NO344405B1

NO344405B1 - Peptidforbindelse som binder til TPO reseptor for terapeutisk behandling av blodplateforstyrrelse eller trombocytopeni hos mennesker

Info

Publication number: NO344405B1
Application number: NO20081298A
Authority: NO
Inventors: Jeffery Kenneth Weis; Brian R Macdonald; Edward John Yurkow
Original assignee: Ortho Mcneil Pharm Inc
Priority date: 2005-08-09
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2019-12-02
Also published as: JP2009504650A; NI200800040A; NZ565497A; RS52802B; UA96418C2; AU2006280230B2; CA2618958A1; ECSP088169A; MY152177A; UY29736A1; EP1957517B1; TW200744626A; PL1957517T3; ES2419005T3; SI1957517T1; EP1957517A2; US7723295B2; JO2859B1; TWI400081B; GT200600361A

Description

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptidforbindelser som binder til og aktiverer trombopoietinreseptoren (c-mpl eller TPO-R) eller ellers virker som en TPO agonist. Oppfinnelsen angår feltet biokjemi og medisinsk kjemi og tilveiebringer særlig TPO agonister for anvendelse ved behandling av menneske sykdom.

Megakaryocytter er benmargsavledede celler, som er ansvarlige for produksjon av sirkulerende blodplater. Selv om de innbefatter < 0,25% av benmargscellene hos de fleste arter, har de > 10 ganger volumet av typiske margceller. Se Kuter, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108 (1994). Megakaryocytter gjennomgår en prosess kjent som endomitose hvorved de replikerer deres kjerne, men gjennomgår ikke celledeling og gir derved opphav til polyploide celler. Som respons på det reduserte blodplatetallet, øker den endomitotiske hastigheten, høyere ploidymegakaryocytter dannes, og antallet megakaryocytter kan øke opp til 3 ganger. Se Harker, J. Clin.

Invest., 47:458-465 (1968). Til forskjell fra dette, som respons på et hevet blodplatetall, blir den endomitotiske hastigheten redusert, lavere ploidymegakaryocytter dannes, og antallet megakaryocytter kan reduseres med 50%.

Den eksakte fysiologiske feedbackmekanismen hvorved massen av sirkulerende blodplater regulerer den endomitotiske hastigheten og antallet benmargsmegakaryocytter er ikke kjent. Den sirkulerende trombopoietiske faktoren involvert i mediering av denne feedbackloopen antas nå å være trombopoietin (TPO). Mer spesifikt har TPO vist seg å være hovedhumoral regulator i situasjoner som involverer trombocytopeni. Se for eksempel Metcalf, Nature, 369:519-520 (1994). TPO har vist seg i flere studier å øke blodplatetall, øke blodplatestørrelse og øke isotopinkorporering i blodplater til resipientdyr. Spesifikt antas TPO å påvirke megakaryocytopoiesi på flere måter: (1) det gir økning i megakaryocyttstørrelse og antall; (2) det gir en økning i DNA innhold, i form av polyploidy, i megakaryocytter; (3) det øker megakaryocyttendomitose; (4) det gir økt modning av megakaryocytter; og (5) det gir en økning i prosentandel forløperceller, i form av små acetylkolinesterasepositive celler, i benmargen.

Blodplater (trombocytter) er nødvendig for blodlevring. Når deres antall blir svært lavt, er det en alvorlig risiko for at pasienten dør fra katastrofeblødning. TPO har derfor en potentiell anvendelse ved både diagnose og behandling av forskjellige hematologiske forstyrrelser, for eksempel sykdommer primært på grunn av blodplatedefekter.

Pågående kliniske forsøk med TPO har indikert at TPO kan administreres sikkert til pasienter. I tillegg har nylige studier tilveiebrakt en basis for projeksjon av effektiviteten til TPO behandling ved behandling av trombocytopeni, og særlig trombocytopeni som resultat av kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon som behandling av kreft eller lymfom. Se for eksempel McDonald, Am. J. Ped. Hematology/Oncology, 14:8-21 (1992).

Genet som koder TPO har blitt klonet og karakterisert. Se Kuter, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 91:11104-11108 (1994); Barley, et al., Cell 77:1117-1124 (1994); Kaushansky et al., Nature 369:568-571 (1994); Wendling, et al., Nature, 369:571-574 (1994); og Sauvage et al., Nature 369:533-538 (1994). Trombopoietin er et glykoprotein med minst to former, med tilsynelatende molekylmasser på 25 kDa og 31 kDa, med en felles N-terminal aminosyresekvens. Se Bartley, et al., Cell, 77: 1117-1124 (1994). Trombopoietin synes å ha to distinkte regioner separert med et potentielt Arg-Arg spaltingssete. Den aminoterminale regionen er i stor grad konservert hos menneske og mus, og har noe homologi med erytropoietin og interferon-a og interferon-b. Den karboksyterminale regionen viser stor artsdivergens.

DNA sekvensene og kodede peptidsekvensenr for humant TPO-R (også kjent som cmpl) har blitt beskrevet. Se Vigon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-5644 (1992). TPO-R er et medlem av hematopoietinvekstfaktorreseptorfamilien, en familie kjennetegnet ved en felles strukturell design med det ekstracellulære domainet, som inkluderer fire konserverte C residuer i den N-terminale delen og et WSXWS motiv (SEQ ID NO:1) nær den transmembrane regionen. Se Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6934-6938 (1990). Bevis for at denne reseptoren spiller en funksjonell rolle i hematopoiese inkluderer observasjoner av at dens ekspresjon er begrenset til milt, benmarg eller fosterlever hos mus (se Souyri, et al., Cell 63:1137-1147 (1990)) og til megakaryocytter, blodplater og CD34+ celler hos mennesker (se Methia, et al., Blood 82: 1395-1401 (1993)). Videre inhiberer eksponering av CD34+ celler for syntetiske oligonukleotider antisense for mpl RNA signifikant forekomst av megakaryocyttkolonier uten å berøre erytroid eller myeloidkolonidannelse. Noen arbeider postulerer at reseptorfunksjonene som en homodimer, tilsvarende situasjonen med reseptorene for G-CSF og erytropoietin.

Evnen til klonede gener for TPO-R letter ettersøkningen etter agonister for denne viktige reseptoren. Tilgjengeligheten av det rekombinante reseptorproteinet muliggjør studien av reseptor-ligandinteraksjonen hos et antall randomiserte og delvis randomiserte peptiddiversitetsgenereringssystemer. Disse systemene er beskrevet i US-patent Nr. 6.251.864, 6.083.913, 6.121.238, 5.932.546, 5.869.451, 5.506.362 og 6.465.430 og i Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990).

WO 2005/023834 beskriver peptider og forbindelser som binder seg til og aktiverer trombopoietinreseptoren (c-mpl eller TPO-R) eller på annen måte fungerer som en TPO-agonist.

Case et al., Stem Cells, 2000, vol.18, nr.5, side 360-365, de Serres et al., Stem Cells, 1999, vol.17, nr.6, side 316-326, de Serres et al., Stem Cells, 1999, vol.17, nr.4, side 203-209, angir administrering av GW395058, et PEGylert peptid, til behandling av trombocytopeni som følge av kjemoterapi.

WO 2004/026332 angir en fremgangsmåte for å øke hematopoietisk stamcelleproduksjon. Fremgangsmåten inkluderer administrering av en TPO-mimetisk forbindelse til et individ. Farmasøytiske preparater som inkluderer en TPO-mimetisk forbindelse og en farmasøytisk akseptabel bærer er også beskrevet.

Den langsomme gjenopprettingen av blodplatenivåer hos pasienter som lider av trombocytopeni er et alvorlig problem, og har gjort det viktig å lete etter en blodvekstfaktoragonist i stand til å akselerere blodplateregenerering. Foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en slik agonist.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot lavmolekylvekt peptidforbindelser som har sterke bindingsegenskaper overfor TPO-R, kan aktivere TPO-R og muliggjør potentielt reduserte bivirkninger sammenlignet med kjente TPO agonister. Følgelig kan peptidforbindelsene anvendes for terapeutiske formål ved behandling av tilstander mediert av TPO (for eksempel trombocytopenia som resultat av kjemoterapi, strålebehandling eller benmargtransfusjoner) så vel som diagnostiske formål ved studering av mekanismen for hematopoiese og for in vitro ekspansjonen av megakaroycytter og overgitte progenitorceller.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en terapeutisk effektiv dose av en peptidforbindelse som innbefatter følgende sekvens: (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), hvori X10er sarkosin for terapeutisk behandling av hematologiske forstyrrelser hos mennesker, hvori nevnte peptidforbindelse administreres ved et doseringsområde på mellom 0,1 og 0,75 μg/kg, og hvori den hematologiske forstyrrelsen er en blodplateforstyrrelse eller

trombocytopeni.

Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av en terapeutisk effektiv dose av en peptidforbindelse som innbefatter følgende sekvens: (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), hvori X10er sarkosin i fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av en menneskepasient som lider av en hematologisk forstyrrelse, hvori nevnte peptidforbindelse administreres ved et doseringsområde på mellom 0,1 og 0,75 μg/kg.

Peptidforbindelser egnede for terapeutiske og/eller diagnostiske formål har en IC50på ca. 2 mM eller mindre, slik det for eksempel bestemmes ved bindingsaffinitetsundersøkelsen fremsatt i Eksempel 3 i US-patent nr.5.869.451, hvori en lavere IC50korrelerer med en sterkere bindingsaffinitet til TPO-R. Undersøkelsen i US-patent nr.

5.869.451 er som følger: Bindingsaffiniteter til peptidforbindelser måles i en konkurrerende bindingsundersøkelse. Brønnene til en mikrotiterplate belegges med 1 mg streptavidin, blokkeres med PBS/1% BSA, fulgt av 50 ng biotinylert anti-reseptor immobiliserende antistoff (Ab 179). Brønnene blir deretter behandlet med en 1:10 fortynning av løselig TPO-R innhøsting. Forskjellige konsentrasjoner av peptidforbindelse blandes med en konstant mengde av en trunkert form av TPO som består av residuer 1-156 sammensmeltet til C-terminusen til maltosebindingsprotein (MBP-TPO1S6). Peptid MBP-TPO156blandingene tilsettes til de TPO-R belagte brønnene, inkuberes i 2 timer ved 4<0>C og vaskes deretter med PBS. Mengden MBP-TPO som er bundet ved likevekt, males ved tilsetning av kanin anti-sera rettet mot MBP, fulgt av alkalinsk fosfatasekonjugert geite anti-kanin IgG. Mengden alkalisk fosfatase i hver brønn blir deretter bestemt ved anvendelse av standardmetoder. Undersøkelsen utføres over et område peptidforbindelsekonsentrasjoner og resultatene fremstilles grafisk slik at y-aksen representerer mengden av bundet MBP-TPO og x-aksen representerer konsentrasjonen av peptidforbindelse. Man kan deretter bestemme konsentrasjonen av hvorved peptidforbindelsen vil redusere ved 50% (IC50) mengden av MBP-TPO bundet for å immobilisere TPO-R. Dissosiasjonskonstanten (Kd) for peptidet bør være tilsvarnde den målte IC50ved anvendelse av disse undersøkelsesbetingelser. For farmasøytiske formål har peptidforbindelsene foretrukket en IC50verdi på ikke mer enn ca. 100 μM, mer foretrukket ikke mer enn 500 nM. I en foretrukket utførelsesform er molekylvekten til peptidforbindelse fra ca.250 til ca.8.000 dalton. Hvis peptidforbindelsen ifølge oppfinnelsen er oligomerisert, dimerisert og/eller derivatisert med en hydrofil polymer slik det er beskrevet heri, vil molekylvektene til slike peptidforbindelser være vesentlige større og kan variere fra ca.500 til ca.120.000 dalton, mer foretrukket fra ca.8.000 til ca.80.000 dalton.

