skuteczny niż strukturalnie podobna erytrozyna B. Może to być przypisane różnicy w kwantowej wydajności wytwarzania singletowego tlenu. Kwantowa wydajność wytwarzania singletowego tlenu, w metanolu, wynosi 0,76 dla różu bengalskiego w porównaniu do 0,6 dla erytrozyny B. Jednakże do zaobserwowanych rozbieżności przyczyniać się może również wiele innych czynników, takich jak szybkość dyfuzji barwnika lub różnice w wiązaniu barwnika z żelem agarowym lub z materiałem krążka.

Szczególną cechą wyników metody krążkowej jest wyaźna różnica we wrażliwości Gram-dodatnich i Gram-ujemnych organizmów na działanie fotodynamiczne przy pH co najmniej 7. Przypuszczalne przyczyny oporności względnej mikroorganizmów G- są omówione gdzie indziej.

Roztwory testowe do badań na powierzchni

Róż bengalski (20 ppm) w buforze o pH 4 oraz:

1) Bez innych dodatków

2) Etanol (10% obj./obj.) i Imbentin C91-35 (0,7%)

3) Propan-2-ol (10% obj./obj.) i Imbentin C91-35 (0,7%)

Jako roztwór kontrolny dodatni stosowano roztwór podchlorynu sodu (0,125%).

Ocena ilości organizmów przylegających do powierzchni płytki Petriego

Zawiesinę mikroorganizmów, np. S. aureus (0,5 ml) dodano do podwielokrotności (100 ml) roztworu Ringera o 1/4 mocy i oznaczono średnią cfu na ml (TVC). Podwielokrotności tych roztworów (20 ml) przeniesiono pipetą na sterylne płytki Petriego i pozostawiono na 5 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą pipety usunięto inokulum do jałowej butli i obliczono ilość cfu na ml pozostającą w zawiesinie. Na podstawie różnicy w stężeniach roztworów oszacowano ilość organizmów przylegających do płytki Petriego (jako cfu) na cm kwadratowy.

Metoda badań

Zawiesiny bakterii w roztworze Ringera o 1/4 mocy (20 ml) przeniesiono pipetą na sterylne plastikowe płytki Petriego i pozostawiono je w temperaturze otoczenia na 5 godzin. Następnie usunięto inoculum, płytki przemyto raz roztworem Ringera,

ΥΤ3 758 za pomocą łagodnego wirowania ręcznego, po czym roztwór wylano. Pary bakteryjnie zanieczyszczonych płytek traktowano roztworami testowymi. Podwielokrotność (20 ml) roztworu testowego wylano na jedną płytkę i po 30 sekundach roztwór zdekantowano. Płytkę przemyto buforem o pH 4 i umieszczono w oświetlonej skrzynce na 20 min. W oddzielnym doświadczeniu drugą płytkę z roztworem pozostawiono na 20 minut w oświetlonej skrzynce, a po zdekantowaniu roztworu przemyto ją buforem o pH 4. Powtórzono obydwa doświadczenia.

Po wystawieniu na światło, jedną z płytek pokryto agarem sojowym, Tryptone Soya, zawierającym 1% glukozy i 0,015% czerwieni obojętnej, oziębionej do około 50°C. Drugą z płytek zabarwiano przez 30 sekund 0,01% oranżem akrydynowym, przemyto i badano pod mikroskopem (mikroskop Optiphot prod. Nikon wyposażony w apochromatyczny obiektyw 100x z olejkiem imersyjnym, okular 10x i przyrząd do epifluorescencji z układem filtr obustronny B2-A/dichroiczne zwierciadło i wysokociśnieniową lampą rtęciową). Powleczone agarem płytki inkubowano w 37°C przez 48 godzin, po którym to czasie z przywierających do nich bakterii, które nie zostały zniszczone, wyrosły kolonie. Kolonie pobrały czerwień obojętną i mogły być widziane i policzone pod agarem na powierzchni płytki. (A. M. R. Mc Kenzie i R. L. Rivera-Calderon, Agar Overlay Method to Measure Adherence of Staphylococcus epidermidis to Four Plastic Surfaces, Applied and Environmental Microbiology, 50, 1322 (1985)).

