MX2009001849A - Bacterinas tratadas con calor, y vacunas de emulsion preparadas a partir de estas bacterinas tratadas con calor. - Google Patents

Abstract

Se describen bacterinas tratadas con calor, un método para producir bacterinas tratadas con calor y vacunas de emulsión preparadas a partir de estas bacterinas tratadas con calor.

Description

BACTERINAS TRATADAS CON CALOR. Y VACUNAS DE EMULSIÓN PREPARADAS A PARTIR DE ESTAS BACTERINAS TRATADAS CON CALOR CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere, en general, al campo de las vacunas y a métodos para estabilizar vacunas de emulsión. En particular, esta invención se refiere a bacterinas tratadas con calor, a un método para producir bacterinas tratadas con calor y a vacunas de emulsión preparadas a partir de estas bacterinas tratadas con calor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La vacunación se usa cada vez más para controlar las enfermedades infecciosas en animales. A menudo se usan adyuvantes en las vacunas debido a que pueden aumentar la respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas a menudo se formulan como emulsiones porque la emulsión puede actuar como un adyuvante, y tiene la propiedad de retener el antígeno como un depósito en el sitio de inyección. En las vacunas de emulsión comúnmente se usan emulsionantes. Aparte de usar emulsionantes, la estabilidad de las vacunas de emulsión también puede conseguirse reduciendo el tamaño de las gotas de la emulsión por medios mecánicos. La Patente de Estados Unidos N° 5.084.269 se refiere a una formulación adyuvante que contiene lecitina en combinación con aceite mineral, que produce menos irritación dentro del animal hospedador, y simultáneamente induce una mayor inmunidad sistémica. Las composiciones de acuerdo con la Patente de Estados Unidos 5.084.269 están en uso comercial con el nombre comercial AMPHIGEN®, una marca comercial de Pfizer, Inc. Generalmente, los antígenos bacterianos son inestables cuando se calientan e incluso una breve exposición a temperaturas elevadas puede reducir la actividad de los antígenos. Por ejemplo, las vacunas contra el ántrax actuales pueden perder toda la actividad biológica en 48 horas a 37°C (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, y R. Bhatnagar; Bioche. Biophys. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5): 1058-62).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a bacterinas tratadas con calor, a un método para producir bacterinas tratadas con calor y a vacunas de emulsión preparadas a partir de estas bacterinas tratadas con calor. El método comprende calentar la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C para formar una bacterina tratada con calor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la distribución del tamaño de las partículas de un análisis del tamaño de partículas de vacunas recién preparadas que contenían bacterinas de Leptospira no tratadas con calor el día 0. La Figura 2 muestra la distribución del tamaño de las partículas de un análisis del tamaño de partículas de vacunas que contenían bacterinas de Leptospira no tratadas con calor el día 60.

La Figura 3 muestra la distribución del tamaño de las partículas de un análisis del tamaño de partículas de vacunas recién preparadas que contenían bacterinas de Leptospira tratadas con calor el día 0. La Figura 4 muestra la distribución del tamaño de las partículas de un análisis del tamaño de partículas de vacunas que contenían bacterinas de Leptospira tratadas con calor el día 60.