Når de anvendes for diagnostiske formål, blir peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen foretrukket merket med et detekterbart merke og, følgelig, tjener peptidforbindelsene uten et slikt merke som intermediater ved fremstilling av de merkede peptidforbindelsene.

En peptidforbindelse som bemøter kriteriene for molekylvekt og bindingsaffinitet definert ovenfor for TPO-R, innbefatter 9 eller flere aminosyrer hvori aminosyrene er naturlig forekommende eller syntetiske (ikke-naturlig forekommende) aminosyrer.

Følgelig innbefatter foretrukne peptidforbindelser en forbindelse som har:

(1) en molekylvekt på mindre enn ca.5.000 dalton, og

(2) en bindingsaffinitet til TPO-R som uttrykkes ved en IC50 på ikk mer enn ca.100 μM,

hvori fra null til alle -C(O)NH-bindingene til peptidforbindelsen har blitt erstattet med en binding valgt fra gruppen som består av en -CH2OC(O)NR-binding; en fosfonat binding; en -CH2S(O)2NR-binding; en -CH2NR-binding; og en -C(O)NR<6>-binding; og en -NHC(O)NH-binding, hvor R er hydrogen eller lavere alkyl og R<6>er lavere alkyl, videre hvori N-terminusen til nevnte peptidforbindelse er valgt fra gruppen som består av en -NRR<1>-gruppe; en -NRC(O)R-gruppe; en -NRC(O)OR-gruppe; en -NRS(O)2R gruppe; en -NHC(O)NHR gruppe; en succinimidgruppe; en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe; og en benzyloksykarbonyl-NH-gruppe som har fra 1 til 3 substituenter på fenylringen valgt fra gruppen som består av lavere alkyl, lavere alkoksy, klor og brom, hvori R og R<1>er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen og lavere alkyl, og ytterligere hvori C-terminusen til nevnte peptidforbindelse har formelen -C(O)R<2>hvor R<2>er valgt fra gruppen som består av hydroksy, lavere alkoksy, og -NR<3>R<4>hvor R<3>og R<4>er uavhengig valgt fra gruppen som består av hydrogen og lavere alkyl og hvor nitrogenatomet til -NR<3>R4-gruppen eventuelt kan være amingruppen til N-terminusen til peptidet for å danne et cyklisk peptid, og fysiologisk akseptable salter derav.

Det beskrives også en merket peptidforbindelse som innbefatter en peptidforbindelse beskrevet ovenfor som har kovalent bundet dertil et merke i stand til å bli detektert.

Oppfinnelsen vedrører peptidforbindelser som inkluderer aminosyresekvensen I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar) (SEQ ID NO:7), hvori (2-Nal) er β-(2- naftyl)alanin og (Sar) er sarkosin for terapeutisk behandling som angitt i krav 1.

I en annnen utførelsesform er peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen foretrukket dimerisert eller oligomerisert for å øke affiniteten og/eller aktiviteten til forbindelsene. Et eksempel på en foretrukket dimerisert peptidforbindelse inkluderer, men er ikke begrenst til følgende:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R X10

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R X10

hvor X1O er et sarkosin (SEQ ID NO:7). Strukturen ovenfor kan også angis med følgende struktur: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXio)2K-NH2.

Når X1O er et sarkosin, har forbindelsen følgende struktur:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R-(Sar)

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R-(Sar),

hvori (2-Nal) er β-(2-naftyl)alanin og (Sar) er sarkosin (SEQ ID NO:7). Denne peptidforbindelsen, som også kan angis med følgende struktur (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAAR-(Sar))2K-NH2blir referert til heri som "TPO Forbindelse Nr.1".

I en ytterligere annen utførelsesform inkluderer foretrukne peptidforbindelser for anvendelse ifølge oppfinnelsen peptidforbindelser som er kovalent bundet til en eller flere av et antall hydrofile polymerer. Egnede hydrofile polymerer inkluderer, men er ikke begrenset til, polyalkyletere som er eksemplifisert ved polyetylenglykol og polypropylenglykol, polymelkesyre, polyglykolsyre, polyoksyalkener, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, cellulose og cellulosederivater, dekstran og dekstranderivater etc., som beskrevet i US-patent nr.5.869.451.

Peptidforbindelsene beskrevet heri er anvendelige for å hindre og behandle sykdommer mediert av TPO, og særlig for behandling av hematologiske forstyrrelser, som inkluderer, men er ikke begrenset til, trombocytopeni som resultat av kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransfusjoner.

Det er beskrevet farmasøytiske sammensetninger som innbefatter en eller flere peptidforbindelser beskrevet heri og en fysiologisk akseptabel bærer. Disse farmasøytiske sammensetningene kan være i et antall former som inkluderer orale doseringsformer, så vel som inhalerbare pulvere og løsninger og injiserbare og infusjonsløsninger.

Fig. 1 viser og sammenligner aktiviteten til TPO Forbindelse Nr.1 med en litteratur peptidforbindelse (referert til heri som "litteraturpeptidforbindelse"). Forskjellen mellom TPO Forbindelse Nr.1 og litteraturpeptidforbindelsen er at litteraturpeptidforbindelse har et β-(l-naftyl)alanin (1-Nal) hvor (2-Nal) er på TPO Forbindelse Nr.1.

Fig. 2 viser og sammenligner aktiviteten til PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 med PEGylert litteraturpeptidforbindelse.

Fig. 3 viser og sammenligner in vivo forandring i blodplatetall hos rotter som demonstrerer den relative potensen til PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 med PEGylert litteraturpeptidforbindelse.

Fig. 4 og 5 viser og sammenligner antallet og volumet av sirkulerende blodplater på en doseavhengig måte, respektivt, etter anvendelsen av PEGylert litteraturpeptidforbindelse og anvendelsen av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1.

Fig. 6 viser at enkle intravenøse doser av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 (30, 100 eller 300 μg/kg) resulterer i et økt periferalt blodplatetall hos normale hannkjønns Wistar rotter.

Fig. 7 viser PK, konsentrasjon - tidprofiler av PEGylert TPO Forbindelse Nr. l hos friske hannkjønns frivillige: fylte ruter - PEGylert TPO Forbindelse Nr.1, 0,75 μg/kg Lv.; åpne diamanter - PEGylert TPO Forbindelse Nr.1, 1,5 μg/kg Lv.; fylte oppoverrettede triangler - PEGylert TPO Forbindelse Nr.1, 2,25 μg/kg Lv.; åpne nedoverrettede triangler - PEGylert TPO Forbindelse Nr.1, 3 μg/kg Lv.

Fig. 8 viser at blodplatetallene øker doseavhengig hos friske hannkjønns frivillige etter administrasjon av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1.

Fig. 9 viser at endogene TPO nivåer øker doseavhengig hos friske hannkjønns frivillige etter administrasjon av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1.

Følgende definisjoner er fremsatt for å illustrere og definere betydningen og omfanget av de forskjellige begrepene anvendt for å beskrive oppfinnelsen heri.

"Agonist" refererer til en biologisk aktiv ligand som binder til dens komplementære biologisk aktive reseptor og aktiverer sistnevnte enten ved å forårsake en biologisk respons hos reseptoren eller for å øke eksisterende biologiske aktivitet til reseptoren.

"Peptidforbindelse" refererer til et molekyl som hydrolyserer til aminosyrer og/eller aminosyrederivater og/eller aminosyresubstituenter. "Farmasøytisk akseptable salter" refererer til de ikke-toksiske alkalimetall, jordalkalimetall og ammoniumsaltene som vanligvis anvendes innen den farmasøytiske industri som inkluderer natrium, kalium, litium, kalsium, magnesium, barium, ammonium og protaminsinksalter, som fremstilles ved fremgangsmåter kjente i litteraturen. Begrepet inkluderer ikke-toksiske syretilsetningssalter, som generelt fremstilles ved omsetning av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en passende organisk eller uorganisk syre. Representative salter inkluderer hydroklorid, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oksalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, napsylat og lignende.

"Farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt" refererer til de saltene som opprettholder den biologiske effektiteten og egenskapene til de frie basene og som ikke er biologisk eller på annen måte uønsket, dannet med de uorganiske syrene slike som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende, og organiske syrer slike som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyrodruesyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salicylsyre og lignende. For en beskrivelse av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter som prodrug, se Bundgaard, H., supra.

"Farmasøytisk akseptable ester" refererer til de esterne som opprettholder, etter hydrolyse av esterbindingen, den biologiske effektiteten og egenskapene til karboksyl syren eller alkoholen og er ikke biologisk eller på annen måte uønsket. For beskrivelse av farmasøytisk akseptable estere som prodrug, se Bundgaard, H., red., “Design of Prodrugs”, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse esterne blir typisk dannet fra den korresponderende karboksylsyren og en alkohol. Generelt kan esterdannelse utføres via hensiktsmessige synteseteknikker. (Se for eksempel March, “Advanced Organic Chemistry”, 4. utgave, John Wiley & Sons, New York (1992), 393-396 og referanser sitert deri, og Mark, et al., “Encyclopedia of Chemical Technology”, John Wiley & Sons, New York (1980).) Alkoholkomponenten til esteren vil generelt innbefatte (i) en C2-C12alifatisk alkohol som kan eller kan ikke inneholde en eller flere dobbeltbindinger og kan eller kan ikke inneholde forgrenede karboner eller (ii) en C7-C12aromatisk eller heteroaromatik alkohol. Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av de sammensetningene som både er estere som beskrevet heri og samtidig er farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav.

"Farmasøytisk akseptabelt amid" refererer til de amidene som opprettholder, etter hydrolyse av amidbindingen, den biologiske effektiviteten og egenskapene til karboksylsyren eller aminet og er ikke biologisk eller på annen måte uønsket. For beskrivelse av farmasøytisk akseptable amider som prodrug, se Bundgaard, H., red., “Design of Prodrugs”, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985). Disse amidene blir typisk dannet fra den korresponderende karboksylsyren og et amin. Generelt kan amiddannelse utføres via passende synteseteknikker. (Se for eksempel March, “Advanced Organic Chemistry”, 4. utg., John Wiley & Sons, New York (1992), s.393 og Mark, et al. “Encyclopedia of Chemical Technology”, John Wiley & Sons, New York (1980).) Oppfinnelsen omfatter anvendelse av de sammensetningene som både er amider som beskrevet heri og samtidig er de farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav.

