NO339597B1 - Forbedrede cytotoksiske midler som omfatter nye maytansinoider; fremgangsmåte for deres fremstilling; intermediater derav og fremgangsmåte for deres fremstilling; konjugat mellom maytansinoidene og et cellebindende middel; fremgangsmåte for dets fremstilling og dets anvendelse i en terapeutisk metode eller til fremstilling av et medikament, samt et farmasøytisk preparat derav. - Google Patents

Forbedrede cytotoksiske midler som omfatter nye maytansinoider; fremgangsmåte for deres fremstilling; intermediater derav og fremgangsmåte for deres fremstilling; konjugat mellom maytansinoidene og et cellebindende middel; fremgangsmåte for dets fremstilling og dets anvendelse i en terapeutisk metode eller til fremstilling av et medikament, samt et farmasøytisk preparat derav. Download PDF

Info

Publication number
NO339597B1
NO339597B1 NO20056039A NO20056039A NO339597B1 NO 339597 B1 NO339597 B1 NO 339597B1 NO 20056039 A NO20056039 A NO 20056039A NO 20056039 A NO20056039 A NO 20056039A NO 339597 B1 NO339597 B1 NO 339597B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
compound
methyl
alanine
methyldithio
conjugate
Prior art date
Application number
NO20056039A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20056039L (no
Inventor
Ravi V J Chari
Wayne C Widdison
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=33476883&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO339597(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Publication of NO20056039L publication Critical patent/NO20056039L/no
Publication of NO339597B1 publication Critical patent/NO339597B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D498/16—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/14—Ortho-condensed systems
    • C07D491/147—Ortho-condensed systems the condensed system containing one ring with oxygen as ring hetero atom and two rings with nitrogen as ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/04—Amoebicides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D491/14—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant

Description

Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av forbedrede cytotoksiske konjugater som omfatter maytansinoider og cellebindende midler. Disse konjugatene har terapeutisk anvendelse, siden de tilføres en spesifikk cellepopulsjon på en målstyrt måte. Foreliggende oppfinnelse gjelder også en fremgangsmåte for fremstilling av maytansinoider med en tiolgruppe, som kan anvendes for fremstilling av cytotoksiske konjugater. Foreliggende oppfinnelse gjelder videre nye maytansinoider og nye inter-mediater i syntesen av de nye maytansinoidene.
Oppfinnelses bakgrunn
Der har kommet mange rapporter vedrørende forsøk på spesifikk målstyring til tumorceller med konjugater mellom monoklonale antistoffer og legemidler (Sela et al. i Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, red. 1987); Ghose et al., i Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, red. 1983); Diener et al., i Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell, red. 1988); Pietersz et al., i Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell, red. 1988); Bumol et al., i Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell, red. 1988). Cytotoksiske legemidler slik som metotreksat, daunorubicin, doksorubicin, vinkristin, vinblastin, melfalan, mitomycin C og klorambucil har blitt konjugert til en rekke mono-klonale muse-antistoffer. I noen tilfeller ble legemiddelmolekylene koblet til antistoff molekylene via at intermediært bærermolekyl, slik som serumalbumin (Garnett et al. Cancer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa et al. Cancer Immunol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo et al. Cancer Res. 47:1076-1080
(1980)), dekstran (Hurwitz et al. Appl. Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi et al. Biochem. Pharmacol. 34:289-291 (1985); Dillman et al. Cancer Res. 46:4886-4891
(1986); Shoval et al. Proe. Nati. Acad. Sei. 85:8276-8280 (1988)), eller polyglutaminsyre (Tsukada et al. J. Nati. Canc. Inst. 73:721-729 (1984); Kato et al. J. Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada et al. Br. J. Cancer 52:111-116 (1985)).
Et bredt utvalg av linkerteknologier har blitt benyttet for fremstilling av slike immunkonjugater, og både spaltbare og ikke-s pa Itba re linkere har blitt undersøkt. I de fleste tilfeller kunne imidlertid legemidlenes fulle cytotoksiske potensial kun observeres dersom legemiddelmolekylene kunne frigjøres fra konjugatene i umodifisert form ved må I setet.
En av de spaltbare linkerne som har blitt benyttet for fremstilling av antistoff-legemiddelkonjugater er en syrelabil linker basert på cis-akonitinsyre, som drar fordel av det sure miljø i forskjellige intracellulære avdelinger, slik som endosomene, som møtes under reseptorformidlet endocytose, og lysosomene. Shen og Ryser introduserte denne fremgangsmåten for fremstilling av konjugater mellom daunorubicin og makromolekylære bærere (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang og Reisfeld anvendte den samme teknikken for konjugering av daunorubicin til et anti-melanom anti-stoff (J. Nati. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). Nylig benyttet Dillman et al. også en syrelabil linker på tilsvarende måte for fremstilling av konjugater mellom daunorubicin og et anti-T-celle antistoff (Cancer Res. 48:6097-6102 (1988)).
En alternativ tilnærming som ble utforsket av Trouet et al. omfattet å koble daunorubicin til et antistoff via en avstandsgivende peptidarm (Proe. Nati. Acad. Sei. 79:626-629 (1982)). Dette ble utført under antagelsen om at fritt legemiddel kunne frigjøres fra et slikt konjugat under påvirkning av lysosomale peptidaser.
In vitro cytotoksisitetstester har imidlertid avslørt at antistoff-legemiddelkonjugater sjelden oppnådde den samme cytotoksiske aktivitet som de frie, ikke-konjugerte lege-midlene. Dette tyder på at mekanismene som frigjør legemiddelmolekyler fra antistoffene er svært lite effektive. Når det gjelder immuntoksiner ble konjugater dannet via disulfid-broer mellom monoklonalt antistoffer og katalytisk aktive proteintoksiner vist å være mer cytotoksiske enn konjugater som inneholdt andre linkere. Se Lambert et al. J. Biol. Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert et al. i Immunotoxins 175-209 (A. Rrankel, red. 1988); Ghetie et al. Cancer Res. 48:2610-2617 (1988). Dette ble tilskrevet den høye intra-cellulære konsentrasjonen av glutation, som bidrar til effektiv spalting av disulfidbindingen mellom et antistoffmolekyl og et toksin. Trass i dette foreligger det bare noen få rapporterte eksempler på anvendelse av disulfidbroer for fremstilling av konjugater mellom legemidler og makromolekyler. Shen et al. beskrev omdanning av metotreksat til et merkaptoetylamidderivat, etterfulgt av konjugering til poly-D-lysin via en difulfidbinding (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985)). I tillegg beskriver noen få rapporter fremstilling av konjugater av det trisulfidholdige toksiske legemiddel calicheamicin og antistoffer (Hinman et al, 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 40-46 (2002), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 47-58
(2002)).
Én grunn til mangelen på disulfidsammenkoblede antistoff-legemiddelkonjugater er manglende tilgjengelighet på cytotoksiske legemidler som bærer en svovelatomholdig gruppe som lett kan anvendes for kobling av legemiddelet til et antistoff via en disulfidbro. Videre er kjemisk modifisering av eksisterende legemidler vanskelig uten å redusere deres cytotoksiske potensiale.
Maytansinoider er svært cytotoksiske legemidler. Maytansin ble først isolert av Kupchan et al. fra den øst-Afrikanske busken Maytenus serrata, og ble vist å være 100 til 1000 ganger mer cytotoksisk enn konvensjonelle kjemoterapeutiske kreftmidler som metotreksat, daunorubicin og vinkristin (US patentskrift nr. 3 896 111). Senere ble det oppdaget at noen mikrober også danner maytansinoider, slik som maytansinol og C-3-estere av maytansinol (US patentskrift nr. 4 151 042). Syntetiske C-3-estere av maytansinol og analoger av maytansinol er også blitt rapportert (Kupchan et al. J. Med. CHem. 21:31-37 (1978); Higashide et al. Nature 270:721-722 (1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984)). Eksempler på analoger av maytansinol fra hvilke C-3-estere har blitt fremstilt omfatter maytansinol med modifikasjoner i den aromatiske ring (for eksempel deklor) eller i posisjon C-9, C-14 (for eksempel hydroksylert metylgruppe), C-15, C-18, C-20 og C-4,5.
De naturlig forekommende og syntetiske C-3-esterene av maytansinol kan oppdeles i to grupper:
(a) C-3-estere med enkle karboksylsyrer (US patentskrifter nr. 4 248 870,
4 265 814, 4 308 268, 4 308 269, 4 309 428, 4 317 821, 4 322 348 og 4 331 598), og (b) C-3-estere med derivater av N-metyl-L-alanin (US patentskrifter nr. 4 137 230, 4 260 608, 5 208 020 og Chem. Pharm. Bull. 12:3441 (1984)).
Estere i gruppe (b) ble funnet å være mye mer cytotoksiske enn estere fra gruppe (a).
Maytansin er en mitoseinhibitor. Behandling av L1210-celler in vivo med maytansin har blitt rapportert å føre til at 67 % av cellene akkumuleres i mitose. Ubehandlede kontrollceller ble rapportert å vise en mitotisk indeks i området fra mellom 3,2 til 5,8 % (Sieber et al. 43 Coparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)). Eksperimenter med sjøpinnsvinegg og muslingegg tyder på at maytansin inhiberer mitosen ved å interferere med dannelsen av mikrotubuli, ved å inhibere polymeriseringen av mikrotubulus proteinet, tubulin (Remillard et al. Science 189:1002-1005 (1975)).
In vitro har suspensjoner av muse-leukemicellene P388, L1210 og LY5178 blitt funnet å inhiberes av maytansin i doser på 10<3>til 10<1>ug/ul, med P388-cellelinjen som den mest følsomme. Maytansin har også blitt vist å være en aktiv inhibitor av in vitro-vekst av humane nasofaryngeale karsinomceller og den humane akutte lymfoblastiske leukemi-cellelinje CEM ble rapportert å bli inhibert ved konsentrasjoner ned til IO"<7>ug/ml (Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975)).
Maytansin har også blitt vist å være aktivt in vivo. Tumorvekst i P388-lymfocytt leukemi-systemet ble vist å inhiberes over et doseringsområde på 50 til 100 ganger, noe som antyder en høy terapeutisk indeks, signifikant inhiberende aktivitet kunne også vises med L1210-museleukemi-systemet, med det humane Lewis-lungekarsinom-systemet og det humane B-16-melanokarsinomsystemet (Kupchan, Ped. Proe. 33:2288-2295 (1974)). Maytansinoider anvendt i konjugater med cellebindende midler beskrives i US patentskrifter nr. 5 208 020 og 5 416 064, og i Chari et al., Cancer Res., 52:127-131 (1992) og Liu etl al., Proe. Nati. Acad. Sei., 93: 8618-8623 (1996). I disse konjugatene er det cellebindende middel bundet via disulfidbindinger til maytansinoidet DM1 [N<2>'-deacetyl-N-<2>'(3-merkapto-l-oksopropyl)-maytansin, 1, CAS nummer: 139504-50-0, Fig. 1).
I patentskriftene ovenfor har de maytansinoide legemidlene som bærer acylerte N-metyl-L-alaninsidekjeder formelen 2a,b:
I formel 2a står I for et heltall fra 1 til 10. Således har maytansinoider med formel 2a svovelatomet bundet til en ikke-substituert metylengruppe (-CH2-S-). Det sies at en sulfhydrylgruppe i en slik maytansinoid forbindelse eller en disulfidgruppe i et disulfidbundet konjugat mellom et cellebindende middel og et slikt maytansinoid er "ikke-hindret", siden det ikke foreligger store substituenter på a-karbonatomet i nabostilling til sulfhydryl- eller disulfidgruppen som kan gi sterisk hindring. I formel 2b står for m for 0, 1, 2 eller 3. Maytansinoider med formel 2b har således også svovelatomet bundet til en ikke-substituert metylengruppe, untatt i tilfeller hvor m = 0 og R2= CH3eller CH2CH3. Hvis m = 0 har maytansinoidet en substituent på karbonatomet som bærer tiolgruppen eller disulfidgruppen etter konjugering til et cellebindende middel via en disulfidbinding. Siden svovelatomet i dette tilfellet er i p-posisjon relativt til en karbonylgruppe, ble imidlertid disse maytansinoidene og konjugater av slike maytansinoider og cellebindende midler via en disulfidbinding funnet å være ustabile, grunnet deres tilbøyelighet til å gjennomgå
p-eliminasjon.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er basert på det uventede funn at binding av maytansinoider som bærer en sterisk hindret tiolgruppe (som har én to eller substituenter på a-karbonatomet som bærer tiol-funksjonaliteten) til cellebindende midler gir konjugater med svært forbedret anti-tumoraktivitet in vivo, sammenlignet med konjugater fremstilt med de tidligere beskrevne maytansinoider som ikke hadde en substituent på
a-karbonatomet som bærer disulfidbindingen. Et annet uventet funn var at forbedret biologisk aktivitet oppnås dersom den steriske hindringen er optimal på
maytansinoidsiden av disulfidbindingen i konjugatene. I tillegg må acylgruppen på den acylerte aminosyre-sidekjede i maytansinoidet som bærer sulfhydrylgruppe ha en lineær kjedelengde på minst tre karbonatomer mellom karbonylgruppen i amidet og svovelatomet.
Disse funnene viser at disulfidbundne konjugater mellom cellebindende middel og maytansinoid kan konstrueres slik at substitusjoner på de to a-karbonatomene som bærer disulfidbindingen kan føre til varierende grader av sterisk hindring på hver side av disulfid-bindingen.
Følgelig beskriver foreliggende oppfinnelse syntese av nye, sterisk hindrede tiol-og disulfidholdige maytansinoider som bærer én eller to alkylsubstituenter på a-karbonatomet som bærer svovelatomet. I tillegg har acylgruppen i den acylerte aminosyresidekjede en lineær sidelengde på minst 3 karbonatomer mellom karbonylgruppe til amidet og svovel-atomet.
Fremstilling og biologisk evaluering av konjugater mellom cellebindende middel og disse nye maytansinoidene beskrives også.
I én utførelsesform av oppfinnelsen beskrives nye tiol- og disulfidholdige maytansinoider som bærer en mono- eller di-alkylsubstitusjon på a-karbonatomet som bærer svovelatomet.
I en andre utførelsesform beskriver foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for syntese av disse nye maytansinoidene.
I en tredje utførelsesform beskrives fremgangsmåter for koblingen av disse nye maytansinoidene til cellebindende midler. Disse konjugatene er nyttige som terapeutiske midler som tilføres spesifikt til målceller og er cytotoksiske. Disse konjugatene viser svært forbedret terapeutisk virkning i dyretumormodeller sammenlignet med de tidligere beskrevne midlene.
Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse:
En forbindelse representert ved formel 4:
hvor:
Y står for (CH2)2CRiR2SZ, hvor:
Ri er metyl og R2er H, eller Rlrog R2er metyl; og
Z er H eller-SCH3.
Forbindelsen med formel 4, hvor Ri er metyl, og R2er H, og Z er H. Forbindelse med formel 4, hvor Ri og R2er metyl, og Z er H.
Forbindelse med formel 4, hvor Ri er metyl, R2er H, og Z er -SCH3. Forbindelse med formel 4, hvor Ri og R2er metyl, og Z er -SCH3.
Et konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel som omfatter minst et maytansinoid bundet til det cellebindende middel, hvor maytansinoidet er hvilken som helst av de ovenfor beskrevne forbindelsene.
Hvilket som helst av de ovenfor beskrevne konjugatene mellom maytansinoid og cellebindende middel, hvor det cellebindende middel omfatter minst et bindingssete fra et antistoff, fortrinnsvis humanisert eller overflatemodifisert MY9, humanisert eller overflate-modifisert anti-B4 eller humanisert eller overflatemodifisert C242.
Et farmasøytisk preparat som omfatter en effektiv mengde av hvilket som helst av de ovenfor beskrevne konjugatene mellom maytansinoid og cellebindende middel, et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer, et fortynningsmiddel eller en eksipens.
En fremgangsmåte for forestring av maytansinol for å tilveiebringe et maytansinoid med formelen 42:
hvor fremgangsmåten omfatter å omsette et maytansinol med strukturen 11: i posisjon C-3 med en forbindelse med formel (III'-L), eller (IH'-D,L): hvor
hvor
Ri er metyl og R2er H eller Ri og R2er metyl; og
Z2er SCH3.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoidet med formel 4a, hvor forbindelsen med formel (III) er representert ved formel (III-L).
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4a, hvor forbindelsen med formel (III-L) er forbindelse 15a(S,S), 15b(S,R) eller en blanding av 15a(S,S) og 15b(S,R).
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4a, hvor forbindelsen med formel (III-D,L) er racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol-funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet for å gi forbindelser med strukturen ifølge 15.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4a, hvor blandingen av 15a(S,S) og 15b(S,R) fremstilles ved en prosess som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13; (2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester (14); (3) omsette forbindelse 14 med N-metyl-L-alanin for å gi blandingen av forbindelse 15a(S,S) og 15b(S,R).
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol, hvor forbindelsen 15a(S,S) er fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter å: (1) omdanne (R)-l,3-butandiol til (S)-4-(metylditio)pentansyre 19;
(2) omdanne forbindelse 19 til dens N-hydroksysuksinimidester (20); og
(3) omsette forbindelse 20 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15a(S,S).
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol, hvor forbindelsen 15b(S,R) er fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter å: (1) omdanne (S)-l,3-butandiol til (R)-4-(metylditio)pentansyre 24;
(2) omdanne forbindelse 24 til dens N-hydroksysuksinimidester (25); og
(3) omsette forbindelse 25 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15b(S,R).