Płytki zabarwione oranżem akrydynowym badano i fotografowano. Policzono zabarwione bakterie w polu widzenia (skupiska traktując jako jedną) po uprzedniej ocenie za pomocą fotografowania w skali mikrometrycznej.

Przykład 2. (Badanie na powierzchni)

Kontrolne badania na powierzchni, zarówno z zastosowaniem bezpośredniej mikroskopii epifluorescencyjnej, jak opisano powyżej, jak i wysuszania zawiesiny, dały podobne wyniki dla ilości bakterii (S. aureus), przyłączonych do powierzchni płytki z tworzywa sztucznego (rzędu 1 milion na cm kwadratowy).

Ograniczenie powierzchni kontroli dodatniej (roztwór podchlorynu sodu, 30 sekund) redukuje ilość żywotnych bakterii do zera. Wyniki dla fotodynamicznie zdezaktywowanych bakterii zestawiono w tabeli 2 jako dziesiętny logarytm redukcji [log (redukcja)] żywotnych bakterii przed i po ekspozycji, to jest log (ilość początkowa) log (ilość końcowa).

Przykład 3. Kompozycja: róż bengalski (20 ppm), niejonowy środek powierzchniowo czynny (Imbentin C91-35, 0,7%), propan-2-ol (10%) (pH 4)

Stosowano uprzednio opisaną procedurę eksperymentalną, z tym wyjątkiem, że bakterie, aby mogły być przyłączone do powierzchni, musiały być w fazie silnego wzrostu. Cel ten osiągnięto przez 3-godzinną inkubację na plastikowych płytkach Petriego w pożywce bulionowej (dla bakterii) lub w bulionie SABS (dla drożdży). W przykładzie 2 zawiesinę nie wzrastających bakterii w roztworze Ringera pozostawiono do odstania przez 5 godzin. Zadziałało to dobrze na S. aureus, ale nie na inne bakterie. Wyniki przedstawiono w tabeli 3.

Poprzednie doświadczenie z zastosowaniem bezpośredniej mikroskopii epifluorescencyjnej sugeruje, iż w przypadku uzyskania rozlewającego się wzrostu, mógłby on być równoważny do początkowej gęstości powierzchniowej żywotnych bakterii, rzędu 1 milion/cm². Powierzchnia stosowanych płytek Petriego wynosiła około 57 cm², tak więc we wszystkich przypadkach obróbka zmniejszyła poziom zanieczyszczeń, a rząd wielkości wynosi przynajmniej 5 (log 5).

Badania na powierzchni są znacznie trudniejsze do przeprowadzenia niż badania w zawiesinie, z tych więc względów, aby ukazać wpływ zmieniających się warunków, większość prac eksperymentalnych prowadzono w zawiesinie.

173 758

Przygotowanie roztworów do badań w zawiesinie

Przygotowano następujące roztwory podstawowe przez odważenie i wyjałowienie (z wyjątkiem tych, które zawierają rozpuszczalnik):

Róż bengalski (0,2%) w propano-2-olu (95%)

Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Imbentin C91-36, 14%) (określany czasami skrótem AE, dla etoksylowanego alkoholu)

Anionowy środek powierzchniowo czynny (Empicon LX, 14% (powoływany czasami jako PAS) bufor pH 4[kwas cytrynowy (0,1 M, 307 ml) + dwuzasadowy fosforan sodu (0,2 M, 193 ml) bufor pH 7 [diwodoroortofosforan sodu (0,4 M, 468 ml) + dodekahydrat wodoroortofosforanu disodu (0,4 M, 732 ml)]

Bufory o pH 5, 6, 8, 9 sporządzono jak wskazano w CRC Handbook of Chemistry and Physics, 8-36, 73 wyd., CRC Press (1992-1993).

Końcowe stężenia roztworów testowych wynosiły zwykle:

Róż bengalski 20 ppm

Etanol 10,0% («^j./otjj.)

Środek powierzchniowo czynny 0,7% (wag./obj.)

W kilku przykładach stosowano inne stężenia niż określone.

