NO339917B1

NO339917B1 - Fremgangsmåte for å øke in vitro biologisk potens for ikke-glykosylert interferon-beta med forsterket biologisk potens, konjugat,farmasøytisk sammensetning samt kit

Info

Publication number: NO339917B1
Application number: NO20053556A
Authority: NO
Inventors: David L Williams; Mark G P Saifer; Merry R Sherman; Alexa L Martinez
Original assignee: Mountain View Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2002-12-26
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2017-02-13
Also published as: CY1113281T1; ES2389183T3; DK1667708T5; NO20053556L; PL379987A1; EA008866B1; EP1667708B9; DK1667708T3; WO2004060299A3; AU2003303635B2; CN102319437B; PT1667708E; US9125880B2; AU2003303635A1; JP5207590B2; IL169391A; KR101238517B1; NO20053556D0; NZ541124A; HK1088822A1

Description

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår området protein biokjemi og de farmasøytiske og medisinske vitenskaper. Særlig tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for fremstilling av konjugater mellom vannoppløselige polymerer (for eksempel poly(etylenglykol) og derivater derav) og cytokiner (for eksempel interferon-P), hvilke konjugater har øket potensen sammenlignet med polymerkonjugater av de samme cytokinsyntetisert ved standard metoder. Oppfinnelsen tilveiebringer også konjugater som er fremstilt ved slike metoder, andre preparater omfattende slike konjugater, kit som omfatter slike konjugater og preparater og bruksmetoder for konjugatene og preparatene ved prevensjon, terapi eller diagnose av et antall medisinske og veterinærtilstander. Oppfinnelsen tilveiebringer også metoder for å bestemme et eller flere festeseter for polymerer ved reduktiv alkylering under visse betingelser.

Beslektet teknologi

Den følgende beskrivelse av beslektet teknologi inkluderer interpretasjoner av de foreliggende oppfinnere som i seg selv ikke er kjent teknikk. Cytokiner er utskilte, regulatoriske proteiner som kontrollerer overlevelse, vekst, differensiering og/eller effektorfunksjon av celler på endokrin, parakrin og autokrin måte (oversikt hos N.A. Nicola (1994) i: "Guidebook to Cytokines and Their Receptors", Nicola, N.A., red., s. 1-7, Oxford University Press, New York). På grunn av sin potens, spesifisitet, lille størrelse og relativt enkle produksjon i rekombinante organismer, har cytokiner mange potensielle anvendelser som terapeutika.

To nøkkelfaktorer har hindret utviklingen av cytokiner, spesielt og rekombinante proteiner generelt som terapeutiske midler, deres generelle korte halveringstid i sirkulasjonen og deres potensielle antigenisitet og immunogenisitet. Som benyttet her og generelt innen teknikken, henviser uttrykket "antigenisitet" til et molekyls evne til å binde til preeksisterende antistoffer, mens uttrykket "immunogensisitet" henviser til evnen hos molekylet til å reise en immunrespons in vivo, uansett om responsen involverer dannelsen av antistoffer (en »humoral respons») eller stimulering av cellulære immunresponser.

For administrering av rekombinante, terapeutiske proteiner er intravenøs (i.v.) administrering ofte ønskelig for å oppnå de høyeste sirkulasjonsaktiviteter, og for å minimalisere problemene med biotilgjengelighet og nedbrytning. Imidlertid er halveringstidene for små proteiner etter i.v.-administrering vanligvis ekstremt kort (se for eksempel J. Mordenti et al., (1991) i Pharm Res 8:1351-1359; T. Kuwabara et al.,

(1995) i Pharm Res 12:1466-1469). Proteiner med hydrodynamiske radier som overskrider den til serumalbumin og som har en Stokes radius på rundt 36 Å og en molekylvekt på rundt 66 000 dalton (66 kDa), holdes generelt tilbake i blodstrømmen av friske nyrer. Imidlertid blir mindre proteiner inkludert cytokiner som granulocyt kolonistimulerende faktor ("G-CFS"), interleukin-2 ("IL-2"), interferon-cc ("IFN-a") og interferon-y ("IFN-y"), hurtig klaret fra blodstrømmen ved glomerulær filtrering (B.M. Brenner et al., (1978) i Am J Physiol 234:F455-F460; M.A. Venkatachalam et al.,

(1978) i Circ Res 43:337-347; G. Wilson (1979) i J Gen Physiol 74:495-509; M.J. Knauf et al., (1988) i J. Biol. Chem. 263:15064-15070; Y. Kita et al, (1990) i Drug Des Deliv 6:157-167; L. Rostaing et al. (1998) i J Am Soc Nephrol 9:2344-2348). Som et resultat er opprettholdelsen av terapeutisk brukbare konsentrasjoner av små, rekombinante proteiner i sirkulasjon problematisk etter injeksjon. Derfor må det typisk administreres høyere konsentrasjoner av slike proteiner og det må gis hyppigere injeksjoner. De resulterende doseregimer øker omkostningene ved terapien, reduserer sannsynligheten for pasientvennlighet og øker risikoen for ugunstigehendelser, for eksempel immunreaksjoner. Både cellulære og humorale immunresponser kan redusere de sirkulerende konsentrasjoner av injiserte, rekombinante proteiner i en slik grad at de kan forkludre administreringen av en effektiv dose eller kan føre til behandlingsbegrensende hendelse inkludert akselerert klaring, nøytralisering av effektiviteten og anafylakse (P. Ranghammar et al., (1994) i Bood 84:4078-4087; M. Wadhwa et al., (1999) i Clin Cancer Res 5:1353-1361; Hjem Skog, A.-L., et al., (2001) i Clin Cancer Res 7:1163-1170; J. Li et al., (2001) i Blood 98:3241-3248; RL. Basser et al., (2002) i Blood 99:2599-2602; H. Schellekens (2002) i Clin THer 24:1720-1740).

Modifisering av rekombinante proteiner ved kovalent festing av poly(etylenglykol)

("PEG") er undersøkt i utstrakt grad som et middel for å takle de ovenfor beskrevne mangler (oversikt i M.R. Sherman et al., (1997) i: "Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications", J.M. Harris, et al., red., s. 155-169, American Chemical Society, Washington, D.C.; MJ. Roberts, et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:459-476). Festingen av PEG til proteinet har vist seg å stabilisere proteinene, forbedre deres

biotilgjengelighet og/eller redusere deres immunogenisitet in vivo. (Den kovalente festing av PEG til et protein eller annet substrat beskrives her og er kjent i teknikken som "PEGylering"). I tillegg kan PEGylering øke den hydrodynamiske radius for proteiner på en signifikant måte. Når et lite protein som et cytokin kobles til en enkelt, lang, tråd av PEG (for eksempel med en molekylvekt på minst rundt 18 kDa), har det resulterende konjugat en hydrodynamisk radius som overskrider den til serumalbumin og dens klaring fra sirkulasjonen via renale glomeruli retarderes drastisk. De kombinerte effekter av PEGylering - redusert proteolyse, redusert immungjenkjennelse og redusert grad av renal klaring, gir vesentlige fordeler for PEGylerte proteiner som terapeutiske midler.

Siden 1970-årene har det vært gjort forsøk på å benytte den kovalente festingen av polymerer for å forbedre sikkerheten og effektiviteten for forskjellige proteiner for farmasøytisk bruk (se for eksempel F.F. Davis et al., US 4 179 337). Noen eksempler inkluderer koblingen av PEG eller poly(etylenoksid) ("PEG") til adenosindeaminase (EC 3.5.4.4) for anvendelse ved behandling av alvorlig, kombinert immunodefekt sykdom (S. Davis et al., (1981) Clin Exp Immunol 46:649-652; M.S. Hershfield et al.,

(1987) N Engl J Med 316:589-596), til superoksid dismutase (EC 1.15.1.1) for behandling av inflammatoriske tilstander (M. Saifer et al., US 5 006 333 og 5 080 891) og til uratoksidase (EC 1.7.3.3) for eliminering av overskytende urinsyre fra blod og urin (S.J. Kelly et al. (2001) i J Am Soc Nephrol 12:1001-1009; L.D. Williams et al., WO 00/07629 A3 og US 6 576 235; M.R. Sherman et al, WO 01/59078 A2).

PEOer og PEGer er polymerer som består av kovalent bundne etylenoksidenheter. Disse polymerer har den følgende, generelle struktur:

der R2kan være en hydroksygruppe (eller et reaktivt derivat derav) og Ri kan være hydrogen, som i dihydroksyPEG ("PEG diol"), en metylgruppe som i monometoksyPEG ("mPEG") eller en annen lavere alkylgruppe, for eksempel som i isopropoksyPEG eller t-butoksyPEG. Parameteren n i den generelle struktur for PEG antyder antallet etylenokdisenheter i polymeren og angis her og i teknikken som "polymeriseringsgrad". Polymerer av samme generelle struktur er Ri er en C1.7alkylgruppe er også kalt oksiranderivater (T. Yasukohchi et al., US 6 455 639). PEGer

og PEOer kan være rette, forgrenet og lignende eller stjerneformet (E.W. MErrill (1993) i J Biomater Sei Polym Ed. 5:1-11). PEGene og PEOene er amfipatiske, dvs. at de er oppløselige i vann og i visse organiske oppløsningsmidler og at de kan adhere til lipidholdige materialer, inkludert omhyllede viruser og membraner av animalske og bakterielle celler. Visse tilfeldige eller blokk- eller alternerende kopolymerer av etylenoksid (OCH2CH2) og propylenoksid, som har den følgende struktur:

har egenskaper som er tilstrekkelig like de til PEG til at disse kopolymerer anses å være egnede erstatninger for PEG ved visse anvendelser (se for eksempel H. Hiratani i US 4 609 546 og M. Saifer i US 5 283 317). Uttrykket "polyalkylenoksid" og forkortelsene "PAOer" som benyttet her, henviser til slike kopolymerer så vel som til PEG- eller PEO- eller poly(oksyetylenoksymetylen) kopolymerer (C.G. Pitt et al. i US 5 476 653). Som benyttet her, benyttes uttrykkene "polyalkylenglykoler" og forkortelsen "PAGer" for generisk å henvise til polymerer som er egnet for bruk i konjugatene ifølge oppfinnelsen, særlig PEGer, og mer spesielt PEGer inneholdende en enkelt, reaktiv gruppe ("monofunksjonelt aktive PEGer").

Den kovalente festing av PEG eller andre polyalkylenoksider til et protein krever en konvertering av minst en endegruppe av polymeren til en reaktiv, funksjonell gruppe. Denne prosess angis hyppig som "aktivering" og produktet kalles "aktivert PEG" eller aktivert polyalkylenoksid. MonometoksyPEGer, der et oksygen ved en ende er dekket med en ikke-reaktiv, kjemisk stabil metylgruppe (for å gi en "metoksylgruppe") og på den andre ende med en funksjonell gruppe som er reaktiv mot aminogrupper på et proteinmolekyl, benyttes vanligvis for slike veier. Såkalte "forgrenede" mPEGer som inneholder to eller flere metoksylgrupper distale til en enkelt, aktivert funksjonell gruppe, benyttes mindre hyppig. Et eksempel på forgrenet PEG er di-mPEG-lysin der PEG er koblet til begge aminogrupper og karboksylgruppen av lysin som regel er aktivert med forestring med N-hydroksysuksinimid (Martinez, A. et al., US 5 643 575, R.B. Greenwald et al., US 5 919 455, J.M. Harris et al., US 5 932 462).

Vanligvis omsettes de aktiverte polymerer med en bioaktiv forbindelse med nukleofil funksjonelle grupper som tjener som festeseter. En nukleofil, funksjonell gruppe som vanligvis benyttes som et festesete er e-aminogruppen av lysinrester. Oppløsningsmiddeltilgj engelige a-aminogrupper, karboksylsyregrupper, guanidinogrupper, imidazolgrupper, egnet aktiverte karboksylgrupper, oksiderte karbohydratdeler og tiolgrupper, har også vært benyttet som festeseter.

Hydroksylgruppen av PEG er blitt aktivert med cyanursyreklorid før festingen til proteiner (A. Abuchowski et al., (1977) J Biol Chem 252:3582-3586; A. Abuchowski et al., (1981) Cancer Treat Rep 65:1077-1081). Bruken av denne metode har imidlertid mangler som toksisiteten hos cyanursyreklorid og dens ikke-spesifikke reaktivitet mot proteiner med funksjonelle grupper andre enn aminer, for eksempel oppløsningsmiddeltilgj engelige cystein- eller tyrosinrester som kan være vesentlige for funksjonen. For å overvinne disse og andre mangler, er det innført alternativt aktiverte PEGer som suksinimidylsuksinatderivater av PEG ("SS-PEG") (A. Abuchowski et al.,

(1984) Cancer Biochem Biophys 7:175-186), suksinimidylkarbonatderivater av PAG ("SC-PAG") (M. Saifer et al., US 5 006 333) og aldehydderivater av PEG (GP. Royer, US 4 002 531).

Vanligvis blir flere (for eksempel 5 til 10) tråder av en eller flere PAGer, for eksempel en eller flere PEGer med molekylvekt rundt 5 kDa til rundt 10 kDa, koblet til målproteinet via primær aminogruppene (e-aminogruppen av lysinrester og eventuelt a-aminogruppen av aminoterminalen ("N-terminal") aminosyren). I den senere tid er det syntetisert konjugater inneholdende en enkelt tråd av mPEG med høyere molekylvekt, for eksempel 12 kDa, 20 kDa eller 30 kDa. Direkte korrelasjoner er påvist mellom plasma halveringstider for konjugater og en økende molekylvekt og/eller et økende antall tråder av PEG som er koblet (MJ. Knauf et al., supra, N.V. Karre (1990) J Immunol 144:209-213; R. Clark et al. (1996) J Biol CHem 271:21969-21977; S. Bowen et al., (1999) Exp Hematol 27:425-432; S.R. Leong et al. (2001) Cytokine (16:106-119). På den annen side ble, når antallet tråder av PEG som kobles til hvert proteinmolekyl økes, økes også sannsynligheten for at en aminogruppe i et essensielt område av proteinet vil modifiseres og således den biologiske funksjon for proteiner forringes, særlig hvis det er et reseptorbindende protein. For større proteiner som inneholder mange aminogrupper, og for enzymer med substrater med lav molekylvekt, kan avveiningen mellom øket virkningsvarighet og redusert spesifikk aktivitet være aksepterbar, fordi det oppnås en nettoøkning i biologisk aktivitet for de PEG-holdige konjugater in vivo. For mindre proteiner som virker via interaksjoner med celleoverflate reseptorer som cytokiner er imidlertid en relativt høy substitueringsgrad rapportert å redusere den funksjonelle aktivitet til et punkt som opphever fordelen ved utstrakt halveringstid i blodstrømmen (R. Clark et al., supra).

Enn således er polymerkonjugering en veletablert teknologi for å forlenge bioaktiviteten og redusere immunoreaktiviteten for terapeutiske proteiner som enzymer (se for eksempel US prov. Appl. 60/436 020 av 26. desember 2002 samt US prov. Appl. 60/479 913 og 60/479 914). En klasse terapeutiske proteiner som vil trekke fordel særlig fra slik redusert immunoreaktivitet er interferon-Pene, særlig interferon -P-lb ("IFN-p-lb", Sekv. Id. Nr. 1) (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group (1996) Neurology 47:889-894). Imidlertid gjelder at konjugering av polymerer til regulatoriske proteiner som virker ved bindingsspesifikt til celleoverflatereseptorer vanligvis medfører:

(1) interferering med bindingen:

(2) markert reduksjon av signaltransduksjonspotensene for cytokinagonistene; og

(3) markert reduserer de kompetitive potenser for cytokinantagonistene.

Publiserte eksempler på slike konjugater med redusert reseptorbindingsaktivitet inkluderer polymerkonjugater av granulocytt kolonistimmulerende faktor ("G-CSF")

(O. Kinstler et al., WO 96/11953; S. Bowen et al., supra); human veksthormon ("hGH")

(R. Clark et al., supra); hGH-antagonister (RJ.M. Ross et al., (2001) J Clin Endocrinol Metab 86:1716-1723; og IFN-a (P. Bailon et al, (2001) Bioconjug Chem 12:195-202; D.C. Wylie et al. (2001) Pharm Res 18:1354-1360; og Y.S. Wang et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:547-570) blant andre. I et ekstremtilfelle konverterte koblingen av polymerer til interleukin-15 ('TL-15") denne IL-2-lignende vekstfaktor til en inhibitor for celleproliferering (D.K. Pettit et al., (1997) J Biol Chem 272:2312-2318). Uten å ønske å være bundet av noen teori, kan mekanismen for slike uønskede effekter av PEGylering involvere sterisk hindring av reseptorinteraksjoner med de voluminøse PEG-gruper, ladningsnøytralisering, eller begge deler.

WO 9955377 A2 beskriver metoder metoder for å fremstille et polyol-interferon som er et konjugat som har en polyol del kovalent bundet til Cys hos humant interferon, hvor polyol-interferonkonjugatet har den samme eller høyere interferon-aktivitet som nativt humant interferon-a.

WO 0023114 A2 beskriver metoder for selektivt å erverve en N-terminal modifisert interferon-beta-1 a.

|US 4917888 A beskriver en ikke selektiv PEGylering av en mutant av interferon-P-lb for å øke potens og løselighet.

NO 20043422 A beskriver nye polyalkylen glykolforbindelser, konjugater av polymerene samt proteiner og anvendelsen av disse.

Således eksisterer det et behov for metoder for fremstilling av PAG-holdig (for eksempel PEG- og/eller PEO-holdig) konjugater, særlig konjugater mellom slike vannoppløselige poylmerer og reseptorbindende proteiner, med bevaring av vesentlig bioaktivitet (for eksempel minst rundt 40%), nær fullstendig bioaktivitet (for eksempel minst rundt 80%) eller i det vesentlige komplett bioaktivitet (for eksempel minst rundt 90%). Slike konjugater vil ha fordelene som tilveiebringes av polymerkomponenten når det gjelder øket oppløselighet, stabilitet og biotilgjengelighet in vivo, og vil vise vesentlig øket potens eller brukbarhet, sammenlignet med konvensjonelle polymerkonjugater, i et dyr hvortil konjugatene er innført for profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål.

KORT OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tar sikte på de ovenfor identifiserte behov og tilveiebringer metoder for fremstilling av konjugater av vannoppløselige polymerer, for eksempel poly(etylenglykol) og derivater derav, med bioaktive komponenter, særlig reseptorbindende proteiner og særlig terapeutiske eller diagnostiske, bioaktive komponenter, som cytokiner inkludert interferon-P, og spesielt interferon-P-lb. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også konjugater som er fremstilt med slike metoder. Sammenlignet med de tilsvarende, ikke-konjugerte, bioaktive komponenter, har konjugatene ifølge oppfinnelsen øket stabilitet (dvs. lenger hylletid og lenger halveringstid in vivo). I tillegg og sammenlignet med konjugater av den samme, bioaktive komponent, fremstilt med polymerkjeder som er festet tilfeldig til oppløsningsmiddeltilgj engelige ster langs polypeptidkj edene, har konjugatene ifølge oppfinnelsen øket reseptorbindingsaktivitet, noe som kan måles eller benyttes in vitro, og øket potens, noe som kan måles enten in vitro eller in vivo. Videre tilveiebringer oppfinnelsen preparater omfattende slike konjugater, kit inneholdende slike konjugater og preparater. Det er videre beskrevet metoder for anvendelse av konjugatene og preparatene i et antall terapeutiske eller diagnostiske regimer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for å øke den in vitro biologiske potens for et ikke-glykosylert interferon-éeta-lb, kjennetegnet ved at den omfatter selektiv kobling av en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer til den aminoterminal aminosyren av nevnte interferon-éeta-lb ved tilstedeværelse av et detergent for å danne et modifisert interferon-beta-lb, der aminoterminal aminosyre er lokalisert fjernt fra det (de) reseptorbindingsdomene(ne) av nevnte interferon-éeta-lb, hvor nevnte kobling omfatter: (a) (i) blanding av nevnte interferon- be ta- lb og et aldehyd derivat fra nevnte en eller flere polymerer for å danne en Schiffs base, og (ii) reduksjon av nevnte Schiffs base ved å bruke et mildt reduserende middel under betingelser slik at sekundære aminbindinger dannes, der den in vitro biologiske potens av nevnte modifisert interferon-éeta-lb er omtrent 2,5 ganger, omtrent 5 ganger, omtrent 6 ganger høyere enn in vitro biologisk potens av nevnte interferon-éeta-lb forut for nevnte kobling, eller (b) (i) oksidativ spalting av den aminoterminale aminosyren fra nevnte interferon-éeta-lb til et aldehyd ved å anvende periodat under betingelser som minimerer oksidasjonen til minst en essensiell metioninrest av nevnte interferon-éeta-lb, og (ii) kobling av nevnte aldehyd med et cabazate derivat fra nevnte en eller flere polymerer, der den in vitro biologiske potens av nevnte modifiserte interferon-fetø-lb er omtrent 6-10 ganger høyere enn den in vitro biologiske potens til nevnte interferon-beta-\ b forut for nevnte kobling.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også konjugat, kjennetegnet ved at det omfatter en ikke-glykosylert interferon-éetø-lb, selektivt koblet til en eller flere syntetiske vannløselige polymerer i den aminoterminale aminosyren til nevnte interferon-éeta-lb, der nevnte aminoterminale aminosyre er lokalisert langt vekk fra det/de repetorbindene domene(ne) til nevnte interferon-éeta-lb, der det in vitro biologiske potensialet til nevnte konjugat økes omtrent 2,5 gang til omtrent 10 ganger sammenlignet med det biologiske in vitro potensialet til nevnte interferon-éeta-lb forut for nevnte kobling, der nevnte en eller flere polymerer er valgt fra gruppen bestående av en eller flere polyalkylen glykoler, og en eller flere polyalkylen oksider.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et eller flere av konjugatene ifølge krav 21 og en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter eller bærere.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også kit, kjennetegnet ved at det omfatter konjugatet ifølge krav 21.

I en utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for å øke potensen for et cytokin. Visse metoder ifølge dette aspekt ved oppfinnelsen omfatter for eksempel selektiv kobling av en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer til aminoterminal aminosyren av cytokinet, der aimnoterminal aminosyren har en lokasjon fjernt fra et eller flere reseptorbindende domener av cytokinet. Relaterte metoder som tilveiebringes ved oppfinnelsen for å øke potensen for et cytokin omfatter for eksempel selektivt kobling av en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer ved eller nær et eller flere glykosyleringsseter av cytokiner, der det ene eller de flere glykosyleringsseter er lokalisert fjernt fra et eller flere reseptorbindingsdomener av cytokinet.

Egnede polymerer for bruk ved disse metoder ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, et eller flere polyalkylenglykoler (inkludert, men ikke begrenset til et eller flere poly(etylenglykoler), et eller flere monometoksypoly(etylenglykoler) og et eller flere monohydroksypoly(etylenglykoler)), et eller flere polyalkylenoksider, et eller flere polyoksiraner, et eller flere polyolefiniske alkoholer som polyvinylalkohol, et eller flere polykarboksylater, et eller flere poly(vinylpyrrolidoner), et eller flere poly(oksyetylenoksymetylener), en eller flere poly(aminosyrer), en eller flere polyakryloylmorfoliner, en eller flere kopolymerer av et eller flere amider, og et eller flere alkylenoksider, et eller flere dekstraner og en eller flere hyaluronsyrer. Polymerer egnet for bruk ved metodene ifølge oppfinnelsen har typisk molekylvekter mellom rundt 1 kDa og rundt 100 kDa, eller mer spesielt molekylvekter mellom rundt 8 kDa og rundt 14 kDa, mellom rundt 10 kDa og rundt 30 kDa, rundt 18 kDa til rundt 22 kDa, og særlig rundt 20 kDa eller rundt 30 kDa.

Et antall cytokiner og analoger som etterligner (dvs. agoniserer) eller antagoniserer den biologiske virkning av det tilsvarende cytokin som er mediert med sin spesifikke celleoverflate reseptorer er egnet for bruk ved fremstilling av de foreliggende konjugater. Disse inkluderer cytokiner med en fire heliks buntstruktur (inkludert, men ikke begrenset til granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF), makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF), granulocyt-makrofag kolonostimulerende faktor (GM-CSF), leukemi inhibitorisk faktor (LTF), erytropoietin (Epo), trombopoietin (Tpo), stamcelle faktor (SCF), Flt3-ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 subenhet), IL-13, IL-15, IL-17, interferon-a (IFN-a), interferon-P (IFN-P) (særlig IFN-P-lb), konsesusinterferon og muteiner, varianter, analoger og derivater derav) og cytokiner med en P-ark- eller P-løp struktur (inkludert, men ikke begrenset til, tumornekrosefaktor-a (TNF-a), IL-la, IL-ip, IL-12 (p40 subenhet), IL-16, epidermal vekstfaktor (EGF), insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF-1), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), sur FGF, FGF-4 og keratinocyt vekstfaktor (KGF, FGF-7) og muteiner, varianter, analoger og derivater derav).

Det er beskrevet foretrukne cytokiner som er egnet for bruk, disse inkluderer IL-2, IFN-a, IFN-P, IGF-1, EGF og bFGF. Også spesielt egnet for bruk er kompetitive antagonister av de foregående cytokiner så vel som muteiner, varianter og derivater av disse cytokiner.

