NO339147B1 - Varmebehandlete bakteriner, og emulsjonsvaksiner fremstilt av slike varmebehandlete bakteriner - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt området vaksiner, og fremgangsmåter for å stabilisere emulsjonsvaksiner. Nærmere bestemt, foreliggende oppfinnelse vedrører varmebehandlete Leptospira bakterin for anvendelse i en emulsjonsvaksine, en fremgangsmåte for å fremstille varmebehandlete bakteriner, og emulsjonsvaksiner fremstilt av slike varmebehandlete bakteriner.

Bakgrunn for oppfinnelsen.

Vaksinering anvendes i økende grad for å kontrollere infeksiøse sykdommer i dyr. Adjuvanter benyttes hyppig i vaksiner på grunn av at de er i stand til å øke den humorale og/eller cellulære immunrespons til hvert antigen. Vaksiner formuleres ofte som emulsjoner på grunn av at emulsjonen kan virke som en adjuvant, og har egen-skapen i å opprettholde antigenet som et depot ved injeksjonsstedet. Emulsifiserende midler anvendes vanlig i emulsjonsvaksiner. I tillegg til å anvende emulsifiserende midler kan stabilitet av emulsjonsvaksinene også oppnås gjennom å redusere dråpestørrelse av emulsjonen med mekaniske midler.

U.S. Patent 5,084,269 vedrører en adjuvantformulering inneholdende lecitin i kombinasjon med mineralolje, som produserer mindre irritasjon i vertsdyret, og samtidig induserer øket systemisk immunitet. Sammensetninger i samsvar med US Patent 5,084,269 er i kommersiell bruk under varemerkenavnet AMPHIGEN<®>, et varemerke fra Pfizer, Inc.

Generelt, bakterielle antigener er ustabile idet de oppvarmes og kun kort eksponering til forhøyete temperaturer kan redusere aktiviteten av antigenene. For eksempel, gjeldende miltbrannvaksiner kan tape all biologisk aktivitet innen 48 timer ved 37 °C (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, and R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5): 1058-62).

Zeigler et al., Bulletin of the Pan American Health Organization, Vol. 10 (No.2): 126-130 (1997) beskriver helcellevaksinepreparaterfor immunisering mot Leptospira hvor bakterinet ble fremstilt sterilt i 0,85% saltløsning for injeksjon. Zeigler et al kombinerer ikke bakterinet med en emulsjon. Varmebehandlingen ifølge Zeigler et al. Er ved 56°C i 30 minutter og er tiltenkt å drepe bakterien.

Sammendrag av oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører varmebehandlet Leptospira bakterin for anvendelse i en emulsjonsvaksine, kjennetegnet ved at den omfatter en suspensjon av drepte bakterier som har en lipaseaktivitet på 50 % eller mindre enn lipaseaktiviteten av bakterinet før varmebehandling, hvor varmebehandlingen omfatter å varme bakterinet som har lipaseaktivitet til en temperatur av 60 til 70 °C i 5 til 10 timer. Ytterligere utførelser er angitt i underkavene 2-9.

Oppfinnelsen vedrører også en emulsjonsvaksine, kjennetegnet ved at den omfatter

a) en olje og én eller flere emulgeringsmidler; og

b) varmebehandlet Leptospira bakterin som angitt over.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å fremstille et varmebehandlet

Leptospira bakterin av emulsjonsvaksinen som angitt over, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter trekkene: a) måle lipaseaktiviteten til bakterinet; b) varme bakterinet til en temperatur av 60 til 70 °C i 5 til 10 timer; c) måle lipaseaktiviteten av bakterinet etter varmebehandling; d) sammenligne lipaseaktiviteten av bakterinet før oppvarming med lipaseaktiviteten av bakterinet etter oppvarming;

e) velge et varmebehandlet bakterin,

hvor lipaseaktiviteten etter varmebehandling er 50 % eller mindre enn lipaseaktiviteten av bakterinet før varmebehandling.

Oppfinnelsen vedrører også en emulsjonsvaksine omfattende varmebehandlete Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, and Leptospira pomona bakteriner oppnådd med oppvarming til en temperatur av 65 °C i 8 timer, og ytterligere omfattende AMPHIGEN®, adjuvanter, konserveringsmidler og fortynningsmidler slik at konsentrasjonen av bakteriner er med 1200 NU/5 ml dose for alle Leptospira bakteriner med unntak av Leptospira hardjo som er med 2400 NU/ 5 ml dose, hvor emulsjonsvaksinen homogeniseres og mirkofluidiseres, og hvor pH deretter justeres til pH 7,0-7,3.