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4a, hvor racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen ifølge 15 fremstilles ved en prosess som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13; (2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester 14; (3) omsette forbindelse 14 med racemisk N-metylalanin for å gi racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4b, hvor forbindelsen med formel (III-L) er forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåten for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4b, hvor forbindelsen med formel (III-D,L) er forbindelse 10 inneholdende racemisk N-metylalanin.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4b, hvor forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin, eller racemisk N-metylalanin er fremstilt ved en prosess som omfatter å: (1) omsette isobutylensulfid (5) med anionet av acetonitril for å gi forbindelse 6; (2) hydrolysere forbindelse 6 for å gi 4-merkapto-4-metylpentansyre (7); (3) omdanne forbindelse 7 til disulfidet 8 ved omsetning med metylmetantiol-sulfonat;
(4) omdanne forbindelse 8 til dens N-hydroksysuksinimidester 9; og
(5) omsette forbindelse 9 med N-metyl-L-alanin, eller racemisk N-metylalanin for å gi forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin, eller racemisk N-metylalanin.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for forestring av maytansinol med 10, etterfulgt av separasjon av eventuelt foreliggende diastereomerer og rensing av maytansinoidet ved HPLC på cyanobundet silika, videre omfatter reduksjon av disulfid-bindingen for å gi maytansinoider med formel 4b.
En fremgangsmåte for fremstilling av et konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel, som omfatter fremstilling av et renset maytansinoid ved hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåter for forestring av maytansinol for å gi maytansinoider med formel 4b, og omsette maytansionidet med et cellebindende middel som omfatter en reaktiv ditiogruppe, fortrinnsvis en ditiopyridylgruppe eller en substituert ditiopyridylgruppe.
Forbindelsene 10(S) og racemisk 10.
En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin, eller racemisk N-metylalanin, som omfatter å: (1) omsette isobutylensulfid (5) med anionet av acetonitril for å gi forbindelse 6; (2) hydrolysere forbindelse 6 for å tilveiebringe 4-merkapto-4-metylpentansyre (7); (3) omdanne forbindelse 7 til disulfidet 8 ved omsetning med metylmetantiol-sulfonat;
(4) omdanne forbindelse 8 til dens N-hydroksysuksinimidester 9; og
(5) omsette forbindelse 9 og N-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin for å gi forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin, eller racemisk N-metylalanin.
En blanding av forbindelsene 15a(S,S) og 15b(S,R).
En fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av forbindelse 15a(S,S) og 15b(S,R), som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13;
(2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester (14); og
(3) omsette forbindelse 14 med N-metyl-L-alanin for å tilveiebringe blandingen av forbindelse 15a(S,S) og 15b(S,R).
Racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15.
En fremgangsmåte for fremstilling av racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15, som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13; (2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester (14); (3) omsette forbindelse 14 med racemisk N-metylalanin for å tilveiebringe racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15.
Forbindelse 15a(S,S).
Forbindelse 15b(S,R).
En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse 15a(S,S), som omfatter å:
(1) omdanne (R)-l,3-butandiol til (S)-4-(metylditio)pentansyre 19;
(2) omdanne forbindelse 19 til dens N-hydroksysuksinimidester (20); og
(3) omsette forbindelse 20 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15a(S,S).
En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse 15b(S,R), som omfatter å:
(1) omdanne (S)-l,3-butandiol til (R)-4-(metylditio)pentansyre 24;
(2) omdanne forbindelse 24 til dens N-hydroksysuksinimidester (25); og
(3) omsette forbindelse 25 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15b(S,R).
Et farmasøytisk preparat som omfatter en effektiv mengde av hvilken som helst av de ovenfor beskrevne maytansinoide forbindelsene, et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer, et fortynningsmiddel eller en eksipiens.
Det ovenfor beskrevne farmasøytiske preparat inneholdende en maytansinoid forbindelse og omfatter videre et antistoff.
En fremgangsmåte for induksjon av celledød i valgte cellepopulasjoner in vitro eller eks vivo, som omfatter å sette målceller eller vev som inneholder målceller i kontakt med en effektiv mengde av hvilket som helst av de ovenfor beskrevne konjugater mellom maytansinoider og cellebindende midler, eller salter eller solvater derav.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. 1 viser strukturen til tidligere beskrevne maytansinoider.
Fig. 2 viser strukturen av noen av maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3a-d viser reaksjonsskjemaer for syntese av representative maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 4a og 4b er kurver som viser in wtro-styrken av nye maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 4c og 4d er kurver som sammenligner in wfro-styrken av nye maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse med aktiviteten av tidligere beskrevne maytansinoider. Fig. 5a-d viser reaksjonsskjemaer for fremstilling av konjugater mellom cellebindende midler og maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 6 er en kurve som viser in wtro-styrken av konjugater mellom cellebindende middel og maytansinoid ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 7 er en kurve som sammenligner anti-tumorvirkningen in vivo av huC242-maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse og huC42-konjugater av tidligere beskrevne maytansinoider mot xenotransplantater av de humane kolontumorcellene Ht-29. Fig. 8 er en kurve som sammenligner anti-tumorvirkningen in vivo av huC242-maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse med huC242-konjugater med tidligere beskrevne maytansinoider mot xenotransplantater av de humant kolon tumorcellene COLO 205. Fig. 9 er en kurve som sammenligner anti-tumor virkningen in vivo av MY9-6-maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse og MY9-6-konjugater av tidligere beskrevne maytansinoider mot xenotransplantater av den promyelocytiske myeloide leukemicellelinjen HL60. Fig. 10 viser resultatet fra evalueringen av in wtro-cytotoksisitet av konjugatet huMy9-6-DM4 med HL-60-målceller og Namalwa-ikke-målceller. Fig. 11 viser evalueringen av in v/Vo-virkningen av konjugatet huMy9-6-DM4 mot xenotransplantater av humane HL-60-tumorceller i SCID-mus, sammenlignet med virkningen av et huMy9-6-konjugat av et tidligere beskrevet maytansinoid (huMy9-6-DM1). Fig. 12 viser resultatet fra evalueringen av in wtro-cytotoksisitet av konjugatet huB4-DM4 med Ramos-målceller og Colo 205-ikke-målceller. Fig. 13a viseren evaluering av in wVo-virkningen av konjugatet huB4-DM4 mot xenotransplantater av humane Ramos-tumorceller i SCID-mus, mens Fig. 13b viser endringen i dyrenes kroppsvekt under analysetiden.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse beskriver nye, sterisk hindrede tiol- og disulfidholdige maytansinoider hvor a-karbonatomer som bærer svovalatomet bærer én eller to alkylsubstituenter. Oppfinnelsen beskriver også en fremgangsmåte for syntese av disse nye maytansinoidene. Nye forbindelser som er anvendbare som intermediater i syntesen av de nye maytansinoidene beskrives også. I tillegg beskriver foreliggende oppfinnelse fremstillingen av konjugater mellom disse nye maytansinoidene og cellebindende midler.
Ifølge teknikkens stand er det ekstremt vanskelig å modifisere eksisterende legemidler uten å redusere deres cytotoksiske potensial. Den beskrevne oppfinnelsen overvinner dette problemet ved å beskrive en fremgangsmåte for syntese av nye maytansinoide molekyler som inneholder en sterisk hindret tiol- eller disulfidgruppe. De beskrevne nye maytansinoidene opprettholder, og i noen tilfeller høyner den cytotoksiske styrken av de tidligere beskrevne maytansinoidene.
Konjugatene mellom maytansinoider og cellebindende middel tillater tilføring av hele den cytotoksiske virkning av maytansinoidene på en målrettet måte mot bare uønskede celler, for derved å unngå bivirkninger grunnet skade på friske ikke-målceller. Oppfinnelsen tilveiebringer således nyttige midler og nye fremgangsmåter for fremstilling av disse for elimineringen av syke eller unormale celler som skal drepes eller lyseres, slik som tumorceller (fortrinnsvis faste tumorceller), virusinfiserte celler, mikroorganisme infiserte celler, parasittinfiserte celler, autoimmune celler (celler som danner autoantistoffer), aktiverte celler (de som deltar i transplantatforkastelse eller graft vs. host-sykdom) eller enhver annen type syke eller unormale celler, samtidig som de viser et minimum av bivirkninger.
Foreliggende oppfinnelse beskriver således en fremgangsmåte for fremstilling av forbedrede cytotoksiske konjugater som omfatter nye maytansinoider og cellebindende midler, med svært forbedret biologisk aktivitet sammenlignet med tidligere beskrevne maytansinoider og cellebindende midler. Oppfinnelsen beskriver videre en fremgangsmåte for syntese av maytansinoidderivater som innehar en sterisk hindret tiol- eller disulfid-gruppe som tillater kjemisk binding til et cellebindende middel, samtidig som de viser høy cytotoksisitet, enten i bundet form, frigjort form eller i begge former. Det cytotoksiske konjugat ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter et eller flere maytansinoider bundet til et cellebindende middel. For å binde maytansinoidet til et cellebindende middel, må maytansinoidet først modifiseres.
Maytansinoider som kan anvendes i foreliggende oppfinnelsen for fremstilling av maytansinoidene som kan bindes til et cellebindende middel er velkjente innen faget, og kan isoleres fra naturlig kilder ifølge kjente fremgangsmåter eller fremstilles syntetisk ifølge kjente fremgangsmåter.
Eksempler på egnede maytansinoider omfatter maytansinol.
For å binde maytansinoidet til det cellebindende midlet omfatter maytansinoidet en bindingsgruppe. Bindingsgruppen inneholderen kjemisk binding som tillater frigjøring av fult ut aktive maytansinoider i et bestemt sete. Egnede kjemiske bindinger er velkjente innen faget og inkluderer disulfidbindinger, syrelabile bindinger, fotolabile bindinger, peptiddaselabile bindinger og esteraselabile bindinger. Disulfidbindinger foretrekkes.
Beskrivelsen i US patentskrift nr. 5 208 020 beskriver fremstilling av maytansinoider som bærer slike bindinger.
Ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter bindingsgruppen en sterisk hindret tiolgruppe eller disulfidgruppe.
Maytansinoider som omfatteren bindingsgruppe som inneholderen reaktiv kjemisk gruppe i følge oppfinnelsen er C-3-estere av maytansinol hvor bindingsgruppen inneholder en sterisk hindret tiol- eller disulfidbinding.
Selv om syntesen av estere av maytansinol som har en bindingsgruppe er beskrevet nedenfor i form av en disulfidbinding som inneholder bindingsgrupper i posisjon C-3, vil en fagperson videre forstå at bindingsgrupper med andre kjemiske bindinger som beskrevet ovenfor også kan anvendes i foreliggende oppfinnelse.
Strukturen av forskjellige maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse er gitt i Fig. 2. Syntese av maytansinoider med en sterisk hindret tiol- eller disulfidgruppe kan beskrives ved henvisning til Fig. 3. Mange av metodene det gis eksempler på nedenfor benytter de tiolholdige maytansinoidene N<2->deacetyl-N-<2>(4-merkapto-l-oksopentyl)-maytansin (betegnet DM3) og N<2>'-deacetyl-N-<2>'-4-metyl-4-merkapto-l-oksopentyl)-maytansin (betegnet DM4). DM3 (4a) og DM4 (4b) er representert ved følgende strukturformler:
Cytotoksisiteten in vitro av de nye, sterisk hindrede tiol- og disulfidholdige maytansinoidene ifølge oppfinnelsen kan evalueres for evne til å undertrykke proliferasjon av forskjellige uønskede cellelinjer in vitro (Fig. 4). For eksempel kan cellelinjer slik som den humane brystkarsinomcellelinjen SK-Br-3, eller den humane epidermoide karsinom-cellelinjen KB anvendes for å vurdere cytotoksisiteten av disse nye maytansinoidene. Cellene som skal evalueres kan eksponeres ovenfor forbindelsene i 72 timer, og den overlevende fraksjonen av celler kan måles i direkte analyser ved kjente fremgangsmåter. IC50-verdier kan så beregnes ut fra analyseresultatene.
Fremstilling av maytansinoider med en sterisk hindret tiol- eller disulfidgruppe
Maytansinoidet ifølge foreliggende oppfinnelse er C-3-esteren, som er en forbindelse representert ved formel 4:
hvor substituentene er som definert i krav 1.
Spesielt foretrukket er hvilken som helst av de ovenfor beskrevne forbindelser hvor Ri er H, R2er metyl, R5, R6, R7og R8alle er H, I og m begge er 1, n er 0 og Z er H, forbindelsene hvor Ri og R2er metyl, R5, R6, R7og Rs alle er H, I og m er 1, n er 0 og Z er H, forbindelsene hvor Ri er H, R2er metyl, R5, Re, R7og R8alle er H, I og m begge er 1, n er 0 og Z er -SCH3og forbindelsene hvor Ri og R2er metyl, R5, R6, R7og R8alle er H, I og m er 1, n er 0 og Z er -SCH3. Videre anvendes L-alanyl stereoisomeren, da denne er den mest nyttig for konjugatene ifølge oppfinnelsen.
Foretrukne utførelser av formel 4 omfatter DM3 og DM4, dvs. maytansinoidet med formel 4 hvor Z er H, Ri er H, R2er metyl, R5, R6, R7 og R8alle er H, I og m er 1 og n er 0 (DM3, forbindelse 4a), maytansinoidet med formel 4 hvor Z er H, Ri og R2begge er metyl, R5, R6, R7 og R8alle er H, I og m er 1 og n er 0 (DM4, forbindelse 4b), maytansinoidet med formel 4 hvor Ri er H, R2er metyl, R5, R6, R7og Rs alle er H, I og m begge er 1, n er 0 og Z er -SCH3, og maytansinoidet med formel 4 hvor Ri og R2er metyl, R5, R6, R7og R8alle er H, I og m er 1, n er 0 og Z er -SCH3.
Eksempler på lineære alkyl- eller alkenylgrupper med fra 1 til 10 karbonatomer inkluderer metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, propenyl, butenyl og heksenyl.
Eksempler på forgrenede alkyl- eller alkenylgrupper med fra 3 til 10 karbonatomer inkluderer isopropyl, isobutyl, sek-butyl, tert-butyl, isopentyl, 1-etylpropyl, isobutenyl og isopentenyl.
Eksempler på sykliske alkyl- eller alkenylgrupper med fra 3 til 10 karbonatomer inkluderer syklopropyl, syklobutyl, syklopentyl, sykloheksyl, syklopentenyl og syklo-heksenyl.
Enkle aryler inkluderer aryler med fra 6 til 10 karbonatomer og substituerte aryler inkluderer aryler med fra 6 til 10 karbonatomer som bærer minst en alkylsubstituent som inneholder fra 1 til 4 karbonatomer, en alkoksy-substituent, for eksempel metoksy eller etoksy, en halogensubstituent eller en nitro-substituent.
Eksempler på enkle aryler som inneholder fra 6 til 10 karbonatomer inkluderer fenyl og naftyl.
Eksempler på substituert aryl inkluderer nitrofenyl og dinitrofenyl.
Heterosykliske radikaler inkluderer grupper som har en 3 til 10 leddet ring inneholdende ett eller to heteroatomer valgt blant N, O og S.
Heterosykliske radikaler inkluderer sykliske forbindelser som omfatter en 3 til 10 leddet ring inneholdende ett eller to heteroatomer valgt blant N, O og S.
Eksempler på heterosykliske aromatiske radikaler inkluderer pyridyl, nitropyridyl, pyrrolyl, oksazolyl, tienyl, tiazolyl og furyl.
Eksempler på heteroalkylradiakler inkluderer dihydrofuryl, tetrahydrofuryl, tetrahydropyrrolyl, piperidinyl, piperazinyl og morfolino.
Nye maytansinoider med en sterisk hindret tiol- eller disulfidgruppe kan fremstilles ved de påfølgende, nylig beskrevne fremgangsmåtene:
Syntese av maytansinoider
Fig. 3a viser trinnene i syntesen av maytansinoid DM4 (4b). Isobutylensulfid (5) omsettes med anionet av acetonitril for å tilveiebringe merkaptoforbindelsen 6. Hydrolyse av 6 med base gir 4-merkapto-4-metylpentansyre (7). Omdannelse av 7 til disulfidet 8 oppnås ved omsetning med metylmetantiolsulfonat (MeSS02Me).
Omdannelse av 8 til dens N-hydroksysuksinimidester 9, etterfulgt av omsetning med N-metyl-L-alanin ga karboksyl-syren 10 som ble renset ved kolonnekromatografi på silika gel. Omsetning av 10 med maytansinol (11) i nærvær av N,N'-disykloheksylkarbodiimid (DCC) og sinkklorid ga en blanding av N-acyl-N-metyl-L-alanylmaytansinoid-L-DMF4SMe (4e) og N-acyl-N-metyl-D-alanylmaytansinoid D-DM4SMe (4f). Blandingen av diastereomerer ble separert ved HPLC ved anvendelse av en cyanobundet kolonne. Den ønskede, L-aminosyreholdige isomer 4e ble oppsamlet og redusert med ditiotreitol for å tilveiebringe det tiolholdige L-aminoacyl-maytansinoid DM4 (4b), som igjen ble renset ved HPLC ved anvendelse av en cyanobundet kolonne.
Fig. 3b viser trinnene i syntesen av maytansinoid DM3 (4a).
4-Merkaptopentansyre (12) ble omdannet til metyldisulfidet ved omsetning med metylmetantiolsulfonat for å gi 13. Omdannelse av 13 til dens N-hydroksysuksinimidester 14, etterfulgt av omsetning med N-metyl-L-alanin ga karboksylsyren 15, som ble renset ved kolonnekromatografi på silika gel. En omsetning av 15 med maytansinol (11) i nærvær av N,N'-disykloheksylkarbodiimid (DCC) og sinkklorid ga en blanding av N-acyl-N-metyl-L-alanyl-maytansinoid L-DM3SSMe, (4c), og N-acyl-N-metyl-D-alanylmaytansinoid
D-DM3SSMe (4d). Blandingen av diastereomerer ble separert ved HPLC ved anvendelse av en cyanobundet kolonne. Den ønskede L-aminosyreholdige isomeren ble oppsamlet og redusert med ditiotreitol for å tilveiebringe det merkapto-L-aminosyreholdige maytansinoidet DM3 (4a), som igjen ble renset ved HPLC ved anvendelse av en cyanobundet kolonne.