I visse utførelsesformer blir den ene eller de flere polymerer kovalent koblet (særlig via en sekundær aminbinding) til a-aminogruppen av aminoterminal aminosyren og cytokinet. I andre utførelsesformer blir den ene eller de flere polymerer kovalent koblet til en kjemisk aktiv reaksjons sidekjedegruppe (for eksempel en hydroksyl-, sulfhydryl-, guanidino-, imidazol-, amino- eller karboksylgruppe eller et aldehydderivat) av aminoterminal aminosyren på cytokinet. Ved ytterligere utførelsesformer etterligner koblingen av polymeren til cytokinet på aminoterminale aminosyren ved eller nær et eller flere glykosyleringsseter de fordelaktige effekter av glykosylering av cytokinet. I relaterte utførelsesformer etterligner koblingen av polymeren til cytokinet ved eller nær et eller flere glykosyleringsseter på cytokin de fordelaktige effekter ved hyperglykosylering av cytokinet, der "hypoglykosylering" antyder kovalent festing av enkle eller komplette karbohydratdeler, i tillegg til de som er tilstede i den native struktur.

Oppfinnelsen tilveiebringer også konjugater fremstilt ved metodene ifølge oppfinnelsen. Konjugater ifølge oppfinnelsen omfatter et valgt cytokin eller en valgt antagonist av denne (som beskrevet ovenfor), koblet til en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer (som beskrevet ovenfor), der den ene eller flere polymerer er koblet til aminoterminalen aminosyren av cytokinet og der aminoterminal aminosyren befinner seg fjernt fra en eller flere reseptorbindingsdomener av det valgte cytokin. I tillegg omfatter konjugater ifølge oppfinnelsen er valgt cytokin eller en valgt antagonist mot denne (som beskrevet ovenfor), koblet til en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer (som beskrevet ovenfor), der det ene eller de flere polymerer er koblet til et eller flere glykosyleringsseter av det valgte cytokin og der det ene eller de flere glykosyleringsseter befinner seg fjernt fra den ene eller de flere reseptorbindingsdomener og cytokiner. For konjugater av agonister ifølge oppfinnelsen er det foretrukket at setet eller setene av polymer festning er fjernt fra alle reseptorbindende domener. For polymerkonjugater og visse antagonister ifølge oppfinnelsen kan det være fordelaktig at setet eller setene for polymerfesting ligger fjernt fra visse reseptorbindingsdomener som er essensielle for at binding skal skje, men ikke nødvendigvis fjernt fra alle reseptorbindingsdomener som er essensielle for signaltransduksjon av agonister. Oppfinnelsen tilveiebringer også preparater, og særlig farmasøytiske preparater, omfattende et eller flere av konjugatene ifølge oppfinnelsen og en eller flere ytterligere komponenter som en eller flere farmasøytisk akseptable diluenter, eksipienter eller bærere. Oppfinnelsen tilveiebringer også kit omfattende et eller flere av konjugatene, preparatene og/eller de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også metoder for prevensjon, diagnose eller terapi av fysiske lidelser hos et pattedyr (for eksempel et pattedyr slik som menneske), som lider av eller er predisponert for en fysisk lidelse. Slike metoder kan for eksempel omfatte administrering til dyr av en effektiv mengde av et eller flere konjugater, preparater eller farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen. Fysiske lidelser som hensiktsmessig behandles eller forhindres ifølge slike metoder ifølge oppfinnelsen inkluderer, cancere (for eksempel bryst-, uterin-, ovarie-, prostata-, testikkel- eller lungecancer, leukemi, lymfom, kolon-, gastrointestinal-, pankreatisk-, blære-, nyre-, ben-, neurologisk-, hode- eller hals cancer, en hud cancer, et sarkom eller karsinom, et adenom eller myelom); infeksiøse sykdommer (for eksempel bakterielle, fungale eller parasittiske sykdommer og virale sykdommer (som viral hepatitt, en sykdom forårsaket av kardiotropisk virus, HIV/AIDS, og lignende)); og genetiske lidelser (for eksempel anemi, neutropeni, trombocytopeni, hemofili, dvergvekst og alvorlig kombinert immunodefektsykdom ("SCJD"); autoimmune lidelser (for eksempel psoriasis, systemisk lupus ertytematose og reumatoid artritt) og neurodegenerative lidelser (for eksempel forskjellige former og trinn av multiple sklerose ("MS") som relapserende-remitterende MS, primær progressiv MS og sekundær progressiv MS; Creutzfeldt-Jakob sykdom; Alzheimers sykdom og lignende.

Det beskrives også metoder for å bestemme mengden av en polymer som er festet til aminoterminus av et protein med en N-terminal serinrest, i et polymerprotein konjugat som er syntetisert ved reduktiv alkylering. Metoder ifølge dette aspekt ved oppfinnelsen omfatter for eksempel

(a) omsetning av konjugatet med en tilstrekkelig mengde av et oksidasjonsmiddel i

et tilstrekkelig tidsrom til å spalte polymeren fra serinrestene og proteinet; og (b) måling av økningen av andelen ikke-konjugert protein i preparatet. Proteiner som er egnet for anvendelse i henhold til slike metoder inkluderer, men er ikke begrenset til, cytokiner (inkludert interferon-P (særlig interferon-P-lb, som fortrinnsvis har aminosyresekvensen som er spesifisert i Sekv. Id. Nr. 1) og megakaryocyt vekst og utviklingsfaktor). Det oksiderende middel som benyttes i visse slike metoder ifølge oppfinnelsen kan være et perjodat som inkluderer, men ikke er begrenset til natrium-, kalium- eller litiummetaperijodat eller kalsium- eller bariumperjodat eller perjodsyre. Egnede metoder for måling av økningen i andelen av ikke-konjugerte proteiner i preparatet inkluderer en hvilken som helst varietet av kjente metoder for protein- og peptidanalyse, inkludert for eksempel tørrelseseksklusjonskromatografi, reversfase kromatografi, gelelektroforese, kapillær elektroforese, ultrasentrifugering, ultrafiltrering, lysspredning og massespektroskopi.

Det beskrives ogsåmetoder for selektiv, oksidativ spalting av en N-terminal serinrest av en bioaktivt protein uten å oksidere funksjonelt essensielle aminosyrerester i nevnte bioaktive protein. Visse slike metoder ifølge oppfinnelsen omfatter for eksempel (a) å justere hydrogenionekonsentrasjonen av en oppløsning av det bioaktive protein til en pH-verdi mellom rundt 5 og rundt 10, helst en pH-verdi mellom rundt 7 og rundt 5; (b) blanding av oppløsningen av bioaktivt protein rundt 0,1 mol til rundt 10 mol, og helst med rundt 0,5 mol til rundt 5 mol, av et perjodat per mol bioaktivt protein;

og

(c) innkubering av blandingen i minst 1 time, fortrinnsvis ved en temperatur mellom rundt 2°C og rundt 40°C. Proteinene som er egnet for bruk ifølge slike metoder er, men er ikke begrenset til, cytokiner (inkludert interferon-P (særlig interferon-P-lb som fortrinnsvis har aminosyresekvensen som spesifisert i Sekv. Id. Nr.

<!>))•

Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for å øke den biologiske potens av et preparat av interferon-P, og særlig et preparat av interferon-P-lb, omfattende fjerning av en eller flere inhibitoriske komponenter i et interferon-P (eller interferon-P-lb) preparat. I henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan den ene eller de flere inhibitoriske komponenter fjernes fra preparatet ved et antall velkjente metoder for protein- og peptidprosessering, -rensing og/eller analyse, inkludert, men ikke begrenset til en eller flere kromatografiske metoder som størrelseseksklusjons kromatografi, reversfase kromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi og affinitetskromatografi. Bestemmelsen av den biologiske potens for et gitt preparat av interferon-P (dvs. hvorvidt potensen økes, reduseres eller ikke er påvirket, i forhold til en forrådsoppløsning av interferon-P) kan oppnås ved en hvilken som helst av et antall in vitro- eller in vivo-analyser som vil være velkjente for fagmannen. For eksempel kan en cellekultur analyse som responderer på interferon-P benyttes for å bestemme den biologiske potens av interferon-P preparater. Ikke-begrensende eksempler på slike egnede cellekultur analyser inkluderer antiproliferative analyser, antivirale analyser, signaltransduksjonsanalyser og genaktiverings analyser, eksempler på hvilke er velkjente for fagmannen på området.

Andre foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen vil fremgå for fagmannen i lys av de følgende figurer og beskrivelsen av oppfinnelsen samt fra kravene.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser molekylære modeller og forskjellige cytokiner og vekstfaktorer skapt ved RasMol program (RA. Sayle et al. (1995) Trends Biochem Sei 20:374-376) basert på krystallografiske data. Hver av modellene er representert i "bånd"- eller "carton" format, bortsett fra for visse rester av spesiell interesse som er vist i "kule-og-stav" format. Disse formater er muligheter som er valgt ved bruk av RasMol programmet. De mørke deler av båndene representerer domener av cytokinene og vekstfaktoren som er rapportert å være involvert i bindingen til sine reseptorer. For hver struktur er aksesskoden i Protein Data Bank ("PDB") antydet (se RA. Laskowski

(2001) Nucleic Acids Res 29:221-222; M.C. Peitsch (2002) Bioinformatics 18:934-938;

C.H. Schein (2002) Curr Pharm Des 8:2113-2129).

Figur 1 viser en molekylær modell av human interferon-P-1 (se Sekv. Id. Nr. 2), der flere lysinrester som ligger innenfor eller er nabo til reseptorbindingsdomenet er indikert (Lys 19, Lys 33, Lys 99 og Lys 134). I tillegg er glykosyleringssetet (Asn 80) og den N-terminale metioninrest ("Met 1") vist i "kule-og-stav" format (basert på data fra M. Karpusas et al. (1997) Proe Nati Acad Sei USA 94:11813-88818; M. Karpusas et al., (1998) Cell Mol Life Sei 54:1203-1216; L. Runkel et al., (2000) Biochemistry 39:2538-2551). Met 1 er fjernt fra bindingssetene 1 og 2, mens flere lysinrester befinner seg innen de reseptorbindende domener (PDB kode 1AUI). Strukturen for interferon-P-lb (se Sekv. Id. Nr. 1) skiller seg fra den til interferon-P-la ved at den mangler den N-terminale metioninrest og karbohydratdelen så vel som at den har en serinrest i stedet for den ikke-parrede cysteinrest (Cys 17 av Sekv. Id. Nr. 2). Figur 2 viser oppløsningen ved størrelseseksklusjons HPLC av interferon-P-lb ("IFN") fra sine konjugater dannet ved reduktiv alkylering med 20 kDa mPEG-aldehyd ved forskjellig input-konsentrasjoner ("lx", "2x" eller "4x") med natriumcyanoborhydrid (NaBHsCN) som reduksjonsmiddel. Konjugater inneholdende en tråd av PEG ("PEGi-IFN") eller to tråder ("PEG2-IFN") oppløses fra IFN hvortil PEG ikke var koblet under disse betingelser ("Mock PEGylert IFN"). Figur 3 viser den oksidative spalting med natriumperjodat av rundt 90% PEGi-IFN-P-syntetisert ved reduktiv alkylering under forskjellige betingelser. Størrelseseksklusjons HPLC i nærvær av natriumdodecylsulfat ("SDS") oppløste gjenværende PEGi-IFN-P fra spaltningsproduktene, inkludert formaldehyd og IFN hvori det N-terminale serin var spaltet til et aldehyd ("IFN-aldehyd"). Figur 4 viser oppløsningen ved reversfase kromatografier av PEGi-IFN-P fra Mock PEGylert IFN-P, ikke bundet PEG, ikke-bundet SDS og mindre komponenter i reaksj onsblandingen. Figur 5 viser resultatet av analytisk reversfase ("RP") kromatografi av en PEGyleringsreaksjonsblanding og fraksjoner fra en preparativ RP-kolonne som ble anriket på PEGi-IFN-P (Fraksjon 51) henholdsvis med Mock PEGylert IFN-P (Fraksjon 53). Figur 6 viser resultatene fra elektroforetisk analyser av en PEGylerings reaksjonsblanding og fraksjoner fra en preparativ RP-kolonne som er anriket enten på PEGi-IFN-P (Fraksjon 51) eller på konjugater inneholdende mer enn en tråd av PEG (Fraksjon 49). Gelen ble farget for protein med et fluorescent fargestoff og fotografert med ultrafiolett belysning. Intensiteten for flekken ble målt med Kodak ID billedsopptaksprogram. Figur 7 viser resultatene av elektroforetiske analyser av de samme prøver som i Figur6, bortsett fra at gelen ble farget for PEG med en reagens inneholdende BaCb, h og Kl. Intensiteten for flekken på fotografiet av gelen ble målt som i Figur 6. En topp med gjenværende fri 20-kDa PEG kan detekteres i reaksj onsblandingen. Figur 8 viser reversfase kromatogrammer av prøver av IFN-P-lb som enten var ubehandlet (toppkurven) eller innkubert med 0,5 mM NaIC>4, som spaltet N-terminal serinrestene både fra hoved- og de mindre komponenter til aldehydderivater (middel kurver) eller oksidert med NaIC>4og omsatt med 9-fluorenylmetylkarbazat ("Fmoc-karbazat"). Den mindre komponent ("Topp A") inneholder en oksidert metioninrest. Den tilsvarende økning i retensjonstiden for både Topp A og hovedkomponentene etter oksidasjon, reflekterer spaltingen av N-terminal serinrestene i hver topp til et aldehyd. Ingen økning i prosentandelen Topp A ble detektert etter innkubering med NaI04under disse betingelser. Dannelsen av Fmoc-konjugater fra de oksiderte former av Topp A og hovedkomponenten er indikert ved økningen i retensjonstid og absorbansene etter reaksjon med Fmoc-karbazat. Figur 9 viser syntesen av PEGi-IFN-P ved omsetning av 20-kDa PEG-karbazat med aldehydderivatet av IFN-p. De økende andeler av konjugatet som detekteres etter innkubering av proteinet med 0,125 mM NalCU ved romtemperatur i 0,5, 1 henholdsvis 2 timer antyder at fullstendig konvertering av N-terminal serinet til aldehyd krever mer enn 1 time under disse betingelser. PEGi-IFN-P ble ufullstendig oppløst fra 20-kDa PEG-karbazat på denne størrelses eksklusjonskolonne. Figur 10 viser den større antiproliferative potens på human Burkitts lymfomceller (Daudi-celler) for fortynninger av PEGi-IFN-P som var renset ved reversfase kromatgrafi (Fraksjon 51,karakteriserti Figurene 5-7), enn den til fortynninger av forrådsoppløsningene av IFN-p. Konsentrasjonen av renset PEGi-IFN-P som var nødvendig for å inhibere 50% av den inhibiterbare vekst av disse celler var rundt 40 pg/ml, noe som er rundt 1/6 av det som kreves for forrådsoppløsningen av IFN-p. Konsentrasjonen av renset Mock PEGylert IFN-P (Fraksjon 53 fra det reversfase kromatogram som er vist i Figur 5) krevet, for inhibering av 50% av den inhiberbare vekst av disse celler, rundt 80 pg/ml, noe som er rundt 1/3 av det som kreves for forrådsoppløsningen av IFN-P.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Hvis ikke annet er sagt, har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som benyttes i beskrivelsen samme betydning som vanlig for fagmannen på området som oppfinnelsen tilhører. Selv om metoder og materialer som er tilsvarende eller ekvivalente med de som er beskrevet, også kan benyttes ved gjennomføring eller testing av oppfinnelsen, er de foretrukne metoder og materialer beskrevet nedenfor.

Definisjoner

Rundt: Som benyttet her, når det henvises til en hvilken som helst nummerisk verdi, betyr uttrykket "rundt" eller tilsvarende en verdi på +10% av den angitte verdi (f.eks. "rundt 50°C" angir et temperaturområde fra og med 45 til og med 55°C, "rundt 100 mM" omfatter et konsentrasjonsområde fra og med 90 til og med 110 mM).

Aminosyrerest: Som benyttet her, henviser uttrykket "aminosyrerest" til en spesifikk aminosyre, vanligvis dehydratisert som et resultat av involveringen i to peptidbindinger, i et polypeptidskjellett eller en sidekjede, men også når aminosyren er involvert i en peptidbinding slik dette inntrer ved hver ende av en lineær polypeptidkjede. Aminosyrerestene angis ved de tre-bokstav koder eller enkelt-bokstav koder som er vanlige i teknikken.

Antagonist: Som benyttet her, henviser uttrykket "antagonist" til en forbindelse, molkeyl, en del eller et kompleks som reduserer, vesentlig reduserer eller fullstendig inhiberer den biologiske og/eller fysiologiske effekt av et gitt cytokin på en celle, et vev eller en organisme som er mediert via reseptorene for det gitte cytokin. Antagonister kan utføre slike effekter på et antall måter inkludert, men ikke begrenset til konkurranse med agonisten for bindingsseter eller reseptorer på celleoverflaten som interagerer med agonisten på en måte for å redusere, i det vesentlige redusere eller fullstendig å inhibere evnen hos agonisten til å binde til celleoverflate reseptorene; binding til og indusering av en konformasjonell forandring i celleoverflatereseptorene slik at reseptorene antar en struktur hvortil en agonist ikke lenger kan binde (eller kun kanbinde med redusert eller vesentlig redusert affinitet og/eller effektivitet); indusering av en fysiologisk forandring (f. eks. økning i intracellulære signaleringskomplekser; økning i transkripsjonelle inhibitorer; reduksjon i celleoverflate ligand reseptorekspresjon; osv) i celler, vev eller organismer, slik at bindingen av agonisten, eller det fysiologiske signal som induseres av agonisten ved binding til cellen reduseres, reduseres vesentlig eller fullstendig inhiberes; og andre mekanismer ved hvilke antagonistene kan utføre sine aktiviteter og som vil være velkjente for fagmannen. Som fagmannen vil vite, kan en antagonist ha en struktur lik liganden den antagoniserer (f. eks. kan antagonisten være et mutein, en variant, et fragment eller et derivat av agonisten), eller kan ha en fullstendig ikke-relatert struktur.

Bioaktiv komponent: Som benyttet her, henviser uttrykket "bioaktiv komponent" til en forbindelse, et molekyl, et del eller et kompleks som har en spesiell biologisk aktivitet in vivo, in vitro eller ex vivo på en celle, et vev, et organ eller organisme, og som er i stand til å kunne bindes til et eller flere polyalkylenglykoler for å danne konjugatene ifølge oppfinnelsen. Foretrukne, bioaktive komponenter inkluderer, men er ikke begrenset til proteiner og polypeptider som de som er beskrevet her.

Bundet: Som benyttet her, henviser uttrykket "bundet" til binding eller festing som kan være kovalent, f.eks. ved kjemisk kobling, eller ikke-kovalent, f.eks. ioniske interaksjoner, hydrofobe interaksjoner, hydrogenbindinger osv. Kovalente bindinger kan f. eks. være ester-, eter-, fosfoester-, tioester-, tioeter- uretan-, amid-, amin-, peptid-, imid-, hydrazon-, hydrazid-, karbon-svovelbindinger, karbon-fosforbindinger og lignende. Uttrykket "binding" er bredere enn og inkluderer uttrykk som "koblet", "konjugert" og "festet".

Konjugat/konjugering: Som benyttet her, henviser "konjugat" til produktet av en kovalent festing av en polymer, f. eks. PEG eller PEO, til en bioaktiv komponent, f. eks. et protein eller glykoprotein. "Konjugering" henviser til dannelsen av et konjugat som definert i setningen ovenfor. En hvilken som helst metode som vanligvis benyttes av fagmannen på området for konjugering av polymerer til biologisk aktive materialer, kan benyttes ifølge oppfinnelsen.

Koblet: Uttrykket "koblet", som het benyttet, henviser til festing ved kovalent binding eller ved sterke ikke-kovalente interaksjoner, typisk og fortrinnsvis til festing ved kovalente bindinger. En hvilken som helst metode som vanligvis benyttes av fagmannen for kobling av biologisk aktive materialer kan benyttes ifølge oppfinnelsen.

Cytokin: Som benyttet her, er uttrykket "cytokin" definert som et utskilt, regulatorisk protein som kontrollerer overlevelses-, vekst-, differensierings-, og/eller effektorfunksjonen i celler, på endokrin, parakrin eller autokrin måte (for en oversikt henvises det til N.A. Nicola, supra; A.A. Kossiakoff et al., supra (1999) Adv Protein Chem 52:67-108). I henhold til denne definisjon inkluderer cytokiner interleukiner, kolonistimulerende faktorer, vekst-faktorer og andre peptidfaktorer som produseres av et antall celler inkludert, men ikke begrenset til de som spesifikt er beskrevet eller eksemplifisert her. På samme måte som de nær beslektede polypeptid hormoner og vekstfaktorer initierer cytokiner sine regulatoriske funksjoner ved binding til spesifikke reseptorproteiner på overflaten av målcellene.

Sykdom, lidelse, tilstand: Som benyttet her, betyr uttrykkene "sykdom" eller "lidelse" en hvilken som helst ugunstig tilstand hos et dyr eller menneske, inkludert tumorer, cancer, allergier, addiksjon, autoimmunitet, infeksjon, forgiftning eller forringelse av optimal mental eller legemlig funksjon. "Tilstander" som benyttet her inkluderer sykdommer og lidelser, men henviser også til fysiologiske tilstander. F. eks. er fertilitet en fysiologisk tilstand, men ikke en sykdom eller lidelse. Preparater ifølge oppfinnelsen som er egnet for å forhindre pregnans ved å redusere fertiliteten vil derfor beskrives som en behandling av en tilstand (fertilitet), men ikke som behandling av en sykdom eller lidelse. Andre tilstander vil forstås av fagmannen.

Effektiv mengde: Som benyttet her, betyr uttrykket "effektiv mengde" en mengde av et gitt konjugat eller et preparat som er nødvendig eller tilstrekkelig til å realisere en ønsket, biologisk effekt. En effektiv mengde av et gitt konjugat eller et preparat ifølge oppfinnelsen vil være den mengde som gir det valgte resultat og en slik mengde kan bestemmes rutinemessig av fagmannen ved bruk av analyser som er velkjente i teknikken og/eller som er beskrevet her, uten behovet for urimelige forsøk. F.eks. kan en effektiv mengde for behandling av en immunsystem defekt være den mengde som er nødvendig for å gi aktivering av immunsystemet og resultere i utvikling av en antigen spesifikk immunrespons ved eksponering til et antigen. Uttrykket er også synonymt med "tilstrekkelig mengde". Den effektive mengde for en hvilken som helst anvendelse kan variere av faktorer som sykdommen eller tilstanden som behandles, det spesielle preparat som administreres, administreringsmodus, individets størrelse og/elelr alvor av sykdommen eller tilstanden. En fagmann på området kan lett empirisk bestemme den effektive mengde av et spesielt konjugat eller preparat ifølge oppfinnelsen uten urimelige forsøk.

Et eller flere: Når uttrykkene "en" eller "et" benyttes ifølge oppfinnelsen menes "minst en" eller "en eller et eller flere" eller hvis ikke annet er sagt.

PEG: Som benyttet her, inkluderer "PEG" alle polymerer av etylenoksid, uansett om de er lineære eller forgrenede eller multi-armede eller ende-dekkede eller hydroksylavsluttede. "PEG" inkluderer de polymerer som er velkjente i teknikken som poly(etylenglykol), metoksypoly(etylenglykol) eller mPEG eller poly(etylenglykol)-monometyleter, alkoksypoly(etylenglykol), poly(etylenoksid) eller PEO, a-metyl-co-hydroksypoly(oksy-l,2-etandiyl) og polyoksiran, blant andre navn som benytter teknikken for polymerer av etylenoksid.

PEGylering, PEGylert og Mock PEGylert: Som benyttet her, henviser "PEGylering" til en hvilken som helst prosess for kovalent kobling av PEG til et bioaktivt målmolekyl, og særlig et reseptorbindende protein. Konjugatet som derved produseres angis som "PEGylert". Som benyttet henviser "Moe PEGylert" til den del av proteinet i en PEGyleringsreaksjonsblanding hvortil intet PEG kovalent er festet. Ikke desto mindre kan Mock PEGylerte produkt være blitt endret under reaksjonen eller etterfølgende rensetrinn, f.eks. som en konsekvens av eksponering til reduksjonsmiddelet under PEGyleringen ved reduktiv alkylering og/eller ved å ha et eller flere inhibitoriske midler, forbindelser osv. Fjernet under prosess- og/eller rensetrinn.

Polypeptid: Som benyttet her, henviser uttrykket "polypeptid" til et molekyl bestående av monomerer (aminosyrer) som lineært er forbundet via amidbindinger (også kjent som peptidbindinger). Uttrykket antyder en molekylær kjede av aminosyrer og henviser ikke til noen spesiell mengde av produktet. Således er peptider, dipeptider, tripeptider, oligopeptider og proteiner inkludert innen definisjonen av polypeptid. Dette uttrykk er også ment å henvise til fremstilling av post-ekspresjonsmodifikasjoner av polypeptider, f. eks. glykosylering, hyperglykosylering, acetylering, fosforylering o.l. Et polypeptid kan være avledet fra en naturlig, biologisk kilde, eller fremstilt ved rekombinant DNA-teknologi, men er ikke nødvendigvis translaterte fra noen designert nukleinsyresekvens. Det kan være generert på en hvilken som helst måte, inkludert kjemisk syntese.