Detaljert beskrivelse.

Definisjoner.

Akseptabel antigenisk aktivitet - Termen "akseptabel antigenisk aktivitet" angir evne til å redusere en beskyttende immunrespons i vaksinerte dyr etter å ha blitt utfordret, eller ved å passere en kodet potenstest med homologe levende organismer.

Bakterin - termen "bakterin" angir en suspensjon av drepte bakterier som kan anvendes som en komponent i en vaksine.

Emulsifiserende middel - Termen "emulsifiserende middel" betyr en substans som benyttes for å gjøre en emulsjon mer stabil.

Emulsjon - Termen "emulsjon" angir en sammensetning av to ublandbare væsker hvor små dråper av en væske suspenderes i en kontinuerlig fase av den andre væske.

Varmebehandlet bakterin - Termen varmebehandlet bakterin angir en bakterin som har blitt varmebehandlet og som har en lipaseaktivitet på 50 % eller mindre enn lipaseaktiviteten før varmebehandlingen, og som haren aksessbar antigenisk aktivitet.

Invert emulsjon - Termen "invert emulsjon angir en vann-i-olje-emulsjon.

Lipase - Termen "lipase" angir enzymer, esteraser, lipaser og fosforlipaser, som kan forårsake nedbryting av et emulsifiserende middel i en emulsjonsvaksine.

Normal emulsjon - Termen "normal emulsjon" angir en olje-i-vann-emulsjon.

Olje-i-vann-emulsjon - Termen "olje-i-vann-emulsjon" angir en emulsjon hvor små dråper av olje er suspendert i en kontinuerlig vannfase.

Romtemperatur- Termen "romtemperatur" angir en temperatur fra 18 til 25 °C.

Vann-i-olje-emulsjon - Termen "vann-i-olje-emulsjon angir en emulsjon hvor dråper av vann er suspendert i en kontinuerlig oljefase.

Beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører bakteriner som reduserer lipaseaktivitet, vaksiner fremstilt av slike bakteriner, og en fremgangsmåte for å redusere lipaseaktiviteten i bakteriner. I tillegg til antigeniske komponenter har noen bakteriner lipaseaktivitet. Idet bakterinet med lipaseaktivitet inkorporeres i en emulsjon kan lipasen bryte ned de emulsifiserende midler som anvendes for å etablere emulsjon. Emulsjonsvaksiner som inneholder bakteriner som har høy lipaseaktivitet syntes å være utstabile emulsjoner, og de som inneholder bakteriner som har lave nivåer av lipase syntes å være stabile. Eksempler på bakterier som kan, idet de drepes, produsere bakteriner som har lipaseaktivitet inkluderer Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacterjejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11- 1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium og Leptospira species, så som de kjente patogener Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae og Leptospira pomona.

Lipasen, som kan bryte ned de emulsifiserende midler anvendt for å etablere emulsjonen, og som således kan forårsake ustabilitet og nedbryting av emulsjonen, kan inkludere en eller flere emulsjonsbrytende enzymer så som esteraser, lipaser og fosforlipaser. Samlet benevnes disse enzymer, esteraser, lipaser og fosforlipaser, som lipaser. Lipaseaktiviteten av en bakterin kan måles ved anvendelse av et syntetisk substrat benevnt O-pivaloyloksymetyl umbelliferon (C-POM). Hydrolysehastigheten forårsaket av lipasen er et mål for lipaseaktiviteten. Reaksjonshastigheten av hydrolysen forårsaket av lipasen i denne reaksjon monitoreres med en økning i fluoressensintensitet i produktet av lipaseaktiviteten. Reaksjonshastigheten er avhengig av den eksakte hydrolysetestbetingelse som velges, slik at sammen-ligninger av lipaseaktivitetsnivåer, som målt med hydrolysehastigheter, bør utføres ved anvendelse av data produsert av de samme testbetingelser. Litteraturmetoder er beskrevet i flere artikler, inkluderende Kurioka S., and Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281-289, De Silva NS, and Quinn PA. (1987) J. Clin. Microbiol. 25: 729-731, and Grau, A., and Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91: 109-118.