"Farmasøytisk eller terapeutisk akseptabel bærer" refererer til et bærermedium som ikke interfererer med effektiviteten til den biologiske aktiviteten til de aktive ingrediensene og som ikke er toksiske for verten eller pasienten.

"Stereoisomer" refererer til en kjemisk forbindelse som samme molekylvekt, kjemisk sammensetning og bestanddeler som hverandre, men med atomer gruppert forskjellig. Dvs. visse identiske kjemiske bestanddeler er forskjellige når det gjelder orienteringer i rommet og, derfor, når de er rene, har evnen til å rotere planet til polarisert lys.

Imidlertid kan noen rene stereoisomerer ha en optisk rotasjon som er så svak at den er ikke-detekterbar med foreliggende instrumentering. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan ha et eller flere asymmetriske karbonatomer og derfor inkludere forskjellige stereoisomerer. Alle stereoisomerer er inkludert innenfor rammen av oppfinnelsen.

"Terapeutisk eller farmasøytisk effektiv mengde" slik det anvendes for sammensetningene ifølge oppfinnelsen, refererer til mengden av sammensetning tilstrekkelig til å indusere en ønskelig biologisk resultat. Dette resultatet kan være lindring av tegn, symptomer eller årsaker til en sykdom, eller en hvilken som helst annen ønsket forandring på et biologisk system. I foreliggende oppfinnelse vil resultatet typisk involvere en reduksjon i de immunologiske og/eller inflammatoriske responsene på infeksjon eller vevsskade.

Aminosyreresiduer i peptider blir forkortet som følger: fenylalanin er Phe eller F;

Leucin er Leu eller L; Isoleucin er lie eller I; Metionin er Met eller M; Valin er VaI eller V; Serin er Ser eller S; Prolin er Pro eller P; Treonin er Thr eller T; Alanin er Ala eller A; Tyrosin er Tyr eller Y; Histidin er His eller H; Glutamin er GIn eller Q; Asparagin er Asn eller N; Lysin er Lys eller K; Asparginsyre er Asp eller D; Glutaminsyre er GIu eller E; Cystein er Cys eller C; Tryptofan er Trp eller W; Arginin er Arg eller R; og Glycin er GIy eller G. I tillegg er t- Buo tert-bulyloksy, BzI er benzyl, CHA er cykloheksylamin, Ac er acetyl, Me er metyl, Pen er penicillamin, Aib er aminoisosmørsyre, Nva er norvalin, Abu er aminosmørsyre, Thi er tienylalanin, OBn er O-benzyl, og hyp er hydroksyprolin.

Peptidanaloger blir ofte anvendt innenfor farmasøytisk industri som ikke-peptidlegemidler med egenskaper analoge med de til templatpeptidet. Disse typene av ikkepeptidforbindelser navngis "peptidmimetiske midler" eller "peptidomimetiske midler" (Luthman, et al, ”A Textbook of Drug Design and Development”, 14:386-406, 2. utg., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720 (1994); Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber og Freidinger TINS, p.392 (1985); og Evans, et al., J. Med. Chem.30:1229 (1987)). Peptidmimetiske midler som er strukturelt tilsvarende de terapeutisk anvendelige peptider kan anvendes for å gi en ekvivalent eller økt terapeutisk eller profylaktisk effekt. Generelt er peptidomimetiske midler strukturelt tilsvarende et paradigmepolypeptid (dvs. et polypeptid som har en biologisk eller farmakologisk aktivitet), slik som naturlig forekommende reseptorbindingspolypeptid, men har en eller flere peptidbindinger eventuelt erstattet med en alternativ binding slik som -CH2NH-, -CH2S- etc. ved fremgangsmåter kjente i litteraturen og ytterligere beskrevet i følgende referanser:

Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, red., Marcel Dekker, New York, s.267 (1983); Spatola, A. R, Vega Data (Mars 1983), Vol.1, emne 3, Peptide Backbone Modifications (generell gjennomgang); Morley, Trends Pharm. Sci. s.463-468 (1980), (generell gjennomgang); Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:177-185 (1979); Spatola, et al, Life Sci., 38:1243-1249 (1986); Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 307-314 (1982); Almquist, et al., J. Med. Chem., 23:1392-1398, (1980); Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett.23:2533 (1982); Szelke, et al., European Appln. EP 45665 (1982); Holladay, et al., Tetrahedron Lett., 24:4401-4404 (1983); og Hruby, Life Sci., 31:189-199 (1982). En særlig foretrukket ikke-peptidbinding er -CH2NH-. Slike peptidmimetiske midler kan ha signifikante fordeler i forhold til polypeptidutførelsesformer som for eksempel inkluderer: mer økonomisk produksjon, større kjemisk stabilitet, økte farmakologiske egenskaper (halveringstid, absorpsjon, potentiale, effektivitet etc.), forandret spesifisitet (for eksempel et bredt spekter av biologiske aktiviteter), redusert antigenisitet og andre. Merking av peptidomimetiske midler involverer vanligvis kovalent binding av et eller flere merker, direkte eller gjennom en mellomgruppe (for eksempel en amidgruppe), til ikke-interfererende posisjoner på det peptidomimetiske midlet som predikeres ved kvantitative strukturaktivitetsdata og/eller molekylær modellering. Slike ikkeinterfererende posisjoner er generelt posisjoner som ikke danner direkte kontakter med makromolekylene (for eksempel immunoglobulin superfamiliemolekyler) til hvilke de peptidomimetiske midlene binder for å gi den terapeutiske effekten. Derivatisering (for eksempel merking) av peptidomimetiske midler bør ikke i vesentlig grad interferere med den ønskede biologiske eller farmakologiske aktivitetem til det peptidomimetiske midlet. Generelt binder peptidomimetiske midler til reseptorbindingspeptider til reseptoren med høy affinitet og fremviser detekterbar biologisk aktivitet (dvs. er agonistiske eller antagonistiske overfor en eller flere reseptormedierte fenotypiske forandringer).

Systematisk substitusjon av en eller flere aminosyrer til en konsensussekvens med en D-aminosyre av samme type (for eksempel D-lysin i stedet for L-lysin) kan anvendes for å generere mer stabile peptider. I tillegg kan tvungede peptider som innbefatter en konsensussekvens eller en i det vesentlige identisk konsensussekvensvariasjon genereres ved fremgangsmåter kjente i litteraturen (Rizo, et al., Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); for eksempel ved tilsetning av interne cysteinresiduer i stand til å danne intramolekylære disulfidbroer som cykliserer peptidet.

"Detekterbart merke" refererer til materialer, som når de kovalent bindes til peptidforbindelser ifølge oppfinnelsen, muliggjør deteksjon av peptidforbindelsene in vivo hos pasienten til hvilken peptidforbindelsen har blitt administrert. Egnede detekterbare merker er godt kjente i litteraturen og inkluderer, for eksempel radioisotoper, fluorescensmerker (for eksempel fluorescein) og lignende. Det bestemte detekterbare merket som anvendes er ikke kritisk og velges relativt til mengden merket middel som anvendes så vel som toksisiteten til det merkede midlet ved mengden av det merkede midlet som anvendes. Valg av merket middel relativt til slike faktorer er innenfor fagmannens kunnskap.

Kovalent binding av det detekterbare merket til peptidforbindelsen utføres ved kjente fremgangsmåter. For eksempel, når<125>I radioisotopen anvendes som det detekterbare merket, kan kovalent binding av<125>I til peptidforbindelsen oppnås ved inkorporering av aminosyren tyrosin i peptidforbindelsen og deretter jodere peptidforbindelsen (se for eksempel Weaner, et al., ”Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds”, s. 137-140 (1994)). Inkorporering av tyrosin i N eller C terminusen til peptidforbindelsen kan oppnås ved godt kjent kjemi. På samme måte kan<32>P inkorporeres i peptidforbindelsen som en fosfatbestanddel, for eksempel, gjennom en hydrokylgruppe på peptidforbindelsen ved anvendelse av kjent kjemi.

Det er beskrevet peptidforbindelser som binder til og aktiverer TPO-R eller på annen måte oppfører seg som en TPO agonist. Disse peptidforbindelsene inkluderer "lede" peptidforbindelser og "derivat" peptidforbindelser konstruert for å ha samme eller tilsvarende molekylstruktur eller form som ledepeptidforbindelsene, men som er forskjellig fra ledepeptidforbindelsene enten med hensyn til mottakelig for hydrolyse eller proteolyse og/eller med hensyn til andre biologiske egenskaper, slik som økt affinitet for reseptoren. Det er også beskrevet sammensetninger som innbefatter en effektiv mengde av en peptidforbindelse, og mer særlig en peptidforbindelse som er anvendelig for behandling av hematologiske forstyrrelser, og særlig trombocytopeni assosiert med kjemoterapi, strålebehandling eller benmargtransfusjoner.

Oppfinnelsen vedrører peptidforbindelser som inkluderer aminosyresekvensen (SEQ ID NO:7): I E G PT L R Q (2-Nal) L A A R (Sar), som angitt i kravene.

Peptidforbindelsene kan foretrukket være dimerisert eller oligomerisert for å øke affiniteten og/eller aktiviteten til forbindelsene. Et eksempel på en foretrukket dimerisert peptidforbindelse inkluderer, men er ikke begrenset til, følgende:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)-X10

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R (Sar)-X10

hvor X10er et sarkosin (SEQ ID NO:7). Strukturen ovenfor kan også angis med følgende: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARXiO)2K-NH2.

En foretrukket peptidforbindelse er som følger:

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)

\

K(NH2)

/

I E G P T L R Q (2-Nal) L A A R -(Sar)

hvori (2-Nal) er β-(2-naftyl)alanin og (Sar) er sarkosin (SEQ ID NO.7). Denne peptidforbindelsen er referert til heri som "TPO Forbindelse Nr.1".

Peptidforbindelser som har en IC5O større enn ca.100 mM har ikke tilstrekkelig binding til å muliggjøre anvendelse innenfor enten de diagnostiske eller terapeutiske aspektene ifølge oppfinnelsen. Foretrukket, for diagnostiske formål, har peptidforbindelsene en IC50på ca.2 mM eller mindre og, for farmasøytiske formål, har peptidforbindelsene en IC50på ca.100 μM eller mindre.

Fig. 1 sammenligner aktiviteten til tre forskjellige batcher av TPO Forbindelse Nr.1, med en batch av peptidforbindelse ifølge litteraturen ved anvendelse av standard relative luminescensenhetsundersøkelsesteknikker. Undersøkelsen anvender murinceller modifisert til stabilt å uttrykke den humane TPO reseptoren og et luciferasereporter konstrukt drevet av fospromoteren. Forskjellen mellom TPO Forbindelse Nr.1 og peptidforbindelsen ifølge oppfinnelsen er at peptidforbindelsen ifølge litteraturen har et β-(l-naftyl)alanin (1-Nal) hvor (2-Nal) er en TPO Forbindelse Nr.1. TPO Forbindelse Nr. 1 blir referert til som 2-Nal og peptidforbindelsen ifølge litteraturen refereres til som 1-Nal (litteratur) i Fig.1. Slik det er vist fra Fig.1, er aktiviteten tilsvarende for hver forbindelse.

