NO341716B1

NO341716B1 - Reagenser og fremgangsmåter for å bedre reproduserbarhet og redusere feil priming i PCR-amplifikasjon

Info

Publication number: NO341716B1
Application number: NO20072507A
Authority: NO
Inventors: Lawrence J Wangh; John Rice; Aquiles J Sanchez; Kenneth Pierce; Jesse Salk; Arthur Reis; Cristina Harthorn
Original assignee: Univ Brandeis
Priority date: 2004-10-18
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2018-01-08
Also published as: EP1802774B1; RU2007118546A; AU2005295299A1; JP5165376B2; EP1802774A1; CA2584576C; RU2495046C2; EP1802774A4; ATE541055T1; US20060177842A1; JP2008516613A; BRPI0516619A; US20090226973A1; CA2584576A1; KR20070090158A; WO2006044995A1; CN101076608A; ES2380775T3; NO20072507L; BRPI0516619B1

Abstract

Et tilsetningsstoff for forhindring av feilpriming i polymerasekjedereaksjon (PCR)-amplifiseringer og -analyser som omfatter et hårnålsoligonukleotid med en stammedupleks som er lengre enn seks nukleotider og en stabilisert stammeende. Tilsetningsstoffet forbedrer PCR-amplifiseringer, innbefattet LATE-amplifiseringer, når det tilsettes til de innledende amplifiseringsreaksjons-blandingene. Det kan inngå i oligonukleotidsett og i sett for PCR-amplifisering og -analyser.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder nukleinsyreamplifiseringsreagenser og analyser som benytter polymerasekjedereaksjonen (PCR) innbefattet homogene analyser, både sanntidsanalyser og sluttpunktsanalyser.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Nukleinsyreamplifisering ved benyttelse av polymerasekjedereaksjonen (PCR) er velkjent og likeså analyser som omfatter PCR-amplifisering. Se U.S. patentskrifter nr. 4,683,202, 4,683,195 og 4,965,188 og, generelt PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis et al. eds., Academic Press (San Diego, CA (USA) 1990). Homogene PCR-analyser som ikke krever vask for fjerning av ubundne detektorreagenser eller prober og som således kan utføres uten å åpne amplifiseringsreaksjonskar, er også velkjente. Homogene PCR-analyser omfatter både sluttpunktsanalyser, i hvilke amplifisert produkt påvises ved avsluttet amplifiseringsreaksjon og sanntidsanalyser i hvilke amplifisert produkt påvises under noen eller alle temperatursykluser etter hvert som reaksjonen forløper. Se U.S. patentskrifter nr. 5,994,056, 5,487,972, 5,925,517 og 6,150,097.

PCR-amplifiseringsreaksjoner er generelt utformet til å være symmetriske, det vil si for å fremstille dobbelttrådede amplikoner ved benyttelse av en foroverprimer og en revers primer som er "tilpasset hverandre", det vil si at de har smeltetemperaturer som ligger så nær hverandre som mulig og at de tilsettes til reaksjonen i ekvimolare konsentrasjoner. En teknikk som har funnet begrenset anvendelse for fremstilling av enkelttrådet DNA direkte i en PCR-reaksjon er "asymmetrisk PCR". Gyllensten og Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988); og U.S. patentskrift nr. 5,066,584. Asymmetrisk PCR skiller seg fra symmetrisk PCR ved at en av primerne tilsettes i begrenset mengde, typisk 1-20 prosent av konsentrasjonen av den andre primeren.

Mer nylig har vi utviklet en ikke-symmetrisk PCR-amplifiseringsfremgangsmåte som betegnes "lineær-etter-eksponensiell" PCR eller forkortet "LATE-PCR". Se Sanchez et al. (2004) PNAS 101: 1933-1938, Pierce et al. (2005) PNAS 102: 8609-8614 og den offentliggjorte internasjonale patentsøknaden WO 03/054233 (3. juli 2003). LATE-PCR tar hensyn til de faktiske smeltetemperaturene til PCR-primerne ved amplifiseringens start, betegnet Tm[o]. Tm[o] kan bestemmes empirisk, noe som er nødvendig dersom ikke-naturlige nukleotider anvendes eller beregnes ifølge "nærmeste nabo"-fremgangsmåten (Santa Lucia, J. (1998) PNAS (USA) 95: 1460-1465; og Allawi, H. T. og Santa Lucia, J. (1997) Biochem. 36: 10581-10594) ved anvendelse av en justering for saltkonsentrasjonen. I vårt arbeid har vi benyttet en konsentrasjon av monovalente salter på 0,07 M.

En uønsket egenskap ved PCR-amplifiseringer som er redusert når det gjelder LATE-PCR, er spredning blant replikater. Etter den eksponentielle fasen av amplifiseringen, vil amplifiseringer i replikat som følges i sanntid divergere fra hverandre og nå et platå på forskjellige nivåer. Spredningen indikerer at replikatene ikke har den samme reaksjonskinetikk og reduserer nøyaktigheten. Dette er et problem for PCR-analyser generelt, men spesielt for sluttpunktsanalyser og analyser som avhenger av signalets vinkelkoeffisient under den lineære fasen.

Et annet signifikant problem forbundet med PCR-amplifiseringer er feilpriming som vi mener viser seg som minst tre typer: Type 1, feilpriming som opptrer under forberedelse av reaksjonsblandingene før amplifiseringens start; type 2, feilpriming som opptrer under amplifiseringen dersom syklustemperaturene omfatter en temperatur som ligger signifikant under en primers smeltetemperatur; og type 3, feilpriming som opptrer i de sene stadier av en PCR-amplifisering som fortsettes etter at en høy konsentrasjon av amplikon er blitt fremstilt. Flere tilnærminger er blitt anvendt for å løse den første typen av feilpriming. En tilnærming er å modifisere polymerasen kjemisk slik at den er inaktiv inntil den oppvarmes til en høy temperatur, for eksempel 95 °C. Se U.S. patentskrifter nr. 5,677,152 og 5,773,258. En annen tilnærming er å binde et antistoff til polymerasen for inhibering av polymerasen inntil reaksjonsblandingen oppvarmes til en høy temperatur, for eksempel 95 °C, for irreversibel denaturering av antistoffet. Se U.S. patentskrift nr. 5,338,671. Ytterligere en tilnærming er å la en aptamer inngå i reaksjonsblandingen. Se Doug og Jayasena (1996), J. Mol. Biol. 264: 268 - 278 og U.S. patentskrift nr. 6,020,130. En aptamer er et enkelttrådet oligonukleotid med lengde tilnærmet 30 nukleotider som bindes til en polymerase og inhiberer dens evne til å forlenge en tilbaketrukket 3'-ende ved lav temperatur. Aptamerer denatureres ikke irreversibelt ved 95 ºC, en typisk høyeste temperatur for en PCR-syklus. Kainz et al. (2000) Biotechniques 28: 278-282 rapporterte at tilsetning til PCR-reaksjonsblandinger av dobbelttrådede DNA-fragmenter med en lengde på 16-21 nukleotider i visse mengder inhiberer polymeraser ved temperaturer under typiske PCR-forlengelsestemperaturer og undertrykker syntesen av ikke-spesifikke produkter. DNA-fragmenter denatureres ikke irreversibelt under PCR-temperatursykluser. Eppendorf-5 Prime, Inc. markedsfører en hurtighetsbeskyttet ligand som sies å bindes til Taq-polymerase på en temperaturavhengig måte og inhibere bindingen av polymerasen til dobbelttrådet DNA ved temperaturer under tilnærmet 50 °C. Trass i disse mange forsøkene, forblir feilpriming et problem forbundet med PCR-amplifiseringer.

WO 0102559 A beskriver bruken av inhiberende oligonukleotider som kan have en hårnålsstruktur og som kan brukes til å forhindre ikke-spesifikk nukleinsyre syntese.

US 6183967 B1 beskriver bruken av nukleinsyreligander som kan have en stammeløkkestruktur og som kan forhindre at en PCR-blanding amplifiserer bakgrunns-DNA.

En annen måte som feilpriming viser seg på under PCR-amplifisering, betegnes primer-dimerdannelse og -amplifisering. Ifølge dette fenomenet hybridiserer en primer til den andre primeren eller til seg selv og gjennomgår så forlengelse av den 3' enden for dannelse av et lite dobbelttrådet amplikon som så kan amplifiseres videre eller danne multimerer og amplifiseres videre. Primer-dimerdannelse kan opptre i fravær av målsekvens.

Kvantitativ analyse av PCR-amplifiseringer er blitt gjort mulig ved sanntids deteksjonsfremgangsmåter siden den PCR-syklus, hvori fluorescenssignal blir synlig over terskelverdien eller CT for reaksjoner, indikerer utgangskonsentrasjonen av målsekvens. Sluttpunktsanalyser er i beste fall semikvantitative, delvis grunnet spredning mellom replikater idet reaksjonen går ut av eksponentiell amplifisering. Elektroforetisk analyse av dobbelttrådede amplikoner er semikvantitativ og kan benytte fluorescensmerkede primere. Sluttpunktsanalyse ved benyttelse av fluorescensmerkede prober, enten alleldiskriminerende prober eller feiltilpasningstolerante prober, er også i beste fall semikvantitativ. Ved å redusere spredningen og fremstille enkelttrådet produkt, byr LATE-PCR på en signifikant forbedring i sluttpunktsanalyse, men spredningen mellom replikater er ofte ikke fullstendig fjernet, noe som gjør kvantitativ multipleks deteksjon fortsatt mindre nøyaktig enn ønskelig.

Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en klasse av reagenstilsetninger for å forbedre produktspesifiteten og fjerne virkningene av feilpriming i PCR-amplifiseringsreaksjoner. Disse tilsetningsstoffene fungerer bedre enn eksisterende "varmstart"-metodologier i alle former for PCR og kan anvendes for å forhindre akkumulering av uønskede produkter innbefattet primer-dimerer og feilprimede amplikoner, både i reaksjonens tidlige stadier og under LATE-PCR-reaksjoner med mange sykluser (typisk 60 sykluser eller mer).

Det beskrives også heri PCR-amplifiserings- og analysefremgangsmåter, både symmetrisk PCR og ikke-symmetrisk PCR innbefattet, men ikke begrenset til, LATE-PCR og sett, ufullstendige sett og oligonukleotidsett som omfatter slike reagenstilsetninger.

OPPSUMMERING

Reagensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er tilsetningsstoffer som kan forhindre en eller flere manifestasjoner av feilpriming i i det minste noen PCR-amplifiseringer. Med "forhindre en manifestasjon" mener vi at ett eller flere produkter som skyldes feilpriming ikke påvises ved avslutningen av en reaksjon ved teknikker som beskrives heri, nemlig fluorescerende DNA-fargestoff, gelelektroforese, DNA-sekvensering og smeltepunktanalyse. Reagenser beskrevet heri kan inngå i PCR-amplifiseringsblandinger før amplifiseringens start i relativt lav konsentrasjon, mindre enn 1 mikromolar ( μM), det vil si 1000 nM, fortrinnsvis ikke mer enn 650 nanomolar (nM), mer foretrukket ikke mer enn 300 nM og mest foretrukket 50-250 nM, selv dersom det benyttes polymeraser som har både polymeriseringsaktivitet og 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet. Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er modifiserte enkelttrådede oligonukleotider.

Oligonukleotider som kan benyttes for konstruksjon av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, er oligonukleotider i bred forstand. De kan være DNA, RNA eller blandet DNA-RNA. De kan inneholde modifiserte nukleotider, ikkenaturlige nukleotider, for eksempel 2'O-metylribonukleotider, ikke-naturlige internukleotidbindinger, ikke-nukleotidlinkere, PNA, LNA og adderte kjemiske grupper så som et modifiserte nukleotider beskrevet av Glenn Research.

Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er enkelttrådede oligonukleotider som danner en stamme-og-løkkestruktur, vanligvis betegnet en "hårnåls"-struktur i en PCR-amplifiseringsreaksjonsblanding, selv om de også kan bestå av en stammeog-løkkestruktur hvori strukturen ikke består av nukleotider. I en slik struktur forblir en sentral del av molekylet enkelttrådet (ikke hybridisert) (løkken), mens endene hybridiserer til hverandre og danner stammen. En stamme kan være buttendet eller en tråd kan strekke seg ut over enden av den andre. En stamme kan bestå av et kontinuerlig dobbelttrådet område eller omfatte et internt feiltilpasset basepar, noe som gir en utbuling. Enden av stammen som dannes av oligonukleotidets ender er stabilisert slik at endene er bundet tettere sammen enn i et DNA-DNA-hybrid. Vi karakteriserer stammen i et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen ved henvisning til dens smeltetemperatur eller Tm.

Smeltetemperaturen er den temperatur i grader celsius ved hvilken 50% av de komplementære sekvensene i stammen ikke er hybridisert (åpen konfigurasjon) og 50% av de komplementære sekvensene er hybridisert eller delvis hybridisert til seg selv (lukket konfigurasjon). I den foreliggende patentsøknaden betyr den "beregnede Tm" for en stamme den beregnede smeltetemperaturen for stammedelen av det tilsvarende, ikke-stabiliserte, fullstendige DNA-oligonukleotid beregnet ved anvendelse av M-foldprogrammet: Zucker, M. (2003). "Mfold Web Server for Nucleic Acid Folding and Hybridization Prediction." Nucl. Acids Res. 31: 3406-3415, idet det antas en natriumkonsentrasjon på 70 millimolar (mM) og en magnesiumkonsentrasjon på 3 mM. Når det gjelder foretrukne utførelser som har innførte blokkerende par, fortrinnsvis ikke-fluorescerende blokkerende grupper som "Dabcyl" og "Black Hole Quenchers" som absorberer lys men som utsender energi som varme, er Tm den beregnede Tm for DNA-hårnålen uten de blokkerende gruppene. Når det gjelder utførelser som har modifiserte nukleotider i endene, er Tm den beregnede Tmfor DNA-hårnålen som inneholder de tilsvarende ikkemodifiserte nukleotidene. Når det gjelder 2'-O-metylribonukleotidinklusjoner i en stammeende, er Tmden beregnede Tmfor hårnåler som bare består av DNA og som inneholder deoksoribonukleotidanaloger av 2'-O-metylribonukleotidene. Vi benytter denne metodologien av den praktiske grunn at det er vanskelig å erholde det faktiske smeltepunktet for en stabilisert hårnål samtidig som vi innser at det faktiske smeltepunktet vil være flere grader høyere enn den beregnede Tmgrunnet den stabiliserende modifiseringen. Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen har en beregnet Tm for stammen som ikke overskrider 94ºC og som fortrinnsvis ligger i området 50-85ºC. For noen utførelser foretrekker vi en beregnet Tmfor stammen som er høyere enn primerens hybridiseringstemperatur (typisk 55-72ºC for en amplifiseringsreaksjon, det vil si i området 72-85ºC), mens vi i andre utførelser foretrekker en beregnet Tm for stammen som er lavere en primerens hybridiseringstemperatur, det vil si området 50-71ºC. De komplementære sekvensene i stammen åpnes og blir enkelttrådede ved 95ºC, temperaturen som anvendes for trådsmelting under PCR-sykluser. Videre har stammen i reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen en lengde som overskrider seks nukleotider ved temperaturer som er tilstrekkelig lave til at det dannes en lukket selvhybridisert konformasjon. For tiden danner våre foretrukne utførelser stammer som er 9-12 basepar lange, fortrinnsvis 9-11 basepar lange, når de er lukket, mer foretrukket 9-12, mest foretrukket 9-11 kontinuerlige komplementære basepar uten interne feiltilpassede basepar, mest foretrukket buttendede stammer som er 9-12 basepar lange og fullstendig komplementære. Den 3' enden i reagenset kan ikke forlenges av en DNA-polymerase i amplifiseringsreaksjonen slik at reagenset ikke er en PCR-primer. En eventuelt overhengende 3'-ende er blokkert for å forhindre forlengelse ved for eksempel addering av en fosfatgruppe eller en annen blokkerende kjemisk gruppe.

Lengden av løkken kan varieres i betydelig grad. Dersom en løkke består av nukleotider og internukleotidbindinger, er den minst tre nukleotider lang. Videre inneholder den, dersom den kun er tre nukleotider lang, en tymidinrest. Våre for tiden foretrukne nukleotidløkker har lengder i området 3-22 nukleotider. Løkker kan også være kjemiske ikke-nukleotidlinkere, for eksempel alkylenkjeder. For karbonkjedelinkere foretrekker vi en lengde på 3-6 karbonatomer og en mest foretrukket lengde på 3 karbonatomer. I alkylenkarbonkjeder deltar de gjenværende to valenselektronene i hvert medlem av karbonkjeden også i kovalente bindinger. Slike bindinger kan være til hydrogenatomer, til kortkjedede alkyl- eller alkylengrupper, til substituenter for kobling av reagenset til en fast overflate. Ikkeoligonukleotidløkker som omfatter kjemiske linkere er ikke begrenset til hydrokarbonkjeder og kan omfatte heteroatomer (ikke karbon eller hydrogen). Vi foretrekker at kjemiske linkere er elektrisk nøytrale slik at de ikke bindes til polymerasen. Siden aktiviteten av reagenset avhenger av stammens lukkede konformasjon, foretrekkes det at sammensetningen av løkken for reagenser med løkker på mer enn 5 nukleotider ikke i omfattende grad er komplementær til noen annen sekvens eller noen andre sekvenser i reaksjonsblandingen eller som dannes ved reaksjonen. Et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen er ikke en hybridiseringsprobe for noe produkt fra amplifiseringsreaksjonen og signaliserer ikke akkumulering av produkt.