I en emulsjonsvaksine forårsaker nedbryting av emulsjonen faseseparasjon av komponentene. Dette er ikke hensiktsmessig på grunn av at idet der oppstår en faseseparasjon så vil de individuelle doseringer som er fjernet fra beholderen ikke inneholde det samme nivå av vaksinekomponenter. I tillegg, tap av emulsjon kan føre til tap av adjuvant aktivitet av det emulsifiserende middel og føre til reduksjon i den antigeniske effekt av vaksinen.

Attenuerte levende virus inkluderes hyppig i vaksiner sammen med bakteriner. Slike vaksiner er nyttige på grunn av at en enkelt vaksine kan anvendes for å etablere immunitet til forskjellige sykdommer med en vaksine. Dersom lipaseaktiviteten foreligger i bakterinet vil dette føre til frigivelse av emulsifiserende middel fra emulsjonen. Dette frie emulsifiserende middel kan ødelegge og inaktivere i levende vaksinevirus, og dermed føre til tap av viral ineffektivitet.

Et bakterin som er nyttig i vaksiner kan dannes ved å dyrke den aktuelle bakterier og deretter drepe bakterien for å produsere et bakterin som inneholder en rekke bakterielle komponenter, inkluderende celleveggkomponentene. Bakterien kan drepes med en rekke metoder inkluderende å eksponere disse til en forbindelse så som mertiolat, formalin, formaldehyd, dietylamin, binært etylenamin (BEI), beta propiolakton (BPL) og glutaraldehyd. Kombinasjoner av disse forbindelser kan anvendes. I tillegg, det er mulig å drepe bakteriene med steriliserende bestråling.

Det er nå blitt funnet at lipaseaktiviteten av et bakterin som har slik lipaseaktivitet kan reduseres med varmebehandling. Nærmere bestemt, lipaseaktiviteten av et bakterin kan reduseres ved å oppvarme bakterinet til en temperatur av ca 35 til ca 80 °C for å danne et varmebehandlet bakterin, som har akseptabel antigenisk aktivitet. Varmebehandlingen utføres for en periode tilstrekkelig til at lipaseaktiviteten av det varmebehandlete bakterin er 50 % eller mindre enn det som finnes i bakterinet før varmebehandlingen. For god emulsjonsvaksinestabilitet er det ikke nødvendig at lipaseaktiviteten reduseres til null. Vi har funnet at vaksiner som har en god lagring kan fremstilles fra varmebehandlete bakteriner som har lipaseaktivitetsnivå som er 50 % eller mindre enn lipaseaktivitetsnivået før varmebehandlingen.

Idet hydrolysehastigheten av en testsubstrat har blitt anvendt som et mål på lipaseaktiviteten av et bakterin så sammenlignes hydrolysehastigheten av testsubstratet før varmebehandling med hydrolysehastigheten etter varmebehandling. Varme behandlingen utføres for å redusere hydrolysehastigheten til 50 % eller mindre enn hydrolysehastigheten som observeres for ferskt bakterin.

Den eksakte metode for å måle lipaseaktivitetsnivået er ikke kritisk så lenge samme metode anvendes som mål på aktiviteten før varmebehandling og aktiviteten etter varmebehandlingen. For eksempel, dersom hydrolysehastigheten av et testsubstrat måles ved anvendelse av et substrat, kan et annet substrat produsere en forskjellige hastighet. Imidlertid, dersom det samme substrat anvendes for den innledende aktivitetsbestemmelse og aktivitetsbestemmelsen etter behandlingen, så vil de relative hastigheter fremdeles vise effekten av varmebehandlingen.

For bakterinene som omfatter en eller flere av følgende; Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira pomona, så er der en kodifisert test for antigenisk aktivitet (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104, og §113.105). For disse spesies så defineres akseptabel antigenisk aktivitet som evne til å indusere en beskyttende immunrespons i vaksinerte hamstere slik at idet hamsterene utfordres med homologe levende bakterier så vil minst 75 % av de vaksinerte hamstere overleve i en modell hvor minst 80 % av de ikkevaksinerte hamstere ikke overlever.