Protein og glykoprotein: Som benyttet her, henviser uttrykket "protein" til et polypeptid, generelt med en større over rundt 10 eller flere, 20 eller flere, 25 eller flere, 50 eller flere, 75 eller flere, 100 eller flere, 200 eller flere, 500 eller flere, 1000 eller flere eller 2000 eller flere aminosyrer. Proteiner har generelt en definert, tre-dimensjonal struktur, selv om de ikke nødvendigvis har en slik struktur, og angis ofte som folede, i motsetning til peptider og polypeptider, som ofte ikke har noen definert, tre-dimensjonal struktur, men som heller kan adoptere et stort antall forskjellige konformasjoner og som også angis som ikke foldet. Peptider kan imidlertid også ha definert, tre-dimensjonal struktur. Som benyttet her, henviser uttrykket glykoprotein til et protein som er koblet til minst en karbohydrat del som er festet til proteinet via en oksygenholdig eller en nitrogenholdig sidekjede av en aminosyrerest, f. eks. en serinrest eller asparaginrest.

Fjernt: Som benyttet her, henviser uttrykket "fjernt" (som i "fjern N-terminal aminosyre" eller "fjernt glykosyleringssete") til en struktur der lokasjonen av et eller flere festeseter for en eller flere polymerer på et protein er distalt til eller rommelig fjernt fra et eller flere reseptor bindingsområder eller -domener for proteinet, bedømt ved molekylær modellering. Konjugering av en polymer ved et slikt fjernt festesete

(vanligvis N-terminal aminosyre (for reseptorbindingsproteiner som derfor angis som "fjern N-terminal" eller "RN" reseptorbindingsproteiner) eller en eller flere karbohydratdeler eller glykosyleringsseter på et glykoprotein (for reseptorbindingsproteiner som derfor angis som "fjern glykosylering" eller "RG" reseptorbindingsproteiner)) som ikke forårsaker vesentlig sterisk hindring av bindingen av proteinet til sin(e) reeptor(er). Således sies en aminoterminal aminosyre eller et glykosyleringssete på et cytokin å være "lokalisert fjernt fra et eller flere reseptorbindings domener" av cytokinet når konjugering (f.eks. kovalent festing) av en vannoppløselig polymer til aminoterminal aminosyren henholdsvis glykosyleringssetet ikke interfererer vesentlig med evnen hos cytokinet til å binde til sin eller sine reseptorer, særlig til celleoverflate reseptorer. Det skal selvfølgelig være klart at et gitt cytokin kan inneholde mer enn et reseptorbindingsdomene. I slike situasjoner kan en aminoterminal aminosyre eller et glykosyleringssete hos et cytokin være lokalisert fjernt fra et slikt domene eller fra mer enn et slikt domene, og allikevel anses å være "lokalisert fjernt fra et eller flere reseptorbindingsdomener" så lenge konjugeringen av aminoterminal aminosyre eller glykosyleringssetet ikke interfererer vesentlig med bindingen av cytokinet til sin eller sine reseptorer, via et eller flere av reseptorbindingsdomenene. Om konjugeringen interfererer vesentlig med evnen hos et protein til å binde til sin eller sine reseptorer kan lett bestemmes ved bruk av kjente analyser av ligandreseptorbinding som vil være velkjent for fagmannen på området.

PEG er en sterkt utstrakt og fleksibel polymer som opptar et stort volum i oppløsningen i forhold til et protein med tilsvarende molekylvekt. Selv om aminosyreresten hvortil PEG er festet kan ligge fjernt fra et eller flere reseptorbindingsseter, kan deler av polymeren derfor ikke desto mindre interferere, i en viss grad, med reseptorbindingen. Sannsynligheten for slike interferenser øker med molekylvekten og derved med det volum som opptas av polymeren i oppløsning. I ethvert tilfelle, vil målrettet festing av PEG til et eller flere seter som er fjernt fra reseptorbindingsområdet eller -områdene interferere mindre med funksjonen av cytokinet enn vilkårlig PEGylering.

Metoder for å bedømme ligandreseptorbindinger inkluderer, uten begrensning, kompetitiv bindingsanalyse, radioreseptor bindingsanalyse, cellebaserte analyser, overflateplasmon resonansmålinger, dynamisk lysspredning, ultrasentrifugering og ultrafiltrering.

Vesentlig og lignende: Som benyttet her, sies konjugeringen av et protein ikke å interferere "vesentlig" med proteinets evne til å binde til sin eller sine reseptorer hvis graden eller mengden av binding av et konjugert protein til en reseptor ikke er mindre enn rundt 40%, rundt 50%, rundt 60%, rundt 65%, rundt 70%, rundt 75%, rundt 80%, rundt 85%, rundt 90%, rundt 91%, rundt 92%, rundt 93%, rundt 94%, rundt 95%, rundt 96%, rundt 97%, rundt 98%, rundt 99% eller rundt 100% eller mer, av bindingsgraden og/eller mengden av det tilsvarende cytokin som ikke er konjugert.

Behandling: Som benyttet her betyr uttrykkene "behandling", "behandle", "behandlet" eller tilsvarende til profylakse og/eller terapi. Benyttet med henblikk på en infeksiøs sykdom kan for eksempel uttrykket henvise til en profylaktisk behandling som øker resistensen hos et individ mot infeksjon av et patogen eller, med andre ord, som reduserer sannsynligheten for at individet vil bli infisert med patogenet eller vil vise tegn på sykdom som kan skyldes infeksjonen, så vel som behandling etter at individet er infisert for å kjempe mot infeksjonen, for eksempel for å redusere eller eliminere infeksjonen eller forhindre at den blir verre.

Oversikt

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer metoder for syntese av polymerkonjugater av reseptorbindingsproteiner som bibeholder uventet høy reseptorbindingsaktivitet i forhold til polymerkonjugater av samme reseptorbindingsprotein og hvori et eller flere polymerer er festet tilfeldig. Via bruken av røntgenkrystallografi- og NMR-basert strukturanalyser, mutasjonelle analyser og molekylær modelleringsprogrammer har foreliggende oppfinnere identifisert målseter for PEGylering av cytokiner som er involvert eller som ikke er involvert i binding til sine reseptorer. Som en klasse av proteiner er disse cytokiner her angitt som reseptorbindende proteiner. Ved valg av en syntetisk strategi som sitter på polymerfesting til området eller områdene av reseptorbindende proteiner som ikke er involvert i reseptorinteraksjoner, unngås visse uønskede, steriske hindringer og de resulterende polymerkonjugater bibeholder uvanlig høy potens. De reseptorbindingsproteiner som har en aminoterminal rest som er fjernt fra et eller flere av reseptorbindingsområdene eller -domenene er her angitt som "fjern N-terminal"- eller "RN"-reseptorbindingsproteiner; de inkluderer alle cytokiner eller antagonister derav som har sine aminoterminale aminosyrer lokalisert fjernt fra reseptorbindingssetet eller -setene av proteinet.

I ytterligere utførelsesformer av oppfinnelsen fremstilles det konjugater omfattende en eller flere syntetiske polymerer (for eksempel et eller flere poly(etylenglykoler)) kovalent koblet til cytokiner som har naturlige glykosyleringsseter som er fjernt fra et eller flere av deres reseptorbindingsområder eller -domener. I henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen vil de bioaktive komponenter (for eksempel cytokiner) i konjugaten vise godt bevarte reseptorbindingsaktiviteter når syntetiske polymerer kobles i området for glykosyleringssetet(ene). Dette undersett av reseptorbindingsproteiner angis her som "RG"-reseptorbindingsproteiner. Når en hydrofil eller amfipatisk polymer kobles selektivt ved eller nær et "fjernt glykosylerings"-sete, særlig når målproteinet er en ikke-glykosylert form av et protein som er naturlig glykosylert, kan polymeren etterligne de gunstige effekter av det naturlig forekommende karbohydrat, for eksempel når det gjelder aggregering, stabilitet og/eller oppløselighet. Derfor angis festing av polymeren ved eller nær et glykosyleringssete her som "pseudoglykosylering". Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse metoder for syntese av konjugater hvori den seteselektive kobling av en syntetisk polymer effektivt erstatter de naturlig forekommende karbohydratdeler. Den resulterende pseudoglykosylering bidrar til forbedret oppløselighet, redusert aggregering og forsinket klaring fra blodstrømmen sammenlignet med andre, ikke-glykosylerte former av proteiner. Denne vei er derfor spesielt fordelaktig for fremstilling av konjugater og preparater av proteiner som fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi i prokaryotiske vertsceller (for eksempel bakterier som Escherichia coli), fordi prokaryotiske organismer generelt ikke glykosylerer proteinene de uttrykker.

Analogt kan selektiv PEGylering av karbohydratdelen av et glykoprotein resultere i "pseudohyperglykosylering" av glykoproteinet. Denne prosess er for eksempel beskrevet av C. Bona et al. i WO 96/40731,. Denne vei er derfor spesielt fordelaktig for fremstilling av konjugater og preparater av proteiner som fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi i eukaryotiske vertsceller (for eksempel i gjær- eller planteceller eller dyreceller (inkludert pattedyr- og innsektsceller), fordi eukaryotiske organismer generelt glykosylerer proteinene de uttrykker hvis disse proteiner inkluderer naturlig forekommende glykosyleringssignaler eller glykosyleringssignaler innføres ved rekombinant DNA-teknologi. Slike pseudoglykosylerte og pseudohyperglykosylerte RG reseptorbindingsproteiner ligger innenfor rammen av oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således også polymerkonjugater av "RN" resptorbindingsproteiner som bibeholder vesentlig, så å si vesentlig, eller i det vesentlige fullstendig reseptorbindingsaktivitet og pseudoglykosylerte eller pseudohyperglykosylerte "RG"-reseptorbindingsproteiner som bibeholder vesentlig, så å si fullstendig, eller nær fullstendig reseptorbindingsaktivitet. Som benyttet her, sies et cytokin å "bibeholde vesentlig, så å si fullstendig eller i det vesentlige fullstendig reseptorbindingsaktivitet" når konjugert med en eller flere vannoppløslige polymerer ifølge oppfinnelsen, hvis konjugeringen av cytokinet ikke interfererer vesentlig med proteinets evne til å binde til reseptoren(e), dvs. hvis graden og/eller mengden av binding av konjugerte proteiner til den eller de tilsvarende reseptorer ikke er mindre enn rundt 40%, rundt 50%, Rundt 60%, rundt 65%, rundt 70%, rundt 75%, rundt 80%, rundt 85%, rundt 90%, rundt 91%, rundt 92%, rundt 93%, rundt 94%, rundt 95%, rundt 96%, rundt 97%, rundt 98%, rundt 99% eller rundt 100% eller mer, av bindingsgraden og/eller -mengden av en ikke-konjugert form av det tilsvarende protein. Også innenfor rammen av oppfinnelsen er det polymerkonjugater av de reseptorbindingsproteiner som er klassifisert både som "RN"- og "RG"-reseptorbindingsproteiner. To eksempler på de sistnevnte proteiner er interferon-P (og særlig interferon-P-lb) og IL-2.

I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for syntese av polymerkonjugater av reseptorbindingsproteiner som bibeholder uventet høy reseptorbindingsaktivitet i forhold til polymerkonjugater av det samme reseptorbindingsprotein der en eller flere polymerer er festet tilfeldig. Oppfinnelsen tilveiebringer også konjugater som fremstilles ved slike metoder samt preparater omfattende et eller flere av disse konjugater ifølge oppfinnelsen som ytterligere kan omfatte en eller flere ytterligere komponenter eller reagenser som et eller flere buffersalter, en eller flere karbohydratresipienter, et eller flere bærerproteiner, et eller flere enzymer, en eller flere detergenser, et eller flere nukleinsyremolekyler, en eller flere polymerer som ikke-konjugert PEG eller polyalkylenglykol og lignende.

Oppfinnelsen tilveiebringer også kit som omfatter konjugatene og/eller preparatene ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også farmasøytiske eller veterinærpreparater omfattende konjugatene ifølge oppfinnelsen, og minst en eksipient eller bærer som er akseptabel for farmasøytisk eller veterinær bruk. Det beskrives videre metoder for terapi eller prevensjon av et antall fysiske lidelser ved bruk av slike preparater og som omfatter administrering av en effektiv mengde av et eller flere av konjugatene eller preparatene ifølge oppfinnelsen til et dyr som lider av eller er predisponerte for en fysisk lidelse eller tilstand.

Det beskrives stabiliserte reseptorbindingsproteiner og metoder for deres fremstilling for anvendelse ved industriell cellekultur, hvorved uventet høye potenser oppnås som et resultat av de kombinerte effekter av vesentlig retensjon av bioaktiviteten og øket virkningsvarighet ved industriell bruk. De uventet høye potenser for konjugatene ifølge oppfinnelsen kan reflekteres ved uventet høy biomasse produksjon, uventet høye nivåer av ekspresjon av rekombinante proteiner og andre forbedringer i effektiviteter ved bioprosessering.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer alternative metoder for å øke den biologiske potens for et preparat av interfer-p, og særlig et preparat av interferon-P-lb. Metoder i henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan for eksempel omfatte fjerning av en eller flere inhibitoriske komponenter fra et preparat av interferon-P (eller interferon-P-lb). I henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan en eller flere inhibitoriske komponenter fjernes fra preparatet ved et antall velkjente metoder for protein- og peptidprosessering, -rensing og/eller -analyse, inkludert, men ikke begrenset til en eller flere kromatografiske metoder som størrelseseksklusjonskromatografi, reversfase kromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi og affinitetskromatografi. Som en praktisk forholdsregel kan bestemmelsen av den biologiske potens for et gitt preparat av interferon-P (dvs. hvorvidt den biologiske potens økes, reduseres eller ikke påvirkes i forhold til en forrådsoppløsning av et cytokin som interferon-P) kan gjennomføres ved en hvilken som helst av et antall in vitro- eller in vivo-analyser som vil være velkjente for fagmannen på området. For eksempel kan cellekultur analysene som responderer på interferon-P gjennomføres for å bestemme den biologiske potens for interferon-P-preparater. Ikke-begrensende eksempler på egnede slike cellekulturnanalyser inkluderer antiproliferative analyser, antivirale analyser, signaltransduksjonsanalyser og genaktiveringsanalyser, eksempler på hvilke er velkjente for fagmannen.

Det beskrives også fremgangsmåter for bestemmelse av mengden av en polymer som er bundet til aminoterminus av et protein med en N-terminal serinrest, i et polymert proteinkonjugat som er syntetisert ved reduktiv alkylering. Metoder i henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen omfatter for eksempel

(a) å omsette konjugatet med en tilstrekkelig mengde av et oksidasjonsmiddel i

tilstrekkelig tid til å spalte polymeren fra serinresten av proteinet; og

(b) å måle økningen av andelen av ikke-konjugert protein i preparatet.

Proteinet som er egnet for bruk i henhold til en slik metode inkluderer, men er ikke begrenset til, cytokiner (inkludert interferon-P (særlig interferon-P-lb, som fortrinnsvis har aminosyresekvensen som spesifisert i Sekv. Id. Nr. 1) og megakaryocytt-vekst og utviklingsfaktor (P.I- Guerra et al. (1998) Pharm Res 15:1822-1827). Oksidasjonsmiddelet som benyttes i visse slike metoder ifølge oppfinnelsen kan være et perjodat inkludert, men ikke begrenset til natrium-, kalium- eller litiummetaperjodat, kalsium- eller bariumperjodat og perjodsyre. Egnede metoder for å måle økningen i andelen av ikke-konjugert protein i preparatet inkluderer en hvilken som helst varietet av velkjente metoder for protein- og peptidanalyser inkludert for eksempel størrelseseksklusjonskromatografi, reversfase kromatografi, gelelektroforese, kapillær elektroforese, ultrasentrifugering, ultrafiltrering, lysspredning og massespektroskopi.

I ytterligere, relaterte utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for selektiv, oksidativ spalting av en N-terminal serinrest av et bioaktivt protein uten å oksidere funksjonelt vesentlige aminosyrerester i nevnte bioaktive protein. Visse slike metoder beskrives og omfatter for eksempel (a) å justere hydrogen ionekonsentrasjon av en oppløsning av det bioaktive protein til en pH-verdi mellom rundt 5 og rundt 10, og mer spesielt en pH-verdi mellom rundt 7 og rundt 8; (b) å blande oppløsningen av bioaktivt protein med rundt 0,1 mol til rundt 10 mol,

og fortrinnsvis rundt 0,5 mol til rundt 5 mol, av et perjodat per mol bioaktivt protein; og

(c) å innkubere blandingen i minst 1 time, fortrinnsvis ved en temperatur mellom rundt 2 og rundt 40°C. Proteiner som er egnet for bruk i henhold til slike

metoder inkluderer, men er ikke begrenset til cytokiner (inkludert interferon-P (særlig interferon-P-lb), som fortrinnsvis har aminosyresekvensen som angitt i Sekv. Id. Nr. 1).

Metoder

Foreliggende oppfinnere har funnet at målsøkning av polymerer på aminoterminale aminosyren av av et "RN"-reseptorbindingsprotein eller på nærheten av glykosyleringssetet av et "RG"-reseptorbindingsprotein sikrer at polymeren festes på et sete som er fjernt fra et eller flere av reseptorbindingsområdene eller domene av protein, for derved å minimalisere sterisk hindring av reseptorinteraksjoner på grunn av de festede polymermolekyler. Som en konsekvens kan en høyere prosentandel av reseptorbindingsaktiviteten bevares ved konjugering av proteiner ifølge oppfinnelsens fremgangsmåter enn det som ville skje hvis polymeren ble festet innen eller nær en del av molekylet som er involvert i binding til sin eller sine reseptorer. Dette prinsipp, som kan resultere i uventet høy retensjon av reseptorbindingsaktivitet, kan påvises for reseptorbindingsproteiner som er valgt blant basisk fibroblast vekstfaktor ("bFGF" eller "FGF-2"), epidermal vekstfaktor ("EGF"), insulinlignende vekstfaktor-1 ("IGF-1"), interferon-cc ("IFN-oc"), interferon-p ("IFN-p", inkludert, men ikke begrenset til IFN-p-lb), granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF"), monocytt kolonistimulerende faktor ("M-CSF"), Flt3-ligand, stamcellefaktor ("SCF"), interleukiner 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 og 15, transformerende vekstfaktor-p ("TGF-p"), human veksthormon ("hGH"), prolaktin, placental laktogenisk hormon, ciliær neurotrofisk faktor ("CNTF"), leptin og strukturelle analoger av disse reseptorbindende proteiner som etterligner virkningene av disse proteiner, eller som er reseptorbindende antagonister av disse. På den annen side, er den selektive festing av en stor polymer til aminoterminus av IFN-y ikke prediktert til å bevare mesteparten av aktiviteten av dette cytokin, fordi slik kobling er ventet å interferere med bindingen av den aktive dimer til sine reseptorer (basert på data i henhold til M.R. Walter et al., (1995) Nature 376:230-235).

Det blir beskrevet at polymerer koblet til aminoterminalresten av muteiner av reseptorbindingsproteiner som viser som kompetitive antagonister av det naturlige protein ved binding til en eller flere av de samme reseptorer uten å initiere signaltransduksjon. Eksempler er polymerkonjugater av en hGH-antagonist som inneholder punktmutasjonen G120R (M. Sundstrøm et al., (1996) J Biol Chem 271:32197-32203) og en antagonist av prolaktin som inneholder punktmutasjonen G129R (V. Goffin et al. (1997) J Mammary Gland Biol Neoplasia 2:7-17; W.Y. Chen et al., (1999) Clin Cancer Res 5:3583-3593; W.Y. Chen, WO 99/58142 Al). Andre antagonister av reseptorbindende proteiner kan fremstilles ved selective punktmutasjoner, -trunkering eller -delesjoner (se f.eks. A. Tchelet et al. (1997) Mol Cell Endocrinol 130:141-152; F.C. Peterson (1998) Identification of MOtifs Associated with the Lactogenic and Somatotropic Actions of Human Growth Hormone, Ph.D. Dissertation, Ohio State University, UMI nr. 9822357).

Det beskrives videre "RG"-reseptorbindingsproteiner, fremgangsmåtene som resulterer i festing av en eller flere syntetiske polymerer nær det naturlige festesetet for karbohydratdeler i disse reseptorbindende proteiner som er glykoproteiner. Dette resulterer i "pseudoglykosylering" av disse reseptorbindende proteiner (for eksempel når de er uttrykt ved rekombinant DNA-teknologi i E. coli, eller andre prokaryotiske celler som ikke gjennomfører post-translasjonell glykosylering) eller resulterer i "pseudohyperglykosylering" av dere glykoproteinformer (for eksempel, for naturlig fremstilte glykoproteiner eller for glykoproteiner som fremstilles av eukaryotiske vertsceller (dvs. gjær-, eller planteceller og animal celler (inkludert pattedyr- og innsektsceller) som ikke yter post-translasjonell glykosylering)). Eksempler er polymerkonjugater av interferoner-a og -p\ så vel som erytropoietin ("Epo") og interleukin-2. Festingen av syntetiske polymerer ved eller nær setene for naturlig glykosylering kan gjennomføres ved en hvilken som helst i og for seg kjent måte, inkludert den mutasjonelle metode som beskrevet av RJ. Goodson et al., ((1990) Biotechnology 8:343-346) og R.S. Larson et al., ((2001) Bioconjug Chem 12:861-869) som involverer forutgående oksidering av karbohydratet.

Aminoterminal modifisering av visse proteiner er beskrevet tidligere (se for eksempel H.B.F. Dixon (1984) J Protein Chem 3:99-108). For eksempel er N-terminal modifisering av proteiner rapportert å stabilisere visse proteiner mot innvirkning av aminopeptidaser (P.I. Guerra et al., supra), for å forbedre oppløseligheten for proteinet (K. Hinds et al., (2000) Bioconjung Chem 11:195-201), for å øke ladningen på N-terminal aminogruppe, eller for å forbedre homogeniteten for de resulterende konjugater (O. Knistler et al. EP 0 822 199 A2; O. Kinstler et al. (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:477-485) blant andre. En alternativ metode for kobling av polymerer til oc-aminogruppen av en terminal cystein- eller histidinresten, ved en tilpasning av en prosedyre som er velkjent i teknikken som "nativ kjemisk ligering", er tidligere beskrevet (MJ. Roberts et al., WO 03/031581 A2 samt USSN 2003/0105224 Al). Imidlertid er eksistensen av "RN"- og "RG"-subklassene av reseptorbindingsproteiner generelt anvendelige metoder for valg av medlemmer av disse klasser samt fremstilling og bruk av polymerkonjugater av slike reseptorbindende proteiner som en vei for å bevare uventet høy funksjonell aktivitet for "RN"-reseptorbindingsproteiner, ikke tidligere erkjent eller beskrevet.

Således er det en fordel å bestemme hvorvidt eller ikke et gitt cytokin har en N-terminus og/eller et eller flere glykosyleringsseter som ligger fjernt fra reseptorbindingssetet(ene) av liganden. Evnen til å forutsi hvorvidt et gitt cytokin er en "RN"- eller "RG"-ligand, før konjugering av liganden med en polymer, øker vesentlig den forsøksvirksomhet som kreves for å gi polymerligandkonjugater (for eksempel cytokiner eller antagonister derav, konjugert med polymerer, for eksempel PEGer) hvori antigenisiteten og immunogenisiteten for konjugatet er redusert i forhold til antigenisiteten og immunogenisiteten for den ikke-konjugerte ligand, mens samtidig reseptorbindingen og de fysiologiske aktiviteter for den konjugerte ligand ikke vesentlig reduseres.

Det beskrives metoder for å identifisere og å velge reseptorbindingsproteinligander (for eksempel cytokiner og antagonister av disse) som har et eller flere N-terminus- og /eller glykosyleringsseter som er fjernt fra reseptorbindingssetene av proteinligandene (dvs. metoder for å identifisere og å velge "RN"- eller "RG"-proteiner .Den optimale lokasjon for konjugering av en eller flere polymerer (for eksempel en eller flere PEGer) kan bestemmes ved bruk av molekylær modellering, for eksempel ved å betrakte den tredimensjonale struktur av proteinet (cytokinet eller antagonisten derav) ved bruk av molekylær modelleringsprogrammer for å prediktere lokasjonen(e) ved hvilken eller hvilke en eller flere polymerer kan festes til proteinet uten vesentlig tap av biologisk eller reseptorbindingsaktivitet hos proteinet (se også C.H. Schein, supra). En analog vei er vist for eksempel for konjugering av PEG til G-CSF i et forsøk på å forbedre resistensen mot proteolytisk digistering (se publisert USSN 2001/0016191 Al i navnet T.D. Osslund ). Egnede molekylmodelleringsprogrammer for bruk ifølge oppfinnelsen som RASMOL (Sayle et al., supra) og andre programmer som benyttes for generering av databasene av makromolekylære strukturer som er deponert ved "the Protein Data Bank" (PDB, se RA. Laskowski, supra), er velkjent i teknikken og velkjente for fagmannen. Ved bruk av slike molkeylære modelleringsprogram kan den tredimensjonale struktur for et polypeptid, for eksempel et cytokin eller antagonist derav, predikteres eller bestemmes med høy grad av pålitelighet, basert på krystallografiske analyser av liganden og deres reseptorer. På denne måte kan fagmannen på området lett bestemme hvilke ligander som er "RN"- eller "RG"-ligander som er egnet for bruk ifølge oppfinnelsen.

For å gjennomføre oppfinnelsen er en hensiktsmessig vei for kovalent kobling av en vannoppløselig polymer til a-aminogruppen av den N-terminale aminosyrerest av et protein den reduktive alkylering av Schiffs baser som dannes med polymerer som bærer en enkelt aldehydgruppe, for eksempel som krevet av G.P. Royer (US 4 002 531), men som ikke er krevet av J.M. Harris et al. (US 5 252 714) fordi de sistnevnte oppfinnere kun krever polymerer som er derivatisert ved begge ender med aldehydgrupper som er fornettningsmidler og derfor lite egnet for syntese av lengevirkende reseptorbindingsproteiner som bibeholder en vesentlig reseptorbindende aktivitet.