Som antydet, omfatter reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen stabilisering av enden av stammen lengst bort fra løkken slik at stammens ende er tettere sammenbundet enn enden av et DNA-DNA-hybrid. I våre for tiden mest foretrukne utførelser er stammen buttendet og stammens ende er modifisert på en måte som inhiberer partiell trådseparasjon sammenlignet med et naturlig DNA-DNA-hybrid. Vi demonstrerer nedenfor virkningen av å innføre stabiliserende interaktive kjemiske grupper til stammens ender, både et par av dabcylgrupper kovalent bundet til det 3' og det 5' nukleotid i stammen ved hjelp av en kommersiell linker og et par kommersielt tilgjengelige Black Hole<TM>-blokkerere (rettighetsbeskyttede blokkerende grupper markedsført av Biosearch Technologies, Novato, CA, U.S.A.). Vi demonstrerer også virkningen av å benytte kraftig bindende ikke-naturlige nukleotider, 2'O-metylribonukleotider, i stammens ende. Foretrukne stabiliserende grupper er ikke-fluorescerende slik at reagensene ikke bidrar med bakgrunnsfluorescens til amplifiseringer og amplifiseringsanalyser. Ikke-stabiliserte oligonukleotid DNA-hårnåler av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilsatt i en konsentrasjon under 1 μM, vil ikke nødvendigvis i vesentlig grad redusere feilprimingen dersom de ikke er modifisert som beskrevet for stabilisering av stammenenden holdt sammen av hydrogenbindinger og vil i mange tilfeller ikke gjøre dette. Stabilisering er følgelig essensiell i reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Hårnålsreagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan beskrives som molekyler som inneholder to komplementær nukleotidoligomerer som holdes sammen på en slik måte at de kan danne en stamme på mer enn 6 basepar og at stammens åpne ende er kjemisk modifisert på en eller annen måte slik at stammens tendens til oppvinding eller "opptrivling" i den åpne enden undertrykkes. Selv om en grundig forståelse av den molekylære virkningsmekanismen i påvente av en videre analyse via enzymkinetikk i nærvær og fravær av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen så vel som strukturell analyse av interaksjonen mellom slike reagenser og polymerasen ved hjelp av alektronmikroskopi, kjernemagnetisk resonans og røntgenkrystallografi, kan en delvis forståelse av mekanismen forventes basert på den informasjon som gis her og i den vitenskapelige litteraturen. Litteraturen forteller oss at Taq-polymerase i likhet med andre DNA-polymeraser består av et syntesedomene og et 5'-eksonukleolytisk domene. Det 5'-eksonukleolytiske domenet foreligger ikke i Stoffelfragmentet. Litteraturen beskriver videre at syntesedomenet utfører DNA-polymerisering ved først å bindes til og så slik langs dobbelttrådet DNA. Syntesedomenet har en form som er blitt sammenlignet med en "åpen hånd" som i nærvær av dNTP'er gjennomgår en formendring på polypeptidnivå etter kontakt med dobbelttrådet DNA. Som et resultat av dette "lukkes håndens fingre" rundt det dobbelttrådede DNA-molekylet. Mistilpassede sekvenser i et dobbelttrådet molekyl får polymerasen til å rykke tilbake noen nukleotider og erstatte den gale basen med den korrekte basen ved anvendelse av 3'-redigeringsfunksjonen i syntesedomenet. Syntese av en ny DNA-tråd skjer etter hvert som enzymet leser templattråden og forlenger den 3' enden av den komplementære primeren. Dersom enzymet møter en 5'-hale på et oligonukleotid som allerede er bundet til templattråden, kan polymerasen invadere området som oligonukleotidet er bundet til ved 1-2 nukleotider og kløyve den resulterende 5'-halen ved hjelp av enzymets 5'-eksonukleasedomene.

Basert på denne informasjonen, kan man tenke seg at den dobbelttrådede stammen i et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen i det minste delvis fungerer ved å bindes til polymerasens syntesedomene i dennes åpne konformasjon og få domenet til å lukke seg. Synteseaktiviteten til polymerasen inhiberes derved. Uten ønske om å være bundet til en gitt teori, kan det følgelig postuleres at den første virkemåten er som en temperaturavhengig inhibitor av polymerasens synteseaktivitet.

Bevismaterialet som presenteres nedenfor viser at i det minste noen versjoner av reagensene ikke frigjøres av enzymet ved smeltetemperaturen for deres dobbelttrådede områder, det vil si stammer, men forblir bundne ved høyere temperaturer innbefatter spesielt typisk PCR-forlengelsestemperaturer. Under denaturerings- (eller trådsmeltings) trinnet i en PCR-syklus, løsner imidlertid reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen fra DNA-polymerase. Under denatureringstrinnet i PCR-syklusene (også betegnet trådsmeltingstrinnet), typisk over 90°C, smelter stammene i hårnålsreagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen og de bindes igjen til polymerasen bare dersom og når temperaturen reduseres tilstrekkelig til at det dobbelttrådede området gjendannes. Man kan følgelig velge å utforme et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen som kun er dobbelttrådet inntil den første denatureringen, det vil si et reagens som er dobbelttrådet når den tilsettes til PCR-reaksjonsblandingen før amplifiseringen (vanligvis ved romtemperatur), men som senere holdes over Tm for stammen. For en slik utførelse er primerhybridiseringstemperaturen i alle amplifiseringssykluser og eventuelle LATE-PCR-deteksjonstemperaturer ved lav temperatur høyere enn den beregnede Tm for stammen, fortrinnsvis med min 5°C. Alternativt kan man velge å utforme et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen som igjen blir dobbelttrådet senere under amplifiseringen. Dette kan oppnås ved å benytte en Tm for stammen (beregnet som beskrevet) som er høyere enn primerhybridiseringstemperaturen som anvendes i alle eller noen amplifiseringssykluser. I LATE-PCR-amplifisering kan dette alternativt oppnås ved å benytte en Tmfor stammen som er under primerhybridiseringstemperaturen men høyere enn de lavere

deteksjonstemperaturene. Den første utformingstypen vil generelt ikke inhibere polymerisering som vist ved en forsinkelse av CTmens benyttelse av en primer som har en hybridiseringstemperatur under Tm for stammen generelt vil føre til en moderat forsinkelse av CTpå 1-3 amplifiseringssykluser.

Uten ønske om å være bundet av en gitt teori, kan det videre postuleres at en andre virkemåte for reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er som en temperaturavhengig inhibitor av polymerasens 5'-eksonukleolytiske aktivitet. Vi viser nedenfor at reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer 5'- til 3'-eksonukleaseaktiviteten av polymeraseenzymet ved temperaturer på opptil minst 55°C og gjør dette uten i vesentlig grad å undertrykke enzymets evne til å forlenge en DNA-tråd ved polymerisering av den 3' enden (som PCR-primere forlenges i PCR-amplifiseringer).

Uten ønske om å være bundet av en gitt teori, kan det i tillegg postuleres at en tredje virkemåte for reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er som en temperaturavhengig ligand som bindes til polymerasen og får polymerasens polypeptid til å endre form. Når liganden frigjøres fra enzymet, forblir enzymet i den endrede formen i en viss tid før det vender tilbake til sin tidligere form. Mens enzymet foreligger i den endrede forme, bindes det fortrinnsvis til fullstendig komplementære primer-templathybrider sammenlignet med delvis feiltilpassed primer-templathybrider.

Basert på denne modellen, kan det forventes at evnen til stammen i reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å endre formen av syntesedomenet i polymerasen er forskjellig fra evnen til reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å inhibere enten polymerasens syntesefunksjon (første måte, ovenfor) eller funksjonen av polymerasens 5'-eksonuklease (andre måte, ovenfor). Både den første og den andre virkemåten avhenger faktisk av hastigheten ved hvilken det bundne reagenset frigjøres fra polymerasen. Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen som frigjøres hurtig, virker fortrinnsvis ved den tredje virkemåten, uten i signifikant grad å inhibere polymerasens synteseaktivitet, selv i høy konsentrasjon. I motsetning til dette, vil reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen som frigjøres langsomt fra polymerasen sannsynligvis være inhibitoriske i høye konsentrasjoner. For eksempel vil forbindelse 12-C3DD som består av en stamme og en karbonlinkerløkke med tre metylen (-CH2-) -grupper og forbindelse 12-C3 C3DD som består av en stamme og en karbonlinkerløkke med seks metylen (-CH2-) -grupper bare delvis inhibere PCR-amplifisering i konsentrasjon er på 3000 nM. I motsetning til dette inhiberer reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen med løkker som består av nukleotider typisk PCR-amplifisering fullstendig i en konsentrasjon på <1000 nM og noen ganger i konsentrasjoner på <500 nM i analysen i eksempel 1.

Som personer med kjennskap til protein-nukleinsyreinteraksjoner vil forstå, kan virkningen av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen skje ved mer enn en av virkemåtene 1-3 som ikke gjensidig utelukker hverandre, men som snarere er relative. Som beskrevet nedenfor, har vi utformet en kvantitativ analyse (eksempel 14) som kan anvendes for å bestemme i hvilken grad en gitt molekylstruktur som sammenkobler de to oligonukleotidene som utgjør stammen får den fullstendige forbindelsen til å virke som en enzyminhibitor (via den første eller den andre virkemåten) eller primært som en forsterker av enzymets spesifitet, den tredje virkemåten.

Basert på modellen ovenfor, kan det videre forventes at ett eller flere polymerasemolekyler kan bindes til et likt antall molekyler av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen som i sin tur er kovalent bundet til en større gruppe, for eksempel en kule, en partikkel eller et materiale fremstilt av et fast materiale. Det faste materialet kan med dette anses å være "lastet" med polymerase. Koblingen av reagenser til det faste stoffet kan være midlertidig eller kløyvbar ved hjelp av en rekke midler som er kjent innen faget. Kløyving av bindingen vil frigjøre reagenset eller reagens-polymerasekomplekset til løsningen (senere kan reagenset frigjøres fra polymerasen).

Utforming av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ligger innen teknikkens stand. Det vil forstås at smeltetemperaturen til en stamme kan i betydelig grad justeres ved å variere G-C-innholdet. For eksempel har stammene i to foretrukne utførelser som beskrives nedenfor, begge en lengde på ni nukleotider, men de har beregnede Tm'er som ligger 25°C fra hverandre (81°C og 56°C). Vi benytter vanligvis datamaskinprogramvaren M-fold, sitert ovenfor, for beregning av Tmfor stammen i forbindelse med en eller flere mulig løkkesekvenser.

Løkkesekvensen har ellers ikke blitt funnet å være signifikant i feilprimingsreagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I vår utforming benytter vi en sekvens som danner en perfekt buttendet stamme, det vil si en stamme uten indre feiltilpassede basepar og uten et terminalt overheng. Man kan da ved enkel prøving evaluere virkningen av å innføre et internt feiltilpasset basepar (en terminal feiltilpasning virker destabiliserende og kan ikke aksepteres, som vist i eksempel) eller en kort forlengelse på ett eller maksimalt to nukleotider utover det dobbelttrådede området.

Konstruksjon av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ligger innen teknikkens stand. For eksempel kan oligonukleotidsekvenser fremstilles i et oligonukleotidsynteseinstrument. Stabiliserende grupper kan innføres ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. For eksempel kan dabcylgrupper enkelt adderes ved å starte med en dabcylert kolonne (Glen Research) og avslutte syntesen med et dabcylmodifisert nukleotid. Ikke-naturlige nukleotider kan anvendes som det første, nest siste og siste nukleotidet i syntesen.

Når først et reagenskandidat er utformet og konstruert, kan smeltetemperaturen for stammen tilnærmet bestemmes empirisk i noen tilfeller ved å tilsette fluorescerende DNA-bindende fargestoff og utføre en smelteanalyse samtidig som fargestoffet eksiteres (idet man innser at fargestoffet selv har en virkning på Tm). Praktisk anvendbar informasjon vedrørende den faktiske smeltetemperaturen for en stabilisert stamme i et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan også i mange tilfeller utledes ved å utføres sanntids PCR-amplifiseringer ved benyttelse av forskjellige hybridiseringstemperaturer. Justeringer av stammelengder eller G-C-innhold kan om nødvendig innføres for å oppnå en ønsket Tm. Vi evaluerer så virkningene av et reagenskandidat på forskjellige manifestasjoner av feilpriming og amplifiseringseffektivitet ved å bestemme reagensets yteevne i en rigorøs PCR-amplifisering, for eksempel som beskrevet nedenfor i eksempel 1. Et reagenskandidat vurderes til å være et reagens dersom den når den inngår i reaksjonsblandingen ifølge eksempel 1 i en viss konsentrasjon under 1000 nM, fortrinnsvis ikke høyere enn 650 nM, gir et rent amplikon (se figur 1). Vi evaluerer kandidatanalyser ved anvendelse av analysen i eksempel 1, bortsett fra når det gjelder det påtenkte mål og de påtenkte primere. Amplifiseringer og analyser (amplifisering pluss deteksjon) er imidlertid ikke begrenset til betingelsene eller fremgangsmåtene i eksempel 1. Selv om et reagens inhibere i det minste én manifestasjon av feilpriming ved tilsetning i en konsentrasjon under 1000 nM sammenlignet med en polymerasekonsentrasjon (eksempel 1) på 1,25 enheter pr 25 μl reaksjonsblanding, kan reagenset anvendes i en hvilken som helst konsentrasjon relativ til polymerasekonsentrasjonen ved hvilket reagenset er effektiv, det vil si en hvilken som helst konsentrasjon (eller relativ konsentrasjon) ved hvilken den forhindrer feilpriming, men ikke i vesentlig grad forhindrer amplifisering.

Benyttelse av de påtenkte primerne i evalueringen vil avsløre utilsiktede konsekvenser så som manglende blokkering av reagensets 3' ende eller en oversett komplementaritet.

Beskrevet heri er PCR-amplifiseringsreaksjoner og analyser som innbefatter PCR-amplifiseringsreaksjoner innbefatter reaksjoner hvori amplifiseringsreaksjonsblandingen omfatter en varmestabilt DNA-polymerase med både polymeriseringsaktivitet og 5'-3'-eksonukleaseaktivitet så som Taq DNA-polymerase og hvori minst ett reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen inngår i amplifiseringsreaksjonsblandingen. Mange reagenser inhiberer aktiviteten av polymerase og tilsettes i en konsentrasjon relativt polymerasekonsentrasjonen innenfor de områder som er beskrevet ovenfor før eller under temperatursyklusene, det vil si ikke mer enn 1000 nM, fortrinnsvis ikke mer enn 650 nM for en reaksjon som inneholder 1,25 enheter DNA-polymerase pr 25 μl reaksjonsvolum. Noen reagenser vil, selv om de er effektive ved konsentrasjoner under 1000 nM og fortrinnsvis i konsentrasjoner under 650 nM, inhibere aktiviteten av polymerasen i mindre grad og kan tilsettes i konsentrasjoner på opptil 1500 nM eller til og med 3000 nM for en slik polymerasekonsentrasjon. I analyser som inneholder mer enn ett reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan hvert reagens ha en stamme med sin egen Tm og kan tilsettes i sin egen konsentrasjon slik at forskjellige reagenser fungerer i forskjellige deler av trinnene i amplifiseringsprosessen.

Dersom et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilsettes under temperatursykluser, bør det tilsettes uten at reaksjonsblandingen overføres til arbeidsområdet. Slike amplifiseringsreaksjoner omfatter symmetriske PCR-amplifiseringer, asymmetriske PCR-amplifiseringer og LATE-PCR-amplifiseringer som alle videre kan omfatte revers transkripsjon dersom RNA-mål inngår. PCR-amplifiseringer kan anvendes for fremstilling av amplifisert produkt for ethvert formål, for eksempel som et utgangsmateriale for dideoksysekvensering. PCR-amplifiseringer kan kombineres med påvirkning av amplifisert produkt i en analyse innbefattet fortrinnsvis homogene analyser som benytter merkede primere, merkede prober eller fluorescerende DNA-bindende fargestoffer så som SYBR Green eller etidiumbromid. Analysen kan være en sanntidsanalyse hvori deteksjonsavlesninger utføres under flere amplifiseringssykluser eller en sluttpunktsanalyse hvori deteksjonen utføres etter fullført amplifisering. Analysen kan være kvalitativ eller kvantitativ innbefattet, men ikke begrenset til, en kvantitativ sluttpunktsanalyse. Analysen kan være utformet for amplifisering av et enkelt dobbelttrådet eller enkelttrådet produkt eller mer enn ett dobbelttrådet produkt, uten eller med beslektede enkelttrådede produkter.

Som anvendt i den foreliggende patentsøknaden, betyr "LATE-PCR" en ikkesymmetrisk DNA-amplifisering som benytter polymerasekjedereaksjon (PCR) -prosessen ved benyttelse av en olignukleotidprimer ("overskuddsprimer") som foreligger i minst fem gangers overskudd relativt til den andre primeren (den "begrensende primer") som selv anvendes i lav konsentrasjon, opptil 200 nM, slik at den oppbrukes etter et antall PCR-sykluser som grovt sett er tilstrekkelig til å danne dobbelttrådet amplikon som kan påvises ved fluorescens hvori den konsentrasjonsjusterte smeltetemperaturen for den begrensende primeren ved amplifiseringens start, Tm[0], er høyere enn eller ikke mer enn 5°C lavere enn den konsentrasjonsjusterte smeltetemperaturen for overskuddsprimeren ved amplifiseringens start, Tm[0]<X>, fortrinnsvis 3-10°C høyere og hvori temperatursyklusene fortsetter i flere sykluser etter at den begrensende primeren er oppbrukt for dannelse av enkelttrådet produkt, nemlig forlengelsesproduktet av overskuddsprimeren. LATE-PCR-analyser kan omfatte et deteksjonstrinn ved lav temperatur, i hvilket temperaturen reduseres til under primerens hybridiseringstemperatur i i det minste noen sykluser i den lineære amplifiseringen. Et slikt trinn innføres fortrinnsvis etter forlengelsen og før trådsmeltingen.