I tilfelle for antigenet Leptospira hardjo, så defineres akseptabel antigenisk aktivitet som evnen av en vaksine til å indusere en serologisk agglutinering geometrisk midlet titer mot Leptospira hardjo på £40 i kalver som er blitt vaksinert med en vaksine omfattende det bakterielle antigen Leptospira hardjo. For andre bakteriner defineres akseptable antigeniske aktiviteter som evne til å indusere en beskyttende immunrespons i vaksinerte dyr etter å ha blitt utfordret eller ved å passere en kodifisert potenstest med homologe levende organismer.

Varmebehandlingen kan utføres over en rekke temperaturer, og for en varierende mengde av tid. Generelt, oppvarmingen kan utføres ved en temperatur av ca 35 til ca 80 °C i ca 20 minutter til ca 24 timer. Idet bakterinet oppvarmes til en høyere temperatur, så som ca 75 til ca 80 °C, så vil tiden for oppvarming være av den korte del av tidsintervallet. Idet oppvarmingen utføres ved en lavere temperatur vil oppvarmingen utføres for en lengre tidsperiode. En ytterligere kombinasjon av temperatur og tid er oppvarming ved en temperatur på ca 60 til ca 70 °C fra ca 9 til ca 10 timer. En ytterligere kombinasjon av temperatur og tid er oppvarming ved en temperatur av ca 65 til ca 70 °C i ca 5 til ca 8 timer. En ytterligere kombinasjon av temperatur og tid er oppvarming ved en temperatur av ca 65 til ca 70 °C i ca 1 time. En ytterligere kombinasjon av temperatur og tid er oppvarming ved en temperatur ved ca 55 til ca 65 °C i ca 5 til ca 8 timer.

Bakterinene, etter varmebehandling, har en lavere lipaseaktivitet enn ferskt fremstilte bakteriner men kan ellers formuleres på samme måte som ferskt fremstilte bakteriner, således, de varmebehandlete bakteriner kan inkorporeres inn i vaksiner med vanlige fremgangsmåter for å produsere vaksiner. Disse fremgangsmåter er godt kjent innen fagfeltet.

Emulsjonsvaksiner kan dannes ved å kombinere det ønskete bakterin med en oljefase og et emulsifiserende middel, eller flere emulsifiserende midler. Kombinasjonen underlegges deretter til intens agitering for å danne en emulsjon. Egnete agiteringsmetoder inkluderer homogenisering og påfølgende mikrofluidisering. Konserverende midler og eksipienter kan også inkluderes i kombinasjonen før emulsifiseringen.

Vaksiner kan inkludere både bakteriner og virale antigener. Ved fremstilling av en vaksine som inkluderer bakteriner og virale antigener kombineres bakterinene, virale antigener som skal inkluderes, emulsifiserende middel eller midler, og valgfritt konserverende midler og eksipienter med en oljefase, og det emulsifiseres. Etter dannelse av emulsjon kan pH av formuleringen justeres til en egnet pH ved anvendelse av løsninger av NaOH eller HCI. For vaksine i bruk er det generelt ønskelig at pH er så nær til det nøytrale for å unngå irritasjon ved injeksjonsstedet. En pH på ca 7,0 til ca 7,3 er vanlig.

Egnete oljefaserforemulsjonsvaksineformulering inkluderer ikke-metaboliserbare oljer og metaboliserbare oljer. De ikke-metaboliserbare oljer inkluderer mineraloljer så som hvit mineralolje og lett mineralolje. De metaboliserbare oljer inkluderer vegetabilske oljer, fiskeoljer og syntetiske fettsyreglyserider.

Eksempler på emulsifiserende midler som kan anvendes i emulsjonsvaksiner ifølge oppfinnelsen er fosforlipider, sorbitan estere, polyetoksylert sorbitan estere, og mannitol derivativer som er vanlige vaksineemulsifiserende midler. Fosforlipid emulsifiserende midler inkluderer lecitin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinisitol, fosfatidylserin og lecitin, (for eksempel så som AMPHIGEN<®>). Sorbitan ester-emulsifiserende midler inkluderer sorbitan monolaurat, (for eksempel Span<®>20 og Arlacel<®>20), sorbitan monooleat (for eksempel Span<®>80 og Arlacel<®>80), sorbitan monopalmitat (for eksempel Span<®>40 og Arlacel<®>40) og sorbitan monostearat (for eksempel Span<®>60 og Arlacel<®>60). Polyetoksylerte sorbitan estere inkluderer polyetoksy sorbitan monolaurat (for eksempel Tween<®>20 og Tween<®>21), polyetoksy sorbitan monooleat (for eksempel Tween<®>80), polyetoksy sorbitan monopalmitat (for eksempel Tween<®>40) og polyetoksy sorbitan monostearat (for eksempel Tween<®>60). Mannitol derivat emulsifiserende midler inkluderer mannitol oktadekanoiske estere.