Fig. 3c og d viser syntesen av DM3 bærende enten (S)-4-metylditio-l-oksopentyl-gruppen eller (R)-4-metylditio-l-oksopentylgruppen. Omdannelse av (R)-1,3-butandiol (16) til ditosylatet 17, etterfulgt av omsetning med natriumcyanid og så kaliumetylxantat ga nitril 18 (Fig. 3c). Basehydrolyse etterfulgt av disulfid-bytting ga (S)-4-metylditiopentan-syre 19. Omdannelse av 19 til suksinimidylesteren 20, etterfulgt av omsetning med
N-metyl-L-alanin ga N-metyl-N-[4-(S)-metylditio-l-oksopentyl]-S-alanin (15a). Reaksjon med maytansinol som beskrevet ovenfor for forbindelse 15 ga de to diastereomerene av
L-DM3SMe 4g og 4h. På tilsvarende måte ble (S)-l,3-butandiol (21) omdannet til (R)-4-metylditiopentansyre 24 og så til 15b. Reaksjon med maytansinol som beskrevet ovenfor ga de to diastereomerene av DM3SMe, 4k og 41.
Følgelig tilveiebringer foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for forestring av maytansinol for å gi et maytansinoid med formelen 42:
hvor fremgangsmåten omfatter å la maytansinol reagere i posisjon C-3 med en forbindelse med formelen (III-L) eller (III-D,L): hvor
hvor
Ri er metyl og R2er H eller Ri og R2er metyl; og
Z2er SCH3.
Fortrinnsvis er forbindelsen som er representert ved formel (III) L-stereoisomeren.
Ved fremstilling av DM3 er forbindelsen med formel (III-L) 15a(S,S), 15b(S,R) eller en blanding av 15a(S,S) og 15b(S,R), og forbindelsen med formel (III-D,L) er racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15.
Blandingen av 15a(S,S) og 15b(S,R) kan fremstilles ved en prosess som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) og metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13; (2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester (14); (3) omsette forbindelse 14 med N-metyl-L-alanin for å gi blandingen av forbindelse 15a(S,S) og 15b(S,R).
Racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med struktur 15 kan fremstilles ved en prosess som omfatter å: (1) omsette 4-merkaptopentansyre (12) og metylmetantiolsulfonat for å gi forbindelse 13; (2) omdanne forbindelse 13 til dens N-hydroksysuksinimidester 14; (3) omsette forbindelse 14 med racemisk N-metylalanin for å gi racemisk N-metylalanin acylert med en karboksylgruppe som bærer en beskyttet tiol funksjonalitet, hvor karbonsenteret som bærer svovelatomet enten er racemisk eller har R- eller S-kiralitet, for å gi forbindelser med strukturen 15.
Forbindelse 15a(S,S) kan fremstilles ved en prosess som omfatter å:
(1) omdanne (R)-l,3-butandiol til (S)-4-(metylditio)pentansyre 19;
(2) omdanne forbindelse 19 til dens N-hydroksysuksinimidester (20); og
(3) omsette forbindelse 20 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15a(S,S).
Forbindelse 15b(S,R) kan fremstilles ved en prosess som omfatter å:
(1) omdanne (S)-l,3-butandiol til (R)-4-(metylditio)pentansyre 24;
(2) omdanne forbindelse 24 til dens N-hydroksysuksinimidester (25); og
(3) omsette forbindelse 25 med N-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15b(S,R).
Ved fremstilling av DM4 er forbindelsen med formel (III-L) en forbindelse 10 inneholdene N-metyl-L-alanin, og forbindelsen med formel (III-D,L) er forbindelse 10 inneholdende racemisk N-metylalanin.
Forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin fremstilles ved en prosess som omfatter å: (1) omsette isobutylensulfid (5) med anionet av acetonitril for å gi forbindelse 6; (2) hydrolysere forbindelse 6 for å gi 4-merkapto-4-metylpentansyre (7); (3) omdanne forbindelse 7 til disulfidet 8 ved omsetning med metylmetantiolsulfonat;
(4) omdanne forbindelse 8 til dens N-hydroksysuksinimidester 9; og
(5) omsette forbindelse 9 med N-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin for å gi forbindelse 10 inneholdende N-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin.
Ifølge foreliggende oppfinnelse er forbindelser ifølge formel III også nye:
hvor
Y2er som definert i krav 9.
Forbindelsene med formel III kan lett fremstilles av en gjennomsnitts fagperson ved fremgangsmåter som tilsvarer dem beskrevet her for fremstilling av forbindelsene 10 og 15.
In v/tro-cytotoksisitet av maytansinoider
In wtro-cytotoksisiteten av maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i Fig. 4. De nye maytansinoidene (4c, 4e), som bærer en hindret disulfidbinding, er svært aktive mot de analyserte cellelinjene. Således dreper 4c A-375-celler og SK-Br-3-celler med IC50-verdier på henholdsvis 1,5 x 10<11>M og 7,0 x 10 12 M. På tilsvarende måte er maytansinoid 4e også svært aktivt, med IC50-verdier på 3,2 x 10<11>M og 9,0 x 10<12>M mot henholdsvis A-375-celler og SK-Br-3-celler. Sammenligning av in vitro-styrken av det hindrede tiolholdige maytansinoidet 4a ifølge foreliggende oppfinnelse, med den til det tidligere beskrevne maytansinoid 1 (Fig. 4c, d), viser at de nye maytansinoidene er 20- til 50-ganger mer aktive enn de tidligere beskrevne.
Fremstilling av cellebindende midler
Effektiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen som terapeutiske midler avhenger av nøye utvelgelse av et egnet cellebindende middel. Cellebindende midler kan være av enhver type som i dag er kjent eller som vil bli kjent, og omfatter peptider og ikke-peptider. Vanligvis kan disse være antistoffer (fortrinnsvis monoklonale antistoffer), lymfokiner, hormoner, vekstfaktorer, vitaminer, næringstransportmolekyler (slik som transferin) eller ethvert annet cellebindende molekyl eller forbindelse.
Mer spesifikke eksempler på cellebindende midler som kan anvendes inkluderer:
polyklonale antistoffer,
monoklonale antistoffer,
fragmenter av antistoffer, slik som Fab, Fab' og F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983), Spring et al. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960));
interferoner (f. eks. alfa, beta, gamma);
lymfokiner, slik som IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
hormoner, slik som insulin, TRH (tyrotropinfrigjørende hormon), MSH (melanocytt-stimulerende hormon), steroide hormoner, slik som androgener og østrogener;
vekstfaktorer og kolonistimulerende faktorer, slik som EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF og GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));
transferin (0'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); og vitaminer, slik som folat.
Monoklonale antistoff-teknikker tillater fremstilling av ekstremt spesifikke cellebindende midler i form av spesifikke monoklonale antistoffer. Spesielt velkjente innen faget er teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer dannet ved å immunisere mus, rotter, hamstere eller ethvert annet pattedyr med antigenet av interesse, slik som den intakte målcellen, antigener isolert fra målcellen, hele virus, attenuerte hele virus og virusproteiner, slik som virus kappeproteiner. Sensibiliserte humane celler kan også anvendes. En annen fremgangsmåte for å fremstille monoklonale antistoffer er anvendelse av bakteriofag biblioteker av scFv (enkeltkjedet variabelt område), fortrinnsvis humane scFv (se f. eks. Griffiths et al., US patentskrift nr. 5 885 793 og 5 969 108, McCafferty et al., WO 92/01047, Liming et al., WO 99/06587). I tillegg kan overflatemodifiserte antistoffer, beskrevet i US patentskrift nr. 5 639 641 også anvendes, og likeså humaniserte antistoffer.
Seleksjon av det egnede cellebindende middel er et spørsmål om valg som er avhengig av den bestemte cellepopulasjon som målet skal rettes mot, men generelt foretrekkes humane monoklonale antistoffer dersom et passende ett er tilgjengelig.
For eksempel er det monoklonale antistoff MY9 et muse-IgGi-antistoff som binder spesifikt til CD33-antigenet (J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)), og som kan anvendes dersom målcellene uttrykker CD33, som i sykdommen akutt myelogen leukemi (AML). På tilsvarende måte er det monoklonale antistoffet anti-B4 et muse-IgGisom binder til CD19-antigenet på B-celler (Nadler et al., 131 J. Immunol. 244-250 (1983)) og kan anvendes dersom målcellene er B-celler eller syke celler som uttrykker dette antigenet, slik som i non-Hodgkin's lymfom eller kronisk lymfoblastisk leukemi. På tilsvarende måte kan det monoklonale antistoff C242, som binder til CanAg-antigenet (US patentskrift nr. 5 552 293), anvendes ved behandling av CanAg-uttrykkende tumorer, slik som kolorektal-, bukspyttkjertel- og magekreft.
I tillegg kan GM-CSF, som binder til myeloide celler, anvendes som cellebindende middel mot syke celler fra akutt, myelogen leukemi. IL-2, som binder til aktiverte T-celler, kan anvendes for forebyggelse av transplantatforkastelse, for behandling og forebyggelse av graft-versus-host-sykdom og for behandling av akutt T-celleleukemi. MSH, som binder til melanocytter, kan anvendes for behandling av melanom. Folsyre kan anvendes for styring til folatreseptoren, som uttrykkes på ovarie-og andre tumorer. Epidermal vekstfaktor kan anvendes for målstyring til plateepitelkreft, slik som i lunge, hode og hals. Somatostatin kan anvendes for målstyring til neuroblastomer og andre tumortyper.
Styring til kreft i bryst og testis kan oppnås med suksess med henholdsvis østrogen (eller østrogenanaloger) eller androgen (eller androgenanaloger) som cellebindende midler.
Fremstilling av cytotoksiske konjugater
Foreliggende oppfinnelse frembringer også et konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel, hvor maytansinoidet er representert ved formel 4i:
hvor substituentene er som definert i krav 6.
Representative cytotoksiske konjugater ifølge oppfinnelsen er antistoff/- maytansinoid, antistoffragment/maytansinoid, epidermal vekstfaktor (EGF)/maytansinoid, melanocyttstimulerende hormon (MSH)/maytansinoid, tyroidstimulerende hormon (TSH)/-maytansinoid, somatostatin/maytansinoid, folat/maytansinoid, østrogen/maytansinoid, østrogenanalog/maytansinoid, androgen/maytansinoid og androgenanalog/maytansinoid.
Det tiolholdige maytansinoidet omsettes med et passende modifisert cellebindende middel for å fremstille cytotoksiske konjugater. Disse konjugatene kan renses ved gel-filtrering, ionebytterkromatografi eller HPLC.
Reaksjonsskjemaer for fremstilling av konjugater for sulfhydrylgruppeholdige maytansinoider vist i Figur 5. Nærmere bestemt (Fig. 5a, b), kan en løsning av et antistoff i en vandig buffer inkuberes med et molart overskudd av et antistoffmodifiserende middel, slik som N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP, 3a) for innføring av ditiopyridyl-grupper (Fig. 5a) eller med N-suksinimidyl-4-(2-pyridylditio)butanoat (SPDB, 3b) for innføring av ditiopyridylgrupper (Fig. 5b). Det modifiserte antistoffet får så reagere med de tiolholdige maytansinoidene (slik som 4a eller 4b) for dannelse av et disulfid-bundet antistoff-maytansinoidkonjugat. Maytansinoid-antistoffkonjugatet kan så renses ved gel-filtrering.
Alternativt kan antistoffet inkuberes med et molart overskudd av et antistoffmodifiserende middel, slik som 2-iminotiolan, for innføring av sulfhydrylgrupper. Det modifiserte antistoffet omsettes så med de ønskede disulfidholdige maytansinoidene for dannelse av et disulfid-bundet antistoff-maytansinoidkonjugat. Maytansinoid-antistoffkonjugatet kan så renses ved gel-filtrering.
Antallet av maytansinoidmolekyler (angitt med w i Figurene 5a til 5d) som er bundet per antistoffmolekyl kan bestemmes ved spektrofotometrisk måling av forholdet mellom absorbansen ved 252 nm og 280 nm. Et gjennomsnitt på 1-10 maytansinoidmolekyler/antistoffmolekyl kan bindes ved denne fremgangsmåten. Det foretrukne gjennomsnitlige antall bunnede maytansinoidmolekyler per antistoffmolekyl er 2-5, og mest foretrekket er 3-4,5.
Alternativt kan en løsning av et antistoff i en vandig buffer inkuberes med et molart overskudd av et antistoffmodifiserende middel, slik som N-suksinimidyl-4-(N-maleimido-metyl)-sykloheksan-l-karboksylat (SMCC, 26) for innføring av maleimidogrupper (Fig. 5c) eller med N-suksinimidyl-4-(jodacetyl)-aminobenzoat (SIAB, 27) for innføring av jodacetyl-grupper (Fig. 5d). Det modifiserte antistoffet omsettes så med de tiolholdige maytansinoidene (slik som 4a eller 4b) for dannelse av et tioeter-bundet antistoff-maytansinoidkonjugat. Maytansinoid-antistoffkonjugatet kan så renses ved gel-filtrering.
Antall maytansinoidmolekyler som er bundet per antistoffmolekyl kan bestemmes ved spektrofotometrisk analyse som beskrevet ovenfor.
Således omtaler foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for fremstilling av et konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel som omfatter fremstilling av et renset maytansinoid ved én av fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, og omsette det rensede maytansinoidet med et cellebindende middel som omfatter en reaktiv ditio- eller sulfhydrylgruppe. Fortrinnsvis er den reaktive ditiogruppen en ditiopyridylgruppe eller en substituert ditiopyridylgruppe. Spesielt foretrukket omfatter den reaktive ditiogruppen en nitropyridylditio- eller dinitropyridylditiogruppe.
I en annen fremgangsmåte omsettes det rensede maytansinoid med et cellebindende middel som omfatteren maleimidogruppe eller en haloacetylgruppe.
Konjugater mellom cellebindende midler og maytansinoide legemidler ifølge oppfinnelsen kan evalueres for deres evne til å undertrykke proliferasjon av forskjellige uønskede cellelinjer in vitro (Fig. 6). For eksempel kan cellelinjer som den humane kolon-karsinomcellelinjen COLO 205, den humane melanomcellelinjen A-375 eller den humane myeloide leukemicellelinjen HL60 anvendes for å vurdere cytotoksisiteten til disse konjugatene. Cellene som skal evalueres kan eksponeres for forbindelsene i 24 timer, og den overlevende fraksjonen av celler kan måles i direkte analyser ved kjente fremgangsmåter. IC50-verdier kan så beregnes ut fra resultatene fra disse analysene.
In wfro-styrken og målspesifisiteten for antistoff-maytansinoidkonjugater ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i Fig. 6, 10 og 12. Således viser Fig. 6 at både huC242-DM3 og huC242-DM4 er svært effektive for dreping av antigenpositive COLO 205-celler, med IC50-verdier på henholdsvis 1,3 x 10<11>M og 1,1 x 10<11>M. I motsetning til dette er antigennegative A-375-celler rundt 500-fold mindre følsomme, noe som viser at maytansinoidkonjugater ifølge foreliggende oppfinnelse er svært effektive og spesifikke. På tilsvarende måte viser Fig. 10 og 12 den høye effektiviteten og målspesifisiteten av konjugater av maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse med antistoffene henholdsvis MY9-6, og anti-B4.
Anti-tumorvirkningen in vivo av konjugater mellom antistoffer og hindret tiolholdige maytansinoider ifølge foreliggende oppfinnelse ble sammenlignet med den til tidligere beskrevne maytansinoidkonjugater i flere forskjellige humane tumormodeller i mus. I den første modellen (Fig. 7) ble SCID-mus som bar etablerte, subkutane humane kolontumor HT-29 xenotransplantater behandlet, enten med antistoff konjugatet (huC242-DMl) av det tidligere beskrevne maytansinoid DM1, eller med de to nye maytansinoidkonjugatene (huC242-DM3, huC242-DM4). Behandling med huC242-DMl førte til en forsinkelse i tumorveksten på 18 dager. I motsetning til dette var de nye midlene signifikant mer virkningsfulle, med en tumorvekst-forsinkelse på 28 dager for huC242-DM3 og 36 dager for huC242-DM4.
I den andre modellen (Fig. 8) ble mus som bar etablerte, subkutane humane kolon-tumor COLO 205 xenotransplantater behandlet, enten med antistoff konjugatet (huC242-DMl) av det tidligere beskrevne maytansinoid DM1, eller med de to nye maytansinoid-konjugatene (huC242-DM3, huC242-DM4). Behandling med huC242-DMl førte ikke til tumorregresjon og ga en forsinkelse i tumorveksten på 20 dager. I motsetning til dette var de nye midlene signifikant mer virkningsfulle. Fullstendig tumorregresjon som varte i 45 dager ble oppnådd i gruppen som ble behandlet med huC242-DM3. huC242-DM4 var enda mer virkningsfulle og førte til kurering av alle de behandlede musene.
I den tredje modellen (Fig. 9) ble mus som bar etablerte, subkutane humane myeloide leukemi HL60 xenotransplantater behandlet, enten med antistoff konjugatet (MY-9-6-DM1) av det tidligere beskrevne maytansinoid DM1, eller med de to nye maytansinoidkonjugatene (MY9-6-DM3, MY9-6-DM4). Behandling med MY9-6-DM1 førte ikke til tumorregresjon og ga en forsinkelse i tumorveksten på 5 dager. I motsetning til dette var de nue midlene signifikant mer virkningsfulle og førte til tumorregresjon. Både MY9-6-DM3 og MY-9-6-DM4 ga en forsinkelse av tumorveksten på mer enn 20 dager.
I den fjerde modellen (Fig. 11) ble et maytansinoid ifølge foreliggende oppfinnelse (huMY9-6-DM4) direkte sammenlignet med det av et konjugat av det tidligere beskrevne maytansinoid (huMY9-6-DMl) i en subkutan xentotransplantatmodell etablert med HL-60-celler. I en ekvivalent dose førte behandling med konjugatet ifølge foreliggende oppfinnelse, MY9-6-DM4, til en fullstendig tumorregresjon som varte i 85 dager. I motsetning er konjugatet av det tidligere beskrevne maytansinoid mye mindre aktivt, med en forsinkelse i tumorveksten på kun tilnærmet 48 dager.