Komplette PCR-sett, ufullstendige sett og oligonukleotidsett er også beskrevet heri. Et komplett PCR-amplifiseringsett inneholder i det minste alle reagenser for utførelse av en PCR-amplifisering eller en analyse innbefattet minst ett par av PCR-primere, dNTP'er, reaksjonsbuffer, varmestabil DNA-polymerase, fortrinnsvis polymerase med 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet og minst ett reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Et komplett for en homogen PCR-analyse omfatter videre eventuelle tilleggsreagenser for deteksjon etter behov, for eksempel et fluorescerende DNA-fargestoff eller fluorescensmerkede prober. Et komplett sett av begge typer omfatter fortrinnsvis reagenser for prøveklargjøring og kan i noen utførelser omfatte en revers transkriptase. Ufullstendige sett utelater i det minste noen bestanddeler av et komplett sett, men innbefatter i det minste den varmestabile DNA-polymerasen (og om nødvendig revers transkriptase) og minst ett reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Produkter som kommersielt betegnes "hovedblanding" eller "basalt sett" inneholder typisk ikke PCR-primere og prober. Et foretrukket ufullstendig sett omfatter alle reagenser som er nødvendige for en amplifisering eller analyse, bortsett fra prøvepreparatet. Oligonukleotidsett ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter minst ett par av PCR-primere og minst ett reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen. De kan videre omfatte oligonukleotidprober eller sekvenseringsprimere.

Detaljene vedrørende en eller flere utførelser av oppfinnelsen beskrives i de vedlagte figurer og i beskrivelsen nedenfor. Andre egenskaper, formål og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare ut fra beskrivelsen og figurene og fra kravene.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser en gelelektroforetisk analyse av prøver fra en kvalitativ rigorøs PCR-analyse for feilprimingsfeil utformet for å analysere den inhibitoriske aktiviteten av reagensene som beskrives i den foreliggende oppfinnelsen.

Figur 2 viser at reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen muliggjør PCR-baserte sanntidsanalyser og sluttpunktsanalyser.

Figur 3 viser et DNA-sekvenskromatogram erholdt fra enkelttrådede DNA-produkter fremstilt under 70 sykluser med LATE-PCR-amplifisering i fravær av feilprimingsfeil ved anvendelse av reagensene som beskrives i den foreliggende oppfinnelsen.

Figur 4 viser virkningen av forbindelse 9-3 DD på en pentapleks LATE-PCR-amplifisering.

Figur 5 viser materiale som viser at når først reagensene ifølge oppfinnelsen binder Taq-polymerase, frigjøres de ikke fra polymerasen før PCR-syklusteperaturene når denatureringstrinnet.

Figur 6 viser en direkte sammenligning av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen når det gjelder deres virkning på DNA-polymeraseaktivitet ved 25°C.

Figur 7 illustrerer en analyse for vurdering av virkningen av reagensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen på en polymerases eksonukleaseaktivitet i fravær av polymeraseaktivitet.

Figur 8 illustrerer evnen til et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen til å forhindre feilpriming i en symmetrisk PCR-analyse.

Figur 9 illustrerer en analyse for kvantifisering av eksonukleaseinhibering.

Figur 10 viser den doseavhengige virkningen av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen når det gjelder dannelse av primerdimerer og primeroligomerer i en LATE-PCR-amplifisering.

Figur 11 viser virkningen av en lav konsentrasjon av reagens 9-22 DD på dupleks LATE-PCR-amplifiseringer av to målsekvenser med to primerpar.

Figur 12 viser virkningen av å variere sammensetningen av stammen i reagens 9-3 DD på en dupleks LATE-PCR-amplifisering av to målsekvenser med to primerpar.

Figur 13 viser virkningen av å variere konsentrasjonen av reagens 9-3b DD på en dupleks LATE-PCR-amplifisering av to målsekvenser med to primerpar.

Figur 14 viser virkningen av økte konsentrasjoner av reagens 9-3 DD på aktiviteten av en LATE-PCR-amplifisering når det gjelder CT-verdier.

Figur 15 viser virkningen av økende konsentrasjoner av reagens 9-3 DD på effektiviteten av en LATE-PCR-amplifisering når det gjelder vinkelkoeffisienten for fluorescenssignalet og den endelige fluorescensen.

Figur 16 viser produkter fra en multipleksreaksjon utført med og uten en blanding av forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Figur 17 viser resultatene fra en analyse av virkningen av forbindelse 12-3DD.

Figur 18 viser resultatene fra en analyse av virkningen av forbindelse 12-C3DD.

Like referansesymboler i de forskjellige figurene angir like elementer.

DETALJERT BESKRIVELSE

Som angitt ovenfor, har vi identifisert hva vi antar å være tre forskjellige typer av og årsaker til feilprimingsfeil. For å anslå feilpriming for alle tre typer har vi utviklet den rigorøse analysen i eksempel 1 nedenfor. Amplifiseringen begynner med fragmentert DNA, noe som fremmer feilpriming. Fysisk håndtering, for eksempel å trekke DNA inn i en pipette, fører til fragmentering av DNA. Siden kun type 1-feilpriming kan forhindres ved "varmstart"-reagenser og -fremgangsmåter, har vi videre innført i analysen mange temperatursykluser (minst 60). I tillegg har vi innført et deteksjonstrinn ved lav temperatur som benyttes i noen LATE-PCR-analyser. Vi innser også at dannelse av primerdimerer og videre oligomerisering og amplifisering av disse er ytterligere en type av feilpriming. Primerdimerdannelse og -amplifisering kan opptre både i nærvær og fravær av tilsatt templat DNA og vi har også utviklet analyser for disse fenomenene.

Mens varmstartenzymer kun er effektive før amplifiseringens begynnelse grunnet irreversible endringer som opptrer etter oppvarming til høy temperatur, for eksempel 95°C, vil feilprimingsreagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen ikke denatureres irreversibelt og kan ha positive eller negative virkninger eller begge deler senere i reaksjonen dersom et trinn med lav temperatur inngår.

Man kan utforme stammer til å ha smeltetemperaturer, Tm'er, over eller under gitte syklustemperaturer med forskjellige virkninger på amplifiseringen. Ved utforming av stammer tar man fortrinnsvis i betraktning at smelting er et dynamisk fenomen som opptrer over et temperaturområde hvor Tmangir den temperatur ved hvilken 50% av molekylene foreligger i dobbelttrådet form og 50% foreligger i enkelttrådet form. Vi antar at binding av noen lukkede stammer til polymerasen forskyver likevekten blant molekyler som forblir ubundne til polymerasen i fordel av mer lukking av stammer. Dersom vi ønsker at det store flertallet av stammer skal være lukket ved en gitt syklustemperatur, for eksempel primerhybridiseringstemperaturen, starter vi generelt med en umodifisert oligonukleotidstamme med en beregnet Tmsom er minst 5°C over denne temperaturen, idet vi anser at stabiliserende stammemodifisering vil heve den faktiske Tmmed flere grader. Dersom vi omvendt ønsker at det store flertallet av stammer skal være åpne ved en gitt syklustemperatur, starter vi generelt med en umodifisert oligonukleotidstamme med en beregnet Tm som er minst 5°C under, fortrinnsvis minst tilnærmet 10°C under den gitte syklustemperaturen, igjen siden vi innser at stabiliserende stammemodifisering sannsynligvis vil heve den faktiske Tm med flere grader.

Benyttelse av et gitt reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen med forskjellige primerhybridiseringstemperaturer kan ha forskjellige virkninger på amplifiseringens effektivitet som vi viser nedenfor i eksempel 5. En av våre for tiden beregnede utførelser (forbindelse 9-22 DD) som diskuteres nedenfor, har en beregnet Tm på 81°C. Denne vil lukkes under hver typiske PCR-temperatursyklus når temperaturen reduseres fra trådsmeltingstemperaturen (for eksempel 95°C) til primerhybridiseringstemperaturen (for eksempel 55°C). Et reagens med en slik stamme vil ha en virkning i hver syklus i amplifiseringen. En annen av våre for tiden foretrukne utførelser (forbindelse 9-3 DD) har en beregnet Tmpå 56°C. Når PCR-amplifiseringsblandinger fremstilles ved romtemperatur, har dette reagenset en lukket stamme og bindes til polymerasen. Det forblir bundet når temperaturen heves ved amplifiseringens begynnelse. Polymerasebundne molekyler av 9-3DD blir ubundne og åpne i det innledende høytemperaturtrinnet og binder ikke igjen til polymerasen med mindre temperaturen reduseres i en slik grad at stammen i de ubundne molekylene lukkes. Ved å holde den laveste syklustemperaturen på 65°C vil følgelig stammen ikke gjendannes. Under disse betingelsene vil denne utførelsen fungere i amplifiseringen som et varmstartreagens for forhindring av feilpriming som skjer før amplifiseringens begynnelse. Dersom imidlertid et deteksjonstrinn ved lav temperatur inngår, for eksempel 40°C innkubering etter forlengelse i en LATE-PCR-syklus for hybridisering av en molekylfyrprobe med lav temperatur eller en annen merket probe til enkelttråden som akkumuleres i amplifiseringens lineære fase, vil sammen med den beregnede smeltetemperaturen på 56°C lukkes, noe som tillater reagenset å igjen bindes til polymerasen inntil en høy temperatur med trådsmelting oppnås.

Eksempel 1 nedenfor beskriver en rigorøs LATE-PCR-analyse som vi benytter for evaluering av yteevnen til reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Figur 1 viser at feilprimingsfeil ikke bare opptrer med "regulære" Taq-DNA-polymeraser, det vil si varmestabile DNA-polymeraser med 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet, men uten varmstartmodifisering (spor b og spor c), men også med varmstart Taqpolymeraser (spor d og e). Figur 1 viser videre elimineringen av ikke-spesifikke produkter som dannes grunnet feilprimingsfeil og nærvær av kun det ønskede spesifikke produktet som oppnås ved tilsetning av reagens 9-22 DD i en konsentrasjon på 300 nM, ikke bare til amplifiseringer med varmstartpolymeraser (spor h og spor i), men også til amplifiseringer med regulære Taq-polymeraser (spor f og spor g). Effektiviteten av forbindelsene 9-22 DD og 9-3 DD når det gjelder å undertrykke feilpriming ble anslått ved benyttelse av analysen som beskrives i eksempel 1. Begge ble funnet å undertrykke type 1-feilpriming. Den lave beregnede Tm for stammen i 9-3 DD (56°C) tillater anvendelse av dette reagenset som ganske enkelt et effektivt varmstartreagens ved å benytte en PCR-amplifiseringsfremgangsmåte hvor alle syklustemperaturer er på 60°C og høyere. Ved å holde seg over stammens smeltepunkt, vil stammen ikke gjendannes etter hvert som amplifiseringen forløper. Forbindelse 9-3 DD har ingen inhiberende virkning på polymeriseringseffektiviteten anvendt på denne måten. Eksempel 5 nedenfor er instruktivt i denne sammenheng. Her sammenlignes amplifiseringer som benytter reagens 9-3 DD og hybridiseringstemperaturer på 65°C og 55°C. Når 65°C ble benyttet, ble ingen virkning på polymeriseringseffektiviteten, gjenspeilet av CT, funnet. Når 55°C ble benyttet, var imidlertid CT forsinket. Dette viser at dersom temperaturen reduseres tilstrekkelig til at stammen lukkes og polymerase bindes, fortsetter bindingen mens temperaturen økes for primerforlengelse, selv dersom primerforlengelsestemperaturen er over Tmfor stammen. Derimot vil den høye Tmfor stammen i 9-22 DD (81°C) tillate gjendanning av stammen til en hårnål under primerhybridiseringstrinnet i hver PCR-syklus. Dette forhindrer forekomsten av ikke bare type 1-feilpriming, men også type 2-feilpriming, type 3-feilpriming og primer-dimerdannelse. Dette påvirker imidlertid i en viss grad polymeriseringseffektiviteten som vist ved en forsinkelse på 1,5 sykluser i terskelsyklusen (CT) for PCR-amplifiseringen fulgt i sanntid med SYBR Green 1 eller en målspesifikk molekylfyrprobe anvendt i en konsentrasjon på 100 nM.

Tabell I i eksempel 1 rapporterer anvendelsen av denne rigorøse analysen på en serie av tilsetningsstoffer og rapporterer videre den minimale konsentrasjonen som er nødvendig for å oppnå forebyggelse av manifestasjoner på feilpriming, det vil si unngåelse av et påvisbart nivå av ikke-spesifikke produkter dannet grunnet feilprimingsfeil og nærvær av kun det ønskede spesifikke amplifiseringsproduktet, for eksempel som vist i sporene f og g i figur 1, ved anvendelse av regulær Taqpolymerase snarere enn en varmstartversjon. I tabell I er forbindelser identifisert ut fra vært nomenklatursystem. Ikke-modifiserte hårnålsmolekyler identifiseres ut fra stammeløkkelengden. For eksempel har forbindelse 6-22 en stamme på seks nukleotider og en løkke på tjueto nukleotider. Siden løkkeidentifiseringen begynner med et tall eller kun er et tall ("22" eller "3b"), består løkken av nukleotider. Ikkenukleotidløkker er spesifisert videre. Forbindelse 12-C3C3 har en stamme som er tolv nukleotider lang og en løkke som er en sekskarbonkjede, det vil si en kjede av seks metylen (CH2) -grupper. Forskjellige modifikasjoner ble innført i en eller begge ender av de basale hårnålene. Disse er angitt ved etterstavelser, hvor 3D er en dabcylgruppe (5'-dimetoksytrityloksy-5-[(N-4'-karboksy-4-(dimetylamino)-azobenzen)aminoheksyl-3-akrylimido]-2'-deoksyuridin-3'-[(2-cyanoetyl)-(N,N-diisopropyl)]fosforamiditt) tilsatt til det 3' endenukleotidet, 5D er en dabcylgruppe addert til nukleotidet i 5'-enden, DD er dabcyl addert til begge endenukleotidene, BHQBHQ er en "Black Hole"-blokkerer addert til begge endenukleotidene, FF er en fluorofor (i dette tilfellet FAM) addert til begge endenukleotidene, AA er en adenosin (A) addert til begge endenukleotidene og TT er en tymidin (T) addert til begge endenukleotidene.

I tillegg til addisjoner ble flere modifikasjoner innført i de basale stammene.

Etterstavelsen 2'OM<4>angir at fire endenukleotider, de siste to i hvert stammeoligonukleotid eller hvert arm, ble endret fra deoksyribonukleotider til 2'-O-metylnukleotider. For å endre stammenes smeltetemperatur, endret vi G-Cinnholdet. Forbindelser i hvilke stammesekvensen, men ikke stammelengden, ble endret er betegnet med en liten bokstav foran etterstavelsen for endemodifiseringen, for eksempel 9-3b DD eller 9-3i DD. Nukleotidsekvensene, innbefattet også anvendte karbonkjedeløkker, for de forskjellige forbindelsene i tabell I er vist i tabell II: Tabell I er instruktiv på mange måter. Den viser for eksempel at i denne analysen er umodifiserte DNA-hårnålsoligonukleotider enten ikke effektive eller effektive kun i høye konsentrasjoner, 1000 nM eller høyere. Oligomer 9-22 (stamme på 9 nukleotider, løkke på 22 nukleotider) var effektiv kun i en konsentrasjon på 3000 nM, den mengde som er rapportert for undertrykkelse av feilpriming ved dodbbelttrådet DNA. Oligomerene 6-22 (stamme på 6 nukleotider og løkke på 22 nukleotider) og 9-5 (stamme på 9 nukleotider og løkke på 5 nukleotider) var ikke effektive, selv i konsentrasjoner på 3000 nM. Dersom 9-22-oligomeren ble modifisert ved addering av dabcylgrupper til begge ender av stammen for dannelse av forbindelse 9-22 DD, et foretrukket reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, var en konsentrasjon på kun 50 nM tilstrekkelig til å forhindre manifesteringer på feilpriming. Dersom 9-22-oligomeren ble modifisert på tilsvarende måte, på kun 100 nM nødvendig.

Tabell I viser virkningen av stammelengde. Mens de mange oligomerene med stammer på ni og tolv nukleotider fjernet feilpriming ved lav konsentrasjon når de var modifisert med et par av interagerende dabcylblokkere, responderte oligomer 6-22 ikke på denne måten på modifisering: Sammensetning 9-22 DD som ikke er et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen var kun effektiv i høy konsentrasjon (3000 nM). Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen har i de fleste tilfeller stammer som er lengre enn seks nukleotider og kortere enn fjorten basepar. Lengder som er kortere enn fjorten basepar foretrekkes for tiden.

Tabell I viser også effektiviteten av andre modifikasjoner som forsterker bindingsstyrken i stammens ende. Addisjon av et par av interaktive Black Hole<TM>-blokkere til stammen av oligomer 9-5 ga reagens 9-5 BHQBHQ for hvilket en konsentrasjon på 100 nM var tilstrekkelig til å fjerne ikke-spesifikke produkter dannet grunnet feilprimingsfeil og nærvær av kun det ønskede spesifikke amplifiseringsproduktet. Innføring av to 2'-O-metylribonukleotider i hver ende av oligomer 9-5 ga reagens 9-5 2'OM<4>for hvilket en konsentrasjon på kun 50 nM var nødvendig.