Span<®>, Arlacel<®>og Tween<®>er varemerker av ICI Americas. AMPHIGEN<®>er et varemerke for Pfizer, Inc. Generelt, vaksiner formuleres som normal olje-i-vann-emulsjoner, selv om det også er mulig å fremstille inverte vann-i-olje-emulsjoner.

En rekke adjuvanter så som Quil A, kolesterol, aluminum fosfat og aluminum hydroksid, og konserverende midler så som mertiolat kan anvendes i vaksinene. Quil A er renset blanding av quillaja saponiner ekstrahert fra barken av det sørameri-kanske treet Quillaja Saponaria Molina. Quil A fungerer direkte på immunsystemet for å aktivere en generalisert tilstand av sensitivitet. Det produseres således både humoral og cellemedierte responser. Den lipofile kjede muliggjør interaksjon av antigen og adjuvant til å avgis inn i cytosol for prosessering i en endogen reaksjons-vei. Quil A anvendes ofte med kolesterol på grunn av at kolesterol eliminerer de mindre ønskelige bieffekter dersom de tilsettes i egnete forhold. Kolesterol danner uløselige komplekser med Quil A som danner helikslignende strukturer idet kolesterolet binder med Quil A, og eksponerer således molekylenes sukkerenheter som bevirkes å stimulere immunresponsen.

Det er vanlig å tilsette virale antigener til vaksiner som inneholder bakteriner. En fordel med denne tilnærming er at en vaksine kan anvendes for å etablere immunitet til flere sykdommer i stedet for å kreve doseringer av flere forskjellige vaksiner for å oppnå det samme resultat. Både drepte virus og attenuerte levende virus kan anvendes i vaksiner. Blant virusene som kan anvendes er Avian herpesvirus, Bovin herpesvirus, Canine herpesvirus, Equine herpesvirus, Feline viral rinotrakeitis virus, Mareks sykdomsvirus, Ovine herpesvirus, Porcine herpesvirus, Pseudorabies virus, Avian paramyksovirus, Bovin respirasjons synkytial virus, Canine distemper virus, Canine parainfluensa virus, Bovine Parainfluensa 3, Ovine parainfluensa 3, Rinderpest virus, Border disease virus, Bovint viralt diare (BVD) virus, Klassisk svinefeber virus, Avian Leukosis virus, Bovin immunsviktvirus, Bovin leukemia virus, Equine infeksjons anemia virus, Feline immunsviktvirus, Feline leukemia virus, Ovine progressive pneumonia virus, Ovine pulmonare adenokarsinom virus, Canine coronavirus, Bovine coronavirus, Feline enteriske coronavirus, Feline infektiøse peritonititt, virus, Porcine epidemiske diare virus, Porcine hemagglutinerende ensefalomyletititt virus, Porcine parvovirus, Transmissible gastroenteritt virus, Tyrkisk coronavirus, Bovin epemeral febervirus, Rabies, Vesikular stomatitt virus, Avian influensa, Equine influensa virus, Svineinfluensa virus, Canine influensa virus, Eastern Equine ensefalitt virus (EEE), Venezuelsk equine ensefalitt virus og vestlig equine ensefalitt virus.

Dersom lipaseaktiviteten foreligger i bakterinet kan det forårsake frigivelse av det emulsifiserende middel fra emulsjon. Dette frie emulsifiserende middel kan ødelegge kappen på det levende virus, og inaktivere de levende vaksinevirus og fører dermed til tap av viral infektivitet. Således, varmebehandling av bakterinet fungerer til å stabilisere emulsjonen, og konserverer dets adjuvant effekt, og konserverer likeledes den virale infektivitet av viruset.

Prosedyrer.

Prosedyre 1 bestemmelse av turbiditet.