Metoda badań

Roztwory sporządzono w jałowych płytkach Petriego z tworzywa sztucznego o głębokości 5 mm (30 mis). Do każdego roztworu dodano zawiesinę mikroorganizmów (0,3 ml) i łagodnie wymieszano. Jeżeli w roztworze testowym występował róż bengalski, był on dodawany na końcu, aby zminimalizować naświetlanie. Następnie roztwory zarówno umieszczano w oświetlonej skrzynce, w ciemności (w warunkach zmniejszonej ekspozycji na światło), bądź też pozostawiono na stole. Średnie natężenie światła na powierzchni dyfuzora w oświetlonej skrzynce wynosiło 4000 luksów, co zmierzono za pomocą światłomierza Megatron DA 10 (prod. Megatron Ltd). Po określonych czasach ekspozycji policzono żywe bakterie jako tworzące kolonie jednostki (cfu/ml), po czym inkubowano, poddawano seryjnym rozcieńczeniom i umieszczono na płytkach z agarem. Oznaczono logarytm dziesiętny ilości pozostałych bakterii (jako jednostki tworzące kolonie na ml) i porównano z ilością przed ekspozycją - log (ilość początkowa) - log (ilość końcowa). Im wyższa jest ta wartość, tym większe zabicie bakterii.

Aby zoptymalizować działanie fotodynamiczne przeciwko wielu organizmom, łącznie z organizmami Gram-ujemnymi i drożdżami, badania w zawiesinie prowadzono wobec rozmaitych mikroorganizmów i w różnorodnych warunkach. Wyniki tych badań są zestawione w odpowiednich tabelach. Są one wyrażone jako logarytm początkowej ilości jednostek tworzących kolonie na ml do ilości pozostającej po ekspozycji, log (redukcja). Zgodnie z tym oznakowaniem, wartość zero oznacza, że ilość organizmów, po poddaniu ich działaniu różnych warunków, nie zmieniła się. Oznakowanie poprzedzające liczbę log redukcji, wskazuje, że nie obserwowano wzrostu mikroorganizmów (tj. całkowite zabicie).

Przykład 4. W celu ukazania śmiertelnego działania różu bengalskiego i światła na mikroorganizmy w zawiesinie, a zwłaszcza synergii niskiej wartości pH i etanolu, prowadzono badania w zawiesinie, jak opisano powyżej. Badania prowadzono z użyciem samego różu bengalskiego (20 ppm) i w połączeniu z etanolem (10%, obj./obj.) i przy 20-minutowej ekspozycji na światło (oświetlona skrzynka). Wyniki wyażone jako wartości log (redukcja) podano w tabeli 4.

Dłuższe czasy ekspozycji (60 i 100 minut) poprawiają wyniki dla organizmów Gramujemnych, zwłaszcza przy pH 7.

173 758

Jak będzie pokazane, wyniki dla organizmów Gram-ujemnych są znacznie lepsze przy pH 4 w porównaniu z pH 7.

Przykład 5. Badania prowadzono, jak opisano powyżej, przy pH 4 i pH 7 i przedstawiono śmiertelne działanie różu bengalskiego (20 ppm) i światła (20-minutowa ekspozycja w oświetlonej skrzynce) na rozmaite Gram-dodatnie i Gram-ujemne mikroorganizmy i drożdże w zawiesinie. Wyniki wyrażone jako log (redukcja) są przedstawione graficznie na fig. 1a i 1b. Fig. 1a pokazuje rezultaty dla mikroorganizmów Gram-dodatnich, a fig. 1b dla mikroorganizmów Gram-ujemnych i drożdży.

Przykład 6. Badania prowadzono, jak opisano powyżej, w zakresie różnych wartości pH i ukazano biobójcze działanie różu bengalskiego (20 ppm) i światła na

S. aureus (G + ) i E. coli (G-) jako funkcję pH. Wyniki, wyrażone jako log (redukcja), przedstawiono graficznie na fig. 2a (20-minutowy czas ekspozycji) i 2b (60-minutowy czas ekspozycji). Na figurach tych krzyżyki pokazują wyniki dla kontrolnych (G-), podwójne krzyżyki dla E. coli, odwrócone trójkąty dla kontrolnych (G+), a trójkąty dla

S. aureus;.

Podobnie badania w zawiesinie prowadzono w celu przedstawienia biobójczego działania erytrozyny B i światła na S. aureus i E. coli w funkcji pH. Wyniki przedstawiono graficznie na fig. 3a i 3b, które są prawie identyczne jak fig. 2a i 2b. Pokazują one, że erytrozyna B działa podobnie jak róż bengalski, jeśli chodzi o jej fotobiocydowy profil względem pH.