I den femte modellen (Fig. 13a) viser et konjugat at et maytansinoid ifølge foreliggende oppfinnelse med huB4-antistoffet høy anti-tumoraktivitet på en doseavhengig måte i en subkutan Ramos-tumormodell. Fullstendig tumorregresjon og kurering oppnås i doser som er ikke-toksiske (Fig. 13a, b).
Resultatene fra de ovenfor beskrevne aktivitetseksperimentene viser at de sterisk hindrede tiolholdige maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse gir konjugater med cellebindende midler med svært forbedret anti-tumoraktivitet, sammenlignet med de tidligere beskrevne konjugater mellom maytansinoid og cellebindende middel.
Preparater og fremgangsmåter for anvendelse
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater som omfatter en effektiv mengde av hvilket som helst av konjugatene mellom maytansinoid og cellebindende middel ifølge foreliggende oppfinnelse, et farmasøytisk akspeterbart salt eller solvat derav, og et farmasøytisk akseptabelt bærer, et fortynningsmiddel eller en eksipiens.
Beskrivelsen omtaler også behandlingsfremgangsmåter som omfatter administrering til et individ med behov for behandling av en effektiv mengde av et hvilket som helst av konjugatene som er beskrevet ovenfor.
På tilsvarende måte omtaler foreliggende beskrivelse en fremgangsmåte for induksjon av celledød i utvalgte cellepopulasjoner som omfatter å sette målceller eller vev som inneholder målceller i kontakt med en effektiv mengde av et cytotoksisk middel som omfatter et hvilket som helst av konjugatene mellom maytansinoid og cellebindende middel ifølge foreliggende oppfinnelse, et salt eller solvat derav. Målcellene er celler som det cellebindende middel kan bindes til.
Om ønsket kan andre aktive midler, slik som andre anti-tumor midler, administreres sammen med konjugatet.
Egnede, farmasøytisk akseptable bærerer, fortynningsmidler og eksipienser er velkjente og kan bestemmes av gjennomsnittsfagpersoner ut fra hva den kliniske situasjon krever.
Eksempler på egnede bærerer, fortynningsmidler og/eller eksipienser inkluderer: (1) Dulbecco's fosfatbufrede saltvann, pH rundt 7,4, inneholdende eller ikke inneholdende 1 mg/ml til 25 mg/ml humant serumalbumin, (2) 0,9 % saltvann (0,9 % vekt/vol NaCI) og (3) 5 % (vekt/vol) dekstrose, og kan også inneholde en antioksidant, slik som tryptamin og et stabiliseringsmiddel, slik som Tween 20.
Fremgangsmåte for induksjon av celledød i valgte cellepopulasjoner kan utføres in vitro, in vivo eller ex vivo.
Eksempler på in wtro-anvendelser inkluderer behandling av autolog benmarg før tilbakeføring til pasienten for å drepe syke eller ondartede celler: behandling av benmarg før transplantasjon for å drepe kompetente T-celler og forhindre graft-versus-host-sykdom (GVHD), behandling av cellekulturer for å drepe alle celler bortsett fra ønskede varianter som ikke uttrykker målantigenet eller for å drepe varianter som uttrykker uønsket antigen.
Betingelsene for ikke-klinisk in wfro-anvendelse fastsettes lett av en gjennomsnitts fagperson.
Eksempler på klinisk ex wVo-anvendelse er å fjerne tumorceller eller lymfoide celler fra benmarg før autolog transplantasjon ved kreftbehandling eller behandling av autoimmun sykdom, eller å fjerne T-celler og andre lymfoide celler fra autolog eller allogen benmarg eller vev før transplantasjon for å forhindre GVHD. Behandlingen kan utføres som følger: Benmarg høstes fra pasienten eller et annet individ og inkuberes så i medium som inneholder serum og som er tilsatt det cytotoksiske middel ifølge oppfinnelsen i et konsentrasjonsområde fra rundt 10 til 1 pM, i rundt 30 minutter og til rundt 48 timer ved rundt 37°C. De eksakte betingelsene for konsentrasjon og inkuberingstid, dvs. dosen, bestemmes lett av en gjennomsnitts fagperson. Etter inkuberingen vaskes benmargcellene med medium som inneholder serum og tilbakeføres til pasienten intravenøst ifølge kjente fremgangsmåter. Under omstendigheter hvor pasienten gis annen behandling, slik som en kur med ablativ kjemoterapi eller bestråling av hele kroppen, i tidsrommet mellom høsting av margen og reinfusjon av de behandlede cellene lagres de behandlede margscellene nedfrosset i flytende nitrogen ved anvendelse av standard medisinsk utstyr.
For klinisk in wVo-anvendelse vil det cytotoksiske middel ifølge oppfinnelsen leveres som en løsning eller et frysetørket pulver som er testet for sterilitet og endotoksinnivå. Eksempler på egnede protokoller for konjugat administrering er som følger: Konjugater gis ukentlig i 4 uker som en intravenøs bolusinfusjon hver uke. Bolusdosene gis i 50 til 1000 ml av normalt saltvann hvor 5 til 10 ml humant serumalbumin kan være tilsatt. Dosene vil være 10^g til 2000 mg per intravenøst administrering, (i området fra 100 ng til 20 ng/kg per dag). Etter 4 uker med behandling kan pasientene fortsette med å få behandling på ukebasis. Spesifikke, kliniske protokoller med hensyn til administreringsvei, eksipienser, fortynningsmidler, doser, tidsrom osv. kan bestemmes av en gjennomsnittsfagperson ut fra hva den kliniske situasjon tilsier.
Eksempler på medisinske tilstander som kan behandles ifølge in vivo- eller ex wVo-fremgangsmåtene for induksjon av celledød i utvalgte cellepopulasjoner, inkluderer ondartede tilstander av enhver type, inkludert for eksempel kreft i lunge, bryst, kolon, prostata, nyre, bukspyttkjertel, ovarie og lymfatiske organer, autoimmune sykdommer slik som systemisk lupus, reumatoid artritt og multippel sklerose, transplantatforkastelse, slik som nyretransplantat-forkastelse, levertransplantat-forkastelse, lungetransplantat-forkastelse, hjertetransplantat-forkastelse og benmargstransplantat-forkastelse, graft-versus-host-sykdom, virusinfeksjoner, slik som CMV-infeksjon, HIV-infeksjon, AIDS osv. og parasittinfeksjoner, slik som giardiasis, amoebiasis, schiostosomiasis og andre, som fastslått av en gjennomsnitts-fagperson.
EKSEMPLER
Oppfinnelsen vil nå illustreres ved henvisning til ikke-begrensende eksempler. Dersom ikke annet er angitt er alle prosentverdier, forhold, deler osv. gitt som vekt/vekt. Alle reagenser ble innkjøpt fra Aldrich Chemical Co., New Jersey, eller andre kommersielle kilder. Maytansinol (11) ble fremstilt som beskrevet tidligere (US patentskrift nr. 6 333 410). Kjernemagnetisk ressonans (<1>H NMR)-spektere ble oppnådd i et Bruker 400 MHz-instrument, og massespektere ble oppnådd i et Bruker Daltonics Esquire 3000-instrument ved anvendelse av elektrospray ionisering.
Eksempel 1
Syntese av maytansinoid 4b
4-Merkapto-4-metylpentansyre (7): En 500 ml kolbe ble utstyrt med rørepinne og en 150 ml tilsetn i ngstra kt. Systemet ble plasset under argonatmosfære. 150 ml vannfri tet ra hyd rof uran (THF) og 75 ml 2,5 M n-BuLi i heksaner (18,7 mmol) ble tilsatt via en kanyle, og løsningen ble avkjølt i et tørris/aceton bad ved -78°C. Acetonitril (7,3 g, 9,4 ml, 18 mmol) ble tilsatt dråpevis via en sprøyte over tilnærmet 5 minutter. Reaksjons-blandingen ble omrørt i 30 minutter mens en hvit utfelling av litiumacetonitril ble dannet. Isobutylensulfid (15 g, 17 mmol) ble løst i 100 ml vannfri THF og tilsatt dråpevis over tilnærmet 30 minutter via tilsetningstrakten. Kjølebadet ble fjernet og reaksjonsblandingen fikk stå med røring i 3 timer. Kolben ble avkjølt i et is/vannbad mens 38 ml 0,5 M HCI ble tilsatt dråpevis. THF-laget ble beholdt og Det vandige sjiktet ble vasket to ganger med 75 ml etylacetat. THF- og etylacetatsjiktene ble slått sammen, tørket over tilnærmet 20 g vannfritt natriumsulfat og overført til en 250 ml kolbe. Løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi
urent 6. Etanol (30 ml) og en rørepinne ble tilsatt. Innholdet ble omrørt mens en løsning av 8,0 g NaOH i 30 ml deionisert vann ble langsomt tilsatt. Kolben ble utstyrt med en tilbakeløpskjøler og plassert under argon-atmosfære. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet med tilbakeløp over natten og så avkjølt til romtemperatur. Avionisert vann (60 ml) ble tilsatt og blandingen ble ekstrahert to ganger med 25 ml posjsoner av en 2:1 blanding av etylacetat og heksan. Det vandige sjiktet ble surgjort til pH 2 med konsentrert HCI og så ekstrahert tre ganger med 75 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble tørket over vannfri Na2S04, og løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi 10 g produkt 7 (39 % utbytte). Materialet ble anvendt uten ytterligere rensing.
<*>H NMR (CDCI3): 8 1,38 (6H, s), 1,87-1,93 (2H, m), 2,08 (1H, s), 2,51-2,57 (2H, m).
4-Metyl-4-(metylditio)pentansyre (8): En løsning av merkaptopentansyre 7 (6,0 ml, 40 mmol) ble løst I 50 ml avionisert vann i en 250 ml kolbe. Løsningen ble magnetisk omrørt mens natriumkarbonat (6,4 g, 60 mmol) ble tilsatt til syren med en hastighet som ikke forårsaker overdreven skumming. Kolben ble utstyrt med en 100 ml tilsetn i ngstra kt, som ble fylt med en løsning av metylmetantiolsulfonat (7,5 g, 60 mmol) løst i 30 ml glassdestillert 100 % etanol. Kolben ble avkjølt i et is/vannbad, og systemet ble holdt under argonatmosfære. Metylmetantiolsulfonatløsningen ble tilsatt dråpevis til kolben så hurtig som mulig, men uten å forårsake overdreven skumming. Kjølebadet ble fjernet og reaksjonsblandingen omrørt i ytterligere 3 timer. Løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum inntil tilnærmet 20 ml var igjen. Deretter ble 10 ml mettet natriumbikarbonat og 30 ml avionisert vann tilsatt. Blandingen ble vasket tre ganger med 25 ml porsjoner av etylacetat i en skilletrakt. Det vandige sjiktetet ble justert til tilnærmet pH 2 med 5M HCI og ble ekstrahert to ganger med 120 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen og vasket med 20 ml av en løsning bestående av mettet NaCI og IM HCI i forholdet 4:1. Det organiske sjiktet ble så tørket over 14 g vannfritt natriumsulfat, og løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi 5,4 g av produkt 8 (70 % utbytte). Materialet kan benyttes i neste trinn uten ytterligere rensing.
<*>H NMR (CDCI3): 8 1,54 (6H, s), 2,15-2,21 (2H, m), 2,64 (3H, s), 2,69-2,72 (2H, m). MS (M+Na<+>) ber.: 217,0, funnet: 217,1.
N-Hydroksysuksinimidyl-4-metyl-4-(metylditio)pentanoat (9): Metylditiopentansyre 8 (3,0 g, 15 mmol) ble løst i 20 ml metylenklorid og omrørt magnetisk mens N-hydroksysuksinimid (2,65 g, 23 mmol) ble tilsatt, etterfulgt av l-[3-(dimetyl-amino)propyl]-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (EDC, 4,4 g, 23 mmol). Blandingen ble omrørt under argonatmosfære i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble hellet over i en 125 ml skilletrakt, 40 ml etylacetat ble tilsatt og løsningen ble vasket to ganger med 20 ml porsjoner av 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,0 og én gang med 12 ml mettet natriumklorid. Det organiske sjiktet ble tørket over 14 g vannfritt Na2S04, og løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi 4,0 g av produkt 9 (90 % utbytte), som ble anvendt uten ytterligere rensing.
<*>H NMR (CDCI3): 8 1,30 (6H, s), 2,00-2,05 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,68-2,72 (2H, m), 2,73-2,83 (4H, m). MS (M+Na<+>) ber.: 314,0, funnet: 314,1.
N-Metyl-N-(4-metyl-4-metylditio-l-oksopentyl)-L-alanin (10): N-metyl-L-alanin (2,85 g, 18,0 mmol) ble løst I 50 ml av en 1:1 blanding av dimetoksyetan og avionisert vann i en 125 ml kolbe utstyrt med magnetisk rørepinne. Trietylamin (6,9 g, 36 mmol) ble tilsatt, og løsningen ble kraftig omrørt mens 9 (5,44 g, 18 mmol) løst i 40 ml av den samme løsemiddelblanding ble tilsatt dråpevis over tilnærmet 5 minutter. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen oppkonsentrert til tilnærmet 40 ml ved evaporering ved rotering under vakuum, hvoretter 10 ml avionisert vann og 1 M HCI ble tilsatt for å gi en pH på tilnærmet 2. Blandingen ble hellet over i en skilletrakt og ekstrahert to ganger med 50 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen og vasket med 7 ml mettet natriumklorid løsning. Det organiske sjiktet ble tørket over 8,0 g vannfritt Na2S04og løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum. Restmaterialet ble løst i et minimalt volum etylacetat og renset ved kromatografi på silika (silika: 40^m "flash"-renhet, kolonnestørrelse: 24 x 3,0 cm, mobilfase: heksaner:etylacetat:eddiksyre 50:48:2). Fraksjoner som inneholdt det ønskede produktet ble slått sammen og løsemiddelet ble fjernet under vakuum. Gjenværende eddiksyre ble fjernet ved å løse restmaterialet i et minimalt volum etylacetat og felle produktet ut ved hurtig, men dråpevis tilsetning av heksan under omrøring. Heksan ble tilsatt inntil produkt ikke lenger kunne påvises i supernatanten ved TLC-analyse. Presipitatet ble vakuumtørket i 4 timer for å gi 2,2 g av produkt 10 (51 % utbytte).
<*>H NMR (CDCI3): 5 1,32 (6H, s), 1,42 (3H, d, J=7 Hz), 1,90-97 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,42-2,49 (2H, m), 2,9 (3H, s), 5,15 (1H, q, J=7 Hz). MS (M+Na<+>) ber.: 302,1, funnet: 302,0.
N<2>'-deacetyl-N<2>'-(4-metyl-4-metylditio-l-oksopentyl)maytansin (L-DM4-SMe, 4e): En løsning av maytansinol (11, 25 mg, 0,44 mmol) og N-metyl-N-(4-metyl-4-metylditio-l-oksopentyl)-L-alanin (10, 42,0 mg, 0,177 mmol) i 3 ml diklrometan ble magnetisk omrørt under argonatmosfære mens en løsning av disykloheksylkarbodiimid (DCC, 57,1 mg, 0,277 mmol) i 0,67 ml diklormetan ble tilsatt. Etter 1 minutt ble en løsning av IM ZnCI21 dietyleter (0,03 ml, 0,03 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer, hvoretter 5 ml etylacetat ble tilsatt og blandingen vakuumfiltrert gjennom grovt filterpapir. Filtratet ble vasket med 2 ml mettet natriumbikarbonatløsning, etterfulgt av 1 ml mettet natriumkloridløsning. Det organiske sjiktet ble tørket over 2 g vannfritt natriumsulfat. Løsemiddelet ble fjernet under vakuum, og restmaterialet ble renset ved silika kromatografi ved anvendelse av en blanding av diklormetan og metanol for å fjerne ikke-reagert maytansinol. Fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum for å gi en blanding av diastereomerene 4e og 4f. Restmaterialet ble løst i et minimalt volum etylacetat og renset på en 50 cm x 250 cm 10^M "Diazem" CN-kolonne ved anvendelse av en blanding av heksan, 2-propanol og etylacetat i forholdet 68:8:24 som mobilfase. Gjennomstrømningshastigheten var 118 ml/min. Under disse betingelsene ble det ønskede produkt 4e eluert med en retensjonstid på 11 minutter, mens den uønskede diastereomer 4f hadde en retensjonstid på 19 minutter. Fraksjoner som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum for å gi 12,0 mg av produkt 4e (36 % utbytte).
<*>H NMR (CDCI3): 8 0,80 (3H, s), 1,28-1,36 (13H, m), 1,42-1,46 (2H, m), 1,53-1,63 (2H ,m), 1,64 (3H, s), 1,75-1,85 (1H, m), 1,90-2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3Hz og 14 Hz), 2,31 (3H, s), 2,40-2,49 (1H, m), 2,50-2,65 (1H, m), 2,85 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J = ll Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz og 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd, J=9 Hz og 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = ll Hz og 15 Hz), 6,65 (1H, d, J = l,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=ll Hz), 6,81 (1H, d, J = l,5 Hz). Høyresolusjons-MS (M+H<+>) ber.: 826,3174, funnet: 826,3150.