Å rette den reduktive alkylering av Shiffs baser på PEG-monoaldehyder mot a-aminogruppen av den N-terminale aminosyren av et reseptorbindende protein, og bort fra8-aminogruppene av dets lysinrester kan gjennomføres på et antall måter, basert på beskrivelsen i J.T. Edsall i kaptilene 4 og 5 i "Proteins Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions ((1943), Reinhold Publishing Corporation, New York).

Syredissosiasjonskonstanten ("pKa") av en oc-aminogruppe av en N-terminal aminosyre av et polypeptid er ventet å være under 7,6, mens pKVverdiene av e-aminogruppene av lysinrester i polypeptidet er ventet å være rundt 9,5. Edsall ((1943, supra) angir klart at aldehyder vil binde med aminogruppen av en aminosyre" kun på den alkaliske side av dens isoelektriske punkt".

Således og basert på foreliggende beskrivelse og informasjon som er lett tilgjengelig i teknikken vil fagmannen på område erkjenne at

(1) den selektive reaksjon av aldehyder med a-aminogruppen av et protein vil være begunstiget av et pH-område som er under 9,5 (omtrent pKafor e-aminogruppen i proteinet); (2) hastigheten for reaksjonen mellom aldehydet og e-aminogrupper vil lett synke hvis pH-verdien for reaksjonen senkes mot 7,6 (rundt pKafor a-aminogruppen i proteinet); (3) reaksjonshastigheten for aldehyder med a-aminogruppen vil synke mindre enn den til s-aminogruppen når reaksjons-pH-verdien senkes mot 7,6, og (4) selektiviteten for reaksjonen for et aldehyd med a-aminogruppen vil forbedres noe ved å redusere pH-verdien mot 6,6.

Fordi den sistnevnte verdi er rundt 1 pH-enhet under pKafor a-aminogruppen og 3 pH-enheter under pKafor e-aminogrupper, vil rundt 10% av a-aminogruppene og rundt 0,1% av8-aminogruppene foreligge i sin reaktive, ikke-beskyttede tilstand. Ved pH 6,6 er således andelen av ubeskyttede a-aminogrupper 100 ganger høyere enn en andel av ubeskyttede8-aminogrupper. Derfor vil meget liten økning selektiviteten økes ved å redusere pH-verdien av reaksjonen ytterligere, for eksempel til 6,5, der teoretisk 1% av a-aminogruppene og 0,01% av e-aminogruppene ville foreligge i reaktiv, ikke-beskyttet tilstand. Det beskrives således proteinligander (særlig "RN"- eller "RG"-ligander, inkludert cytokiner og antagonister derav) konjugert med en eller flere polymerer ved å danne en blanding mellom liganden(e) og den ene eller de flere reaktive polymerer med en pH-verdi rundt 5,6 til rundt 7,6, ved en pH-verdi rundt 5,6 til rundt 7,0; ved en pH-verdi rundt 6,0 til rundt 7,0, ved en pH-verdi rundt 6,5 til rundt 7,0, ved en pH-verdi rundt 6,6 til rundt 7,6, ved en pH-verdi rundt 6,6 til rundt 7,0 eller en pH-verdi rundt 6,6. De foreliggende metoder skiller så således signifikant fra de som er kjent i teknikken der kobling av polymerer til a-aminogrupper på N-terminal aminosyrerestene av ligander gjennomføres ved en pH-verdi rundt 5 (O. Kinstler et al. (2002) supra, EP

0 822 199 A2, US 5 824 784 og 5 985 265, M.J. Roberts et al., (2002), supra, C. Delgado et al., USSN 2002/0127244 Al), mens kobling av polymerer til e-aminogrupper av lysinrester i ligandpolypeptid skjellettet gjennomføres ved en pH-verdi på 8,0 (O. Kinstler et al., EP 0 822 199 A2, US 5 824 784 og 5 985 265). På samme måte er foreliggende metoder også signifikant distinkte fra enzymatiske metoder som har vært benyttet for kobling av alkylaminderivater av poly(etylenglykol) til visse proteiner ved bruk av transglutaminase, som gjennomføres ved en pH-verdi på 7,5 (H. Sato, (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:487-504).

Reduksjon av de resulterende Schiff-baser med milde, reduserende midler som natriumcyanoborhydrid eller pyridinbor (J.C. Cabacungan et al. (1982) Anal Biochem 124:272-278), danner sekundære aminbindinger som bevarer den positive ladning av den N-terminale a-aminogruppe av protein ved fysiologisk pH-verdi. Slike bindinger som bibeholder den samme ladning som det native protein vil mer sannsynlig bevare sin biologiske aktivitet enn alternative bindingskjemier som nøytraliserer ladningen, for eksempel ved å danne amidbindinger (J. Burg et al., WO 02/49673 A2, O. Kinstler et al., EP 0 822 199 A2; O. Kinstler et al. (1996) Pharm Res., 13:996-1002; Y. Kita et al., supra) eller uretanbindinger (C.W. Gilbert et al., US 6 042 822; M. Grace et al. (2001) J Interferon Cytokine Res 21:1103-1115; S. Youngster et al., (2002) Curr Pharm Des 8:2139-2157).

Alternative veier for selektiv kobling av polymerer til N-terminal aminosyrerester er velkjente for fagmannen. Inkludert er metoder for kobling av hydrazid, hydrain, semikarbazid eller andre aminholdige polymerer til N-terminal serin- eller treoninrester som oksidativt er spaltet til aldehyder med perjodat (H.B.F. Dixon, supra, K.F. Geoghegan, US 5 362 852, H.F. Gaertner et al. (1996) Bioconjug Chem 7:38-44; RJ. Drummond et al., US 6 423 685).

I visse utførelsesformer av oppfinnelsen er det ønskelig å minimalisere dannelsen av intramolekylære og intermolekylære kryss-koblinger med polymerer som PEG under reaksjonen der polymeren kobles til den bioaktive komponent for å gi konjugater ifølge oppfinnelsen. Dette kan oppnås ved å benytte polymerer som aktiveres ved kun en ende (her angitt som "monofunksjonelt aktiverte PEGer" eller "monofunksjonelt aktiverte PAGer") eller polymerpreparater hvori prosentandelen bifunksjonelt aktiverte (angitt når det gjelder lineære PEGer som "bis-aktiverte PEG dioler") eller multi-funksjonelt aktiverte polymerer er mindre enn rundt 30%, fortrinnsvis mindre enn rundt 10% og helst mindre enn rundt 2 vekt% (vekt/vekt). Bruken av aktiverte polymerer som helt eller så å si helt er monofunksjonelle kan minimalisere dannelsen av alle de følgende: intramolekylære fornettninger med individuelle proteinmolekyler, "dumbbell" strukturer der en polymertråd forbinder to proteinmolekyler, eller større aggregater eller geler.

Aktiverte former av polymerer som er egnet for bruk i metodene og preparatene ifølge oppfinnelsen kan inkludere hvilke som helst lineære eller forgrenede, monofunksjonelt aktiverte former av polymerer som erkjent i teknikken. For eksempel omfattes de med molekylvekter (ekskludert massen av den aktiverende gruppe) som ligger i området rundt 1 kDa til rundt 100 kDa. Egnede områder for molekylvektene inkluderer, men er ikke begrenset til rundt 5 kDa til rundt 30 kDa; rundt 8 kDa til rundt 14 kDa; rundt 10 kDa til rundt 20 kDa; rundt 18 kDa til rundt 60 kDa; rundt 18 kDa til rundt 22 kDa; rundt 12 kDa til rundt 30 kDa; rundt 5 kDa, rundt 10 kDa, rundt 20 kDa eller rundt 30 kDa. Når det gjelder lineære PEGer tilsvarer molekylvekter på rundt 10 kDa, rundt 20 kDa eller rundt 30 kDa polymeriseringsgrader (n) på rundt 230, rundt 450 henholdsdvis rundt 680 monomerenheter av etylenoksid. Det skal være klart at lenge før eksistensen av "RN"- og "RG"-klasser av reseptorbindingsproteiner var gjenkjent, ble fordelene ved kobling av terapeutiske proteiner til polymerer med relativ høye molekylvekter (dvs.

>20-30 kDa) først beskrevet (M. Saifer et al., WO 89/01033 Al, publisert 9. februar, 1989.

I andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan konjugater av reseptorbindingsproteiner med uvanlig høye prosentandeler bibeholdt bioaktivitet fremstilles for bruk in vitro, for eksempel i cellekultur, ved kobling av monofunksjonelt aktiverte polymerer på rundt 1 kDa, rundt 2 kDa eller rundt 5 kDa i henhold til oppfinnelsens metoder. For slike in vitro anvendelser kan dette nedre området av molekylvekter være foretrukket.

Eventuelt kan en lineær polymer ha en reaktiv gruppe ved en ende eller begge ender og derved skape en "reaktiv polymer". I visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan det være ønskelig å benytte N-hydroksysuksinimidylestere av monopropionsyrederivatet av PEG, som beskrevet av J.M. Harris et al. i US 5 672 662, eller andre N-hydroksysuksinimid-aktiverte PEG-monokarboksylsyrer. I visse andre utførelsesformer kan det være ønskelig å benytte enten monosuksinimidylkarbonatderivatene av PEG ("SC-PEG") som beskrevet hos M. Saifer et al. i US 5 006 333, 5 080 891, 5 283 317 og 5 468 478 eller mono-p-nitrofenylkarbonatderivatet av PEG som beskrevet av S.J. Kelly et al., supra; LD. Williams et al. i WO 00/07629 A2, L.D. Williams et al. i US

6 576 235 og M.R. Sherman et al., WO 01/59078 A2. Videre kan andre typer av reaktive grupper benyttes for å syntetisere polymerkonjugater av proteiner. Disse derivater inkluderer, men er ikke begrenset til monoaldehydderivater av PEGer (GP. Royer, US 4 002 531; J.M. Harris et al., US 5 252 714), monoamin-, monotribromfenylkarbonat-, monokarbonylimidazol-, kmonotriklorfenylkarbonat-, monotrifluorfenylkarbonat-, monohydrazid-, monohydrazin-, monosemikarbazid-monokarbazat-, monotriosemikarbazid-, monojodacetamid-, monomaleimid-, monoortopyridyldisulfid-, monooksim-, monofenylglyoksal-, monotiazolidin-2-tion-, monotioester-, monotiol-, monotriazin- og monovinylsulfonderivater av PEGer. I ytterligere utførelsesformer kan cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, polypeptid hormoner og antagonister derav kobles til en eller flere polymerer som beskrevet i den offentlig eide, samtidige USSN 10/669 597..

Bioaktive forbindelser

Som angitt ovenfor omfatter konjugatene ifølge oppfinnelsen en PAG eller PAO, og spesielt en tråd av PEG, kovalent festet til en eller flere, bioaktive komponenter. Bioaktive komponenter hvortil en eller flere polymerer (eller tråder derav) kovalent er festet angis her på forskjellig måter og ekvivalent som "konjugerte, bioaktive komponenter" eller "modifiserte, bioaktive komponenter". Disse uttrykk skal her skilles fra "ikke-konjugerte, bioaktive komponenter", "initial bioaktive komponenter" eller "ikke-modifiserte bioaktive komponenter", alle uttrykk som henviser til bioaktive komponenter som ikke har fått polymerer kovalent festet dertil. Det skal imidlertid være klart at en "ikke-konjugert", "ikke-modifisert" eller "initial" bioaktiv komponent kan inneholde andre, ikke-polymerer konjugeringer eller modifiseringer sammenlignet med et villtype- eller nativt molekyl, og vil fremdeles anses for å være "ikke-konjugert", "ikke-modifisert" eller "initial" i henhold til foreliggende oppfinnelse, fordi den bioaktive komponent vil være "ikke-konjugert", "ikke-modifisert" eller "initial" i forhold til festingen av polymerer slik tilfellet er for de bioaktive komponenter det henvises til her som "Mock PEGylert".

Uttrykket "stabilisering" av en bioaktiv komponent (eller "metoder for stabilisering" eller "stabilisert bioaktiv komponent") antyder at bioaktiv komponent er stabilisert i henhold til oppfinnelsens metoder (dvs. en bioaktiv komponent hvortil en polymer kovalent er festet i henhold til oppfinnelsens metoder). Slike stabiliserte, bioaktive komponenter vil vise visse endrede biokjemiske og biofysiske karakteristika ved sammenligning med en bioaktiv komponent som ikke er stabilisert (dvs. en bioaktiv komponent hvortil en polymer ikke kovalent er festet). Inkludert blant slike endrede biokjemiske og biofysiske parametere, og særlig for reseptorbindingsproteiner, kan være redusert tilbøyelighet til proteolytisk nedbrytning, og særlig opprettholdelse av aktiviteten av et reseptorbindingsprotein under innkubering under spesielt grove miljø-eller forsøksbetingelser. Ved visse utførelsesformer av oppfinnelsen kan de endrede biokjemiske og biofysiske parametere inkludere for eksempel en øket halveringstid i sirkulasjonen in vivo, øket biotilgjengelighet, øket virknings varighet in vitro og lignende.

Et hvilket som helst reseptorbindende protein (karakteristisk et cytokin) med biologisk (dvs. fysiologisk, biokjemisk eller farmasøytisk) aktivitet i forbindelse med deler av molekylet som er fjernt fra dets aminoterminus eller fra naturlig forekommende eller mutasjonelt innført glykosyleringssete kan hensiktsmessig benyttes som en initialkomponent ifølge oppfinnelsen. Slike bioaktive komponenter inkluderer, men er ikke begrenset til peptider, polypeptider, proteiner og lignende. Bioaktive komponenter inkluderer også fragmenter, muteiner og derivater av slike peptider, polypeptider, proteiner og lignende, særlig slike fragmenter, muteiner og derivater som har biologisk (dvs. fysiologisk, biokjemisk eller farmasøytisk) aktivitet.

Egnede peptider, polypeptider og proteiner, glykoproteiner og lignende som er brukbare som bioaktive komponenter ifølge oppfinnelsen, inkluderer et hvilket som helst peptid, polypeptid eller protein osv., med en eller mer enn en tilgjengelig aminogruppe, tiolgruppe eller en annen gruppe som er fjernt fra det eller de reseptorbindende områder av den bioaktive komponent hvortil polymerer selektivt kan festes. Slike peptider, polypeptider, proteiner, glykoproteiner og lignende inkluderer cytokiner som kan ha en hvilken som helst av et antall strukturer (N.A. Nicola, supra, C.H. Schein, supra).

For eksempel inkluderer egnede peptider, polypeptider og proteiner av interesse uten begrensning klassen av cytokiner med strukturer omfattende fire oc-heliks bunter (både langkjede- og kortkjede subklasser) (for en oversikt se C.H. Schein, supra). En varitet av slike fire helikale buntproteiner er egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen, inkludert, men ikke begrenset til, interleukiner, for eksempel IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 subenhet), IL-13, IL-15 og IL-17; kolonistimulerende faktorer, for eksempel makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF; D.A. Rozwarski et al. (1996) Proteins 26:304-313); interferoner, for eksempel IFN-a, INF-P (inkludert, men ikke begrenset til IFN-P-lb) og konsesus-IFN; leukemi-inhibitorisk faktor (LIF); erytropoietin (Epo); trombopoetin (Tpo); megakaryocyt vekst-og utviklingsfaktor (MGDF); stamcelle faktor (SCF), også kjent i teknikken som "Steel Factor" (P.J. MOrrissey et al., (1994) Cell Immunol 157:118-131; I.K. McNiece et al.,

(1995) J Leukoc Biol 58:14-22); onkostatin M (OSM); fosfolipase-aktiverende protein (PLAP); neurotrofiske faktorer og peptid-mimetika derav. Selv om prolaktin og veksthormon er klassiske hormoner, og som sirkulerer utstrakt i kroppen, til forskjell fra cytokiner som vanligvis fremstilles nær sine målceller, hører prolaktin og veksthormon til den samme strukturklasse som cytokiner med fire oc-helikal bunter (N.A. Nicola, supra; V. Goffin et al., supra) og de er tilsvarende egnede mål for polymer kobling og for fremstilling av de foreliggende konjugater i henhold til oppfinnelsen.

Reseptorbindingsproteiner for langkjede P-ark- eller P-løp strukturklassene (for en oversikt, se C.H. Schein, supra) er også egnet for bruk ved fremstilling av konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til: tumornekrosefaktor familien av cytokiner, for eksempel TNF-oc, TNF-P og Fas-ligander, som viser P-"jelly roll" strukturer; IL-1 (inkludert IL-la og IL-ip) og FGF (inkludert basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF), sur FGF, FGF-4 og keratinocyt vekstfaktor (KGF; FGF-7)) familiene, som viser en P-"trefoil" folding (C.H. Schein, supra; J. Schlessinger et al., supra); IL-12; IL-16; epidermal vekstfaktor (EGF; H.-S. Lu et al., supra) og plateavledede vekstfaktorer (PDGFer), transformerende vekstfaktorer (inkludert transformerende vekstfaktor-a og transformerende vekstfaktor-P (TGF-P)) og nervevekst faktorer som adopterer cysteinknute strukturer.

En ytterligere strukturell klasse av proteiner som med fordel benyttes i konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen er den til de disulfid-rike, blandede a/p-cytokiner og vekstfaktorer (for en oversikt, se C.H. Schein, supra) inkludert, men ikke begrenset til: EGF-familien som har en P-meander struktur; IL-8, RANTES; neutrofilaktiverende peptid-2 (NAP-2); stromal celleavledet faktor-la (SDF-la); monocyt kjemotiltrekningsproteiner (MCP-1, MCP-2 og MCP-3); eotaksinene (for eksempel eotaksin-1, eotaksin-2 og eotaksin-3); myeloid progenitor inhibitorisk faktor-1 (MPIF-1); neurotaktin makrofag migreringsinhibitorfaktor (MIF); vekst-relatert onkogen-/melanom-vekststimmulatorisk aktivitet (GRO-a/MGSA); somatomediner; og insuling og de insulinlignende vekstfaktorer (for eksempel IGF-1 og IGF-2). En relatert strukturklasse av proteiner for anvendelse i konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen er cytokiner med mosaikkstrukturer som inkluderer vekstfaktorer som IL-12 og og hepatocyt vekstfaktor (N.A. Nicola, supra).

Andre proteiner av interesse inkluderer, men er ikke begrenset til: veksthormoner (særlig human veksthormon (hGH; se A. Tchelet et al., supra (1997) Mol Cell Endocrinol 130:141-152) og antagonister derav (se for eksempel M. Sundstrom et al.

(1996) J Biol Chem 271:32197-32203), prolaktin og antagonister derav, korioniske gonadotropin, follikelstimmulerende hormon, tyroidstimmulerende hormon, pigmentærhormoner, hypotalamisk frigivningsfaktorer, antidiuretiske hormoner og reseptorbindings antagonister og cytokiner og vekstfaktorer av alle de ovenfor nevnte strukturklasser. Mange slike proteiner eksisterer i både glykosylerte og ikke-glykosylerte former. De ikke-glykosylerte former kan være et resultat av deres produksjon ved bruk av rekombinante DNA-teknikker i prokaryoter eller bruk av kjemisk syntese. Slike ikke-glykosylerte produkter er blant peptidene og proteinene som er egnede, bioaktive komponenter ifølge oppfinnelsen. Til slutt, og selv om noen antistoffer virker som reseptorbindende agonister eller antagonister (se for eksempel J.C. Morris, et al. (2000) Ann Rheum Dis 59 (Suppl. I):il09-ill4), er slike immunoglobuliner ikke egnede kandidater for N-terminal polymerkobling innen oppfinnelsens ramme, dvs. de er ikke RN-reseptorbindingsproteiner fordi de aminoterminale områder av både den lette og tunge kjede deltar i antigengjenkjennelse.

Av spesiell nytte som bioaktive komponenter for bruk ved fremstilling av polymerkonjugatene ifølge oppfinnelsen er interferon-oc, interferon-P, IL-2, IL-4, IL-10, hGH, prolaktin, insulin, IGF-1, EGF, bFGF og erytropoietin (Epo). Også av spesiell nytte er muteiner og fragmenter av slike bioaktive komponenter, særlig de som er i stand til å binde til reseptorene for det tilsvarende villtype- eller intakte polypeptid, uansett om denne binding induserer en biologisk eller fysiologisk effekt eller ikke. I visse slike utførelsesformer kan muteiner og fragmenter av de bioaktive komponenter virke som antagonister for de tilsvarende ligander, noe som reduserer, reduserer vesentlig eller fullstendig inhiberer bindingen av ligander til deres reseptorer og/eller aktiviteten av ligandene på deres målceller, vev og/eller organismer. Andre antagonister som eventuelt kan være strukturelle analoger, muteiner, varianter eller derivater av ligandene av interesse, er det også egnet for fremstilling av konjugatene ifølge oppfinnelsen. Rent praktisk, og uansett om det dreier seg om et gitt mutein, et fragment, en variant, et derivat eller en antagonist som antagoniserer den biologiske og/eller fysiologiske effekt for en gitt ligand, kan bestemmes, uten urimelige forsøk, ved bruk av analyser for biologiske/fysiologiske effekter på liganden per se, er et antall velkjente analyser velkjente i teknikken og/eller beskrevet her.

Strukturene (primær, sekundær, tertiær og der det er aktuelt, kvarternært) for disse og andre polypeptider av interesse som med fordel benyttes ifølge oppfinnelsen, er velkjent i teknikken og vil være velkjente for fagmannen på området, særlig i lys av de strukturer som gis her, og de her gitte referanser.

Konjugater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer stabile konjugater av bioaktive komponenter, særlig cytokiner, for bruk i et antall anvendelser. Slike konjugater ifølge oppfinnelsen har et antall fordeler i forhold til de som er velkjente i teknikken, vist i de følgende, ikke-begrensende og eksempelvise sammenligninger av kjente konjugater.

H. Hiratani (EP 0 098 110 Bl og US 4 609 546) beskriver konjugater av polymerer av etylenoksid og propylenoksid ("PEG-PPG", et medlem av den generelle klasse av PAGer) med proteiner, inkludert interferferoner og interleukiner, der ingen referanse for å unngå områder i proteinene som er involvert i reseptorbinding er beskrevet. I disse referanser ble interferonene a, p og y ansett for å være ekvivalente mål for kobling av PAG, til forskjell fra foreliggende oppfinnelse der interferon-y ikke anses å være et egnet mål for N-terminal kobling fordi aminoterminus ligger innenfor dette cytokins reseptorbindende område. I tillegg beskriver Hiratani konjugater som syntetiseres kun med PAGer på 1 til 10 kDa, mens metodene ifølge oppfinnelsen foretrekker kobling av vannoppløselige, syntetiske polymerer med molekylvekter ut over 10 kDa for terapeutiske formål. Analogt beskriver N.V. Karre ((1990) supra) at kobling av større antall tråder på 5-kDa mPEG til human, rekombinant interleukin-2 øker levetiden for de resulterende konjugater i blodstrømmen hos mus og kaniner. Imidlertid verken beskriver eller erkjenner denne referanse fordelen av kobling av små antall lengre tråder av PEG og/eller av kobling av en enkelttråd av høymolekylvekt PEG til aminoterminus av IL-2.

G. Shaw (US 4 904 584 og WO 89/05824 A2) beskriver metoder for å innføre seteselektiv festing av aminreaktive polymerer ved innføring, erstanting og deletering av lysinrester i målprotein, og særlig i Epo, G-CSF og IL-2. Til forskjell fra foreliggende oppfinnelse beskriver imidlertid disse referanser ikke at aminreaktive polymerer kan reagere med et hvilket som helst amin i målproteinet andre enn e-aminogruppen av lysinrester, noe som klart skiller disse beskrivelser fra foreliggende oppfinnelse.

D.E. Nitecki et al, (US 4 902 502) beskriver et antall PEGylerte IL-2-konjugater som er fremstilt fra forskjellige kloformatderivater av PEG som var ment å reagere med e-aminogruppene av lysinrester. I motsetning til de foreliggende metoder beskriver imidlertid denne referanse ingen metode for å unngå PEGylering av lysinrester i områder av IL-2-proteinet som er involvert i reseptorbinding, og heller ikke vises noen erkjennelse om at det å unngå slike seter er fordelaktig.

N. Katre et al. (US 5 206 344) beskriver PEG-IL-2-konjugater hvori PEG er koblet til s-aminogruppene av lysinrester, til den ikke-parrede sulfhydrylgruppe av den naturlig forekommende cysteinrest med posisjon 125 (tellet fra aminoterminus) eller til sulfhydrylgruppen av en cysteinrest som mutasjonelt er innført mellom den første og tyvende rest fra aminoterminus av IL-2. Inkludert blant de muteiner som er beskrevet i "344 er "des-ala-1" IL-2, dvs. et mutein hvori aminoterminal alaninet er deletert og ikke-PEGylert. I motsetning til foreliggende beskrivelse, beskriver imidlertid 322 ikke noen metode for å unngå kobling av PEG til amionsyrerester som er involvert i binding til reseptorer, og heller ingen erkjennelse om at en slik vei vil være fordelaktig. Konsistent med dette, og i motsetning til foreliggende oppfinnelse antyder det brede området av festepunkter som foreslås i 344 ikke at kobling av PEG til aminoterminus av IL-2 vil være spesielt fordelaktig.