Przykład 7. Prowadzono dalsze badania w zawiesinie, jak opisano powyżej, przy pH 7 i stosując następujące roztwory:

Niejonowy środek powierzchniowo czynny Imbentin C91-35 (0,7%)

Imbentin C91-35 (0,7%) z różem bengalskim (100 ppm)

Anionowy środek powierzchniowo czynny Empicol LX (0,7%)

Empicol LX z różem bengalskim (100 ppm)

Imbentin C91-35, Empicol LX (obydwa 0,7%) i róż bengalski (100 ppm)

Rezultaty zestawiono poniżej w tabeli 5. W tabeli tej określenie ciemno wskazuje raczej warunki zmniejszonej ekspozycji na światło niż całkowitej ciemności, powodem czego są praktyczne trudności w uniknięciu choćby niewielkiej ekspozycji na światło. Określenie jasno oznacza wyniki będące średnią z kilku doświadczeń prowadzonych w zakresach czasowych (20 minut, 1 godzina, 3 godziny) w statystycznie wyznaczonym eksperymencie.

Wyniki uzyskane w podobny sposób dla E. coli przy pH 7 są przedstawione graficznie w postaci wykresów słupkowych na fig. 4. Na figurze tej PAS stosuje się jako skrót dla Empicolu LX, IPA jest skrótem dla izopropanolu, a AE dla Imbentinu C91-35. Rysunek ten obrazuje uśrednione dane dla 0,7% AE, 0,7% PAS i 10% IPA.

Przykład 8. Prowadzono dalsze badania w zawiesinie przy pH 4 dla E. coli, stosując jeden lub więcej z następujących: róż bengalski 40 ppm, środek powierzchniowo czynny 0,7% (Imbentin C91-35 lub Empicol LX), IPA (izopropanol) 10%. Wyniki podano w tabeli 6.

Następujące przykłady dotyczą badań w zawiesinie, prowadzonych ogólnie tak jak opisano powyżej, ale przy pH 4. Kiedy stosowano róż bengalski, był on obecny w stężeniu 20 ppm, aczkolwiek w niektórych przypadkach działaniu światła poddawano roztwory kontrolne, bez różu bengalskiego, czego wyniki przedstawiono w kolumnie z nagłówkiem Bez różu bengalskiego.

W przykładach 9, 10, 11 i 12 stosowano Gram-dodatnie S. aureus, a w przykładach 13 i 14 Gram-ujemne E. coli. Inne stosowane reagenty określono w przykładach. We wszystkich tych przykładach, próbki wystawiono na 20 minut w oświetlonej skrzynce. Średnie natężenie na powierzchni dyfuzora wynosiło 4000 luksów, co zmierzono światłomierzem Megatron DA10 (prod. Megatron Ltd.).

173 758

Przykład 9. Prowadzono badania w zawiesinie dla S. aureus, stosując róż bengalski, etanol i Imbentin C91-35. Logarytm dziesiętny początkowego stężenia, log (start), dla S. aureus wynosił 6,8. Wyniki podano w tabeli 7.

Przykład 10. Prowadzono badania w zawiesinie dla S. aureus, stosując róż bengalski, Dowanol PnB i Imbentin C91-35. Log (start) wynosił 6,9. Wyniki podano w tabeli 8.

Przykład ten pokazuje, iż Dowanol PnB ma pewne własności biobójcze.

Przykład 11. Prowadzono badania w zawiesinie dla S. aureus, stosując róż bengalski, glikol etylenowy i Imbentin C91-35. Log (start) wynosił 6,8. Wyniki podano w tabeli 9.