Fig. 2 sammenligner aktiviteten til flere forskjellige batcher PEGylert TPO Forbindelse Nr. 1 (pegylering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er beskrevet i mer detalj nedenfor). Begge batcher av PEGylert litteratur peptidforbindelse viser høy aktivitet med i det vesentlige samme aktivitetsnivå som den ikke-PEGylerte litteratur peptidforbindelsen. De gjenværende linjene illustrerer aktiviteten til forskjellige batcher av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1. Slik det er vist i Fig.2, i denne modellen, har sistnevnte lavere aktivitet relativt til de PEGylerte litteratur peptidforbindelsene, PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert litteratur peptidforbindelse refereres til som PEG-I -NaI (litteratur) i Fig.2.

Fig. 3 demonstrerer det relative potentialet til PEGylert litteratur peptidforbindelse og PEGylert TPO Forbindelse Nr.1. Gjennom en rottemodell viser Fig.3 in-vivo forandring i blodplatetall etter administrasjon av PEGylert litteratur peptidforbindelse og PEGylert TPO Forbindelse Nr.1. Slik det er vist med Fig.3, har den høyeste dosen av PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 samme aktivitet som den laveste dosen av PEGylert litteratur peptidforbindelse. En mindre potent forbindelse kan gi en mindre drastisk stimulering av målcellen, som kan redusere risikoen for bivirkninger forårsaket av overstimulering av målcellen, slik som forsterket trombocytopeni som kommer etter etterfølgnde cykel av kjemoterapi. PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert litteratur peptidforbindelse refereres til som PEG-I -NaI (Litteratur) i Fig.3.

Fig. 4 og 5 viser resultatene av en hode-til-hode doseresponsstudie av en PEGylert litteratur peptidforbindelse og PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 hos normale mus.

PEGylert TPO Forbindelse Nr.1 refereres til som PEG-2-Nal og PEGylert litteratur peptidforbindelse refereres til som PEG-1-Nal (Litteratur) i Fig.4 og 5. Fig.4 viser økning i blodplatenivåer og Fig.5 viser midlere blodplatevolum seks (6) dager etterfølgende behandling. Doseringsområdet var fra 10 til 3000 ug/kg. Begge peptidforbindelsene økte antallet sirkulerende blodplater på en doseavhengig måte som øker relativt til kontrollgruppen observert ved doser så lave som 30ug/kg for begge forbindelsene. Ved maksimal respons hevet disse peptidforbindelsene blodplatetallene til nivåer som var opp til 4 ganger større enn kontrollverdier. Dose-responskurvene for disse peptidforbindelsene var svært tilsvarende som indikerer at i denne modellen var det i det vesentlige ingen forskjell mellom de to testartiklene basert på disse sluttpunktene.

Peptidforbindelsene kan fremstilles ved klassiske fremgangsmåter kjente i litteraturen, for eksempel ved anvendelse av standard fastsatte teknikker. Standardfremgangsmåtene inkluderer eksklusiv fast fasesyntese, delvis fast fasesyntese fremgangsmåter, fragmentkondensasjon, klassisk løsningssyntese og til og med rekombinant DNA teknologi. Se for eksempel Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963). Ved fast fase blir syntesen typisk startet fra den C-terminale enden til peptidet ved anvendelse av en alfa-aminobeskyttet harpiks. Et passende utgangsmateriale kan for eksempel fremstilles ved binding av den ønskede alfa-aminosyren til en klormetylert harpiks, en hydroksymetylharpiks eller en benzhydrylaminharpiks. En slik klormetylert harpiks selges under varemerkenavnet BIO-BEADS SX-I av Bio Rad Laboratories, Richmond, CA, og fremstillingen av hydroksymetylharpiksen er beskrevet av Bodonszky, et al., Chem. Ind. (London), 38:1597 (1966). Benzhydrylamin (BHA) harpiksen har blitt beskrevet av Pietta og Marshall, Chem. Commn., 650 (1970) og er kommersielt tilgjengelig fra Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, Calif., i hydrokloridformen.

Således kan peptidforbindelsene fremstilles ved kobling av en alfa- aminobeskyttet aminosyre til den klormetylerte harpiksen for eksempel ved hjelp av cesiumbikarbonatkatalysator, i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Gisin, HeIv. Chim. Acta., 56:1467 (1973). Etter den initielle koblingen blir den alfa-amino beskyttende gruppen fjernet ved valg av reagenser som inkluderer trifluoreddiksyre (TFA) eller saltsyre (HCl) løsninger i organiske løsemidler ved romtemperatur.

De alfa-aminobeskyttende gruppene er de som er kjent for å være anvendelig i litteraturen ved trinnvis syntese av peptider. Inkludert er acyltypebeskyttende grupper (for eksempel formyl, trifluoracetyl, acetyl), aromatiske uretantypebeskyttende grupper (for eksempel benzyloksykarboyl (Cbz) og substituert Cbz), alifatiske uretanbeskyttende grupper (for eksempel t-butyloksykarbonyl (Boc), isopropyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl) og alkyltypebeskyttende grupper (for eksempel benzyl, trifenylmetyl). Boc og Fmoc er foretrukne beskyttende grupper. Sidekjedebeskyttende gruppe holder seg intakt i løpet av koblling og blir ikke splittet av i løpet av avbeskytting av amino-terminusbeskyttende gruppe eller i løpet av kobling. Den sidekjedebeskyttende gruppen må være mulig å fjerne etter ferdig syntese av sluttpeptidet og under reaksjonsbetingelsene som ikke forandrer målpeptidet. Sidekjedebeskyttende grupper for Tyr inkluderer tetrahydropyranyl, tert-butyl, trityl, benzyl, Cbz, Z-Br-Cbz, og 2,5-diklorbenzyl. Sidekjedebeskyttende grupper for Asp inkluderer benzyl, 2,6-diklorbenzyl, metyl, etyl og cykloheksyl. Sidekjedebeskyttende grupper for Thr og Ser inkluderer acetyl, benzoyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-diklorbenzyl og Cbz.

Sidekjedebeskyttende gruppe for Thr og Ser er benzyl. Sidekjedebeskyttende grupper for Arg inkluderer nitro, Tosyl (Tos), Cbz, adamantyloksykarbonylmesitoylsulfonyl (Mts) eller Boc. Sidekjedebeskyttende grupper for Lys inkluderer Cbz, 2-klorbenzyloksykarbonyl (2-Cl— Cbz), 2-brombenzyloksykarbonyl (2-BrCbz), Tos eller Boc.

Etter fjerning av den alfa-aminobeskyttende gruppen blir de gjenværende beskyttede aminosyrene koblet trinnvis i ønsket rekkefølge. Et overskudd av hver beskyttet aminosyre blir generelt anvendt med en passende karboksylgruppeaktivator slik som dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i løsning, for eksempel, i metylenklorid (CH2Cl2), dimetylformamid (DMF) blandinger.

Etter at den ønskede aminosyresekvensen er fullstendig, blir det ønskede peptidet avkoblet fra harpiksstøttematerialet ved behandling med et reagens slik som trifluoreddiksyre eller hydrogenfluorid (HF), som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men spalter også alle gjenværende sidekjedebeskyttende grupper. Når den klormetylerte harpiksen anvendes, resulterer hydrogenfluoridbehandling i dannelsen av de frie peptidsyrene. Når benzhydrylaminharpiksen anvendes, resulterer hydrogenfluoridbehandling direkte i det frie peptidamidet. Alternativt, når den klormetylerte harpiksen anvendes, kan det sidekjedebeskyttede peptidet avkobles ved behandling av peptidharpiksen med ammoniakk for å gi det ønskede sidekjedebeskyttede amidet eller med et alkylamin for å gi et sidekjedebeskyttet alkylamid eller dialkylamid. Sidekjedebeskyttelsen blir deretter fjernet på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.

Disse faste fasepeptidsyntesefremgangsmåtene er godt kjente i litteraturen og ytterligere beskrevet av John Morrow Stewart og Janis Dillaha Young, ”Solid Phase Peptide Syntheses” (2. utg., Pierce Chemical Company, 1984).

Disse fremgangsmåtene kan også anvendes for å syntetisere peptider hvori aminosyrer forskjellig fra de 20 naturlig forekommende, genetisk kodede aminosyrene substitueres ved en, to eller flere posisjoner til en hvilken som helst av forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Man kan erstatte de naturlig forekommende sidekjedene til de 20 genetisk kodede aminosyrene (eller D aminosyrene) med andre sidekjeder, for eksempel med grupper slike som alkyl, lavere alkyl, cyklisk 4-, 5-, 6- til 7-leddet alkyl, amid, amid lavere alkyl, amid di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy, karboksy og de lavere esterderivatenes derav, og med 4-, 5-, 6- til 7-leddede hetereocykliske forbindelser. Særlig kan prolinanaloger hvori ringstørrelsen til prolinresiduet er forandret fra 5-leddet til 4, 6, eller 7-leddet anvendes. Cyklisk grupper kan være mettet eller umettet, og hvis umettet, kan de være aromatiske eller ikke-aromatiske. Heterocykliske grupper inneholder foretrukket et eller flere nitrogen-, oksygen og/eller svovelheteroatomer. Eksempler på slike grupper inkluderer furazanyl, furyl, imidazolidinyl, imidazolyl, imidazolinyl, isotiazolyl, isoksazolyl, morfolinyl (for eksempel morfolino), oksazolyl, piperazinyl (for eksempel 1-piperazinyl), piperidyl (for eksempel 1-piperidyl, piperidino), pyranyl, pyrazinyl, pyrazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyridyl, pyrimidinyl, pyrrolidinyl (for eksempel 1-pyrrolidinyl), pyrrolinyl, pyrrolyl, tiadiazolyl, tiazolyl, tienyl, tiomorfolinyl (for eksempel tiomorfolino), og triazolyl. Disse heterocykliske gruppene kan være substituerte eller usubstituerte. Der en gruppe er substituert, kan substituenten være alkyl, alkoksy, halogen, oksygen, eller substituert eller usubstituert fenyl.

En kan også lett modifisere peptidene ved fosforylering (se for eksempel W. Bannwarth, et al., ”Biorganic og Medicinal Chemistry Letters”, 6(17):2141-2146 (1996)), og andre fremgangsmåter for fremstilling av peptidderivater av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er beskrevet i Hruby, et al., ”Biochem. J.”, 268(2):249-262 (1990). Således tjener peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen også som en basis for fremstilling av peptidmimetiske midler med tilsvarende biologiske aktivitet.