Tabell I viser at lengden av oligonukleotidløkken kan varieres betraktelig.

Løkkelengder på tre nukleotider (reagens 9-3 DD), fem nukleotider (reagens 9-5 DD) og tjueto nukleotider (reagens 9-22 DD) førte alle til reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen som forhindret feilpriming i konsentrasjoner på 100 nM eller lavere. Samtidig viser tabell I at en viss justering ved prøving og feiling er nødvendig for optimalisering. Dersom et par av 2'-O-metylribonukleotider innføres i stedet for dabcylblokkerne i den stabiliserende modifiseringen av oligomer 9-5 (sammenligning av reagens 9-5 2'OM<4>og reagens 9-5 DD), er graden av effektivitet uendret, det er tilstrekkelig med en konsentrasjon på kun 50 nM. Innføring av den samme endringen i den modifiserte oligomer 9-3 (sammenligning av reagens 9-3 2'OM<4>og reagens 9-3 DD) reduserte imidlertid effektivitetsnivået, selv om dette fortsatt var godt: En konsentrasjon på 300 nM var nødvendig, snarere enn en konsentrasjon på 50 nM. De samme resultatene viser at ved å øke løkkelengden i reagens 9-3 2'OM<4>med to nukleotider for dannelse av reagens 9-5 2'OM<4>økte effektiviteten: En konsentrasjon på kun 50 nM, snarere enn en konsentrasjon på 300 nM. Reagenskandidater kan rutinemessig evalueres og justeres ved hjelp av en rigorøs analyse, for eksempel analysen som beskrives i eksempel 1.

Tabell I viser også at forbindelser som består av to komplementære oligonukleotider som holdes sammen med motsatt polaritet av en ikke-nukleotid bro (løkke) også er aktive når oligonukleotidenes frie 3' og 5' ende modifiseres ifølge den foreliggende oppfinnelsen (i de analyserte utførelser med dabcylgrupper). Tabell I viser at størrelsen av en ikke-nukleotid bro ikke er avgjørende. Broene som beskrives i tabell I er kjemiske linkere som består av lineære kjeder med 3-6 karbonatomer, men mange andre varianter av ikke-nukleotidbroer (løkker) vil kunne konstrueres av fagfolk. Resultatene i tabell I tyder på at en bro med en 3-karbonatomkjede er bedre enn brom med en 6-karbonatomkjede for den samme oligonukleotidstammen (aktiv ved en lavere konsentrasjon) og selv om dette ikke er rigorøst analysert, tenker vi oss at denne forskjellen gjenspeiler broenes relative fleksibilitet og deres medfølgende virkning eller evne til å heve eller redusere stammens smeltetemperatur. Vi benytter kjemisk nøytrale linkere (uladde), noe som vi foretrekker.

Forskjellige anvendelser av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen og fremgangsmåter er eksemplifisert i eksemplene 2-4 nedenfor. Eksempel 2 beskriver benyttelse av reagens 9-22 DD i en LATE-PCR-analyse som er en sanntidsanalyse, men vises også å være egnet for en sluttpunktsanalyse. Analysen i eksempel 2 benytter en deteksjonsteknikk som er gjenstand for vår samtidig innleverte U.S. foreløpige patentsøknad nr. 60/619,654 med tittelen Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid Amplification. Denne deteksjonsteknikken omfatter tilsetning av både et fluorescerende DNA-fargestoff så som SYBR Gold som fluorescerer når det bindes til dobbelttrådet DNA og en fluoroformerket hybridiseringsprobe som er komplementær til enkelttrådet amplikon som dannes i en LATE-PCR-amplifisering etter at den begrensende primeren er oppbrukt, hvor fluoroforen stimuleres ved emisjonen fra fargestoffet, stimulering av fargestoffet, påvisning av emisjon fra både fargestoff og fluorofor og beregning av forholdet mellom fluoroforsignalet og fargestoffsignalet. Eksempel 2 viser således kompabiliteten av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen med fluorescerende prober og fluorescerende fargestoffer og effektiv forhindring av feilpriming anvendt med en eller begge av disse.

Eksempel 4 beskriver flere multipleks LATE-PCR-amplifiseringer som benytter to, tre, fire og til og med fem primerpar og viser amplifisering av de korrekte amplikoner i alle tilfeller hvor reagens 9-3 DD var tilsatt til reaksjonsblandingen. Selv om amplifiserte produkter ble analysert ved gelelektroforese for formålet i eksempel 4, er multipleksfremgangsmåten også anvendbar for multipleksanalyser innbefattet kvalitative og kvantitative analyser, for eksempel sanntidsanalyser, ved benyttelse av andre deteksjonsmidler så som fluorescerende hybridiseringsprober for de påtenkte amplikoner. For sanntids LATE-PCR-analyser foretrekker vi å benytte et deteksjonstrinn ved lav temperatur etter primerforlengelsestrinnet og lavtemperaturprober er for eksempel illustrert i eksempel 3.

Eksempel 13 viser at amplifiseringsreaksjoner med amplifiseringsreaksjonsblandinger som inneholder mer enn en versjon av reagensene ifølge den foreliggende oppfinnelsen også kan benyttes. For eksempel kan en amplifiseringsblanding inneholde både en forbindelse med høy smeltetemperatur og en annen forbindelse med lav smeltetemperatur, hver tilsatt i sin optimale konsentrasjon. Stammen i forbindelse 9-22DD med en beregnet Tmpå 81 ºC foreligger i lukket konformasjon ved reaksjonens begynnelse og kort tid etter at temperaturen reduseres i hver temperatursyklus, mens forbindelse 12-3DD med en beregnet Tm på 58 ºC kun er lukket ved relativt lave temperaturer. Denne forbindelsen virker følgelig som et "varmstart"-reagens for forhindring av feilpriming når reaksjonsblandingen fremstilles ved romtemperatur, men under de påfølgende temperatursyklusene i en PCR-amplifisering med en hybridiseringstemperatur på 60 ºC eller høyere vil forbindelsen ikke lukkes og bindes til polymerasen. Blandinger av reagenser er spesielt anvendbare for konstruksjon av multipleksreaksjoner i hvilke flere primerpar som spenner over et område av hybridiseringstemperaturer kombineres for amplifisering av flere amplikoner. Blandingen av reagenser som anvendes i eksempel 13 er bedre enn hvert enkelt reagens alene.

Eksempel 3 beskriver en LATE-PCR-amplifisering som benytter reagens 9-3 DD for fremstilling av et amplifisert enkelttrådet produkt som har en tilstrekkelig mengde og som er tilstrekkelig fritt for ikke-spesifikke produkter grunnet feilpriming til at det er egnet for anvendelse som utgangsmateriale for sekvensering. Amplifiseringen ble utvidet til sytti sykluser for å sikre tilstrekkelig utgangsmateriale. Vi har funnet at noen amplikoner er mer utsatt for type 2- og type 3-feilprimingsfeil enn andre amplikoner. I amplifiseringer hvor slik feilpriming er mer sannsynlig, foretrekker vi at stammen i reagenset ifølge den foreliggende oppfinnelsen lukkes når syklustemperaturen reduseres fra trådsmeltingstrinnet til primerhybridiseringstrinnet. Dette kan sikres ved å justere stammens Tm, hybridiseringstemperaturen eller begge. I beslektet arbeid har vi funnet at produktfortynning er en enkel rensefremgangsmåte for anvendelse med sekvensering som beskrevet i vår samtidig innleverte U.S. foreløpige patentsøknad som er identifisert ovenfor.

Vi har undersøkt virkningen og effektiviteten av utførelser av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med ikke-modifiserte hårnålsdannende DNA-oligomerer og med hverandre. Vi utformet en DNA-polymeriseringsanalyse for å bestemme forlengelsen av en merket primer ved Taq DNA-polymerase i nærvær av et analysereagens. Analysen benytter primere som er merket med fluoroforer som eksiteres ved emisjon fra et fluorescerende fargestoff som beskrevet i vår samtidig innleverte U.S. foreløpige patentsøknad som er identifisert ovenfor. Analyseblandingen omfatter en konsentrasjon på 0,5 μM av et syntetisk oligonukleotid DNA-templat, 1,5 μM av en DNA-primer som er komplementær til templatets 3' ende og merket med Cy5 i den 5' enden, PCR-buffer, MgCl2, Taq DNA-polymerase, SYBR Green fluorescerende DNA-fargestoff fortynnet 1:40000 og analysereagens. Kontrollert start av reaksjonen oppnås ved tilsetning av dNTP'er. Reaksjonen er isotermal: Den forløper ved en gitt temperatur over et gitt tidsrom. For evaluering av virkningen av analyseforbindelsen på DNA-polymerasens 5'-3'-eksonukleaseaktivitet, tilsetter vi til reaksjonsblandingen en "blokker", nemlig et oligonukleotid som er komplementært til templatets 5' ende og som er blokkert med en fosfatgruppe i den 3' enden og merket med ROX i den 5' enden. For evaluering av virkningen av analyseforbindelsen på polymeriseringsaktiviteten til DNA-polymerasen, benyttes ikke blokkeren. For å forenkle analysen av reaksjonsprodukter ved smeltekurveanalyse, er templatet, primeren og blokkeren utformet slik at følgende hybrider lett kan skilles fra hverandre ut fra smeltetempetatur: Primer-templat, blokker-templat, fullengde forlengelsesprodukttemplat og delvis forlenget produkt (opp til blokkeren)-templat. Sanntidsanalyse oppnås ved regelmessig eksitering av fargestoffet og regelmessig måling av fluorescensemisjonen fra fargestoffet og fra de to fluoroforene som begge eksiteres indirekte ved emisjonen fra fargestoffet. Økt SYBR Green I-fluorescens viser polymerisering. Redusert ROX-fluorescens viser degradering av blokkeren.

Sluttpunktsanalyse oppnås ved å stoppe reaksjonen ved tilsetning av 12 mM EDTA, justere fortynningen av SYBR Green I til 1:14200 og justere konsentrasjonen av analyseforbindelse til 800 nM; og så utføre en standard smeltekurveanalyse mens fargestoffet stimuleres og fluorescensen fra hver av de to fluoroforene måles.

Vi evaluerte forbindelsene 9-22, 9-22 DD og 9-3 DD med innkuberinger ved 55 ºC i 60 minutter. Vi innbefattet også en kontroll uten analyseforbindelse. Resultatene fra kontrollen innkubert med blokker tilstede, men uten analyseforbindelse, viser at Taq DNA-polymerase forlenget primeren gjennom blokkerområdet, om enn ikke fullstendig under disse betingelsene og ga produkt med nærmest en enkelt smeltetopp ut fra Cy5-fluorescensen. Enzymet viste følgelig både polymeriseringsaktivitet og 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. Resultatene med forbindelse 9-22 DD i en konsentrasjon på 300 nM eller 1000 nM viste dannelse av delvis forlenget produkt og en virkning på mengden av gjenværende blokker på en doseavhengig måte. Følgelig inhiberte forbindelse 9-22 DD polymerasens 5'-3'-eksonukleaseaktivitet ved 55 ºC. Det var en reduksjon i dannelsen av fullengdeprodukt, særlig ved konsentrasjon på 1000 nM, noe som antyder at forbindelse 9-22 DD i høy konsensentrasjon begynner å inhibere polymeriseringen.

En annen analyse som vi har benyttet for å undersøke egenskapene til reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet nedenfor i eksempel 6. Denne analysen viser evnen til en testanalysereagens til å inhibere forlengelse ved Taq DNA-polymerase ved 25 ºC. Resultater som rapporteres i eksempel 7 viser at de ikke-modifiserte hårnålsoligonukleotidene 9-22 og 9-3 ikke hadde noen virkning sammenlignet med kontrollen, inhiberte reagensene 9-22 DD og 9-3 DD primerforlengelsen på en doseavhengig måte. Selv ved en temperatur som er tilstrekkelig lav til at reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer polymeriseringsaktivitet ved lave konsentrasjoner, hadde således deres ikkemodifiserte analoger ikke denne egenskapen i de samme konsentrasjoner.

Vi har benyttet to analyser for å undersøke den inhiberende virkningen av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen på DNA-polymerasens 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. En analyse er beskrevet nedenfor i eksempel 7. Analysen måler inhibering av 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet under en temperatursyklus. Figur 7 viser at reagens 9-22 DD inhiberer eksonukleaseaktivitet på en doseavhengig måte i lave konsentrasjoner i området fra 50 nM til 300 nM.

Den andre analysen er beskrevet nedenfor i eksempel 9. Denne måler kvantitativt inhiberingen av 5'- til 3'-eksonukleaseaktiviteten ved 25 ºC. Figur 9 viser doseavhengig inhibering ved reagens 9-22 DD i konsentrasjoner fra 50 nM til 1000 nM.

Ytterligere en analyse som beskrives nedenfor i eksempel 6, måler reagensinhibering av primerforlengelse utført av Stoffelfragmentet av Taq DNA-polymerase. Som for intakt Taq-polymerase, krevde inhibering av forlengelsen nærvær av modifiserte ender på oligonukleotidstammene og ble ikke i signifikant grad påvirket av lengden av løkken mellom stammen. I motsetning til intakt Taqpolymerase, inhiberer imidlertid Stoffelfragmentet av forbindelse 6-22DD et reagens med en stamme på kun seks nukleotider. Vi konkluderer at Stoffelfragmentet ikke interagerer med reagenser på samme måte som intakt polymerase gjør.

Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendbare for forhindring av feilpriming til symmetriske PCR-analyser som vist nedenfor i eksempel 8. Analysen målte amplifisering av en sekvens i cystisk fibrosegenet ved anvendelse av ekvimolart primerpar med svært like Tm-verdier.

PCR-amplifiseringer og analyser som for tiden anvendes, omfatter typisk fremstilling av amplifiseringsreaksjonsblandinger ved romtemperatur, noe som krever innbefattelse av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen i den innledende blandingen for inhibering av type 1-feilpriming. Dette må imidlertid ikke være tilfelle. Visse automatiserte fremgangsmåter, for eksempel fremgangsmåter som omfatter manipulering av mikromengder av væsker, tillater tilsetning av en polymerase til en reaksjonsblanding ved forhøyet temperatur for varmstart slik at type 1-feilpriming unngås. Med slike fremgangsmåter kan reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilsettes etter amplifiseringens begynnelse.

Primer-dimerdannelse er en manifestasjon av feilpriming som kan finnes sted i komplette reaksjoner, det vil si reaksjoner som inneholder alle de bestanddeler som er nødvendige for amplifisering pluss en innledende målsekvens, så vel som i reaksjoner som ikke innholder en målsekvens. Primer-dimerer er typisk korte dobbelttrådede DNA-sekvenser dannet ved feilpriming av en eller flere primere i en reaksjon med hybridisering til og forlengelse langs enten en annen kopi av den samme enkelttrådede primer eller en annen primer som foreligger i reaksjonen. Primer-dimerdannelse i nærvær av en målsekvens observeres som en akkumulering av primer-dimerer i tillegg til akkumulering av det forventede amplikon. Primerdimerdannelse i fravær av en målsekvens, observeres som en akkumulering av primer-dimeren uten akkumulering av et spesifikt amplikon. Primer-dimerer kan også danne oligomerer som har lengre sekvens enn den basale primer-dimer siden de inneholder ytterligere, konkatenerte kopier av en eller begge primere.

Oligomeriseringsprosessen er ikke godt forstått, men kan lett påvises ved gelelektroforese eller smeltepunktanalyse av reaksjonsproduktene. Grunnet primerdimerdannelsen, reduseres mengden av det forventede amplikon dannet over et gitt antall temperatursykluser siden en eller begge primere forbrukes til dannelse og akkumulering av primer-dimerer. Eliminering av primer-dimer er følgelig ønskelig siden dette øker både spesifiteten og utbyttet av det korrekte produktet. Disse egenskapene ved primer-dimerer samt eliminering av dem ved tilsetning av reagensene som beskrives i den foreliggende oppfinnelsen, illustreres i eksempel 10.

Sannsynligheten for primer-dimerdannelse økes ved sekvenshomologi mellom en primers 3' ende og sekvenser inne i den samme primeren eller en annen primer, i tillegg til at mange andre faktorer, for eksempel økning av primerkonsentrasjonen, økt lengde av primeren, redusert hybridiseringstemperatur i temperatursyklusen og en økning av det totale antall primere som foreligger i reaksjonen. I tillegg er det velkjent innen faget at sannsynligheten for primer-dimerdannelse er mye høyere i reaksjoner som benytter ikke-varmstartpolymeraser sammenlignet med reaksjoner som benytter varmstartpolymeraser. Dette skyldes at primer-primerhybridisering og -forlengelse kun kan skje ved relativt lave temperaturer når bestanddelene i reaksjonsblandingen sammenblandes. Varmstartenzymer reduserer, men eliminerer ikke fullstendig dannelsen og akkumulering av primer-dimerer. Disse egenskapene ved primer-dimerer samt eliminering av dem ved tilsetning av reagensene som beskrives i den foreliggende oppfinnelsen, er illustrert i eksempel 11.