Turbiditet bestemmes i nefelometriske enheter (NU) ved en lysavbøyningsmetode. Intensiteten av lys som avbøyes av prøven under definerte betingelser sammenlignes med intensiteten av lys som avbøyes av en standard referansesuspensjon. Jo høyere intensiteten av det avbøyde lys, jo høyere er turbiditeten av prøven. En lyskilde rettes mot prøven og lysavbøyning måles ved 90 °C i forhold til retningen av lyskilden. Instrumentet kalibreres ved å måle lysavbøyning fra en farmazinsuspen-sjon.

Kalibrering av nefelometer instrumentet.

Ultrafiltrert vann fremstilles ved å filtrere destillert vann gjennom et membranfilter som har en porestørrelse på 0,2 um. En første løsning fremstilles ved å oppløse 1,00 g hydrazinsulfat, (Nhb) H2SO4, i ultrafiltrert vann og fortynne med ultrafiltrert vann til 100 ml, i en volumetrisk flaske.

En andre løsning fremstilles ved å oppløse 10,00 g av heksametylentetramin i ultra-filtret vann og fortynne med ultrafiltrert vann til 100 ml i en volumetrisk flaske. En formazin suspensjon fremstilles ved å blande 5,0 ml av den første løsning med 5,0 ml av den andre løsning. Blandingen tillates å stå til henstand i 24 timer ved tilnærmet 24 °C. Blandingen fortynnes til 100 ml med ultrafiltrert vann for å danne en forråds turbiditets suspensjon som har en turbiditet av 400 NU. En 40 NU formazin turbiditets suspensjon fremstilles ved å fortynne 10,00 ml av forråds turbiditets-løsningen til 100 ml med ultrafiltrert vann. Ytterligere kalibreringsløsninger fremstilles ved å fortynne forrådsløsningen.

Måling av turbiditet.

Prøven som skal måles fortynnes med ultrafiltrert vann slik at turbiditeten faller innen det kalibrerte område for nefelometeret. Turbiditeten måles og den opprinnelige turbiditet beregnes ved anvendelse av følgende ligning:

Opprinnelig turbiditet i

hvor: M er turbiditeten av den fortynnete prøve i NU

D er volumet av fortynnet vann, i ml

0 er det opprinnelige prøvevolum, i ml.

Prosedyre 2 Lipaseanalyse.

Lipaseaktiviteten ble bestemt ved anvendelse av O-pivaloksymetylumbelliferon som et fluorogenisk substrat. Lipase katalyserer hydrolyse av dette ikke-fluorsente substrat og produserer en hydroksymetyleter som er ustabil under vandige betingelser. Dekomponeringen av den ustabile hydroksymetyleter genererer formaldehyd og det fluoriserende produkt umbelliferon. Monitorering av fluoressens intensiteten av umbelliferon som produseres, som en funksjon av tid, tilveiebringer et sensitivt kinetisk mål på lipase enzymatisk aktivitet.

O-pivaloksymetylumbelliferon (Molecular Probes produkt nr. P35901) løsninger ble

fremstilt i ren DMSO, med en forhåndskonsentrasjon på 5 mM; ubrukte løsninger ble lagret ved - 20 °C, beskyttet fra lys. En 5 mM O-pivaloksymetylumbelliferon løsning ble fortynnet til 750 uM ved anvendelse av 58 mM TRIS-HCI buffer (pH 8,0), og den resulterende løsning ble prevarmet til 37 °C. Leptospira -prøven eller kontrollbuffer/ medium ble sentrifugert i 10 minutter ved romtemperatur ved 6500 X gravitet for å danne en pellet og en supernatant. Reaksjoner ble utført ved å kombinere 15 ul 100 mM TRIS-HCI buffer (pH 8,0) med 15 ul av supernatanten ved romtemperatur fra Leptospira -prøven eller kontrollbuffer/medium, i analysebrønner av lavvolum 96 brønns plater (Corning 3393, svart polystyren ikke-bindende overflate, halvt areal); preinkubering i 10 minutter ved 37 °C; og deretter initiering av reaksjonen ved tilsetning av 20 ul 750 uM O- pivaloksymetylumbelliferon eller kontrollbuffer/medium. Den resulterende reaksjonsblanding inneholdt 53 mM TRIS-HCI buffer (pH 8,0) og 0 eller 300 uM O-pivaloksymetylumbelliferon. Fluoressens intensitet ble målt ved 30-35 sekunders intervaller og over en en-timers periode (Spectramax Gemini XS, 37 °C, Aex= 360 nm, Aem=460 nm, PMT sensitivitetsinnstilling "medium", 6 lesinger per

brønn). Reaksjonshastigheten ble bestemt fra stigningen av den resulterende utviklingskurve.