Fagmannen vil se at et antall teknikker er tilgjengelige for å konstruere peptidforbindelser med samme eller tilsvarende ønsket biologisk aktivitet som den korresponderende peptidforbindelsen, men med mer fordelaktig aktivitet enn peptidforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og tilbøyelighet for hydrolyse og proteolyse. Se for eksempel Morgan, et al., “Ann. Rep. Med. Chem.”, 24:243-252 (1989). Det følgende beskriver fremgangsmåter for fremstilling av peptidforbindelser modifisert ved den N-terminale aminogruppen, den C-terminale karboksylgruppe og/eller forandring av en eller flere av amidobindingene i peptidet til en ikke-amidobinding. Det er å forstå at to eller flere slike modifikasjoner kan kobles i en peptideforbindelsesstruktur (for eksempel modifikasjon ved den C-terminale karboksylgruppen og inklusjon av en -CH2–karbamatbinding mellom to aminosyrer i peptidforbindelsen).

Peptidforbindelsene blir typisk syntetisert som den frie syren, men, slik det er angitt ovenfor, kan de lett fremstilles som amidet eller esteren. Man kan også modifisere amino og/eller karboksyterminusen til peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen for å gi andre forbindelser ifølge oppfinnelsen. Aminoterminusmodifikasjoner inkluderer metylering, acetylering, tilsetting av en benzyloksykarbonylgruppe eller blokkering av aminoterminusen med en hvilken som helst blokkerende gruppe som inneholder en karboksylatfunksjon definert ved RCOO-, hvor R er valgt fra gruppen som består av naftyl, akridinyl, steroidyl og tilsvarende grupper. Karboksyterminusmodifikasjoner inkluderer erstatning av den frie syren med en karboksamidgruppe eller dannelse av et cyklisk laktam ved karboksyterminusen for å introdusere strukturelle begrensnigner.

Aminoterminusmodifikasjoner er slik det er angitt ovenfor og inkluderer alkylering, acetylerting, tilsetting av en karbobenzoylgruppe, dannelse av en succinimidgruppe etc. (Se for eksempel Murray, et al., “Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery”, 5. utg., Vol.1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc. (1995).) Spesifikt kan den N-terminale aminogruppen deretter omsettes som følger:

(a) for å danne en amidgruppe med formel RC(O)NH- hvor R er som definert ovenfor ved reaksjon med et syrehalid eller symmetrisk anhydrid. Typisk kan reaksjon utføres ved å bringe i kontakt ca. ekvimolar eller overskuddsmengder (for eksempel ca.5 ekvivalenter) av et syrehalid til peptidet i et inert fortynningsmiddel (for eksempel diklormetan) som foretrukket inneholder et overskudd (for eksempel ca.10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin, for å fange opp syren som genereres i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers hensiktsmessige (for eksempel romtemperatur i 30 minutter). Alkylering av den terminale aminogruppen for å gi en lavere alkyl N-substitusjon fulgt av reaksjon med et syrehalid slik det er beskrevet ovenfor, vil gi N-alkylamidgruppe med formelen RC(O)NR-;

(b) for å danne en succinimidgruppe ved reaksjon med ravsyreanhydrid. Som ovenfor, kan en tilnærmet ekvimolar mengde eller et overskudd av ravsyreanhydrid (for eksempel ca.5 ekvivalenter) anvende og aminogruppen omdannes til succinimidet ved fremgangsmåter kjente i litteraturen som inkluderer ved anvendelse av et overskudd (for eksempel ti ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin i et passende inert løsemiddel (for eksempel diklormetan). Se for eksempel Wollenberg, et al., US-patent nr.4.612.132. Det er å forstå at ravsyregruppen kan substitueres med for eksempel alkyl eller -SR substituenter som fremstilles på vanlig måte for å gi substituert succinimid ved N-terminusen til peptidet. Slike alkylsubstituenter fremstilles ved reaksjon med en lavere olefin med maleinsyreanhydrid på en måte slik det er beskrevet av Wollenberg, et al., ovenfor og -SR substituenter fremstilles ved reaksjon mellom RSH og maleinsyreanhydrid hvor R er som definert ovenfor;

(c) for å danne benzyloksykarbonyl-NH- eller en substituert benzyloksykarbonyl-NH-gruppe ved reaksjon med en tilnærmet ekvivalent mengde eller et overskudd av CBZ-Cl (dvs. benzyloksykarbonylklorid) eller et substituert CBZ-Cl i et passende inert fortynningsmiddel (for eksempel diklormetan) foretrukket inneholder et tertiært amin for å fange opp syren som genereres i løpet av reaksjonen;

(d) for å danne en sulfonamidgruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (for eksempel 5 ekvivalenter) av R-S(O)2Cl i et passende inert fortynningsmiddel (diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til et sulfonamid hvor R er som definert ovenfor. Foretrukket inneholder det inerte fortynningsmidlet overskudd tertiært amin (for eksempel ti ekvivalenter) slik som diisopropyletylamin, for å fange opp syren som genereres i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers hensiktsmessige (for eksempel rom temperatur i 30 minutter);

(e) for å danne en karbamatgruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (for eksempel 5 ekvivalenter) av R-OC(O)Cl eller R-OC(O)OC6H4-p-NO2i et passende inert fortynningsmiddel (for eksempel diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til et karbamat hvor R er som definert ovenfor. Foretrukket inneholder det inerte fortynningsmidlet et overskudd (for eksempel ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slik som diisopropyletylamin, for å fange opp eventuell syre generert i løpet av reaksjonen. Reaksjonsbetingelsene er ellers passende (for eksempel romtemperatur i 30 minutter); og

(f) for å danne en ureagruppe ved reaksjon med en ekvivalent mengde eller et overskudd (for eksempel 5 ekvivalenter) av R-N=C=O i et egnet inert fortynningsmiddel (for eksempel diklormetan) for å omdanne det terminale aminet til et urea (dvs. RNHC(O)NH-) gruppe hvor R er som definert ovenfor. Foretrukket inneholder det inerte fortynningsmidlet et overskudd (for eksempel ca. 10 ekvivalenter) av et tertiært amin, slike som diisopropyletylamin.

Reaksjonsbetingelsene er ellers passende (for eksempel romtemperatur i ca.30 minutter).

Ved fremstilling av peptidforbindelser hvori den C-terminale karbokylgruppen er erstattet med en ester (dvs. -C(O)OR hvor R er som definert ovenfor), blir harpiksene anvendt for fremstilling av peptidsyrer anvendt, og sidekjedebeskyttet peptid spaltes med base og passende alkohol, for eksempel, metanol. Sidekjedebeskyttende grupper blir deretter fjernet på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid for å gi den ønskede esteren.

Ved fremstilling av peptidforbindelser hvori den C-terminale karboksylgruppen erstattes ved amidet -C(O)NR<3>R<4>, blir en benzhydrylaminharpiks anvendt som det faste støttematerialet for peptidsyntesen. Etter fullstendig syntese resulterer hydrogenfluorid behandling for å frigi peptidet fra støttematerialet direkte i det frie peptidamidet (dvs. C-terminusen er -C(O)NH2). Alternativt gir anvendelsen av den klormetylerte harpiksen i løpet av peptidsyntese koblet med reaksjon med ammoniakk for å spalte det sidekjedebeskyttede peptidet fra støttematerialet det frie peptidamidet og reaksjon med et alkylamin eller et dialkylamin gir det sidekjedebeskyttede alkylamidet eller dialkylamidet (dvs. C-terminusen er -C(O)NRR<1>hvor R og R<1>er som definert ovenfor). Sidekjedebeskyttelsen blir deretter fjernet på vanlig måte ved behandling med hydrogenfluorid som gir de frie amidene, alkylamidene eller dialkylamidene.

Man kan også cyklisere peptidforbindelsene, eller inkorporere et desamino eller deskarboksyresidu ved terminiien til peptidforbindelsen, slik at det ikke er noen terminal amino- eller karboksylgruppe, for å redusere mottageligheten for proteaser eller for å begrense konformasjonen av peptidforbindelsen. C-terminale funksjonelle grupper til peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen inkluderer amid, amid lavere alkyl, amid di(lavere alkyl), lavere alkoksy, hydroksy og karboksy, og de lavere esterderivatene derav, og de farmasøytisk akseptable saltene derav.

I tillegg til de foregående N-terminale og C-terminale modifikasjonene kan peptidforbindelsene, som inkluderer peptidomimetiske midler, fordelaktig modifiseres med eller kovalent koblet til en eller flere av et antall hydrofile polymerer. Det har blitt funnet at når peptidforbindelsene derivatiseres med en hydrofilpolymer, øker deres løselighet og sirkuleringshalveringstid og deres immunogenisitet maskeres. Det foregående kan utføres med liten, hvis noen, reduksjon i deres bindingsaktivitet. Ikke-proteinholdige polymerer egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, polyalkyletere som for eksempel polyetylenglykol og polypropylen glykol, polymelkesyre, polyglykolsyre, polyoksyalkener, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, cellulose og cellulosederivater, dekstran og dekstranderivater etc. Generelt har slike hydrofile polymerer en gjennomsnittlig molekylvekt varierende fra ca.500 til ca. 100.000 dalton, mer foretrukket fra ca.2.000 til ca.40.000 dalton og, enda mer foretrukket, fra ca.5.000 til ca.20.000 dalton. I foretrukne utførelsesformer har slike hydrofile polymerer en gjennomsnittlig molekylvekt på ca.5.000 daltons 10.000 dalton. og 20.000 dalton.

Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres med eller kobles til slike polymerer ved anvendelse av en hvilken som helst av fremgangsmåtene fremsatt i Zallipsky, S., ”Bioconjugate Chem.”, 6:150-165 (1995); Monfardini, C, et al., “Bioconjugate Chem.”, 6:62-69 (1995); US-patent nr. 4.640.835; US-patent nr.

4.496.689; US-patent nr.4.301.144; US-patent nr.4.670.417; US-patent nr.4.791.192; US-patent nr.4.179.337 eller WO 95/34326.

I en foreliggende foretrukket utførelsesform blir peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen derivatisert med polyetylenglykol (PEG). PEG er en lineær, vannløselig polymer av etylenoksidrepeterende enheter med to terminale hydroksylgrupper. PEGer blir klassifisert ved deres molekylvekter som typisk varierer fra ca.500 dalton til ca.40.000 dalton. I en foreliggende foretrukket utførelsesform har PEGene som anvendes molekylvekter varierende fra 5.000 dalton til ca.20.000 dalton. PEGer koblet til peptidforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan enten være forgrenet eller uforgrenet. (Se for eksempel Monfardini, C, et al., “Bioconjugate Chem.”, 6:62-69 (1995)). PEGer er kommersielt tilgjengelige fra Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.) (nå del av Nektar Therapeutics (San Carlo, CA), Sigma Chemical Co. og andre selskaper. Slike PEGer inkluderer, men er ikke begrenset til, monometoksypolyetylen glykol (MePEG-OH), monometoksypolyetylenglykol-succinat (MePEG-S), monometoksypolyetylenglykol-succinimidylsuccinat (MePEG-S-NHS), monometoksypolyetylen glykol-amin (MePEG-NH2), monometoksypolyetylenglykol-tresylat (MePEG-TRES), og monometoksypolyetylenglykol-imidazolyl-karbonyl (MePEG-IM).