S.P. Monkarsh et al., (1997) Anal Biochem 247:434-440 og S.P. Monkarsch et al.

(1997) i J.M. Harris, et al., red., Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, s. 207-216, American Chemical Society, Washington, D.C., beskriver at omsetting av interferon-a-2a med et tre-ganger molart overskudd av en aktivert PEG med en molekylvekt på 5 300 dalton gir 11 posisjonelle isomerer av monoPEG-interferon, tilsvarende de 11 lysinrester på interferon-oc-2a. Intet PEG-interferon i hvilket PEG er koblet til a-aminogruppen på aminoteminus av interferonet, er rapportert. De 11, posisjonelle isomerer som angis i disse referansene viste antivirale aktiviteter i cellekulturer som lå fra 6% til 40% av den til ikke-modifisert interferon og antiproliferative aktiviteter i cellekulturer som lå fra 9% til 29% av den til ikke-modifisert interferon. Slike resultater viser klart at den tilfeldige PEGylering av lysinrester som ble gjennomført av disse forskere, interfererte med funksjonene til interferon-a-2a, mediert av dens reseptorer, i motsetning til konjugater som fremstilles ved oppfinnelsens metoder. I tillegg og til forskjell fra konjugatene ifølge oppfinnelsen, var det intet N-terminalt PEGylert interferon i de konjugater som ble rapportert i disse referanser.

O. Nishimura et al. (US Patent Statutory Invention Registration Nr. H1662) beskriver konjugater av interferon-a, interferon-y og IL-2 som fremstilles ved reduktiv alkylering av aktiverte "polyetylenglykolmetyleteraldehyder" med natriumcyanoborhydrid ved pH 7,0 (for interferonkonjugatene) eller pH 7,15 (for IL-2-konjugatene). Konjugatene som fremstilles ved slike metoder ble imidlertid rapportert å ha mistet opp til 95% av bioaktiviteten av de ikke-modifiserte proteiner, åpenbart på grunn av nærværet av multiple seter av polymerfesting, alt rapportert å være på e-aminogruppene av lysinrestene. D.K. Pettit et al, (1997) J Biol Chem 272:2312-2318 beskriver polymerkonjugater av interleukin-15 ("IL-15"). Det konjugerte IL-15 som rapporteres i denne referanse har imidlertid ikke bare mistet sin IL-2-lignende vekstfremmende evne som et resultat av kobling av polymerer til lysinrestene i områder av proteinet som er involvert i reseptorbindinge, men viste også antagonisme heller enn agonisme. Disse forskere konkluderer med at selektiv inhibering av binding av IL-15 til en av flere celleoverflate reseptorer kan være en konsekvens av polymerkonjugering og at slik inhibering ikke bare reduserer reseptorbindingen, men også kan reversere den biologiske effekt av proteiner. Ved å unngå kobling av polymerer til deler av reseptorbindingsproteinet som er involvert i interaksjoner med sine reseptorer, unngår foreliggende oppfinnelse denne uønskede konsekvens av polymerkoblingen.

J. Hakimi et al. (US 5 792 834 og 5 834 594) beskriver uretanforbundne PEG-konjugater av proteiner, inkludert interfero-a, IL-2, interleukin-1 ("IL-1") og en antagonist av IL-1-reseptoren, som ble rapportert fremstilt for å redusere immunogenisitet, øke oppløseligheten og å øke den biologiske halveringstid av de respektive proteiner. I disse referanser ble PEG koblet til "forskjellige, frie aminogrupper", uten referanse til N-terminal PEGylering og ingen beskrivelse i retning av N-terminal a-aminogruppe kunne eller burde bli PEGylert. Disse patenter angir også at konjugatet som beskrives der "har minst en del" av den opprinnelige, biologiske aktivitet av utgangsproteinet, noe som antyder et mulig tap av vesentlig bioaktivitet. Dette resultat ville være konsistent med bruken av ikke-innsiktede PEGyleringsmetider som beskrevet der. I motsetning til foreliggende oppfinnelse beskriver disse patenter ikke noe forsøk på å forbedre retensjonen av bioaktivitet hos konjugatene ved å endre selektiviteten for den der PEGyleringsprosess.

O.B. Kinstler et al. (EP 0 822 199 A2) beskriver en fremgangsmåte for å omsette poly(etylenglykol) med a-aminogruppen av aminosyren på aminoterminus av et polypeptid, særlig konsensusinterferon og G-CSF, som er to av de proteiner som fremstilles av Amgen, Inc., dette patents eier. Denne publikasjon antyder at "en pH-tilstrekkelig sur til selektivt å aktivere a-aminogruppen" er et nødvendig trekk ved den beskrevne prosess. I motsetning til dette, er det ifølge foreliggende oppfinnelse funnet at reduksjon av pH-verdien reduserer reaktiviteten for aminogruppene med PEG-aldehyder og at a-aminogruppen er mer reaktiv når den ikke er protonert, dvs. ved pH over pKa-verdien. Således finner foreliggende oppfinere at ingen pH-verdi er "tilstrekkelig sur til selektivt å aktivere a-aminogruppen" av noen som helst av RN-cytokinkonjugatene ifølge oppfinnelsen. Forklaringen på pH-avhengigheten av reaktiviteten av N-terminal a-aminogrupper med aldehyder som gis av J.T. Edsall (supra) og R.S. Larsen et al. ((2001) Bioconjug Chem 12:861-869) er mer kompatible med erfaringene til de foreliggende oppfinnere. Videre rapporterer Kinstler et al., ved bruken av N-terminal PEGylering av polypeptider for øket homogenitet av de resulterende konjugater og beskyttelse av aminoterminus fra nedbrytning på grunn av proteinaser, men beskriver ikke at N-terminal PEGylering kan bevare en større andel av reseptorbindingsaktiviteten for visse reseptorbindingsproteiner (se for eksempel WO 96/11953, EP 0 733 067 Bl og US 5 770 577, 5 824 784 og 5 985 265 alle i navnet O.B. Kinstler et al.).

EP 0 822 199 A2 i navnet Kinstler et al. generaliserer også fordelen ved N-terminal PEGylering til alle polypeptider, noe som ikke er foreliggende oppfinnernes erfaring. Spesielt, og fordi aminotermini for antistoff molekyler opptrer proksimalt til det antigen-kombinerende området av antistoffproteinene (A.P. Chapman (2002) Adv Drug Deliv Rev 54:531-545), er N-terminal PEGylering av antistoffer uventet skadelig for bioaktiviteten sammenlignet med tilfeldig PEGylering av lysinrester som beskrevet av R.S. Larsen et al, supra. Tilsvarende er N-terminal PEGylering av reseptorbindende proteiner som ikke er "RN" reseptorbindende proteiner, for eksempel interferon-y, forventet å være mer inhibitoriske for interaksjoner med reseptorer enn tilfeldig PEGylering av lysinrestene av slike reseptorbindende proteiner.

Som angitt ovenfor, skiller metodene beskrevet heri fra de som beskrives av Kinstler at al. i de her siterte publikasjoner ved at konjugatene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved konjugering av et eller flere cytokiner eller antagonister derav, som er valgt som RN reseptorbindingsproteiner med en eller flere polymerer ved å danne en blanding mellom liganden(e) og den ene eller de flere polymerer ved en pH-verdi rundt 5,6 til 7,6; rundt 5,6 til 7,0; rundt 6,0 til 7,0; rundt 6,5 til 7,0; rundt 6,6 til 7,6; rundt 6,6 til 7,0; eller ved en pH-verdi rundt 6,6. I motsetning til dette er metodene ifølge Kinstler et al. basert på konjugering av ligander ved en pH-verdi under 5,5, et pH-område som foreliggende oppfinnere har funnet å være suboptimal og dårligere for fremstilling av preparater av ligander som selektivt er konjugert med polymerer ved fjerde N-terminale aminosyrer og/eller fjerne glykosyleringsseter.

B. Pepinsky et al. (WO 00/23114 og USSN 2003/0021765 Al) beskriver polymerkonjugater av glykosylert interferon-P-la som er mer aktivt enn ikke-glykosylert interferon-P-lb i en antiviral analyse. Når Pepinsky et al kobler 5-kDa-eller 20-kDa-mPEG til aminoterminus av INF-P-la ved reduktiv alkylering, ble ingen effekt av PEGyleringen på den antivirale potens observert, mens kobling av PEGer med høyere molekylvekt reduserte eller eliminerte potensen. Denne referanse beskriver også at polyalkylenglykol kan kobles til interferon-P-la via et antall koblingsgrupper på forskjellige seter, inkludert aminoterminus, karboksylterminus og karbohydratdelen av det glykosylerte protein. Metodene som beskrives i denne publikasjon er imidlertid angitt ikke å være generaliserbare: "disse studier antyder at, på tross av bevaringen i sekvensen mellom interferon-P-la og interferon-P-lb, disse er distinkte, biokjemiske enheter og derfor kan meget av det som vites om interferon-P-lb ikke anvendes på interferon-P-la og vise versa". I motsetning til dette beskriver foreliggende oppfinnelse det felles trekk som utføres i "RN"- og "RG"-reseptorbindingsproteiner som definert her. I henhold til oppfinnelsen er både interferon-P-la og interferon-P-lb "RN" reseptorbindende proteiner. I tillegg er interferon-P-lb et "RG" reseptorbindende protein. I motsetning til metodene i WO 00/23114, er i henhold til dette metodene ifølge oppfinnelsen brukbare for å fremstille stabile, bioaktive konjugater av både interferon-P-lb og interferon-P-la.

Z. Wei et al (US 6 077 939) beskriver metoder for kobling av vannoppløslige polymerer (særlig PEG) til N-terminal a-karbonatomet av et polypeptid (særlig erytropoietin), der amin på a-karbonat av N-terminal aminosyre først transamineres til en oc-karbonylgruppe, som så omsettes med et PEG-derivat for å danne et oksim eller en hydrazonbinding. Fordi de beskrevne formål ved denne referansen er å utvikle en metode som kan anvendes på proteiner generelt, ble ingen vurderinger gitt hva angår bevaring av den reseptorbindende aktivitet som kan oppstå i forbindelse med valget av aminoterminus som sete for PEGylering av visse reseptorbindende proteiner. I motsetning til det som beskrives av Wei et al., krever således foreliggende oppfinnelse ikke fjerning av den N-terminale a-aminogruppe, men kan tvert imot bevare ladningen ved N-terminal a-aminogruppe med nøytral pH-verdi ved dannelse av en sekundær aminbinding mellom proteinet og polymeren.

C.W. Gilbert et al. (US 6 042 822, EP 1 039 922 Bl) beskriver ønskeligheten av en blanding av posisjonelle isomerer av PEG-interferon-a-2b der en særlig ønsket isomer har PEG koblet til en histidinrest av interferon-a-2b, og særlig histidin 34, og viser at PEG-bindingen til histidin-34 er ustabil. Fordi histidin-34 ligger på overflaten av interferon-a-2b i et område som må komme i dypt intim kontakt med en interferonreseptor for å utløse signaltransduksjon og synes mangelen på stabilitet for bindingen mellom PEG og histidin-34 som beskrives i disse referanser å være kritisk for funksjonen av det der beskrevne PEG-interferonkonjugat. Det i det vesentlige rene, histidinforbundne proteinpolymer konjugat ble beskrevet av S. Lee et al. i US 5 985 263. I motsetning til dette viser foreliggende oppfinnelse at det foretrukne konjugat er et PEG-interferonkonjugat der PEG stabilt er forbundet på et sete som er fjernt fra de reseptorbindende domener av interferonkomponenten.

P. Bailon et al. ((2001) Bioconjug Chem 12:195-202) beskriver at interferon-a-2a som er PEGylert med et molekyl på 40-kDa di-mPEG-lysin per molekyl interferon består av fire hovedposisjonelle isomerer. Denne referanse beskriver at så å si all PEG ble festet ved amidbindinger til lysinene 31, 121, 131 eller 134, hver av hvilke ligger innen eller nær de reseptorbindende domener av interferon-a-2a (restene 29-35 og 123-140 i henhold til Bailon et al). N-terminal PEGylering ble ikke rapportert av Bailon et al. Antiviral aktivitet for den isolerte blanding av posisjonelle isomerer av PEG-interferon mot vesikulær stomatitt virusinfeksjon av Madin-Darby bovin nyreceller in vitro, ble rapportert å være 7% av den til det ikke-konjugerte interferon-a-2a som ble testet. Det vesentlige tap av bioaktivitet som ble observert på disse PEG-interferonkonjugater som ikke inkluderte N-terminal PEGylert interferon skilte seg således klart konjugatene ifølge Bailon et al., fra de ifølge oppfinnelsen.

R.B. Pepinsky et al. ((2001) J Pharmacol Exp Ther 297:1059-1066) beskriver syntese av et konjugat fra

(1) glykosylert interferon-P-la med en N-terminal metioninrest, og

(2) et 20-kDa PEG-aldehyd.

Konjugatet, som i referansen antydes til å være monoPEGylerte på det N-terminale metionin, sies å bibeholde full bioaktivitet i en antiviral analyse. Mens disse forfattere beskriver at deres valg av N-terminalsete for PEGylering av glykosylert interferon-P-la var diktert av tilgjengeligheten av seteselektive PEGyleringsreagenser og molekylær modellering, erkjente de at "visse effekter er produktspesifikke". Videre, og i motsetning til foreliggende oppfinnelse, ble de der rapporterte observasjoner ikke generalisert til å inkludere klassen av reseptorbindende proteiner som er definert her som "RN" reseptorbindende proteiner.

J. Burg et al. (WO 01/02017 A2) beskriver fremstilling av alkoksyPEG-konjugater av erytropoietinglykoproteiner der 1-3 tråder av et metoksyPEG ble omsatt med sulfhydrylgrupper som var innført kjemisk ved modifisering av e-aminogrupper av lysinrester på overflaten av glykoproteinet. I motsetning til foreliggende oppfinnelse beskriver denne referanse imidlertid intet forsøk på å koble PEG til den frie a-aminogruppe av N-terminale aminosyren av erytropoietin, eller å unngå modifisering av lysinrestene i områder av erytropoietinglykoprotein som er vesentlige for interaksjoner med erytropoietin reseptorer.

J. Burg et al. (WO 02/49673 A2) beskriver syntesen av N-terminale, amidforbundne PEG-konjugater av naturlig og mutein erytropoetin glykoproteiner ved en prosess som benytter selektivt spaltbare N-terminal peptidforlengelser som må spaltes før PEGylering og etter reversibel citrakonylering av alle e-aminogrupper av lysinrestene av glykoproteinet. Det beskrevne rasjonalet for denne flertrinns prosess i denne referanse var å gjøre PEGyleringsprosessen aktiv for den frie a-aminogruppe av N-terminal aminosyre for å produsere homogene monoPEGylerte konjugater og for derved å unngå behovet for å separere monoPEGylerte konjugater fra multippel PEGylerte derivater. Denne metode skiller seg fra den ifølge oppfinnelsen ved et antall viktige aspekter inkludert, men ikke begrenset til: (1) tanken hos Burg et al. er begrenset til erytropoietin glykoproteiner, hvortil alkoksyPEG er bundet via amidbindinger, mens foreliggende oppfinnelse kan anvendes på et antall bioaktive komponenter som er forbundet via et antall syntetiske polymerer; (2) foreliggende oppfinnelse leder både glykosylerte og ikke-glykosylerte "RN"- og "RG"-reseptorbindingsproteiner, mens Burg et al. kun beskriver konjugeringen av glykoproteinene; (3) foreliggende oppfinnelse omfatter både alkoksyPEGer som mPEG, og monofunksjonelt aktiverte hydroksyPEGer, mens Burg et al. beskriver kun bruken av alkoksyPEGer; og (4) ifølge foreliggende oppfinnelse er sekundære aminbindinger mellom polymerene og proteinet foretrukket i forhold til amidbindinger som benyttet av Burg et al., fordi de førstnevnte er mer stabile og bevarer den positive ladning på aminogruppen. I analoge arbeider fra samme gruppe beskriver Burg et al. (US 6 340 742) fremstillingen av amidbundne konjugater av erytropoietin glykoproteiner der en til tre strenger av alkoksyPEG er bundet til en til tre aminogrupper på proteinet. I motsetning til foreliggende oppfinnelse rapporterer imidlertid denne referanse ingen preferanser for a-aminogruppen av N-terminal aminosyre eller for aminogruppene som ikke er i områder som er involvert i interaksjoner med reseptorene. C. Delgado et al. (US 6 384 195) beskriver konjugater av granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor som er fremstilt ved bruk av en reaktiv polymer som presenteres som tresylmonometoksyPEG og her angis som "TMPEG". Denne referanse antyder at når TMPEG bringes i kontakt med rekombinant human GM-CSF "inneholder det modifiserte materialet spesier uten aktivitet og med høyere aktivitet enn ikke-modifisert materiale". Som fagmannen på området vil erkjenne, er spesier uten aktivitet uønsket i en blanding av polymer-bioaktive komponent-konjugater, særlig i preparater for terapeutisk anvendelse som omfatter slike konjugater, fordi disse da kan bidra til risikoen for å administrere konjugatet til en pasient som trenger slik administrering uten å bidra til de fordelaktige effekter. Som nevnt her, avhjelper foreliggende oppfinnelse denne begrensningen i den kjente teknikk, i det minste delvis, ved å unngå modifisering av GM-CSF og andre reseptorbindingsproteiner på seter på proteinene som er involvert i sin reseptorbindingsaktivitet, og for derved å redusere eller eliminere syntesen av spesier uten aktivitet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også metoder for fraksjonering og rensing av konjugater som har forskjellige størrelser, forskjellige ladninger og/eller forskjellig grader av avskjerming av ladninger på proteinet med polymeren.

Det er verdt å merke seg at US 6 384 195 ikke nevner N-terminal PEGylering av GM-CSF og derfor ikke erkjenner fordelene ved metodene ifølge foreliggende oppfinnelse. Til slutt antyder US 6 384 195 en preferanse for konjugater der mer enn en PEG er koblet til hvert molekyl av GM-CSF, uten noen vurderinger om hvor på GM-CSF-molekylet disse PEG-molekyler er festet (annet enn å være festet til lysinrester). Ved å angi en preferanse for konjugering med opp til 6 PEG-molekyler per GM-CSF, angir referansen derved en preferanse for konjugater der PEG kan være festet til alle mulige lysinrester, og sikrer derved at PEG vil være festet i posisjoner som sterisk hindrer nær mulighet for proteinet til sine celleoverflatereseptorer. I motsetning til dette antyder foreliggende oppfinnelse uønsketheten av å koble PEG til lysinrester, bortsett fra der disse lysinrester er fjernt fra domenene for reseptorbindingsproteinet som er essensielt for interaksjoner med reseptorene og således for signaltransduksjon (når det gjelder agonister) og for kompetitivt å inhibere signaltransduksjon (når det gjelder antagonister).

T. Nakamura et al. (WO 02/32957 Al) beskriver at økning av molekylvekten av PEG som er koblet til e-aminogruppen av lysinresten på posisjon 52 av erytropoietin glykoproteinet øker erytropoietineffekten av konjugatet in vivo, og reduserer affiniteten av konjugatet for erytropoietin reseptorer. I motsetning til foreliggende oppfinnelse beskriver imidlertid denne referanse ikke kobling av PEG på aminoterminus eller nær et glykosyleringssete og erkjenner ikke heller noen fordeler ved å gjøre dette.

Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse konjugater av bioaktive komponenter, koblet til syntetiske polymerer, som har distinkte strukturelle og funksjonelle fordeler i forhold til det som tidligere er beskrevet.

Preparater

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer konjugater eller komplekser omfattende en eller flere bioaktive forbindelser, hensiktsmessig et eller flere cytokiner, koblet til en eller flere stabiliserende polymerer som en eller flere PEGer. Karakteristisk fremstilles slike konjugater ved fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen som beskrevet ovenfor; imidlertid anses konjugater med strukturene og aktivitetene som beskrevet her, uansett i metoder som benyttes for å fremstille slike konjugater, som ekvivalente med de som fremstilles ved de foreliggende metoder, og er derfor omfattet av oppfinnelsen. I relaterte aspekter omfatter oppfinnelsen også preparater omfattende en eller flere av slike konjugater eller komplekser. Preparater i henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen vil omfatte et eller flere (for eksempel et, to., tre, fire, frem, ti osv.) av de ovenfor beskrevne konjugater eller komplekser ifølge oppfinnelsen. I visse slike aspekter kan preparatene omfatte en eller flere ytterligere komponenter som et eller flere buffersalter, et eller flere kaotropiske midler, en eller flere detertengser, et eller flere proteiner (for eksempel albumin eller et eller flere enzymer), en eller flere ikke-bundne polymerer, et eller flere osmotisk aktive midler og lignende. Preparatene i henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan foreligge i en hvilken som helst form inkludert faststoffer (for eksempel tørrpulver) eller oppløsning (særlig i form av en fysiologisk kompatibel bufiret saltoppløsning omfattende et eller flere av konjugatene ifølge oppfinnelsen).

A. Farmasøytiske preparater

Visse preparater ifølge oppfinnelsen er spesielt formulert for bruk som farmasøytiske preparater for anvendelse ved profylaktiske, diagnostiske eller terapeutiske applikasjoner. Slike preparater vil karakteristisk omfatte et eller flere av konjugatene, kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen, og en eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienter. Uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient" som benyttet her, henviser til et ikke-toksisk fast, halvfast eller flytende fyllstoff, diluent, innkapslingsmateriale eller formuleringshjelpemateriale av en hvilken som helst type som kan tolereres av et mottagerdyr, inkludert et menneske eller et annet pattedyr, hvortil det farmasøytiske preparat administreres, uten ugunstige effekter.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan administreres til en resipient på en hvilken som helst egnet administreringsvei som oralt, rektalt, parenteralt, intrasystemisk, vaginalt, intraperitonealt, topisk (som ved pulvere, salver, dråper eller transdermale puter), bukalt som oral- eller nesespray eller ved inhalering. Uttrykket "parenteralt" slik det her benyttes, henviser til administreringsmåter som inkluderer intravenøs, intra-arteriell, intramuskulær, intraperitoneal, intracisternal, subkutan og intra-artrikulær injeksjon og -infusjon.

Farmasøytiske preparater som tilveiebringes ifølge oppfinnelsen for parenteral injeksjon kan omfatte farmasøytisk akseptable, sterile, vandige eller ikke-vandige oppløsninger, dispersjoner, suspensjoner eller emulsjoner så vel som sterile pulvere for rekonstituering til sterile, injiserbare oppløsninger eller dispersjoner før bruk. Eksempler på egnede vandige og ikke-vandige bærere, diluenter, solventer og vehikler inkluderer vann, etanol, polyoler (som glyserol og lignende, propylenglykol, poly(etylenglykol)), karboksymetylcellulose og egnede blandinger derav, vegetabilske oljer (som olivenolje) og injiserbare, organiske estere som etyloleat. Egnet fluiditet kan opprettholdes for eksempel ved bruk av belegningsmaterialer som lecitin, ved opprettholdelse av den ønskede partikkelstørrelse når det gjelder dispersjoner, eller ved bruk av en surfaktant.

Slike farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan også inneholde adjuvanter som preservering-, fukte-, emulgerings- og dispergeringsmidler. Prevensjon av virkning av mikroorganismer kan sikres ved innarbeiding av forskjellige antibakterielle og antifungale midler, for eksempel paraben, benzylalkohol, klorbutanol, fenol, sorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å inkludere osmotiske midler som sukkere, natriumklorid og lignende. Forlenget absorpsjon for den injiserbare, farmasøytiske form kan tilveiebringes ved en inklusjon av midler som forsinker absorpsjon som aluminium monostearat, hydrogeler og gelatin.

I enkelte tilfeller og for å forlenge virkningen av medikamentene er det ønskelig å redusere absorpsjonen fra subkutan og intramuskulær injeksjon. Dette kan gjennomføres ved bruk av en flytende suspensjon av krystallinsk eller amorft materiale med dårlig oppløselighet i vandige kroppsfluider. Graden av absorpsjon av medikamentene avhenger så av oppløsningshastigheten som i sin tur kan avhenge av den fysikalske form. Alternativt kan forsinket absorpsjon av et parenteralt administrert medikament oppnås ved å oppløse eller suspendere medikamentet i en oljevehikkel.

Injiserbare depotformer fremstilles ved å tildanne mikroinnkapslede matriser av medikamentet i bionedbrytbare polymerer som polylaktid-polyglykolid. Avhengig av forhold mellom medikament og bærerpolymerer og arten av den spesielle bærerpolymer som benyttes, kan hastigheten for medikamentfrigivning kontrolleres. Eksempler på andre, bionedbrytbare polymerer inkluderer biokompatible poly(ortoestere) og poly(anhydrider). Injiserbare depotformuleringer fremstilles også ved å fange medikamentet i liposomer eller mikroemulsjoner som er kompatible med kroppsvev. De injiserbare formuleringer kan steriliseres, for eksempel ved filtrering gjennom bakterie-tilbakeholdende filtere, eller ved å innarbeide steriliseringsmidler i form av sterile, faste preparater som kan oppløses eller dispergeres i sterilt vann eller et annet sterilt, injiserbart medium før bruk.