N<2>'-deacetyl-N<2>'-(4-merkapto-4-metyl-l-oksopentyl)maytansin (L-DM4, 4b): Disulfidet 4e ovenfra (12 mg, 0,015 mmol) ble løst i 1,0 ml 1:1 etylacetat:metanol. En løsning av ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) i 0,50 ml 50 mM fosfatbuffer, pH 7,5 ble så tilsatt. Løsningen ble magnetisk omrørt under argonatmosfære i 3 timer, hvoretter 1 ml 200 mM fosfatbuffer, pH 6,0 ble tilsatt og blandingen ekstrahert tre ganger med 2 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen og vasket med 1 ml mettet natriumklorid løsning, og så tørket over 1 g vannfritt natriumsulfat. Løsemiddelet ble fjernet under vakuum og restmaterialet ble løst i en minimal mengde etylacetat og renset på en 50 cm x 250 cm 10^M "Diazem" CN-kolonne ved anvendelse av en blanding av heksan, 2-propanol og etylacetat i forholdet 70:8:22 som mobilfase. Gjennomstrømnings-hastigheten var 22 ml/min. Det ønskede produkt 4b ble eluert med en retensjonstid på 10 minutter. Fraksjoner som inneholdt rent 4b ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum for å tilveiebringe 11 mg 4b (97 % utbytte).
<*>H NMR (CDCI3): 8 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H, m), 1,28-1,36 (12H, m), 1,42-1,46 (2H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,75-1,85 (1H, m), 1,90-2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz og 14 Hz), 2,40-2,49 (1H, m), 2,50-2,65 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J=ll Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz og 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7Hz), 5,66 (1H, dd, J=9 Hz og 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42
(1H, dd, J = ll Hz og 15 Hz), 6,65 (1H, d, J=l,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = ll Hz), 6,81 (1H, d, J = l,5 Hz). Høyresolusjons-MS (M+Na<+>) ber.: 802,3101, funnet: 802,3116.
Eksempel 2
Syntese av maytansinoid 4a
4-Metylditiopentansyre (13): En løsning av 4-merkaptopentansyre (12, 16,6 g, 124 mmol) ble løst i 350 ml avionisert vann i en 500 ml kolbe. Løsningen ble magnetisk omrørt mens natriumkarbonat (19,7 g, 186 mmol) ble tilsatt til syren med en hastighet som ikke ville gi overdreven skumming. Kolben ble utstyrt med en 250 ml tilsetn i ngstra kt, som ble fylt med en løsning av metylmetantiolsulfonat (23,4 g, 186 mmol), løst i 220 ml glassdestillert 100 % etanol. Kolben ble avkjølt i et is/vannbad og systemet ble holdt under argonatmosfære. Metylmetantiolsulfonatløsningen ble tilsatt dråpevis til kolben så hurtig som mulig, men med en slik hastighet at det ikke førte til overdreven skumming. Kjølebadet ble fjernet og reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 2 timer. Løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum inntil tilnærmet 250 ml var igjen. Deretter ble 30 ml mettet natriumbikarbonatløsning og 50 ml avionisert vann tilsatt. Blandingen ble vasket tre ganger med 200 ml porsjoner av etylacetat i en skilletrakt. Det vandige sjiktet ble justert til tilnærmet pH 2 med 5 M HCI og ble ekstrahert to ganger med 400 ml porsjoner etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen, deretter vasket med 60 ml av en 4:1 blanding av mettet NaCI-løsning og IM HCI og tørket over 50 g vannfritt natriumsulfat, og tilslutt ble løsemiddelet fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi 10,2 g av produkt 13 (45 % utbytte). Materialet ble anvendt i neste reaksjon uten ytterligere rensing.
<*>H NMR 8 1,36 (3H, d, J=7 Hz), 1,84-1,95 (1H, m), 1,85-2,56 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,53 (2H, t, J=7 Hz), 2,85-2,95 (1H, m). MS (M+Na<+>) ber.: 203,3, funnet: 203,2.
N-Hydroksysuksinimidyl-4-metylditiopentanoat (14): 4-Metylditiopentansyre (13, 0,75 g, 4,16 mmol) ble løst i 7,0 ml metylenklorid og omrørt magnetisk mens
N-hydroksysuksinimid (0,526 g, 4,57 mmol) ble tilsatt, etterfulgt av l-[3-(dimetylamino)-propyl]-3-etylkarbodiimid-hydroklorid (0,877 g, 4,57 mmol). Blandingen ble omrørt under argonatmosfære i 2,5 timer og så hellet over i en 60 ml skilletrakt som inneholdt 20 ml etyalcetat. Den resulterende løsning ble vasket to ganger med 15 ml porsjoner av 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,0, og en gang med 5 ml mettet natriumklorid. Det organiske sjiktet ble tørket over 8 g vannfritt Na2S04og løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum for å gi 1,15 g av produkt 14 (87 % utbytte), som ble anvendt i neste reaksjon uten ytterligere rensing.
<*>H NMR 8 1,48 (3H, d, J=7), 2,06 (1H, m), 2,17 (1H, m), 2,55 (3H, s), 2,93 (2H, t, J=7), 2,98 (4H, s), 3,15 (1H, m). MS (M+Na<+>) ber.: 304,1, funnet: 304,0.
N-Metyl-N-(4-metylditio-l-oksopentyl)-L-alanin (15): N-Metyl-L-alanin (0,64 g, 6,2 mmol) ble løst i 8 ml av en 1:1 blanding av dimetoksyetan og avionisert vann i en 125 ml kolbe utstyrt med magnetisk rørepinne. Trietylamin (0,841 g, 8,3 mmol) ble tilsatt, og kolben ble omrørt kraftig mens en løsning av 14 (1,0 g, 3,6 mmol) i 8 ml av den samme løsemiddelblandingen ble tilsatt dråpevis over tilnærmet 5 minutter. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen oppkonsentrert til tilnærmet 3 ml ved evaporering ved rotering under vakuum, hvoretter 15 ml avionisert vann og 1 M HCI ble tilsatt til en pH på tilnærmet 2. Blandingen ble hellet over i en 60 ml skilletrakt og ekstrahert to ganger med 15 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen, vasket med 3 ml mettet natriumkloridløsning og tørket over 8,0 g vannfritt Na2S04, hvoretter løsemiddelet ble fjernet ved evaporering ved rotering under vakuum. Restmaterialet ble løst i et minimalt volum etylacetat og renset ved silika kromatografi (silika: 40 "flash"-renhet, kolonne-dimensjoner 24 x 3,0 cm, mobilfase heksaner:etylacetat:eddiksyre 50:48:2). Fraksjonene som inneholdt det ønskede produkt 15 ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum. Rester av eddiksyre ble fjernet ved å løse restmaterialet i et minimalt volum etyalcetat og presipitere produktet ved hurtig, men dråpevis tilsetning av heksan under omrøring. Heksan ble tilsatt inntil produktet ikke lenger kunne påvises i supernatanten ved TLC-analyse. Det utfelte materialet ble vakuumtørket for å tilveiebringe 0,60 g av produkt 15 (62 % utbytte).
<*>H NMR 8 1,35 (3H, d, J=7), 1,41 (3H, d, =7), 1,94-2,03 (2H, m), 2,43 (3H, s), 2,50-2,55 (2H, m), 2,83-2,93 (1H, m), 2,98 (3H, s), 5,14 (1H, q, J=7). MS (M+Na<+>) ber.: 288,1, funnet: 288,1.
N<2->deacetyl-N<2->(4-metylditio-l-oksopentyl)maytansin (L-DM3-SMe, 4c): En løsning av maytansinol (25 mg, 0,44 mmol) og 15 (42,0, 0,177 mmol) i 3 ml diklormetan ble magnetisk omrørt under argonatmosfære mens en løsning av disykloheksylkarbodiimid (DCC, 57,1 mg, 0,277 mmol) i 0,67 ml diklormetan ble tilsatt. Etter 1 minutt ble en løsning av IM ZnCI2i dietyleter (0,03 ml, 0,03 mmol) tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer, hvoretter 5 ml etylacetat ble tilsatt og blandingen vakuumfiltrert gjennom grovt filterpapir. Filtratet ble vasket med 2 ml mettet natrium bi karbonat løsning, etterfulgt av 1 ml mettet natriumklorid løsning. Det organiske sjiktet ble tørket over 2 g vannfritt natriumsulfat, hvoretter løsemiddelet ble fjernet under vakuum. Restmaterialet ble renset ved silikakromatografi ved anvendelse av en blanding av diklormetan og metanol for fjerning av ikke-reagert maytansinol. Fraksjonene som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum for å gi en blanding av diastereomerene 4c og 4d. Restmaterialet ble løst i et minimalt volum etylacetat og renset på en 50 cm x 250 cm 10^M "Diazem" CN-kolonne ved anvendelse av en 68:8:24 blanding av heksan, 2-propanol og etylacetat som mobilfase. Gjennomstrømningshastigheten var 118 ml/min. Det ønskede produkt 4c ble eluert med en retensjonstid på 11 minutter, mens den uønskede diastereomer 4d hadde en retensjonstid på 19 minutter. Fraksjonene som inneholdt det ønskede produkt ble slått sammen og løsemiddel ble fjernet under vakuum for å gi 12,0 mg av produkt 4c (36 % utbytte).
<*>H NMR (CDCI3): 8 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H, m), 1,28-1,36 (9H, m), 1,42-1,46 (1H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80-1,89 (1H, m), 1,90-2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz og 14 Hz), 2,32 (3H, s), 2,33-2,42 (1H, m), 2,49-2,62 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J = ll Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz og 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd, J=9 Hz og 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = ll Hz og 15 Hz), 6,65 (1H, d, J = l,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=ll Hz), 6,81 (1H, d, J=l,5 Hz). MS (M+Na<+>) ber.: 834,3, funnet: 834,3.
N<2>'-Deacetyl-N<2>'-(4-merkapto-l-oksopentyl)maytansin (L-DM3, 4a): L-DM3-SMe (4 c, 12 mg, 0,015 mmol) ble løst i 1,0 ml av en 1:1 blanding av etylacetat og metanol. En løsning av ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) i 0,50 ml 50 mM fosfatbuffer, pH 7,5 ble så tilsatt. Reaksjonsblandingen ble magnetisk omrørt under argonatmosfære i 3 timer, hvoretter 1 ml 200 mM fosfatbuffer, pH 6,0 ble tilsatt og blandingen ekstrahert tre ganger med 2 ml porsjoner av etylacetat. De organiske sjiktene ble slått sammen og vasket med 1 ml mettet natriumklorid løsning, og så tørket over 1 g vannfritt natriumsulfat. Løsemiddelet ble fjernet under vakuum, og restmaterialet ble løst i et minimalt volum etylacetat og renset på en 50 cm x 250 cm, 10^M "Diazem" CN-kolonne ved anvendelse av en 70:8:22 blanding av heksan, 2-propanol og etylacetat som mobilfase. Gjennom-strømningshastigheten var 22 ml/min. Det ønskede produkt ble eluert med en retensjons-tid på 10 minutter. Fraksjonene som inneholdt rent produkt ble slått sammen, og løsemiddelet ble fjernet under vakuum for å gi 11 mg av produkt 4a (97 % utbytte).
<*>H NMR (CDCI3): 8 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H, m), 1,28-1,36 (9H, m), 1,42-1,46 (1H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80-1,89 (1H, m), 1,90-2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz og 14 Hz), 2,33-2,42 (1H, m), 2,49-2,62 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J=ll Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz og 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7Hz), 5,66 (1H, dd, J=9 Hz og 14 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = ll Hz og 15 Hz), 6,65 (1H, d, J = l,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = ll Hz), 6,81 (1H, d, J = l,5 Hz). MS (M+Na<+>) ber.: 788,3, fuunet: 788,3.
Eksempel 3
Syntese av maytansinoid 4g,h (Fig. 3c)
R-l,3-Di-0-p-toluensulfonylbutan (17): En løsning av R(-)-l,3-butandiol (16, 2,00 g, 22,22 mmol) i en blanding av tørr pyridin (40 ml) og tørr toluen (60 ml), ble behandlet med p-toluensulfonylklorid (12,70 g, 66,84 mmol) under argon ved 0 °C. Etter omrøring ved 0 °C i 5 minutter, etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 2 timer, ble blandingen evaporert under vakuum, løst i etylacetat og vasket med 0,1 M vandig NaHC03, etterfulgt av mettet NaCI. Det organiske sjiktet ble tørket over MgS04og filtrert, og løsemiddelet ble avdampet. Rensing med kromatografi på silika gel og eluering med 1:2 (vol/vol) etylacetat/heksan ga 6,51 g (74 %) av tittelproduktet 17. Rf = 0,40 (1:1 EtOAc/heksan).<*>H NMR (CDCI3) 7,76 (dd, 4H, J = 1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J=0,4, 8,0 + 9,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J=6,3Hz);<13>C NMR 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06; MS: 420,99 (M+Na)<+>, 421,93 (M+1+Na)<+>.
S-4-O-Etylxantinpentannitril (18): En løsning av R-l,3-di-0-p-toluensulfonyl-butan (17, 4,80 g, 12,06 mmol) i tørr DMSO (50 ml) ble behandlet med NaCN (0,65). Etter omrøring ved romtemperatur under argon i 18 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med etylacetat, vasket med kald 1,0 M NaH2P04, pH 7,5, så med vann og deretter med 1,0 M NaH2P04, pH 4,0. Det organiske sjiktet ble separert og tørket over MgS04, filtrert og inndampet for å gi 2,63 g av urent R-3-O-p-toluensulfonylpentannitril. MS 275,80 (M+Na)<+>, 276,75 (M+1+Na)<+>. Produktet ble anvendt direkte uten ytterligere rensing.
En løsning av urent R-3-O-p-toluensulfonylpentannitril (2,63 g) i etanol (15 ml) ble tilsatt kalium-O-etylxantat (4,55 g) i etanol (50 ml). Etter omrøring over natten under argon ble blandingen oppkonsentrert, fortynnet med etylacetat og filtrert gjennom en kort silika kolonne. Eluatet ble oppkonsentrert og renset ved kromatografi på silika gel ved eluering med 1:4 (vol/vol) EtOAc/heksan for å gi 1,54 g (63 %, 2 trinn) av tittelproduktet 18. Rf = 0,40 (1:4 EtOAc/heksan).^ NMR (CDCI3) 4,67 (dd, 2H, J = 7,1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J=7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H, J=7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H);
<13>C NMR 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M+Na)<+>, 242,51 (M+K)<+>.
S-(+)-4-Metylditiopentansyre (19): Til en løsning av S-4-O-etylxantinsyre-pentannitril (18, 1,95 g, (9,61 mmol) i en blanding av etanol (10 ml) og vann (150 ml) ble det tilsatt 5,0 g NaOH. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet med tilbakeløp over
natten under argon. Blandingen ble avkjølt til romtemperatur, fortynnet med vann (150 ml) og ekstrahert med 1:1 EtOAc/heksan (2 x 100 ml). Det vandige sjiktet ble surgjort med H3P04til pH 2,5 - 3,0 og ekstrahert med EtOAc (6 x 75 ml). De organiske sjiktene ble slått sammen, tørket over MgS04, filtrert og inndampet til tørrhet for å gi uren S-4-merkapto-pentansyre. Det urene produkt ble anvendt direkte i neste trinn uten ytterligere rensing.
Til en løsning av uren S-4-merkaptopentansyre (1,2 g) i en blanding av etanol (50 ml) og 0,5M NaH2P03, pH 7,0 (75 ml) ble det tilsatt dråpevis metylmetantiolsulfonat (1,47 g, 11,65 mmol) i vannfri THF (5 ml) over 45 minutter ved 0 °C. Etter omrøring under argon ved 0 °C i 30 minutter, etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 2 timer, ble blandingen oppkonsentrert og ekstrahert med diklormetan (2 x 50 ml). Det vandige sjiktet ble surgjort med H3P04til pH 2,5-3,0 og ekstrahert med EtOAc (4 x 100 ml). De organiske sjiktene ble slått sammen, tørket over MgS04, filtrert og inndampet. Restmaterialet ble renset ved kromatografi på silika gel og eluering med (1:100:400 HOAc/EtoAc/heksan) for å gi 1,43 g (83 %) av tittelproduktet 19. Rf = 0,32 (1:100:400 HOAc/EtOAc/heksan);<*>H NMR (CDCI3) 2,91 (ddd, 1H, J = 6,8, 13,7, 20,5 Hz), 2,53 (t, 2H, J=7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,94 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J=6,8 Hz);<13>C NMR 179,18, 45,35, 31,58, 30,73, 24,70, 21,05; MS: 202,92 (M+Na)<+>, 203,91 (M+1+Na)<+>; [a] = 41,35 (c = 2, CH3OH).
N-metyl-N-[4-(S)-metylditio-l-oksopentyl[-S-alanin (15a): S-(+)-4-(metylditio)-pentansyre (19) ble omdannet til N-hydroksysuksinimidylesteren 20 ved frem-gangsmåten som er beskrevet ovenfor for forbindelse 14. Reaksjon med N-metyl-L-alanin med fremgangsmåten beskrevet ovenfor for forbindelse 15 ga 15a (62 % utbytte).<*>H NMR 5 1,36 (3H, d, J=7), 1,42 (3H, d, J=7), 1,93-1,98 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,50-2,53 (2H, m), 2,90-2,95 (1H, m), 2,99 (3H, s), 5,14 (1H, q, J=7), MS: (M+Na) ber.: 288,1, funnet: 288,1.
N<2->deacetyl-N<2->(4-(S)-metylditio-l-oksopenyl)maytansin (DM3-SMe, 49,11): Maytansinol (11) ble bundet til 15a ved anvendelse av DCC og sinkklorid i diklormetan som beskrevet ovenfor for syntesen av 4c. En blanding av 2 diastereomerer som bar N-metyl-S-alanylgruppen (4g, S,S) og N-metyl-R-alanylgruppen (4h, R,S) ble oppnådd. Diastereomerene ble separert ved HPLC på en Kromasil cyanokolonne (4,6 mm x 250 mm) ved anvendelse av isokratisk eluering med en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/min med heksan:etylacetat:2-propanol (68:24:8, vol/vol/vol). Under disse betingelsene ble isomeren 4g (S,S) eluert etter 24,5 minutter. Massespektrum: m/z 834,2 (M+Na)<+>. Toppen for den andre isomer 4h (R,S), var godt separert og ble eluert etter 34,6 minutter. MS: m/z 834,2 (M+Na)<+>.