Przykład 12. Prowadzono badania w zawiesinie dla S. aureus, stosując róż bengalski, IPA i Lialet 111. Lialet 111 jest nazwą dostępnej w handlu kompozycji eterosiarczanu produkcji Enichem, mającej średnią długość łańcucha 11 i średni stopień etoksylacji 3. Log (start) wynosił 6,7. Wyniki podano w tabeli 10.

Przykład 13. Prowadzono badania w zawiesinie dla E. coli, stosując róż bengalski, propan-2-ol i Imbentin C91-35. Log (start) wynosi; 6,8. Wyniki podano w tabeli 11.

Przykład 14. Prowadzono badania w zawiesinie dla £. coli, stosując róż bengalski, etanol i Imbentin C91-35. Log (start) wynosił 7,1.

Wyniki podano w tabeli 12.

Przykład 15. Oznaczono adsorpcję różu bengalskiego za pomocą odparowania wody ze stężonego roztworu. Stężenia uzyskano metodą spektroskopową z absorbancji mierzonych przy długości fali o maksymalnej absorbancji (około 549 nm) przy użyciu spektrofotometru WPA Linton 3100, na supematantach uwolnionych od mikroorganizmów przez odwirowanie.

Wyniki przedstawiono na fig. 5 do 8.

Wyniki te pokazują, że działanie fotobiocydowe uzależnione jest od adsorpcji barwnika. Adsorpcja barwnika jest:

a) zwiększona przy niskiej wartości pH (fig. 4);

b) zwiększona przez obojętny elektrolit (który również zwiększa fotobiocydowe oddziaływanie na E. coli przy neutralnym pH) (fig. 6);

c) zmniejszona przez środek powierzchniowo czynny (fig. 7);

d) zwiększona przez propan-2-ol (fig. 8).

Obliczenia wskazują, że zaadsorbowana przez E. coli ilość pozostaje we właściwej proporcji do zabezpieczenia warstwy bakterii, a ponieważ wiadomo, że barwnik ma tendencje do gromadzenia się, wyliczona powierzchnia E coli powinna być pomniejszona (bez brania pod uwagę fimbriae/pili). Szczegółowe zestawienie wyników jest podane poniżej. Cząsteczkowy wymiar różu bengalskiego wyliczono z modelu skali (Catalin Ltd., Londyn).

Powierzchnia E. coli 1E7 nm²

Powierzchnia różu bengalskiego 2 im? (płaska)

0,5 nm² (boczna)

Zabezpieczona warstwa 5E6 (płaska) lub 20E6 (boczna)

Pomiary adsorpcji 2-8 E-16 moli/bakterie

Ilość cząsteczek 1210 - 480 E6 dla bakterii

Przykład 16. Prowadzono badania w zawiesinie, jak opisano powyżej, dla określenia wpływu różu bengalskiego na szybkość zabicia E. coli, w zależności od wartości pH i dodatku elektrolitu (5% siarczan sodu) przy pH 7, a wyniki pokazano graficznie na figurach 9 i 10, odpowiednio.

173 758

Tabela 1 (Przykład 1)

Fotobiocydowe oddziaływanie ujawnionych środków

Strefa zahamowania wokół krążka

Mikroorganizm	Typ Gram	Róż bengalski	Erytrozyna B	APS
S. aureus	+	4	1	2
B. subtilis	+	3	1	1
B. megaterium	+	3	1	1,5
E. ooli	-	0	0	0
Ps. aeruginosa	-	0	0	0
Enterobacter sp.	-	0	0	0
C. albicans		0	0	0

Tabela 2 (Przykład 2)

Śmiertelne działanie różu bengalskiego i światła na Staphylococcus Aureus przyłączonych do powierzchni z tworzywa

Roztwór	Log (Stosunek)
Róz bengalski	4,7
Róż bengalski + Imbetin C91-35 + Etanol	6,0

Tabela 3 (Przykład 3)

Mikroorganizm	Nr doświadczenia	Wyniki w metodach z płytką pokrytą agarem
Kontrola	Po ekspozycji
S. aureus	1	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
	2	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
E. coli	1	Duży wzrost	45 cfu
	2	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
K. pneumoniae	1	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
	2	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
P. aeruginosa	1	Duży wzrost	5 cfu
	2	rozlewający się wzrost	brak wzrostu
C. albicans	1	rozlewający się wzrost	5 cfu
	2	rozlewający się wzrost	4 cfu