Dannelse av primer-dimerer kan også ha subtile virkninger på en reaksjons kinetikk og eliminering av den ved hjelp av reagensene som beskrives heri kan observeres og optimaliseres kinetisk. Eksempel 12 beskriver en LATE-PCR-amplifisering som omfatter to primerpar og hvor det dannes to enkelttrådede produkter. Den kinetiske akkumulering av disse produktene ble påvist ved hybridisering til en fluorescerende probe og vises i figur 13 og figur 14. Resultatene viser at lineariteten av kinetikken påvirkes av både den nøyaktige sammensetning av stammen i reagenset grunnet dennes virkning på smeltetemperaturen og av konsentrasjonen av reagenset. Videre kan optimal og suboptimal anvendelse av reagenser endre hastigheten av den lineære amplifisering i en LATE-PCR og følgelig størrelsen av signalet ved avsluttet reaksjon, uten å påvirke reaksjonens CT-verdi. Figur 15 og figur 16 viser at amplifiseringseffektiviteten var den samme, vurdert ut fra CT-verdier over et område av utgangskonsentrasjoner av templat når forbindelse 9-3DD ble anvendt i en konsentrasjon på 150 og 300 nM, mens størrelsen av signalene fra et utgangstall av templater på 100 og 1000 i nærvær av 300 nM 9-3DD var høyere enn signalene erholdt ved anvendelse av 150 nM 9-3DD, trolig grunnet fravær av primerdimerdannelse.

EKSEMPLER

Eksempel 1. Rigorøs analyse for vurdering av feilprimingsfeil

For å anslå type 1-, type 2- og type 3-feilpriming i PCR-amplifiseringsreaksjoner, utførte vi en LATE-PCR-amplifisering som benytter fragmenter genomisk DNA og undersøker produktene ved smeltepunktsanalyse og gelelektroforese. En spesiell amplifisering som vi har anvendt, er følgende:

A. Substrat: 10-10000 genomekvivalenter av fragmentert genomisk DNA. Dette DNA ble erholdt kommersielt og behandlet ved flere gangers frysing og tining av genomisk DNA eller ved hvilken som helst annen tilsvarende fremgangsmåte som er kjent innen faget for fragmentering av DNA.

B. PCR-amplifiseringsblanding, basal (se Sanchez et al. (1994) PNAS 101: 1933-1938):

Substrat: 2000 genomer av fragmentert genomisk DNA

1X PCR-buffer

Mg<+2>: 3 millimolar (mM)

dNTP: 250 mikromolar ( μM) konsentrasjon av hvert av de fire dNTP'er Overskuddsprimer: Sekvens 5' CTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEKV.ID. NR. 13) i en konsentrasjon på 1000 nanomolar (nM) Begrensende primer: Sekvens 5' CCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEKV.ID. NR. 14) i en konsentrasjon på 50 nM

DNA-polymerase: 1,25 enheter pr 25 mikroliter ( μl) reaksjonsblanding.

C. Amplifiseringsfremgangsmåte:

Innkubering ved lav temperatur: 35 minutter ved romtemperatur.

PCR-amplifiseringsfremgangsmåte: Behandling ved høy temperatur ved 95 ºC i 15 minutter, 10 sykluser bestående av 95 ºC i 10 sekunder, 55 ºC i 30 sekunder og 70 ºC i 30 sekunder, fulgt av 70 sykluser bestående av 95 ºC i 10 sekunder, 50 ºC i 30 sekunder og 70 ºC i 30 sekunder.

Et basalnivå for feilpriming ble etablert ved amplifiseringer som benytter to varmestabile DNA-polymeraser, Promega Taq og Invitrogen Taq, uten anvendelse av noen form for varmstartmetodologi. Ytterligere amplifiseringer ble utført ved benyttelse av to forskjellige kommersielle varmstart-DNA-polymeraser, Qiagen Hot Star Taq og Platinum Taq (Invitrogen). Endelig ble ytterligere amplifiseringer utført med tilsetning av 300 nM av en for tiden foretrukket utførelse av et reagens ifølge oppfinnelsen. En utførelse som anvendes i dette eksempelet er et reagens som vi betegner preparat 9-22 DD (i vår nomenklatur er "9" stammelengden, "22" er løkkelengden og "DD" angir den stabiliserende modifisering, i dette tilfellet et par av dabcylblokkere). Forbindelse 9-22 DD har en beregnet Tmpå 81 ºC. Forbindelsen har sekvensen som er vist i tabell II, modifisert ved addering av dabcylgrupper i 5'-enden og 3'-enden.

Gelelektroforeseresultater for de forskjellige amplifiseringene med farging med etidiumbromid vises i figur 1 som omfatter størrelsesmarkører (100 basepar forskjeller) i de umerkede sporene på sidene. Det ble analysert prøver i duplikat slik at det er to spor for produktet fra hver LATE-PCR-amplifisering. Sporene a, et basaltilfelle i hvilket DNA ble utelatt; sporene b, et basaltilfelle i hvilket DNA-polymerasen var Promega Taq; sporene c, et basaltilfelle i hvilket DNA-polymerasen var Invitrogen Taq; sporene d, innføring av varmstartenzymet Qiagen Hot Star Taq; sporene e, innføring av varmstartenzymet Platinum Taq; sporene f, amplifisering ved benyttelse av Promega Taq-polymerase og tilsetning av forbindelse 9-22 DD; sporene g, amplifisering ved benyttelse av Invitrogen Taqpolymerase og forbindelse 9-22 DD; sporene h, amplifisering ved benyttelse av Qiagen Hot Star Taq DNA-polymerase og forbindelse 9-22 DD; sporene i, amplifisering ved benyttelse av Platinum Taq-polymerase og forbindelse 9-22 DD.

Fra figur 1 kan det ses at regulære Taq DNA-polymeraser som har både polymeriseringsaktivitet og 5'-3'-eksonukleaseaktivitet (sporene b og sporene c) ga et område av produktstørrelser av hvilke nesten ingen var det ønskede amplikon, definert ut fra primerparet, som er produktet som ses i sporene f-i. Bytte til

5 modifiserte "varmstart"-polymeraser (sporene d-e) hjalp, men eliminerte fortsatt ikke uspesifikke produkter dannet grunnet feilprimingsfeil. Når forbindelse 9-22 DD forelå i en konsentrasjon på 300 nM, ble imidlertid det ønskede amplikon erholdt uten uspesifikke produkter dannet grunnet feilprimingsfeil, både når enzymet var en regulær Taq DNA-polymerase (sporene f-g) og når enzymet var en 0 varmstart Taq DNA-polymerase (sporene h-i).

Ved anvendelse av den rigorøse analysen i dette eksempelet, har vi sammenlignet en rekke ikke-modifiserte og modifiserte DNA-hårnålsmolekyler uten endestabilisering; med destabilisering av endene erholdt ved å innføre identiske nukleotider i enden av hver arm; med endestabilisering ifølge den foreliggende 5 oppfinnelsen; og med ikke-stabiliserende adderinger til endene. For å gjøre sammenligningen kvantitativ, utførte vi doseresponsanalyser ved anvendelse av analysen for hver forbindelse som viste feilprimingsundertrykkende aktivitet for å bestemme den minimale konsentrasjonen som var nødvendig for å fjerne uspesifikke produkter dannet grunnet feilprimingsfeil og nærvær av kun det ønskede 0 spesifikke produktet, erholdt som vist i figur 1 med regulær Taq DNA-polymerase.

Resultatene er vist i tabell I som omfatter den beregnede Tm for stammen i hvert av de analyserte reagensene. Sekvensene til de forskjellige forbindelsene som beskrives i tabell I gis i tabell II.

Tabell I

Tabell II

I tabell I sammenlignes flere DNA-hårnåler, med og uten modifikasjoner, og tabellen identifiserer flere endestabiliserte hårnålsmolekyler som er reagenser (rent amplikon uten feilprimingsprodukter ved en konsentrasjon på mindre enn 1000 nM) eller som er foretrukne reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen (rent amplikon uten feilprimingsprodukter ved en konsentrasjon som ikke er høyere enn 650 nM). De ikke-modifiserte hårnålene er identifisert med to numre hvor det første er stammelengden og det andre er løkkelengden. Forbindelser som foreligger i tabell I har flere stabiliserende modifiseringer: En 5'-dabcylblokker og en 3'-dabcylblokker kovalent bundet til endenukleotidene ved hjelp av en kommersiell linker (angitt med etterstavelsen "DD"), en 3' Black Hole<TM>-blokker og en 5' Black Hole<TM>-blokker tilkoblet på tilsvarende måte (angitt med etterstavelsen "BHQBHQ") og to 3'2'-O-metylribonukleotider og to 5'2'-O-metylribonukleotider som erstatning for deoksyribonukleotider i enden av stammen (betegnet med "2'OM<4>"). Destabiliserende modifiseringer av stammeendene omfattet innføring av et par av A'er eller T'er i molekylets 3' og 5' ender. Innføring av et par av FAM-fluoroforer som antas ikke å interagere med hverandre på en stammestabiliserende måte, var destabiliserende og likeså innføring av en enkelt 5'-dabcylgruppe.

Innføring av en enkelt 3'-dabcylgruppe stabiliserte imidlertid 9-22-hårnålen i en viss grad, vist ved en reduksjon av den nødvendige konsentrasjonen. Hårnål 9-22 undertrykte feilpriming kun i høy konsentrasjon (3000 nM), men 9-22 DD gjorde dette ved lav konsentrasjon (50 nM).

En annen av våre for tiden foretrukne hårnåler, forbindelse 9-3, undertrykte feilpriming kun i høy konsentrasjon (1000 nM), mens 9-3 DD og 9-32'OM<4>gjorde dette ved mye lavere konsentrasjon (100-300 nM). Ytterligere en utførelse, 9-5 DD, 9-5 BHQBHQ og 9-52'OM<4>gjorde dette også i lave konsentrasjoner (50-100 nM). Oligonukleotid 9-5 har den samme stamme som oligonukleotid 9-22, men en korte løkke hvis nukleotider er A'er og T'er. Den beregnede Tmfor stammen i oligonukleotid 9-5 er 93 ºC, rundt 12 ºC høyere enn den beregnede Tm for stammen i oligonukleotid 9-22, grunnet virkningen av løkkene.

Tilsvarende resultater ble erholdt med en enda lengre stamme. Forbindelse 12-3 undertrykte ikke feilpriming, men forbindelse 12-3DD var effektiv i en konsentrasjon på kun 50 nM.

Tabell I viser at stabiliserte stammer kan modifiseres slik at den beregnede smeltetemperaturen (Tm) for stammen endres. For eksempel var forbindelse 9-3dD, Tm 56 ºC effektiv i en konsentrasjon på 100 nM. Ved å endre stammens G-C-innhold, fremstilte vi forbindelsene 9-3bDD (Tm 62 ºC) og 9-3iDD (Tm 68 ºC). Begge disse var også effektive i en konsentrasjon på 100 nM. Forbindelse 12-3DD, Tm 58 ºC, var effektiv i en konsentrasjon på 50 nM. Forbindelser med endrede stammer, nemlig forbindelse 12-3bDD, Tm 63 ºC, og forbindelse 12-3cDD, Tm 68 ºC, var effektive i en konsentrasjon på 100 nM, fortsatt svært godt.

Eksempel 2. LATE-PCR sluttpunktsanalyse

Stokastisk variasjon i reaksjonskinetikken blant prøver i replikat fører til spredning av signaler fra hybridiseringsprober og gjør sluttpunktsanalysen vanskelig. LATE-PCR reduserer i signifikant grad dette problemet. Benyttelse av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen forbedrer ytterligere evnen til å benytte sluttpunktsdeteksjon. Figur 2 viser resultater erholdt ved amplifisering av et amplikon som omfatter G269-allelet av heksosaminidase A-genet som er ansvarlig for Tay Sachs sykdom. Reaksjonsblandingen inneholdt 0,6 μM hybridiseringsprobe og enten 1000 genomer homozygot villtype DNA-mål (+/+) eller heterozygot DNA-mål (G269/+). Prøver i replikat av hver type ble amplifisert som følger: 1x PCR-buffer, 3 mM MgCl2, 250 μM av hvert dNTP, 25 nM begrensende primer med sekvensen 5' CGAGGTCATTGAATACGCACGGCTCC 3' (SEKV.ID. NR. 15), 1000 nM overskuddsprimer med sekvensen 5' TAACAAGCAGAGTCCCTCTGGT 3' (SEKV.ID. NR. 16), 1,25 enheter platinum (varmstart) Taq-polymerase, 0,6 μM Cy5-merket hybridiseringsprobe med sekvensen 5' Cy5-GGGACCAGGTAAGAA-fosfat 3' (SEKV.ID. NR. 17) og SYBR Gold I fortynnet 1:40000 i nærvær eller fravær av 100 nM av utførelse 9-22 DD i reaksjonsblandinger på 25 μl. PCR-syklusparameterne var 95ºC i 3 minutter; 25 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 20 sekunder og 72ºC i 20 sekunder; og 30 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 20 sekunder, 72ºC i 20 sekunder, 55ºC i 20 sekunder og 45ºC i 20 sekunder med oppsamling av fluorescens ved 72°C for SYBR Gold og oppsamling av fluorescens ved 55ºC og 45ºC for Cy5. For korreksjon for variasjoner fra rør til rør i reaksjonskinetikken, ble hybridiseringssignalene normalisert ut fra forholdet mellom Cy5-signaler ved 55ºC og SYBR Gold-signaler ved 72 ºC. En følge av slik normalisering er at eventuelle forsinkelser i CTmaskeres.

Figur 2, linjer identifisert med sirkel 21 og piler identifisert med sirkel 22, viser resultatene flere replikater uten tilsetning av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, men med varmstart polymerase. Homozygote replikater (sirkel 21) og heterozygote replikater (sirkel 22) kan skilles fra hverandre ut fra vinkelkoeffisienten for de lineære kurvene. Spredning blant replikater og feilprimingsfeil i disse prøvene, vist ved fallet i signalet i hybridiseringsproben ("krokeffekten") etter omtrent 40 sykluser, vanskeliggjør sluttpunktsidentifisering av disse prøvene. Figur 2, linjer identifisert ved sirklene 23-24, viser resultatene med tilsetning av reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, nemlig 100 nM 9-22 DD. Under disse betingelsene opptrer ikke feilprimingsfeil, lineær kinetikk bevares i løpet av analysen, spredningen reduseres, krokvirkningen unngås og sluttpunktsidentifisering av homozygote og heterozygote prøver er mulig etter 50 sykluser.

Eksempel 3. Klargjøring av DNA-prøver for dideoksysekvensering

LATE-PCR er en ikke-symmetrisk amplifiseringsfremgangsmåte som har evnen til å danne store mengder av enkelttrådet DNA som er egnet for DNA-sekvensering dersom amplifiseringsreaksjonen utføres over 60 eller flere temperatursykluser. Et slikt stort antall amplifiseringssykluser fremmer imidlertid forekomsten av feilprimingsprodukter, antatt å omfate dannelse av type 2- og type 3-feilprimingsfeil som viser seg ved akkumulering av påvisbare uspesifikke produkter som til syvende og sist blir de dominerende produktene i reaksjonen. Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen tillater syntese av store mengder av enkelttrådet DNA som er egnet for DNA-sekvensering i fravær av uspesifikke produkter ved anvendelse av 70 sykluser eller mer i LATE-PCR-amplifisering. Prøver som var egnet for dideoksysekvensering ved kapillærgelelektroforese ble fremstilt som følger. LATE-PCR-reaksjonsblandingen ble først satt opp i 25 μl inneholdende 1X PCR-buffer, 3 mM MgCl2, 1000 nM overskuddsprimer med sekvensen 5' GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3' (SEKV.ID. NR.18, 25 nM begrensende primer med sekvensen 5' CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3' (SEKV.ID. NR.

19), 1,25 enheter Platinum Taq-polymerase, 600 nM reagens 9-3 DD og 250 μM av hvert dNTP. Forbindelse 9-3 DD har en dabcylblokker addert til hvert endenukleotid i oligonukleotid 9-3. Amplifiseringen ble utført ved 95°C i 3 minutter; 10 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 20 sekunder og 72ºC i 20 sekunder; og 60 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 20 sekunder, 72ºC i 20 sekunder og 45ºC i 20 sekunder. Reaksjoner i parallell ble utført med enten SYBR Green fortynnet 1:40000 eller 2,4 μM molekylærfyrprobe med lav Tm og sekvensen 5' FAM-CGTGCGCTCTGGTAAGGGTTTGCACG-dabcyl 3' (SEKV.ID. NR. 20) for måling av syntesen av dobbelttrådet og enkelttrådet DNA separat. Hver prøve inneholdt 6 ng (tilnærmet 1000 genomer) humant DNA. Videre ble det kjørt en kontroll uten tilsetning av forbindelse 9-3 DD.

Resultatene fra amplifiseringsreaksjonene var kontrollen med varmstart Taq DNA-polymerase men uten forbindelse 9-3 DD, viste signifikant feilpriming, vist ved en sekundær økning av SYBR Greensignalet i amplifiseringens senere stadier, etter at den begrensende primeren er oppbrukt. Siden produktet var en slik blanding, var det ikke mulig å sekvensere kontrollen. Resultatene fra amplifiseringen med forbindelse 9-3 DD viste derimot nærvær av kun det ønskede spesifikke produktet uten en forsinket økning av SYBR Greensignalet gjennom 70 sykluser. Ut fra konsentrasjonen av den begrensende primeren og en antatt effektivitet for den lineære amplifiseringen på 50%, beregnet vi at reaksjonen ga 250 fmol/ μl rent produkt. Dette produktet ble levert til deoksysekvenseringsenheten ved Brandeis University for sekvensering.