Faste doseringsformer for oral administrering inkluderer kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I hver slik fast doseringsform blir aktive forbindelser blandet med minst en farmasøytisk akseptabel eksipient eller bærer som natriumcitrat eller dikalsiumsofat og/eller a) fyllstoffer eller ekstendere som stivelse, laktose, sukkrose, glukose, mannitol og silisiumsyre, b) bindemidler som karboksymetylcellulose, alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukkrose og gummi akasia,

c) fuktemidler som glyserol,

d) disintegreringsmidler som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet- eller tapioka stivelse, alginsyre, visse silikater og natriumkarbonat,

e) oppløsningsforsinkende midler som parafin,

f) absorpsjonsakseleratorer som kvarternære ammoniumforbindelser,

g) fuktemidler som for eksempel cetylalkohol eller glyserolmonostearat,

h) absorbenter som kaolin og bentonitt leire, og

i) smøremidler som talkum, kalsiumstearat, mangesiumstearat, faste PEGer,

natriumlaurylsulfat og blandinger derav.

Når det gjelder kapsler, tabletter og piller, kan doseringsformen også omfatte buffermidler.

Faste preparater av tilsvarende type kan også benyttes som fyllstoffer i myk- og hard-fylte gelatinkapsler ved bruk av slike eksipienter som laktose (melkesukker) så vel som høymolekylvekt PEGer og lignende.

Faste doseringsformer som tabletter, drageer, kapsler, piller og granuler kan fremstilles med belegg og omhyllinger som enteriske og kronomodulerende belegg og andre belegg som er velkjente på det farmasøytiske formuleringsområdet. Disse kan eventuelt inneholde opasitetsgivende midler og kan også være av en slik sammensetning at de frigir kun den eller de aktive bestanddeler eller preferensielt, i et visst område av fordøyelseskanalen, eventuelt på forsinket måte. Eksempler på omhyllingspreparater som kan benyttes inkluderer polymerstoffer og voks. De aktive forbindelser kan også foreligge i mikroinnkapslet form, hvis dette er hensiktsmessig, med en eller flere av de ovenfor nevnte eksipienter.

Flytende doseringsformer for oral administrering kan inneholde farmasøytisk akseptable emulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. I tillegg til de aktive forbindelser kan disse doseringsformer inneholde inerte fortynningsmidler som vanligvis benyttes i teknikken, for eksempel vann eller andre oppløsningsmidler, oppløseliggj ørende midler og emulgatorer som etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, dimetylformamid, oljer (særlig bommulsfrø-, jordnøtt-, mais-, germ-, oliven-, risinus- og sesamolje), glyserol, tetrahydrofurfurylalkohol, PEGer og fettsyreestere av sorbitan og blandinger derav.

I tillegg til inerte diluenter kan orale preparater også inkludere adjuvanter som fuktemidler, emulgatorer og suspenderingsmidler, søtnere, smaks- og luktstoffer.

Suspensjoner kan i tillegg til de aktive forbindelser inneholde suspenderende midler som etoksylerte isostearylalkoholer, polyoksyetylensorbitol og sorbitanestere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminium-metahydroksid, bentonit, agar-agar, tragakant og blandinger derav.

Topisk administrering omfatter administrering til hud eller slimhinner, inkludert overflaten av lunger og øyne. Preparater for topisk administrering inkluderer slike for inhalering og kan fremstilles som tørrpulver som kan settes under trykk eller være uten trykk. I ikke-trykksatte pulverpreparater kan aktive bestanddeler i fin oppdelt form benyttes i blanding med større dimensjonerte, farmasøytisk akseptable, inerte bærere omfattende partikler med en størrelse for eksempel opp til 100 um i diameter. Egnede, inerte bærere inkluderer sukkere som laktose og sukkrose. Ønskelig har minst 95 vekt% av partiklene av den aktive bestanddel en effektiv partikkelstørrelse i området 0,01 til 10 um.

Alternativt kan det farmasøytiske preparat være trykksatt og inneholde en komprimert gass som nitrogen eller et flytendegjort gass drivmiddel. Det flytendegjorte drivmedium og også det totale preparat kan fortrinnsvis være slik at de aktive bestanddeler ikke oppløses deri i vesentlig grad. Det trykksatte preparat kan også inneholde et overflateaktivt middel. Det overflateaktive middel kan være en væske eller et fast, ikke-ionisk, overflateaktivt middel eller kan være et fast, anionisk overflateaktivt middel. Det er foretrukket å benytte den faste, anioniske, overflateaktive middelet i form av et natriumsalt.

En ytterligere form for topisk administrering er til øyet. Med denne administreringsmetode blir konjugatene eller preparatene ifølge oppfinnelsen avgitt i en farmasøytisk akseptabel, oftalmisk vehikkel, slik at de aktive forbindelser holdes i kontakt med okkulæroverflaten i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate at forbindelsene å penetrere konjungtiva eller de korneale og indre områder av øyet som for eksempel det fremre kammer, det bakre kammer, det vitrøse legemet, den vandige humor, den vitrøse humor, kornea, iris/ciliær, linse, koroid/retina og sklera. Den farmasøytisk akseptable, oftalmiske vehikkel kan for eksempel være en salve, en vegetabilsk olje eller et innkapslingsmateriale.

Preparater for rektal eller vaginal administrering er fortrinnsvis suppositorier som kan fremstilles ved å blande konjugatene eller preparatene ifølge oppfinnelsen med egnede, ikke-irriterende eksipienter eller bærere som kakaosmør, PEG eller en suppositorievoks som ikke er fast ved romtemperatur, men flytende ved kroppstemperatur og derfor smelter i rektum- eller vaginalkaviteten og frigir medikamentene.

De farmasøytiske preparater som benyttes ifølge de terapeutiske metoder kan også administreres i form av liposomer. Som velkjent i teknikken avledes liposomer generelt fra fosfolipider eller andre lipidsubstanser. Liposomer dannes av mono- eller multilamellær, hydratisert væskekrystaller som er dispergert i et vandig medium. Hvilke som helst ikke-toksiske, fysiologisk akseptable og metaboliserbare lipider som er i stand til å danne liposomer, kan benyttes. I tillegg til et eller flere konjugater eller preparater ifølge oppfinnelsen kan de farmasøytiske preparater i liposomform også inneholde en eller flere stabilisatorer, preserveringsmidler, eksipienter og lignende. De foretrukne lipider er fosfolipidene og fosfatidylkolinene (lecitinene), både naturlige og syntetiske. Metoder for å fremstille liposomer er velkjent i teknikken (se for eksempel S. Zalipsky et al., US 5 395 619). Liposomer som omfatter fosoflipider som er konjugert til PEG, og mer vanlig fosfatidyletanolamin koblet til monometoksy-PEG har fordelaktige egenskaper inkludert forlenget levetid i blodsirkulasjonen hos pattedyr (D. Fisher, US 6 132 763).

B. Anvendelser

Som angitt annen steds blir metodene, konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen med fordel benyttet ved metoder for å opprettholde eller forbedre bioaktiviteten for de biologiske komponenter uten å interferere med evnen hos de biologiske komponenter til å binde til sine reseptorer. Visse slike metoder ifølge oppfinnelsen kan medføre avlevering av et eller flere av konjugatene og preparatene til celler, vev, organer eller organismer. Særlig tilveiebringer oppfinnelsen kontrollert avlevering av det ene eller de flere komponenter av konjugatene, kompleksene eller preparatene til celler, vev, organer eller organismer, for derved å gi brukeren muligheten for å regulere, temporært eller spatialt, mengden av en spesiell komponent som frigis for aktivitet på cellene, vev, organer eller organismer.

Rent generelt involverer slike metoder ifølge oppfinnelsen en eller flere aktiviteter. For eksempel omfatter en metode ifølge oppfinnelsen: (a) å fremstille et eller flere konjugater eller preparater ifølge oppfinnelsen som

detaljert her; og

(b) å bringe en eller flere celler, vev, organer eller organismer i kontakt med et eller flere konjugater eller preparater, under betingelser som favoriserer bindingen av det ene eller de flere konjugater eller preparater ifølge oppfinnelsen til celler, vev, organer eller organismer.

Når først de bioaktive komponenter av konjugatene og/eller preparatene ifølge oppfinnelsen er bundet til (eller i enkelte tilfeller internalisert med) cellene, vevene, organene eller organismene, fortsetter komponentene og utøve sin tilsiktede, biologiske funksjoner. For eksempel kan peptidkomponenter binde til reseptorer eller andre komponenter på eller i celler, vev, organer eller organismer; for å delta i metabolske reaksjoner i cellene, vevene, organene eller organismene; og gjennomføre, oppregulere eller aktivere eller eventuelt å nedregulere eller å inhibere, en eller flere enzymatiske aktiviteter i cellene, vevene, organene eller organismene; og tilveiebringe en manglende strukturkomponent til cellene, vevene, organene eller organismene; og tilveiebringe et eller flere næringsbehov for cellene, vevene, organene eller organismene; og inhibere, behandle, reversere eller på annen måte å forbedre en eller flere prosesser eller symptomer for en sykdom eller en fysisk lidelse; og lignende.

I ytterligere utførelsesformer kan konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen benyttes i industriell celledyrking, på grunn av de uventet høye potenser for de bioaktive komponenter av konjugatene som oppnås som et resultat av de kombinerte effekter av vesentlig retensjon av bioaktiviteten og øket virkningsvarighet selv under betingelsene for industriell bruk. Disse uventet høye potenser for oppfinnelsens konjugater kan føre til uventet høy biomasse produksjon, uventet høye nivåer av ekspresjon av rekombinante proteiner, og andre forbedringer når det gjelder effektiviteter ved bioprosessering.

C. Doseregimer

Konjugatene, kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres in vitro, ex vivo eller in vivo til celler, vev, organer eller organismer for til disse å avgi en eller flere bioaktive komponenter (dvs. et eller flere cytokiner eller antagonister derav). Fagmannen på området vil erkjenne at effektive mengder av en gitt, aktiv forbindelse, et konjugat, et kompleks eller et preparat, kan bestemmes empirisk og behøver ikke å benyttes i ren form eller, der slike former eksisterer, i farmasøytisk akseptabel formulering eller prodrug form. Forbindelsene, konjugatene, kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres til dyr (inkludert pattedyr som mennesker) som trenger dette, som veterinær- eller farmasøytisk preparat i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter. Det terapeutisk effektive dosenivå for en hvilken som helst spesiell pasient vil avhenge av et antall faktorer, inkludert typen og graden av cellulær respons som ønskes oppnådd; identiteten og/eller aktiviteten av den eller de spesielle forbindelser, konjugater, komplekser eller preparater som benyttes; alder, kroppsvekt eller overflateareal, generell helse, kjønn og diett hos pasienten, administreringstid, administreringsvei og utskillingsgrad for aktive komponenter; behandlingsvarighet; andre medikamenter som benyttes i kombinasjon eller sammenfallende med de spesifikke forbindelser, konjugater, komplekser eller preparater; og lignende faktorer som er velkjente for fagmannen på området farmasøytisk og medisinsk teknologi. For eksempel ligger det godt innenfor fagmannens område å starte doser av en gitt forbindelse, et konjugat, kompleks eller preparat ifølge oppfinnelsen på nivåer under det som er nødvendig for å oppnå en ønsket, terapeutisk effekt, og så gradvis å øke doseringen inntil den ønskede effekt er oppnådd.

Doseregimene kan også arrangeres på pasient-spesifikk måte for å gi på forhånd bestemte konsentrasjoner av en gitt, aktiv forbindelse i blodet, bestemt ved teknikker som er akseptert og som er rutine i teknikken, for eksempel størrelseseksklusjon, ionebyttings- eller reversfase høyytelses væskekromatografi ("HPLC"), bioanalyser eller immunoanalyser. Således kan pasient doseregimer justeres for å oppnå relativt konstante blodnivåer, målt ved HPLC eller immunoanalyser, i henhold til metoder som er rutinemessige og velkjente for fagmannen på det medisinske, farmasøytiske eller farmakologiske området.

D. Diagnostiske og terapeutiske anvendelser

En diagnostisk anvendelse av et konjugat ifølge oppfinnelsen kan være for å lokalisere celler eller vev med uvanlig høy bindingskapasitet for cytokinet, for eksempel en cancer, i kroppen hos et dyr, og særlig et menneske, ved administrering av et konjugat eller preparat ifølge oppfinnelsen der konjugatet (eller en eller flere komponenter, dvs. den bioaktive komponent og/eller den syntetiske polymer) er merket eller omfatter en eller flere detekterbare merkelapper for å muliggjøre detektering, for eksempel ved optisk, radiometrisk, fluorescent eller resonant detektering i henhold til kjente metoder. For eksempel uttrykker hovedandelen av ikke-småcelle lungecancere uvanlig høye konsentrasjoner av reseptorer for epidermal vekstfaktor (P.A. Bunn et al., (2002) Semin Oncol 29(Suppl 14): 38-44). I et ytterligere trekk ved oppfinnelsen kan således konjugater og preparater ifølge oppfinnelsen benyttes i diagnostiske eller terapeutiske metoder, for eksempel ved diagnostisering, terapi eller prevensjon av et antall fysiologiske lidelser i et dyr og særlig et pattedyr som et menneske, som er predisponert til eller lider av en slik lidelse. I andre anvendelser er et formål ved terapien å forsinke eller forhindre utviklingen av lidelsen og/eller å helbrede, indusere en remisjon eller opprettholde en remisjon av lidelsen og/eller å redusere eller minimalisere bivirkningene ved andre terapeutiske regimer.

Således kan konjugatene, kompleksene og preparatene ifølge oppfinnelsen benyttes for beskyttelse, suppresjon eller terapi av fysiske lidelser som infeksjoner eller sykdommer. Uttrykket "beskyttelse" eller "proteksjon" fra en fysisk lidelse, som benyttet her, omfatter "prevensjon", "suppresjon" og "terapi" eller tilsvarende uttrykk. "Prevensjon" involverer administrering av et kompleks eller et preparat ifølge oppfinnelsen før induksjon av sykdommen eller en fysikalsk lidelse, mens "suppresjon" involverer administrering av konjugatet eller preparatet før den kliniske opptreden av sykdommen og derfor foretas "prevensjon" og "suppresjon" av en fysisk lidelse typisk hos et dyr som er predisponert for eller tilbøyelig til å få lidelse, men som ennå ikke lider av den. "Terapi" eller tilsvarende er imidlertid en fysisk lidelse som involverer administrering av det terapeutiske konjugatet eller preparat ifølge oppfinnelsen etter opptreden av sykdommen. Det vil være klart at det ved human- eller veterinærmedisin er det ikke alltid mulig å skille mellom "prevensjon" og "suppresjon" av en fysisk lidelse. I mange tilfeller kan den ultimate, induktive hendelse eller flere slike være ukjente eller latente og verken pasienten eller legen må nødvendigvis være klar over det induktive element inntil godt etter at det har opptrådt. Det er derfor vanlig å benytte uttrykket "profylakse" som distinkt fra "terapi" for å omfatte både "prevensjon" og "suppresjon" som definert her. Uttrykket "proteksjon" eller tilsvarende, benyttes i forbindelse med metodene ifølge oppfinnelsen, er derfor ment å inkludere "profylakse". Metoder i henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan omfatte et eller flere trinn som tillater at legen oppnår de ovenfor beskrevne formål. En slik fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen kan for eksempel omfatte: (a) å identifisere et dyr (fortrinnsvis et pattedyr som et menneske) som lider av eller

er predisponert for en fysisk lidelse; og

(b) til dyret å administrere en effektiv mengde av et eller flere av konjugatene,

kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen som beskrevet her, slik at

administreringen av konjugatet, komplekset eller preparatene forhindrer, forsinker eller diagnostiserer utviklingen av, eller helbreder eller induserer remisjonen av den fysiske lidelse hos dyret.

Som benyttet her er et dyr som er "predisponert for" en fysisk lidelse definert som et dyr som ikke viser et antall åpne, fysiske symptomer på lidelsen, men som genetisk, fysiologisk eller på annen måte løper risiko for å utvikle lidelsen. I de foreliggende metoder kan identifiseringen av et dyr (som et pattedyr, inkludert et menneske) som er predisponert for, risikrer eller lider av en gitt fysisk lidelse, gjennomføres i henhold til velkjente standardmetoder som vil være velkjente for fagmannen, inkludert for eksempel radiologiske analyser, biokjemiske analyser (for eksempel analyser av de relative nivåer av spesielle peptider, proteiner, elektrolytter osv., i en prøve oppnådd fra et dyr), kirurgiske metoder, genetisk screening, familiehistorie, fysisk palpering, patologiske eller histologiske tester (for eksempel mikroskopisk bedømmelse av vev-eller kroppsfluid prøver eller utsmøringer, immunlogiske analyser osv), testing av kroppsfluider (for eksempel blod, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urin, spytt, sæd og lignende), et billedopptak (for eksempel radiologisk, fluorescent, optisk, resonans (for eksempel ved bruk av kjernemagnetisk resonans ("NMR") eller elektronspin resonans ("ESR")) osv. Når først et dyr er identifisert ved en eller flere slike metoder kan dyret aggressivt og/eller proaktivt behandles for å forhindre, undertrykke, forsinke eller helbrede den fysiske tilstand.

Fysiske lidelser som kan forhindres, diagnostiseres eller behandles med konjugatene, kompleksene, preparatene og metodene ifølge oppfinnelsen inkluderer hvilke som helst fysiske lidelser for hvilke den bioaktive komponent (typisk cytokinet eller antagonistene derav) av konjugatene eller preparatene kan benyttes ved prevensjon, diagnose eller terapi. Slike lidelser inkluderer, men er ikke begrenset til et antall cancere (for eksempel bryst-, uterin-, ovarie-, prostata- eller testikkelcancere, leukemier, lymfomer, lunge-, neurologiske-, hud-, hode- og hals-, ben-, kolon- og andre gastrointestinale, pankreate, blære- eller nyrecancere og andre karsinomer, sarkomer, adenomer og myelomer); iatrogeniske sykdommer; infeksiøse sykdommer (for eksempel bakterie sykdommer, fungale sykdommer, virale sykdommer (inkludert hepatitt, sykdommer forårsaket av kardiotropiske viruser, HIV/AIDS og lignende), parasittiske sykdommer og lignende); genetiske lidelser (for eksempel cystisk fibrose, amyotrofisk latteral sklerose, muskulær dystrofi, Gauchers sykdom, Pompes sykdom, alvorlig kombinert immunodefekt lidelse, dvergvekst og lignende), anemi, neutropeni, trombocytopeni, hemofili og andre blodlidelser; neurodegenerative lidelser (for eksempel multiple sklerose ("MS" inkludert, men ikke begrenset til, relapserende-remitterende MS, primær progressiv MS, sekundær progressiv MS og lignende), Creutzfeldt-Jakob sykdom, Alzheimers sykdom og lignende); enzymatiske lidelser (for eksempel gikt, uremi, hyperkolesterolemi og lignende); lidelser av uviss eller multifokal etiologi (for eksempel kardiovaskulær sykdom, hypertensjon, inflammatorisk tarmsykdom og lignende); autoimmune lidelser (for eksempel systemisk lupus erytomatose, reumatoid artritt, psoriasis og lignende) og andre lidelser av medisinsk betydning som lett erkjennes av fagmannen på området. Konjugatene, kompleksene, preparatene og metodene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes ved prevensjon av sykdomsprogresjon som ved kjemoprevensjon av progresjonen av en premalignant lesjon til et malignant lesjon.

Et eller flere konjugater, komplekser eller preparater ifølge oppfinnelsen, eller et eller flere av de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen, kan administreres til et dyr som trenger dette og et antall forskjellige administreringsmåter inkludert oral, rektal, parenteral (inkludert intravenøs, intra-arteriell, intra-muskulær, intraperitoneal, intracisternal, subkutan og intra-artikulær injeksjon og infusjon), intrasystemisk, vaginal, intraperitoneal, topisk (for eksempel ved pulvere, salver, dråper eller transdermale puter), bukal som oral- eller nesespray, eller ved inhalering. Ifølge oppfinnelsen kan en effektiv mengde av konjugatene, kompleksene eller preparatene administreres in vitro, ex vivo eller in vivo til celler eller dyr som lider av eller er predisponert for en spesiell lidelse, for derved forhindre, forsinke, diagnostisere eller behandle lidelsen hos dyret. Som benyttet her, henviser uttrykket "en effektiv mengde av et konjugat (eller kompleks eller preparat)" til en mengde slik at konjugatet (eller komplekset eller preparatet) utøver den biologiske aktivitet for den bioaktive komponent (dvs. cytokiner eller antagonisten derav) av konjugatet, komplekset eller preparatet, for derved å forhindre, forsinke, diagnostisere, behandle eller helbrede den fysikalske lidelse hos dyret til hvilket konjugat, komplekset eller preparatet ifølge oppfinnelsen er administrert. Fagmannen på området vil erkjenne at effektive mengder av konjugatet, komplekser eller preparater ifølge oppfinnelsen kan bestemmes empirisk i henhold til standardmetoder som er velkjente for fagfolk på det farmasøytiske og medisinske området, se for eksempel M.H. Beers et al, red. (1999) Merck Manual of Diagnosis & Therapy, 17. utgave, Merck og Co., NJ Rahway; J.G. Hardman et al., utgiver (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10. utgave, McGraw-Hill Medical Publishing Division, New York, T.M. Speight et al., utgiver (1997) Avery's Drug Treatment, 4. utgave, Adis International, Auckland, New Zealand; B.G. Katzung (2000) Basic & Clinical Pharmacology, 8. utgave, Lange Medical Books/McGraw-Hill, New York.

Det vil være klart at ved administrering til en human pasient vil den totale daglige, ukentlige eller månedlige dosering av konjugatene, kompleksene og preparatene ifølge oppfinnelsen bestemmes av legen innenfor rammen av vanlig, medisinsk bedømmelse. For eksempel oppnås tilfredsstillende resultater ved administrering av visse av konjugatene, kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen ved egnede doseringer avhengig av den spesifikke, benyttede aktive forbindelse, hvilke doseringer umiddelbart er velkjente for fagmannen på området og som lett kan bestemmes empirisk ved bruk av rutineforsøk. I henhold til dette aspekt ved oppfinnelsen kan konjugatene, kompleksene eller preparatene administreres en gang eller, i oppdelte doser, for eksempel en eller to ganger per dag, eller en eller to ganger per uke, eller en eller to ganger per måned osv. Egnede doseregimer for forskjellig administreringsmåter (for eksempel parenteral, subkutan, intramuskulær, intra-okulær, intranasal osv.) kan også lett bestemmes empirisk ved bruk av enkle rutineforsøk, eller vil være åpenbare for fagmannen på området, avhengig av identiteten av den bioaktive forbindelse (dvs. cytokinet eller antagonisten derav) av konjugatet, komplekset eller preparatet.

I ytterligere applikasjoner kan konjugatene, kompleksene og preparatene ifølge oppfinnelsen benyttes for spesifikt å målsøke et diagnostisk eller terapeutisk middel mot en celle, et vev, et organ eller en organisme som uttrykker en reseptor for, binder, inkorporerer eller på annen måte kan ta opp den bioaktive forbindelse (dvs. cytokinet eller antagonisten derav) av konjugatet, komplekset eller preparatet. Metoder i henhold til dette aspekt kan for eksempel omfatte å bringe cellen, vev, organer eller organismer i kontakt med et eller flere konjugater, komplekser eller preparater ifølge oppfinnelsen, og som i tillegg omfatter et eller flere diagnostiske eller terapeutiske midler, slik at konjugatet, komplekset eller preparatet er bundet eller tas opp av cellen, vevet, organet eller organismen, og derved avgir det diagnostiske eller terapeutiske middel til cellene, vevet, organet eller organismen. Det diagnostiske eller terapeutiske middel som benyttes i henhold til dette aspekt kan således være, men er ikke begrenset til, minst et middel valgt blant en nukleinsyre, en organisk forbindelse, et protein eller peptid, et antistoff, et enzym, et glykoprotein, et lipoprotein, et element, et lipid, et sakkarid, en isotop, et karbohydrat, et billedmiddel, en detekterbar probe eller en hvilken som helst kombinasjon derav, som på detekterbar måte kan merkes som beskrevet her. Et terapeutisk middel som benyttes i dette aspekt kan ha en terapeutisk virkning på målsetning (eller vev, organismen eller organet) idet effekten er valgt blant, men ikke begrenset til korreksjon av et defektivt gen eller protein, medikamentvirkning, toksisk effekt, vekststimulerende effekt, vekstinhiberende effekt, metabolsk effekt, katabolsk effekt, anabolisk effekt, antiviral effekt, antifungal effekt, antibakteriell effekt, en hormonal effekt, en neurohormonal effekt, en celledifferensierings stimulatorisk effekt, en celledifferensierings inhibitorisk effekt, en neuromodulatorisk effekt, en anti-neoplastisk effekt, en anti-tumor effekt, en insulinstimulerende eller inhiberende effekt, en benmarg stimulerende effekt, en pluripotent stamcelle stimulerende effekt, en immunsystem stimulerende effekt og en hvilken som helst annen kjent, terapeutisk effekt som kan tilveiebringes av et terapeutisk middel som avleveres til en celle (eller vev, organ eller organisme) via avleveringsysstemet ifølge dette aspekt ved oppfinnelsen.

Slike ytterligere, terapeutiske midler kan velges blant, men er ikke begrenset til, kjente og nye forbindelser og preparater inkludert antibiotika, steroider, cytoksiske midler, vasoaktive medikamenter, antistoffer og andre terapeutiske midler. Ikke-begrensende eksempler på slike midler der antibiotika og/eller medikamenter som benyttes ved behandling av bakterielt sjokk som gentamycin, tobramycin, nafcillin, parenteral cefalosporiner osv.; adrenale kortikosteroider og analoger derav som deksametason, mitigering av cellulær skade forårsaket av endotoksiner, vasoaktive medikamenter som a-adrenergiske reseptor blokkeringsmidler (for eksempel fenoksybenzamin), en 0-adrenergisk reseptoragonist (som isoproterenol) og dopamin.