Eksempler

Eksempel 1 Reduksjon av lipaseaktivitet ved varmebehandling.

En samling mertiolat-drepte leptospira inneholdende følgende spesis: Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, og Leptospira pomona ble fremstilt for å danne et bakterin. Seks prøver av bakterin ble lagret natten over (tilnærmet 12 timer) ved 4 °C, 14 °C, 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C og 80 °C. Prøven lagret ved 4 °C fungerte som ikke-behandlet kontroll. Prøvene lagret i 12 timer ved 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C og 80 °C var de varmebehandlete prøver. Etter lagring ble hastigheten hvorved testsubstratet hydrolyserte i nærvær av hvert bakterin målt i samsvar med fremgangsmåten ifølge prosedyre 2.

Hydrolysehastigheten for en prøve delt med hydrolysehastigheten for prøve lagret ved 4 °C multiplisert med 100 er prosentandelen av opprinnelig lipaseaktivitet av hvert bakterin som er igjen etter lagring. Det påfølgende kart viser temperatur ved lagring og prosentandel av opprinnelig lipaseaktivitet som forblir etter lagring.

Eksempel 2 Fremstilling av eksperimentelle vaksineformuleringer. Kulturer av Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo og Leptospira pomona ble dyrket. Turbiditet av hver kultur ble målt i nefelometriske enheter (NU). Bakteriene ble drept med mertiolat for å danne bakteriner..Hvert bakterin ble varmebehandlet ved 65 °C i 8 timer for å redusere lipaseaktivitet. Bakterinet ble kombinert og deretter blandet med amfigener, adjuvanter, konserveringsmidler og fortynningsbuffer slik at hver 5 ml dosering av vaksine inneholdt komponentene som angitt i kartet nedenfor

Konsentrasjon av antigener.

Formuleringen ble homogenisert ved anvendelse av en Silverson homogeniserer og mikrofluidisert ved anvendelse av en mikrofluidisererfra Microfluidics. Etter både homogenisering og mikrofluidisering ble pH i formuleringen justert til en pH av 7,0 til 7,3.

Eksempel 3 Potensitetstesting i hamstere og kuer.

Vaksinen fra eksempel 2 ble administrert til hamstere og kuer for å teste for potensitet ved anvendelse av standard laboratorie og vert-dyremodeller. Test hamsterne ble deretter utfordret med en dosering av Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, eller Leptospira pomona for å teste potensiteten til vaksinen. Antallet overlevende ble målt som et mål på effektivitet. Bovin mikroskopisk agglutineringstiter ble målt mot Leptospira hardjo for å vise potensitet av denne fraksjon av vaksine i kuer. Tabellen nedenfor viser at vaksinen fremstilt fra varmebehandlet Leptospira bakteriner er i stand til å produsere en antigenisk respons som passerer effektivitets kriteriene.

Eksempel 4 Fysiokjemisk testing av vaksiner.

En vaksine ble fremstilt fra varmebehandlete Leptospira bakterin i samsvar med metoden i eksempel 2. En tilsvarende vaksine ble fremstilt fra og ikke-varmebehandlet Leptospira bakterin i samsvar med fremgangsmåten i eksempel 2. Begge vaksineformuleringer ble lagret ved 4 °C i 60 dager. Analysering av partikkelstørrelse ble utført for hver vaksine ved fersk fremstilling ved dag 0 og igjen etter 60 dager ved anvendelse av laser diffraktometer.

Figurene viser partikkelstørrelsesfordelingerfor hver vaksine ved dag 0 før og etter lagring i 60 dager.

Vaksinene fremstilt fra varmebehandlet Leptospira bakteriner viste partikkel-størrelsesretensjon som indikerer emulsjonsstabilitet. Vaksinen fremstilt fra ikke-varmebehandlete Leptospira bakteriner viser en økning i partikkelstørrelse som indikerer nedbryting av emulsjon.

Eksempel 5 viricidal analyse.