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Actividad antigénica aceptable - la expresión "actividad antigénica aceptable" significa la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en animales vacunados después de la exposición o pasando un ensayo de potencia codificado con organismos vivos homólogos. Bacterina - el término "bacterina" significa una suspensión de bacterias muertas que puede usarse como componente de una vacuna. Emulsionante - el término "emulsionante" significa una sustancia usada para obtener una emulsión más estable. Emulsión - el término "emulsión" significa una composición de dos líquidos inmiscibles en los que pequeñas gotas de un líquido se suspenden en una fase continua del otro líquido. Bacterina tratada con calor - la expresión "bacterina tratada con calor" significa una bacterina que se ha tratado con calor y que tiene una actividad lipasa de 50% o menor con respecto a la actividad lipasa antes del tratamiento con calor, y tiene actividad antigénica aceptable. Emulsión invertida - la expresión "emulsión invertida" significa una emulsión de agua en aceite. Lipasa - el término "lipasa" significa enzimas, esterasas, lipasas y fosfolipasas, que pueden producir la degradación de un emulsionante en una vacuna de emulsión. Emulsión normal - la expresión "emulsión normal" significa una emulsión de aceite en agua. Emulsión de aceite en agua - la expresión "emulsión de aceite en agua" significa una emulsión en la que pequeñas gotas de aceite están suspendidas en una fase acuosa continua. Temperatura ambiente - la expresión "temperatura ambiente" significa una temperatura de 18 a 25°C. Emulsión de agua en aceite - la expresión "emulsión de agua en aceite" significa una emulsión en la que gotas de agua están suspendidas en una fase oleosa continua. Esta invención se refiere a bacterinas con actividad lipasa reducida, a vacunas preparadas a partir de estas bacterinas, y a un método para reducir la actividad lipasa de bacterinas. Además de componentes antigénicos, algunas bacterinas tienen actividad lipasa. Cuando se incorporan bacterinas con actividad lipasa en una emulsión, la lipasa puede degradar los emulsionantes usados para crear la emulsión. Las vacunas de emulsión que contienen bacterinas que tienen alta actividad lipasa tienden a ser emulsiones inestables, y las que contienen bacterinas que tienen bajos niveles de lipasa tienden a ser estables. Los ejemplos de bacterias que, cuando están muertas, pueden producir bacterinas con actividad lipasa incluyen Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus luminescens, Propionibacterium acnés, Proteus vulgaris, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas Meóla, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, y la especie Leptospira, tales como los patógenos conocidos Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. La lipasa, que puede degradar los emulsionantes usados para crear la emulsión, y de esta manera producir inestabilidad y ruptura de la emulsión, puede incluir una o más enzimas de ruptura de la emulsión tales como esterasas, lipasas y fosfolipasas. Colectivamente, estas enzimas esterasas, lipasas y fosfolipasas reciben en nombre de lipasa. La actividad lipasa de una bacterina puede medirse usando un sustrato sintético denominado O-pivaloiloximetil umbeliferona (C-POM). La velocidad de hidrólisis producida por la lipasa es la medida de la actividad lipasa. La velocidad de reacción de la hidrólisis producida por la lipasa en esta reacción se controla por un aumento en la intensidad de fluorescencia del producto de la actividad lipasa. La velocidad de reacción depende de las condiciones exactas del ensayo de hidrólisis elegidas, de forma que las comparaciones de los niveles de actividad lipasa, medidos por las velocidades de hidrólisis, deben realizarse usando datos producidos por las mismas condiciones de ensayo. Se describen métodos bibliográficos en varios artículos, incluyendo Kurioka S., y Matsuda M. (1976) Ana. Biochem. 75: 281 -289, De Silva NS, y Quinn PA.(1987) J. Clin. Microbio!. 25: 729-731 , y Grau, A., y Ortiz, A. (1998) Chem. Phys. of Lipids. 