Eksempel 4
Syntese av maytansinoid 4k,l (Fig. 3d)
S-l,3-Di-0-p-toluensulfonylbutan 22: En løsning av S-(-)-l,3-butandiol (21, 2,00 g, 22,22 mmol) i en blanding av vannfri pyridin (40 ml) og vannfri toluen (60 ml) ble behandlet med p-toluensulfonylklorid (12,70 g, 66,84 mmol) under argon ved 0 °C. Etter omrøring ved 0 °C i 5 minutter, etterfulgt av omrøring ved romtemperatur i 2 timer ble blandingen inndampet under vakuum. Restmaterialet ble løst i etylacetat og vasket med 0,1 M vandig NaHC03og mettet NaCI. Det organiske sjiktet ble separert, tørket over MgS04, filtrert og inndampet. Restmaterialet ble renset ved kromatografi på silika gel og eluering med 1:2 etylacetat/heksan for å gi 6,25 g (71 %) av det ønskede produkt 22. Rf = 0,40 (1:1 EtOAc/heksan);<*>H NMR (CDCI3) 7,76 (dd, 4H, J=1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J=0,4, 8,0 + 8,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J=6,3 Hz);<13>C NMR 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06; M: 420,99 (M+Na)<+>.
R-4-O-Etylxantinsyrepentannitril (23): En løsning av S-l,3-di-0-p-toluen-sulfonylbutan (22, 6,25 g, 15,70 mmol) i vannfri DMSO (50 ml) ble behandlet med NaCN (0,85 g). Reaksjonsblandingen ble omrørt under argon i 18 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble så fortynnet med etylacetat og vasket, først med kald 1,0 M NaH2P04, pH 7,5 så med vann og til slutt med 1,0 M NaH2P04, pH 4,0. Det organiske sjiktet ble tørket over MgS04, filtrert og inndampet for å gi 3,62 g urent S-3-O-p-toluensulfonyl-pentannitril. Produktet ble anvendt direkte uten ytterligere rensing.
En løsning av urent S-3-O-p-toluensulfonylpentannitril (3,62 g) i etanol (50 ml) ble tilsatt kalium-O-etylxantat (5,72 g) i etanol (100 ml). Etter omrøring under argon over natten ble blandingen oppkonsentrert, fortynnet med etylacetat og filtrert gjennom en kort kolonne av silika gel. Eluatet ble oppkonsentrert og restmaterialet renset ved kromatografi på silika gel ved eluering med 1:4 EtOAc/heksan for å tilveiebringe 2,0 g (62 %, 2 trinn) av tittelproduktet 23. Rf = 0,40 (1:4 EtAc/heksan).<*>H NMR (CDCI3) 4,67 (dd, 2H, 3=7, 1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J=7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H, J=7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H);<13>C NMR 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M+Na)<+>, 242,51 (M+K)<+>.
R-(-)-4-Metylditiopentansyre (24): En løsning av R-4-0-etylxantinsyrepantan-nitril (23, 2,0 g, 9,85 mmol) i en blanding av etanol (10 ml) og 200 ml vann ble behandlet med NaOH (6,0 g). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet med tilbakeløp over natten under argon. Blandingen ble fortynnet med vann (150 ml) og ekstrahert med 1:1 EtOAc/heksan (2 x 100 ml). Det vandige sjiktet ble surgjort med H3P04til pH 2,5-3,0 og ekstrahert med EtAc (6 x 75 ml). De organiske sjiktene ble slått sammen, tørket over MgS04, filtrert og inndampet til tørrhet for å gi uren R-4-merkaptopentansyre. Råproduktet ble anvendt direkte i neste trinn uten ytterligere rensing.
Til en løsning av 1,60 g av den urene R-4-merkaptopentansyren i en blanding av etanol (50 ml) og 0,5 M NaH2P04, pH 7,0 (75 ml) ble det tilsatt dråpevis metylmetantiol-sulfonat (1,96 g, 15,53 mmol) i vannfri THF (7 ml) over 45 minutter ved 0 °C. Reaksjons-blandingen ble omrørt under argon ved 0 °C i 30 minutter og så ved romtemperatur i 2 timer. Blandingen ble oppkonsentrert og ekstrahert med diklormetan (2 x 50 ml). Det vandige sjiktet ble surgjort med H3P04til pH 2,5-3,0 og ekstrahert med EtOAc (4 x 100 ml). De organiske sjiktene ble slått sammen, tørket over MgS04, filtrert og inndampet. Rest-mate ri a I et ble renset ved kromatografi på silika gel og eluering med 1:100:400 HOAc/EtOAc/heksan for å tilveiebringe 1,65 g (93 %) av det ønskede produkt 24. Rf = 0,32 (1:100:400 HOAc/EtOAc/heksan);<*>H NMR (CDCI3) 2,91 (ddd, 1H, J=6,8, 13,7, 20,4 Hz), 2,53 (t, 2H, J=7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,96 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J=6,8Hz);<13>C NMR 179,46, 45,67, 31,91, 31,07, 25,02, 21,36; MS: 202,9 (M+Na)<+>, 203,9 (M+1+Na)<+>; [a] = -39,16 (c = 2, CH3OH).
N-metyl-N-[4-(R)-metylditio-l-oksopentyl]-S-alanin (15b): R-(+)-4-metyl-ditiopentansyre (24) ble omdannet til N-hydroksysuksinimidylesteren 25 ved fremgangs-måten som er beskrevet ovenfor for forbindelse 14. Omsetning med N-metyl-L-alanin ved fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor for forbindelse 15 ga 15b. MS: m/z (M+Na): ber.: 288,1, funnet: 288,1.
N<2->deacetyl-N<2->(4-(R)-metylditio-l-oksopentyl)maytansin (DM3-SMe, 4k,l): Maytansinol (11) ble bundet til 15b ved anvendelse av DCC og sinkklorid i diklormetan som beskrevet ovenfor for syntesen av 4c. En blanding av 2 distereomerer som bar N-metyl-S-alanylgruppen (4k, S,R) og N-metyl-R-alanylgruppen (4I,R,R) ble oppnådd. Diastereomerene ble separert ved HPLC på en Kromasil cyanokolonne (4,6 mm x 250 mm) ved anvendelse av isokratisk eluering med en gjennomstrømningshastighet på 1 ml/min med heksan:etylacetat:2-propanol (68:24:8, vol/vol/vol). Under disse betingelsene ble isomeren 4k (S,R) eluert etter 23,9 minutter. Massespektrum: m/z 834,2 (M+Na)<+>. Toppen for den andre isomer, 41 (R,R), var godt separert og ble eluert etter 33,7 minutter. MS: m/z 834,2 (M+Na)<+>.
Eksempel 5a
In v/tro-cytotoksisitet av maytansinoider og antistoff-maytantansinoidkonjugater
Cellelinjen KB (ATCC CCI-17) er av humant epitelialt opprinnelse. Cellelinjen SK-BR-3 (ATCC HTB-30) ble etablert fra et humant brystadenokarsinom. De humane kolontumorcellelinjene COLO 205 (ATCC CCL-222) og HT-29 (ATCC HTB 38), den humane melanomcellelinjen A-375 (ATCC CRL 1619), den humane Burkitts lymfomcellelinjen Ramos (ATCC CRL-1596) og den humane myeloide leukemicellelinjen HL-60 (ATCC CCL-240) ble alle anskaffet fra ATCC, Maryland. Cellellinjene ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagles medium (DMEM, Biowhittaker, Walkersville, MD) tilsatt L-glutamin og 10 % føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah) og 50 \ ig/ m\ gentamycinsulfat (Life Technologies, Rockville, MD). Cellene ble dyrket ved 36-37,5 °C i en fuktig atmosfære som inneholdt 6 % C02.
Cytotoksisitetsstudien som ble utført anvendte klonogen analyse. Test-cellelinjene ble sådd ut i 6-brønners dyrkningsskåler med et konstant antall på 1000 celler per brønn. Cellene ble inkubert med varierende konsentrasjoner (0 til 3 nM) av de forskjellige maytansinoidene (frie eller konjugert til antistoffer) i 72 timer. Mediet ble så sugd av og erstattet med friskt medium. Kulturene fikk vokse og danne kolonier i totalt 7-10 dager etter utsåing. Kulturene ble så fiksert og farget med 0,2 % krystallfiolett i 10 % formalin/PBS, og koloniene ble talt. Utsåingseffektiviteten for ikke-behandlede celler (medium alene) ble bestemt ved å dividere antallet av talte kolonier på antall celler sådd ut. Den overlevende fraksjonen av celler eksponert for legemidlene ble bestemt ved å dividere antallet av kolonier i brønner som var eksponert for legemiddel med antallet av kolonier i kontrollbrønnene.
Resultatene fra in wfro-cytotoksisitetsmålingene av de nye maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i Figur 4. De nye maytansinoidene 4c,e, som bærer hindrede disulfidbindinger, er svært cytotoksiske mot begge de analyserte cellelinjene, SK-BR-3 og A-375, med IC50-verdier i området fra 7 x 10<12>M til 2,5 x 10<11>M. Således har innføring av alkylsubstituenter på karbonatomet som bærer disulfidgruppen bevart den høye cytotoksiske styrken. Det sterisk hindret tiolholdige maytansinoid 4a ifølge foreliggende oppfinnelse er 30 til 50-fold mer potent enn det tidligere beskrevne, tilsvarende, uhindrede maytansinoid 1. Således har innføring av alkylsubstituenter på karbonatomet som bærer tiolgruppen ført til svært mye høyere aktivitet.
Resultatene fra in wtro-analyse av antistoff konjugater av maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse er vist i figurene 4c og 4d. Kobling av de to nye maytansinoidene 4a og 4b til huC242 antistoff, som er rettet mot humane kolontumorer, førte til antigenspesifikk dreping av målcellene. Konjugatene er således svært aktive mot antigenpositive COLO 205-celler, med IC50-verdier i området fra 1,1 til 1,3 x 10"<11>M. Konjugatene er derimot 100 til 200-ganger mindre cytotoksiske mot antigennegative A-375-celler, noe som viser at de nye maytansinoidene ifølge foreliggende oppfinnelse danner konjugater som besitter sterisk hindrede disulfidbindinger og som viser høy målspesifikk cytotoksisitet.
Eksempel 5b
Fremstilling av cytotoksiske konjugater med huC242 antistoff ved anvendelse av maytansinoid 4a eller 4b (Fremgangsmåte A, Fig. 5 a,b)
En løsning av huC242 antistoff (8 mg/ml) i vandig buffer (50 mM kaliumfosfat, 50 mM natriumklorid, 2 mM etylandiaminotetraeddiksyre-dinatriumsalt), pH 6,5 ble inkubert i 2 timer med et 7-10 gangers molart overskudd av SPDP (suksinimidyl-3-(2-pypridylditio)-propionat, 3a) eller med N-suksinimidyl-4-(2-pyridylditio)butanoat (SPDB, 3b). Reaksjons-blandingen ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne. Antistoffkonsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av antistoffets kjente ekstinksjonskoeffisienter, e28onm= 217,560 M^cm"<1.>
Det modifiserte antistoffet ble fortynnet til 2,5 mg/ml med vandig buffer (50 mM kaliumfosfat, 50 mM natriumklorid, 2 mM etylendiaminotetraeddiksyre-dinatriumsalt), pH 6,5, og så behandlet med et 1,5 til 2,5 ganger molart overskudd av enten DM3 eller DM4 i dimetylacetamid (sluttkonsentrasjonen av DMA var 3 % vol/vol). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 18 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne. Konsentrasjonen av konjugatet ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av de kjente ekstinksjonskoeffisientene (for antistoffet e28onm= 217,560 M^cm"<1>og e252nm=
80,062 M^cm"<1>for DM3 eller DM4, e28onm = 5,700 M^cm"<1>og e252nM<=>26,790 M^cm"1). Det resulterende konjugatet var monomert og inneholdt gjennomsnittlig 3,2-3,5 DM3-eller DM4-molekyler bundet per antistoffmolekyl.
Eksempel 5c
Fremstilling av cytotoksiske konjugater av huC242 antistoff ved anvendelse av maytansinoid 4a eller 4b (Fremgangsmåte B, Fig. 5c)
En løsning av huC242 antistoff (8 mg/ml) i vandig buffer (50 mM kaliumfosfat, 50 mM natriumklorid, 2 mM etylendiaminotetraeddiksyre-dinatriumsalt), pH 6,5 ble inkubert i 2 timer med et 7 til 10 gangers molart overskudd av SMCC [suksinimidyl-4-(N-maleimido-metyl)-sykloheksan-l-karboksylat, 26]. Reaksjonsblandingen ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne. Antistoffkonsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av antistoffets kjente ekstinksjonskoeffisienter, e28onm= 217,560 M^cm"<1>.
Det modifisete antistoffet ble fortynnet til 2,5 mg/ml i vandig buffer (50 mM kaliumfosfat, 50 mM natriumklorid, 2 mM etylandiaminotetraeddiksyre-dinatriumsalt), pH 6,5, og så behandlet med et 1,5 til 2,5 ganger molart overskudd av enten DM3 eller DM4 i dimetylacetamid (sluttkonsentrasjonen av DMA var 3 % vol/vol). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 18 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne. Konsentrasjonen av konjugatet ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av de kjente ekstinksjonskoeffisientene (for antistoffet: s280nm= 217,560 M ^cm 1 og s252nm<=>
80,062 M^cm"<1>for DM3 eller DM4, s280nm= 5,700 M^cm"<1>og e252nM= 26,790 M^cm"<1>). Det resulterende konjugat var monomert og inneholdt gjennomsnittlig 3,2-3,5 DM3-eller DM4-molekyler tilkoblet per antistoffmolekyl.
Eksempel 5d
Fremstilling av cytotoksiske konjugater av huC242 antistoff ved anvendelse av maytansinoid 4a eller 4b (Fremgangsmåte C, Fig. 5d)
En løsning av huC242 antistoff (8 mg/ml) i vandig buffer (50 mM kaliumfosfat, 50 mM natriumklorid, 2 mM etylendiaminotetraeddiksyre-dinatriumsalt), pH 6,5 ble inkubert i 2 timer ved et 7 til 10 gangers molart overskudd av SIAB [N-suksinimidyl-(4-jodacetyl)-aminobenzoat, 27]. Reaksjonsblandingen ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne. Antistoffkonsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av de kjente ekstinksjonskoeffisientene for antistoffet: e28onm<=>217,560 M^cm"<1>.
Eksempel 6
In wVo-virkning av huC242-maytansinoidkonjugater mot HT-29-xenotransplantater
Fem uker gamle SCID-hunnmus (20 dyr) ble inokulert subkutant i høyre flanke med humant kolonkarsinomcellene HT-29 (1,5 x IO6 celler/mus) i 0,1 ml serumfritt medium. Tumorene ble dyrket i 11 dager til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. Dyrene ble så tilfeldig oppdelt i 4 grupper (5 dyr per gruppe). Den første gruppen ble tilført huC242-DMl-konjugat (DMl-dose på 75^g/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den andre gruppen ble tilført huC242-DM3-konjugat (DM3-dose på 75^ig/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den tredje gruppen ble tilført huC242-DM4-konjugat (DM4-dose på 75^ig/kg, qd x 5), mens en fjerde gruppe av dyr fungerte som kontroller og fikk PBS ifølge det samme behandlings-skjemaet som for gruppene 1-3.
Størrelsen av tumoren ble målt to ganger ukentlig, og tumorvolumene ble beregnet ut fra formelen: tumorvolum =<1>/2(lengde x bredde x høyde). Dyrenes vekt ble også målt to ganger ukentlig. Resultatene er vist i Figur 7. Tumorene i kontrollgruppen av mus vokste til en størrelse på nesten 1000 mm<3>på 35 dager. Behandling med huC242-DMl førte til en forsinkelse av tumorveksten på 18 dager, mens konjugater fremstilt med maytansinoidene 4a og 4b ifølge foreliggende oppfinnelse var signifikant mer virksomme og forlenget forsinkelsen av tumorveksten til henholdsvis 28 dager og 36 dager.
Eksempel 7
In wVo-virkning av huC242-maytansinoidkonjugater på COLO 205 xenotransplantater
Fem uker gamle SCID-hunnmus (20 dyr) ble inokulert subkutant i høyre flanke med humane kolonkarsinomcellene COLO 205 (1,5 x 106 celler/mus) i 0,1 ml serumfritt medium. Tumorene ble dyrket i 11 dager til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. Dyrene ble så tilfeldig fordelt på 4 grupper (5 dyr per gruppe). Den første gruppen ble tilført huC242-DMl-konjugat (DMl-dose på 75^ig/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den andre gruppen fikk huC242-DM3-konjgat (DM3-dose på 75^ig/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den tredje gruppen ble tilført huC242-DM4-konjugat (DM4-dose på 75^ig/kg, qd x 5), mens en fjerde gruppe av dyr fungerte som kontroller og fikk PBS ved anvendelse av det samme behandlingsskjemaet som for gruppene 1-3.
Tumorstørrelsen ble målt to ganger ukentlig, og tumorvolumer ble beregnet ut fra formelen: tumorvolum =<1>/2(lengde x bredde x høyde). Dyrenes vekt ble også målt to ganger ukentlig. Resultatene er vist i Figur 8. Tumorene i kontrollgruppen av mus vokste til en størrelse på nesten 900 mm<3>på 24 dager. Behandling med huC242-DMl førte til en forsinkelse i tumorveksten på 20 dager, mens konjugatet fremstilt med maytansinoid 4a ifølge foreliggende oppfinnelse var betraktelig mer virksomt og ga fullstendige tumor-regresjoner som varte i 45 dager. Behandling med konjugatet fremstilt med maytansinoid 4b ifølge foreliggende oppfinnelse var enda mer virksomt og førte til kurering av alle de behandlede dyr.