173 758

Tabela 4 (Przykład 4)

Mikeoorganizm	Typ Gram	Warunki ekspozycji
	Bez rozpuszczalnika	Z etanolem
		pH 7	pH 4	pH 7	pH 4
S. aureus	+	7,0	7,1	7,1	6,9
B. subtilis	+	0,6	2,1	3,1	0,8
B. megaterium	+	1,3	0,3	1,1	0,3
E. coli	-	0,3	5,3	0,1	6,9
K. pneumoniae	-	0,9	5,6	0	7,0
Ps. aeruginosa	-	0	7,0	0	6,9
Enterobacter sp.	-	1,1	7,3	0	7,4
S. albicans	-	0	5,7	0	5,7
	Kontrola (Bez różu bengalskiego)
E. coli		0,4	0,8

Tabela 5 (Przykład 7)

Mikroorganizm	IMBENTIN	IMBENTTN/RB	EMPICOL	EMPICOL/RB
jasno	ciemno	jasno	ciemno	jasno	ciemno	jasno	ciemno
St. aureus	4,5	4,0	8,0	3,5	4,5	4,5	5,5	5,0
E. coli	9,0	9,5	10,5	10,0	5,5	5,0	6,5	6,0
Entero	0	0	0	0	0	0	0	0
Klebsiella	7,0	6,0	6,0	7,0	6,0	6,0	6,0	6,0
Ps. aerug.	0	0	0	0	0	0	0	0
C. albicans	0	0	0	0	0	0	0	0

Mikroorganizm	IMBENTIN/ EMPICOL	IMBENTIN/ EMPICOL/RB	RÓZ BENGALSKI
jasno	ciemno	jasno	ciemno	jasno	ciemno
St. aureus	3,0	4,0	2,0	0	4,0	0
E. coli	4,0	4,0	4,0	4,5	0	0
Entero.	0	0	0	0	0	0
Klebsiella	3,5	3,5	4,0	2,5	0	0
Ps. aerug.	0	0	0	0	0	0
C. albicans	0	0	0	0	0	0

173 758

Tabela 6 (Przykład 8)

CZAS EKSPOZYCJI
	1 GODZINA	2 GODZINY	3 GODZINY
jasno	ciemno	jasno	ciemno	jasno	ciemno
Róz bengalski	3,8	0,5	7,2	0,4	0,4	7,2
RB/Imbentin	0,2	0,2	1,0	0,3	3,8	0,5
C91-31
RB/Empicol LX	1,7	0,4	3,9	0,7	7,2	0,7
RB/IPA	5,4	3,6	4,7	5,0	7,2	7,2
Imbentin	0,1		0,3		0,9
C91-35
Empicol LX	0,1		0,6		1,0
IPA	0,3		1,7		4,4

Tabela 7 (Przykład 9)

Etanol %	Imbentin C91-35 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
5	0,2	+6,8
5	0,6	4,6
10	0,6	+6,8
15	0,6	+6,8
5	-	+6,8	0,1
10	-	+6,8	-0,4
15	-	+6,8	0,0
-	0,2	4,6	2,5
-	0,6	3,5	2,3
-	-	+6,8	2,3

Tabela 8 (Przykład 10)

Dowanol %	Imbentin C91-35 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
3	0,7	+6,9
• 3	-	+6,9	4,0
-	0,7	5,2	3,4
-	-	+6,9

Tabela 9 (Przykład 11)

Glikol etylenowy %	Imbentin C91-35 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
10	0,7	+6,8
10	-	+6,9	-0,2
-	0,7	+6,8	3,4
-	-	+6,8

173 758

Tabela 10 (Przykład 12)

Propan-2-ol %	Lialet 111 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
15	0,5	+6,7
15	-	+6,7	4,9
-	0,5	+6,7	+6,7
-	-	+6,7

Tabela 11 (Przykład 13)