91 : 109-1 18. En una vacuna de emulsión, la ruptura de la emulsión produce separación de fases de los componentes. Esto es indeseable porque cuando hay separación de fases, las dosis individuales retiradas del recipiente pueden no contener el mismo nivel de componentes de vacuna. Además, la pérdida de emulsión puede llevar a una pérdida de la actividad adyuvante del emulsionante y conducir a una reducción en el efecto antigénico de la vacuna. A menudo se introducen virus vivos atenuados en las vacunas junto con las bacterinas. Estas vacunas son útiles porque puede usarse una sola vacuna para crear inmunidad a diferentes enfermedades con una vacuna. Si en la bacterina está presente la actividad lipasa, producirá la liberación del emulsionante de la emulsión. Este emulsionante libre puede romper e inactivar los virus de vacuna vivos, ocasionando de esta manera una pérdida de infectividad viral. Una bacterina útil en vacunas puede formarse cultivando la bacteria de interés y después destruyendo la bacteria para producir una bacterina que contiene una diversidad de componentes bacterianos, incluyendo componentes de la pared celular. La bacteria puede destruirse por una diversidad de métodos que incluyen su exposición a un compuesto tal como mertiolato, formalina, formaldehído, dietilamina, etilenamina binaria (BEI), beta propiolactona (BPL) y glutaraldehído. Pueden usarse combinaciones de estos compuestos. Además, es posible destruir las bacterias con radiación de esterilización. Ahora se ha descubierto que la actividad lipasa de una bacterina que tiene esta actividad lipasa puede reducirse por tratamiento con calor. Específicamente, la actividad lipasa de una bacterina puede reducirse calentando la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C para formar una bacterina tratada con calor, que tiene una actividad antigénica aceptable. El tratamiento con calor se realiza durante un periodo de tiempo suficiente para que la actividad lipasa de la bacterina tratada con calor sea 50% o menor con respecto a la encontrada en la bacterina antes del tratamiento con calor. Para conseguir una buena estabilidad en una vacuna de emulsión, no es necesario que la actividad lipasa se reduzca a cero. Se ha descubierto que pueden prepararse vacunas con una buena vida útil a partir de bacterinas tratadas con calor que tienen un nivel de actividad lipasa que es 50% o menor con respecto al nivel de actividad lipasa antes del tratamiento con calor. Cuando se ha usado una velocidad de hidrólisis de un sustrato de ensayo como medida de la actividad lipasa de una bacterina, la velocidad de hidrólisis del sustrato de ensayo antes del tratamiento con calor se compara con la velocidad de hidrólisis después del tratamiento con calor. El tratamiento con calor se realiza para reducir la velocidad de hidrólisis a 50% o menos con respecto a la velocidad de hidrólisis que se observa para la bacterina sin tratamiento. El método exacto para medir el nivel de actividad lipasa no es crítico siempre que se use el mismo método para medir la actividad antes del tratamiento con calor y la actividad después del tratamiento con calor. Por ejemplo, si la velocidad de hidrólisis de un sustrato de ensayo se mide usando un sustrato, un sustrato diferente produciría una velocidad diferente. Sin embargo, si se usa el mismo sustrato para la determinación de la actividad inicial y la determinación de la actividad después del tratamiento, las velocidades relativas mostrarán el efecto del tratamiento con calor. Para las bacterinas que comprenden uno o más de los siguientes Leptospira canteóla, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa o Leptospira pomona, hay un ensayo codificado para la actividad antigénica (9CFR §113.101 , §1 13.102, §1 13.103, §1 13.104 y §1 13.105). Para estas especies, una actividad antigénica aceptable se define como la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en hámsters vacunados de tal forma que cuando los hámsters se exponen a bacterias vivas homólogas, al menos 75% de los hámsters vacunados sobrevivan en un modelo en el que al menos 80% de los hámsters no vacunados no sobreviven. En caso del antígeno Leptospira hardjo, una actividad antigénica aceptable se define como la capacidad de una vacuna de inducir una titulación media geométrica de aglutinación serológica contra Leptospira hardjo de D40 en terneros que se han vacunado con una vacuna que comprende el antígeno bacteriano, Leptospira hardjo. Para otras bacterinas, una actividad antigénica aceptable se define como la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora en animales vacunados después de la exposición o pasando un ensayo de potencia codificado con un organismo vivo homólogo.