Sekvenseringsreaksjonen ble utført ved anvendelse av en standard fremgangsmåte og likeså kapillærelektroforesen ved benyttelse av et Beckman CEQ 2000 DNA sekvenseringsinstrument. Sekvenseringsreaksjonen ble utført med et 1/5 uttak av det amplifiserte produktet, det vil si med kun 50 fmol produkt. Den instrumentfremstilte sekvensen vises i figur 3 som viser sekvensen langs den øvre delen av figuren, de rene utvetydige produkttoppene som sekvensen ble utledet fra og nederst et svært lavt nivå av bakgrunnssignal. Vi bekreftet korrektheten av den instrumentfremstilte sekvensen ved å sammenligne den med den kjente sekvensen av amplikonet, tilgjengelig fra GenBank aksesjonsbetegnelse NT 010235.

Eksempel 4. Multipleks PCR-amplifisering

Undertrykkelse av feilprimingsfeil er spesielt viktig i multipleksreaksjoner hvor flere produkter amplifiseres samtidig. Nærvær av flere primerpar og amplifiseringsprodukter øker sannsynligheten for feilprimingsinteraksjoner mellom og blant disse reaktive molekylene. Multipleksreaksjoner bestående av et økende antall amplikoner ble utført i fravær eller nærvær av forbindelse 9-3 DD. LATE-PCR-reaksjoner i et volum på 25 μl bestående av prøve, 1X PCR-buffer, 3 mM MgCl2, 100 μM av hvert dNTP, 1000 nM overskuddsprimer, 50 nM begrensende primer og 1,25 enheter ikke-varmstart Promega Taq-polymerase ble satt opp i fravær eller nærvær av 300 nM reagens 9-3 DD for forskjellige kombinasjoner av primerpar som angitt nedenfor. Prøvene ble amplifisert ved anvendelse av en temperatursyklusprofil som besto av 95ºC i 3 minutter; 10 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 30 sekunder og 70ºC i 30 sekunder; og 40 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 50ºC i 30 sekunder og 70ºC i 30 sekunder. Etter avsluttet reaksjon ble prøvene analysert ved gelelektroforese i en 3,5% agarosegel i 0,5 x TBE. De påtenkte amplikoner og primerpar som ble analysert var som følger.

Reaksjon A: To områder, TSD 1278 TSD 1421 fra Hex-A-genet som er forbundet med Tay Sachs sykdom.

TSD 1278 overskuddsprimer: 5' GCCAGGGGTTCCACTACGTAGA 3' (SEKV.ID. NR. 21)

TSD 1278 begrensende primer: 5' CCGCCCTTCTCTCTGCCCCCTGGT 3' (SEKV.ID. NR. 22)

TSD 1421 overskuddsprimer: 5' CCGGGTCTCTAAGGGAGAACTCCT 3' (SEKV.ID. NR. 23)

TSD 1421 begrensende primer: 5' CCGGCCGACAACACAAACCTGGTCC 3' (SEKV.ID. NR. 24)

Reaksjon B: TSD 1278-amplikon, TSD 1421-amplikon og et område fra CFTR-genet, CF-ekson 10 amplikonet.

Denne reaksjonen inneholdt de samme primerpar som reaksjon A pluss

CF ex10 overskuddsprimer: 5' GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEKV.ID. NR. 25)

CF ex 10 begrensende primer: 5' CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEKV.ID. NR. 26)

Reaksjon C: TSD 1278-amplikon, TSD 1421-amplikon, CF-ekson 10-amplikon og et annet område fra CFTR-genet, CF-ekson 11-amplikonet.

Denne reaksjonen inneholdt de samme primerpar som reaksjon B pluss

CF ex 11 overskuddsprimer: 5' TCGAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3' (SEKV.ID. NR. 27)

CF ex 11 begrensende primer: 5' TGACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3' (SEKV.ID. NR.28)

Reaksjon D: TSD 1278-amplikon, TSD 142 1-amplikon, CF-ekson 10-amplikon, CF ex 11-amplikon og et område fra det humane betaglobingenet.

Denne reaksjonen inneholdt de samme primerpar som reaksjon C pluss

Betaglobin overskuddsprimer: 5' TGGGTTTCTGATACGCACTGACTCTCTC 3' (SEKV.ID. NR. 29)

Betaglobin begrensende primer: 5' GGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACT 3' (SEKV.ID. NR. 30)

Elektroforesegelene ble farget med etidiumbromid for påvisning av dobbelttrådede produkter dannet under den eksponentielle fasen av LATE-PCR-reaksjonen. Figur 4 viser relevante deler av geler av produkter fra multipleksreaksjonene A til D. Piler viser spesifikke dobbelttrådede amplifiseringsprodukter, unummererte bånd tilsvarer spesifikke enkelttrådede DNA-produkter med sekundær struktur og stjerner angir uspesifikke produkter. Gelparene A-D tilsvarer reaksjonene A-D. Hver gel merket "+" er produkt fra amplifisering som omfatter forbindelse 9-3 DD. Hver gel merket "-" er produkt fra amplifisering uten forbindelse 9-3 DD.

Gelpar A viser at område TSD 1278 (pil 41) i fravær av 9-3 DD-forbindelsen ikke ble amplifisert, mens område TSD 1421 (pil 42) ble amplifisert sammen med et stort antall uspesifikke produkter, hovedsakelig eller fullt ut dobbelttrådede som foreligger i gelen som en smørje. Tilsetning av forbindelse 9-3 DD reduserte bakgrunnen av uspesifikke produkter og tillot amplifisering av både TSD 1278 (pil 41) og TSD 1421 (pil 42), amplifisert mer rent, noe som viser at flere manifestasjoner av feilpriming ble forhindret.

Gelpar B viser at i fravær av forbindelse 9-3 DD ble områdene TSD 1278, TSD 1421 og CF-ekson 10 (pil 43) amplifisert sammen med et stort antall uspesifikke produkter som foreligger i gelen som en smørje. Tilsetning av forbindelse 9-3 DD fjernet bakgrunnen av uspesifikke produkter og alle de tre forventede amplikonene ble erholdt.

Gelpar C viser at i fravær av forbindelse 9-3 DD ble områdene TSD 1278, TSD 1421, CF-ekson 10 og CF-ekson 11 (pil 44) amplifisert sammen med et uspesifikt produkt vist med en stjerne. Tilsetning av forbindelse 9-3 DD eliminerte syntesen av det uspesifikke produktet og alle fire forventede amplikoner ble erholdt.

Gelpar D viser at i fravær av forbindelse 9-3 DD ble det utvalgte området fra betaglobingenet (pil 45) ikke amplifisert, mens TSD 1278, TSD 1421, CF-ekson 10 og CF-ekson 11 ble amplifisert sammen med et uspesifikt produkt angitt med en stjerne. Tilsetning av forbindelse 9-3 DD eliminerte syntesen av det uspesifikke produktet og tillot amplifisering av alle de fem forventede amplikonene.

Vi har også demonstrert anvendelsen av en forbindelse ifølge den foreliggende oppfinnelsen i multipleksamplifiserings- og deteksjonsreaksjoner hvor kun ett mål foreligger i en gitt analyseprøve, noe som kan skje dersom man for eksempel søker etter en infeksiøs patogen organisme. I et slikt tilfelle foreligger flere primerpar (vi benyttet flere par av overskuddsprimere og begrensende primere for LATE-PCR-amplifiseringer), men kun ett primerpar vil være aktivt for en gitt prøve. Som vist ved SYBR Green-fluorescensen og elektroforetisk analyse etter amplifiseringen, er dette faktisk hva som skjedde, noe som viser at forbindelser ifølge den foreliggende oppfinnelsen effektivt inhiberer feilpriming i multipleksreaksjoner når færre enn alle substrater foreligger.

Eksempel 5. Sammenheng mellom Tmfor stammen og hybridiseringstemperatur

To forskjellige LATE-PCR-amplifiseringsfremgangsmåter ble sammenlignet ved benyttelse av den samme amplifiseringsblandingen innbefattet målsekvensen. Hver amplifisering ble utført både med 600 nM forbindelse 9-3 DD og uten forbindelse 9-3 DD. Som angitt tidligere, er Tmfor stammen i forbindelse 9-3 DD (det vil si den beregnede smeltetemperaturen for det umodifiserte oligonukleotid 9-3) 56 ºC.

Varmstart Platinum Taq DNA-polymerase ble anvendt. De to amplifiseringene skilte seg hovedsakelig fra hverandre når det gjaldt hybridiseringstemperaturen for den benyttede primeren, enten 65 ºC (over Tmfor stammen) eller 55 ºC (under Tmfor stammen). Amplifiseringssyklusparameterne var:

Profil A: 95ºC i 3 minutter; ti sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 65ºC i 20 sekunder og 72ºC i 20 sekunder; seksti sykluser bestående av 95ºC i 15 sekunder, 55ºC i 20 sekunder, 72ºC i 20 sekunder og 50ºC i 20 sekunder.

Profil B: Den samme som profil A, bortsett fra at de siste seksti syklusene var 95 ºC i 10 sekunder, 65 ºC i 20 sekunder, 72 ºC i 20 sekunder og 45 ºC i 20 sekunder.

Amplifiseringsreaksjonene ble fulgt i sanntid ved anvendelse av det fluorescerende fargestoffet SYBR Green I for å følge syntesen av dobbelttrådet produkt som plater ut i en LATE-PCR-reaksjon etter at den begrensende primeren er oppbrukt, med mindre feilpriming fører til en variasjon i den siste delen av en amplifisering.

Avlesningene ble utført under deteksjonstrinnet ved lav temperatur.

Resultatene vises i figur 5. Felt A viser fluorescensavlesningene fra prøver i replikat for profil A hvor hybridiseringstemperaturen på 55 ºC ble benyttet etter ti forlengelsessykluser, både med (sirkel 52) og uten (sirkel 51) innbefattelse av forbindelse 9-3 DD. Felt B viser fluorescensavlesningene fra prøver i replikat for profil B hvor hybridiseringstemperaturen på 65 ºC ble anvendt etter ti sykluser med forlengelse, både med (sirkel 54) og uten (sirkel 53) innbefattelse av forbindelse 9-3 DD.

Figur 5 viser at dersom en primerhybridiseringstemperatur under Tm for stammen i reagenset ifølge den foreliggende oppfinnelsen ble anvendt (felt A), ble en forsinkelse på flere sykluser i terskelsyklusen, CT, observert. Dersom primerhybridiseringstemperaturen ble holdt signifikant over Tmfor stammen gjennom den eksponensielle PCR-fasen (felt B), ble imidlertid liten, om noen, forsinkelse av CT observert. Det ble bemerket at for det spesielle amplikon som ble benyttet i denne amplifiseringen, ble ingen type 2/type 3-feilpriming observert med eller uten forbindelse 9-3 DD når varmstart Taq ble anvendt, noe som viser hvor uforutsigbar forekomsten av slike feilprimingsfeil er. Dette eksempelet viser at stammen i reagens 9-3 DD lukkes når temperaturen i reaksjonen faller til 55 ºC og at reagenset for blir bundet til polymerasen under forlengelsestrinnet ved høyere temperatur i reaksjonen.

Eksempel 6. Virkning på DNA-polymeraseaktivitet ved 25 ºC

En serie av primerforlengelseseksperimenter ble utført ved 25 ºC for evaluering av virkningen av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen og deres umodifiserte oligonukleotidanaloger. Hver reaksjonsblanding inneholdt et templat, en primer og Taq DNA-polymerase. Reaksjonen ble i alle tilfeller utført i to timer. Primeren var fluorescensmerket med Cy5. Det fluorescerende fargestoffet SYBR Green ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter forlengelsesreaksjonene ble smeltekurver fremstilt, i hvilke fargestoffet ble stimulert og fluoroforemisjonen grunnet FRET-overføring fra fargestoffet ble avlest, som beskrevet i vår samtidig innleverte U.S. foreløpige patentsøknad med tittelen "Primers, Probes and Methods for Nucleic Acid amplification". Resultatene vises i figur 6.

Figur 6, felt A, omfatter smeltekurve 61, erholdt når forlengelse ble forhindret ved å utelate dNTP'er fra reaksjonsblandingen. Kurve 61 er følgelig smeltekurven for primer-målhybridet som viser en Tm på 58 ºC. Felt A omfatter også flere kontroller som inneholdt dNTP'er, enten alene eller med umodifisert oligonukleotid 9-3 (300 nM, 1000 nM) eller 9-22 (50 nM, 100 nM, 300 nM). Kurver identifisert med sirkel 62 for kontrollene viser forlengelse i alle tilfeller, det vil si at primersmeltetoppen ved 58ºC forsvant. Figur 6, felt B, viser en doseavhengig virkning av å innbefatte reagens 9-22 DD i reaksjonsblandingen: Kurve 63, 50 nM; kurve 64, 100 nM; kurve 65, 300 nM. Jo større toppen ved 58ºC er, jo større er virkningen når det gjelder å forhindre forlengelse ved polymerisering under de isotermale analysebetingelsene. Figur 6, felt C, viser en doseavhengig virkning av å innbefatte reagens 9-3 DD i reaksjonsblandingen: Kurve 66, 300 nM; kurve 67, 1000 nM. Igjen er det slik at jo større toppen ved 58 ºC er, jo større er virkningen når det gjelder å forhindre forlengelse ved polymerisering eller analysebetingelsene.

Vi undersøkte også virkningen på Stoffelfragmentet (Lawyer et al. (1993) PCR Methods and Applications 2: 275-287), en DNA-polymerase som mangler 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. Vi sammenlignet forskjellige forbindelser som er opplistet i tabell 1 med en negativ kontroll som kun inneholdt templat, fluorescensmerket primer, Stoffelfragmentet og dNTP. I denne serien ble forlengelsen utført ved 42 ºC og SYBR Green-avlesninger ble utført hvert 20. sekund i mer enn 30 minutter.

Kurvene ble sammenlignet med øyet, noe som var pålitelig siden den erholdte kurven enten fulgte kontrollkurven nesten nøyaktig eller avvek i markant grad fra kontrollkurven. Analyseforbindelser ble tilsatt i konsentrasjoner på 50 nM, 100 nM og 300 nM. De umodifiserte hårnålene 6-22, 9-3, 9-5 og 9-22 undertrykte ikke forlengelsen ved Stoffelfragmentet i noen konsentrasjon. Forbindelse 6-22DD undertrykte forlengelsen ved alle de tre konsentrasjonene og likeså forbindelsene 9-3DD, 9-5DD og 9-22DD. Følgende forbindelser undertrykte ikke forlengelsen ved en konsentrasjon på 50 nM eller 100 nM, men undertrykte forlengelsen ved en konsentrasjon på 300 nM: 9-22-5D, 9-22-3D, 9-5 2'OM<4>, 9-5BHBHQ og 9-32'OM<4>.

Eksempel 7. Virkning på Taq eksonukleaseaktivitet i fravær av polymeraseaktivitet

Vi har oppdaget en analyse som viser inhibering av 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet i fravær av DNA-syntese. Analysen benytter som et substrat et spesifikt dobbelttrådet DNA-molekyl hvori en tråd er merket med en FAM-fluorofor i den 5' enden og den andre tråden er merket i den 3' enden med en dabcylblokker. Fluoroforen ligger nær opptil blokkereren og fluorescens opptrer ikke når fluoroforen stimuleres.

Tråddenaturering og hybridisering etter oppvarming og avkjøling fører til kløyving av den FAM-merkede tråden og frigjøring av fluorofor. Vi antar at temperatursykluser på en eller annen måte danner et substrat for Taq-polymerasen 5'- til 3'-eksonukleaseaktivitet. Fluorescensøkning gir følgelig et mål for 5'- til 3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq-polymerase.

Reaksjonsblandingen på 25 μl inneholder 300 nM dobbelttrådet DNA-templat i 1X PCR-buffer, 3 mM MgCl2, 1,25 enheter (U) Taq-polymerase og nærvær eller fravær av en egnet konsentrasjon av forbindelse 9-22 DD. Reaksjonsblandingene inneholder ikke dNTP eller noe annet nukleinsyremål enn det dobbelttrådede DNA. Sekvensene til de komplementære trådene i det dobbelttrådede DNA-templatet er 5' FAM-AGTGTGATGATGGTGAGG-fosfat 3' (SEKV.ID. NR. 31) og 5'-5 ACTTTCAACTCTGTCT 3'-dabcyl (SEKV.ID. NR. 32). Prøvene denatureres ved 95°C i 3 minutter og behandles så ved temperatursykluser omfattende 95°C i 10 sekunder, 67°C i 30 sekunder, 72°C i 30 sekunder og 45°C i 20 sekunder.

Fluorescensen måles under hver syklus ved 45 ºC.

Fluorescensavlesninger fra anvendelse av analysen på flere prøver gis i figur 7, hvori avlesningene er normalisert slik at de begynner med den samme bakgrunnsfluorescens. Kurve 76 er en kontroll som viser fluorescensen uten nærvær av Taq-polymerase. Taq-polymerase inngikk i de gjenværende prøvene. Kurve 71 viser fluorescensøkningen som oppnås når reagens 9-22 DD ikke var tilsatt.

Fluorescensen økte gradvis over tretti sykluser. Kurvene 72-75 viser fluorescensøkningen med reagens 9-22 DD innbefatter i konsentrasjoner på henholdsvis 50 nM, 100 nM, 200 nM og 300 nM. Tilsetning av forbindelse 9-22 DD til reaksjonen ovenfor reduserte den observerte fluorescensøkningen på en doseavhengig måte.