Kort fortalt, i en utførelsesform, er den hydrofile polymeren som anvendes, for eksempel, PEG, foretrukket dekket på en ende med en ureaktiv gruppe slik som en metoksy- eller etoksygruppe. Deretter blir polymeren aktivert ved den andre enden ved reaksjon med et passende aktiveringsmiddel, slik som cyanurinhalider (for eksempel cyanurinklorid, bromid eller fluorid), diimadozl, et anhydridreagens (for eksempel et dihaloravsyreanhydrid, slik som dibromravsyreanhydrid), acylazid, p-diazoiumbenzyl eter, 3-(p-diazoniumfenoksy)- 2-hydroksypropyleter) og lignende. Den aktiverte polymeren blir deretter omsatt med en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen for å gi en peptidforbindelse derivatisert med en polymer. Alternativt kan en funksjonell gruppe i peptidforbindelsen ifølge oppfinnelsen aktiveres for reaksjon med polymeren, eller de to gruppene kan bindes i en samtidig koblingsreaksjon ved anvendelse av kjente koblingsfremgangsmåter. Det vil være å forstå at peptidforbindelsen ifølge oppfinnelsen kan derivatiseres med PEG ved anvendelse av en myriade av andre reaksjonsskjemaer kjente for og anvendt av fagmannen.

Når peptidforbindelsene derivatiseres med en hydroflil polymer, blir deres løselighet og sirkuleringshalveringstider økt og deres immunogenisitet redusert. Det foregående kan også utføres med lite, hvis noe, tap av biologisk aktivitet. I foretrukne utførelsesformer har de derivatiserte peptidene en aktivitet som er 0,1 til 0,01 ganger den til ikkemodifiserte peptider. I mer foretrukne utførelsesformer har de derivatiserte peptidene en aktivitet som er 0,1 til 1 ganger den til de ikke-modifiserte peptidene. I enda mer foretrukne utførelsesformer har de derivatiserte peptidene en aktivitet som er større enn de ikke-modifiserte peptidene.

Andre fremgangsmåter for fremstilling av peptidderivater av forbindelsene beskrevet heri er beskrevet i Hruby, et al., ”Biochem J.”, 268(2):249-262 (1990). Således tjener peptidforbindelsene også som strukturmodeller for ikke-peptidforbindelser med tilsvarende biologiske aktivitet. Fagmannen vil se at et antall teknikker er tilgjengelige for å konstruere forbindelser med samme eller tilsvarende ønsket biologisk aktivitet som ledepeptidforbindelsen, men med mer fordelaktig aktivitet enn den ledeforbindelsen med hensyn til løselighet, stabilitet og tilbøyelighet til hydrolyse og proteolyse. Se Morgan, et al., “Ann. Rep. Med. Chem.”, 24:243-252 (1989). Disse teknikker inkluderer erstatning av peptidryggradne med en ryggrad bestående av fosfonater, amidater, karbamater, sulfonamider, sekundære aminer og N-metylamino syrer.

Egnede reagenser inkluderer, for eksempel, aminosyreanaloger hvori karboksylgruppen til aminosyren har blitt erstattet med en bestanddel egnet for å danne en av bindingene ovenfor.

Tilsvarende kan erstatning av en amidobinding i peptidet med en fosfonatbinding oppnås på måten fremsatt i US-patenter nr.5.359.115 og 5.420.328.

Forbindelsene beskrevet heri kan eksistere i en cyklisert form med en intramolekylær disulfidbinding mellom tiolgruppene til inkorporerte cysteiner, hvis tilstede. Alternativt kan en intermolekylær disulfidbinding mellom tiolgruppene til cysteinene fremstilles for å gi en dimer (eller høyere oligomer) forbindelse. En eller flere av cysteinresiduene kan også være substituerte med et homocystein.

Peptidforbindelsene er anvendelige in vitro som unike verktøy for å forstå den biologiske rollen til TPO, som inkluderer evalueringen av de mange faktorer antatt å influere, og bli influert av, fremstilling av TPO og reseptorbindingsprosessen.

Foreliggende peptidforbindelser er også anvendelige ved utvikling av andre forbindelser som binder og aktiverer TPO-R, på grunn av at de foreliggende peptidforbindelsene tilveiebringer vikting informasjon når det gjelder forholdet mellom struktur og aktivitet som skan avstedkomme slik utvikling.

Peptidforbindelsene er også anvendelige som konkurrerende bindingsmidler i undersøkelser for å screene for nye TPO reseptoragonister. I slike undersøkelses utførelsesformer kan peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes uten modifikasjon eller kan modifiseres på et antall måter; for eksempel, ved merking, slik som kovalent eller ikke-kovalent å binde en bestanddel som direkte eller indirekte tilveiebringer et detekterbart signal. I en hvilken som helst av disse undersøkelsene kan materialene dertil merkes enten direkte eller indirekte. Muligheter for direkte merking inkluderer merkede grupper slike som: radiomerker slike as 125 I, enzymer (US-patent nr.

3.645.090) slik som peroksidase og alkalisk fosfatase, og fluorescensmerker (US-patent nr. 3.940.475) i stand til å overvåke forandringen i fluorescensintensitet, bølgelengdeskift eller fluorescenspolarisering. Muligheter indirekte merking inkluderer biotinylering av en bestanddel fulgt av binding til avidin koblet til en eller flere av de ovenfor nevnte merkede gruppene. Peptidforbindelsene kan også inkludere mellomromsgrupper eller bindingsgrupper i tilfeller hvor peptidforbindelsene skal bindes til et fast støttemateriale.

Videre, basert på deres evne til å binde til TPO reseptoren, kan peptidforbindelsene anvendes som reagenser for å detektere TPO reseptorer på levende celler, fikserte celler, i biologiske fluider, i vevshomogenater, i rensede, naturlige biologiske materialer etc. For eksempel, ved å merke slike peptidforbindelser, kan man identifisere celler som har TPO-R på deres overflater. I tillegg, basert på deres evne til å binde TPO reseptoren, kan peptidforbindelsene anvendes i in situ farging, FACS (fluorescensaktivert cellesortering), Western blotting, ELISA etc. I tillegg, basert på deres evne til å binde til TPO reseptoren, kan peptidforbindelsene anvendes i reseptorrensing eller i å rense celler som uttrykker TPO reseptorer på celleoverflaten (eller inne i permeabiliserte celler).

Peptidforbindelsene kan også anvendes som kommersielle reagenser for forskjellig medisinsk forskning og diagnostiske anvendelser. Slike anvendelser inkluderer, men er ikke begrenset til: (1) anvendelse av en kalibreringsstandard for kvantifisering av aktivitetene til kandidat TPO agonister i et antall funksjonelle undersøkelser; (2) anvendelse for å opprettholde proliferasjon og vekst av TPO-avhengige cellelinjer; (3) anvendelse i strukturanalyse av TPO-reseptoren gjennom ko-krystallisering; (4) anvendelse for å undersøkte mekanismen for TPO signal transduksjon/reseptoraktivering; og (5) annen forskning og diagnostiske anvendelser hvori TPO-reseptoren foretrukket aktiveres eller slik aktivering blir hensiktsmessig kalibrert mot en kjent mengde av en TPO agonist og lignende.

Peptidforbindelsene kan anvendes for in vitro ekspansjonen av megakaryocytte og deres overgitte progenitorer, både i forbindelse med ytterligere cytokiner eller alene. Se for eksempel DiGiusto, et al., PCT Publikasjon Nr.95/05843. Kjemoterapi og strålebehandling forårsaker trombocytopeni ved avliving av den raske celledelingen, mer moden populasjon av megakaryocytter. Imidlertid kan disse terapeutiske behandlinger også redusere antallet levedyktige ikke-modne, mindre mitotisk aktive megakaryocyttforløperceller. Således kan lindring av trombocytopeni med TPO eller forbindelser ifølge oppfinnelsen gå fortere ved å infusere pasienter etter kjemoterapi eller strålebehandling med en populasjon av hans eller hennes egne celler anriket med megakaryocytter og ikke-modne forløpere med in vitro kultur.

Peptidforbindelsene kan også administreres til varmblodige dyr, som inkluderer mennesker, for å aktivere TPO-R in vivo. For eksempel kan peptidforbindelsene administreres for å behandle et antall hematologiske forstyrrelser, som inkluderer, men ikke begrenset til blodplate forstyrrelser og trombocytopeni, særlig når de er assosiert med benmargtransfusjoner, strålebehandling og kjemoterapi.

TPO antagonister kan foretrukket først bli administrert til pasienter som gjennomgår kjemoterapi eller strålebehandling, fulgt av administrasjon av TPO agonistene ifølge oppfinnelsen.

Aktiviteten til peptidforbindelsene kan evalueres enten in vitro eller in vivo i en av et antall modeller beskrevet i McDonald, ”Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology”, 14:8-21 (1992).

Ifølge en utførelsesform er sammensetningene ifølge oppfinnelsen anvendelige for behandling av trombocytopeni assosiert med benmargstransfusjoner, strålebehandling eller kjemoterapi. Peptidforbindelsene vil typisk administreres profylaktisk før kjemoterapi, strålebehandling eller benmargstransplantasjon eller etter slik eksponering.

Følgelig beskrives også farmasøytiske sammensetninger som innbefatter, som en aktiv ingrediens, minst en av peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen i assosiasjon med en farmasøytisk bærer eller fortynningsmiddel. Peptidforbindelsene kan administreres ved oral, pulmonær, parental (intramuskulær, intraperitoneal, intravenøs (IV) eller subkutan injeksjon), inhalasjon (via en finpulverformulering), transdermale, nasale, vaginale, rektale eller sublinguale administrasjonsruter og kan formuleres i doseringsforms passende for hver administrasjonsrute. Se for eksempel Bernstein, et al., PCT Patent Publikasjon Nr. WO 93/25221; Pitt, et al., PCT Patent Publikasjon Nr. WO 94/17784; og Pitt, et al., Europeisk Patentsøknad 613.683.

Faste doseringsformer for oral administration inkluderer kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faste doseringsformer blir den aktive peptidforbindelsen blandet med minst en inert farmasøytisk akseptabel bærer slik som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også innbefatte, slik det er normalt, ytterligere substanser forskjellig fra inerte fortynningsmidler, for eksempel smøremidler slike som magnesiumstearat. I tilfellet kapsler, tabletter og piller kan doseringsformene også innbefatte buffere. Tabletter og piller kan i tillegg fremstilles med enteriske belegg.

Flytende doseringsformer for oral administrasjon inkluderer farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper, med eliksirene innbefattet inerte fortynningsmidler slik det er vanlig i litteraturen, slik som vann. I tillegg til slike inert fortynningsmidler kan sammensetninger også inkludere adjuvanser, slike som fuktemidler, emulgeringsmidler og suspenderingsmidler, og søtningsstoffer, smaksstoffer og parfymer.