El tratamiento con calor puede realizarse en un intervalo de temperaturas, y durante un periodo de tiempo variable. Generalmente, el calentamiento puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C durante un periodo de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas. Cuando la bacterina se calienta a una temperatura superior, tal como de aproximadamente 75 a aproximadamente 80°C, el tiempo de calentamiento está en el extremo inferior del intervalo de tiempo. Cuando el calentamiento se realiza a una temperatura inferior, el calentamiento se realiza durante un periodo de tiempo mayor. Otra combinación de temperatura y tiempo es el calentamiento a una temperatura de aproximadamente 60 a aproximadamente 70°C durante un periodo de aproximadamente 9 a aproximadamente 10 horas. Otra combinación de temperatura y tiempo es el calentamiento a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 70°C durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 horas. Otra combinación de temperatura y tiempo es el calentamiento a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 70°C durante aproximadamente una hora. Otra combinación de temperatura y tiempo es el calentamiento a una temperatura de aproximadamente 55 a aproximadamente 65°C durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 horas. Las bacterinas, después del tratamiento con calor, tienen una actividad lipasa menor que las bacterinas recién preparadas, pero por lo demás pueden formularse de la misma manera que las bacterinas recién preparadas. Por consiguiente, las bacterinas tratadas con calor pueden incorporarse en vacunas por métodos habituales de producción de vacunas. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Pueden formarse vacunas de emulsión combinando la bacterina deseada con una fase oleosa y uno o más emulsionantes. La combinación después se somete a agitación intensa para formar una emulsión. Los métodos de agitación adecuados incluyen homogeneización y posteriormente microfluidización. También pueden incluirse conservantes y excipientes en la combinación antes de la emulsión. Las vacunas pueden incluir tanto bacterinas como antígenos virales. Para preparar una vacuna que incluye bacterinas y antígenos virales, las bacterinas, cualquier antígeno viral que se vaya a incluir, el emulsionante o los emulsionantes, y opcionalmente conservantes y excipientes, se combinan con una fase oleosa y se emulsionan. Después de la formación de la emulsión, el pH de las formulaciones puede ajustarse a un pH apropiado usando soluciones de NaOH o HCI. Para el uso en vacunas, generalmente es deseable que el pH esté próximo al neutro para evitar la irritación en el sitio de inyección. Es común un valor de pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,3. Las fases oleosas adecuadas para la formación de vacunas de emulsión incluyen aceites no metabolizables y aceites metabolizables. Los aceites no metabolizables incluyen aceites minerales tales como aceite mineral blanco y aceite mineral ligero. Los aceites metabolizables incluyen aceites vegetales, aceites de pescado y glicéridos de ácidos grasos sintéticos. Son ejemplos de emulsionantes que pueden usarse en la preparación de vacunas de emulsión de esta invención fosfolípidos, ésteres de sorbitano, ésteres de sorbitano polietoxilados y derivados de manitol que son emulsionantes de vacuna comunes. Los emulsionantes fosfolípidos incluyen lecitina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y lecitina, (por ejemplo, tal como AMPHIGEN®). Los emulsionantes de éster de sorbitano incluyen monolaurato de sorbitano, (por ejemplo, Span® 20 y Arlacel® 20), monooleato de sorbitano (por ejemplo, Span® 80 y Arlacel® 80), monopalmitato de sorbitano (por ejemplo, Span® 40 y Arlacel® 40) y monoestearato de sorbitano (por ejemplo, Span® 60 y Arlacel® 60). Los ésteres de sorbitano polietoxilados incluyen monolaurato de polietoxi sorbitano (por ejemplo Tween® 20 y Tween® 21), monooleato de polietoxi sorbitano (por ejemplo, Tween® 80), monopalmitato de polietoxi sorbitano (por ejemplo, Tween® 40) y monoestearato de polietoxi sorbitano (por ejemplo, Tween® 60). Los emulsionantes que son derivados de manitol incluyen éteres octadecanoicos de manitol. Span®, Arlacel® y Tween® son marcas comerciales de ICI Amencas. AMPHIGEN® es una marca comercial de Pfizer, Inc. En general, las