Eksempel 8
In wVo-virkning av MY9-6-maytansinoidkonjugater på HL-60-xenotransplantater
Fem uker gamle SCID-hunnmus (20 dyr) ble inokulert subkutant i høyre flanke med humane myeloide leukemicellene HL-60 (1,5 x IO<6>celler/mus) i 0,1 ml serumfritt medium. Tumorene ble dyrket i 12 dager til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. Dyrene ble så tilfeldig fordelt på 4 grupper (5 dyr per gruppe). Den første gruppen ble tilført MY9-6-DMl-konjugat (DMl-dose på 200^g/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den andre gruppen ble tilført MY9-6-DM3-konjugat (DM3-dose på 200^ig/kg, qd x 5) administrert intravenøst. Den tredje gruppen fikk MY9-6-DM4-konjugat (DM4-dose på 200^ig/kg, qd x 5) administrert intravenøst, mens en fjerde gruppe av dyr fungerte som kontroller og fikk PBS ved anvendelse av det samme behandlingsskjemaet som for gruppene 1-3.
Tumorstørrelsen ble målt to ganger ukentlig, og tumorvolumer ble beregnet med formelen: tumorvolum =<1>/2(lengde x bredde x høyde). Dyrenes vekt ble også målt to ganger ukentlig. Resultatene er vist i Figur 9. Tumorene i kontrollgruppen av mus vokste hurtig til en størrelse på nesten 1600 mm<3>på 21 dager. Behandling med MY9-6-DM1 førte til en forsinkelse av tumorveksten på tilnærmet 5 dager, mens konjugater fremstilt med maytansinoidene 4a og 4b ifølge foreliggende oppfinnelse var signifikant mer virksomme og forlenget forsinkelsen av tumorveksten til mer enn 20 dager.
Eksempel 9
Fremstilling av et cytotoksisk konjugat av huMY9-6 antistoff ved anvendelse av maytansinoid DM4 (4b)
En løsning av huMY9-6 antistoff i en konsentrasjon på 8 mg/ml ble inkubert i 2 timer med et 6,5 gangers molart overskudd av SSNPB [sulfosuksinimidyl-4-(5'-nitro-2'-pyridylditio)butyrat] i 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,5, tilsatt 2 mM etylendiaminotetra-eddiksyre (buffer A) med 5 % etanol. Det modifiserte antistoffet ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne ekvilibrert med buffer A, og konsentrasjonen av det rensede antistoffet ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av antistoffets ekstinksjonskoeffisient ved 280 nm. Det modifiserte antistoffet ble fortynnet til 4,9 mg/ml med buffer A og inkubert i 18 timer ved romtemperatur med et 1,7-gangers molart overskudd av DM4, som ble tilsatt til reaksjonsblandingen som en stamløsning i dimetylacetamid (sluttkonsentrasjonen av dimetylacetamid var 3 % v/v). Antistoff-legemiddelkonjugatet ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25-kolonne ekvilibrert med PBS, pH 6,5. Konsentrasjonen av konjugat ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av de kjente ekstinksjonskoeffisientene for antistoff og DM4 (for antistoffet, s28onm= 206,460 M_<1>cm"
\ £252nm = 72,261 M^cm1; for DM4, s28onm<=>5,700 M^cm"<1>, s252nM= 26,790 M^cm"1). Det resulterende antistoff-legemiddelkonjugatet inneholdt gjennomsnittlig 3,6 DM4-molekyler per antistoffmolekyl. Biokjemisk analyse viste at antistoffet forble mer enn 94 % monomert etter konjugeringen og hadde den bindingsaffinitet som tilsvarte den til det umodifiserte antistoff, bestemt ved "flow"-cytometri. Mengden av legemiddel forbundet med antistoffet som ikke var kovalent bundet (fritt legemiddel) ble bestemt ved HPLC-analyse og funnet å være mindre enn 1 % av den totale mengde bundet legemiddel.
Eksempel 10
In v/tro-selektivitet og -virkning av huMY9-6-DM4-konjugat
Cytotoksisiteten av huMy9-6-DM4 mot CD33-uttrykkende celler (HL-60) og CD33-negative Namalwa-celler ble analysert ved anvendelse av en klonogen analyse, hvor celledrepingsaktiviteten bestemmes ved å kvantifisere antallet kolonier som kan vokse etter behandlingen. huMY9-6-DM4 viser en kraftig celledrepende aktivitet mot de CD33-positive, humane tumorcellene HL-60 in vitro (Figur 10). Ingen signifikant toksisitet mot CD33-negative humane Namalwa-celler ble observert, noe som indikerer at den CD33-avhengige cytotoksisitet skyldtes spesifikk målstyring av konjugatet via anti-CD33-antistoffet, huMy9-6.
Eksempel 11
In wVo-virkning av huMy9-6-DM4-konjugater mot xenotransplantater av de humane tumorcellene HL60 i SCID-mus
Virkningen av huMy9-6-DM4 in vivo ble bestemt i SCID-mus som bar humane HL-60-tumor xenotransplantater. HL-60-celler ble injisert subkutant, og tumorene fikk vokse til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. HuMy9-6-DM4-konjugat ble tilført i.v. en gang daglig i 5 dager i dosen som er angitt i Figur 11. Dosen er uttrykt som^g DM4 i konjugatet, noe som tilsvarer en antistoffdose på tilnærmet 67^g antistoff per^g DM4. Tumorvolumet ble målt som en indikasjon på behandlingens virkning, og musens kroppsvekt ble fulgt som et mål på toksisitet grunnet behandlingen. huMy9-6-DM4 induserer en langvarig forsinkelse av tumorveksten i humane HL-60-celle xenotransplantater i doser som gir lite toksisitet (Figur 11). Virkningen av huMy9-6-DM4 ble også sammenlignet med virkningen av huMy9-6-DMl. Overraskende nok ble det funnet at huMy9-6-DM4 var mer effektiv enn huMy9-6-DMl. huMy9-6-DM4 opprettholdt dyrene i fullstendig remisjon (CR) i nesten 60 dager, mens dyr behandlet med huMy9-6-DMl fikk et tilbakefall etter rundt 20 dager i CR.
Eksempel 12
Fremstilling av et cytotoksisk konjugat av huB4 antistoff ved anvendelse av maytansinoid DM4 (4b)
En løsning av huB4 antistoff i en konsentrasjon på 20 mg/ml ble inkubert i 1,5 timer med et 8-gangers molart overskudd av SSNPB [sulfosuksinimidyl-4-(5'-nitro-2'-pyridylditio)butyrat] i 50 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,5 tilsatt 2 mM etylendiamintetra-eddiksyre (buffer A) og 5 % dimetylacetamid. Det modifiserte antistoffet ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25 gelfiltreringskolonne ekvilibrert med buffer A, og konsentrasjonen av det rensede antistoffet ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av antistoffets ekstinksjonskoeffisient ved 280 nm (199,569 M^cm"<1>). Det modifiserte antistoffet ble fortynnet til 8 mg/ml med buffer A og inkubert i 3 timer ved romtemperatur ved et 1,7 gangers molart overskudd av DM4, som ble tilsatt til reaksjonsblandingen som en stamløsning i dimetylacetamid (sluttkonsentrasjonen av dimetylacetamid var 3 % v/v). Antistoff-legemiddelkonjugatet ble renset ved passasje gjennom en Sephadex G25-kolonne og en Sephadex S300-kolonne, begge ekvilibrert med PBS-buffer, pH 6,5. Konsentrasjonen av konjugat ble bestemt spektrofotometrisk ved anvendelse av de kjente ekstinksjons-koeffisientene for antistoff (e28onm= 199,560
M^cm"<1>, 8252nM = 67,850 M^cm"<1>) og DM4 (e280nm<=>5,700 M^cm"<1>, e252nM= 26,790 M"
^m"<1>). Det resulterende antistoff-legemiddel-konjugatet inneholdt gjennomsnittlig 4,0 DM4-molekyler per antistoffmolekyl. Biokjemisk analyse viste at antistoffet fortsatt var mer enn 98 % monomert etter konjugering og hadde en bindingsaffinitet som tilsvarte den til det ikke-modifiserte antistoff, bestemt ved "flow"-cytometri. Mengden av legemiddel som var assosiert med antistoffet, men ikke kovalent bundet (fritt
legemiddel) ble bestemt ved HPLC-analyse og utgjorde tilnærmet 2 % av den totale mengde bundet legemiddel.
Eksempel 13
In wtro-selektivitet og -virkning av huB4-DMF4-konjugat
Cytotoksisiteten av huB4-DM4 mot CD19-uttrykkende celler (Ramos) sammenlignet med en CD19-negativ cellelinje (Colo 205) ble analysert ved anvendelse av en MTT-basert analyse, hvor celledrepende aktivitet bestemmes ved å kvantifisere antallet levedyktige celler som foreligger etter behandling med et konjugat. Antall levedyktige celler bestemmes ved spektrofotometrisk kvantifisering etter inkubering av cellene med vitalfargestoffet MTT. huB4-DM4 viser en kraftig celledrepende aktivitet mot CD19-positive humane Ramos-tumorceller in vitro (Figur 12). Ingen signifikant toksisitet mot CD19-negative celler ble observert, noe som viser at den CD19-avhengige cytotoksisteten skyltes spesifikk målstyring via anti-CD19-antistoffet, huB4.
Eksempel 14
In wVo-virkning av huB4-DM4-konjugat mot xenotransplantater av de humane tumorcellene Ramos i SCID-mus
Virkningen av huB-DM4 in vivo ble bestemt ved anvendelse av SCID-mus som bar etablerte xenotransplantater av de humane tumorcellene Ramos. Ramos-celler ble injisert subkutant, og tumorene fikk vokse til en gjennomsnittlig størrelse på 100 mm<3>. HuB4-DM4-konjugat ble tilført i.v. som en enkelt injeksjon i dosene som er oppgitt i Figur 13a. Dosen er uttrykt som^g DM4 i konjugatet, noe som tilsvarer en antistoffdose på tilnærmet 44^g antistoff per^g DM4. Tumorvolumet ble målt som en indikasjon på behandlingens virkning, og musenes kroppsvekt ble fulgt som et mål på toksisitet grunnet behandling. I doser på mer enn 50^g/kg ga HuB4-DM4 fullstendig regresjon av tumoren i alle dyr. Dyrene forble uten målbar sykdom i tilnærmet 35 dager i gruppen behandlet med 100 mg/kg og i mer enn 55 dager i de to høyeste doseringsgruppene. Disse behandlingene ga svært lite, om noe toksisitet (Figur 13b), vurdert ut fra endringer i kroppsvekt for de behandlede dyrene.

Claims (43)

1. Forbindelsekarakterisert vedat den har formel 4:
hvor: Y står for (CH2)2CR!R2SZ, hvor: Ri er metyl og R2er H, eller Rlrog R2er metyl; og Z er H eller-SCH3.
2. Forbindelse ifølge krav 1, hvor Ri er metyl, R2er H, og Z er H.
3. Forbindelse ifølge krav 1, hvor Ri og R2er metyl, og Z er H.
4. Forbindelse ifølge krav 1, hvor Ri er metyl, R2er H, og Z er -SCH3.
5. Forbindelse ifølge krav 1, hvor Ri og R2er metyl, og Z er -SCH3.
6. Konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel med formel 4^ hvor: Yi står for (CH2)2CRiR2S-, hvor: Ri og R2er som definert i krav 1.
7. Konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel ifølge krav 6, hvor Ri er metyl og R2er H.
8. Konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel ifølge krav 6, hvor Ri og R2er metyl.
9. Fremgangsmåte for forestring av maytansinol for å gi et maytansinoid med formel 42:
hvor fremgangsmåten omfatter å omsette maytansinol med strukturen 11 i posisjon C-3:
med en forbindelse med formel (III-L) eller (III-D,/.),
hvor Y2står for (CH2)2CRiR2SZ2 hvor Ri er metyl og R2er H eller Ri og R2er metyl; og Z2er SCH3.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9 hvor forbindelsen med formel (III) er representert ved formel (III-/.):
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9 hvor Ri er metyl, R2er H.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 9 hvor forbindelsen med formel (III-/.) er /v-metyl-N- [4-(S)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (15a(S,S)), /V-metyl-/V-[4-(Æ)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (15b(S,/?)) eller en blanding av 15a(S,S) og 15b(S,R).
13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor forbindelsen med formel (III-D,/.) er N-metyl-N-[4-metylditio-l-okso-pentyl]-alanin (15) hvor N-metylalaninet er rasemisk og hvor karbon atomet som bærer svovel atomet enten er rasemisk eller har R- eller S-kiralitet.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor blandingen av 15a(S,S) og 15b(S,Æ) dannes ved en prosess som omfatter: (1) omsetting av 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi 4-metylditiopentansyre (forbindelse 13); (2) omdannelse av forbindelse 13 til /V-hydroksysuksinimidyl-4-metylditio-pentanoat (forbindelse 14); og (3) omsetting av forbindelse 14 med /V-metyl-L-alanin for å gi blandingen av 15a(S,S) og 15b(S,/?).
15. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor forbindelse 15a(S,S) dannes ved en fremgangsmåte som omfatter: (1) omdannelse av (R)-l,3-butandiol til (S)-4-(metylditio)pentansyre (forbindelse 19); (2) omdannelse av forbindelse 19 til /V-hydroksysuksinimidyl(S)-4-metylditio-pentanoat (forbindelse 20); og (3) omsetting av forbindelse 20 med /V-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15a(S,S).
16. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor forbindelse 15b(S,/?) dannes ved en fremgangs-måte som omfatter: (1) omdannelse av (S)-l,3-butandiol til (R)-4-(metylditio)pentansyre (forbindelse 24); (2) omdannelse av forbindelse 24 til /V-hydroksysuksinimidyl(R)-4-metylditio-pentanoat (forbindelse 25); og (3) omsetting av forbindelse 25 med /V-metyl-L-alanin for å gi forbindelse 15b(S,R).
17. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor forbindelsen med formel (III-D,L) dannes ved en prosess som omfatter: (1) omsetting av 4-merkaptopentansyre (12) med metylmetantiolsulfonat for å gi 4-metylditiopentansyre (forbindelse 13); (2) omdannelse av forbindelse 13 til /V-hydroksysuksinimidyl-4-metylditiopentanoat (forbindelse 14); (3) omsetting av forbindelse 14 med racemisk /V-metylalanin for å gi forbindelsen med formel (III-D,L).
18. Fremgangsmåte ifølge krav 9 hvor Ri og R2er metyl.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor forbindelsen med formel (III-/.) er /V-metyl-/V-(4-metyl-4-metylditio-l-okso-pentyl)-L-alanin (forbindelse 10 inneholdende /V-metyl-L-alanin).
20. Fremgangsmåte ifølge krav 9, hvor forbindelsen med formel (III-D,/.) er N-metyl-/V-(4-metyl-4-metylditio-l-okso-pentyl)-D,L-alanin (forbindelse 10 inneholdende racemisk /V-metylalanin).
21. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 19 eller 20 hvor forbindelse 10 inneholdende /V-metyl-L-alanin eller racemisk /V-metylalanin dannes ved en prosess som omfatter: (1) omsetting av isobutylensulfid (5) med anionet av acetonitril for å gi 4-merkapto-4-metyl-pentan-nitril (forbindelse 6); (2) hydrolyse av forbindelse 6 for å gi 4-merkapto-4-metylpentansyre (forbindelse 7); (3) omdannelse av forbindelse 7 til 4-metyl-4-(metylditio)-pentansyre (forbindelse 8) ved reaksjon med metylmetantiolsulfonat; (4) omdannelse av forbindelse 8 til /V-hydroksysuksinimidyl-4-metyl-4-(metylditio)pentanoat (forbindelse 9); og (5) omsetting av forbindelse 9 med /V-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin for å gi forbindelse 10 inneholdende /V-metyl-L-alanin eller racemisk N-metylalanin.
22. Fremgangsmåte for å fremstille et maytansinoid ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 20 hvor den videre omfatter separasjon av eventuelt foreliggende diastereomerer og rensing av maytansinoidet ved HPLC på cyanobundet kiselgel.
23. Et konjugat som definert i et hvilket som helst av kravene 6 til 8 for anvendelse i en terapeutisk metode som omfatter å administrerer til et individ med behov for behandling en effektiv mengde av konjugatete eller et farmasøytisk akseptabelt salt eller solvat deerav.
24. Konjugat som definert i et hvilket som helst av kravene 6 til 8, for anvendelse i en metode for å behandle malignitet, an autoimmun sykdom, en tranasplantat avvisning, graft versus host sykdom, en virusinfeksjon eller en parasitt inefeksjon.
25. Konjugate for anvendelse ifølge krav 24, hvor metoden en behandling av en tumor.
26. Konjugat for anvendelse ifølge krav 24 hvor metoden er for behandling av kreft i lungene, brystet, kolon, prostata, nyrene, bukspyttkjertelen, eggstokkene eller lymfatiske organer.
27. Anvendelse av et konjugat som definert i et hvilket som helst av kravene 6 til 8, til fremstilling av et medikament for anvendelse i en metode som definert i et hvilket som helst av kravene 24 til 26.
28. Forbindelse med formel (III-L) eller (III-D,L) som definert i krav 9.
29. Forbindelsen i følge krav 28 som er /V-metyl-/V-(4-metyl-4-metylditio-l-okso-pentyl)-L-alanin (forbindelse 10(S)), /V-metyl-/V-(4-metyl-4-metylditio-l-okso-pentyl)-D-alanin (forbindelse 10(R)) eller/V-metyl-/V-(4-metyl-4-metylditio-l-okso-pentyl)-D,L-alanin (racemisk 10).
30. Forbindelsen i følge krav 28 som er en blanding av /V-metyl-/v-/" 4-(S)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin og /V-metyl-/V-[4-(/?)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (forbindelser 15a(S,S) og 15b(S,/?)).
31. Forbindelsen i følge krav 28 som er/V-metyl-N-[4-metylditio-l-okso-pentyl]-alanin (15) hvor N-metylalanin er rasemisk og hvor karbon atomet som bærer svovel atomet enten er rasemisk eller har R- eller S-kiralitet.
32. Forbindelsen i følge krav 28 som er/V-metyl-/V-/"4-(S)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (forbindelse 15a(S,S)).