Konjugatene, kompleksene og preparatene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes for diagnose av sykdom og for å følge terapeutiske responser. I visse slike metoder kan konjugater, komplekser eller preparater ifølge oppfinnelse omfatte en eller flere detekterbare merkelapper (som de som er beskrevet annet steds her). I spesifikke slike metoder kan disse detekterbart merkede konjugater, komplekser eller preparater ifølge oppfinnelsen benyttes for å detektere celler, vev, organer eller organismer som uttrykker reseptorer for, eller på annen måte tar opp den bioaktive komponent (dvs. cytokin eller antagonist derav) av konjugatene, kompleksene eller preparatene. I et eksempel ved en slik metode blir cellen, vevet, organet eller organismen brakt i kontakt med et eller flere av konjugatene, kompleksene eller preparatene ifølge oppfinnelsen under betingelser som favoriserer binding eller opptak av konjugatet av cellen, vevet eller organismen (for eksempel ved binding av konjugatet til en celleoverflate reseptor eller ved pinocytose eller diffusjon av konjugatet inn i cellen) og så detektering av konjugatet bundet til eller inkorporert i cellen ved bruk av detekteringsmiddelet som er spesifikke for den benyttede merkelapp (for eksempel fluorescensdetektering for fluorescent merkede konjugater; magnetisk resonans billedopptak for magnetisk merkede konjugater; radiobilledopptak for radiomerkede konjugater; osv.). Andre anvendelser av slike detekterbart merkede konjugater kan for eksempel inkludere billedopptak av en celle, et vev, et organ eller en organisme, eller den indre struktur av et dyr (inkludert et menneske) ved administrering av en effektiv mengde av en merket form av et eller flere av konjugatene ifølge oppfinnelsen og måling av detekterbar stråling assosiert med cellen, vevet, organet eller organismen (eller dyret). Metoder for detektering av forskjellige typer merkelapper og deres anvendelser i diagnose og terapeutisk billedopptak er velkjente for fagfolk og er beskrevet annen steds her.

I et annet aspekt kan konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen benyttes i metoder for å modulere konsentrasjonen eller aktiviteten av en spesifikk reseptor for den bioaktive komponent av konjugatet på overflaten av en celle som uttrykker slik reseptor. Med "modulering" av aktiviteten for en gitt reseptor menes at konjugatet, ved binding til reseptoren, enten aktiverer eller inhiberer den fysiologiske aktivitet (for eksempel den intracellulære signalkaskade) som medieres via denne reseptor. Uten å ønske å være bundet til noen spesiell mekanistisk forklaring for den regulatoriske aktivitet av konjugatene ifølge oppfinnelsen, kan slike konjugater antagonisere den fysiologiske aktivitet av en cellulær reseptor ved binding til reseptoren via den bioaktive komponent av konjugatet, for derved å blokkere bindingen av den naturlige agonist (for eksempel ikke-konjugert, bioaktivt komponent) og å forhindre aktivering av reseptoren på grunn av den naturlige agonist uten å indusere noen vesentlige aktivering av den fysiologiske aktivitet av reseptoren per se. Metoder ifølge dette aspekt ved oppfinnelsen kan omfatte et eller flere trinn, for eksempel å bringe cellen (noe som kan skje in vitro eller in vivo) i kontakt med et eller flere konjugater ifølge oppfinnelsen under betingelser slik at konjugatet (dvs. den bioaktive komponentdel av konjugatet) binder til en reseptor for den bioaktive komponent av celleoverflaten, men ikke vesentlig aktiverer reseptoren. Slike metoder vil være brukbare i et antall diagnostiske og terapeutiske anvendelser slik fagmannen umiddelbart vil erkjenne.

Kit

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også kit (sett) omfattende konjugatene og/eller preparatene ifølge oppfinnelsen. Slike kit omfatter karakteristisk en bærer som en boks, en kartong, et rør eller lignende, med et lukket rom deri i form av en eller flere beholdere som vialer, rør, ampuller, flasker, sprøyter og lignende, der en første beholder inneholder et eller flere av konjugatene og/eller preparatene ifølge oppfinnelsen. Kittet som omfattes ved dette aspekt av oppfinnelsen kan videre omfatte en eller flere ytterligere komponenter, dvs. reagenser eller forbindelser, som er nødvendige for å gjennomføre en eller flere applikasjoner av konjugatene og preparatene ifølge oppfinnelsen slik at en eller flere komponenter som er brukbare for diagnosen, behandlingen eller prevensjonen av en spesiell sykdom eller fysisk lidelse (for eksempel en eller flere ytterligere terapeutiske forbindelser eller preparater, en eller flere diagnostiske reagenser, en eller flere bærere eller eksipienter og lignende), et eller flere ytterligere konjugater eller preparater ifølge oppfinnelsen og lignende.

Fagmannen vil umiddelbart erkjenne at ytterligere egnede modifikasjoner og adapsjoner av metodene og applikasjonene som beskrevet her kan foretas uten å gå utenfor oppfinnelsens ånd og ramme. Oppfinnelsen er beskrevet i detalj og den vil forstås ytterligere under henvisning til de følgende eksempler som er gitt som illustrasjon.

EKSEMPLER

Følgende eksempler, særlig som vist grafisk i Figur 1, gir en lett visualisert basis for forståelsen av den potensielle rolle av sterisk hindring for proteinreseptor interaksjoner av PEGylering når det gjelder reseptorbindingsproteiner innen eller nær reseptorbindingsdomene for disse bioaktive komponenter. Det store volum som opptas av de sterkt forlengede og fleksible PEG-tråder vil også sterisk hindre assosiasjonen av monomerene av visse reseptorbindingsproteiner til funksjonelle homodimerer eller homotrimerer, hvis PEG kobles i områder som rapporteres å være nødvendige for interaksjoner mellom monomerene. Således reduserer målsøking av PEGylering til seter som er fjernt fra reseptorbindingsområdene av reseptorbindingsproteiner sannsynligheten for et PEGylering vil interferere med de intermolekylære interaksjoner som er krevet for deres funksjon. Ved å gå frem i henhold til foreliggende oppfinnelsesmetode, kan flere av fordelene som ventes fra PEGylering av reseptorbindignsproteiner realiseres. De resulterende konjugater kombinerer de ventede fordeler av forbedret oppløselighet, øket biotilgjengelighet, større stabilitet og redusert immunogenisitet med en uventet høy retensjon av bioaktivitet.

Eksempel 1: PEGylering av interferon-pMb med reduktiv

alkylering

I en serie utførelsesformer ble konjugater av interferon-P-lb ('TFN-P-lb", Sekv. Id. Nr. 1) med monometoksyPEG ("mPEG") syntetisert ved reduktiv alkylering med 20 kDa-eller 30 kDa mPEG-aldehyd ved bruk av boran-pyridinkompleks som reduksjonsmiddel (J.C. Cabacungan et al., supra). Interferon-P-lb, fri for bærerproteiner og i konsentrasjoner på rundt 1,9 mg/ml i en oppløsning inneholdende rundt 3 mg/ml SDS, ble oppnådd fra Chiron Corporation (Emeryville, CA). Dette protein angis som "BETASERON®" i formuleringen som markedsføres av Berlex Laboratories, et US datterselskap av Schering AG og som "BETAFERON®" i den formulering som markedsføres direkte av Schering. Boran-pyridinkompleks (Aldrich 17,975-2, Milwaukee, WI) ble fortynnet til 450 mM boran i 60 volum% vandig acetonitril. 20 kDa mPEG n-propionaldehyd ("PEG-aldehyd"; NOF Corporation, Tokyo) ble oppløst i 1 mM HC1 ved en konsentrasjon på 30 mg/ml. Etter oppløsning ble 0,1 ml av PEG-aldehydoppløsningen satt til 0,7 ml av IFN-P-lb oppløsning og blandet. Tilsetning av 0,05 ml 100 mM acetatbuffer, pH 4,6, ga reaksj onsblandingen en slutt-pH-verdi på 5. Til en annen reaksj onsblanding inneholdende 0,1 ml PEG-aldehyd oppløsning og 0,7 ml IFN-P-lb oppløsning ble 0,05 ml av en blanding av 200 mM eddiksyre, 200 mM Na2HP04og 68 mM NaOH tilsatt for å gi en slutt-pH-verdi på 6,4. Til tre 0,85 ml alikvoter av hver av disse blandinger ble det satt 0,1 ml enten vann, 1,5 M NaCl eller 10 mg/ml SDS. Det fortynnede boran-pyridinkompleks ble så satt til hver reaksj onsblanding for å gi en sluttkonsentrasjon på 23 mM boran. Hver av de resulterende reaksj onsblandinger ble delt i to rør som ble innkubert i 2 dager ved enten 4°C eller romtemperatur. Alikvoter av reaksj onsblandingene ble analysert ved størrelseseksklusjons HPLC i 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3, inneholdende 0,3 mg/ml SDS ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min på en Superose™ 12 kolonne (Amersham Biosciences HR 10/30; Piscataway, NJ). Absorbansen for eluatet ble overvåket ved 214 nm. Med et input-forhold på rundt 2 mol PEG per mol protein, var de predominante spesier monoPEGylert interferon-P-lb (PEGi-IFN-P-lb). Utbyttet av PEGi-IFN-P-lb var mellom 65 og 72% under alle de testede innkuberingsbetingelser (ved pH 5 eller pH 6,4; ved 4°C eller romtemperatur, i nærvær eller fravær av NaCl eller ytterligere SDS).

I andre forsøk ble NaBH3CN benyttet som reduksjonsmiddel og prøvene ble analysert ved størrelseseksklusjons HPLC på en Superdex 200 HR 30/10 kolonne (Amersham Biosciences) i 10 mM acetat, 150 mM NaCl, pH 4,6, inneholdende 1 mg/ml SDS ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Resultatene av et slikt forsøk er vist i Figur 2. Input-konsentrasj onene av 20 kDa mPEG var rundt 0,1 mM, 0,2 mM og 0,4 mM (angitt som "lx", "2x" og "4x" i Figur 2) og reaksj onsblandingen ble innkubert ved romtemperatur i 3 dager. Kontrollprøven (bunnsporet) ble innkubert med kun reduksjonsmiddel. Når de samme prøver ble kromatografert under de samme betingelser, bortsett fra utelatelsen av SDS fra elueringsbufferen, ble ikke-PEGylert IFN-P-lb ikke detektert i eluatet. Tilsvarende resultater ble oppnådd når 30 kDa mPEG n-propionaldehyd ble benyttet i stedet for 20 kDa mPEG n-propionaldehyd i metodene i dette Eksempel 1. Tilsvarende resultater ble også oppnådd når 10 kDa mPEG n-propionaldehyd ble benyttet i stedet for 20 kDa mPEG n-propionaldehyd. Alternativt kan mPEG-acetaldehyder eller -butyraldehyder benyttes. Selektiv N-terminal PEGylering av IFN-P ved fremgangsmåten ifølge dette eksempel, gir konjugater med forbedret bioaktivitet uansett om N-terminal aminosyre er serin, som i IFN-P-lb, metionin som i IFN-P-la eller en annen aminosyre.

Eksempel 2: Bestemmelse av graden av N-terminal PEGylering med

oksidativ spalting

Andelen av PEG som er koblet til a-aminogruppen av N-terminal serinrest av et protein, heller en til e-aminogruppen av tilgjenglige lysinrester, ble bedømt med en ny metode som involverte oksidativ spalting av den alkylerte serinrest. En reaksj onsblanding der PEGi-IFN-P-lb var den predominante spesie (rundt 70% av det totale protein) ble dialysert mot 1 mg/ml SDS i acetatbuffer, pH 4,6. pH-verdien ble så justert til 7,4 ved tilsetning av 10 mM Na3PC>4. Andeler av denne oppløsning ble innkubert ved 4°C i opp til 20 timer i fravær av natriumperjodat eller med sluttkonsentrasjoner på 0,1 til 10 mM NaIC>4. Etter innkubering ble reaksj onsblandingene kromatografert på en Superose™ 6-kolonne i 10 mM acetatbuffer, 150 mM NaCl, pH 4,6, inneholdende 1 mg/ml SDS. Tilsvarende resultater med henblikk på gjenvinning av monoPEGylert IFN-P-lb ble oppnådd på en Superose 12-kolonne med fordelen av at Superose 12-kolonnen tillot oppløsning av det ikke-modifiserte IFN-P-lb fra "salttoppen". En graf av arealene under toppene av absorbans ved 214 nm tilsvarende PEGi-IFN-P-lb versus perjodat konsentrasjonen viste en steil reduksjon i arealet opp til 1 mM perjodat og så å si konstant nivå av gjenværende PEGi-IFN-P-lb mellom rundt 1 mM og 10 mM perjodat. Tilsvarende analyser etter behandling med > 3 mM perjodat i 0,2, 2 henholdsvis 7 timer antydet at den oksidative spalting av det serinbundne PEG var i det vesentlige fullstendig i løpet av 2 timer. De gjenværende PEG-konjugater inneholdt kun lysin-forbundet PEG, hvilken binding var stabil mot behandling med opp til minst 10 mM perjodat. Andelen av konjugater som overlevet oksidasjoner med perjodat var tilsvarende fraksjonen som ble estimert ved Edman-nedbrytning til å være PEGylert ved seter andre enn aminoterminal en. Tilsvarende resultater oppnås når fordelingen av konjugater som er stabile eller ustabile mot oksidative prosedyrer som beskrevet i dette eksempel bedømmes ved et antall analytiske metoder inkludert, men ikke begrenset til reversfase kromatografi, kapillær elektroforese, gel-elektroforese, ultrasentrifugering, massespektroskopi, lysspredning eller ultrafiltrering.

Interferon-P-lb ble koblet til 20 kDa PEG-aldehyd med boran-pyridin kompleks som reduserende middel under varierende betingelser, som beskrevet i Eksempel 1. Det monoPEGylerte IFN-P-lb ble renset ved kromatografi på en Superose 12-kolonne i 20 mM natriumfosfatbuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4, inneholdende 0,3 mg/ml SDS, ved en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Andeler av de rensede PEGi-IFN-P-lb konjugater ble innkubert i 2 timer ved romtemperatur i fravær eller nærvær av 3 mM natriumperjodat. Figur 3 viste kromatogrammer av de ikke-behandlede og oksidativt spaltede prøver av PEGi-IFN-P-lb på en Superose 12-kolonne i 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3, inneholdende 0,3 mg/ml SDS, kjørt ved 0,5 ml/min. Disse data antyder at rundt 90% av PEG i PEGi-IFN-p-lb som var syntetisert ved pH 6,4, var koblet til N-terminal serinet. Dette resultat ble ikke endret signifikant ved å gjennomføre koblingen etter tilsetting av enten 150 mM NaCl (nedre kurver) eller 1 mg/ml SDS (øvre kurver) til reaksjonsblandingene eller ved å gjennomføre koblingsreaksjonene ved pH 5 (resultater ikke vist). Tilsvarende resultater oppnås når monohydroksyPEG n-propionaldehyder benyttes i stedet for mPEG n-propionaldehyder eller når PEG-aldehyder andre enn n-propionaldehyd benyttes. På samme måte måler fremgangsmåten ifølge dette eksempel graden av N-terminal, reduktivt alkylerte proteiner andre enn IFN-P-lb, der slike proteiner har en N-terminal serin- eller treoninrest. På samme måte blir oksidativ spalting av polymerer bundet ved reduktiv alkylering til N-terminal serin- eller -treoninrest oppnådd ved bruk av perjodater andre enn natriumperjodat inkludert, men ikke begrenset til: natrium-metaperjodat (annen steds her og i teknikken kjent som natriumperjodat), kalium-metaperjodat, litiummetaperjodat, kalsiumperjodat, bariumperjodat og perjodsyre.

Polymerkonjugater som var syntetisert ved reduktiv alkylering av andre cytokiner på hvilke metoden ifølge dette Eksempel 2 kan anvendes, inkludert interleukin-l-oc (K.F. Geoghegan et al., supra) og megakaryocytt vekst- og -utviklingsfaktor (P.I. Guerra, et al, supra).

Eksempel 3: Rensing av konjugater og fjerning av fri PEG og SDS

ved reversfase kromatografi

Reversfase ("RP") kromatografi ble benyttet av S. Hershenson et al. (US 4 894 330) for å rense IFN-P-lb etter dets ekspresjon i bakteriecellekultur. Foreliggende oppfinnere tilpasset metodene ifølge Hershenson et al. til å separere de individuelle PEGylerte spesier som var syntetisert som beskrevet i Eksempel 1, fra det ikke-modifiserte protein. Denne prosedyre oppløste også fritt PEG og mesteparten av SDS fra proteintoppene. Figur 4 viser et analytisk kromatogram på en Jupiter™ C4 300Å kolonne (15 cm x 4,6 mm; Phenomenex; Torrance, CA) med en gradient på 20% acetonitril pluss 0,04% trifluoreddiksyre til 80% acetonitril pluss 0,1% trifluoreddiksyre. 1/10 milliliter av reaksj onsblandingen ble lastet inn og 0,5 ml fraksjoner samlet ved en strømningshastighet på 1 ml/min. En topp av IFN-P-lb som var ikke-modifisert bortsett fra eksponering til PEGylerings reagensene ("Mock PEGylert") og topper av PEG-konjugater inneholdende en eller flere tråder av PEG per molekyl protein ble detektert ved å overvåke absorbansen ved 280 nm (fast kurve). I dette forsøk ble kolonnen holdt ved 40°C. Kvalitativt tilsvarende resultater, men med forskjellige retensjonstider, ble oppnådd ved kromatografi ved romtemperatur.

Resultatene av analysene av SDS i de samlede fraksjoner er vist ved de åpne triangler. En forrådsoppløsning av SDS-analysereagensen inneholder 1 mg/ml av et karbocyanin fargestoff, Stains-All (Sigma, nr. E-9379; 3,3'-dietyl-9-metyl-4,5,4',5'-dibenzotiakarbocyanin) i 50% (v/v) vandig isopropanol (F. Rusconi et al, (2001) Anal Biochem 295:31 -37). Arbeidsreagensen ble preparert akkurat i forkant ved blanding av 2 ml av forrådsoppløsningen pluss 2 ml N,N-dimetylformamid og 41 ml vann. Tilsetning av SDS til denne reagens forårsaket spektralforandringer som er spesifikke for SDS og som resulterte i en reduksjon i absorbanstoppen ved 510-515 nm og opptredenen av en absorbanstopp ved 439 nm. Forandringene i absorbans ved 439 nm etter tilsetning av 2 mikroliter av hver fraksjon, fra RP-kromatografi kolonne til 250 mikroliter av arbeidsreagensen i en 96-brønners plate ble overvåket i en SpectraMax 250 plateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Resultatene av en analyse for PEG i de samlede fraksjoner er vist ved de fylte sirkler i

Figur 4. PEG-analysereagens som ble preparert umiddelbart før bruk ved blanding av 1 volum 20% vekt/volum bariumklorid i IN HC1 med 4 volumer 4 mg/ml jod i 1% vekt/volum kaliumjodid. Fra hver fraksjon av RP-kromatografi kolonne (og PEG-standardene) ble en 10 mikroliter alikvot satt til 90 mikroliter vann i brønnene i en 96-brønners plate fulgt av 10 mikroliter PEG-analysereagens. Etter at prøver og reagenser var blandet og innkubert ved romtemperatur i 15 minutter ble absorbansen ved 508 nm målt i en SpectraMax plateleser. Grafene i Figur 4 viser at RP-kromatografi under disse betingelser separerte Mock PEGylert protein fra konjugater inneholdende en eller flere tråder av 20 kDa PEG, mens ikke-bundet PEG og SDS ble oppløst fra konjugatene. Tilsvarende resultater ble oppnådd med konjugater inneholdende PEGer av andre molekylvekter (for eksempel 10 kDa eller 30 kDa PEG) og andre, syrestabile bindinger mellom PEG og IFN-p-lb.

Eksempel 4: Kromatografiske og elektroforetiske analyser av

rensede fraksjoner fra preparativ reversfase HPLC

Reversfase kromatografi under betingelser tilsvarende de som er beskrevet i Eksempel 3 ble gjennomført på større prøver (0,3 eller 0,5 ml) av PEGylerings reaksjonsblandinger på den samme Jupiter C4-kolonne med en modifisert gradient. Når større prøver ble fylt inn var oppløsningen blant de forskjellige former av interferon (Mock PEGylert, PEGi-IFN-P-lb eller konjugater med mer enn en tråd av PEG) ikke så klar som vist i Figur 4. Ikke desto mindre ble det oppnådd fraksjoner som var høyt anriket enten på Mock PEGylert eller på monoPEGylerte protein som vist ved rekromatografi av små alikvoter av de delvis rensede fraksjoner på den samme RP-kolonne (Figur5). Kromatogrammene ble analysert ved bruk av EZChrom Elite software (Scientific Software, Inc., Pleasanton, CA). Fra denne analyse inneholdt preparatet som vises i den øvre kurve (Fraksjon 53 fra preparativ RP-kolonne) rundt 70-80% Mock PEGylert IFN-P-lb, mens preparatet vist i den midtre kurve (Fraksjon 51) inneholdt 99% PEGi-IFN-P-lb. Bunnkurven i Figur 5 viser et kromatogram av reaksj onsblandingen hvorfra fraksjonene ble hentet, der rundt 19% av absorbansen ble assosiert med det Mock PEGylerte protein, rundt 61% med toppen til PEGi-IFN, rundt 12% med toppen merket PEG2-IFN og 5-6% med former som eluerte tidligere en PEG2-IFN. Kvantitative, tilsvarende resultater oppnås når reversfase kolonner fra andre produsenter benyttes.

Den samme reaksj onsblanding (analysert ved RP-kromatografi i Figur 5) og to fraksjoner av PEG-interferon, renset ved RP-kromatografi, ble analysert ved polyakrylamid gelelektroforese i nærvær av SDS ("SDS-PAGE"). Resultatene er vist i Figurene 6 og 7. Replikatprøver ble innkubert med et reduksjonsmiddel (Invitrogen, nr. NP0004; Carlsbad, CA) eller uten reduksjonsmiddel i 10 minutter enten ved omgivelsestemperatur eller 102°C og elektroforesert i 140 minutter ved 120 volt gjennom et 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen, nr. NP0321B). Sporene som vises i Figurene 6 og 7 var fra prøvene som verken var redusert eller oppvarmet. Proteinene i gelen ble farget med SYPRO® Ruby Stein (Molecylar Probes nr. S-12000, Eugene, OR), belyst ved 302 nm og fotografert ved bruk av et oransje/rødt synlig lysfilter (Molecular Probes, nr. S-6655) (Figur 6). Digitalbildene ble analysert ved bruk av ID Imaging Analysis program fra Kodak (Rochester, NY). Den horisontale akse representerer migreringsavstanden i forhold til fargestoff fronten (100 enheter) og den vertikale akse representerer den relative intensitet for fluorescent proteinfargen. Bunnlinje verdiene for de forskjellige spor er forskjøvet vertikalt for å klargjøre presentasjonen av resultatene. Bunnsporene representerer en blanding av standardproteiner (Marki2™, nr. LC5677 fra Invitrogen), hvori toppene nummerert 1 til 9 er identifisert som proteiner med de følgende molekylvekter (alle i kDa): 200, 116, 97,1, 66,3, 55,4, 36,5, 31,0, 21,5 og 14,4. Det andre spor fra bunnen viser den elektroforetiske analyse av reaksj onsblandingen. I denne blanding var prosentandelene av proteinfarge assosiert med hver form av IFN-P-lb: 14% Mock PEGylert; 64% PEGi-IFN; 20% PEG2-IFN og rundt 2% av former større enn PEG2-IFN. Det tredje spor fra bunnen viser en fraksjon fra RP kromatografikolonnen som inneholdt 33 + 1%, PEGi-IFN, 64+1% PEG2-IFN og rundt 6% former større enn PEG2-IFN. Toppkurven viser en fraksjon inneholdende 95+1% PEGi-IFN, rundt 2% Mock PEGylert IFN og rundt 2% former større enn PEG2-IFN. Prosentandelene som antydes ovenfor er gjennomsnitt og standardavvik av resultater av fire replikatnalyaser for hver prøve. Kvantitativt tilsvarende resultater ble oppnådd ved PEGer på 10 kDa og 30 kDa. Figur 7 viser resultatene fra SDS-PAGE-analyser som beskrevet for Figur 6, bortsett fra at gelen var faget for PEG ved bruk av 20% vekt/volum BaCb i IN HC1 kombinert med 4 volumer 4 mg/ml I2i 1% vekt/volum Kl. Bunnsporet representerer en blanding av på forhånd fargede standardproteiner (SeeBlue Plus2™, Invitrogen nr. LC5625) der toppene nummerert 1 til 9 identifiserer proteiner med de følgende tilsynelatende molekylvekter (i kDa): 204, 111, 68,8, 51,5, 40,2, 28,9, 20,7,14,9 og c. 6. De kvantitative analyser av de PEG-fargede geler indikerte at 99% av PEG i Fraksjon 51 fra RP-kolonnen (toppkurven) er assosiert med PEGi-IFN mens fraksjonen anriket på diPEG-konjugat (andre kurve fra toppen) inneholdt 25+ 1% PEGi-IFN og rundt 3% former større enn PEG2-IFN, i tillegg til rundt 71% PEG2-IFN. Ved estimering av de relative mengder av de forskjellige former av IFN-P-lb som er farget for PEG, ble arealet under PEG2-IFN-toppen dividert med 2. I reaksj onsblandingen (andre kurve fra bunnen) var rundt 50% PEG-farge assosiert med ikke-bundet PEG, rundt 35% med PEGi-IFN, rundt 14% med PEG2-IFN og rundt 1% med former større en PEG2-IFN.