vacunas se formulan como emulsiones normales de aceite en agua, aunque es posible preparar emulsiones invertidas de agua en aceite. En las vacunas puede usarse una diversidad de adyuvantes tales como Quil A, colesterol, fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio, y conservantes tales como mertiolato. Quil A es una mezcla purificada de saponinas de quillaja extraídas a partir de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina. Quil A actúa directamente sobre el sistema inmune activando un estado de sensibilidad generalizado. Al hacer esto, induce tanto una respuesta humoral como una respuesta mediada por células. La cadena lipófila permite la interacción del antígeno y el adyuvante a administrar en el citosol para el procesamiento en una ruta endógena. Quil A a menudo se usa con colesterol porque el colesterol elimina los efectos secundarios menos deseables cuando se añade en las proporciones apropiadas. El colesterol forma complejos insolubles con Quil A formando estructuras de tipo helicoidal cuando el colesterol se une a Quil A, exponiendo de esta manera las unidades de azúcar de la molécula que ayudan a estimular la respuesta inmune. Es común añadir antígenos virales a vacunas que contienen bacterinas. Una ventaja de esta estrategia es que una vacuna puede usarse para crear inmunidad contra varias enfermedades en lugar de requerir dosificaciones de varias vacunas diferentes para conseguir el mismo resultado. En las vacunas pueden usarse tanto virus muertos como virus vivos atenuados. Entre los virus que pueden usarse se encuentran los herpesvirus aviares, herpesvirus bovinos, herpesvirus caninos, herpesvirus equinos, virus de la rinotraqueítis viral felina, virus de la enfermedad de Marek, herpesvirus ovinos, herpesvirus porcinos, virus de la seudorrabia, paramixovirus aviares, virus sincitial respiratorio bovino, virus del moquillo canino, parainfluenzavirus canino, parainfluenza 3 bovino, parainfluenza 3 ovino, Rinderpest virus, virus de la enfermedad de Border, virus de la diarrea viral bovina (BVD), virus de la fibre porcina clásica, virus de la leucosis aviar, virus de la inmunodeficiencia bovina, virus de la leucemia bovina, virus de la anemia infecciosa equina, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la leucemia felina, virus de la neumonía progresiva ovina, virus de adenocarcinoma pulmonar ovino, coronavirus canino, coronavirus bovino, coronavirus entérico felino, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la encefalomielitis de hemaglutinación porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, coronavirus de pavo, virus de la fiebre efímera bovina, rabia, virus de la estomatitis vesicular, influenza aviar, influenzavirus equino, influenzavirus porcino, influenzavirus canino, virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina venezolana y virus de la encefalitis equina occidental.

Si en la bacterina está presente la actividad lipasa, puede provocar la liberación del emulsionante de la emulsión. Este emulsionante libre puede romper la envuelta del virus vivo e inactivar los virus vivos de la vacuna conduciendo de esta manera a una pérdida de infectividad viral. Por consiguiente, el tratamiento con calor de la bacterina sirve para estabilizar la emulsión y conservar su efecto adyuvante, así como para conservar la infectividad viral de los virus. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada.

PROCEDIMIENTOS Procedimiento 1 Determinación de Turbidez La turbidez se determina en unidades nefelometrías (NU) por un método de dispersión de luz. La intensidad de la luz dispersada por la muestra en condiciones definidas se compara con la intensidad de la luz dispersada por una suspensión de referencia convencional. Cuanto mayor es la intensidad de la luz dispersada, mayor es la turbidez de la muestra. Se dirige una fuente de luz a la muestra y la dispersión de la luz se mide a 90° con respecto a la dirección de la fuente luminosa. El instrumento se calibra midiendo la dispersión de la luz desde una suspensión de formazina. Calibración del Instrumento Nefelómetro Se prepara agua ultrafiltrada filtrando agua destilada a través de un filtro de membrana que tiene un tamaño de poros de 0,2 µ?t Se prepara una primera solución disolviendo 1 ,00 g de sulfato de hidrazina, (NH2) H2S04, en agua ultrafiltrada y se diluye con agua ultrafiltrada