Eksempel 8. Symmetrisk PCR-amplifisering

Vi utførte en sanntids PCR-amplifiseringsanalyse ved benyttelse av fragmentert genomisk DNA og et par av primere med tilsvarende Tm i ekvimolar konsentrasjon. Vi utførte analyser i replikat uten og med tilsetning av 400 nM reagens 9-3 DD. Virkningene av reagenser ble evaluert når det gjelder kinetikken for akkumulering av totalt DNA ved farging med SYBR Green så vel som ved gelelektroforese med farging med etidiumbromid.

Det påtenkte amplifiseringsmålet var et allel av CFTR-genet som foreligger i intron 19 som en enkel basetransisjon (GenBank aksesjonsbetegnelse AC000061).

Reaksjonsblandingen på 25 μl inneholdt et substrat bestående av 120 pikogram (pg) fragmentert humant genomisk DNA, 1 x PCR-buffer, 5 mM MgCl2, 250 μM av hvert dNTP, SYBR Green fortynnet 1:40000, 1000 nM foroverprimer med sekvens 5' TAATTACAAGAGTCTTCCAT 3' (SEKV.ID. NR. 33), Tm 56,6ºC og 1000 nM revers primer med sekvens 5' CATGAATAGAACATTTCCTT 3' (SEKV.ID. NR.

34), Tm 56,3ºC og 1,25 enheter ikke-varmstart Invitrogen Taq-polymerase i fravær eller nærvær av 400 nM av reagens 9-3 DD. Prøvene ble amplifisert ved anvendelse av en temperatursyklusprofil bestående av 95ºC i 3 minutter; 60 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 55ºC i 30 sekunder og 72ºC i 30 sekunder med avlesning av SYBR Green I-fluorescens ved 72ºC og endelig en temperaturgradient fra 54ºC til 96ºC med økninger på 1ºC hvert 30. sekund. Etter avsluttet reaksjon ble flere tilfeldig utvalgte prøver fra hvert sett av reaksjoner analysert ved gelelektroforese i en 3,0% agarosegel i 0,5 x Tris-borsyre-EDTA-løsning(TBE).

Figur 8 viser de erholdte resultatene. Amplifiseringskurven i felt A i figur 8 viser SYBR Green I-fluorescensen over 60 sykluser hvor kurvene identifisert ved sirkel 81 er prøvene i replikat som ikke inneholdt reagens 9-3 DD og kurvene identifisert ved sirkel 82 er prøvene i replikat med 400 nM 9-3 DD. Kinetikken for fluorescenssignalene som oppstår fra de to prøvesettene viser at totalt dobbelttrådet DNA ble akkumulert noe hurtigere i fravær av reagens 9-3 DD enn i nærvær av reagenset, men den totale mengde dobbelttrådet DNA som var akkumulert etter 60 sykluser var nær sagt den samme i de to reaksjonssettene.

Felt B i figur 8 viser elektroforesegelene med farging med etidiumbromid. Til venstre er spor a en størrelsesmarkør (50 basepar forskjeller) og sporene b til i er prøver uten reagens 9-3 DD. Til høyre er sporene j til q prøver med 400 nM 9-3 DD og spor r er størrelsesmarkøren. Resultatene viser at reaksjoner som ikke inneholdt reagenset ifølge den foreliggende oppfinnelsen ga det korrekte produktet så vel som mange uspesifikke produkter med høyere molekylvekt, mens reaksjonene som inneholdt reagens 9-3 DD kun ga det korrekte produktet. Videre ga reaksjoner som inneholdt reagens 9-3 DD tilnærmet to ganger mer av det korrekte produktet enn reaksjoner som ikke inneholdt reagenset, vurdert ut fra den relative intensitet av det korrekte produktbåndet i gelene.

I kombinasjon viser den kinetiske analysen og elektroforeseanalysen at reaksjonene 81 som ga uspesifikke produkter gir fluorescenssignaler tidligere enn reaksjonene 82 som kun ga det korrekte produktet. SYBR Green-fargestoffet interkalerer i dobbelttrådet DNA uten sekvensspesifitet. Den sigmoide kinetikken for reaksjonene 82 sammenlignet med den mer rettlinjede kinetikken i reaksjonene 81, kan følgelig anvendes for å avgjøre hvorvidt en symmetrisk reaksjon kun akkumulerer det korrekte produktet eller ikke gjør det.

Eksempel 9. Kvantifisering av eksonukleaseinhibering

Dette eksempelet beskriver en rigorøs analyse for måling av den inhibitoriske virkningen av et reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen på 3'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq DNA-polymerase. Analysen benytter et primertemplatsystem som tilsvarer det beskrevet av M. W. Kaiser, N. Lyamicheva, W. Ma, C. Miller, B. Neri, L. Fors og V. I. Lyamicheva in J. Bio. Chem., 274, sidene 21387-21394 (1999), bortsett fra at templatet er merket med Cy5 i den 5' enden og at analysen utføres i nærvær av SYBR Green I, et DNA-fargestoff som fluorescerer når det er bundet til dobbelttrådet DNA. Templatet i denne analysen består av oligonukletoidsekvensen

5'-Cy5-AAAACGCTGTCTCGCTGAAAGCGAGACAGCGAAAGACGCTCGT-3' (SEKV.ID. NR. 35) hybridisert til en primer med nukleotidsekvensen:

5'-ACGAGCGTCTTTC-3' (SEKV.ID. NR. 36). Det lengste oligonukleotidet danner en hårnålsstruktur med to enkelttrådede haler med forskjellig lengde. Den kortere 5'-halen i templatet inneholder Cy5-fluoroforen og består av 4 adenosinrester mens den lengre 3'-halen i templatet fungerer som må for primeroligonukleotidet slik at primeren sitter direkte foran den 5' templathalen med ett basepars overlapp.

Tilsetning av SYBR Green I til dette templat-primerkomplekset fører til SYBR Green I-binding til de dobbelttrådede DNA-områdene i komplekset. Etter eksitasjon av SYBR Green I med en laser ved 480 nm, absorberes fluorescensenergien fra det bundne DNA-fargestoffet fullstendig av Cy5, noe som antas å skje via fluorescensresonansenergioverføring, og det er ingen påvisbar fluorescens ved den maksimale emisjonsbølgelengden for SYBR Green (maksimal emisjonsbølgelengde: 521 nm). Hydrolyse av den 5' halen via 5'-3'-eksonukleaseaktivitet til Taqpolymerase fører til fjerning av Cy5-gruppen fra templat-primerkomplekset og gjendanning av påvisbar SYBR Green I-fluorescens. Kinetikken for gjendanningen av SYBR Green I-fluorescensen i nærvær av Taq DNA-polymerase gir et kvantitativt mål på 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. Reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen inhiberer 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq-polymerase og reduserer økningen av SYBR Green I-fluorescens.

Analyseblandingen besto av 0,5 μM av templatet ovenfor og 1,5 μM av primeren ovenfor blandet med 1X PCR-buffer, 3 mM MgCl2, en kommersiell SYBR Green I-lagerløsning (Molecular Probes, Eugene, OR) fortynnet 1:40000, 1,25 U Taqpolymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i fravær eller nærvær av forbindelse 9-22 DD i en konsentrasjon på 50 nM, 100 nM, 300 nM eller 1000 nM i et volum på 25 mikroliter ( μl). dNTP ble ikke tilsatt reaksjonsblandingen siden analysen ikke bygger på DNA-polymeraseaktivitet. Reaksjonsblandingen uten templat og primer ble satt opp ved 25 ºC for å fremme interaksjonen mellom forbindelse 9-22 DD og Taq DNA-polymerase. Prøven ble så plassert på is, tilsatt templat og primere og holdt på is inntil reaksjonen ble startet. De negative kontrollene manglet Taq DNA-polymerase. Reaksjonen ble startet ved å innkubere prøven ved 25 ºC i en ABI Prism Sequence Detector 7700 i 60 minutter med oppsamling av fluorescens i SYBR Green I-kanalen hvert 30. sekund. Gjennomsnittsverdien for tre forskjellige forsøk ble beregnet for hver kontroll og for hver konsentrasjon av reagens 9-22 DD.

Figur 9 viser resultatene fra analysen. Påvisbar SYBR Green I-fluorescens gir et mål på omfanget av 5'-3'-eksonukleaseaktivitet. Kontrollen "No Taq" viser intet SYBR-fluorescenssignal, noe som er i samsvar med fullstendig absorpsjon av SYBR Green I-fluorescensen ved Cy5 og fullstendig fravær av 5'-3'-eksonukleaseaktivitet (linje 96). Tilsetning av Taq-polymerase gir gjenvinning av SYBR Green I-fluorescens og gir et basalnivå for det maksimale nivået av 5'-3'-eksonukleaseakvitiet under analysebetingelsene (linje 91). Tilsetning av forbindelse 9-22 DD til reaksjonsblandingen reduserer gjenvinningen av SYBR Green I-fluorescens på en doseavhengig måte grunnet den inhibitoriske virkningen av 9-22 DD på 5'-3'-eksonukleaseaktiviteten til Taq-polymerase (linje 92, 50 nM; linje 93, 100 nM; linje 94, 300 nM; linje 95, 1000 nM). Tabell III nedenfor kvantifiserer prosent inhibering av 5'-3'-eksonukleaseaktivitet ved forskjellige konsentrasjoner av forbindelse 9-22 DD basert på det relative SYBR Green I-fluorescensnivået oppnådd etter 60 minutter innkubering ved 25 ºC.

TABELL III

Reaksjon Fluorescens % 5'-3'-eksonukleaseinhibering

Ingen 9-22DD 1378 enheter 0,0

50 nM 9-22DD 1315 enheter 4,6

100 nM 9-22DD 1155 enheter 16,2

300 nM 9-22DD 989 enheter 28,2

1000 nM 9-22DD 624 enheter 54,7

Uten Taq: 0 enheter Ingen 5'-3'-eksonukleaseaktivitet

Eksempel 10. Hindring av primer-dimerdannelse og oligomerisering i nærvær og fravær av mål-DNA

En serie av LATE-PCR-amplifiseringsreaksjoner ble satt opp i nærvær eller fravær av 100 genomer humant placenta-DNA (Sigma, St Louis, MO) i et endelig volum på fra 15 til 25 μl. I dette eksperimentet består LATE-PCR-amplifiseringsreaksjonsblandingene av 1X PCR-buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3 mM MgCl2, 0,25 mM dNTP, 1000 nM overskuddsprimer, 50 nM begrensende primer, 0,25 μM FAM-merket probetråd, 0,3 μM dabcylmerket revers og komplementær tråd, 1,25 enheter Platinum Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Sekvensen til primerne og probene var som følger:

Overskuddsprimer: 5’ GTTTCTTTGCTGCCGTGTTC 3’ (SEKV.ID. NR. 37)

Begrensende primer: 5' CCCCAGAGACCCCAGTTGCTMCCAGAC 3' (SEKV.ID. NR. 38)

FAM-merket probetråd: 5' [TET] AGACAGAGTTGAAAGTCAGG [Phos] 3' (SEKV.ID. NR. 39)

Dabcylmerket revers og komplementær tråd: 5' ACTTTCAACTCTGTCT

[dabcyl] 3' (SEKV.ID. NR. 40)

Disse primerne og probene amplifiserer og detekterer et amplikon på 488 basepar (bp) som omfatter eksonene 5 og 6 fra det humane p53-genet.

Amplifiseringen ble utført i en ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, CA) med en temperaturprofil som besto av 1 syklus bestående av 95ºC i 3 minutter; 25 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 64ºC i 30 sekunder og 75ºC i 30 sekunder; og 35 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 64ºC i 30 sekunder, 75ºC i 30 sekunder og 45ºC i 20 sekunder med fluorescensdeteksjon i TET-kanalen under trinnet på 45ºC.

De resulterende amplifiseringsproduktene ble analysert ved gelelektroforese i en 3% agarosegel i 0,5X TBE-buffer i 2 timer og farget med etidiumbromid. Resultatene vises i figur 10. Prøvene i sporene 3, 5, 7, 9 og 11 ble satt opp uten genomisk DNA. Prøvene i sporene 2, 4, 6, 8 og 10 ble satt opp med DNA. Spor 1 inneholdt elektroforestørrelsesmarkører i en stige på 100 basepar. Reagens 9-22 DD ble tilsatt til utgangsreaksjonene som følger: Sporene 2 og 3, 0 nM; sporene 4 og 5, 50 nM; sporene 6 og 7, 100 nM; sporene 8 og 9, 200 nM; sporene 10 og 11, 300 nM.

På høyre side av gelen har vi markert størrelsen av det korrekte produktet og også størrelser som vi anslår å være primer-dimerer og oligomerer av primer. Resultatene som vises i figur 10 viser at i reaksjoner initiert med genomisk DNA, virker økende konsentrasjoner av reagens 9-22 DD på en doseavhengig måte ved å forhindre manifestering av uspesifikke produkter innbefatter primer-dimerer og primeroligomerer, hvorved både spesifiteten og utbyttet av de korrekte produktene økes. Økende konsentrasjoner av reagens 9-22 DD forhindrer også manifestasjon av primer-dimerer og primer-oligomerer i reaksjoner som ikke inneholder genomisk DNA.

Eksempel 11. Forhindring av primer-dimerdannelse i en dupleksreaksjon

En serie av LATE-PCR-amplifiseringsreaksjoner ble satt opp i nærvær eller fravær av 100 genomer humant placenta-DNA (Sigma, St Louis, MO) i et endelig volum på 25 μl. I dette eksperimentet besto LATE-PCR-amplifiseringsreaksjonsblandingene av 1X PCR-buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3 mM MgCl2, 0,20 mM dNTP. Taqpolymerase ble anvendt i en mengde på 1,25 enheter i hver prøve. Den første amplifiseringsmålsekvensen (produkt 1) var en del av ekson 11 i cystisk fibrosegenet og ble amplifisert med en begrensende primer: 5' GACGTTTACAGCGAATGCTTGCTAGACCAAT 3' (SEKV.ID. NR. 41) i en konsentrasjon på 100 nM og en overskuddsprimer: 5' TCCAAGTTTGCAGAGAAAGACAAT 3' (SEKV.ID. NR. 42) i en konsentrasjon på 2000 nM. En andre amplifiseringsmålsekvens (produkt 2) var en del av ekson 10 i cystisk fibrosegenet og ble amplifisert med en begrensende primer: 5' CAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCAT 3' (SEKV.ID. NR. 43) i en konsentrasjon på 50 nM og en overskuddsprimer: 5' GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTA 3' (SEKV.ID. NR. 44) i en konsentrasjon på 1000 nM.

Amplifiseringen ble utført i en ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, CA) med en temperaturprofil bestående av 2 minutter ved 95ºC fulgt av 25 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 56ºC i 15 sekunder og 70ºC i 20 sekunder, fulgt av 50 sykluser bestående av 95ºC i 10 sekunder, 56ºC i 15 sekunder, 70ºC i 20 sekunder og 45ºC i 30 sekunder med oppsamling av fluorescens.

De resulterende amplifiseringsproduktene ble analysert ved gelelektroforese i en 3% agarosegel i 0,5X TBE-buffer i 2 timer og farget med etidiumbromid. Resultatene vises i figur 11. Reaksjonene analysert i sporene 1-6 benyttet en ikke-varmstart Taq-polymerase, reaksjonene analysert i sporene 7-12 benyttet en Taq-polymerase pluss et varmstartantistoff. Reagens 9-22 DD ble tilsatt til reaksjonene analysert i sporene 4-6 og 10-12 i en konsentrasjon på 100 nM.

På høyre side av gelen har vi tilført vår tolkning av identiteten til amplifiseringsproduktene innbefatte enkelttrådede amplikoner (ssDNA) og dobbelttrådede amplikoner (dsDNA) av produkt 1 og produkt 2, så vel som kortere produkter som vi mener er primer-dimerer. Andre uspesifikke produkter er avmerket med en stjerne. Amplifiseringer med ikke-varmstartpolymerase og uten reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, sporene 1-3, ga primer-dimerer og andre uspesifikke produkter. Amplifiseringer med varmstartpolymerase og uten reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen, sporene 7-9, var totalt sett noe renere, men viste fortsatt tegn på feilpriming. Tilsetning av reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen til varmstartamplifiseringene, sporene 10-12, ga kun de påtenkte produktene. Tilsetning av reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen til ikkevarmstartamplifiseringene, sporene 4-6, eliminerte primer-dimerer og i to av de tre replikatene (spor 4 og spor 6) også alle andre uspesifikke produkter, mens kun ett replikat (spor 5) viste et uspesifikt produkt. Resultatene som vises i figur 11 viser at en lav konsentrasjon (100 nM) av reagens 9-22 DD var tilstrekkelig til å forhindre dannelse av primer-dimerer, både med ikke-varmstart Taq-polymerase og med varmstart Taq-polymerase og videre at en lav konsentrasjon av reagens 9-22 DD nesten var tilstrekkelig til å forhindre alle manifestasjoner av feilpriming, selv når anvendt med ikke-varmstart Taq-polymerase i amplifiseringer av to målsekvenser med to primerpar.