Ved å følge fremgangsmåten i eksempel 2 ble vaksiner fremstilt fra ikke-varmebehandlet Leptospira bakteriner og varmebehandlet Leptospira bakteriner. Etter 5 til 6 måneders aldring ble vaksine testet for viricidal aktivitet mot BHV-1 virus, PI3 virus og BRSV virus. Test for viricidal aktivitet ble utført ved å rehydrere monovalent viricidale analysekontroller (VAC), med adjuvanten fortynnet som skulle testes. To monovalente viricidale analysekontroller ble rehydrert ved hvert doseringsvolum. De to rehydrerte molovalenter VACer ble samlet og inkubert ved 20-25 °C i to timer før titrering og innokkulering på celler for å bestemme TCID5o(50 % vevskultur infektiv dosering), levende viral titer. Det er ikke tilfredsstillende å ha et viralt titertap på mer enn 0,7 TCID50/ml.

Resultatene av de viricidale analyser som viser viral titertap er angitt i tabellen nedenfor:

Vaksinen fremstilt med ikke-varmebehandlet Leptospira bakteriner viser høye nivåer av viricidal aktivitet. Vaksinen fremstilt med varmebehandlet Leptospira bakterin var ikke-viricidal.

Claims (12)

1. Varmebehandlet Leptospira bakterin for anvendelse i en emulsjonsvaksine,karakterisert vedat den omfatter en suspensjon av drepte bakterier som har en lipaseaktivitet på 50 % eller mindre enn lipaseaktiviteten av bakterinet før varmebehandling, hvor varmebehandlingen omfatter å varme bakterinet som har lipaseaktivitet til en temperatur av 60 til 70 °C i 5 til 10 timer.

2. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 1,karakterisert vedat nevnte varmebehandlete Leptospira bakterie fremstilles med en fremgangsmåte som omfatter å varme nevnte bakterin til en temperatur av 65 °C i 8 timer.

3. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisertved at nevnte drepte bakterier er en til fem Leptospira- arter valgt blant gruppen som består av Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, and Leptospira pomona.

4. Varmebehandlet bakterin i samsvar med ethvert av kravene 1-3,karakterisert vedat det ytterligere omfatter levende virus.

5. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 1,karakterisert vedat det ytterligere omfatter et lecitinpreparat, Quil A og kolesterol.

6. Varmebehandlet bakterin i samsvar med ethvert av kravene 1-3,karakterisert vedat det ytterligere omfatter drepte virus.

7. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 5,karakterisert vedat det ytterligere omfatter drepte virus.

8. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 4,karakterisert vedat de levende virus er en av tre virus valgt blant gruppen som består av bovin rinotraceitis (IBR) virus, parainfluensa 3 (PI3) virus og bovin respiratorisk synktial virus (BRSV).

9. Varmebehandlet bakterin i samsvar med krav 7,karakterisert vedat de drepte virus er en eller to virus valgt blant gruppen som består av Type 1 Bovin Viral Diarrhea (BVD) og Type 2 Bovine Viral Diarrhea (BVD).

10. En emulsjonsvaksine,karakterisert vedat den omfatter a) en olje og én eller flere emulgeringsmidler; og b) varmebehandlet Leptospira bakterin ifølge ethvert av kravene 1-9.

11. Fremgangsmåte for å fremstille et varmebehandlet Leptospira bakterin av emulsjonsvaksinen ifølge krav 10, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter trekkene: a) måle lipaseaktiviteten til bakterinet; b) varme bakterinet til en temperatur av 60 til 70 °C i 5 til 10 timer; c) måle lipaseaktiviteten av bakterinet etter varmebehandling; d) sammenligne lipaseaktiviteten av bakterinet før oppvarming med lipaseaktiviteten av bakterinet etter oppvarming; e) velge et varmebehandlet bakterin, hvor lipaseaktiviteten etter varmebehandling er 50 % eller mindre enn lipaseaktiviteten av bakterinet før varmebehandling.

12. En emulsjonsvaksine omfattende varmebehandlete Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, and Leptospira pomona bakteriner oppnådd med oppvarming til en temperatur av 65 °C i 8 timer, og ytterligere omfattende AMPHIGEN®, adjuvanter, konserveringsmidler og fortynningsmidler slik at konsentrasjonen av bakteriner er med 1200 NU/5 ml dose for alle Leptospira bakteriner med unntak av Leptospira hardjo som er med 2400 NU/ 5 ml dose, hvor emulsjonsvaksinen homogeniseres og mirkofluidiseres, og hvor pH deretter justeres til pH 7,0-7,3.