hasta 100 mi, en un matraz aforado. Se prepara una segunda solución disolviendo 10,00 g de hexametilentetramina en agua ultrafiltrada y se diluye con agua ultrafiltrada hasta 100 mi, en un matraz aforado. Se prepara una suspensión de formazina mezclando 5,0 mi de la primera solución con 5,0 mi de la segunda solución. La mezcla se deja en reposo durante 24 horas a aproximadamente 24°C. La mezcla se diluye hasta 100 mi con agua ultrafiltrada para formar una suspensión madre de turbidez con una turbidez de 400 NU. Se prepara una suspensión de turbidez de formazina de 40 NU diluyendo 10,00 mi de la suspensión madre de turbidez hasta 100 mi con agua ultrafiltrada. Se preparan soluciones de calibración adicionales diluyendo la solución madre. Medición de Turbidez La muestra a medir se diluye con agua ultrafiltrada de manera que la turbidez esté dentro del intervalo calibrado del nefelómetro. Se mide la turbidez y la turbidez original se calcula usando la siguiente ecuación: M x (D + 0) Turbidez Original en NU = — en la que: M es la turbidez de la muestra diluida en NU D es el volumen de agua de dilución, en mi O es el volumen de la muestra original, en mi. Procedimiento 2 Análisis de Lipasa La actividad lipasa se determinó usando O-pivaloximetilumbeliferona como sustrato fluorogénico. La hidrólisis catalizada por lipasa de este sustrato no fluorescente produce un hidroximetil éter, que es inestable en condiciones acuosas. La descomposición del hidroximetil éter inestable genera formaldehído y el producto de umbeliferona fluorescente. El control de la intensidad de fluorescencia de la umbeliferona producida, en función del tiempo, proporciona una medida cinética sensible de esta actividad enzimática lipasa. Se prepararon soluciones de O-pivaloximetilumbeliferona (Molecular Probes, n° de producto P35901 ) en DMSO puro, a una concentración de solución madre de 5 mM; la solución no usada se almacenó a -20°C, protegida de la luz. La solución de O-pivaloximetilumbeliferona 5 mM se diluyó a 750 µ? usando tampón TIRIS-HCI 58 mM (pH 8,0), y la solución resultante se precalentó a 37°C. La muestra de Leptospira o el tampón/medio de control se centrifugó durante 10 minutos a temperatura ambiente a 6500 veces la fuerza de la gravedad para formar un sedimento y un sobrenadante. Las reacciones se realizaron combinando 15 µ? de tampón TRIS-HCI 100 mM (pH 8,0) con 15 µ? del sobrenadante a temperatura ambiente de la muestra de Leptospira o el tampón/medio de control, en pocilios de ensayo de placas de 96 pocilios de bajo volumen (Corning 3393, superficie sin unión de poliestireno negro, semiárea); preincubando durante 10 minutos a 37°C; y después iniciando la reacción por la adición de 20 µ? de O-pivaloximetilumbeliferona 750 µ? o el tampón/medio de control. Las mezclas de reacción resultantes contenían tampón TRIS-HCI 53 mM (pH 8,0) y O-pivaloximetilumbeliferona 0 ó 300 µ?. Se midió la intensidad de fluorescencia a intervalos de 30-45 segundos durante un periodo de una hora (Spectramax Gemini XS, 37°C, Dex = 360 nm, Dem = 460 nm, sensibilidad PMT 'media', 6 lecturas por pocilio). La velocidad de reacción se determinó a partir de la pendiente de la curva de progreso resultante.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Reducción de Actividad Lipasa por Tratamiento con Calor Se preparó un conjunto de leptospira inactivada con mertiolato que contenía las siguientes especies Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo y Leptospira pomona para formar una bacterina. Se almacenaron durante una noche seis muestras de la bacterina (aproximadamente 12 horas) a 4°C, 37°C, 45°C, 56°C, 65°C y 80°C. La muestra almacenada a 4°C sirvió como control no tratado. Las muestras almacenadas durante 12 horas a 37°C, 45°C, 56°C, 65°C y 80°C eran muestras tratadas con calor. Después del almacenamiento, la velocidad a la que se hidrolizó un sustrato de ensayo en presencia de cada bacterina se midió de acuerdo con el método del Procedimiento 2. La velocidad de hidrólisis para una muestra dividida por la velocidad de hidrólisis de la muestra almacenada a 4°C multiplicado por 100 es el porcentaje de la actividad lipasa original de cada bacterina que queda después del almacenamiento. El siguiente diagrama muestra la temperatura de almacenamiento y el porcentaje de actividad lipasa original que queda después del almacenamiento.