Preparatene for parental administrasjon inkluderer sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempels på ikke-vandige løsemidler eller vehikler er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, slik som olivenolje og maisolje, gelatin og injiserbare organiske estere slik som etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde adjuvanser slike som konserveringsmidler, fuktemidler, emulgatorer og dispergeringsmidler. De kan for eksempel steriliseres ved filtrering gjennom et bakterietilbakeholdende filter, ved inkorporering av steriliseringsmidler i sammensetningene, ved bestråling av sammensetningene, eller ved oppvarming av sammensetningene. De kan også fremstilles ved anvendelse av sterilt vann, eller et annet sterilt injiserbart medium, umiddelbart før anvendelse.

Sammensetninger for rektal eller vaginal administrasjon er foretrukket stikkpiller som kan inneholde, i tillegg til den aktive substansen, eksipienser slike som kakaosmør eller en stikkpillevoks. Sammensetninger for nasal eller sublingual administrasjon blir også fremstilt med standard eksipienser godt kjent i litteraturen.

Sammensetningene som inneholder peptidforbindelsene kan administreres for profylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger. Ved terapeutiske anvendelser blir sammensetningene administrert til en pasient som allerede lider av en sykdom, slik det er beskrevet ovenfor, i en mengde tilstrekkelig til å helbrede eller i det minste delvis arrestere symptomene til sykdomdmen og dens komplikasjoner. En mengde adekvat for å utføre dette er definert som "terapeutisk effektive dose". Mengder effektive for denne anvendelsen vil avhenge av alvorligheten til sykdommen og vekten og den generelle tilstanden til pasienten.

Sammensetningene kan også mikroinnkapsles, for eksempel, med fremgangsmåten til Tice og Bibi (i ”Treatise on Controlled Drug Delivery”, red. A. Kydonieus, Marcel Dekker, New York (1992), s.315-339).

I profylaktiske anvendelser blir sammensetningene som inneholder peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen administrert til en pasient mottagelig for eller på annen måte med risiko for en spesiell sykdom. En slik mengde er definert til å være en "profylaktisk effektiv dose". Ved denne anvendelsen avhenger de presise mengdene igjen på pasientens helsetilstand og vekt.

Mengder av peptidforbindelse nødvendig for effektiv behandling vil avhenge av mange forskjellige faktorer, som inkluderer administrasjonsmåte, målsete, fysiologisk tilstand til pasienten og andre medikamenter som administreres. Således skal behandlingsdosene titreres for å optimalisere sikkerhet og effektivitet. Typisk kan doseringene anvendt in vitro tilveiebringe anvendelige retningslinjer når det gjelder mengder anvendelige for in situ administrasjon av disse reagensene. Dyretesting av effektive doser for behandling av spesielle forstyrrelser vil gi ytterligere predikerende indikasjon på human dosering. Forskjellige overveielser er beskrevet, for eksempel, i Gilman, et al. (red.), Goodman og Gilman's: “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 8. utg., Pergamon Press (1990); og Remington's Pharmaceutical Sciences, 7. utg., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985).

Peptidforbindelsene er effektive ved behandling av TPO medierte tilstander når de administreres ved en dose som varierer fra ca.0,001 mg til ca.10 mg/kg kroppsvekt per dag. Den spesifikke dosen som anvendes reguleres av den bestemte tilstanden som behandles, administrasjonsrute så vel som vurdering av ansvarlig lege avhengig av faktorer slike som alvorlighet av tilstanden, alder og generell tilstand til pasienten, og lignende.

Eksempel 1

Fastfase peptidforbindelsessyntese

Peptidforbindelsene kan for eksempel syntetiseres ved anvendelse av Merrifield fastfasesynteseteknikker (se Steward og Young, ”Solid Phase Peptide Synthesis”, 2. utg., Pierce Chemical, Rockford, 111. (1984) og Merrifield, “J. Am.

Chem. Soc”., 85:2149 (1963)) eller en Applied Biosystems Inc. Model 43 IA eller 433A peptidsyntetiserer. Peptidforbindelsene kan settes sammen ved anvendelse av standard protokoller i Applied Biosystems Inc. Synth Assist™ 1.0.0 eller Synth Assist™ 2.0.2. Hver kobling kan utføres i 2x30 min. med HBTU (2-(lH-benzatriazol-l-yl)-l, 1,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat) og HOBt (1-hydroksybenzotriazol).

Harpiksen som anvendes kan være HMP harpiks (p-hydroksymetyl fenoksymetyl)-polystyrenharpiks eller PAL (Milligen/Biosearch), som er en tverrbundet polystyren harpiks med 5-(4'- Fmoc-aminometyl-3,5'-dimetyoksyfenoksy)valerinsyre som en bindingsgruppe. Anvendelse av PAL harpiks resulterer i en karboksylterminal amidfunksjonalitet etter spalting av peptidet fra harpiksen. Etter spalting gir HMP harpiksen en karboksylsyrebestanddel ved C-terminusen til sluttproduktet. De fleste reagenser, harpikser og beskyttede aminosyrer (frie eller på harpiksen) kan kjøpes fra Millipore eller Applied Biosystems Inc.

Fmoc gruppen kan anvendes for aminobeskyttelse i løpet av koblingsfremgangsmåten. Primær aminbeskyttelse på aminosyrer kan oppnås med Fmoc og sidekjedebeskyttende grupper slike som t-butyl for serin, tyrosin, glutamsyre og treonin; trityl for glutamin; Pmc (2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl) for arginin; N-t-butyloksykarbonyl for tryptofan; N-trityl for histidin og S-trityl for cystein kan anvendes.

Fjerning av peptidforbindelsene fra harpiksen og simultan avbeskyttelse av sidekjedefunksjonene kan oppnås ved behandling med reagens K eller små modifikasjoner av det. Alternativt, ved syntese av de peptidene, med en amidert karboksylterminus, kan det fullt sammensatte peptidet spaltes med en blanding av 90% trifluoreddiksyre, 5% etanditiol og 5% vann, initielt ved 4°C, og gradvis økende til romtemperatur. De avbeskyttede peptidforbindelsene kan presipitere med dietyleter. Rensing kan skje ved preparativ, omvendt fase, høy-ytelses væskekromatografi på en C18bundet silikagel kolonne med en gradient av acetonitril/vann i 0,1% trifluoreddiksyre. De homogene peptidforbindelsene kan karakteriseres ved Rask Atom Bombardment massespektrometri eller elektrospraymassespektrometri og aminosyreanalyse når det er mulig.

I en foretrukket utførelsesform blir peptidforbindelsene dimerisert ved anvendelse av standard syntesefremgangsmåter kjente for og anvendt av fagmannen. Etterfølgende disse synteseskjemaene kan fagmannen lett fremstille dimer peptidforbindelser i henhold til foreliggende oppfinnelse. I tillegg vil det være nærliggende for fagmannen at de dimere underenhetene lett kan bindes ved anvendelse av kjente metodologier og bindingsgrupper.

Eksempel 2

Pegylering av peptidforbindelsene

Pegylering av en peptidforbindelse kan utføres ved godt kjente teknikker. For eksempel kan en peptidforbindelse ifølge oppfinnelsen løses i 100 mM bicin pH 8,0 ved en konsentrasjon på 10 mg/ml, tilsettes til en 1,25 ganger molart overskudd av pulverisert PEG2 (kommersielt tilgjengelig fra Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala., nå Nektar Therapeutics (San Carlo, CA)) og røres ved romtemperatur til fullstendig reaksjon, typisk 1-2 timer. Reaksjonen overvåkes ved revers fase HPLC ved anvendelse av en 40-65% acetonitrilgradient med en YMC ODS AQ kolonne. Idet reaksjonen er fullstending, blir løsningen tilsatt til et andre 1,25 molart overskudd av pulverisert PEG2 og fremgangsmåten gjentas 4 ganger ved anvendelse av totalt 5 mol PEG2 for hvert mol polypeptid. Løsningen fortynnes 2 ganger med PBS for å redusere viskositeten og tilsettes til en superdeks 200 kolonne (Pharmacia), på forhånd likevektsinnstilt og elutert med PBS. Fraksjoner fra størrelseseksklusjonskolonnen kan analyseres ved omvendt fase HPLC. Fraksjoner som inneholder di-PEG-polypeptid som eluerer før eventuell mono-PEG peptidforbindelse kan samles opp og lagresl ved 5<0>C eller lyofiliseres.

Eksempel 3

Pre-kliniske dyrestudier på trombopoietisk aktivitet av TPO PEGylert forbindelse nr. 1

TPO Forbindelse Nr.1 deler ingen sekvenshomologi med endogent TPO, som reduserer risikoen for dannelse av antistoffer som kryssreagerer med endogent TPO. TPO forbindelse nr.1 ble PEGylert for å redusere klarering og for ytterligere å redusere antigenisiteten. Dette eksempelet beskriver pre-kliniske studier av trombopoietisk aktivitet av PEGylert TPO forbindelse nr.1 hos et dyr.

Normal hannkjønn Wistar rotter (kilde) ble anvendt for studiene. Andre dyr, slik som hunder, mus, aper etc. kan også anvendes for pre-kliniske studies. All fremgangsmåter som involverer dyr ble utført i en dyrefasilitet fulgt akkreditert av “the American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care” (AAALAC) og i henhold til “The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (NIH).

Normale hannkjønns Wistar rotter (10 uker gamle, 230 til 367 g kroppsvektområde ved dosering) ble behandlet med enkle intravenøse doser av TPO forbindelse nr. 1 ved 30, 100 eller 300 ug/kg (40 rotter/gruppe). Før dosering, 96, 144, 192, 240, 288 og 312 timer etter dosering, ble ca.0,5 ml blod samlet opp ved punktering av jugularvenen til ikke-anestetibehandlede rotter (5 rotter per tidspunkt, EDTA som antikoagulant) og blodplatetallene ble bestemt ved anvendelse av et automatisert hematologisk analyse system. Dyrene ble fastet over natten, med vann tilgjengelig, før hver prøveoppsamling.

Enkle intravenøse doser av PEGylert TPO forbindelse nr.1 (30, 100 eller 300 μg/kg) resulterte i et økt periferalt blodplatetall hos normal hannkjønn Wistar rotter med tidligste etter-dosebestemmelse på day 4 (Fig.6). Blodplatetallene ble bestemt hver 2 dag i løpet av 2 uker oppfølging og sammenlignet med før-dosetellingen. 300 μg/kg dose induserte den høyeste økningen i blodplatetall, som returnerte til grunnlinje på dag 14.

Eksempel 4

Fase I kliniske studier av trombopoietisk aktivitet til PEGylert TPO forbindelse nr. 1

Fase I studier ble utført for å undersøke tolererbarheten, farmakodynamikker og farmakokinetikker til PEGylert TPO forbindelse nr.1. Dette eksempelet beskriver fase I studier av PEGylert TPO forbindelse nr.1 etter en enkel intravenøs injeksjon hos friske frivillige hannkjønnssubjekter. Fase I studier på PEGylert TPO forbindelse nr.1 og andre forbindelser ifølge oppfinnelsen etter multiple intravenøs injeksjon eller andre måter for administrasjon og/eller til en pasient som trenger behandling, kan utføres ved anvendelse av protokoller kjente for fagmannen.