Propan-2-ol %	Imbentin C91-35 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
5	0,1	2,3
10	0,1	+6,8
10	0,5	+6,8
10	0,7	+6,8
-	-	4,8
5	-	5,5	0,3
10	-	3,0	1,9
-	0,1	1,2	1,3
-	0,5	1,0	1,2
-	0,7	1,1	1,1

Tabela 12 (Przykład 14)

Etanol %	Imbentin C91-35 %	Log (redukcja)
Po ekspozycji na światło	Bez różu bengalskiego
5	0,2	4,1
15	0,6	+7,1
5	-	5,0	0,2
10	-	+7,1	0,2
15	-	+7,1	2,2
-	0,2	3,3	2,5
-	0,6	3,4	2,6
	-	3,9

173 758

^KONTROWTG-] ^E.coliVKONTROWG+)AS.aureus

Fig. 2b

173 758

Fig. 4a

Fig. 4b

173 758

Fig. 5

-o-BRAK DODATKL|_SIARCZAN SODU (1%)^'SIARCZAN SODl^o/^

Fig. 6a

Fig. 6b

-«SRAK DODATKU-+SIARCZAN SODU H%)-^IARCZAN SODUJ5%)

173 758

-o-BRAK DODAT -HNI(0.7°/o)-^PAS (0.7%) I

KU j

Fig. 7a

Fig. 7b

173 758

-ο-srak podatkuj- 1Q% IPA 0.7% Imbentin -ą-10% IPA/ 0.7% Imbentin

Fig. 8

173 758

*B§$TKU +SIARCZAN Na (₅ο_/ο)

Fig. 10

173 758

LOG/ redukcja /

Fig. 1a

Fig. 1 b

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób niszczenia mikroorganizmów osadzonych na powierzchni, znamienny tym, że:

a) traktuje się powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami kompozycją zawierającą barwnik wybrany z grupy obejmującej róż bengalski, erytrozynę B oraz ftalocyjaninosulfoniany, który wiąże mikroorganizmy i wywołuje fotodynamiczną dezaktywację mikroorganizmów, w ilości od 1 do 100 ppm; i następnie

b) eksponuje się tę powierzchnię na światło zabijając mikroorganizmy osadzone na powierzchni fotodynamiczną dezaktywacją.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się barwnik, który wytwarza przy ekspozycji na światło tlen singletowy.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się barwnik substatywny w stosunku do mikroorganizmów.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się barwnik, który wybiela się przez ekspozycję na światło.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kompozycję, która dodatkowo zawiera środek powierzchniowo czynny.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się alkoksylowany środek powierzchniowo czynny.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się etoksylowany środek powierzchniowo czynny.
8. Sposób według zastrz. 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że stosuje się środek powierzchniowo czynny, który jest co najmniej w przeważającym stopniu niejonowy i/lub anionowy.
9. Sposób według zastrz. 5, albo 6, albo 7, znamienny tym, że stosuje się środek powierzchniowo czynny w ilości mieszczącej się w zakresie od 0,05 do 2,5% wagowych całkowitego ciężaru wagowego kompozycji.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kompozycję, która zawiera jeden lub więcej rozpuszczalników.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik polarny.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik stosuje się alkohol o 2 do 5 atomach węgla o łańcuchu prostym lub rozgałęzionym.
13. Sposób według zastrz. 10, albo 11, albo 12, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalnik w ilości mieszczącej się w zakresie od 2 do 20% wagowych całkowitego ciężaru wagowego kompozycji.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się kompozycję o wartości pH w zakresie od 3 do 5.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się kompozycję o wartości pH 4.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nanosi się na powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami kompozycję barwnika wywołującego fotodynamiczną dezaktywację mikroorganizmów oraz środka powierzchniowo czynnego i rozpuszczalnika.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na powierzchnię pokrytą osadzonymi mikroorganizmami

173 758 , a) nanosi się kwaśną, wodną kompozycję czyszczącą, która zawiera kwaśny barwnik, który jest substatywny w stosunku do białka, rozpuszczalnik mieszający się z wodą oraz alkoksylowany środek powierzchniowo czynny

b) eksponuje się tę powierzchnię na światło a następnie płucze.