33. Forbindelsen i følge krav 28 som er /V-metyl-/V-[4-(Æ)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (forbindelse 15b(S,Æ)).
34. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelse 10 inneholdende /V-metyl-L-alanin eller racemisk /V-metylalanin, som definert i krav 19 eller 20 ved en prosess som definert i krav 21.
35. Fremgangsmåte for fremstilling av en blanding av forbindelser 15a(S,S) og 15b(S,R) som definert i krav 12 ved en prosess som definert i krav 14..
36. Fremgangsmåte for fremstilling av /V-metyl-N-[4-metylditio-l-okso-pentyl]-alanin (15) hvor N-metylalanin er rasemisk og hvor karbon atomet som bærer svovel atomet enten er rasemisk eller har R- eller S-kiralitet, ved en prosess som definert i krav 17.
37. Fremgangsmåte for fremstilling av /V-metyl-/V-/"4-(S)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (forbindelse 15a(S,S)) ved en prosess som definert i krav 15.
38. Fremgangsmåte for fremstilling av /V-metyl-/V-[4-(/?)-metylditio-l-okso-pentyl]-S-alanin (forbindelse 15b(S,/?)) ved en prosess som definert i krav 16.
39. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter en effektiv mengde av forbindelsen ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5 eller konjugat mellom et maytansinoid og et cellebindende middel ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8, eller et farmasøytisk aksepterbart salt eller solvat derav, og et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, fortynningsmiddel eller en eksipiens.
40. Farmasøytisk preparat ifølge krav 39, som omfatter en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor det videre omfatter et antistoff.
41. Fremgangsmåte for induksjon av celledød i utvalgte cellepopulasjoner in vitro eller ex vivo, karakterisert vedat den omfatter å sette målceller eller vev som inneholder målceller i forbindelse med en effektiv mengde av konjugatet mellom et maytansinoid og et cellebindende middel ifølge hvilket som helst av kravene 6 til 8.
42. Fremgangsmåte ifølge krav 41, hvor konjugat representert med følgende formel
hvor w gjennomsnittelig er 1-10.
43. Fremgangsmåte for fremstilling av av konjugatet mellom et maytansinoid og et cellebindende middel som definert i et hvilket som helst av kravene 6 til 8 med nevnte cellebindende middel karakterisert vedat det cellebindende midlet omfatter en reaktiv ditio-gruppe.
NO20056039A 2003-05-20 2005-12-19 Forbedrede cytotoksiske midler som omfatter nye maytansinoider; fremgangsmåte for deres fremstilling; intermediater derav og fremgangsmåte for deres fremstilling; konjugat mellom maytansinoidene og et cellebindende middel; fremgangsmåte for dets fremstilling og dets anvendelse i en terapeutisk metode eller til fremstilling av et medikament, samt et farmasøytisk preparat derav. NO339597B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US47173903P 2003-05-20 2003-05-20
PCT/US2004/013314 WO2004103272A2 (en) 2003-05-20 2004-05-20 Improved cytotoxic agents comprising new maytansinoids

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20056039L NO20056039L (no) 2006-02-20
NO339597B1 true NO339597B1 (no) 2017-01-09

Family

ID=33476883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20056039A NO339597B1 (no) 2003-05-20 2005-12-19 Forbedrede cytotoksiske midler som omfatter nye maytansinoider; fremgangsmåte for deres fremstilling; intermediater derav og fremgangsmåte for deres fremstilling; konjugat mellom maytansinoidene og et cellebindende middel; fremgangsmåte for dets fremstilling og dets anvendelse i en terapeutisk metode eller til fremstilling av et medikament, samt et farmasøytisk preparat derav.

Country Status (28)

Country Link
EP (4) EP3851126A1 (no)
JP (2) JP5208420B2 (no)
KR (1) KR101145506B1 (no)
CN (2) CN1956722A (no)
AU (1) AU2004240541B2 (no)
BR (2) BRPI0419348B8 (no)
CA (1) CA2525130C (no)
CL (1) CL2012000651A1 (no)
CO (1) CO5660276A2 (no)
CR (1) CR20170291A (no)
CY (2) CY1117161T1 (no)
DK (2) DK3524611T3 (no)
EA (1) EA010909B1 (no)
EC (1) ECSP056149A (no)
ES (2) ES2863498T3 (no)
HK (1) HK1116777A1 (no)
HR (2) HRP20160046T1 (no)
HU (2) HUE028314T2 (no)
IL (6) IL171170A (no)
LT (1) LT3524611T (no)
MX (3) MX370281B (no)
NO (1) NO339597B1 (no)
NZ (1) NZ542695A (no)
PL (2) PL1651162T3 (no)
PT (2) PT1651162E (no)
SI (2) SI3524611T1 (no)
WO (1) WO2004103272A2 (no)
ZA (1) ZA200507845B (no)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3851126A1 (en) * 2003-05-20 2021-07-21 ImmunoGen, Inc. Maytansinoid-cell-binding agent conjugates
EA013323B1 (ru) 2004-12-09 2010-04-30 Сентокор, Инк. Иммуноконъюгаты против интегрина, способы и варианты применения
AU2006213662B2 (en) * 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
AU2006235276A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. CACNA1E in cancer diagnosis, detection and treatment
WO2006110585A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Cancer-related genes (prlr)
EP1868649A4 (en) 2005-04-15 2011-06-29 Immunogen Inc ELIMINATION OF A POPULATION OF HETEROGENEOUS OR MIXED CELLS IN TUMORS
ES2533992T3 (es) * 2005-08-24 2015-04-16 Immunogen, Inc. Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpo maitansinoide
US9486408B2 (en) 2005-12-01 2016-11-08 University Of Massachusetts Lowell Botulinum nanoemulsions
PT1813614E (pt) 2006-01-25 2012-01-09 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina
EP2389948A1 (en) 2006-03-23 2011-11-30 Novartis AG Anti-tumor cell antigen antibody therapeutics
AU2007238636A1 (en) 2006-04-13 2007-10-25 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
US8846005B2 (en) 2007-03-14 2014-09-30 Novartis Ag APCDD1 inhibitors for treating, diagnosing or detecting cancer
EP2276506A4 (en) 2008-04-30 2014-05-07 Immunogen Inc EFFICIENT CONJUGATES AND HYDROPHILIC BINDER
KR102444399B1 (ko) * 2009-06-03 2022-09-16 이뮤노젠 아이엔씨 메이탄시노이드의 제조방법
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AR078471A1 (es) 2009-10-02 2011-11-09 Sanofi Aventis COMPUESTOS MAITANSINOIDES Y EL USO DE ESTOS PARA PREPARAR CONJUGADOS CON UN ANTICUERPO LOS CUALES SE UTILIZAN COMO AGENTES ANTICANCERIGENOS Y EL PROCEDIMIENTO DE PREPARACIoN DE ESTOS CONJUGADOS
CN102596922A (zh) * 2009-10-06 2012-07-18 免疫基因公司 有效的缀合物和亲水性连接体
HUE026447T2 (en) 2009-10-16 2016-05-30 Novartis Ag Pharmacodynamic tumor response biomarkers
FR2963007B1 (fr) 2010-07-26 2013-04-05 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique
CA2806252C (en) 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
BR112013010853A2 (pt) 2010-11-03 2016-08-16 Immunogen Inc "agentes citotóxicos compreendendo derivados de ansamitocina, composição farmacêutica e uso destes"
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
RU2451010C1 (ru) * 2011-01-11 2012-05-20 Закрытое Акционерное Общество "Ива Фарм" Палладиево-медные катализаторы гомогенного селективного окисления тиольных групп, комбинация и композиция на их основе и способ терапевтического воздействия
UA116524C2 (uk) 2011-03-29 2018-04-10 Іммуноджен, Інк. Спосіб одержання кон'югата антитіло-майтансиноїд
EP2524929A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-21 Sanofi Use of anti-CD19 maytansinoid immunoconjugate antibody for the treatment of CD19+ B-cell malignancies syptoms
EP2550975A1 (en) * 2011-07-29 2013-01-30 Sanofi Combination therapy for the treatment of CD19+ B-cell malignancies symptoms comprising an anti-CD19 maytansinoid immunoconjugate and rituximab
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
AU2012323287B2 (en) 2011-10-10 2018-02-01 Xencor, Inc. A method for purifying antibodies
EP3486248B1 (en) * 2012-09-26 2021-04-07 ImmunoGen, Inc. Improved methods for the acylation of maytansinol
RU2661083C2 (ru) 2012-10-04 2018-07-11 Иммуноджен, Инк. Использование пвдф-мембраны для очистки конъюгатов клеточно-связывающий агент - цитотоксический агент
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CN110981964B (zh) 2013-01-14 2023-09-15 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CN103933575B (zh) 2013-01-23 2017-09-29 上海新理念生物医药科技有限公司 一种三齿型连接子及其应用
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3936521A1 (en) 2013-03-15 2022-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014232416B2 (en) 2013-03-15 2017-09-28 Xencor, Inc. Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
CN104974252B (zh) * 2014-04-01 2020-04-24 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途
EP3160518A4 (en) * 2014-06-30 2018-05-23 Tarveda Therapeutics, Inc. Targeted conjugates and particles and formulations thereof
WO2016014984A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
WO2016036861A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Immunogen, Inc. Methods for formulating antibody drug conjugate compositions
TWI697493B (zh) 2014-09-03 2020-07-01 美商免疫原公司 細胞毒性苯并二氮呯衍生物
WO2016036804A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
PE20171103A1 (es) 2014-11-26 2017-08-07 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a cd3 y cd38
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10428155B2 (en) 2014-12-22 2019-10-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
CN106279352B (zh) 2015-05-29 2020-05-22 上海新理念生物医药科技有限公司 海兔毒素10的衍生物及其应用
CN106243127B (zh) 2015-06-09 2021-01-26 凯惠科技发展(上海)有限公司 抗体药物偶联物、中间体、制备方法、药物组合物及应用
AU2016343817B2 (en) 2015-10-28 2021-05-27 Tva (Abc), Llc SSTR-targeted conjugates and particles and formulations thereof
CN106729743B (zh) 2015-11-23 2021-09-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗ErbB2抗体-药物偶联物及其组合物、制备方法和应用
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
RU2022104399A (ru) 2016-06-14 2022-05-05 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела-ингибиторы контрольных точек
AU2017290086A1 (en) 2016-06-28 2019-01-24 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
GB201615725D0 (en) 2016-09-15 2016-11-02 Polytherics Ltd Novel cytotoxic agents and conjugates thereof
CN110214148A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα Fc融合蛋白和PD-1抗体片段的双特异性异源二聚体融合蛋白
AU2017360346B2 (en) 2016-11-21 2023-11-23 Eirion Therapeutics, Inc. Transdermal delivery of large agents
CN116785450A (zh) 2017-02-28 2023-09-22 伊缪诺金公司 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物
GB201703876D0 (en) 2017-03-10 2017-04-26 Berlin-Chemie Ag Pharmaceutical combinations
TW201839001A (zh) 2017-04-20 2018-11-01 美商伊繆諾金公司 細胞毒性苯并二氮平衍生物及其綴合物
MA49517A (fr) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor Inc Protéines de fusion fc hétérodimères ciblées contenant il-15/il-15ra et domaines de liaison à l'antigène
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
JP2021502100A (ja) 2017-11-08 2021-01-28 ゼンコア インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１配列を用いた二重特異性および単一特異性抗体
WO2019105835A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Bayer Consumer Care Ag Combinations of copanlisib and anetumab ravtansine
JP2021506291A (ja) 2017-12-19 2021-02-22 ゼンコア インコーポレイテッド 改変されたｉｌ−２ ｆｃ融合タンパク質
WO2019133652A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Immunogen, Inc. Benzodiazepine derivatives
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
EP3781599A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
GB201809746D0 (en) 2018-06-14 2018-08-01 Berlin Chemie Ag Pharmaceutical combinations
SG11202013138RA (en) 2018-07-02 2021-01-28 Amgen Inc Anti-steap1 antigen-binding protein
WO2020023871A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Promega Corporation Quinone-containing conjugates
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
CA3132185A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
US11420981B2 (en) * 2019-04-18 2022-08-23 Indena S.P.A. Diasteroselective process for the preparation of thiol- or disulfide-containing maytansinoid esters and intermediates thereof
WO2020234114A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Bayer Aktiengesellschaft A novel stable high concentration formulation for anetumab ravtansine
BR112022000297A2 (pt) 2019-07-10 2022-03-15 Cybrexa 3 Inc Conjugados de peptídeos de agentes de alvo de microtúbulos como terapêuticos
CN114341162A (zh) 2019-07-10 2022-04-12 赛博克萨2公司 作为治疗剂的细胞毒素的肽缀合物
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
KR102607909B1 (ko) 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
WO2023089314A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Oxford Biotherapeutics Limited Pharmaceutical combinations

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
WO2001024763A2 (en) * 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2002016368A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
WO2003020909A2 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Genentech, Inc. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
WO2004110498A2 (en) * 2003-05-14 2004-12-23 Immunogen, Inc. Drug conjugate composition
WO2005009369A2 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Immunogen, Inc. A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
SE9102074D0 (sv) 1991-07-03 1991-07-03 Kabi Pharmacia Ab Tomour antigen specific antibody
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
CA2297070A1 (en) 1997-08-01 1999-02-11 Morphosys Ag Novel method and phage for the identification of nucleic acid sequences encoding members of a multimeric (poly)peptide complex
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP3851126A1 (en) * 2003-05-20 2021-07-21 ImmunoGen, Inc. Maytansinoid-cell-binding agent conjugates

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
WO2001024763A2 (en) * 1999-10-01 2001-04-12 Immunogen, Inc. Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents
WO2002016368A1 (en) * 2000-08-18 2002-02-28 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
EP1258255A1 (en) * 2001-05-18 2002-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
WO2003020909A2 (en) * 2001-09-05 2003-03-13 Genentech, Inc. Methods for the identification of polypeptide antigens associated with disorders involving aberrant cell proliferation and compositions useful for the treatment of such disorders
WO2004110498A2 (en) * 2003-05-14 2004-12-23 Immunogen, Inc. Drug conjugate composition
WO2005009369A2 (en) * 2003-07-21 2005-02-03 Immunogen, Inc. A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
PL3524611T3 (pl) 2021-06-14
NZ542695A (en) 2009-04-30
HK1116777A1 (en) 2009-01-02
EP1651162A4 (en) 2010-06-30
JP2013082733A (ja) 2013-05-09
IL231810A0 (en) 2014-05-28
CA2525130C (en) 2014-04-15
EP1651162A2 (en) 2006-05-03
NO20056039L (no) 2006-02-20
IL241211B (en) 2019-09-26
MX340862B (es) 2016-07-28
DK3524611T3 (da) 2021-04-06
CN101186613B (zh) 2014-09-17
MXPA05011811A (es) 2006-02-17
CY1117161T1 (el) 2017-04-05
ECSP056149A (es) 2006-10-17
IL213876A0 (en) 2011-07-31
HRP20210464T1 (hr) 2021-05-14
EA010909B1 (ru) 2008-12-30
IL213876A (en) 2013-12-31
CY1124278T1 (el) 2021-10-29
KR101145506B1 (ko) 2012-05-15
EP3031810A1 (en) 2016-06-15
BRPI0419348B1 (pt) 2018-10-16
IL238894A0 (en) 2015-06-30
BRPI0410748A (pt) 2006-06-27
CL2012000651A1 (es) 2012-10-19
EA200501836A1 (ru) 2006-08-25
PL1651162T3 (pl) 2016-04-29
BRPI0410748B1 (pt) 2019-02-19
KR20060003120A (ko) 2006-01-09
LT3524611T (lt) 2021-04-12
MX370281B (es) 2019-12-09
EP3524611A1 (en) 2019-08-14
IL171170A (en) 2015-09-24
IL223297A0 (en) 2012-12-31
BRPI0419348B8 (pt) 2021-05-25
EP3851126A1 (en) 2021-07-21
PT1651162E (pt) 2016-02-22
EP3031810B1 (en) 2019-03-06
IL223297A (en) 2014-04-30
CN1956722A (zh) 2007-05-02
HUE054074T2 (hu) 2021-08-30
HUE028314T2 (en) 2016-12-28
WO2004103272A3 (en) 2006-11-23
IL241211A0 (en) 2015-11-30
ES2559670T3 (es) 2016-02-15
JP5208420B2 (ja) 2013-06-12
HRP20160046T1 (hr) 2016-02-12
DK1651162T3 (en) 2016-02-01
ES2863498T3 (es) 2021-10-11
WO2004103272A2 (en) 2004-12-02
IL238894A (en) 2017-06-29
IL231810A (en) 2016-02-29
JP5563673B2 (ja) 2014-07-30
CA2525130A1 (en) 2004-12-02
JP2007514646A (ja) 2007-06-07
AU2004240541A1 (en) 2004-12-02
PT3524611T (pt) 2021-04-01
CR20170291A (es) 2017-07-27
AU2004240541B2 (en) 2009-08-20
BRPI0410748B8 (pt) 2021-05-25
CO5660276A2 (es) 2006-07-31
SI1651162T1 (sl) 2016-02-29
EP3524611B1 (en) 2020-12-30
EP1651162B1 (en) 2015-10-21
SI3524611T1 (sl) 2021-05-31
CN101186613A (zh) 2008-05-28
ZA200507845B (en) 2007-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO339597B1 (no) Forbedrede cytotoksiske midler som omfatter nye maytansinoider; fremgangsmåte for deres fremstilling; intermediater derav og fremgangsmåte for deres fremstilling; konjugat mellom maytansinoidene og et cellebindende middel; fremgangsmåte for dets fremstilling og dets anvendelse i en terapeutisk metode eller til fremstilling av et medikament, samt et farmasøytisk preparat derav.
US20180043013A1 (en) Cytotoxic agents comprising new maytansinoids (dm4)
EP0425235B1 (en) Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5416064A (en) Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
JP5162581B2 (ja) レプトマイシン誘導体
JP2013542958A (ja) アンサマイトシン誘導体を含む細胞傷害性剤