Eksempel 5: Selektiv N-terminal oksidasjon av interferon-pMb og

kobling til et lav-molekylærvekt karbazat

En alternativ metode for kobling av mPEG til aminoterminus av IFN-P-lb ble benyttet for å øke den tilsynelatende selektivitet for dette festesete til rundt 100% fra verdien på rundt 90% som ble oppnådd ved reduktiv alkylering, som beskrevet i Eksemplene 4 og 5. Det første trinn i denne metode av PEGylering er basert på et tilsvarende prinsipp til oksidativ spalting av reduktivt alkylert PEG-IFN-P-lb som beskrevet i Eksempel 2. Denne veien trekker fordel av den unike sensitivitet hos en N-terminal serin- eller -treoninrest til å kunne spaltes til et aldehyd med perjodat, som angitt av H.B.F. Dixon (supra) og av K.F. Geoghegan et al. ((1992) Bioconjug Chem 3:138-146; K.F. Geoghegan, US 5 362 852; R.J. Drummond et al., US 6 423 685). Når N-terminal serinresten av IFN-P-lb var maksimalt oksidert, f.eks. etter behandling med 3 mM NaIC>4i 2 timer ved romtemperatur, syntes den resulterende topp for proteinabsorbans bred ved preliminær størrelseseksklusjonskromatografi på en Superose 6 kolonne. Etterfølgende analyse på en Superose 12 kolonne i 10 mM acetat, 150 mM NaCl, pH 4,6, inneholdende 0,3 mg/ml SDS oppløste tydelig det oksiderte protein i to former som ble tolket til å være monomerer og dimerer av proteinet. Identiteten av disse to topper ble bekreftet ved SDS-PAGE, gjennomført som beskrevet i Eksempel 4.

Analyser ved revers fasekromatografi dokumenterte videre den oppdagelse av preferensiell oksidasjon av N-terminal serinet ble oppnådd med minimal oksidasjon av minst en essensiell metioninrest. L.S. Lin et al, ((1996) Pharm Biotechnol 9:275-301) og L. Lin ((1998) Dev Biol Stand 96:97-104) viste at RP-kromatografi oppløste preparater av IFN-P-lb i hovedkomponenten ("Topp B") og en mindre komponent som eluerte tidligere ("Topp A"). Lin ((1998) supra) viste videre at Topp A inneholdt IFN-P-lb hvori et funksjonelt aktivt metionin (Met 61 av BETASERON) ble oksidert til et sulfoksid. Foreliggende oppfinnere har funnet betingelser under hvilke så å si fullstendig oksidasjon av N-terminal serin kan oppnås med minimal oksidasjon av Met 61 som reflektert i prosentandelen av Topp A i RP-kromatogrammene. Oksidasjon av Met 61, målt ved RP-kromatografi, ble benyttet som en surrogatmarkør for oksidasjon av de andre metioninrester av IFN-p-lb (Met 35 og Met 116 av BETASERON).

Studier av graden av oksidasjon av Met 61 som en funksjon av pH-verdi og innkuberingstid med 0,25 mM NaI04ved 4°C, er oppsummert i Tabell 1.

Påvisningen av aldehyddannelse ved N-terminal oksidasjon av IFN-P-lb ble tettet ved konjugering til 9-fluorenylmetylkarbazat ("Fmoc-karbazat", også i teknikken kjent som "Fmoc-hydrazid") (Fluka 46917; R-E. Zhang et al., (1991) Anal Biochem 195:160-167). De distinktive absorbansspektra av Fmoc-karbazat addukter i IFN-P-lb muliggjorde deres diskriminering fra de tilsvarende ikke-konjugerte former av proteiner uten bruk av en fluorescens detektor. Interferon-P-lb ble oksidert ved behandling med forskjellige konsentrasjoner av NaI04ved pH 7,8 i forskjellige tidsrom (0,5 til 2 timer ved romtemperatur, eller opp til flere dager i kulde). I forsøket som vist i Figur 8 ble proteinet innkubert i 1 time ved romtemperatur med 0,5 mM NaI04. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetting av glyserol. Etter 30 minutter ved romtemperatur ble pH-verdiene redusert ved tilsetting av eddiksyre til en sluttkonsentrasjon på 19 med mer. Til hver ml av den resulterende blanding ble det tilsatt 182 mikroliter 15 mM Fmoc- karbazat i metanol for å gi en sluttkonsentrasjon på 2,3 mM Fmoc-karbazat. Denne reaksj onsblanding ble innkubert over natten ved 4-8°C før analyse ved reversfase kromatograf

Figur 8 illustrerer effektene på RP kromatografisk oppførsel for innkubering av IFN-P-lb med 0,5 mM NaIC>4i 1 time ved romtemperatur og kobling av oksidasjonsproduktet til Fmoc-karbazat. En sammenligning av resultatene for kontrollprøven (øvre kurve) med de for den oksiderte prøve (midtre kurve med åpne sirkler) viste at retensjonstiden for både hovedkomponenten og Topp A (refererer nærværet av rundt 5% IFN-P-lb med en oksidert metioninrest) økes med 0,2 til 0,3 minutter ved oksidasjon. Som målt ved prosentandelen av Topp A, sammenlignet med Topp A', ble mindre enn 1% oksidering av metionin detektert etter innkubering med NaIC>4under disse betingelser.

Resultatene av bioanalyser som er beskrevet i Eksempel 8 gir ytterligere bevis på at kontrollert oksidasjon (for eksempel opp til 2 timer i kulde) med 0,1 til 0,3 mM perjodat bevarte integriteten hos aminosyrerestene i proteinet som er vesentlig for bioaktiviteten.

Som vist i den nedre kurve med fylte triangler i Figur 8 ble bevis på dannelsen av Fmoc-addukter tilveiebrakt ved skift til lengre retensjonstider for både hovedkomponenten og Topp A' (N-terminal aldehydderivatet av Topp A). Videre var det en 50% økning i forholdet mellom absorbansen ved 278 nm og den ved 214 nm for de skiftede topper. For begge former av proteinet var økningene i retensjonstider på grunn av dannelsen av de tilsvarende N-terminale aldehyder (0,2-0,3 minutter) meget mindre, men økningen som skyldes dannelse av de tilsvarende Fmoc-derivater (1,0-1,2 minutter).

Eksempel 6: Syntese av PEG-karbazat-addukter av N-terminalt

oksidert interferon-|3-lb

Interferon-P-lb, selektivt oksidert ved aminoterminus som beskrevet i Eksempel 5, ble også koblet til et karbazatderivat av PEG ved en tilpasning av metoder som beskrevet av RJ. Drummond et al. (WO 99/45026, US 6 423 685) og av S. Zalipsky et al. (WO 92/16555 Al i J.M. Harris et al., red. (1997) Chemistry and Biological Applications of Poly(ethylene glycol), s. 318-341, Washington D.C., American Chemical Society). PEG-karbazat ble syntetisert ved omsetning av hydrazin med et p-nitrofenylkarbonatderivat av 20 kDa PEG ("NPC-PEG" fra NOF Corporation). Etter innkubering av proteinet ved romtemperatur i fravær av perjodat eller i nærvær av 0,125 mM NaI04i 0,5, 1 henholdsvis 2 timer, ble prøvene fortynnet med 4 volumer 20 kDa PEG-karbazat i 10 mM acetatbuffer, 150 mM NaCl, pH 4,6, inneholdende 1 mg/ml SDS og innkubert i 1 dag ved romtemperatur. Prøvene ble analysert ved størrelseseksklusjonskromatografi på en Superose 12 kolonne i 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,3 inneholdende 0,3 mg/ml SDS. Som vist i Figur 9 resulterte oksidasjonen av proteinet i opp til 2 timer før omsetningen med PEG-karbazat i en progressiv reduksjon av konsentrasjonen av ikke-modifisert protein (eluert ved en retensjonstid på ca. 25 minutter) og en progressiv økning i andelen absorbans assosiert med PEGi-IFN-P-lb konjugatet (eluert ved en retensjonstid på rundt 20 minutter). Utbytter av PEGi-IFN-P-lb på over 80% er oppnådd ved denne metode. Tilsvarende resultater ble oppnådd ved bruk av monokarbazatderivater på 10 kDa eller 30 kDa PEG.

Eksempel 7: Bioanalyse av monoPEGylert interferon-p-lb, renset

ved reversfase HPLC

Bruken av human Daudi Burkitfs lymfomceller (ATCC nr. CCL-231, Manassas, VA) for antiproliferative analyser for interferon-P-la og forskjellige muteiner er beskrevet av L. Runkel et al. ((2000) Biochemistry 39:2538-2551). Figur 10 viser resultatene av analyser av de antiproliferative aktiviteter på Daudi-celler av ikke-behandlet IFN-P-lb og et N-terminalt monoPEGylert konjugat som partielt var renset ved RP-kromatografi. Cellene ble dyrket i supplert RPMI i 1640-medium (Gibco nr. 11875-093, Grand Island, NY) med 10 volum% fetalt kalveserum (Ivrine Scientific nr. 3000, Santa Ana, CA). Et hundretusen celler ble inokulert i 250 mikroliter medium i hver brønn i en 48-brønners plate og tillatt å vokse ved 37°C med 5% CO2i 4 timer før blanding med et likt volum på forhånd oppvarmet medium eller fortynninger av IFN-P-lb eller et PEG-konjugat i medium. I løpet av 3 dager øket antallet celler som var fortynnet kun med medium til 590 +/- 24% (s.a.) av antallet på tid 0, basert på celletellinger med en Coulter counter (Modell Zl, Miami, FL). Under betingelser for maksimal vekstinhibering med IFN-P-lb eller dennes PEG-konjugat øket antallet celler til 283 til +/- 8% av antallet på tid 0. Således var den maksimale prosent av vekstinhibering som ble observert i dette forsøk 48%. Data i Figur 10 for forskjellige konsentrasjoner av to preparater av IFN-P-lb ble uttrykt som prosent av den inhibiterbare cellevekst.

Figur 10 viser resultatene fra en studie som benytter fortynninger av forrådsoppløsningen av IFN-P-lb og fraksjoner fra det preparative reversfase kromatografiske forsøk som er beskrevet i Eksempel 4, som inneholdt enten så å si rent monoPEG-konjugat som vist i Figurene 5-7 (Fraksjon 51) eller så å si rent Mock PEGylert IFN-P-lb (Fraksjon 53 av kolonnen vist i Figur 5). Prøvene ble fortynnet, i triplikat, til 1 mikrogram/ml i medium supplert med fetalt kalveserum og sterilisert ved filtrering gjennom et 0,2 mikrometer filter. Fra hver av de opprinnelige fortynninger ble det foretatt en 32 ng/ml fortynning og derpå følgende seriefortynninger. Fra data i Figur 10 ble den konsentrasjon av hvert preparat som er nødvendig for inhibering av 50% av den inhibiterbare cellevekst ("IC50") beregnet. Resultatene viste at den monoPEGylerte IFN-P-lb (IC50= c. 40 pg/ml) var rundt 6 ganger så potent som ikke-modifisert IFN-P-lb (IC50= c. 250 pg/ml). Den midlere økning i antiproliferative potens for konjugatene med PEGer av forskjellige størrelse, testet i en serie forsøk tilsvarende det som er vist i Figur 10, hadde et område på 2,5 ganger (for 10 kDa PEG) til rundt 5 ganger (for 30 kDa PEG).

Overraskende hadde det Mock PEGylerte preparat som vises i Figur 10 en IC50på rundt 80 pg/ml, noe som var mellom verdien til forrådsoppløsningen av IFN-P-lb og det monoPEGylerte preparat. Uten å ønske å være bundet av noen teori eller noen spesiell mekanistisk forklaring er det plausibelt at den økede, antiproliferative potens for Mock PEGylert preparat reflekterer fjerningen under reversfase kromatografi av noe inhibitorisk materiale som er tilstede i forråds IFN-P-lb-oppløsningen. Denne tolkning er konsistent med resultatene av størrelseseksklusjonskromatografi på en kolonne av Superose 6 i en buffer inneholdende SDS (som beskrevet i Eksempel 1), som avdekket en absorbansetopp ved både 214 nm og 280 nm som eluerte mellom elueringsposisjonene for IFN-P-lb og "salt-toppen". Bioanalyseforsøk tilsvarende de som er vist i Figur 10 ble gjennomført på Fraksjon 49 fra RP-kolonnen som inneholdt en blanding av PEG2- og PEGi-IFN-P-lb (se Figurene 6 og 7). Som når det gjelder den Mock PEGylerte prøve hadde den multipel PEGylerte prøve en antiproliferativ potens som var større enn den til forrådsoppløsningen av IFN-P-lb, men mindre enn den til det monoPEGylerte konjugat. I andre forsøk lå økningen i potens som ble observert med monoPEGylert IFN-P-lb fra 6-ganger til 10-ganger. Tilsvarende økninger i potens ble observert med karbazat-adduktene som beskrevet i Eksempel 6 og som benyttet PEGer på 10, 20 henholdsvis 30 kDa.

De antiproliferative potenser på Daudi-celler som ble oppnådd med konjugatene ifølge oppfinnelsen kan sammenlignes med de rapporterte, spesifikke aktiviteter av tre farmasøytiske former av interferon-P mot en antiviral analyse. I henhold til de respektive pakkeinnlegg var aktivitetene 32 x IO6 IU/mg for Berlex's BETASERON®

(IFN-p-lb), 200 x IO<6>R7/mg for AVONEX® (Biogen's formulering av IFN-p-la) og 270 x IO<6>R7/mg for REBIF® (Serono's formulering av IFN-p-lb). I henhold til dette illustrerer økningen på minst 6 ganger i potens av monoPEGylert BETASERON i den antiproliferative analyse som vist i Figur 10 at N-terminal PEGylering av BETASERON ved metodene ifølge oppfinnelsen har øket potensen til et område som er ventet for de kommersielt tilgjengelige, glykosylerte preparater, AVONEX og REBIF.

Tidligere ble oppløseligheten for ikke-glykosylert interferon-P (uttrykt i Escherichia coli) øket ved bruk av sure oppløsninger (W.H. Hanisch et al., US 4 462 940) ved tilsetning av SDS (J.W. Thomson, US 4 816 440). Uten ønske om å være bundet av noen teori, er en mekanisme ved hvilke PEGylering kan øke den antiproliferative effekt for IFN-P-lb målt in vitro, ved å redusere tendensen til selvassosiering i kulturmediet. I henhold til dette indikerer den observasjon av prøve anriket på PEG2-IFN-P-lb var mindre effektiv enn PEGi-IFN-P-lb at de positive effekter av redusert aggregering kan overvinnes ved negativ effekt av for stor PEGYlering på evnen hos dette cytokin til å binde til sine reseptorer og/eller initere signaltransduksjonen som er ansvarlig for den antiproliferative aktivitet.

Eksempel 8: Bioanalyser av selektivt oksidert interferon-p-lb

Analyse av den antiproliferative aktivitet på Daudi-celler av IFN-P-lb, oksidert i forskjellig grad, ble gjennomført som beskrevet i Eksempel 7. De testede prøver inkluderte forrådsoppløsning av IFN-P-lb og prøver som var behandlet i flere dager ved 4°C med 0,1, 0,3 henholdsvis 3 mM perjodat. Prøvene ble fortynnet som beskrevet i Eksempel 7 og blandet med et likt volum Daudi-cellesuspensjon, 4 timer etter inokulering av cellene. Cellene ble dyrket i 2 dager ved 37°C med 5% CO2og så tellet med en Coulter counter. Den antiproliferative aktivitet for IFN-P-lb var upåvirket eller øket ved behandling med 0,075-0,5 mM NaI04under de testede betingelser. Tilsvarende resultater ble oppnådd i 3 dagers antiproliferative analyser som beskrevet i Eksempel 7. Antiproliferativ potens ble ytterligere forsterket ved konjugering av det selektivt oksiderte IFN-P-lb med PEG-karbazat som beskrevet i Eksempel 6. Tilsvarende resultater til de som oppnås med PEG-karbazat oppnås ved konjugeringsprodukter av selektivt oksidert IFN-P-lb til PEG-hydrazid. På den annen side ble den antiproliferative effekt på Daudi-celler undertrykt eller fullstendig avskaffet ved behandling av IFN-P-lb med høyere konsentrasjoner av perjodat, for eksempel 1-3 mM. Disse høye konsentrasjoner av NaIC>4induserte dimerisering av protein som ble detektert ved størrelseseksklusjons HPLC på en Superose 12-kolonne, som beskrevet i Eksempel 2, og oksidasjon av metionin som detektert ved reversfase kromatografi som beskrevet i Eksempel 3 (resultater ikke vist).

Bioaktiviteter for konjugatene ifølge oppfinnelsen kan måles ved kjente antiproliferative og antivirale analyser basert på forskjellige cellelinjer eller primærkulturer, der cellene bærer celleoverflatereseptorer for INF-p. Alternativt kan man overvåke responser på IFN-P som inkluderer induksjon av neopterin (R.B. Pepinsky et al., supra), P2-mikroglobulin (R.B. Pepinsky et al, supra) eller 2',5'-oligoadenylat syntetase (G. Bruchelt et al., (1992) Eur J. Clin Chem Clin Biochem 30:521-528) eller rapportørproteier operativt forbundet til promoter av proteiner som kan induseres av IFN-p. Ytterligere metoder for å analysere bioaktiviteten av polymerkonjugatene av IFN-P inkluderer signaltransduksjonsanalyser og genaktiveringsanalyser (for eksempel E. Pungor et al, (1998) J Interferon Cytokin Res 18:1025-1030).

Claims

1. Fremgangsmåte for å øke den in vitro biologiske potens for et ikke-glykosylert interferon-éeta-lb,karakterisert vedat den omfatter selektiv kobling av en eller flere syntetiske, vannoppløselige polymerer til den aminoterminal aminosyren av nevnte interferon-éeta-lb ved tilstedeværelse av et detergent for å danne et modifisert interferon-beta-lb, der aminoterminal aminosyre er lokalisert fjernt fra det (de) reseptorbindingsdomene(ne) av nevnte interferon-éeta-lb, hvor nevnte kobling omfatter: (a) (i) blanding av nevnte interferon-éeta-lb og et aldehyd derivat fra nevnte en eller flere polymerer for å danne en Schiffs base, og (ii) reduksjon av nevnte Schiffs base ved å bruke et mildt reduserende middel under betingelser slik at sekundære aminbindinger dannes, der den in vitro biologiske potens av nevnte modifisert interferon-éeta-lb er omtrent 2,5 ganger, omtrent 5 ganger, omtrent 6 ganger høyere enn in vitro biologisk potens av nevnte interferon-éeta-lb forut for nevnte kobling, eller (b) (i) oksidativ spalting av den aminoterminale aminosyren fra nevnte interferon-éeta-lb til et aldehyd ved å anvende periodat under betingelser som minimerer oksidasjonen til minst en essensiell metioninrest av nevnte interferon-éeta-lb, og (ii) kobling av nevnte aldehyd med et cabazate derivat fra nevnte en eller flere polymerer, der den in vitro biologiske potens av nevnte modifiserte interferon-fetø-lb er omtrent 6-10 ganger høyere enn den in vitro biologiske potens til nevnte interferon-beta- lb forut for nevnte kobling.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte kobling omfatter koblingen i (a).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte kobling omfatter koblingen i (b).

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den biologiske potens måles i en cellekulturanalyse som responderer på interferon-fetø-lb.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte ene eller flere polymerer er valgt fra gruppen bestående av et eller flere polyalkylenglykoler, et eller flere polyalkylenoksider, et eller flere polyvinylalkoholer, et eller flere polykarboksylater, et eller flere poly(vinylpyrrolidoner), et eller flere poly(oksyetylenoksymetylener), en eller flere poly(aminosyrer), et eller flere polyakryloylmorfoliner, en eller flere kopolymerer av et eller flere amider og et eller flere alkylenoksider, et eller flere dekstraner og en eller flere hyaluronsyrer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte interferon-éeta har aminosyresekvensen til interferon-éeta-lb som spesifisert i Sekv. Id. Nr. 1.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte interferon-éeta har i det vesentlige aminosyresekvensen i Sekv. Id. Nr. 1.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat polymeren kovalent er koblet til a-aminogruppen av nevnte aminoterminale aminosyre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat nevnte kovalente kobling av nevnte polymer til a-aminogruppen er via en sekundær aminbinding.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat polymeren er en polyalkylenglykol.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat polyalkylenglykolen er valgt fra gruppen bestående av poly(etylenglykol), et monometoksypoly(etylenglykol) og et monohydroksypoly(etylenglykoi).

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat polyalkylenglykol er en monometoksypoly(etylenglykol).

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisert vedat polyalkylenglykol er en monohydroksypoly(etylenglykol).

14. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt fra og med rundt 1 kDa til og med rundt 100 kDa.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt fra og med rundt 8 kDa til og med rundt 14 kDa.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt fra og med rundt 10 kDa til og med rundt 30 kDa.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt fra og med rundt 18 kDa til og med rundt 22 kDa.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt på rundt 20 kDa.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14,karakterisert vedat polyalkylenglykolen har en molekylvekt på rundt 30 kDa.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat koblingen av polymeren til nevnte interferon-éetø-lb ved nevnte aminoterminale aminosyre etterligner de fordelaktige effekter av glykosylering eller hyperglykosylering av nevnte interferon- be ta- lb.

21. Konjugat,karakterisert vedat det omfatter en ikke-glykosylert interferon-éeta-lb, selektivt koblet til en eller flere syntetiske vannløselige polymerer i den aminoterminale aminosyren til nevnte interferon-fetø-lb, der nevnte aminoterminale aminosyre er lokalisert langt vekk fra det/de repetorbindene domene(ne) til nevnte interferon-éeta-lb, der det in vitro biologiske potensialet til nevnte konjugat økes omtrent 2,5 gang til omtrent 10 ganger sammenlignet med det biologiske in vitro potensialet til nevnte interferon-éeta-lb forut for nevnte kobling, der nevnte en eller flere polymerer er valgt fra gruppen bestående av en eller flere polyalkylen glykoler, og en eller flere polyalkylen oksider.

22. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et eller flere av konjugatene ifølge krav 21 og en eller flere farmasøytisk akseptable eksipienter eller bærere.

23. Kit,karakterisert vedat det omfatter konjugatet ifølge krav 21.

24. Kit,karakterisert vedat det omfatter det farmasøytiske preparat ifølge krav 22.

25. Konjugatet i følge krav 21, for forebygging, diagnostisering eller behandling av en interferon-éeta-responsiv fysisk lidelse i et dyr som lider av, eller er predisponert for nevnte fysiske lidelse.

26. Sammensetning i følge krav 22, for forebygging, diagnostisering eller behandling av en interferon-éeta-responsiv fysisk lidelse i et dyr som lider av, eller er predisponert for nevnte fysiske lidelse.

27. Konjugatet i følge krav 25, der nevnte dyr er et pattedyr.

28. Sammensetningen i følge krav 26, der nevnte dyr et pattedyr.

29. Konjugatet i følge krav 27 eller sammensetningen i følge krav 28, der nevnte pattedyr er et menneske.

30. Konjugatet ifølge krav 25,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, fysiske lidelse er valgt fra gruppen bestående av en cancer, en infeksiøs sykdom, en neurodegenerativ lidelse, en autoimmun lidelse og en genetisk lidelse.

31. Konjugatet ifølge krav 30,karakterisert vedat nevnte cancer er valgt fra gruppen bestående av en bryst-, uterin-, ovarie-, prostata-, testikkel-, lunge-, kolon-, gastrointestinal-, pankreas-, blære-, nyre-, ben-, neurologisk-, hode- og hals cancer, en leukemi, et lymfom, et karsinom, et sarkom et adenom eller et myelom.

32. Konjugatet ifølge krav 30,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, infeksiøse sykdom er valgt fra gruppen bestående av en viral hepatitt, en sykdom forårsaket av kardiotropisk virus og HIV/AIDS.

33. Konjugatet ifølge krav 30,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, neurodegenerative lidelse er multiple sklerose.

34. Konjugatet ifølge krav 33,karakterisert vedat nevnte multippel sklerose er valgt fra gruppen bestående av relapserende-remitterende, primær progressiv og sekundær progressiv multippel sklerose.

35. Sammensetning ifølge krav 26,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, fysiske lidelser er valgt fra gruppen bestående av cancer, en infeksiøs sykdom, en neurodegenerativ lidelse, en autoimmun lidelse og en genetisk lidelse.

36. Sammensetning ifølge krav 35,karakterisert vedat canceren er valgt blant en bryst-, uterin-, ovarie-, prostata-, testikkel-, lunge-, kolon-, gastrointestinal-, pankreas-, blære-, nyre-, ben-, neurologisk-, hode- og hals cancer, en leukemi, et lymfom, et karsinom, et sarkom et adenom og et myelom.

37. Sammensetning ifølge krav 35,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, infeksiøse sykdom er valgt fra gruppen bestående av en viral hepatitt, en sykdom forårsaket av kardiotropisk virus og HIV/AIDS.

38. Sammensetning ifølge krav 35,karakterisert vedat nevnte interferon-éeat-responsive, neurodegenerative lidelse er multiple sklerose.

39. Sammensetning ifølge krav 38,karakterisert vedat nevnte multippel sklerose er valgt fra gruppen bestående av relapserende-remitterende, primær progressiv og sekundær progressiv multippel sklerose.