Eksempel 12. Optimalisering av kinetikken for en dupleks sanntids PCR og en sanntids PCR ved å forhindre primer-dimerdannelse

Vi utformet en dupleks sanntids LATE-PCR-analyse for samtidig amplifisering av sekvenser i eksoner i musegenene Oct4 og Xist (GenBank aksesjonsbetegnelse NM_013633 og L04961 henholdsvis). Hver reaksjon ble utført i et sluttvolum på 50 μl og inneholdt følgende reagenser: 1 X PCR-buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) bestående av 20 mM Tris-HC1, pH 8,4, og 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 0,4 mM av hvert dNTP, 50 nM Oct4 begrensende primer med sekvensen 5' TGGCTGGACACCTGGCTTCAGACT 3' (SEKV.ID. NR. 45), 2 μM Oct4 overskuddsprimer med sekvensen 5' CAACTTGGGGGACTAGGC 3' (SEKV.ID. NR. 46), 100 nM Xist begrensende primer med sekvensen 5' GGTCGTACAGGAAAAGATGGCGGCTCAA 3' (SEKV.ID. NR. 47), 2 μM Xist overskuddsprimer med sekvensen 5' TGAAAGAAACCACTAGAGGGCA 3' (SEKV.ID. NR. 48), 1 μM Oct4 molekylfyrprobe med lav Tm og sekvensen 5' TET-CCG CCT GGG ATG GCA TAC TGT GGA AGG CGG-dabcyl 3' (SEKV.ID. NR.

49) og 2 enheter Platinum<®>Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i kompleks med antistoff. PCR-reaksjonsblandingene inneholdt også enten forbindelse 9-3DD eller forbindelse 9-3bDD i konsentrasjonene som er angitt nedenfor. En molekylfyrprobe for påvisning av Xist-amplikoner ble ikke tilsatt i dette eksempelet. Hver analyse inneholdt også reagensene som er nødvendige for lysering av celler og revers transkripsjon ifølge PurAmp-fremgangsmåten (se Hartshorn et al. (2005) BMC Biotechnol 5: 2) i et volum på 2,5 μl. I denne dupleks LATE-PCR-analysen var sluttkonsentrasjonene av slike reagenser som følger: 2,5 mM Tris-acetat, pH 8,4, 3,75 mM kaliumacetat og 0,4 mM magnesiumacetat (fortynnet cDNA Synthesis Buffer, ThermoScript<TM>RT-PCR System, Invitrogen, Carlsbad, CA), ytterligere 50 μM av hvert dNTP, 0,13 mM guanidinisotiocyanat, 6,7 μM β-merkaptoetanol, 0,7 μM natriumcitrat, pH 7,0, 0,7 x 10<-4>% (vol/vol) dimetylsulfoksid og 0,2 x 10<-4>% sarkosyl.

Genomisk muse-DNA (Sigma, St. Louis, MO) ble også tilsatt til hver analyse og tilført templatene for PCR-amplifisering. Antallet tilsatte genomer til hvert rør ble beregnet basert på en genomstørrelse på 6 pg (se Vendrely og Vendrely (1949) Experientia 5: 327-329).

Amplifiseringen ble utført i en ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems, CA) med en temperaturprofil som omfatter 1 syklus med 95°C i 5 minutter; 15 sykluser omfattende 95°C i 10 sekkunder, 63°C i 20 sekunder og 72°C i 30 sekunder; og 40 sykluser omfattende 95°C i 15 sekunder, 55°C i 25 sekunder, 72°C i 35 sekunder og 45°C i 30 sekunder med oppsamling i 45 ºC i TET-kanalen.

Etter avsluttet PCR, ble amplifiseringsproduktene analysert ved gelelektroforese i en 3% agarosegel i 0,5X TBE-buffer i 2 timer og farget med etidiumbromid. Både de dobbelttrådede og de enkelttrådede produktene med de forventede størrelser var synlige for de to samtidig amplifiserte genene, noe som viser effektiv dupleks LATE-PCR.

Figur 12 illustrerer virkningen av å variere sammensetningen av stammen i reagens 9-3DD på kinetikken for dupleks LATE-PCR-analysen beskrevet ovenfor som inneholder to sett av primere for amplifisering av to ikke-homologe sekvenser i genene Oct4 og Xist. Figuren viser fluorescenssignalene som dannes fra akkumulerende Oct4-amplikoner ved hbrydisering med TET-Oct4 molekylfyrproben. Resultatene viser at CT-verdiene er svært like i nærvær av 300 nM 9-3DD (linjer med trekanter) og den samme konsentrasjonen av den modifiserte formen 9-3bDD (tykke linjer uten trekanter) for hver analyserte genomkonsentrasjon (10 genomer, sirkel 122; 100 genomer, sirkel 123; 1000 genomer, sirkel 124). Kinetikken for sanntidsfluorescenssignalene påvirkes derimot av sammensetningen av reagensets stamme. Forbindelse 9-3bDD har en høyere Tmfor stammen enn 9-3DD, og forhindrer derfor, antar vi, primer-dimerdannelse på en optimal måte, noe som i sin tur fører til svært lineære og parallelle signaler for alle de analyserte genomkonsentrasjonene. I nærvær av den mindre stringente forbindelse 9-3DD, har derimot noen av fluorescenssignalene en brattere vinkelkoeffisient, mens andre begynner å flate ut tidlige i reaksjonen, noe som viser tilfeldig dannelse av primer-dimer. Signalene erholdt ved forskjellige templatkonsentrasjoner med forbindelse 9-3DD er mindre parallelle enn signalene erholdt i nærvær av forbindelse 9-3bDD (med den modifiserte stammen). Lineær amplifisering som gir nøyaktig parallelle signaler (med en konstant vinkelkoeffisient) er ideelt sett ønskelig og spesielt relevant for sluttpunktsanalyser.

Agarosegelanalyser av prøvene som inneholdt 9-3DD viste bånd, særlig synlige ved et høyere templattall som kan være primerdimerer og svært små bånd ved lavere templattall som er forenlige med primere. Slike bånd opptrådte ikke i analysen av prøvene som inneholdt 9-3bDD.

Figur 13 illustrerer virkningen av å variere konsentrasjonen av reagens 9-3bDD i dupleks LATE-PCR-analysen som beskrives i dette eksempelet og som også anvendes for figur 12. I dette tilfellet påvirker igjen en reduksjon av konsentrasjonen av reagens 9-3bDD fra 300 nM (heltrukne linjer uten trekanter) til 200 nM (linjer med trekanter) vinkelkoeffisienten for den lineære amplifiseringen grunnet primer-dimerdannelse, noe som bekreftes ved agarosegelanalysen. Som en følge av dette, har noen av prøvene som inneholder et lavt innledende templattall (10 genomer, sirkel 132) høyere fluorescens i siste syklus ("sluttpunktet") enn prøver som inneholder et høyere innledende templattall (100 genomer, sirkel 133 og 1000 genomer, sirkel 134).

Konsentrasjonsvirkningen av reagensene som beskrives i den foreliggende patentsøknaden på PCR-effektiviteten ble også analysert i en LATE-PCR hvor ett templat ble amplifisert med ett primerpar. Det amplifiserte templatet var den samme Oct4-musesekvensen som ble anvendt i dupleksreaksjonen beskrevet for figurene 12 og 13 og primersekvensene og molekylfyrsekvensene var også de samme som i den reaksjonen.

Hver reaksjon ble utført i et sluttvolum på 100 μl og inneholdt følgende reagenser: 1 X PCR-buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA) bestående av 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, og 50 mM KCl, 3mM MgCl2, 0,25 mM av hvert dNTP, 50 nM Oct4 begrensende primer, 2 μM Oct4 overskuddsprimer, 1 μM TET-Oct4 molekylfyrprobe med lav Tm og 2 enheter Platinum<®>Taq DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i kompleks med antistoff. Forbindelse 9-3DD inngikk også i PCR-blandingen i konsentrasjoner på 150, 300 eller 450 nM. Som for den ovenfor nevnte dupleksreaksjonen (se figurene 12 og 13), inneholdt hver reaksjonsblanding også reagensene som er nødvendige for cellelysering og revers transkripsjon ifølge PurAmp-fremgangsmåten i et volum på 10,5 μl. I denne LATE-PCR-reaksjonen var sluttkonsentrasjonen av slike reagenser som følger: 5 mM Tris-acetat, pH 8,4, 7,5 mM kaliumacetat og 0,8 mM magnesiumacetat (fortynnet cDNA syntesebuffer), 1 ng/ μl tilfeldige heksamerer og ytterligere 100 μM av hvert dNTP (alle bestanddeler av et ThermoScript<TM>RT-PCR-system, Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,4 mM guanidinisotiocyanat, 20 μM β-merkaptoetanol, 2 μM natriumcitrat, pH 7,0, 2 x 10<-4>% (vol/vol) dimetylsulfoksid og 0,5 x 10<-4>% sarkosyl.

Genomisk muse DNA ble også tilsatt til hver analyse og tilført templatene for PCR-amplifisering som angitt for dupleks LATE-PCR-reaksjonen som er beskrevet i dette eksempelet. Amplifiseringen ble igjen utført i en ABI Prism 7700 Sequence Detector med den samme temperaturprofil som er beskrevet for dupleksreaksjonen. Etter avsluttet PCR ble amplifiseringsproduktene analysert ved gelelektroforese i en 3% agarosegel i 0.,X TBE-buffer i 2 og farget med etidiumbromid. Både de dobbelttrådede og de enkelttrådede produktene var synlige på gelen og hadde de forventede størrelser, noe som viser effektiv amplifisering med LATE-PCR.

Virkningene av økende konsentrasjoner av forbindelse 9-3DD på amplifiseringseffektiviteten av Oct4-templatet ble også analysert. CT-verdiene ble erholdt fra sanntids PCR-analyser som inneholdt 5 genomer (gjennomsnitt av to replikater for hver av de analyserte 9-3DD-konsentrasjonene), 20 genomer (gjennomsnittet av to replikater for hver av de analyserte 9-3DD-konsentrasjonene), 100 genomer og 1000 genomer utført for hver av de analyserte 9-3DD-konsentrasjonene: 150 nM, 300 nM og 450 nM. Lineær regresjon for hver serie av CT-punkter for hver konsentrasjon er vist i figur 14 hvor trekantene angir en konsentrasjon på 450 nM, åpne firkanter tilsvarer 300 nM og fylte firkanter tilsvarer 150 nM. Det er umiddelbart klart fra disse kurvene at 450 nM 9-3DD i høy grad forsinker forekomsten av fluorescenssignaler over terskelverdien og også endrer doseavhengigheten for PCR-amplifiseringen (se punktene for 10 genkopier og 40 genkopier som ligger langt fra regresjonslinjen). De erholdte CT-verdier ved anvendelse av 150 nM eller 300 nM 9-3DD er derimot svært like og viser en lineær sammenheng mellom templatkopitall og første forekomst av fluorescenssignal.

Analyse av sanntidsfluorescensmønstrene fremhever derimot en forskjell mellom de to betingelsene (konsentrasjonene) som vist i figur 15. Vinkelkoeffisienten for kurvene erholdt med enten 100 genomer, sirkel 151 eller 1000 genomer, sirkel 152, er brattere ved anvendelse av 300 nM 9-3DD (heltrukne linjer uten trekanter) enn ved anvendelse av 150 nM 9-3DD (linjer med trekanter), noe som tyder på at de mer stringente betingelsene, 300 nM, eliminerer primer-dimerer og således øker amplifiseringseffektiviteten.

Eksempel 13. Anvendelse av flere reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen

LATE-PCR-reaksjonsblandinger ble satt opp for amplifisering av fem forskjellige målsekvenser i humant genomisk DNA som utgangsmateriale hver for seg og for amplifisering av alle fem samtidig i en multipleksreaksjon. Hver målsekvens krevde sitt eget par av begrensende primer og overskuddsprimer. Målsekvensene var (1) et globinallel på 191 basepar, (2) et Tay Sachs G269-allele på 312 basepar, (3) Tay Sachs 1278- og 1421-allel på 452 basepar, (4) et segment av mitokondrielle hypervariable område 1 på 549 basepar og (5) et segment på 611 som omfatter p53-geneeksonene 7 og 8. Reaksjonsblandingene på 25 μl innholdt 1x PCR-buffer (Invitrogen), 0,4 mM dNTP, 3 mM Mg++, 0,24 x SYBR Green og 1,5 enheter Taq DNA-polymerase (Invitrogen). Primere ble tilsatt i en konsentrasjon på 50 nM for begrensende primer og 1000 nM for overskuddsprimer. Alle de fem primerparene ble tilsatt til multipleksreaksjonene. Temperatursyklusene omfattet førtifem sykluser bestående av 95°C i 10 sekunder, 64°C i 20 sekunder og 72°C i 1 minutt.

Både reaksjonsblandingene med enkeltvise primerpar og enkeltvise målsekvenser og reaksjonsblandingene med alle de fem primerparene og alle de fem målsekvensene ble amplifisert i nærvær av en kombinasjon av 25 nM forbindelse 9-22DD og 100 nM forbindelse 12-3DD. Pentapleksreaksjonsblandingen ble også amplifisert uten tilsetning av noe reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Reaksjonsproduktene ble undersøkt ved gelelektroforese.

Gelelektroforeseresultatene for de forskjellige amplifiseringene er vist i figur 16 som omfatter størrelsesmarkører (100 basepar forskjeller) i spor 4r. De sentrale sporene g-k er produktene fra enkeltvise amplifiseringer av målsekvensen (1)-(5). Sporene l-q er produktene fra seks pentafleksamplifiseringer i replikat som omfatter blandingen av forbindelse 9-22DD og forbindelse 12-3DD. Sporene a-f er produktene fra seks pentapleksamplifiseringer i replikat som ikke inneholdt noe reagens ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Figur 16 viser at blandingen av forbindelser forbedret amplifiseringen (mer av og renere ønskede amplikoner) sammenlignet med multipleksreaksjonen uten tilsetning av noen forbindelse, noe som viser at blandinger av reagenser kan anvendes i sett, amplifiseringer og analyser.

Eksempel 14. Analyse av virkningsmåter

Vi har utformet en analyse for kvantitativ undersøkelse av feilprimingsreduksjonen (spesifitetsforbedring) og polymeraseinhiberende virkninger av reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen som vi tror skiller den første virkemåten fra den tredje virkemåten. Analysen er en PCR-amplifiseringsanalyse som i det vesentlige tilsvarer analysen beskrevet i eksempel 1, bortsett fra følgende unntak:

Amplifiseringsreaksjonsblanding innholder halvparten så mye (1000 genomer) av det fragmenterte genomiske DNA og den siste del av temperatursyklusene er redusert fra 70 sykluser til 40 sykluser. Amplifiseringene utføres med tilsetning av forskjellige mengder av reagens, typisk 25 nM, 50 nM, 100 nM, 300 nM, 1500 nM og 3000 nM. Analysen omfatter to analyser: Først for spesifitet, en smeltekurve for det amplifiserte produktet; og så for inhibering, en sanntids fluorescenskurve for syntetisert dobbelttrådet produkt.

Figurene 17-18 viser deler av de analytiske resultatene for to reagenser ifølge den foreliggende oppfinnelsen, forbindelse 12-3DD og forbindelse 12-C3DD henholdsvis. I hver figur representerer kolonne I smeltekurver for flere utvalgte konsentrasjoner av reagens som angitt. I hver figur representerer kolonne II sanntids fluorescenskurver for de samme konsentrasjonene, som angitt. Idet det henvises til figur 17, kolonne I, viser smeltekurvene at forbindelse 12-3DD oppnådde høy spesifitet (unngåelse av feilpriming) i konsentrasjoner på 100 nM og høyere (den laveste konsentrasjonen, 100 nM er noe høyere enn hva som ble funnet i reaksjonen beskrevet i eksempel 1). Idet det henvises til figur 17, kolonne II, viste sanntidsfluorescenskurvene at polymeraseinhiberingen økte gradvis etter hvert som konsentrasjonen av forbindelse 12-3DD ble økt over 100 nM inntil reaksjonen i det vesentlige ble stanset ved konsentrasjoner over 1000 nM. Inhiberingen gjenspeilet i den lavere mengden av totale dobbelttrådede produkter dannet (innbefattet det ønskede spesifikke produktet og uspesifikke produkter grunnet feilpriming), indikert ut fra platånivået ut fra fluorescensen og ved forsinkelsen i CT-verdi (10,6 for 100 nM, 21,1 for 300 nM og ikke-eksisterende, det vil si minst 40 for 1500 nM og 3000 nM). Idet det vises til figur 18, kolonne I, viser smeltekurvene at forbindelse 12-3DD oppnådde høy spesifitet ved høye konsentrasjoner på 300 nM og høyere (den laveste konsentrasjonen, 300 nM, er den samme som ble funnet for reaksjonen beskrevet i eksempel 1). Idet det vises til figur 18, kolonne II, viste sanntidsfluorescenskurvene at polymeraseinhiberingen økte gradvis etter hvert som konsentrasjonen av forbindelse 12-C3DD ble økt over 300 nM (CT-verdiene var 18,8 for 100 nM, 18,8 for 300 nM, 21,1 for 1500 nM og 24,5 for 3000 nM), men at reaksjonen ikke ble fullstendig stanset, selv ved en konsentrasjon på 3000 nM.

Dersom man sammenligner figur 18 og figur 18, kan det ses at den totale yteevnen til forbindelse 12-C3DD er mindre konsentrasjonsavhengig enn den totale yteevnen til forbindelse 12-3DD. For denne spesielle amplifiseringsreaksjonen, er følgelig CT-forsinkelsen og reduksjonen i platåfluorescens når konsentrasjonen av forbindelse 12-C3DD går fra 300 nM til 1500 nM grovt sett den samme som når konsentrasjonen av forbindelse 12-3DD går fra 100 nM til 300 nM.

En rekke utførelser av oppfinnelsen er blitt beskrevet.