Temperatura de Almacenamiento 4°C 37°C 45°C 56°C 65°C 80°C (12 horas) Porcentaje de Actividad Lipasa 100% 55,4% 32,5% 15,7% 10,8% 8,4% Original Ejemplo 2 Preparación de Formulaciones de Vacuna Experimentales Se realizaron cultivos de Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo y Leptospira pomona. La turbidez de cada cultivo se midió en unidades nefelométricas (NU). Las bacterias se inactivaron con mertiolato para formar bacterinas. Cada bacterina se trató con calor a 65°C durante 8 horas para reducir la actividad lipasa. Las bacterinas se combinaron y después se mezclaron con AMPHIGEN®, adyuvantes, conservantes y tampón de dilución de forma que cada dosis de 5 mi de la vacuna contenía los componentes indicados en el siguiente diagrama.

Concentraciones de Antígenos La formulación se homogeneizó usando un homogeneizador Silverson y se microfluidizó usando un microfluidizador de Microfluidics. Después de la homogeneización y de la microfluidización, el pH de la formulación se ajustó a un valor de 7,0 a 7,3.

Ejemplo 3 Ensayo de Potencia en Hámsters y Vacas La vacuna del Ejemplo 2 se administró a hámsters y vacas para ensayar la potencia usando modelos de animales hospedadores y de laboratorio convencionales. Los hámsters de ensayo después se expusieron a una dosis de Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotyphosa o Leptospira Pomona para ensayar la potencia de las vacunas. El número de supervivientes se midió como una demostración de la eficacia. Se midieron titulaciones de aglutinación microscópica bovina contra Leptospira hardjo para demostrar la potencia de esa fracción de la vacuna en vacas. La tabla presentada a continuación demuestra que las vacunas preparadas a partir de bacterinas de Leptospira tratadas con calor pueden producir una respuesta antigénica que pasa los criterios de eficacia.

Ejemplo 4 Ensayo Fisicoquímico de Vacunas Se preparó una vacuna a partir de bacterinas de Leptospira tratadas con calor de acuerdo con el método del Ejemplo 2. Se preparó una vacuna similar a partir de bacterinas de Leptospira no tratadas con calor de acuerdo con el método del Ejemplo 2. Las dos formulaciones de vacuna se almacenaron a 4°C durante 60 días. Se realizó un análisis del tamaño de las partículas para cada vacuna recién preparada el día 0 y de nuevo a los 60 días usando un difractómetro láser. Los diagramas presentados en las Figuras muestran distribuciones de tamaños de las partículas para cada vacuna el día 0 antes y después del almacenamiento durante 60 días. La vacuna preparada a partir de bacterinas de Leptospira tratadas con calor muestra una retención del tamaño de las partículas que indica estabilidad de la emulsión. La vacuna preparada a partir de bacterinas de Leptospira no tratadas con calor muestra un aumento del tamaño de las partículas que indica ruptura de la emulsión.

Ejemplo 5 Ensayo Viricida Siguiendo el método del Ejemplo 2, se prepararon vacunas a partir de bacterinas de Leptospira no tratadas con calor y bacterinas de Leptospira tratadas con calor. Después de 5 a 6 meses de maduración, las vacunas se ensayaron con respecto a la actividad viricida contra virus BHV-1 , virus PI3 y virus BRSV. El ensayo de la actividad viricida se realizó rehidratando controles de ensayo viricida (VAC) monovalentes, con el diluyente con adyuvante a ensayar. A cada volumen de dosificación se rehidrataron dos controles de ensayo viricida monovalentes. Los dos VAC monovalentes rehidratados se reunieron e incubaron a 20-25°C durante dos horas antes de la titulación e inoculación en células para determinar, por medio de la TCID50 (dosis infecciosa de cultivo tisular de 50%), la titulación de virus vivos. No es satisfactorio tener una pérdida de titulación viral mayor de 0,7 TCID50/ml. En la siguiente tabla se indican los resultados de los ensayos viricidas que muestran una pérdida de titulación viral: La vacuna realizada con bacterinas de Leptospira no tratadas con calor muestra altos niveles de actividad viricida. La vacuna preparada con bacterinas de Leptospira tratadas con calor no era viricida.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. - Una bacterina tratada con calor, que comprende una suspensión de bacterias muertas que tienen una actividad lipasa de 50% o menos con respecto a la actividad lipasa de la bacterina antes del tratamiento con calor. 2. - Una bacterina tratada con calor de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el tratamiento con calor comprende calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C durante un periodo de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas. 3. - Una bactenna tratada con calor de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el tratamiento con calor comprende calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 60 a aproximadamente 70°C durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 horas. 