Førti frivillige ble randomisert til å motta PEGylert TPO forbindelse nr.1 eller placebo som en enkel i.v. bolusinjeksjon i et forhold på 6:2. Åtte subjekter ble randomisert i 6:2 forhold for å motta en enkel injeksjon av PEGylert TPO forbindelse nr.1 eller placebo, med et doseområde på 0,375, 0,75, 1,5, 2,25 eller 3 μg/kg. Den farmakodynamiske responsen ved PEGylert TPO forbindelse nr.1 ble målt som hevning i blodplatetall. PEGylert TPO forbindelse nr. 1 nivåer ble bestemt i blodplatefattig plasma ved anvendelse av en validert enzymbundet immunosorbentundersøkelse. Nivåer av endogent TPO, EPO, IL-6 og IL-11 ble målt på de indikerte tidspunktene ved anvendelse av standard immunoundersøkelser. En biosensorimmunoundersøkelse (BiaCore technology) ble anvendt for å måle antistoffdannelse overfor peptidbestanddelen til PEGylert TPO forbindelse nr.1. Effekten på blodplatefunksjon ble målt ved å overvåke kollagenindusert blodplateaggregering ved 4 timer og 12 dager etter PEGylert TPO forbindelse nr. 1 administrasjon.

PK analyse indikerte doserelaterte kinetikker av PEGylert TPO forbindelse nr.1, selv om de var ved doser på 0,75 μg/kg eller lavere, plasmakonsentrasjoner av PEGylert TPO forbindelse nr. 1 var generelt under kvantifiseringsgrensen på 6,25 ng/ml (Fig.7). Fire subjekter i 0,375 μg/kg dosegruppen og et subjekt i 3,0 μg/kg PEGylert TPO forbindelse nr.1 dosegruppen hadde ingen kvantifiserbare plasmanivåer. Midlere Cmax verdier varierte fra 10,9 ng/ml ved 0,75 μg/kg PEGylert TPO forbindelse nr.1 til 61,7 ng/ml ved 3,0 μg/kg PEGylert TPO forbindelse nr.1 (Tabell 1). Ingen PK data kan måles ved 0,375 μg/kg i.v. av TPO forbindelse nr.1. Den midlere terminale halveringstiden til PEGylert TPO forbindelse nr.1 varierte fra ca.18 til 36 timer. Median tmax varierte fra 0,09 til 2 timer. Økningen i Cmax med økende dose var tilnærmet doseproporsjonal, men det var en tilsynelatende økning i den normaliserte AUCθ-24 verdien med økende dose, som antas å være en høyere enn doseproporsjonal økning.

Tabell 1. Sammendra av PK anal se

Blodplateresponsen på administrasjon av PEGylert TPO forbindelse nr.1 var tilsvarende publiserte resultater for rhTPO og AMG531. Blodplatetallene økt doseavhengig til de nådde toppnivåer ved day 10-12, og tallene returnerte til bunnlinje i løpet av 3-4 uker (Fig.8). Midlere toppblodplatetall varierte fra 315 xlθ9/L ved 0,375 μg/kg i.v. til 685 x 109/L ved 3 μg/kg i.v., og midlere maksimale blodplatetall økt fra grunnlinje varierte fra 1,4-ganger ved 0,375 μg/kg til 3,2-ganger ved 3,0 μg/kg (Tabell 2). Minst 50% økning i blodplater ble observert i 4 av 6 subjekter som mottar PEGylert TPO forbindelse nr.1 ved en dose på 0,75 ug/kg, mens minst 2-ganger økning i blodplatetall ble observert hos ca.3 av 6 subjekter ved en dose på 1,5 ug/kg etc. Dosen på 0,75 ug/kg i.v. har blitt valgt som utgangsdose for fase II klinisk studie.

Bortsett fra forandringer i blodplatetall ble andre modne sirkulerende blodceller ikke berørt (data ikke vist). I tillegg påvirket administrasjon av PEGylert TPO forbindelse nr.

1 ikke blodplatefunksjon, ikke på administrasjonstidspunktet, heller ikke 12 dager etterdose, ved tidspunktet for fremkomst av nylig produserte blodplater.

Tabell 2. Sammendrag av blodplatetellingsanalyser

Effekten av PEGylert TPO forbindelse nr.1 administrert på vekstfaktorer som er kjente for å fremvise trombopoietisk aktivitet ble bestemt. Endogene TPO nivåer økte doseavhengig til de nådde toppverdier ved 3 dager etter dosering (Fig.9). Ingen signifikante forandringer ble observert i blodnivåer ved IL-6, IL-Il og EPO nivåer.

Blodplatefunksjon, bestemt som kollagenindusert blodplateaggregering i helt blod, var ikke forskjellig mellom behandlingene. Ingen av subjektene opplevde en alvorlig hendelse eller dosebegrensende toksisiteter. De mest hyppig observerte hendelsene inkluderte mild hodepine og svekkelse og opptrådte både etter aktiv behandling og placebo. Ingen antistoffer overfor PEGylert TPO forbindelse nr.1 ble detektert. Disse resultatene indikerer at PEGylert TPO forbindelse nr.1 ble godt tolerert ved testdoseområdet.

Claims

Patentkrav

1.

Terapeutisk effektiv dose av en peptidforbindelse som innbefatter følgende sekvens: (H-IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), hvori X10er sarkosin for terapeutisk behandling av hematologiske forstyrrelser hos mennesker, hvori nevnte peptidforbindelse administreres ved et doseringsområde på mellom 0,1 og 0,75 μg/kg, og hvori den hematologiske forstyrrelsen er en blodplateforstyrrelse eller trombocytopeni.

2.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori den hematologiske forstyrrelsen er trombocytopeni.

3.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori den hematologiske forstyrrelsen er assosiert med benmargstransfusjoner, strålebehandling, og kjemoterapi.

4.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori nevnte peptidforbindelse administreres ved et doseringsområde på 0,375 - 0,75 μg/kg.

5.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori administrering av nevnte peptidforbindelse resulterer i en midlere Cmaxverdi på ca.10 ng/ml ved ca.0,75 μg/kg peptidforbindelse.

6.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori administrering av nevnte peptidforbindelse resulterer i midlere terminal halveringstid av nevnte peptidforbindelse på fra ca.18 timer til ca.36 timer.

7.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori administrering av nevnte peptidforbindelse resulterer i median tmaxpå fra ca.0,09 timer til ca.2 timer.

8.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori administrering av nevnte peptidforbindelse resulterer i en ca.50% økning i blodplatetall ved en dose på ca.0,75 ug/kg.

9.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori administrering av nevnte peptidforbindelse resulterer i en økning av endogene TPO nivåer.

10.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori nevnte peptidforbindelse er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

11.

Forbindelse ifølge krav 10, hvori nevnte hydrofile polymer har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom ca.500 til ca.40.000 dalton.

12.

Forbindelse ifølge krav 11, hvori nevnte hydrofile polymer har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom ca.5.000 til ca.20.000 dalton.

13.

Forbindelse ifølge krav 10, hvori nevnte hydrofile polymer er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, polypropylenglykol, polymelkesyre og polyglykolsyre.

14.

Forbindelse ifølge krav 13, hvori nevnte hydrofile polymer er polyetylenglykol.

15.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori nevnte peptidforbindelse er dimerisert.

16.

Forbindelse ifølge krav 15, hvori hver av de dimere underenhetene til nevnte peptidforbindelse er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

17.

Forbindelse ifølge krav 16, hvori nevnte hydrofile polymer er polyetylenglykol.

18.

Forbindelse ifølge krav 17, hvori polyetylenglykolen er valgt fra gruppen som består av monometoksypolyetylenglykol (MePEG-OH), monometoksypolyetylenglykol-succinat (MePEG-S), monometoksypolyetylenglykol-succinimidylsuccinat (MePEG-S-NHS), monometoksypolyetylen glykol-amin (MePEG-NH2), monometoksypolyetylenglykoltresylat (MePEG-TRES) og monometoksypolyetylenglykol-imidazolyl-karbonyl (MePEG-IM).

19.

Forbindelse ifølge krav 1, hvori nevnte peptidforbindelse har følgende formel:

I E G P T L R Q (2-NaI) L A A R-(Sar)

\

K(NH2)

/

IE G P T LR Q (2-Nal) LA A R-(Sar)

hvori (2-Nal) er β-(2-naftyl)alanin og (Sar) er sarkosin.

20.

Forbindelse ifølge krav 19, hvori nevnte peptidforbindelse er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

21.

Forbindelse ifølge krav 20, hvori nevnte hydrofile polymer er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, polypropylenglykol, polymelkesyre og polyglykolsyre.

22.

Forbindelse ifølge krav 21, hvori nevnte hydrofile polymer er polyetylenglykol.

23.

Forbindelse ifølge krav 22, hvori nevnte polyetylenglykol har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom ca.5.000 til ca.20.000 dalton.

24.

Forbindelse ifølge krav 22, hvori polyetylenglykolen er valgt fra gruppen som består av monometoksypolyetylenglykol (MePEG-OH), monometoksypolyetylenglykol-succinat (MePEG-S), monometoksypolyetylenglykol-succinimidylsuccinat (MePEG-S-NHS), monometoksypolyetylen glykol-amin (MePEG-NH2), monometoksypolyetylenglykoltresylat (MePEG-TRES) og monometoksypolyetylenglykol-imidazolyl-karbonyl (MePEG-IM).

25.

Forbindelse ifølge krav 20, hvori hver av de dimere underenhetene av nevnte peptidforbindelse er kovalent bundet til en hydrofil polymer.

26.

Forbindelse ifølge krav 25, hvori nevnte hydrofile polymer er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, polypropylenglykol, polymelkesyre og polyglykolsyre.

27.

Forbindelse ifølge krav 26, hvori nevnte hydrofile polymer er polyetylenglykol.

28.

Forbindelse ifølge krav 27, hvori nevnte polyetylenglykol har en gjennomsnittlig molekylvekt på mellom ca.5.000 til ca.20.000 dalton.

29.

Forbindelse ifølge krav 27, hvori polyetylenglykolen er valgt fra gruppen som består av monometoksypolyetylenglykol (MePEG-OH), monometoksypolyetylenglykol-succinat (MePEG-S), monometoksypolyetylenglykol-succinimidylsuccinat (MePEG-S-NHS), monometoksypolyetylen glykol-amin (MePEG- NH2), monometoksypolyetylenglykoltresylat (MePEG-TRES) og monometoksypolyetylenglykol-imidazolyl-karbonyl (MePEG-IM).

30.

Anvendelse av en terapeutisk effektiv dose av en peptidforbindelse som innbefatter følgende sekvens: (H- IEGPTLRQ(2-Nal)LAARX10)-K(NH2)-(X10RAAL(2-Nal)QRLTPGEI)-H, (SEQ ID NO: 7), hvori X10er sarkosin i fremstilling av et medikament for terapeutisk behandling av en menneskepasient som lider av en hematologisk forstyrrelse, hvori nevnte peptidforbindelse administreres ved et doseringsområde på mellom 0,1 og 0,75 μg/kg.