4. - Una bacterina tratada con calor de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el tratamiento con calor comprende calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 70°C durante un periodo de aproximadamente 9 a aproximadamente 8 horas. 5. - Una bacterina tratada con calor que comprende una suspensión de bacterias muertas de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el tratamiento con calor comprende: calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 70°C durante aproximadamente 1 hora. 6. - Una bacterina tratada con calor que comprende una suspensión de bacterias muertas de acuerdo con la reivindicación 1 , donde el tratamiento con calor comprende: calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 55 a aproximadamente 65°C durante un periodo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 horas. 7. - Una bacterina tratada con calor que comprende una suspensión de bacterias muertas de acuerdo con la reivindicación 2, donde las bacterias muertas son de una a cinco especies de Leptospira seleccionadas entre el grupo compuesto por Leptospira canteóla, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. 8. - Una vacuna que comprende una emulsión y una bacterina tratada con calor de acuerdo con la reivindicación 2. 9. - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además virus vivos. 10.- Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además una preparación de lecitina, Quil A y colesterol. 1 - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además virus muertos. 12. - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende además virus muertos. 13. - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 9, donde los virus vivos son de uno a tres virus seleccionados entre el grupo consistente en el virus de la rinotraqueítis bovina (IBR), virus de la parainfluenza 3 (PI3) y virus sincitial respiratorio bovino (BRSV). 14.- Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, donde los virus vivos son de uno a tres virus seleccionados entre el grupo consistente en el virus de la rinotraqueítis bovina (IBR), virus de la parainfluenza 3 (PI3) y virus sincitial respiratorio bovino (BRSV). 15. - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 14, donde los virus muertos son uno o dos virus seleccionados entre el grupo consistente en el virus de la Diarrea Viral Bovina (BVD) de Tipo 1 y el virus de la Diarrea Viral Bovina (BVD) de tipo 2. 16. - Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende además una preparación de lecitina en aceite, Quil A y colesterol. 17. - Un método para preparar una bacterina tratada con calor, que comprende calentar una bacterina que tiene actividad lipasa a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C durante un periodo de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas. 18. - Un método para preparar una bacterina tratada con calor, que comprende a) medir la actividad lipasa de la bacterina; b) calentar la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C durante un periodo de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas; c) medir la actividad lipasa de la bacterina después del tratamiento con calor; d) comparar la actividad lipasa de la bacterina antes de calentar con la actividad lipasa después de calentar; e) seleccionar una bacterina tratada con calor, donde la actividad lipasa después del tratamiento con calor es 50% o menos de la actividad lipasa de la bacterina antes del tratamiento con calor. 19.- Un método de acuerdo con la reivindicación 17, donde la bacterina comprende una suspensión de una a cinco especies de Leptospira muertas seleccionadas entre el grupo consistente en Leptospira canteóla, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. 20. - Un método de acuerdo con la reivindicación 18, donde la bacterina comprende una suspensión de una a cinco especies de Leptospira muertas seleccionadas entre el grupo consistente en Leptospira canteóla, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae y Leptospira pomona. 21. - Una bacterina tratada con calor preparada: a) formando una bacterina que tiene actividad lipasa; y b) calentando la bacterina a una temperatura de aproximadamente 35 a aproximadamente 80°C durante un periodo de tiempo suficiente para reducir la actividad lipasa a un nivel de 50% o menor con respecto al nivel antes del tratamiento con calor. 22. - Una bacterina de acuerdo con la reivindicación 21 , donde el periodo de tiempo suficiente para reducir la actividad lipasa a un nivel de 50% o menor con respecto al nivel antes del tratamiento es de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas.