NO334713B1

NO334713B1 - In vitro-fremgangsmåte for inhibering av endotelcelledeling, -overlevelse eller angiogenese, anvendelse av en Bv8-polypeptidantagonist, fremgangsmåte for identifisering av en Bv8-antagonist, Bv8-antagonist og sammensetning omfattende nevnte antagonist.

Info

Publication number: NO334713B1
Application number: NO20120612A
Authority: NO
Inventors: Napoleone Ferrara; Jennifer Lecouter
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2001-08-29
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2014-05-12
Also published as: NO20120612L; EP2311960A2; WO2003020892A2; HK1065565A1; AU2002332732B2; EP1427830A4; ZA200401001B; US20060204510A1; US20070244063A1; MXPA04001720A; EP2311960A3; KR100942880B1; CA2458670A1; US7060278B2; KR101008734B1; US20030092623A1; EP1427830A2; KR20040030166A; JP4361791B2; NO332445B1

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for anvendelse av Bv8-polypeptider for å indusere endotelisk celledeling og for å forsterke endotelisk celleoverlevelse. Også tilveiebrakt heri er fremgangsmåter for å screene modulatorer av Bv8-aktivitet. Videre er det tilveiebrakt anvendelser av Bv8-polypeptider for fremstilling av medikamenter og sammensetninger for behandling.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår generelt fremgangsmåter, sammensetninger og analyser som bruker Bv8, et protein med mitogene aktiviteter.

Endotelceller

Det lokale mikromiljøet påvirker i betydelig grad fenotypen og vekstegenskapene for vaskulære endotelceller på en vevs- eller organspesifikk måte, men de lokale instruktive signalers natur eller beskaffenhet er stort sett ukjent. Det er sterke indikasjoner på at den vaskulære endotelvekstfaktoren (VEGF) og angiopoietingruppen eller -familien av endotelcellespesifikke vekstfaktorer er vesentlige for embryoutvikling og for angiogenese under en rekke forskjellige fysiologiske og patologiske omstendigheter (Ferrara og Alitalo, Nature Medicine, 5: 1359-1364 (1999); Carmeliet, Nature Medicine. 6: 389-395 (2000)). Det er også sterke indikasjoner eller bevis for en lokal vevsspesifikk regulering av endotelcellefenotype og vekst (Aird et al., J. Cell Biol.. 138: 1117-1124 (1997); Stewart og Wiley, Dev. Biol.. 84: 183-192 (1981)). De morfologiske og funksjonelle egenskapene for endotelceller varierer svært sterkt fra organ til organ (Simionescu og Simionescu, Cell and Tissue Biology. Urban and Schwarzenberg, Baltimore, (1988) sidene 355-398). Det har også vist seg at selve anvendelsesstedet i høy grad bestemmer egenskapene for de nye kar som dannes i enda større grad enn den testede typen av angiogen faktor (Dellian et al., Am. J. Pathologv. 149: 59-71

(1996); Roberts et al., Am. J. Pathologv. 153: 1239-1348 (1998)). Den molekylære basisen for denne påvirkningen fra det lokale mikromiljøet på egenskapene for vaskulaturen er ukjent, men det er antatt at spesialiserte stroma spiller en viktig rolle (Dellia, supra). Det er mulig å anta at et integrert nettverk av stimuli som kan innbefatte vevs spesifikke utskilte proteiner i tillegg til cellulære og ekstracellulære matrisekomponenter, fungerer slik at de bestemmer struktur og funksjon så vel som at de modulerer veksten av det tilstedeværende endotelium.

Det er således et løpende behov for å identifisere og karakterisere faktorer som påvirker veksten og/eller differensieringen av endotelceller. I tillegg til å øke vår kunnskap om utviklingen av vaskulaturen, så vil slike forbindelser kunne brukes ved diagnose og behandling av tilstander som er assosiert med vaskulært vev.

Hormonutskillende celler

Skjønt det har vært en betydelig utvikling både innenfor vitenskap og medisinsk terapi, så er det ikke desto mindre stadig et behov for nye behandlinger for samfunnets medisinske lidelser og tilstander. En fremgangsmåte for å finne nye behandlingsmetoder har vært å undersøke hvordan organismen virker. Av spesiell interesse er det å forstå hvorledes signaliserende celler kontrollerer organismens atferd. For eksempel vil endokrine celler utskille signaliserende molekyler som kalles hormoner og hvor en manglende eller sviktende sekresjon av disse hormonene kan føre til en rekke lidelser og sykdommer.

Celler som er spesialisert for sekresjon av hormoner innbefatter gonadeceller som skiller ut testosteron (Leydigs celle i testiklene), østrogen (theca interna-cellene i eggstokkfollikelen) og progesteron (corpus luteum-celle i den brutte eggstokkfollikelen). Skjønt det er en rekke forskjellige behandlingsterapier innen medisinen som anvender eksogen administrering av testosteron, østrogen og progesteron, så er det ikke desto mindre et behov for å regulere disse cellene som produserer disse hormonene.

Andre celler som er spesialiserte for hormonsekresjon innbefatter cellene i binyrene og cellene i fordøyelsessystemet. For eksempel så skiller cellene i binyrene ut et epinefrin, norepinefrin og steroidhormoner så som mineralkortikoider og glukokortikoider. Av spesiell interesse er kortisol som produseres i binyrebarken og som påvirker metabolismen i mange forskjellige celler. Celler i fordøyelsessystemet innbefatter celler i pankreas som skiller ut insulin. Insulin skilles ut av de Langerhanske øyer og er helt vesentlig for karbohydratmetabolismen. Insulin brukes ved behandling og kontroll av diabetes mellitus, men det er ikke desto mindre stadig et behov for effektive behandlinger for lidelser av denne typen. Andre hormoner av interesse forefinnes i svelget og luftveiene og innbefatter serotonin, endorfin, somatostatin, gastrin, sekretin, cholecystokinin, glukagon og bombesin.

Det er en rekke forskjellige sykdommer og lidelser som er assosiert med hormonutskillende celler, da spesielt steroidogene endotelceller inne i endokrine kjertler. Det vil derfor være ønskelig å kunne identifisere vekstfaktorer som spesifikt påvirker slike endotelceller. Slike endotelcellespesifikke vekstfaktorer ville være meget verdifulle redskaper for å kunne diagnostisere og behandle sykdommer som er assosiert med slike celletyper, og for å kunne identifisere ytterligere medikamentkandidater som kan brukes ved diagnose og behandling av slike sykdommer.

Bv8

Bv8 er et lite protein som opprinnelig ble isolert fra hudsekresjoner hos frosken Bombina variegata (Mollay et al. Eur. J. Pharmacol. 374: 189-196 (1999)). Bv8 viser mer enn 40% identitet med MIT-1, et lite protein som finnes i giften fra svart mamba og som har vist seg å være meget virkningsfullt for å indusere sammentrekning i tarmkanalen (Schweitz et al. FEBS Lett. 461: 183-188 (1999)). Flere pattedyrhomologer av Bv8 er blitt klonet fra mus og mennesker og har vist seg å ha identiske aminoterminale sekvenser (Wechselberger et al. FEBS Lett. 462: 177-181 (1999)). På samme måte som MIT-1, så har det humane Bv8 vist seg å kunne indusere en sterk sammentrekning av de glatte musklene i tarmkanalen med en EC5o-verdi det subnanomolare området (Li et al. Mol. Pharm. 59: 692-698 (2001)). To former av Bv8 er blitt identifisert i mennesker, og det lengre formen reflekterer et nærvær av et alternativt spleiset ekson. Den lengre formen av det humane Bv8 er ca 78% homologt og 58% identisk med VRPA, og er beskrevet i U.S. patentsøknad nr. 09/886,242.

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på identifikasjonen av nye aktiviteter av Bv8. Spesielt har man funnet at Bv8 induserer celledeling hos endotelceller, fremmer overlevelsen og livslengden for endotelceller og fremmer angiogenese. Som detaljert beskrevet i det etterfølgende, kan Bv8-nukleinsyrer og -polypeptider brukes i en rekke forskjellige prøver og i diagnose og behandling av tilstander som er assosiert med endotelceller.

I ett aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en in vitro-fremgangsmåte for å inhibere deling av endotelceller, overlevelse av endotelceller eller angiogenese som omfatter å kontakte celler med en antagonist av et Bv8-polypeptid som har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller, eller indusere angiogenese, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

Det naturlige sekvens Bv8-polypeptidet er fortrinnsvis et naturlig humant Bv8-polypeptid. Det naturlige humane Bv8-polypeptidet kan omfatte den aminosyresekvensen som er angitt med SEKV.ID. NR. 2, eller aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 4.1 en annen utførelse omfatter det naturlige sekvens Bv8-aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 6.1 en annen utførelse er Bv8 i stand til heparinbinding. I en utførelse er cellene endotelceller, mer foretrukket steroidogene endotelceller så som cellene i en steroidogen kjertel.

I en utførelse er nevnte Bv8 et naturlig sekvens Bv8-polypeptid. Det er foretrukket at det naturlige sekvens Bv8-polypeptidet er et naturlig humant Bv8-polypeptid. Det naturlige humane Bv8-polypeptidet kan omfatte aminosyresekvensen fra SEKV.ID. NR. 2, eller aminosyresekvensen fra SEKV.ID. NR. 4.1 en annen utførelse vil det naturlige sekvens Bv8 omfatte aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 6, og i en annen utførelse er nevnte Bv8 heparinbindende.

I en utførelse er cellene endotelceller, mer foretrukket steroidogene endotelceller så som cellene i en steroidogen kjertel.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en antagonist av Bv8-polypeptidet som har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR:4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere celledeling for endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller eller indusere angiogenese, for fremstillingen av et medikament for behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling, for behandling av tumor eller cancer, eller regulering av fertilitet hos et pattedyr, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

En antagonist av Bv8-polypeptidet anvendt i følge oppfinnelsen kan fortrinnsvis administreres til et pattedyr i en tilstrekkelig mengde til å behandle tilstanden. I en ytterligere utførelse omfatter medikamentet fremstilt i følge anvendelsen en antagonist av VEGF. Nevnte pattedyr er fortrinnsvis et menneske.

I en utførelse er Bv8 heparinbindende. I en annen utførelse er nevnte Bv8 et naturlig sekvens Bv8-polypeptid. Det naturlige sekvens Bv8-polypeptidet er fortrinnsvis et naturlig humant Bv8-polypeptid. Sistnevnte kan omfatte aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 2 eller aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 4.1 en annen utførelse omfatter det naturlige sekvens Bv8-aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 6.

I en utførelse av anvendelsen tilveiebringes et medikament for å behandle cancer i celler som reagerer overfor Bv8 i et pattedyr, fortrinnsvis et menneske. En Bv8-antagonist kan administreres i en tilstrekkelig mengde til at man effektivt får behandlet canceren. I en utførelse er canceren en hormonavhengig cancer. I en annen utførelse er nevnte cancer en testikkelcancer.

I en utførelse av anvendelsen i følge oppfinnelsen tilveiebringes et medikament for å behandle cancer i reproduksjonsorganene hos pattedyr, og da fortrinnsvis mennesker. En Bv8 antagonist kan administreres til et pattedyr i en tilstrekkelig mengde til effektivt å behandle canceren. Canceren er fortrinnsvis en cancer i testiklene.

Det beskrives videre en fremgangsmåte for å behandle et pattedyr for en tilstand som er assosiert med for omfattende, uønsket eller ukontrollert angiogenese. En antagonist kan administreres i en tilstrekkelig mengde til effektivt å behandle sykdommen. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske.

I en utførelse av anvendelsen i følge oppfinnelsen tilveiebringes et medikament for å regulere fruktbarhet hos et pattedyr. I en utførelse er pattedyret et menneske. En Bv8-antagonist kan administreres til pattedyret i en mengde som effektivt regulerer fruktbarheten.

Det beskrives også en fremgangsmåte for å behandle en steroid hormonavhengig lidelse hos et pattedyr, hvor fremgangsmåten omfatter å administrere Bv8 eller en agonist eller antagonist av denne til pattedyret i en mengde som effektivt behandler den steroide hormo na vhengige lidelsen. Det er foretrukket at pattedyret er et menneske. Den steroidhormonavhengige lidelsen er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av lipoid kongential adrenal hyperplasi, ufruktbarhet, seksuell modning, androgenavhengige tumorer, førmoden pubertet, McCune-Albright syndrom, kongenitiv binyrehypoplasi og hypogonadotropisk hypogonadisme.

Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å identifisere en Bv8-antagonist som omfatter a) å kontakte et kandidatmolekyl med et Bv8-polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 80 prosent identitet med SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, b) bestemme polypeptidets evne til å fremme endotelcelledeling, endotelcelleoverlevelse, eller angiogenese, og c) identifisere et kandidatmolekyl som inhiberer endotelcelledelingsaktiviteten, endotelcelleoverlevelsesaktiviteten, eller angiogeneseaktiviteten for polypeptidet som en antagonist for Bv8, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff eller et antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment. I en utførelse blir en Bv8-antagonist identifisert ved at den hemmer Bv8 sin evne til å stimulere endotelcelledeling. I en annen utførelse blir en Bv8-antagonist identifisert ved dens inhibering av Bv8 sin evne til å fremme endotelcelleoverlevelse.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en antagonist av et Bv8-polypeptid som har minst 80 prosent identitet med SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse av endotelceller eller indusere angiogenese, til anvendelse i behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling, for behandling av tumor eller cancer, eller regulering av fertilitet hos et pattedyr, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

Endelig tilveiebringer oppfinnelsen en sammensetning som omfatter en antagonist av et Bv8-polypeptid i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærervehikkel, der sammensetningen er til anvendelse som definert i ethvert av kravene 28 til 34, og der Bv8-polypeptidet har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4 og er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller eller indusere angiogenese, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

Ytterligere utførelser av de ulike aspekter ved den foreliggende oppfinnelse fremgår av patentkravene og den detaljerte beskrivelsen av oppfinnelsen nedenfor.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID. NR. 1) for et cDNA som koder en human Bv8-homolog. I fet skrift og understreket viser figuren også posisjonene for de respektive start- og stoppkodonene. Figur 2 viser aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 2) for et humant Bv8-homologt polypeptid som er avledet fra den kodende sekvensen i SEKV.ID. NR. 1. En mulig signalsekvens omfattes av aminosyrene 1 til og med 21. Figur 3 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID. NR. 3) for et cDNA som koder en alternativt spleiset versjon av den humane Bv8-homologen. I fet skrift og understreket viser figuren også posisjonene for de respektive start- og stoppkodonene. Figur 4 viser aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 4) for et humant Bv8-homologt polypeptid som er avledet fra den kodende sekvensen i SEKV.ID. NR. 3. Figur 5 viser nukleotidsekvensen (SEKV.ID. NR. 5) for en muse Bv8-homolog. I fet skrift og understreket viser figuren også posisjonene for de respektive start- og stoppkodonene. Figur 6 viser aminosyresekvensen (SEKV.ID. NR. 6) for et muse Bv8-homologt polypeptid som er avledet fra den kodende sekvensen i SEKV.ID. NR. 5. Figur 7 viser en sammenstilling av muse og humane Bv8-homologer. Et mulig heparinbindende område er angitt innenfor et rektangel. Som angitt er dette domenet ikke tilstede i et alternativt spleiset transkript. Mus og humane Bv8-homologer er omtrent 96% identiske. Figur 8 viser en sammenstilling av aminosyresekvensene for human Bv8 og EG-VEGF. Humant Bv8 er ca 60% identisk med humant EG-VEGF. Figur 9 Northern blotanalyse av humane RNA-prøver viste et enkelt transkript på ca 1,8 kb. Ekspresjon var synlig i testikler. Innholdet i kolonnene er angitt over avsetningene, og størrelsen (kb) er angitt på høyre side. Figurene 10A og 10B viser Northern blotanalyser av ekspresjonen av Bv8 i mus og rotter. I mus kan Bv8-ekspresjonen observeres i hjertet og i testiklene (figur 10A). Hos rotte er Bv8-ekspresjonen bare synlig i testiklene (figur 10B). I tillegg er også et mindre bånd på 0,8 kb synlig i rottetestiklene. Figurene 1 IA og 1 IB viser at Bv8 induserer deling av endotelceller. Figur 1 IA viser at administrasjonen av Bv8 i en konsentrasjon på 1, 10 og 50 nM øker delingen av storfe binyrebarkkapillære endotel(ACE) celler sammenlignet med ubehandlede kontroller ("C"). På lignende måte indikerer figur 1 IB at Bv8 i alle tre konsentrasjonene øker delingen av storfe hjernekapillære celler. I begge tilfeller var den celledeling som ble indusert ved Bv8 mindre enn den som ble indusert av

VEGF ("V").

Figur 12 viser at Bv8 fremmer endotelcelleoverlevelse. Etter inkubering i media som inneholdt 5 eller 25 nM Bv8, ble færre storfehjernekapillære celler apoptotiske enn etter inkubering i 2% FCS eller EG-VEGF. Bv8 og VEGF hadde en tydelig synergistisk effekt, med færre apoptotiske celler som var tilstede i kultur etter inkubering med både Bv8 og VEGF, enn med hver enkelt av dem.

Figur 13 viser at Bv8 økte interstitial kapillærdannelse i testiklene hos nakne mus. Etter at testiklene i nevnte mus ble injisert med adenovirale vektorer som enten uttrykte LacZ, VEGF, EG-VEGF eller Bv8, kunne man observere en økende intratestikkulær vaskulær celledeling i de Bv8-behandlede dyrene.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSENE

I. Definisjoner

Hvis intet annet er angitt, så har de tekniske og vitenskapelige begrepene som brukes her samme betydning som vanligvis brukes innenfor det fagfeltet til hvilket denne oppfinnelsen tilhører. Se for eksempel Singleton et al, Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al, Molecular doning. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). For det foreliggende formål, er følgende begreper definert nedenfor.

Begrepene "Bv8" og "Bv8-polypeptid" slik de brukes her og som brukes om hverandre, refererer seg til det opprinnelige eller naturlige sekvens Bv8, Bv8-varianter og kimært Bv8 som alle er definert her. Eventuelt er Bv8 ikke assosiert med naturlig glykosylering. "Naturlig glykosylering" refererer seg til de karbohydratgruppene som er kovalent knyttet til Bv8 når det fremstilles i pattedyrceller, da spesielt i de celler som produserer Bv8 i naturen. Følgelig vil humant Bv8 fremstilt i en ikke-human celle være et eksempel på Bv8 som ikke "er assosiert med naturlig glykosylering". Enkelte ganger kan Bv8 ikke være glykosylert i det hele tatt, noe som er tilfellet når det produseres i prokaryoter, for eksempel E. coli.

Bv8-nukleinsyre er RNA eller DNA som koder et Bv8-polypeptid slik dette er definert ovenfor, eller som hybridiserer seg til et slikt DNA eller RNA og forblir stabilt bundet til dette under stringente hybridiseringsbetingelser og har en lengde som er større enn ca 10 nukleotider. Stringente betingelser er de som (1) anvender lav ionestyrke og høy temperatur for vasking, for eksempel 0,15 M NaCl/0,015 M natriumcitrat/0,1% NaDodS04ved 50°C eller (2) bruker under hybridiseringen et denatureringsmiddel så som formamid, for eksempel 50% vol/vol formamid og 0,1% storfeserum albumin/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidon/50 mM natrium-fosfatbuffer ved pH 6,5 og 750 mM NaCl og 75 mM natriumcitrat ved 42°C.

Nukleinsyre er operativt forbundet når den plasseres i et funksjonelt forhold med en annen nukleinsyresekvens. Bv8-nukleinsyre kan operativt være forbundet med en annen nukleinsyresekvens i en vektor slik at det kan uttrykkes i en spesiell vertsorganisme. Dette kan utføres ved fremgangsmåter som er velkjente innenfor bioteknologien. For eksempel kan DNA for en presekvens eller en sekretorisk leder være operativt forbundet til DNA for et polypeptid hvis det selv blir uttrykt som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet; en promotor eller forsterker er operativt forbundet til en kodende sekvens hvis den påvirker transkripsjonen av sekvensen; eller et ribosombindende sete er operativt forbundet til en kodende sekvens hvis den er slik plassert at den letter translatering. Generelt betyr begrepet "operativt forbundet" at DNA-sekvens ene i dette tilfellet er sammenhengene, og i forbindelse med en sekretorisk leder, sammenhengende og i en lesefase. Nevnte forsterkere trenger imidlertid ikke å være sammenhengende. En forbindelse oppnås ved en ligering i passende og hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, kan syntetiske oligonukleotidadaptere eller linkere brukes i overensstemmelse med vanlig kjent praksis.

"Naturlig sekvens Bv8" omfatter et polypeptid som har den samme aminosyresekvensen som Bv8 avledet fra naturen, uansett hvordan det er fremstilt. Det naturlige sekvens Bv8 kan således ha aminosyresekvensen for naturlig forekommende humant Bv8, muse Bv8 eller Bv8 fra enhver annen pattedyrart. For eksempel er en fullengde, naturlig sekvens Bv8-aminosyresekvens vist på figur 2 (SEKV.ID. NR. 2). En andre fullengde naturlig sekvens human Bv8 er vist på figur 4 (SEKV.ID. NR. 4). Disse to sekvensene er et resultat av alternativ spleising av et ekson som koder et kanonikalt heparinbindende domene. Det naturlige sekvens humane Bv8 hvis aminosyresekvens er vist på figur 2 (SEKV.ID. NR. 2), omfatter således et heparinbindende domene, mens det naturlige sekvens Bv8 som er vist på figur 4 (SEKV.ID. NR. 4) ikke gjør dette. En naturlig sekvens muse Bv8-aminosyresekvens er vist på figur 6 (SEKV.ID. NR. 6). Humane og muse Bv8-sekvensene er også kjent, se for eksempel Wechselberger et al. (FEBS Lett. 462: 177-181 (1999)) og Li et al. (Mol. Pharm. 59: 692-698 (2001)). Slik naturlig sekvens Bv8 kan isoleres fra naturen eller kan produseres ved rekombinante og/eller syntetiske metoder. Begrepet "naturlig sekvens Bv8" omfatter spesifikt naturlig forekommende prepro, pro og modne former og trunkerte former av Bv8, naturlig forekommende variable former (for eksempel alternativt spleisede former slik som vist på figur 4 (SEKV.ID. NR. 4)), og naturlig forekommende alleliske varianter. En foretrukket naturlig sekvens Bv8 er en fullengde naturlig sekvens humant Bv8 som vist på figur 2 (SEKV.ID. NR. 2).

"Bv8-varianter" er biologisk aktive Bv8-polypeptider med en aminosyresekvens som skiller seg fra sekvensen for et naturlig sekvens Bv8-polypeptid, for eksempel av den type som er vist på figurene 2, 4 og 6 (SEKV.ID. NR. 2, 4 og 6) for menneske og muse Bv8 på grunn av en innsetting, delesjon, modifikasjon og/eller substitusjon av en eller flere aminosyreresidua inne i den naturlige sekvensen. Bv8-

varianter har vanligvis mindre enn 100% sekvensidentitet med en naturlig sekvens Bv8 så som det humane Bv8 som er vist på figur 2 (SEKV.ID. NR. 2). Vanligvis vil en slik biologisk aktiv Bv8-variant ha en aminosyresekvens som er minst 70% identisk med aminosyresekvensen i et naturlig forekommende Bv8 så som det humane Bv8 som er vist på figur 2 (SEKV.ID. NR. 2), fortrinnsvis minst ca 75%, mer foretrukket minst ca 80% og enda mer foretrukket minst ca 85% og enda mer foretrukket minst 90%, med økende preferanse for minst 95% eller minst 99% aminosyresekvensidentitet i trinn på 1%. Bv8-variantene inkluderer peptidfragmenter på minst 5 aminosyrer som beholder en biologisk aktivitet for det tilsvarende naturlige sekvens Bv8-polypeptidet. Bv8-varianter innbefatter også Bv8-polypeptider hvor ett eller flere aminosyreresidua er addert på en N- eller C-terminus eller inne i en naturlig Bv8-sekvens. Bv8-varianter innbefatter også Bv8-polypeptider hvor en rekke aminosyreresidua er fjernet og eventuelt erstattet med en eller flere andre aminosyreresidua. Bv8-varianter kan også være kovalent modifisert, for eksempel ved substitusjon med en gruppe som er forskjellig fra det som forekommer i en naturlig forekommende aminosyre, eller ved modifikasjon av en aminosyregruppe slik at man får fremstilt en ikke-naturlig forekommende aminosyre. Bv8-variantene kan også omfatte et heparinbindende domene.

"Prosent aminosyresekvensidentitet" med hensyn til Bv8-sekvensen er her definert som den prosentsatsen av aminosyreresidua i kandidatsekvensen som er identisk med tilsvarende residua i Bv8-sekvensen etter sammenligning mellom sekvensene og innføring av gap hvis dette er nødvendig, for å oppnå maksimal prosent sekvensidentitet, idet man ikke tar hensyn til eventuelle konservative substitusjoner som en del av sekvensidentiteten. Ingen av de N-terminale, C-terminale eller indre forbindelser, delesjoner eller innsettinger i kandidat Bv8-sekvensen må være utført slik at det påvirker sekvensidentitet eller homologi. Fremgangsmåter og dataprogrammer for sammenstilling er velkjente. Et slikt dataprogram er "ALIGN-2" fremstilt av Genentech, Inc., som er blitt innsendt med brukerdokumentasjon i United States Copyright Office, Washington, D.C. 20559, hvor det er registrert under U.S. Copyright registreringsnr. TXU510087.

Et "kimært Bv8" molekyl er et polypeptid som innbefatter fullengde Bv8 eller ett eller flere domener av dette som er fusjonert eller bundet til et heterologt polypeptid. Det kimære Bv8-molekylet vil vanligvis ha minst én biologisk egenskap felles med naturlig forekommende Bv8. Et eksempel på et kimært Bv8-molekyl er ett som er epitopmerket for rensingsformål. Et annet kimært Bv8-molekyl er et Bv8-immunoadhesin.

Begrepet "epitopmerket" slik det brukes her, refererer seg til et kimært polypeptid som omfatter Bv8 fusjonert til et "tag-polypeptid". Sistnevnte har tilstrekkelige residua til å tilveiebringe en epitop mot hvilken det kan fremstilles et antistoff, men ikke desto mindre er tilstrekkelig kort at det ikke påvirker den biologiske aktiviteten til Bv8. Merke-polypeptidet er fortrinnsvis relativt enestående slik at antistoffet mot dette ikke i særlig grad kryssreagerer med andre epitoper. Egnede merke-polypeptider vil ha minst seks aminosyreresidua og vanligvis mellom 8 og 50 aminosyreresidua (fortrinnsvis mellom 9 og 30 residua). Polyhistidinsekvenser er foretrukne, ettersom disse binder nikkel, noe som muliggjør en isolering av det merkede proteinet ved hjelp av Ni-NTA-kromatografi slik dette er beskrevet i litteraturen (se for eksempel Lindsay et al. Neuron 17: 571-574 (1996)).

"Isolert Bv8" betyr Bv8 som er blitt renset fra en Bv8-kilde, eller som er blitt fremstilt ved rekombinante eller syntetiske metoder og så renset. Renset Bv8 er i alt vesentlig fritt for andre polypeptider eller peptider. "I alt vesentlig fritt" betyr her mindre enn ca 5%, fortrinnsvis mindre enn ca 2%, og mer foretrukket mindre enn ca 1% og mest foretrukket mindre enn 0,5% og aller mest foretrukket mindre enn 0,1% forurensning med andre kildeproteiner.

"I alt vesentlig rent" protein betyr en sammensetning som innbefatter minst 90 vekt% av proteinet basert på sammensetningens totale vekt, fortrinnsvis minst 85 vekt%, mer foretrukket minst 90 vekt% og mest foretrukket minst ca. 95 vekt%. "I alt vesentlig homogent" protein betyr en sammensetning som omfatter minst

99 vekt% protein basert på sammensetningens totale vekt.

Bv8-"agonister" er molekyler eller forbindelser som har en eller flere av de biologiske egenskapene som forefinnes i naturlig sekvens Bv8. Disse kan inkludere, men er ikke begrenset til, mindre organiske molekyler, peptider og agonistanti-Bv8-antistoffer.

Begrepet "antagonist" brukes i sin bredeste betydning og innbefatter ethvert molekyl som helt eller delvis blokkerer, hemmer eller nøytraliserer en biologisk aktivitet som forefinnes i naturlig Bv8-polypeptid. Egnede antagonistmolekyler innbefatter spesifikt antagonistantistoffer eller antistoffragmenter, fragmenter eller aminosyresekvensvarianter av naturlige Bv8-polypeptider, peptider, små organiske molekyler osv. Fremgangsmåter for å identifisere agonister eller antagonister av et Bv8-polypeptid kan innbefatte at et Bv8-polypeptid kontaktes et kandidat agonist-eller antagonistmolekyl, hvoretter man måler en forandring i en eller flere biologiske aktiviteter som normalt er assosiert med Bv8-polypeptidet.

"Aktiv" eller "aktivitet" for det foreliggende formålet refererer seg til former av Bv8 som har beholdt en biologisk og/eller en immunologisk aktivitet som forekommer i naturlig eller naturlig forekommende Bv8, hvor "biologisk" aktivitet refererer seg til en biologisk funksjon (enten hemmende eller stimulerende) som er forårsaket av et naturlig eller naturlig forekommende Bv8, bortsett fra evnen til å indusere produksjonen av et antistoff mot en antigen epitop som er tilstede i et naturlig eller naturlig forekommende Bv8, mens en "immunologisk" aktivitet refererer seg til

evnen til å indusere produksjonen av et antistoff mot en antigen epitop som er tilstede i et naturlig eller naturlig forekommende Bv8.

Begrepet "biologisk aktiv" når det brukes i forbindelse med "Bv8" og "isolert Bv8" eller en agonist av Bv8, betyr således et Bv8-polypeptid som utøver eller har en felles effektorfunksjon med naturlig sekvens Bv8. En prinsipiell effektorfunksjon for Bv8 er dens evne til å stimulere celledelingen av endotelceller. Mer foretrukket er den biologiske aktiviteten dens evne til å indusere celledeling hos kapillære endotelceller, da spesielt steroidogene celler inne i endokrine kjertler. En ytterligere effektorfunksjon for Bv8 er dens evne til å indusere angiogenese.

"Biologisk egenskap" når det brukes i sammenheng med "Bv8" og "isolert Bv8" eller en "agonist" av Bv8, betyr en effektor eller antigen funksjon eller aktivitet som enten direkte eller indirekte er forårsaket eller utføres av naturlig sekvens Bv8 (enten dette er naturlig eller foreligger i en denaturert konformasjon). Effektorfunksjoner innbefatter en forbedring av celledelingen hos endotelceller og/eller en induksjon av angiogenese.

"Bv8-reseptor" er et molekyl til hvilket Bv8 binder seg og som styrer de biologiske egenskapene til Bv8.

Begrepet "antistoff brukes her i sin videste betydning og dekker spesifikt humane, ikke-humane (for eksempel mus) og humaniserte monoklonale antistoffer (inklusive fullengde monoklonale antistoffer), polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (for eksempel bispesifikke antistoffer) og antistoffragmenter så lenge disse utøver den forønskede biologiske aktiviteten.

"Antistoffer" (Abs) og "immunoglobuliner" (Igs) er glykoproteiner med de samme strukturelle egenskapene. Mens antistoffer utøver en binding som er spesifikk for et spesifikt antigen, så inkluderer immunoglobuliner både antistoffer og andre antistofflignende molekyler som mangler antigenspesifisitet. Polypeptider av den sistnevnte typen blir for eksempel fremstilt i små mengder i lymfesystemet og i forøkede mengder av myeloma.

"Naturlige antistoffer" og "naturlige immunoglobuliner" er vanligvis heterotetramere glykoproteiner med en molekylvekt på ca. 150000 dalton, sammensatt av to identiske lette (L) kjeder og to identiske tunge (H) kjeder. Hver lette kjede er forbundet til en tung kjede ved hjelp av en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom de tunge kjedene hos de forskjellige immunoglobulinisotypene. Hver tunge og lette kjede har også regelmessig plasserte intrakjededisulfidbroer. Hver tunge kjede har i en ende et variabelt domene (Vh) fulgt av et visst antall konstante domener. Hver lette kjede har et variabelt domene i en ende (Vl) og et konstant domene i den andre, og det konstante domenet i den lette kjeden er sammenstilt med det første konstante domenet i den tunge kjeden, og

det lettkjedede variable domenet er sammenstilt med det variable domenet i den tunge kjeden. Det er antatt at spesielle aminosyreresidua danner en interfase mellom de variable domenene i de lette og tunge kjedene.

Begrepet "variable" refererer seg til det faktum at visse deler av de variable domenene har betydelige sekvens forskjeller fra ett antistoff til et annet, og disse brukes ved bindingen og spesifisiteten for hvert enkelt antistoff for sitt spesielle antigen. Variabiliteten er imidlertid ikke jevnt fordelt ut over antistoffenes variable domener. Variabiliteten er stort sett konsentrert til tre segmenter som kalles hypervariable områder, både i de variable domenene i den lette kjeden og i den tunge kjeden. De sterkest konserverte delene av de variable domenene kalles rammeverks området (FR). De variable domenene i naturlige tunge og lette kjeder omfatter hver fire FR (henholdsvis FRI, FR2, FR3 og FR4), som i alt vesentlig har en P-platekonfigurasjon, og er forbundet med tre hypervariable områder som danner sløyfer som forbinder og i enkelte tilfeller danner en del av P-platestrukturen. De hypervariable områdene i hver kjede holdes tett sammen ved hjelp av nevnte FR, og med de hypervariable områdene fra den andre kjeden, bidrar de til dannelsen av antistoffenes antigenbindende sete (se Kabat et al, Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), sidene 647-669). De konstante domenene inngår ikke direkte i bindingen av et antistoff til et antigen, men utøver forskjellige effektorfunksjoner så som en deltakelse i antistoffet i den antistoffavhengige cellulære toksisiteten.

Begrepet "hypervariabelt område" refererer seg til de aminosyreresidua i et antistoff som er ansvarlige for antigenbinding. Det hypervariable området omfatter aminosyreresidua fra et "komplementært bestemmende område" eller "CDR" (det vil si residua 24-34 (LI), 50-52 (L2) og 89-97 (L3) i det lettkjedede variable domenet og 31-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i det tungkjedede variable domenet; Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) og/eller de residua som kommer fra en "hypervariabel sløyfe" (det vil si residua 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96 (L3) i det lettkjedede variable domenet og 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i det tungkjedede variable domenet; Chothia og Lesk, J. Mol Biol 196: 901-917 (1987)). "Rammeverk"- eller "FR"-residua er de fra det variable domenet som er forskjellige fra residua i det hypervariable området slik dette er definert her.

Papainkutting av antistoffene gir to identiske antigenbindende fragmenter som kalles "Fab"-fragmenter som hver har et enkelt antigenbindende sete og et residualt "Fc"-fragment hvis navn reflekterer dets evne til lett å utkrystallisere. Pepsinbehandling i et F(ab')2-fragment som har to antigenkombinerende seter og som ennå er i stand til å tverrbinde et antigen.

"Fv" er det minimumsantistoffragmentet som inneholder et fullstendig antigengjenkjennende og -bindende sete. Dette området består av en dimer av en tung kjede og et lettkjedet variabelt domene i en tett ikke-kovalent assosiasjon. Det er i denne konfigurasjonen at de tre hypervariable områdene i hvert enkelt variabelt område virker sammen og definerer et antigenbindende sete på overflaten av Vh-VL-dimeren. Til sammen er det disse seks hypervariable områdene som gir antistoffet dets antigenbindende spesifisitet. Et enkelt variabelt domene (eller halvparten av et Fv som omfatter bare tre hypervariable områder som er spesifikke for et antigen) har imidlertid evnen til å gjenkjenne og binde antigenet, skjønt med lavere affinitet enn hele bindingssetet.

Fab-fragmentet inneholder også det konstante domenet fra den lette kjeden og det første konstante domenet (CH1) i den tunge kjeden. Fab'-fragmentene skiller seg fra Fab-fragmentene ved at det er addert noen få residua ved karboksylterminusdelen av det tungkjedede CH1-domenet inklusive ett eller flere cysteiner fra antistoff-hengselsområdet. Fab'-CH er her betegnelsen på Fab' hvor cysteinresiduaene i de konstante domenene bærer en fri tiolgruppe. F(ab')2-antistoffragmentene ble opprinnelig produsert som et par av Fab'-fragmenter som har såkalte hengsel cysteingrupper mellom seg. Det er imidlertid også kjent andre kjemiske koblinger av antistoffragmenter.

"Lette kjeder" av antistoffer (immunoglobuliner) fra en hvilken som helst virveldyrart kan klassifiseres i en av to klart distinkte typer som kalles kappa (k) og lambda basert på aminosyresekvensene i deres konstante domener.

Avhengig av aminosyresekvensen i det konstante domene ti deres tunge kjeder, kan immunoglobulinene tilegnes forskjellige klasser. Det er fem hovedklasser av immunoglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM og flere av disse kan ytterligere oppdeles i underklasser (isotyper), for eksempel IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl og IgA2. De konstante domenene i de tunge kjedene som tilsvarer de forskjellige klassene av immunoglobuliner kalles henholdsvis a, 5, s, y og u.. Underenhets-strukturene og de tredimensjonale konfigurasjonene for disse forskjellige klassene av immunglobulinene er velkjente.

"Antistoffragmenter" omfatter en del av et fullengde antistoff, vanligvis det antigenbindende eller variable domenet av dette. Eksempler på antistoffragmenter innbefatter Fab-, Fab'-, F(ab')2- og Fv-fragmenter; diastobber, lineære antistoffer; enkeltkjedede antistoffmolekyler; og multispesifikke antistoffer som er dannet fra antistoffragmenter.

Begrepet "monoklonalt antistoff slik det brukes her, refererer seg til et antistoff som er oppnådd fra en populasjon av i alt vesentlig homogene antistoffer, det vil si at de individuelle antistoffene som inngår i populasjonen er identiske, bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som eventuelt vil være tilstede i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er sterkt spesifikke og er rettet inn mot et enkelt antigent sete. I motsetning til vanlige (polyklonale) antistoffpreparater som typisk innbefatter forskjellige antistoffer som er rettet inn mot forskjellige determinanter (epitoper), så er imidlertid et monoklonalt antistoff rettet inn mot en enkelt determinant på antigenet. Det modifiserende begrepet "monoklonalt" indikerer karakteren til det antistoffet slik dette oppnås fra en i alt vesentlig homogen populasjon av antistoffer og må ikke oppfattes slik at en nødvendig produksjon av antistoffet må utføres ved noen bestemt fremgangsmåte. For eksempel kan de monoklonale antistoffene som brukes i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen fremstilles ved hybridommetoden som først var beskrevet av Kohler et al, Nature 256: 495 (1975) eller kan fremstilles ved hjelp av andre rekombinante DNA-metoder (se for eksempel U.S. patent nr. 4,816,567). De "monoklonale antistoffene" kan også isoleres fra fagantistoffbiblioteker ved å bruke de teknikker som for eksempel er beskrevet i Clackson et al, Nature 352: 624-628 (1991) og Marks et al, J. Mol Biol 222: 581-597 (1991).

Monoklonale antistoffer slik dette begrepet brukes her, inkluderer spesifikt "kimære" antistoffer (immunoglobuliner) hvor en del av den tunge og/eller lette kjeden er identisk med eller er homologe til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en spesiell art, eller som hører til en spesiell antistoffklasse eller underklasse, mens resten av kjeden er identisk med eller homolog til tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra andre arter, eller som hører til en annen antistoffklasse eller underklasse så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge de utøver den forønskede biologiske aktiviteten (U.S. patent nr. 4,816,567; og Morrison et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 (1984)).

"Humaniserte" former av ikke-humane (for eksempel mus) antistoffer er kimærte antistoffer ved at de inneholder en minimal sekvens avledet fra et ikke-humant immunoglobulin. Vanligvis vil humaniserte antistoffer være humane immunoglobuliner (mottakende antistoff) hvor residua i mottakeren er erstattet med residua fra det hypervariable området fra en ikke-human art (donorantistoff) så som mus, rotte, kanin eller en ikke-human primat som har den forønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I visse tilfeller vil residuaene i rammeverksområdet (FR) i det humane immunoglobulinet være erstattet av tilsvarende ikke-humane residua. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte residua som ikke finnes i det mottakende antistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene kan utføres for ytterligere å raffinere eller å bedre antistoffets virkning. Generelt vil det humaniserte antistoffet omfatte i alt vesentlig alt, i det minste av en, typisk to variable domener, hvor alle eller i alt vesentlig alle de hypervariable områdene tilsvarer de tilsvarende i et ikke-humant immunoglobulin og hvor alle eller i vesentlig grad alle rammeverks område ne er de som finnes i en human

immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoffet kan eventuelt også omfatte i det minste en del av et immunoglobulinkonstant område (Fc), vanligvis fra et humant immunoglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al, Nature 321: 522-525

(1986); Reichmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); og Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2: 593-596 (1992).

"Enkeltkjedede Fv" eller "sFv"-antistoffragmenter omfatter Vh- og VL-domenene i antistoffet hvor disse domenene er tilstede i en enkelt polypeptidkjede. Vanligvis vil Fv-polypeptidet ytterligere omfatte en polypeptidlinker mellom Vh- og VL-domenene, noe som gjør at nevnte sFv kan danne den forønskede strukturen for antigenbinding. For en oversikt over sFv, se Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg og Moore red. Springer-Verlag, New York, sidene 269-315 (1994).

Begrepet "diastoffer" refererer seg til små antistoffragmenter med to antigenbindende seter og hvor fragmentene omfatter et tungkjede variabelt område (Vh) forbundet til et lettkjede variabelt domene (Vl) i den samme polypeptidkjeden (Ch-Vl). Ved å bruke en linker som er for kort til at det kan oppstå en paring mellom de to domenene på den samme kjeden, blir domenene presset til å pare seg med de komplementerende domenene i den andre kjeden og skape to antigenbindende seter. Diastoffer er mer detaljert beskrevet, for eksempel i EP 404,097; WO 93/11161; og Hollinger et al, Proe. Nati. Acad. Aci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Uttrykket "lineære antistoffer" slik det brukes her, refererer seg til den type antistoffer som er beskrevet i Sapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Kort beskrevet omfatter disse antistoffene et par av tandem Fd-segmenter (Vh-Ch1-Vh-Ch1) som danner et par av antigenbindende områder. Lineære antistoffer kan være bispesifikke eller monospesifikke.

Begrepet "epitop" slik det brukes her, refererer seg til bindingsseter for (monoklonale eller polyklonale) antistoffer på proteinantigener.

Med "agonistantistoff" forstås et antistoff som er en Bv8-agonist og således innehar en eller to av de biologiske egenskapene som forefinnes i naturlig sekvens Bv8.

Begrepet "Bv8-immunoadhesin" brukes om hverandre med begrepet "Bv8-immunoglobulinkimæra" og refererer seg til et kimært molekyl som kombinerer i det minste en del av Bv8-molekylet (enten naturlig eller en variant) med en immunoglobulinsekvens. Sistnevnte er fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, et immunoglobulinkonstant domene. Immunoadhesiner kan ha en rekke av de verdifulle kjemiske og biologiske egenskapene som forefinnes i humane antistoffer. Ettersom immunoadhesiner kan konstrueres ut fra en human proteinsekvens med den forønskede spesifisitet forbundet med et passende human immunoglobulinhengsel og en konstant domene (Fc) sekvens, så kan bindingsspesifisiteten av interesse oppnås ved å bruke utelukkende humane komponenter. Slike immunoadhesiner er minimalt immunogene for pasienten og følgelig sikrere for kronisk eller gjentatt bruk.

Eksempler på homomultimere immunoadhesiner som er blitt beskrevet for terapeutisk anvendelse innbefatter CD4-IgG-immunoadhesinet for å blokkere bindingen av HIV til celleoverflate CD4. Data som er oppnådd fra fase I av kliniske forsøk hvor CD4-IgG ble administrert til en svanger kvinne like før fødselen, antyder at dette immunoadhesinet kan brukes for å hindre en overføring av HIV fra mor til barn (Ashkenazi et al, Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)). Et immunoadhesin som binder tumornekrosefaktor (TNF) er også blitt utviklet. TNF er et proinflammatorisk cytokin som har vist seg å være en viktig faktor ved septisk sjokk. Basert på en musemodell på septisk sjokk, har en TNF-reseptor immunoadhesin vist seg å være lovende som en kandidat for klinisk bruk for behandling av septisk sjokk (Ashkenazi, A. et al. (1991) PNAS USA 88: 10535-10539). ENBREL<®>(etanercept), et immunoadhesin som omfatter en TNF-reseptorsekvens fusjonert til et IgG Fc-område er blitt godkjent av U.S. Food and Drug Administration (FDA) den 2. november 1998 for behandling av reumatisk artritt. Den nye utvidede bruken av ENBREL<®>ved behandlingen av reumatisk artritt ble godkjent av FDA den 6. juni 2000. For senere informasjon om TNF-blokkere og heri inngår ENBREL<®>, se Lovell et al, N. Engl J. Med. 342: 763-169 (2000) og en leder på sidene 810-811; og Weinblatt et al, N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999); som også er behandlet i Maini og Taylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000).

Hvis de to armene i immunoadhesinstrukturen har forskjellige spesifisiteter, så kalles immunoadhesinet et "bispesifikt immunoadhesin" ved analogi til bispesifikke antistoffer. Dietsch et al, J. Immunol. Methods 162: 123 (1993) beskriver et slik bispesifikt immunoadhesin som kombinerer de ekstracellulære domenene i adhesjonsmolekylene E-selektin og P-selektin som hver for seg uttrykkes i forskjellige celletyper i naturen. Bindingsundersøkelser indikerer at det bispesifikke immunoglobulinfusjonsproteinet som ble dannet på denne måten har bedret evne til å binde seg til en myeloid cellelinje sammenlignet med de monospesifikke immunoadhesinene fra hvilket det var avledet.

Begrepet "heteroadhesin" brukes om hverandre med uttrykket "kimært heteromultimeradhesin" og refererer seg til et kompleks av kimære molekyler (aminosyresekvenser) hvor hvert enkelt kimært molekyl kombinerer en biologisk aktiv del, for eksempel det ekstracellulære domenet i hver av de heteromultimere reseptormonomerene, med et multimeriserende domene. Det "multimeriserende domenet" fremmer stabil interaksjon for de kimære molekylene inne i heteromultimerkomplekset. De multimeriserende domenene kan virke sammen med en immunoglobulinsekvens, leukinzipper, et hydrofobt område, et hydrofilisk område eller en fri tiol som danner en intramolekylær disulfidbinding mellom de kimære molekylene i den kimære heteromultimeren. Det multimeriserende domenet kan omfatte et immunglobulinkonstant område. I tillegg kan et multimeriserende område manipuleres slik at den steriske interaksjonen ikke bare fremmer stabil interaksjon, men også fremmer dannelsen av heterodimerer fremfor homodimerer fra en blanding av monomerer. "Fremspring eller protuberanser" er konstruert ved å erstatte små aminosyrekjeder fra interfasen av det første polypeptidet med større side kjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Tilsvarende "hulrom" av identisk eller tilsvarende størrelse som nevnte protuberanser kan eventuelt skapes på interfasen på det andre polypeptidet ved å erstatte større aminosyresidekjeder med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Immunoglobulinsekvensen er fortrinnsvis, men ikke nødvendigvis, et immunoglobulinkonstant domene. Immunoglobulingruppen i kimærene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan oppnås fra IgGi-, IgG2-, IgG3- eller IgG4-undertypene, IgA, IgE, IgD eller IgM, men fortrinnsvis IgGieller IgG3.

Med begrepet "behandling" som anvendt heri, forstås en fremgangsmåte for å oppnå fordelaktige eller forønskede kliniske resultater. I den foreliggende oppfinnelsen inkluderer fordelaktige eller forønskede kliniske resultater, men er ikke begrenset til disse, lindring av symptomer, svekkelse av sykdomsgraden, stabilisering (det vil si ikke en forverring) av sykdomstilstanden, forsinkelse eller nedsettelse av sykdommens progresjon, lindring av sykdomstilstanden og remisjon (enten denne er delvis eller total), enten den lar seg påvise eller ikke lar seg påvise. "Behandling" kan også bety å forlenge levetiden sammenlignet med forventet levetid uten behandling. "Behandling" er en intervensjon som utføres med den hensikt å kunne hindre utviklingen eller endre lidelsens patologi. "Behandling" refererer seg således både til terapeutisk behandling og profylaktisk behandling. De som har behov for behandling innbefatter de som allerede har sykdommen, foruten de hvor man ønsker å hindre sykdommen. Mer spesifikt kan behandlingen direkte hindre, nedsette utviklingen av eller på annen måte nedsette patologien ved cellulær degenerering eller skade, for eksempel patologien i forbindelse med tumorceller ved cancerbehandling, eller kan gjøre cellene mer følsomme for behandling for andre terapeutiske midler.

"Steroidogenese" er den hormonelt induserte, CAMP-medierte akutte reguleringen av steroidhormonbiosyntesen i "steroidogene celler" og erkarakterisert vedmobiliseringen av kolesterol fra forskjellige cellulære lagre til mitokondrier i den ytre membranen og dens translokasjon til den indre membranen hvor det skjer en omdannelse av kolesterol til pregnenolon.

"Steroidogent vev" refererer seg til vev som produserer steroidale hormoner ved den steroidogene prosessen. Eksempler innbefatter vev i binyrene, reproduksjonsorganene, svelget og vev i luftveiene.

"Kronisk" administrering refererer seg til administrering av ett eller flere midler på en kontinuerlig måte i motsetning til en akutt fremgangsmåte for derved å opprettholde den opprinnelige terapeutiske effekten (aktiviteten) i et lengre tidsrom. "Intermitterende" administrering er en behandling som utføres med enkelte avbrudd, men ofte er av syklisk type.

"Pattedyr" for behandlingsformål refererer seg til ethvert dyr som klassifiseres som et pattedyr, heri inngår mennesker, andre høyere primater, forskjellige typer husdyr og dyr i zoologiske hager, dyr som blir brukt for forskjellige sportsformål eller kjæledyr så som hunder, katter, kuer, hester, sauer, griser, geiter, kaniner etc. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske.

"Tumor" slik det brukes her, refererer seg til alle typer neoplastisk cellevekst og celledeling, enten godartet eller ondartet, og alle pre-cancer og cancerceller og vev.

Begrepene "cancer" og "cancerøs" refererer seg til eller beskriver den fysiologiske tilstanden i pattedyr som typisk erkarakterisert veduregulert cellevekst. Eksempler på cancere av spesiell interesse her innbefatter cancer i reproduksjonsorganene som for eksempel eggstokkcancer, testikkelcancer, livmorcancer, halscancer; prostatacancer; cancer i binyrene og heri inngår cancer i binyrebarken (for eksempel adrenokortikalt carcinom) og adrenal medulla; tyroid cancer; paratyroid cancer; pankreascancer; og endometrialt carcinom.

En sykdoms "patologi" inkluderer alle fenomener som svekker pasientens helse. For cancer innbefatter dette uten begrensning unormal eller ukontrollerbar cellevekst, metastase, forstyrrelser i nabocellenes normale funksjon, frigjøring av cytokiner eller andre sekretoriske produkter på et unormalt nivå, undertrykkelse eller forsterkning av immunologiske eller inflammatoriske reaksjoner etc.

Administrering "i kombinasjon med" ett eller flere ytterligere terapeutiske midler innbefatter samtidig og etterfølgende administrering i hvilken som helst rekkefølge.

"Bærere" slik det brukes her, innbefatter farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler eller stabilisatorer som er ikke-toksiske for cellen eller det pattedyr som blir eksponert overfor bæreren i de doser og konsentrasjoner som anvendes. Ofte er den fysiologisk akseptable bæreren en vandig pH-bufret løsning. Eksempler på fysiologisk akseptable bærere innbefatter buffere så som fosfat, citrat og andre typer organiske syrer; antioksidanter så som askorbinsyre; lavmolekylære (mindre enn ca. 10 residua) peptider; proteiner så som serumalbumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer så som polyvinylpyrrolidon; aminosyrer så som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater som for eksempel glukose, mannose eller dekstriner; gelateringsmidler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol;

saltdannende motioner så som natrium; og/eller ikke-ioniske overfiateaktive midler så som TWEEN™; polyetylenglykol (PEG) og PLURONICS™.

En "liposom" er en liten blære eller vesikkel sammensatt av forskjellige typer lipider, fosfolipider og/eller overfiateaktive midler som kan brukes for tilførsel av et medikament (for eksempel et Bv8-polypeptid eller et antistoff til dette) til et pattedyr. Komponentene i liposomen er vanligvis plassert eller arrangert i to lag, det vil si tilsvarende det lipidene er plassert i biologiske membraner.

Et "lite molekyl" er her definert som et molekyl med en molekylvekt under ca. 500 Dalton.

Begrepene "vaskulær endotelvekstfaktor", "VEGF" og "VEGF-polypeptid" og "VEGF-protein" når de brukes her, omfatter naturlig sekvens VEGF og VEGF-varianter (slik disse er definert her). VEGF-polypeptidet kan være isolert fra en rekke forskjellige kilder, for eksempel fra forskjellige humane vevstyper eller fra andre humane kilder, eller kan fremstilles ved rekombinante og/eller syntetiske metoder.

Et "naturlig sekvens VEGF" omfatter et polypeptid som har den samme aminosyresekvensen som et VEGF avledet fra naturen. Slik naturlig sekvens VEGF kan isoleres fra naturlige kilder eller kan fremstilles ved rekombinante og/eller syntetiske metoder. Begrepet "naturlig sekvens VEGF" omfatter spesifikt naturlig forekommende forkortede eller utskilte former (for eksempel en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende variantformer (for eksempel alternativt spleisede former) og naturlig forekommende allelvarianter av nevnte VEGF. I en utførelse av oppfinnelsen er det naturlige sekvens VEGF en av de fem kjente isoformene, og består av henholdsvis 121, 145, 165, 189 og 206 aminosyreresidua, slik det for eksempel er beskrevet i U.S. patent nr. 5,332,671 og 5,240,848; i PCT-publikasjon nr. WO 98/10071; Leung et al.. Science 246: 1306-1309 (1989); og Kecket al. Science 246: 1309-1312 (1989).

"VEGF-variantpolypeptid" betyr et aktivt VEGF-polypeptid slik det er definert her med minst ca 80%, fortrinnsvis minst ca 85%, mer foretrukket minst ca 90% og aller mest foretrukket minst 95% og helst minst 98% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen i naturlig sekvens VEGF. Et slikt VEGF-variantpolypeptid inkluderer for eksempel VEGF-polypeptider hvor ett eller flere aminosyreresidua er tilsatt eller fjernet, ved N- og/eller C-terminus, så vel som inne i ett eller flere interne domener i den naturlige sekvensen.

Sekvensidentiteten (enten aminosyre eller nukleinsyre) for VEGF bestemmes ved å bruke den samme fremgangsmåten som spesifikt er beskrevet i forbindelse med Bv8. På lignende måte vil de definisjoner som er gitt for agonist og antagonister for Bv8, inklusive men ikke begrenset til, antistoffer, også gjelde for VEGF-agonister og -antagonister.

B. Fremgangsmåter for gjennomføring av oppfinnelsen

I. Identifikasjon av Bv8- varianter

I tillegg til fullengde naturlig sekvens Bv8-polypeptid slik dette er beskrevet her, så er det underforstått at Bv8-varianter kan identifiseres, fremstilles og brukes i den foreliggende oppfinnelsen. Bv8-varianter kan fremstilles ved å innføre passende nukleotidforandringer i DNA fra Bv8 og/eller ved syntese av det forønskede Bv8-polypeptidet. Det tør være innlysende for personer med innsikt i fagfeltet at aminosyreforandringene kan endre posttranslaterende prosesser for Bv8, for eksempel ved å forandre antallet eller posisjonen for glykosyleringssetene. Fremgangsmåter for produksjon av Bv8-varianter er fortrinnsvis de samme som for naturlig sekvens Bv8 slik disse er detaljert beskrevet i det etterfølgende, og den eneste forskjellen er at den anvender nukleinsyren som koder Bv8-varianten i stedet for nukleinsyren som koder for naturlig sekvens Bv8.

Nukleinsyremolekyler som koder Bv8 kan brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. cDNA som koder to fullengdevarianter av humant Bv8 er vist på figurene 1 og 2 (SEKV.ID. NR. 1 og 2), og de tilsvarende deduserte aminosyresekvensene er vist på figurene 2 og 4 (SEKV.ID. NR. 2 og 4). Et cDNA som koder muse Bv8 er vist på figur 5 (SEKV.ID. NR. 5), og den tilsvarende deduserte aminosyresekvensen er vist på figur 6 (SEKV.ID. NR. 6). Polynukleotidene som brukes i den foreliggende oppfinnelsen kan fremstilles eller oppnås ved hjelp av standard teknikker innenfor bioteknologien, for eksempel ved hybridiseringsscreening og PCR-metoder.

Enhver nukleotidsekvens som koder aminosyresekvensen i Bv8 kan brukes for å utvikle rekombinante molekyler som styrer ekspresjonen av Bv8. Videre kan fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse bruke et fusjonspolynukleotid mellom en Bv8-kodende sekvens og en andre kodende sekvens for et heterologt protein.

For å klone fullengde homologe cDNA-sekvenser fra forskjellige arter og som koder hele Bv8 cDNA eller for å klone gruppevarianter eller variante former så som allelvarianter, så kan det fremstilles merkede DNA-prober fra fragmenter som tilsvarer enhver del av de cDNA-sekvenser som her er beskrevet og så bruke disse for å screene eller undersøke cDNA-bibliotek avledet fra en celle eller vevstype som antas å uttrykke Bv8. Mer spesifikt kan oligonukleotider som tilsvarer enten 5'-eller 3'-terminus i den kodende sekvensen, brukes for å oppnå lengre nukleotidsekvenser.

Det kan være nødvendig å screene eller å undersøke mange cDNA-bibliotek fra forskjellige vev for å oppnå et fullengde cDNA. I det tilfelle at det er vanskelig å identifisere cDNA-kloner som koder det fullstendige 5'-terminale kodende området, en situasjon som ofte oppstår i forbindelse med cDNA-kloning, så er det mulig å bruke den såkalte RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) teknikken. RACE er en anerkjent PCR-basert strategi for å amplifisere 5'-enden i ufullstendige cDNA-molekyler. 5'-RACE-ferdig RNA syntetisert fra human placenta inneholdende en enestående ankersekvens er kommersielt tilgjengelig (Clontech). For å oppnå 5'-enden av cDNA-molekylet, så utføres PCR med et 5'-RACE-ferdig cDNA ved å bruke den tilveiebrakte ankerprimeren og 3'-primeren. En ny PCR utføres så ved å bruke den forankrede primeren og en innsatt 3'-primer ved å følge fabrikantens instruksjoner. Så snart nevnte fullengde cDNA-sekvens er oppnådd, så kan denne oversettes til en aminosyresekvens og undersøkes for visse egenskaper, for eksempel en kontinuerlig åpen leseramme flankert av seter for å starte translateringen og termineringen, en mulig signalsekvens og til slutt en generell strukturell likhet med de Bv8-sekvenser som her er beskrevet.

Alternativt kan en merket probe brukes for å screene et genomisk bibliotek avledet fra enhver organisme av interesse ved å bruke passende stringente betingelser som beskrevet tidligere.

Isolering av en Bv8-kodende sekvens eller en homolog sekvens kan utføres ved hjelp av polymerasekjedereaksjoner (PCR) ved å bruke to degenererte oligonukleotidprimersamlinger som er utformet på basis av de Bv8-kodende sekvensene som her er beskrevet. Templaten for reaksjonen kan være cDNA oppnådd ved revers transkripsjon (RT) av mRNA fremstilt for eksempel fra humane eller ikke-humane cellelinjer eller vev som er kjent for eller som mistenkes for å uttrykke et Bv8-genallel.

PCR-produktet kan så subklones og sekvenseres for å sikre at de oppformerte eller amplifiserte sekvensene representerer sekvensene for en Bv8-kodende sekvens. PCR-fragmentet kan så brukes for å isolere en fullengde cDNA-klon ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter. For eksempel kan det amplifiserte fragmentet merkes og brukes for å screene et bakteriofag cDNA-bibliotek. Alternativt kan det merkede fragmentet brukes for å isolere genomiske kloner via screening av et genomisk bibliotek.

PCR-teknologi kan også brukes for å isolere fullengde cDNA-sekvenser. For eksempel kan RNA isoleres ved hjelp av standard metoder fra en passende cellulær eller vevskilde. En RT-reaksjon kan så utføres på nevnte RNA ved å bruke en oligonukleotidprimer som er spesifikk for den ytterste 5'-enden til det amplifiserte fragmentet for priming av første tråds syntese. Den resulterende RNA/DNA-hybriden kan så "endetilføyes" med guaningrupper ved å bruke en standard terminal transferasereaksjon, hvoretter hybriden kan kuttes med RNAse H, og den andre tråds syntesen kan så primes med en poly-C-primer. cDNA-sekvenser oppstrøms for det amplifiserte fragmentet kan således lett isoleres.

En cDNA-klon av en mutant eller en allelvariant av Bv8-genet kan for eksempel isoleres ved å bruke PCR. I dette tilfellet kan den første cDNA-tråden syntetiseres ved å hybridisere et oligo-dT-oligonukleotid til mRNA isolert fra vev som er kjent for eller som mistenkes for å uttrykke Bv8 hos et individ som antatt bærer mutant Bv8-allelet og så forlenge den nye tråden ved hjelp av revers transkriptase. Den andre tråden av nevnte cDNA kan så syntetiseres ved å bruke et oligonukleotid som hybridiserer seg spesifikt til 5'-enden til det normale genet. Ved å bruke disse to primerne kan produktet så oppformeres eller amplifiseres via PCR, klones inn i en egnet vektor og underkastes en DNA-sekvensanalyse ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Ved å sammenligne DNA-sekvensen fra nevnte mutante Bv8-allel i forhold til det normale Bv8-allelet, så er det mulig å fastslå den eller de mutasjonene som er ansvarlige for tapet eller endringen av funksjonen til det mutante Bv8-genproduktet.

Alternativt er det mulig å konstruere et genomisk bibliotek ved å bruke et DNA fra et individ som er mistenkt for eller som er kjent for å bære et mutant Bv8-allel, eller et cDNA-bibliotek kan konstrueres ved å bruke RNA fra et vev som er kjent for eller som mistenkes for å uttrykke et mutant Bv8-allel. Et usvekket Bv8-gen eller et egnet fragment av dette kan så merkes og brukes som en probe for å identifisere det tilsvarende mutante Bv8-allelet i slike biblioteker. Kloner som inneholder de mutante Bv8-gensekvensene kan så renses og underkastes sekvensanalyse ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente innenfor bioteknologien.

Videre kan et ekspresjonsbibliotek konstrueres ved å bruke cDNA syntetisert for eksempel fra RNA som er isolert fra vev som er kjent for eller som mistenkes for å uttrykke et mutant Bv8-allel i et individ som er mistenkt for eller som er kjent for å bære et slikt mutant allel. På denne måten kan genprodukter fremstilt ved hjelp av det antatt mutante vevet uttrykkes og screenes ved hjelp av standard antistoff-screeningsteknikker i sammenheng med antistoffer som er utviklet mot det normale Bv8-genproduktet slik det er beskrevet i det etterfølgende.

Begrepene nukleinsyre, polynukleotid og nukleotid brukes her om hverandre og refererer seg til enhver nukleinsyre, enten denne er sammensatt av deoksyribo-nukleosider eller ribonukleosider, og uansett hvorvidt de er sammensatt av fosfodiesterbindinger eller modifiserte bindinger så som fosfotriester, fosforamidat, siloksan, karbonat, karboksymetylester, acetamidat, karbamat, tioeter, broforbundet fosforamidat, broforbundet metylenfosfonat, fosfortioat, metylfosfonat, fosforditioat, broforbundet fosfortioat eller sulfonbindinger eller kombinasjoner av slike bindinger.

Begrepene nukleinsyre, polynukleotid og nukleotid innbefatter også spesifikt nukleinsyrer sammensatt av baser som er forskjellige fra de fem biologisk forekommende basene (adenin, guanin, tymin, cytosin og uracil). For eksempel kan et polynukleotid ifølge foreliggende oppfinnelsen inneholde minst én modifisert basegruppe valgt fra gruppen som inkluderer, men som ikke er begrenset til, 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-kloruracil, 5-joduracil, hypoksantin, xantin, 4-acetyl-cytosin, 5-(karboksyhydroksylmetyl)uracil, 5-karboksymetylaminometyl-2-tio-uridin, 5-karboksymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-D-galaktosyl-queosin, inosin, N6-isopentenyladenin, 1-metylguanin, 1-metylinosin, 2,2-dimetyl-guanin, 2-metyladenin, 2-metylguanin, 3-metylcytosin, 5-metylcytosin, N6-adenin, 7-metylguanin, 5-metylaminometyluracil, 5-metoksyaminometyl-2-tiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5N-metoksykarboksymetyluracil, 5-metoksyuracil, 2-metyltio-N6-isopentenyladenin, uracil-5-oksyeddiksyre (v), qybutoksosin, pseudouracil, queosin, 2-tiocytosin, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, uracil-5-oksyeddiksyremetylester, uracil-5-oksyeddiksyre (v), 5-metyl-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropyl)uracil, (acp3)w og 2,6-diaminopurin.

Videre kan et polynukleotid som brukes i den foreliggende oppfinnelsen omfatte minst én modifisert sukkergruppe valgt fra gruppen som inkluderer, men som ikke er begrenset til, arabinose, 2-fluorarabinose, xylulose og heksose.

Det er underforstått at fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen ikke er begrenset av kilden for polynukleotidet. Polynukleotidet kan være fra et menneske eller fra et annet pattedyr, kan være avledet fra enhver rekombinant kilde, syntetisert in vitro eller ved hjelp av kjemisk syntese. Nukleotidet kan være DNA eller RNA og kan eksistere i en dobbelttrådet, enkelttrådet eller delvis dobbelttrådet form.

Nukleinsyrer som kan brukes ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel innbefatte, men er ikke begrenset til, oligonukleotider så som antisens DNA-molekyler og/eller RNA-molekyler; ribozymer; DNA for genterapi; DNA- og/eller RNA-kimærer; forskjellige strukturelle former av DNA inklusive enkelttrådet DNA, dobbelttrådet DNA, supersammenrullet DNA og/eller trippelspiralformet DNA; Z-DNA; og lignende.

Nukleinsyrene kan også fremstilles ved enhver kjent fremgangsmåte som brukes for å fremstille nukleinsyrer i store mengder. For eksempel kan DNA-molekyler og RNA-molekyler kjemisk syntetiseres ved å bruke kommersielt tilgjengelige reagenser og synteseapparater og ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er velkjente (se for eksempel Gait, 1985, Oligonucleotide Svnthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England). RNA kan fremstilles i høyt utbytte via en in vitro transkripsjon ved å bruke plasmider så som SP65 (Promega Corporation, Madison, WI).

Ethvert mRNA-transkript som er kodet av Bv8-nukleinsyresekvenser kan brukes i de foreliggende fremgangsmåtene, og dette innbefatter spesielt mRNA-transkripter som er et resultat av alternativ spleising eller bearbeiding av mRNA-forløpere.

I enkelte tilfeller hvor det er ønskelig med en bedret nukleasestabilitet, er det foretrukket å bruke nukleinsyrer med modifiserte internukleosidbindinger. Nukleinsyrer som inneholder modifiserte internukleosidbindinger kan også syntetiseres ved å bruke reagenser og fremgangsmåter som i seg selv er kjente. Det er for eksempel kjente fremgangsmåter for å syntetisere nukleinsyrer som inneholder fosfonatfosfortioat, fosforditioat, fosforamidat, metoksyetylfosforamidat, formacetal, tioformacetal, diisopropylsilyl, acetamidat, karbamat, dimetylen-sulfid (-CH2-S-CH2), dimetylensulfoksid (-CH2-SO-CH2), dimetylensulfon (-CH2-S02-CH2), 2'-0-alkyl og 2'-deoksy-2'-fluorfosfortioat internukleosidbindinger (se Uhlmann et al, 1990. Chem. Rev. 90: 543-584; Schneider et al, 1990, Tetrahedron Lett. 31: 335 og referanser som der er angitt).

I visse utførelser av den foreliggende oppfinnelsen er det anvendte nukleotidet et a-anomert nukleotid. Et ct-anomert nukleotid danner spesifikke dobbelttrådede hybrider med komplementært RNA hvor trådene løper parallelt til hverandre i motsetning til det som forefinnes i vanlige P-enheter (Gautier et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641). Nukleotidet er et 2N-0-metylribonukleotid (Inoue et al, 1987, Nucl. Acids Res. 75: 6131-6148) eller en kimært RNA-DNA-analog (Inoue et al, 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).

Nukleinsyrene kan renses ved hjelp av enhver egnet fremgangsmåte av de typer som er velkjente innenfor bioteknologien. For eksempel kan nukleinsyrene renses ved revers fase eller ioneutbyttings HPLC, størrelsesekskluderende kromatografi eller gelelektroforese. Personer med innsikt i fagfeltet vil forstå at fremgangsmåten som brukes for rensing delvis vil være avhengig av størrelsen på det DNA som skal renses.

Isolerte eller rensede polynukleotider med minste 10 nukleotider (det vil si en hybridiserbar del) av en Bv8-kodende sekvens eller dens komplement, kan også brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. I andre utførelser inneholder polynukleotidene minst 25 (kontinuerlige) nukleotider, 50 nukleotider, 100 nukleotider, 150 nukleotider eller 200 nukleotider av en Bv8-kodende sekvens eller en fullengde Bv8-kodende sekvens. Nukleinsyrene kan være enkelt- eller dobbelttrådede. Oppfinnelsen angår videre polynukleotider som selektivt hybridiserer seg til et komplement av de foran nevnte kodende sekvensene. I foretrukne utførelser inneholder polynukleotidene minst 10, 25, 50, 100, 150 eller 200 nukleotider eller hele lengden av en Bv8-kodende sekvens. Nukleotidsekvenser som koder en mutant av Bv8, peptidfragmenter av Bv8, trunkerte eller forkortede former av Bv8 og Bv8-fusjonsproteiner kan også brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. Nukleotider som koder fusjonsproteiner kan inkludere, men er ikke begrenset til, fullengde Bv8-sekvenser, forkortede former av Bv8 eller nukleotider som koder peptidfragmenter av Bv8 fusjonert til et urelatert protein eller peptid som for eksempel et domene fusjonert til et lg Fc-domene som øker stabiliteten og halvlivet for de resulterende fusjonsproteiner (for eksempel Bv8-Ig) i blodstrømmen; eller et enzym så som et fluorescerende protein eller luminescerende protein som kan brukes som en markør.

Videre kan Bv8-polynukleotidvarianter som er utviklet i det minste delvis ved en form for direkte evolusjon, det vil si genstokking og/eller en tilbakerekombinasjon av sekvensen slik det for eksempel er beskrevet i U.S. patent nr. 5,605,793 og 5,837,458, kan brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. Ved for eksempel å bruke slike teknikker er det mulig å anvende en Bv8-kodende sekvens eller et utvalg av slike sekvenser som startpunkt for utvikling av nye sekvenser som koder funksjonalitet og/eller strukturelt lignende proteiner med endrede funksjonelle og/eller strukturelle egenskaper.

Meget nærstående genhomologer av de Bv8-kodende polynukleotidsekvensene som her er beskrevet kan også brukes i oppfinnelsen. Meget nærstående genhomologer er polynukleotider som koder proteiner som har minst 60% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvensen i naturlig forekommende Bv8, så som det modne humane Bv8 på figur 2 eller figur 4 (SEKV.ID. NR. 2 og 4) og som fortrinnsvis har minst ca 65%, 70%, 75%, 80% med økende preferanse på fra minst 85% til minst 99% aminosyresekvensidentitet i trinn på 1%. Meget nærstående homologer kan kode proteiner som har samme funksjonelle aktiviteter som Bv8.

Fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen har også fordel av å bruke (a) DNA-vektorer som inneholder enhver av de foran nevnte Bv8-kodende sekvensene og/eller deres komplementer (det vil si antisens); (b) DNA-ekspresjonsvektorer som inneholder enhver av de foran nevnte Bv8-kodende sekvensene operativt assosiert med et regulerende element som styrer ekspresjonen av de kodende sekvensene; (c) genetisk manipulerte vertsceller som inneholder enhver av de foran nevnte Bv8-kodende sekvensene operativt assosiert med et regulerende element som styrer ekspresjonen av de kodende sekvensene i vertscellen; og (d) genetisk manipulerte vertsceller som uttrykker et endogent Bv8-gen under kontroll av et eksogent innført regulerende element (det vil si genaktivering).

Variasjoner i det naturlige sekvens Bv8 eller i forskjellige domener i dette proteinet slik det er beskrevet her, kan for eksempel utføres ved å bruke enhver av de teknikker og retningslinjer for konservative og ikke-konservative mutasjoner som for eksempel er beskrevet i U.S. patent nr. 5,364,934. Disse variasjonene kan være substitusjon, delesjon eller innsetting av en eller flere kodoner som koder Bv8 og som resulterer i en forandring i aminosyresekvensen i nevnte Bv8 sammenlignet med den naturlige sekvensen i Bv8. Eventuelt kan variasjonen være en substitusjon av minst en aminosyre med enhver annen aminosyre i ett eller flere av domenene i Bv8. Innsyn eller retningslinjer for å bestemme hvilke aminosyreresidua som kan innsettes, substitueres eller fjernes uten skadelig å påvirke den forønskede aktiviteten kan man få ved å sammenligne sekvensen i Bv8 med tilsvarende homologe kjente proteinmolekyler og derved minimalisere antallet aminosyre-sekvensforandringer som gjøres i områder med høy homologi. Aminosyresub-stitusjoner kan være et resultat av å erstatte en aminosyre med en annen aminosyre som har tilsvarende strukturelle og/eller kjemiske egenskaper, for eksempel å erstatte leukin med serin, det vil si konservative aminosyreerstatninger. Innsettinger eller fjerninger kan eventuelt være i området fra ca. 1 til 5 aminosyrer. Den variasjon som kan tillates kan bestemmes ved systematisk å foreta innsettinger, fjerninger eller substitusjoner av aminosyrer i sekvensen og deretter teste de resulterende variantene for aktivitet av samme type som man finner i fullengde eller naturlige modne sekvenser.

Bv8-polypeptidfragmenter kan også brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. Slike fragmenter kan være forkortet ved N-terminus eller C-terminus eller kan mangle indre residua, for eksempel sammenlignet med et fullengde naturlig protein. Enkelte fragmenter mangler aminosyreresidua som ikke er vesentlige for en ønsket biologisk aktivitet for Bv8-polypeptidet.

Bv8-fragmenter kan fremstilles ved en rekke forskjellige kjente teknikker. Ønskelige peptidfragmenter kan også kjemisk syntetiseres. En alternativ fremgangsmåte innbefatter å utvikle Bv8-fragmenter ved enzymatisk kutting, det vil si å behandle proteinet med en enzym som er kjent for å spalte proteiner på steder som er definert ved spesielle aminosyreresidua, eller kutte nevnte DNA med egnede restriksjonsenzymer og så isolere det forønskede fragmentet. Andre egnede teknikker innbefatter å isolere og amplifisere et DNA-fragment som koder et forønsket polypeptidfragment, for eksempel ved hjelp av en polymerasekjede-reaksjon (PCR). Oligonukleotider som definerer de forønskede termini for DNA-fragmentet brukes i 5'- og 3'-primerne i nevnte PCR. Det er foretrukket at Bv8-polypeptidfragmentene har i det minste en biologisk og/eller immunologisk aktivitet felles med et naturlig Bv8-polypeptid.

I spesielle utførelser er konservative substitusjoner av interesse vist i tabell 1 under overskriften foretrukne substitusjoner. Hvis slike substitusjoner resulterer i en forandring av biologisk aktivitet, så kan man innføre ytterligere forandringer, angitt som eksempelsubstitusjoner i tabell 1, eller som ytterligere beskrevet i det etterfølgende med henvisning til aminosyregrupper, hvoretter produktene kan screenes og undersøkes.

Vesentlige modifikasjoner i funksjon eller immunologisk identitet for Bv8-polypeptidet utføres ved å velge ut substitusjoner som skiller seg signifikant med hensyn til sin effekt på å opprettholde (a) strukturen på selve polypeptidkjeden i substitusjonsområdet, for eksempel som en plate eller spiralkonformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisitet på molekylet ved målsetet, eller (c) volumet av sidekjeden. Naturlig forekommende residua blir ofte oppdelt i grupper basert på deres felles sidekjedeegenskaper: (1) hydrofobe: norleukin, met, ala, val, leu, ile; (2) nøytralt hydrofil: cys, ser, thr; (3) sur: asp, glu; (4) basisk: asn, gin, his, lys, arg;

(5) residua som påvirker kjede orientering: gly, pro; og

(6) aromatisk: trp, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil være å bytte ut en aminosyre i en av disse klassene med en aminosyre i en annen klasse. Slike substituerte residua kan innføres i konservative substitusjonsseter eller mer foretrukket, i de gjenværende (ikke-konserverte) setene.

Variasjonene kan utføres ved å bruke velkjente fremgangsmåter så som oligo-nukleotidkontrollert (seterettet) mutagenese, alaninscreening og PCR-mutagenese. Seterettet mutagenese (Carter et al., Nucl. Acids Res.. 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.. 10: 6487 (1987)), kasettmutagenese (Wells et al., Gene. 34: 315

(1985)), restriksjonsseleksjonsmutagenese (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A. 317: 415 (1986)) eller andre kjente teknikker kan brukes på klonet DNA for å fremstille Bv8-variant DNA.

Skanningaminosyreanalyse kan også brukes for å identifisere en eller flere aminosyrer i en sammenhengende sekvens. De foretrukne skanningaminosyrene er relativt små og nøytrale aminosyrer. Slike aminosyrer innbefatter alanin, glysin, serin og cystein. Alanin er typisk en foretrukket skanningaminosyre i gruppen, ettersom denne eliminerer side kjeder utenfor beta-karbonatomet, foruten at det er mindre sannsynlighet for at variantens hovedkjedekonformasjon blir endret (Cunningham og Wells, Science. 244: 1081-1085 (1989)). Alanin er også foretrukket, ettersom den er den mest vanlige aminosyren. Videre blir den ofte funnet i både skjulte og eksponerte posisjoner (Creighton, The Proteins. (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chotia, J. Mol. Biol.. 150: 1 (1976)). Hvis alaninsub-stitusjon ikke gir tilfredsstillende variasjon, så er det mulig å bruke en isoterisk aminosyre.

2. Produksjon av Bv8 og Bv8- varianter

Det er innenfor bioteknologien kjent mange teknikker og fremgangsmåter for produksjon av Bv8 og Bv8-varianter. Ettersom de foretrukne teknikkene er de samme for Bv8 og Bv8-variantene, så angår de teknikker som er beskrevet nedenfor både Bv8-varianter så vel som naturlig sekvens Bv8.

De foretrukne produksjonsmetodene innbefatter å isolere Bv8 fra en endogen kilde for polypeptidet, utføre en peptidsyntese (ved å bruke et peptidsynteseapparat) eller rekombinant teknikk (eller enhver kombinasjon av disse teknikkene).

Det meste av den diskusjon som er gitt i det etterfølgende angår rekombinant produksjon av Bv8 ved å dyrke celler som er transformert med en vektor som inneholder Bv8-nukleinsyre og deretter innvinne polypeptidet fra cellekulturen. Personer med innsikt i fagfeltet vil imidlertid forstå at det er mange måter å produsere Bv8 på.

Kort beskrevet innbefatter denne fremgangsmåten å transformere primære humane celler som inneholder et Bv8-kodende gen med et konstrukt (for eksempel en vektor) som omfatter et amplifiserbart gen (så som dihydrofolatreduktase (DHFR) eller andre som er beskrevet i det etterfølgende) og minst ett flankerende område med en lengde på minst 150 bp som er homologt med en DNA-sekvens ved locus for det kodende området av Bv8-genet, for derved å tilveiebringe amplifisering av Bv8-genet. Transformasjonen utføres slik at konstruktet blir homogent integrert i de primære cellenes genom slik at de her definerer et amplifiserbart område.

Primære celler som omfatter konstruktet kan velges ved hjelp av det amplifiserbare genet eller en markør som er tilstede i konstruktet. Nærværet av markørgenet vil fastslå nærværet og integreringen av konstruktet i vertsgenomet. Det er ikke nødvendig med ytterligere seleksjon av de primære cellene, ettersom seleksjonen vil bli utført i en annen vert. Hvis det er ønskelig, kan forekomsten av homologe rekombinante reaksjoner bestemmes ved å bruke PCR og enten sekvensere de resulterende amplifiserte DNA-sekvensene eller bestemme den passende lengden på PCR-fragmentet når DNA fra de riktige homologe integrerte genene er tilstede og så oppformere disse cellene som inneholder slike fragmenter. Hvis det er ønskelig, kan de utvalgte cellene amplifiseres på dette punktet ved å stresse cellene med et passende amplifiseringsmiddel (for eksempel metotreksat hvis det amplifiserbare genet er DHFR), slik at det kan oppnås mange kopier av det forønskede genet. Det er imidlertid foretrukket at amplifiseringen ikke utføres før etter den andre transformasjonen som er beskrevet i det etterfølgende.

Etter seleksjonstrinnet blir DNA-delene av genomet, tilstrekkelig store til å inkludere hele det amplifiserbare området, isolert fra de valgte primære cellene. Sekundære pattedyrekspresjonsvertsceller kan så transformeres med disse genomiske DNA-delene og klones, hvoretter man velger ut de klonene som inneholder det amplifiserbare området. Dette kan så amplifiseres ved hjelp av et amplifiseringsmiddel hvis dette ikke allerede forefinnes i de primære cellene. Til slutt vil man så dyrke opp de sekundære ekspresjonsvertscellene som nå omfatter multiple kopier av det amplifiserbare området som inneholder Bv8, for derved å få uttrykt genet og få fremstilt proteinet.

DNA-kodende Bv8 kan oppnås fra ethvert cDNA-bibliotek fremstilt fra vev som antas å inneholde Bv8 mRNA og så få dette uttrykt på et påvisbart nivå. Følgelig kan Bv8 DNA hensiktsmessig oppnås fra et cDNA-bibliotek fremstilt for eksempel fra flere typer humane vev. Det nevnte Bv8-kodende genet kan også oppnås fra et genomisk bibliotek eller ved oligonukleotidsyntese.

Biblioteker kan også screenes med prober (så som antistoffer for Bv8 eller oligonukleotider med 20-80 baser) som er utformet for å identifisere genet av interesse eller det proteinet som kodes av genet. Screening av cDNA eller genomiske biblioteker med utvalgte prober kan utføres ved hjelp av standard fremgangsmåter, for eksempel slik det er beskrevet i kapitlene 10-12 i Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). En alternativ fremgangsmåte for å isolere genet som koder Bv8, er å bruke den PCR-metodologi som er beskrevet i kapittel 14 i Sambrook et al, supra.

En foretrukket fremgangsmåte for å isolere Bv8 cDNA er å bruke nøyaktig utvalgte oligonukleotidsekvenser til å screene cDNA-biblioteker fra forskjellige typer humane vev. De oligonukleotidsekvensene som er valgt som prober bør ha tilstrekkelig lengde og bør være tilstrekkelig entydige til at man kan minimalisere forekomsten av falske positive tilfeller. De foretrukne sekvensene er de som er oppnådd fra naturlig forekommende Bv8 som beskrevet her.

Oligonukleotidet må merkes slik at det kan påvises ved hybridisering til DNA i det biblioteket som screenes. Den foretrukne fremgangsmåten med hensyn til merking er å bruke<32>P-merket ATP med polynukleotidkinase, noe som er velkjent innenfor bioteknologien, for derved å radiomerke oligonukleotidet. Man kan imidlertid også bruke andre fremgangsmåter for å merke oligonukleotidet og disse innbefatter, men er ikke begrenset til, biotinylering eller enzymmerking.

Nukleinsyren (det vil si cDNA eller genomisk DNA) som koder Bv8 kan settes inn i en replikerbar vektor for ytterligere kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. For dette formålet er det mange vektorer tilgjengelig. Vektor-komponentene innbefatter generelt, men er ikke begrenset til, en eller flere av de følgende: En signalsekvens, et replikasjonsorigo, en eller flere markørgener, et forsterkende element, en promotor og en transkripsjonstermineringssekvens.

Bv8 ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles rekombinant, ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid som fortrinnsvis er en signalsekvens eller et annet polypeptid som har et spesifikt spaltningssete ved N-terminus i det modne proteinet eller polypeptidet. Generelt kan signalsekvensen være en komponent av vektoren, eller den kan være en del av det Bv8 DNA som innsettes i vektoren. Den valgte heterologe signalsekvensen er fortrinnsvis en som blir gjenkjent og bearbeidet (for eksempel spaltet av en signalpeptidase) av vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og bearbeider den naturlige Bv8-signalsekvensen, så blir denne erstattet med en prokaryot signalsekvens som for eksempel kan velges fra gruppen bestående av alkalisk fosfatase, penicillinase, lpp og varmestabile enterotoksin II-ledere. For gjærsekresjon kan den naturlige signalsekvensen erstattes med for eksempel en gjærinvertaseleder, en ct-faktorleder (inklusive Saccharomyces og Kluyveromyces a-faktorledere, og den sistnevnte er beskrevet i U.S. patent nr. 5,010,182 utstedt 23. april 1991), eller en syrefosfatase-leder, C. albicans glukoamylaselederen (EP 362,179 publisert 4. april 1990) eller den signalsekvensen som er beskrevet i WO 90/13646 publisert 15. november 1990. Ved ekspresjon i pattedyrceller, vil den naturlige signalsekvensen (det vil si Bv8-presekvensen som normalt styrer sekresjonen av Bv8 fra humane celler in vivo) være tilfredsstillende, skjønt også andre pattedyrsignalsekvenser kan være egnet, så som signalsekvensene fra andre dyre Bv8-polypeptider, og signalsekvenser fra utskilte polypeptider fra samme eller nærstående arter så vel som virale, sekretoriske ledere, for eksempel herpes simplex gD-signalet.

DNA for slike forløperområder blir ligert i leseramme til DNA som koder modent Bv8 eller en løselig variant av dette.

Både ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som gjør det mulig for vektoren å replikere seg i en eller flere av de valgte vertscellene. I klonende vektorer er vanligvis denne sekvensen en som gjør det mulig for vektoren å replikere seg uavhengig av det vertskromosomale DNA, og innbefatter replikasjonsorigo eller autonome replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente for en rekke bakterier, gjær og virus. Replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 er egnet for de fleste Gram-negative bakterier, 2 u. plasmidorigo er egnet for gjær og forskjellige virale origo (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) kan brukes for klonende vektorer i pattedyrceller. Generelt vil replikasjonsorigo-komponenten ikke være nødvendig for pattedyrekspresjonsvektorer (SV40-origoet kan typisk brukes bare fordi det inneholder en tidlig promotor).

De fleste ekspresjonsvektorene er såkalte "shuttle" vektorer, det vil si at de er i stand til å replikere seg i minst én organismeklasse, men kan transfekteres også over i andre organismer for ekspresjon. En vektor kan for eksempel klones i E. coli og deretter kan den transfekteres eller overføres i gjær- eller pattedyrceller for ekspresjon, selv om den ikke er i stand til en replikasjon uavhengig av vertscellekromosomet.

DNA kan også amplifiseres ved innsetting i vertsgenomet. Dette kan lett utføres ved å bruke Bacillus- arter som verter, for eksempel ved at man i vektoren inkluderer en DNA-sekvens som er komplementær til en sekvens som finnes i Bacillus genomisk DNA. Transfeksjon av Bacillus med denne vektoren vil resultere i homolog rekombinasjon med genomet og innsetting av Bv8 DNA. En innvinning av genomisk DNA som koder Bv8 er imidlertid mer kompleks enn for en eksogent replikert vektor, fordi det er nødvendig med restriksjonsenzymkutting for å få ut nevnte Bv8 DNA.

Ekspresjons- og kloningsvektorer bør inneholde et seleksjonsgen som ofte betegnes som en selekterbar markør. Dette genet koder et protein som er nødvendig for overlevelse eller vekst for de transformerte vertscellene når disse dyrkes i et selektivt kulturmedium. Vertsceller som ikke blir transformert med vektoren som inneholder dette seleksjonsgenet vil således ikke overleve i dyrkningsmediet. Typiske seleksjonsgener koder proteiner som (a) gir resistens for antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetrasyklin, (b) komplementerer forskjellige typer auksotrofisk svikt eller (c) tilfører kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra komplekse media, for eksempel genet som koder D-alaninracemase for Bacilli.

Et eksempel på en seleksjonsprosess bruker en kjemisk forbindelse for å stanse veksten av en vertscelle. De celler som med godt resultat blir transformert med et heterologt gen vil så produsere et protein som tilveiebringer resistens mot nevnte kjemiske forbindelse og således overleve seleksjonsregimet. En slik dominant seleksjon bruker for eksempel forbindelsene neomycin, mykofenolsyre og hygromycin.

Andre eksempler på egnede selekterbare markører for pattedyrceller er de som muliggjør identifikasjon av celler som er kompetente til å ta opp Bv8-nukleinsyren så som DHFR eller tymidinkinase. Pattedyrcelletransformantene blir plassert under et seleksjonstrykk hvor bare de transformantene vil overleve som har tatt opp markøren. Seleksjonstrykket kan utøves ved å dyrke transformantene under betingelser hvor konsentrasjonen av seleksjonsmediet i dyrkningsmediet suksessivt forandres, noe som fører til en amplifisering av både seleksjonsgenet og det DNA som koder Bv8. Amplifisering er den prosessen ved hjelp av hvilken genene som er mest etterspurt for produksjonen av et protein som er kritisk for vekst blir gjentatt i tandem inne i kromosomene hos suksessive generasjoner av rekombinante celler. Økende mengder av Bv8 blir således syntetisert fra det amplifiserte DNA. Andre eksempler på amplifiserbare gener innbefatter metallotionein-I og -II, fortrinnsvis primat metallotioneingener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase etc. Et foretrukket vektorsystem er beskrevet i U.S. patent nr. 5,561,053.

For eksempel kan celler transformert med DHFR-seleksjonsgenet først identifiseres ved å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), en konkurrerende antagonist for DHFR. En passende vertscelle når man anvender villtype DHFR er den kinesiske hamstereggstokk (CHO) cellelinjen som har DHFR-aktivitetssvikt, fremstilt og oppformert som beskrevet av Urlaub et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980). De transformerte cellene blir så eksponert for økende nivåer av metotreksat. Dette fører til syntese av multiple kopier av DHFR-genet og samtidig multiple kopier av annet DNA som omfatter ekspresjonsvektorer så som det DNA som koder Bv8. Denne amplifiseringsteknikken kan brukes med enhver på annen måte egnet vert, for eksempel ATCC nr. CCL61, CHO-K1, uansett nærværet av endogent DHFR, for eksempel hvis man bruker et mutant DHFR-gen som er sterkt resistent mot Mtx (EP 117,060).

Alternativt kan vertsceller (da typisk villtypeverter som inneholder endogent DHFR) transformeres eller samtransformeres med DNA-sekvenser som koder Bv8, villtype DHFR-protein og andre selekterbare markører så som aminoglykosid 3'-fosfotransferase (APH) ved at cellene dyrkes i et medium som inneholder et seleksjonsmiddel for den selekterbare markøren, for eksempel et aminoglykosidisk antibiotikum, for eksempel kanamycin, neomycin eller G418. Se U.S. patent nr. 4,965,199.

Et egnet seleksjonsgen som kan brukes i gjær er trpl-genet som er tilstede i gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). Dettefrpl-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1, Jones, Genetics, 85: 12 (1977). Nærværet av trp 1 -såret i gjærcellens genom kan så gi et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved dyrking i fravær av tryptofan. På lignende måte blir Leu2-sviktende gjærstammer (ATCC 20,622 eller 38,626) komplementert ved kjente plasmider som bærer Zew2-genet.

I tillegg kan vektorer avledet fra det 1,6 u.m sirkulære plasmidet pKDl brukes for

transformasjon av Kluyveromyces- gjær. Bianchi et al, Curr. Genet., 12: 185 (1987). Nylig er det beskrevet et ekspresjonssystem for storskalaproduksjon av rekombinant kalvekymosin ved hjelp av K. lactis. Van den Berg, Bio/ Technology, 8: 135 (1990). Det er også blitt beskrevet stabile multikopiekspresjonsvektorer for sekresjon av modent rekombinant humant serum albumin ved hjelp av industrielle stammer av Kluyveromyces. Fleer et al, Bio/ Technology, 9: 968-975 (1991).

Ekspresjons- og kloningsvektorer vil vanligvis inneholde en promotor som blir gjenkjent av vertsorganismen og som operativt er forbundet med Bv8-nukleinsyren. Promotorer er utranslaterte sekvenser plassert oppstrøms (5') for startkodonet i et strukturelt gen (vanligvis med fra 100 til 1000 basepar) som kontrollerer transkripsjonen og translateringen av en spesiell nukleinsyresekvens så som Bv8-nukleinsyresekvensen, til hvilken de er operativt forbundet. Slike promotorer vil vanligvis bli plassert i to klasser, induserbare og konstitutive. Induserbare promotorer er slike som fremmer en økende transkripsjon fra DNA under deres kontroll som en reaksjon på forandringer i dyrkningsbetingelsene, for eksempel nærvær eller fravær av et næringsstoff eller en temperaturforandring. Det er for tiden kjent et stort antall promotorer som gjenkjennes av en rekke forskjellige potensielle vertsceller. Disse promotorene er operativt forbundet til Bv8-kodende DNA ved å fjerne promotoren fra det opprinnelige DNA ved restriksjonsenzymkutting og innsette den isolerte promotorsekvensen i vektoren. Både den naturlige Bv8-promotorsekvensen og mange heterologe promotorer kan brukes for direkte amplifisering og/eller ekspresjon av Bv8 DNA. Det er imidlertid foretrukket å bruke heterologe promotorer, ettersom disse generelt muliggjør bedre transkripsjon og høyere utbytter av Bv8 sammenlignet med den naturlige Bv8-promotoren.

Promotorer som er egnet for bruk i prokaryote verter innbefatter (3-laktamase- og laktosepromotorsystemene (Chang et al, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al, Nature, 281: 544 (1979)), alkalinsk fosfatase, et tryptofan (trp) promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776) og hybridpromotorer så som tac-promotoren. deBoer et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80: 21-25 (1983). Man kan imidlertid også bruke andre egnede bakterielle promotorer. Deres nukleotidsekvenser er blitt publisert slik at fagpersoner med tilstrekkelig innsyn operativt kan ligere dem til DNA-kodende Bv8 (Siebenlist et al, Cell, 20: 269

(1980)) ved å bruke linkere eller adaptorer for å tilføre eventuelle nødvendige restriksjonsseter. Promotorer som skal brukes i bakterielle systemer vil også inneholde en Shine-Delgarno (S.D.) sekvens som er operativt forbundet til det DNA som koder Bv8.

Promotorsekvenser er også kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har et AT-rikt område plassert ca 25 til 30 baser oppstrøms fra det setet hvor transkripsjonen startes. En annen sekvens som finnes fra 70 til 80 baser oppstrøms fra transkripsjonsstartpunktet i mange gener, er et CXCAAT-område hvor X kan være ethvert nukleotid. Ved 3'-enden i de fleste eukaryote gener er det en AATAAA-sekvens som kan være signalet for addering av poly-A-halen til 3'-enden i den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene kan egnet innsettes i eukaryote ekspresjonsvektorer.

Eksempler på egnede promotorsekvenser som kan brukes i gjærverter innbefatter promotorene for 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al, J. Biol. Chem., 255: 2073

(1989)) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149

(1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1978)) så som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotorer som er induserbare promotorer, men som har den ytterligere fordelen at transkripsjonen er kontrollert av vekstbetingelsene, er promotorområdene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, syrefosfatase, degradative enzymer assosiert med nitrogenmetabolismen, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galaktoseutnyttelse. Egnede vektorer og promotorer som kan brukes i gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i EP 73,657. Gjærforsterkere kan også med fordel brukes sammen med gjærpromotorer.

Bv8-transkripsjon fra vektorer i pattedyrvertsceller er for eksempel kontrollert ved hjelp av promotorer som oppnås fra genomene i forskjellige typer virus så som polyomavirus, hønsedifterivirus (UK 2,211,504 publisert 5. juli 1989), adenovirus (så som adenovirus 2), storfe papillomvirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og mest foretrukket simian virus 40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotorer, for eksempel aktinpromotoren eller en immunoglobulinpromotor, fra varmesjokkpromotorer og fra promotorer som normalt er assosiert med Bv8-sekvensen, forutsatt at slike promotorer er forenlige med vertscellesystemene.

De tidlige og senere promotorene for SV40-viruset kan hensiktsmessig oppnås som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder det SV40-virale replikasjonsorigo. Fiers et al, Nature, 273: 113 (1978); Mulligan et al, Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78: 7398-7402

(1981) . Den umiddelbare tidlige promotoren for det humane cytomegaloviruset kan hensiktsmessig oppnås som et Hindlll E-restriksjonsfragment. Greenaway et al, Gene, 18: 355-360 (1982). Et system for å uttrykke DNA i pattedyrverter ved å bruke storfe papillomviruset som en vektor er beskrevet i U.S. patent nr. 4,419,446. En modifikasjon av dette systemet er beskrevet i U.S. patent nr. 4,601,978. Se også Gray et al, Nature, 295: 503-508 (1982), når det gjelder ekspresjon av et cDNA som koder et immuninterferon i apeceller; Reyes et al, Nature, 297: 598-601

(1982) når det gjelder ekspresjon av humant p-interferon cDNA i museceller under kontrollen av en tymidinkinasepromotor fra herpes simplex virus; Canaani et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79: 5166-5170 (1982) når det gjelder ekspresjon av det humane interferon pi-genet i dyrkede muse- og kaninceller; og Gorman et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79: 6777-6781 (1982) når det gjelder ekspresjon av bakterielle CAT-sekvenser i CV-l-apenyreceller, kyllingembryofibroblaster, kinesiske hamstereggstokkceller, HeLa-celler og muse NIH-3T3-celler ved å bruke den såkalte lange terminale repeat fra Rous sarkomvirus som en promotor.

Transkripsjon av et DNA som koder Bv8 i høyere eukaryoter blir ofte økt ved å innsette en forsterkende sekvens i vektoren. Forsterkere er cisvirkende elementer av DNA, vanligvis fra 10 til 300 bp, og kan virke på en promotor for å øke dens transkripsjon. Forsterkere er relativt orienterings- og stillingsuavhengige og er blitt funnet 5' (Laimins et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 78: 993 (1981)) og 3' (Lusky et al, Mol Cell Biol, 3: 1108 (1983)) i forhold til transkripsjonsenheten, inne i et intron (Banerji et al, Cell, 33: 729 (1983)) så vel som inne i den kodende sekvensen. Osborne et al, Mol. Cell Bio., 4: 1293 (1984). Mange forsterkende sekvenser er nå kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, ct-fetoprotein og insulin). Typisk vil man imidlertid bruke en forsterker fra et eukaryotisk cellevirus. Eksempler innbefatter SV40-forsterkeren på den såkalte sene siden av replikasjonsorigo (bp 100-270), cytomegalovirusets tidlige promotorforsterker, polyomforsterkeren på den sene siden av replikasjonsorigo og adenovirus-forsterkere. Se også Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) når det gjelder forsterkende elementer for aktivering av eukaryote promotorer. De forsterkende elementene kan spleises inn i en vektor i posisjon 5' eller 3' i forhold til den Bv8-kodende sekvensen, men er fortrinnsvis plassert ved et sete 5' fra promotoren.

Ekspresjonsvektorer som skal brukes i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, insekter, planter, dyr og mennesker og nukleerte celler fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendige for avslutningen av transkripsjonen og for stabilisering av mRNA. Slike sekvenser er vanlig tilgjengelig fra 5'-enden, av og til 3', utranslaterte områder av eukaryote eller virale DNA-molekyler eller cDNA. Disse områdene inneholder nukleotidsegmenter som er transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av det mRNA som koder Bv8.

Konstruksjon av egnede vektorer som inneholder en eller flere av de ovenfor angitte komponenter bruker standard ligeringsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, tilpasses og religeres i den form som er ønskelig for å kunne utvikle det eller de nødvendige eller forønskede plasmider.

For analyse for å bekrefte at de korrekte sekvensene forefinnes i de konstruerte plasmidene, blir ligeringsblandingene brukt for å transformere E. coli K12-stamme 294 (ATCC 31,446) hvoretter vellykkede transformanter velges ut ved ampicillin-eller tetrasyklinresistens når dette måtte passe. Plasmider fra transformantene blir fremstilt, analysert ved hjelp av restriksjonsendonukleasekutting og/eller sekvenser ved den fremgangsmåten som er beskrevet av Messing et al, Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved fremgangsmåten til Maxam et al, Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

Spesielt brukbare ved fremstillingen av Bv8 og Bv8-varianter er ekspresjonsvektorer som gir en forbigående ekspresjon i pattedyrceller av DNA som koder Bv8. Vanligvis vil forbigående ekspresjon innbefatte bruken av en ekspresjonsvektor som er i stand til effektivt å replikere seg i en vertscelle slik at denne akkumulerer mange kopier av ekspresjonsvektoren, og deretter igjen syntetiserer store mengder av det forønskede polypeptidet som er kodet av ekspresjonsvektoren. Sambrook et al, supra, sidene 16.17-16.22. Forbigående ekspresjonssystemer som omfatter en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle gjør det mulig å utføre en hensiktsmessig positiv identifisering av polypeptider som er kodet av det klonede DNA, så vel som en rask screening av slike polypeptider for forønskede biologiske eller fysiologiske egenskaper. Forbigående ekspresjonssystemer er således spesielt brukbare i foreliggende oppfinnelse for det formål å identifisere analoger og varianter av Bv8 som er biologisk aktive Bv8.

Andre metoder, vektorer og vertsceller som er egnet for tilpasning til syntesen av Bv8 i rekombinante virveldyrcellekulturer er beskrevet i Gething et al, Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al, Nature, 281: 40-46 (1979); EP 117,060; og EP 117,058. Et spesielt brukbart plasmid for pattedyrcellekulturekspresjon av Bv8 er pRK5 (EP 307,247) eller pSV16B. WO 91/08291 publisert 13. juni 1991.

Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA i de her beskrevne vektorene er prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Egnede prokaryoter for dette formålet innbefatter eubakteria så som Gram-negative eller Gram-positive organismer, for eksempel Enterobacteriaceae så som Escherichia, for eksempel E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans, og Shigella, så vel som Bacilli så som B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P beskrevet i DD 266,710 publisert 12. april 1989), Pseudomonas så som P. aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E. coli kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31,446), skjønt også andre stammer så som Ti. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) og E. coli W3110 (ATCC 27,325) også er egnede. Disse eksemplene er kun illustrerende og ikke begrensende som sådan. Stamme W3110 er en spesielt foretrukket vert eller en utgangsvert, fordi det er en vanlig vertsstamme for rekombinante DNA-produktfermenteringer. Det er foretrukket at vertscellen bør skille ut minimale mengder av proteolytiske enzymer. For eksempel kan stamme W3110 modifiseres slik at den frembringer en genetisk mutasjon i de gener som koder proteiner med for eksempel slike verter som innbefatter E. coli W3110 stamme 27C7. Den fullstendige genotypen for 27C7 er tonAA ptrS phoAAE15 A( argF- lac) 169 omptA degp41kan'. Stamme 27C7 ble innlevert den 30. oktober 1991 til the American Type Culture Collection som ATCC nr. 55,244. Alternativt kan man anvende stammen av E. coli som har mutant periplasmisk protease og som er beskrevet i U.S. patent nr. 4,946,783 utstedt 7. august 1990.

I tillegg til prokaryoter, er også eukaryote mikrober så som stråformet sopp eller gjær egnet som klonings- eller ekspresjonsverter for Bv8-kodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakegjær er den mest vanlig anvendte blant lavere eukaryote vertsmikroorganismer. En rekke andre slekter, arter og stammer er imidlertid lett tilgjengelige og kan brukes her så som Schizosaccharomyces pombe (Beach et al, Nature, 290: 140 (1981); EP 139,383 publisert 2. mai 1985); Kluyveromyces- verter (U.S. patent nr. 4,943,529; Fleer et al, supra) så som for eksempel K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al, J. Bacteriol, 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al, supra), K. thermotolerans og K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichiapastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP244,234); Neurospora crossa (Case et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76: 5259-5263 (1979)); Schwanniomyces så som Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publisert 31. oktober 1990); og trådformet sopp så som for eksempel Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publisert 10. januar 1991) og Aspergillus- verter så somÆ nidulans (Ballance et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289

(1983); Tilburn et al, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 (1984)) og A. niger. Kelly et al, EMBOJ., 4: 475-479

(1985).

Egnede vertsceller for ekspresjonen av glykosylert Bv8 er avledet fra fiercellede organismer. Slike vertsceller er i stand til å utføre en kompleks bearbeiding og har dessuten glykosyleringsaktiviteter. I prinsippet kan enhver høyere eukaryot cellekultur brukes, enten det er en kultur fra virveldyr eller invertebrate. Eksempler på invertebratceller innbefatter planter og insektceller. Det er blitt identifisert tallrike baculovirale stammer og varianter og tilsvarende mulige insektvertsceller fra verter så som Spodoptera frugiperda (larve), Åedes aegypti (moskito), Åedes albopictus (moskito), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori. Se for eksempel Luckow et al, Bio/ Technology, 6: 47-55 (1988); Miller et al, i Genetic Engineering, Setlow et al, red., vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), sidene 277-279; og Maeda et al, Nature, 315: 592-594 (1985). En rekke virale stammer for transfeksjon er offentlig tilgjengelige, for eksempel L-1-varianten av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV, og slike virus kan brukes i den foreliggende oppfinnelsen, spesielt for transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler.

Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat og tobakk kan brukes som verter. Typisk vil plantecellene bli transfektert ved innkubering med visse stammer av bakterien Agrobacterium tumefaciens som tidligere er blitt manipulert slik at den inneholder Bv8-kodende DNA. Under innkuberingen av plantecellene med A. tumefaciens, vil det DNA som koder Bv8 bli overført til plantecellene slik at disse vil bli transfektert, og vil således under passende betingelser uttrykke det Bv8-kodende DNA. I tillegg er det tilgjengelig regulerende sekvenser og signalsekvenser som er forenlige med plantecellene så som den nopaline syntasepromotoren og polyadenyleringssignalsekvensene. Depicker et al, J. Mol Appl Gen., 1: 561 (1982). I tillegg vil DNA-segmenter som er isolert fra oppstrøms området i T-DNA 750-genet være i stand til å aktivere eller å øke transkripsjonsnivået i planteuttrykkbare gener i rekombinant DNA-holdig plantevev. EP 321,196 publisert 21. juni 1989.

Det har imidlertid vært størst interesse for virveldyrceller og oppformering av virveldyrceller i kultur (vevskultur) er blitt en rutinemessig metode. Se for eksempel Tissue Culture, Academic Press, Kruse og Patterson, redaktører (1973). Eksempler på brukbare pattedyrvertscellelinjer er apenyre CVl-linjen som er transformert ved hjelp av SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonyrelinje (293- eller 293-celler subklonet i vekst for suspensjonskultur, Graham et al, J. Gen Virol, 36: 59 (1977)); nyreceller fra nyfødte hamstere (BHK, ATCC CCL 10); kinesiske hamstereggstokkceller-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980)); muse sertoliceller (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23: 243-251 (1980)); apenyreceller (CV1 ATCC CCL 70); nyreceller fra grønn afrikansk ape (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane cervicale carcinomceller (HELA, ATCC CCL 2); nyreceller fra kanin (MDCK, ATCC CCL 34); leverceller fra buffalorotte (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G3, HB8065); muse brysttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-celler (Mather et al, Annals NY. Acad. Sei., 383: 44-68 (1982)); MRC 5-celler; FS4-celler; og en human hepatomlinje (Hep G2).

Vertsceller som er transfektert og fortrinnsvis transformert med de ovenfor angitte ekspresjons- eller kloningsvektorer for Bv8-produksjon kan således dyrkes i vanlig kjente næringsmedia modifisert etter behov for å indusere promotorer, seleksjon av transformanter eller oppformering av gener som koder de forønskede sekvensene.

Med transfeksjon forstås at en ekspresjonsvektor tas opp av en vertscelle, uansett om enhver kodende sekvens i virkeligheten blir uttrykt. Det er innenfor bioteknologien kjent tallrike fremgangsmåter for transfeksjon, for eksempel ved hjelp av CaP04eller elektroporering. Vellykket transfeksjon kan generelt gjenkjennes når det er indikasjoner på at vektoren har aktivitet inne i vertscellen.

Transformering betyr å føre DNA inn i en organisme slik at dette DNA er replikerbart, enten som et ekstrakromosomalt element eller som en kromosomal integrant. Avhengig av den vertscelle som brukes, utføres transformasjonen ved hjelp av standard teknikker som er tilpasset slike celler. Kalsiumbehandling som anvender kalsiumklorid som beskrevet i avsnitt 1.82 i Sambrook et al, supra, eller elektroporering, blir vanligvis brukt for prokaryoter eller andre celler som inneholder vesentlige celleveggbarrierer. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens brukes for transformering av visse typer planteceller slik det for eksempel er beskrevet av Shaw et al, Gene, 23: 315 (1983) og WO 89/05859 publisert 29. juni 1989.1 tillegg kan planter transfekteres ved å bruke ultralydbehandling slik dette er beskrevet i WO 91/00358 publisert 10. januar 1991.

For pattedyrceller uten slike cellevegger, er det foretrukket å bruke kalsiumfosfatutfellingsmetoden til Graham et al, Virology, 52: 456-457 (1978). Generelle aspekter i forbindelse med transformasjoner i pattedyrcellevertssystemer er blitt beskrevet i U.S. patent nr. 4,399,216 utstedt 16. august 1983. Transformasjoner i gjær utføres vanligvis ved hjelp av fremgangsmåten til Van Solingen et al, J. Bact., 130: 946 (1977) og Hsiao et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 76: 3829 (1979). Man kan imidlertid også bruke andre fremgangsmåter for å føre DNA inn i celler, for eksempel ved nukleær mikroinjeksjon, elektroporering, bakteriell protoplastfusjon med intakte celler eller polykationer, for eksempel polybren, polyornitin etc. For beskrivelser av forskjellige teknikker for transformering av pattedyrceller, se Keown et al, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) og Mansour et al, Nature, 336: 348-352 (1988).

Prokaryote celler som brukes for å produsere Bv8-polypeptidet kan dyrkes i egnede media slik dette generelt er beskrevet i Sambrook et al, supra.

De pattedyrvertscellene som brukes for å produsere Bv8 ifølge foreliggende oppfinnelsen kan dyrkes i en rekke forskjellige media. Kommersielt tilgjengelige media så som Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) og Dulbeccos modifiserte Eagles medium ((DMEM), Sigma) er egnede for dyrkning av vertsceller. I tillegg kan enhver av de media som er beskrevet i Ham et al, Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem., 102: 255 (1980), U.S. patent nr. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; eller 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; eller U.S. patent re. 30,985 kan brukes som dyrkningsmedia for vertsceller. Ethvert av disse media kan suppleres etter behov med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (så som insulin, transferrin og epidermal vekstfaktor), salter (så som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (så som HEPES), nukleosider (så som adenosin og tymidin), antibiotika (så som GENTAMYCIN™-medikament), sporelementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis er tilstede i sluttkonsentrasjoner i det mikromolare området) og glukose eller en tilsvarende energikilde. Eventuelle andre nødvendige supplerende stoffer eller forbindelser kan tilsettes i passende konsentrasjoner ved hjelp av velkjent teknikk. Dyrkningsbetingelser så som temperatur, pH og lignende, er de som vanligvis brukes sammen med vertsceller som er valgt ut for ekspresjon, vil være kjent for personer med innsikt i fagfeltet. Generelt er prinsippene, protokollene og praktiske teknikker for å maksimalisere produktiviteten for pattedyrcellekulturer beskrevet i Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, red. (IRL Press, 1991).

Vertsceller som er beskrevet i denne søknaden omfatter både celler i kultur så vel som celler inne i et vertsdyr.

Genamplifisering og/eller -ekspresjon kan måles i en prøve direkte, for eksempel ved vanlig kjent Southern blotting, Northern blotting for å kvantifisere transkripsjonen av mRNA (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 11: 5201-5205

(1980)), punktblotting (DNA-analyse) eller in situ hybridisering ved å bruke en passende merket probe basert på de sekvenser som her er beskrevet. Man kan bruke forskjellige markører, mest vanlige er radioisotoper, spesielt<32>P. Det er imidlertid mulig også å bruke andre typer teknikker så som biotinmodifiserte nukleotider for innføring i et polynukleotid. Nevnte biotin vil da tjene som et sete for binding til avidin eller antistoffer som så kan merkes med en rekke forskjellige markører så som radionukleider, fluorescerende forbindelser, enzymer eller lignende. Alternativt kan man bruke antistoffer som kan gjenkjenne spesifikke duplekser som innbefatter DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser. DNA-stoffene kan på sin side være merket, og prøven utføres når duplekset er bundet til en overflate slik at ved dannelsen av duplekset på overflaten, kan man påvise nærværet av antistoffet som er bundet til duplekset.

Genekspresjon kan alternativt måles ved hjelp av immunologiske metoder, for eksempel en immunohistokjemisk farging av vevssnitt og prøver på cellekulturer eller kroppsvæsker for direkte å kvantifisere ekspresjonen av genproduktet. Med immunohistokjemisk fargingsteknikker blir det fremstilt en celleprøve, typisk ved dehydrering og fiksering, fulgt av en reaksjon med merkede antistoffer som er spesifikke for det koblede genproduktet, og hvor markørene er vanlig visuelt påvisbare, så som enzymatiske markører, fluorescerende markører, luminescerende markører og lignende. En spesielt følsom fargeteknikk som er egnet for bruk i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet av Hsu et al., Am. J. Clin. Path., 15: 734-738 (1980).

Antistoffer som kan brukes for immunohistokjemisk farging og/eller prøving av prøvevæsker kan enten være monoklonale eller polyklonale og kan fremstilles som beskrevet her.

Bv8 blir fortrinnsvis innvunnet fra dyrkningsmediet som et utskilt polypeptid, skjønt det også kan innvinnes fra oppløste vertsceller. Hvis Bv8 er membranbundet, kan det frigjøres fra membranen ved å bruke en egnet rensemiddelløsning (for eksempel Triton-X 100).

Når Bv8 blir produsert i en rekombinant celle fra en annen art enn mennesket, så vil Bv8 være fullstendig fritt for proteiner eller polypeptider av human opprinnelse. Det kan imidlertid være nødvendig å rense Bv8 fra rekombinante celleproteiner eller polypeptider for å oppnå preparater som i alt vesentlig er homogene med hensyn til Bv8. Som et første trinn vil dyrkningsmediet eller lysatet bli sentrifugert for å fjerne partikkelformet celleavfall. Bv8 kan så renses for forurensende løselige proteiner og polypeptider ved hjelp av de følgende fremgangsmåter som bare er et eksempel på egnede rensemetoder: Ved fraksjonering på en ioneutbyttingskolonne; etanolutfelling; revers fase HPLC; kromatografi på silika; kromatofokusering; immunoaffinitet; epitop-merke-bindende harpiks; SDS-PAGE; ammoniumsulfatutfelling; gelfiltrering ved for eksempel å bruke Sephadex G-75; og protein A sefarosekolonne for å fjerne forurensninger så som IgG.

3. Modifikasjoner av Bv8

Kovalente modifikasjoner av Bv8 og Bv8-varianter inngår i den foreliggende oppfinnelsen. En type av slik kovalent modifikasjon innbefatter å reagere de søkte aminosyreresidua i et Bv8-polypeptid med et organisk derivatiserende middel som er i stand til å reagere med utvalgte sidekjeder eller med de N- eller C-terminale residua i Bv8. Derivatisering med bifunksjonelle midler kan for eksempel brukes for å tverrbinde Bv8 til en vannuløselig underlagsmatrise eller overflate for bruk i fremgangsmåten for å rense anti-Bv8-antistoffer og vice versa. Vanlige brukte tverrbindingsmidler innbefatter for eksempel estere med 4-azidosalisylsyre, homobifunksjonelle imidoestere inkludert disuccinimidylestere så som 3,3'-ditiobis(succinimidylpropionat), bifunksjonelle maleimider så som bis-N-maleimido-l,8-oktan og midler så som metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidat.

Andre modifikasjoner innbefatter en deamidering av glutaminyl og asparaginylresidua til de tilsvarende glutamyl- og aspartylresidua henholdsvis, hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgruppene i seryl- eller treonylresidua, metylering av ct-aminogruppene i lysin-, arginin- og histidinsidekjeder (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co., San Francisco, sidene 79-86 (1983)), acetylering av N-terminale amingrupper og amidering av eventuelle C-terminale karboksylgrupper.

En annen type kovalent modifikasjon av Bv8-polypeptidet som inngår i den foreliggende oppfinnelsen omfatter en endring av det naturlige glykosyleringsmønsteret i polypeptidet. "Endring av det naturlige glykosyleringsmønsteret" forstås her å enten fjerne en eller flere karbohydratgrupper som finnes i naturlig sekvens Bv8 (enten ved å fjerne det underliggende glykosyleringssete eller å fjerne selve glykosyleringen enten kjemisk og/eller enzymatisk) og/eller addere ett eller flere glykosyleringsseter som ikke er tilstede i det naturlige Bv8.1 tillegg innbefatter begrepet kvalitative forandringer i det naturlige proteinets glykosylering så som en forandring av type og mengdeforholdet av de tilstedeværende karbohydratgruppene.

En addering av glykosyleringsseter til Bv8-polypeptidet kan utføres ved å endre aminosyresekvensen. Denne endringen kan for eksempel utføres ved en addering eller substitusjon av en eller flere serin- eller treoninresidua i det naturlige sekvens Bv8 (for O-forbundne glykosyleringsseter). Bv8-aminosyresekvensen kan eventuelt endres ved forandringer på DNA-nivået, spesielt ved å mutere det DNA som koder Bv8-polypeptidet i på forhånd valgte baser slik at det blir utviklet kodoner som vil translatere til de forønskede aminosyrene.

Andre metoder for å øke antallet karbohydratgrupper i Bv8-polypeptidet er en kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til polypeptidet. Slike fremgangsmåter er for eksempel beskrevet i WO 87/05330 publisert 11. september 1987 og i Aplin og Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem.. sidene 259-306 (1981).

Fjerning av karbohydratgrupper som er tilstede på Bv8-polypeptidet kan utføres kjemisk eller enzymatisk, eller ved mutasjonssubstitusjon av kodoner som koder aminosyreresidua som tjener som mål for glykosylering. Kjemiske deglykosyleringsteknikker er kjente og er for eksempel beskrevet av Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Bioph<y>s.. 259: 52 (1987) og av Edge et al., Anal. Biochem.. 118: 131 (1981). Enzymatisk spalting av karbohydratgrupper på polypeptider kan oppnås ved å bruke en rekke forskjellige endo- og eksoglykosidaser slik det for eksempel er beskrevet av Thotakura et al., Meth. Enzymol.. 138: 350 (1987).

En annen type av kovalent modifikasjon av Bv8 omfatter å forbinde Bv8-polypeptidet til en av en rekke forskjellige ikke-proteinholdige polymerer, for eksempel polyetylenglykol (PEG), polypropylenglykol eller polyoksyalkylener slik det for eksempel er beskrevet i U.S. patentene 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 eller 4,179,337.

Bv8 ifølge foreliggende oppfinnelsen kan også modifiseres slik at det dannes et kimært molekyl som omfatter Bv8 fusjonert til et annet, heterologt polypeptid eller aminosyresekvens.

I en utførelse omfatter et slikt kimært molekyl en fusjon av Bv8 med et merke-polypeptid som tilveiebringer en epitop til hvilken et anti-tag-antistoff selektivt kan binde seg. Epitopmerket er generelt plassert ved amino- eller karboksylterminus i Bv8. Nærværet av slike epitopmerkede former av Bv8 kan påvises ved å bruke et antistoff mot merke-polypeptidet. Tilveiebringelsen av dette epitopmerket gjør det også mulig at Bv8 lett kan renses ved affinitetsrensing ved å bruke et anti-merke-antistoff eller en annen type affinitetsmatrise som binder seg til et epitoptagen. Det er innenfor bioteknologien kjent forskjellige tag-polypeptider og deres respektive antistoffer. Eksempler innbefatter polyhistidin (poly-his) eller polyhistidinglysin

(poly-his-gly) tagger, influensa AH-tag-polypeptidet og dets antistoff 12CA5 (Field et al, Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)); c-myc-tagen og 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 og 9E10-antistoffene til denne (Evan et al., Molecular and Cellular Biology. 5: 3610-3616 (1985)); og herpes simplexvirus glykoproteinet D (gD) tågen og dets antistoff (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)). Andre tag-polypeptider innbefatter Flag-peptidet (Hopp et al., BioTechnology. 6: 1204-1210

(1988)); KT3-epitoppeptidet (Martin et al., Science. 255: 192-194 (1992)); et ct-tubulin epitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem.. 266: 15163-15166 (1991)); og T7-gen 10 proteinpeptidtagen (Lutz-Freyermuth et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 87: 6393-6397 (1990)).

I en alternativ utførelse kan det kimære molekylet omfatte en fusjon av Bv8 og et immunoglobulin eller spesielt område i dette. For en bivalent form av det kimære molekylet (også betegnet som et "immunoadhesin"), kan en slik fusjon være til Fc-området i et IgG-molekyl.

Den enkleste og letteste immunoadhesinutformingen kombinerer ett eller flere bindingsområder i "adhesin"-proteinet med hengselen og Fc-områdene i en tung kjede i et immunoglobulin. Vanligvis vil man når man fremstiller Bv8-immunoglobulinkimærer for bruk i foreliggende oppfinnelsen, så vil den nukleinsyren som koder Bv8 bli fusjonert C-terminalt til den nukleinsyren som koder N-terminus for en immunoglobulin konstant domenesekvens, men N-terminale fusjoner er imidlertid også mulige.

I slike fusjoner vil typisk det kodede kimære polypeptidet beholde i det minste den funksjonelt aktive hengselen og CH2- og CH3-områdene i det konstante området i immunoglobulinets tunge kjede. Fusjoner kan også utføres til C-terminus i Fc-delen av et konstant domene, eller umiddelbart N-terminalt til CH1 i den tunge kjeden eller det tilsvarende området i den lette kjeden.

Det er ikke kritisk i hvilke seter fusjonen utføres, og spesielle seter er velkjente og kan velges for å optimalisere den biologiske aktiviteten på Bv8-immunoglobulinkimæren.

I visse utførelser blir Bv8-immunoglobulinkimærene satt sammen som monomerer eller som hetero- eller homomultimerer, mer spesielt som dimerer eller tetramerer, i alt vesentlig som illustrert i WO 91/08298.

I en foretrukket utførelse blir Bv8-sekvensen fusjonert til N-terminus i den C-terminale delen av et antistoff (spesielt Fc-domenet) som inneholder effektorfunksjoner for et immunoglobulin, for eksempel immunoglobulin Gi (IgGi). Det er mulig å fusjonere hele det tungkjedede konstante området til Bv8-sekvensen. Det er imidlertid mer foretrukket å bruke i funksjonen en sekvens som binder i hengselsområdet like oppstrøms for papainspaltingssetet (som definerer IgG Fc kjemisk; residium 216, idet man tar det første residiet i det tungkjedede området til å være 114, eller analoge seter i andre immunoglobuliner). I en spesielt foretrukket utførelse blir Bv8-aminosyresekvensen fusjonert til hengselsområdet og CH2 og CH3, eller til CH1, hengselen, CH2- og CH3-domenene i en IgGi, IgG2 eller IgG3 tung kjede. Det er ikke kritisk i hvilket sete fusjonen finner sted, og det optimale setet kan lett bestemmes ved rutinemessig eksperimentering.

I visse utførelser blir Bv8-immunoglobulinkimærene satt sammen multimert, mer spesielt som homodimerer eller -tetramerer. Generelt vil disse sammensatte immunoglobulinene ha kjente enhetsstrukturer. En grunnleggende firekjedet strukturell enhet er i en form hvor IgG, IgD og IgE eksisterer. En fireenhet blir gjentatt i immunoglobuliner med høyere molekylvekt, og IgM vil generelt eksistere som en pentamer av de grunnleggende fireenhetene som holdes sammen ved hjelp av disulfidbindinger. IgA-globulin og av og til også IgG-globulin kan også eksistere i multimer form i serum. I forbindelse med en multimer, kan hver fireenhet være lik eller forskjellig.

Alternativt kan Bv8-sekvensen innsettes mellom den tunge og den lette kjeden i immunoglobulinet, slik at dette omfatter en kimært tung kjede. I denne utførelsen blir Bv8-sekvensen fusjonert til 3'-enden av en immunoglobulin tung kjede i hver arm av et immunoglobulin, enten mellom hengselen og CH2-domenet, eller mellom CH2- og CH3-domenene. Lignende konstrukter er blitt rapportert av Hoogenboom et al, Mol Immunol, 28: 1027-1037 (1991).

Skjønt nærværet av en immunoglobulin lett kjede ikke er nødvendig i immunoadhesiner ifølge foreliggende oppfinnelse, så kan en immunoglobulin lett kjede være tilstede, enten kovalent assosiert til et Bv8-immunoglobulin tungkjedet fusjonspolypeptid, eller direkte fusjonert til Bv8.1 det førstnevnte tilfellet vil et DNA som koder en immunoglobulin lett kjede typisk bli uttrykt samtidig med det DNA som koder det Bv8-immunoglobulin tungkjedede fusjonsproteinet. Ved sekresjon vil den hybridiserte tunge og lette kjeden være kovalent assosiert, slik at man får tilveiebrakt en immunoglobulinlignende struktur som omfatter to disulfidforbundne immunoglobulin tungkjede-lettkjedede par. Fremgangsmåter som er egnet for fremstilling av slike strukturer er for eksempel beskrevet i U.S. patent nr. 4,816,567 utstedt 28. mars 1989.

I en foretrukket utførelse er de immunoglobulinsekvenser som brukes i konstruksjonen av immunoadhesiner ifølge foreliggende oppfinnelse fra et IgG-immunoglobulin tungkjedet konstant domene. For humane immunoadhesiner er det foretrukket å bruke humane IgGi - og IgG3-immunoglobulinsekvenser. En vesentlig fordel ved å bruke IgGi er at IgGl-immunadhesiner kan meget effektivt renses på immobilisert protein A. I motsetning til dette, vil en rensing av IgG3 kreve protein G, et signifikant mindre tilpasningsdyktig medium. Man skal imidlertid ta hensyn til andre strukturelle og funksjonelle egenskaper for immunoglobulinene når man velger Ig-fusjonspartneren for et spesielt immunoadhesinkonstrukt. For eksempel er IgG3-hengselen lengre og mer fleksibel slik at den kan tilveiebringe større adhesindomener som eventuelt ikke vil folde seg eller funksjonere passende ved en fusjon til IgGi. Et annet hensyn kan være valens; fordi IgG-immunoadhesiner er bivalente homodimerer, mens Ig-undertyper som for eksempel IgA og IgM kan gi opphav til dimere eller pentamere strukturer henholdsvis i den basiske Ig-homodimerenheten. For Bv8-immunoadhesiner som er utformet for in vivo anvendelse, så er også de farmakokinetiske egenskapene og effektorfunksjonene som er spesifisert ved hjelp av Fc-området også viktige. Skjønt IgGi, IgG2 og IgG4 alle har in vivo halvliv på 21 dager, så er deres relative evne til å aktivere komplementsystemet forskjellig. IgG4 aktiverer ikke komplement, mens IgG2 er signifikant svakere ved komplementaktivering enn IgGi. I motsetning til IgGi, så binder IgG2 seg ikke til Fc-reseptorer på mononukleære celler eller nøytrofiler. Mens IgG3 er optimal for komplementaktivering, så er imidlertid dets in vivo halvliv omtrent en tredjedel av de andre IgG-isotypene. Et annet viktig hensyn ved utformingen av immunoadhesiner som skal brukes i humane terapeutika, er antallet allotypvarianter av den spesielle isotypen. Generelt er det foretrukket å bruke IgG-isotyper med færre serologisk definerte allotyper. For eksempel har IgGi bare fire serologisk definerte allotypseter, og to av dem (Glm og 2) er plassert i Fc-området og ett av disse setene, Giml, er ikke-immunogent. I motsetning til dette er det 12 serologisk definerte allotyper i IgG3 som alle befinner seg i Fc-området, og tre av disse setene (G3m5, 11 og 21) har en allotype som er ikke-immunogen. Den potensielle immunogeniteten for et y3-immunoadhesin er således større enn for et y 1 -immunoadhesin.

Med hensyn til det opprinnelige immunoglobulinet, så er et brukbart tilknytningspunkt like oppstrøms for cysteinene i hengselen som danner disulfidbindingene mellom de to tunge kjedene. I en mye brukt utforming er kodonet for det C-terminale residiet i Bv8-delen av molekylet plassert direkte oppstrøms for kodonene for sekvensen DKTHTCPPCP i IgGl-hengselsområdet.

De generelle fremgangsmåtene som er egnet for konstruksjon og ekspresjon av immunoadhesiner er de samme som beskrevet ovenfor med hensyn til Bv8. Bv8-immunoadhesiner blir mest hensiktsmessig konstruert ved å fusjonere cDNA-sekvensen som koder Bv8-delen i-ramme til en lg cDNA-sekvens. Man kan imidlertid også bruke fusjon til genomiske Ig-fragmenter (se for eksempel Gascoigne et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 84: 2936-2940 (1987); Aruffo et al, Cell, 61: 1303-1313 (1990); Stemkovic et al, Cell, 66: 1133-1144 (1991)). Den sistnevnte typen fusjon krever nærvær av Ig-regulerende sekvenser for ekspresjon. De cDNA-molekyler som koder det IgG tungkjedede konstante området kan isoleres basert på publiserte og kjente sekvenser fra cDNA-biblioteker som er avledet fra lymfocytter enten fra milt eller fra perifere blodlymfocytter, ved hybridisering eller polymerasekjedereaksjons (PCR) teknikker. De cDNA-molekyler som koder Bv8 og Ig-delene av immunoadhesinet kan innsettes i tandem i en plasmidvektor som styrer effektiv ekspresjon i de valgte vertscellene. For ekspresjon i pattedyrceller kan man bruke pRK5-baserte vektorer (Schall et al, Cell, 361-370 (1990)) og CDM8-baserte vektorer (Seed, Nature, 329: 840 (1989)). Det nøyaktige sammenknytningspunktet kan skapes ved å fjerne ekstrasekvensene mellom de tiltenkte sammenknytnings-kodonene ved å bruke oligonukleotidstyrt delesjonsmutagenese (Zoller et al, Nucleic Acids Res., 10: 6487 (1982); Capon et al, Nature, 337: 525-531 (1989)). Syntetiske oligonukleotider kan brukes, hvor hver halvpart er komplementær til sekvensen på en av sidene av det forønskede tilknytningspunktet, og ideelt er disse 36- til 48-mer. Alternativt kan PCR-teknikker brukes for å knytte sammen de to delene av molekylet i-ramme med en passende vektor.

Valget av vertscellelinje for ekspresjon av Bv8-immunoadhesinene er i alt vesentlig avhengig av ekspresjonsvektoren. Et annet hensyn er den forønskede mengden av proteinet. Milligrammengder kan ofte fremstilles ved forbigående transfeksjoner. For eksempel kan den adenovirus EIA-transformerte 293 humane embryonyre-cellelinjen transfekteres forbigående med pRK5-baserte vektorer ved en modifikasjon av kalsiumfosfatmetoden, noe som muliggjør effektiv immuno-adhesinekspresjon. CDM8-baserte vektorer kan brukes for å transfektere COS-celler ved hjelp av DEAE-dekstranmetoden (Aruffo et al, Cell, 51: 1303-1313 (1990); Zettmeissl et al, DNA Cell Biol. US, 9: 347-353 (1990)). Hvis det er ønskelig med større mengder protein, kan immunoadhesinet uttrykkes etter stabil transfeksjon av en vertscellelinje. For eksempel kan en pRK5-basert vektor innføres i kinesiske hamstereggstokk (CHO) celler i nærværet av et ytterligere plasmid som koder dihydrofolatreduktase (DHFR), noe som gir resistens mot G418. Kloner som er resistente for G418 kan velges ut i kultur ved at man velger de klonene som kan dyrkes i nærværet av økende nivåer av DHFR-inhibitoren metotreksat, og hvor antallet genkopier som koder DHFR og immunoadhesinsekvensene blir amplifisert sammen. Hvis immunoadhesinet inneholder en hydrofob ledersekvens ved sin N-terminus, så er det større sannsynlighet for at den blir bearbeidet og utskilt av de transfekterte cellene. Ekspresjonen av immunoadhesiner med mer komplekse strukturer vil kunne kreve enestående tilpassede vertsceller, og for eksempel kan komponenter så som den lette kjeden eller J-kjeden tilveiebringes av visse myelom-eller hybridomcelleverter (Gascoigne et al, 1987, supra, Martin et al, J. Virol, 67: 3561-3568 (1993)).

Immunoadhesiner kan hensiktsmessig renses ved affinitetskromatografi. Hvorvidt protein A er egnet som en affinitetsligand er avhengig av artsopprinnelse og isotype av immunoglobulin Fc-domenet som brukes i kimæren. Protein A kan brukes for å rense immunoadhesiner som er basert på humane yl, y2 eller y4 tunge kjeder

(Lindmark et al, J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). Protein G er anbefalt for alle museisotyper og for humant y3 (Guss et al., EMBO J., 5: 1567-1575 (1986)). Matrisen til hvilken affinitetsliganden blir knyttet er vanligvis agarose, men også andre matriser er tilgjengelige. Mekanisk stabile matriser så som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen gjør det mulig å anvende raskere strømningshastigheter og kortere bearbeidingstider enn det som kan oppnås med agarose. De betingelser som anvendes for binding av et immunoadhesin til protein A- eller G-affinitetskolonnen er helt ut avhengig av egenskapene for Fc-domenet, det vil si dets artsopprinnelse og isotype. Når en passende ligand er valgt, så vil man generelt oppnå en effektiv binding direkte fra en ukondisjonert kulturvæske. Et spesielt trekk ved immunoadhesiner er at for humane yl-molekyler, så vil protein A sin bindingskapasitet være noe svekket relativt i forhold til et antistoff av den samme Fc-typen. Bundet immunoadhesin kan effektivt elueres enten ved en sur pH (eller over ca 3,0), eller i en nøytral pH-buffer som inneholder et mildt kaotropisk salt. Dette affinitetskromatografitrinnet kan resultere i et immunoadhesinpreparat som er over 95% rent.

Det er også kjent andre fremgangsmåter som kan brukes i stedet for eller i tillegg til affinitetskromatografi på protein A eller G for å rense immunoadhesiner. Immunoadhesiner opptrer på samme måte som antistoffer i tiofilisk gelkromatografi (Hutchens et al, Anal. Biochem., 159: 217-226 (1986)) og immobilisert metallgelat-kromatografi (Al-Mashikhi et al, J. Dairy Sei., 71: 1756-1763 (1988)). I motsetning til antistoffer så vil imidlertid deres atferd eller oppførsel i ioneutbyttingskolonner ikke bare være diktert av deres isoelektriske punkter, men også av en ladningsdipol som kan eksistere i molekylene på grunn av deres kimærte natur.

Hvis det er ønskelig, kan immunoadhesinene gjøres bispesifikke. Immunoadhesinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan således kombinere et Bv8-domene og et annet domene, for eksempel fra en annen vekstfaktor. For bispesifikke molekyler er det en fordel med trimere molekyler, sammensatt av en kimært antistoff tung kjede i en arm og et kimært antistoff tungkjede-lettkjedepar på den andre armen av deres antistofflignende struktur, på grunn av at slike molekyler er meget lette å rense. I motsetning til antistoffproduserende kvadromer som tradisjonelt brukes ved produksjonen av bispesifikke immunoadhesiner som fremstiller en blanding av ti tetramerer, så vil celler transfektert med en nukleinsyre som koder de tre kjedene i en trimerisk immunoadhesinstruktur produsere en blanding av bare tre molekyler, og en rensing av det forønskede produktet fra denne blandingen blir tilsatt lettere.

4. Fremstilling og identifikasjon av modulatorer av Bv8- aktivitet Den foreliggende oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for å screene forbindelser for derved å kunne identifisere de som etterligner eller bedrer en eller flere biologiske aktiviteter for Bv8 (agonister) eller hindrer effekten av Bv8 (antagonister). Bv8-agonister og -antagonister er også betegnet som Bv8-modulatorer. Screeningsprøver for antagonistmedikamentkandidater utformes slik at man identifiserer forbindelser som binder eller kompleksdanner seg med Bv8-polypeptider, eller på annen måte påvirker interaksjonen mellom Bv8 og andre cellulære proteiner.

a. Småmolekylscreening

Små molekyler kan ha evnen til å virke som Bv8-agonister eller -antagonister kan som sådan være brukbare i terapi. Slike små molekyler innbefatter naturlig forekommende små molekyler, syntetiske organiske eller uorganiske forbindelser og peptider. Små molekyler i den foreliggende oppfinnelsen er imidlertid ikke begrenset til disse formene. Omfattende biblioteker av små molekyler er kommersielt tilgjengelige, og det er kjent en rekke forskjellige prøver hvor man kan screene disse molekylene for en eller flere forønskede aktiviteter.

Små molekyler som kan være mulige Bv8-agonister eller -antagonister blir fortrinnsvis identifisert først i en prøve som muliggjør rask identifikasjon av mulige modulatorer av Bv8-aktivitet. Et eksempel på en slik prøve er en protein-proteinbindingsprøve hvor man måler kandidatmolekylets evne til å binde seg til en Bv8-reseptor. I et annet eksempel måler man kandidatmolekylenes evne til å påvirke Bv8-binding til en Bv8-reseptor.

I en foretrukket utførelse blir småmolekyl Bv8-agonister identifisert ved deres evne til å etterligne en eller flere av de biologiske aktivitetene til Bv8. For eksempel kan små molekyler screenes for sin evne til å indusere deling av endotelceller for å fremme endotelcelleoverlevelse, for eksempel slik det er beskrevet i eksemplene 2 og 3 i det etterfølgende, eller for å indusere angiogenese slik det er beskrevet i det etterfølgende eksempel 4.

I en annen utførelse blir småmolekyl Bv8-antagonistene identifisert ved deres evne til å hemme en eller flere av de biologiske aktivitetene til Bv8. En mulig forbindelse blir således kontaktet Bv8. Man måler deretter den biologiske aktiviteten for nevnte Bv8.1 en utførelse bestemmer man Bv8 sin evne til å stimulere endotelcelledeling, for eksempel slik det er beskrevet i eksempel 2.1 en annen utførelse bestemmer man evnen til Bv8 til å fremme endotelcelleoverlevelse, for eksempel slik det er beskrevet i eksempel 3. En forbindelse blir identifisert som en antagonist i de tilfeller hvor en eller flere av Bv8 sine biologiske aktiviteter blir hemmet.

Forbindelser som blir identifisert som Bv8-agonister eller -antagonister kan brukes i de foreliggende fremgangsmåtene. For eksempel kan Bv8-antagonister brukes for å behandle cancer.

b. Fremstilling og identifikasjon av agonistantistoffer

Agonist humane og ikke-humane polyklonale og monoklonale antistoffer (heri inngår humaniserte former av ikke-humane monoklonale antistoffer) som etterligner de biologiske egenskapene til Bv8, inngår også i den foreliggende oppfinnelsen. Disse innbefatter aminosyresekvensvarianter, glykosyleringsvarianter og fragmenter av antistoffer. Det er kjent generelle metoder og teknikker for fremstilling av slike antistoffer og hvordan man utfører en seleksjon av agonistantistoffer, og disse er kort beskrevet i det etterfølgende.

( i) Polyklonale antistoffer

Det er innenfor bioteknologien kjent mange fremgangsmåter for fremstilling av polyklonale antistoffer. Polyklonale antistoffer kan utvikles i et pattedyr, for eksempel ved en eller flere injeksjoner av et immuniseringsmiddel og hvis ønskelig, en adjuvans. Vanligvis vil immuniseringsmiddelet og/eller adjuvansen bli injisert i pattedyret ved flere subkutane eller intraperitoneale injeksjoner. Det kan være fordelaktig å konjugere immuniseringsmiddelet til et protein som er kjent for å være immunogent i det pattedyret som immuniseres, for eksempel serum albumin eller en soyabønnetrypsininhibitor. Eksempler på adjuvanser som kan brukes innbefatter Freuds fullstendige adjuvans og MPL-TDM.

( ii) Monoklonale antistoffer

Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved å bruke den hybridommetoden som først ble beskrevet av Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975), eller kan fremstilles ved hjelp av rekombinante DNA-metoder (U.S. patent nr. 4,816,567).

I hybridommetoden blir en mus eller et annet passende vertsdyr så som en hamster eller en javaape immunisert som beskrevet ovenfor for å utvikle lymfocytter som produserer eller som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde seg til det proteinet som brukes for immuniseringen. Alternativt kan lymfocytter immuniseres in vitro. Lymfocyttene blir så fusjonert med myelomceller ved å bruke et egnet fusjoneringsmiddel så som polyetylenglykol, for derved å få dannet en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, sidene 59-103, (Academic Press, 1986)).

De således fremstilte hybridomcellene blir så tilsatt og dyrket i et egnet dyrkningsmedium som fortrinnsvis bør inneholde ett eller flere stoffer som hemmer veksten eller overlevelsen av ufusjonerte opprinnelige myelomceller. Hvis for eksempel de opprinnelige myelomcellene mangler enzymet hypoksantinguanin-fosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), så vil dyrkningsmediet for hybridomcellene typisk inneholde hypoksantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium), det vil si betingelser hvor man hindrer vekst av celler med HGPRT-svikt). Foretrukne myelomceller er de som fusjonerer seg effektivt, understøtter en stabil høy produksjon av antistoffet ved hjelp av de valgte antistoffproduserende cellene og som er følsomme overfor et medium så som HAT-medium. Blant de foretrukne myelomcellelinjene er musemyelomceller, for eksempel de som er avledet fra MOP-21 og M.C.-l 1 musetumorer og som er tilgjengelige fra Salt Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, og SP-2 eller X63-Ag8-653-celler som er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Det er også beskrevet humane myleom- og musehumane heteromyelomcellelinjer for produksjon av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, sidene 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)).

Det kulturmedium hvor hybridomcellene dyrkes, kan så undersøkes for produksjon av monoklonale antistoffer som er rettet inn mot antigenet. Bindingsspesifisiteten for de monoklonale antistoffene som er produsert av hybridomcellene blir fortrinnsvis bestemt ved en immunoutfelling eller ved en in vitro bindingsprøve, for eksempel en radioimmunoprøve (RIA), eller en enzymforbundet immunabsorpsjonsprøve (ELISA).

Bindingsaffiniteten for monoklonale antistoffer kan for eksempel bestemmes ved Scatchardanalysen til Munson et al, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Etter identifikasjon av de hybridomceller som produserer antistoffer med den forønskede spesifisitet, affinitet og/eller aktivitet, så kan disse cellen subklones ved begrensende fortynningsmetoder og deretter dyrkes ved hjelp av standard metoder (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles andPractice, sidene 59-103 (Academic Press, 1986)). Egnede dyrkningsmedia for dette formålet innbefatter for eksempel DMEM- eller RPMI-1640-medium. I tillegg kan hybridomcellene dyrkes in vivo som buktumorer i et dyr.

De monoklonale antistoffene som skilles ut av subklonene kan så egnet skilles fra kulturmediet, tumorvæsker eller serum ved hjelp av vanlige kjente immunoglobulinrensemetoder, for eksempel ved protein A-sefarose,

hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

DNA som koder de monoklonale antistoffene kan lett isoleres og sekvenseres ved å bruke vanlig kjente fremgangsmåter (for eksempel ved å bruke oligonukleotidprober som er i stand til spesifikt å binde seg til gener som koder de tunge og lette kjedene i de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene kan så tjene som en foretrukket kilde for et slikt DNA. Så snart nevnte DNA er isolert, så kan det plasseres i ekspresjonsvektorer som så transfekteres over i vertsceller så som E. cø/z-celler, simian COS-celler, kinesisk hamstereggstokk (CHO) celler eller myelomceller som ellers ikke produserer immunoglobulinproteiner, for derved å oppnå en syntese av monoklonale antistoffer i rekombinante vertsceller. Nevnte DNA kan også modifiseres, for eksempel ved å sette inn den kodende sekvensen for de humane tung- og lettkjedede konstante områdene i stedet for homologe musesekvenser, Morrison, et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A., 81: 6851 (1984), eller ved kovalent å forbinde den immunoglobulinkodende sekvensen med hele eller en del av den kodende sekvensen for et ikke-immunoglobulinpolypeptid. På denne måten får man fremstilt "kimære" eller "hybride" antistoffer som har bindingsspesifisitet for et Bv8-agonist monoklonalt antistoff slik det er beskrevet her.

Kimære eller hybride antistoffer kan også fremstilles in vitro ved å bruke kjente fremgangsmåter innenfor syntetisk proteinkjemi, for eksempel ved å bruke tverrbindingsmidler. For eksempel kan immunotoksiner konstrueres ved å bruke en disulfidutbyttingsreaksjon, eller ved å danne en tioeterbinding. Eksempler på egnede reagenser for dette formålet inkluderer iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat.

Rekombinant produksjon av antistoffer er mer detaljert beskrevet i det etterfølgende.

( iii) Humaniserte antistoffer

Generelt vil det i det i et humanisert antistoff være innført en eller flere aminosyreresidua fra en ikke-human kilde. Disse ikke-humane aminosyreresidua blir ofte betegnet som "imporf-residua og vil typisk bli tatt fra et "import" variabelt domene. Humanisering kan i alt vesentlig utføres ved å bruke fremgangsmåten til Winter og hans medarbeidere (Jones et al, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)) ved å sette inn gnager CDR eller CDR-sekvenser i stedet for de tilsvarende sekvensene i et humant antistoff.

Slike "humaniserte" antistoffer er således kimære antistoffer (Cabilly, supra), hvor i alt vesentlig mindre enn et intakt humant variabelt område er blitt erstattet med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis vil humaniserte antistoffer typisk være humane antistoffer hvor noen CDR-residua og eventuelt også noen FR-residua er blitt erstattet med residua fra analoge seter i gnagerantistoffer.

Det er viktig at de humaniserte antistoffene beholder sin høye affinitet for antigenet og eventuelle andre gunstige biologiske egenskaper. For å oppnå dette, blir humaniserte antistoffer ifølge en foretrukket fremgangsmåte fremstilt ved en analyse av de opprinnelige sekvensene og forskjellige konseptuelle humaniserte produkter ved å bruke tredimensjonale modeller for de opprinnelige og de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunoglobulinmodeller er kommersielt tilgjengelige og er velkjente innenfor bioteknologien. Det finnes dataprogrammer som illustrerer og viser mulige tredimensjonale konformelle strukturer av utvalgte kandidat immunoglobulinsekvenser. En undersøkelse av disse bildene muliggjør en analyse av residuaenes sannsynlige rolle med hensyn til hvordan kandidat immunoglobulinsekvensene vil fungere, det vil si en analyse av de residua som påvirker kandidat immunoglobulinets evne til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-residua velges ut og kombineres ut fra en konsensus- og en importsekvens slik at man oppnår de forønskede antistoffegenskapene, for eksempel bedret affinitet for det eller de søkte antigenene. Generelt vil CDR-residua direkte og i vesentlig grad påvirke antigenbindingen. For ytterligere detaljer se U.S. søknad serienr. 07/934,373 innsendt 21. august 1992 som er en fortsettelse av søknad serienr. 07/715,272 innsendt 14. juni 1991.

( iv) Humane antistoffer

Humane monoklonale antistoffer kan fremstilles ved hjelp av hybridommetoden. Humane myelom- og musehumane heteromyelomcellelinjer for produksjon av humane monoklonale antistoffer er for eksempel beskrevet av Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984) og Brodeur, et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, sidene 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Det er nå mulig å produsere transgene dyr (for eksempel mus) som ved immunisering er i stand til å produsere et utvalg av humane antistoffer i fravær av endogen immunoglobulinproduksjon. Det er for eksempel blitt beskrevet at en homozygot delesjon av genet for antistoffets tungkjedetilknyttede område (Jh) i kimærte og germlinjemutante mus resulterer i en fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. En overføring av den humane germlinje immunoglobulingenmatrisen i slike germlinje mutante mus vil resultere i produksjon av humane antistoffer ved eksponering overfor antigener. Se for eksempel Jakobovits et al, Proe. Nati Acad. Sei. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al, Nature 362, 255-258 (1993).

Mendez et al. ( Nature Genetics 15: 146-156 (1997)) har videre bedret teknologien og har utviklet en linje av transgene mus med betegnelsen "Xenomouse II" som når den eksponeres overfor et antigen utvikler høyaffinitets hele humane antistoffer. Dette oppnås ved såkalt germlinje integrering av megabase humane tungkjedede og lettkjedede loci i mus med delesjon i det endogene JH-segmentet som beskrevet ovenfor. Xenomouse II har et 1020 kb stort humant tungkjedet locus som inneholder ca 66 VH-gener, fullstendige Dh- og JH-områder og tre forskjellige konstante områder (u., 5 og%), og har inneholder dessuten 800 kb av et humant k-1ocus som inneholder 32 VK-gener, JK-segmenter og CK-gener. De antistoffer som produseres i disse musene ligner i alle henseender de som kan observeres hos mennesker, inklusive genomleiring, sammensetning og repertoar. De humane antistoffene blir fortrinnsvis uttrykt fremfor endogene antistoffer, noe som skyldes en delesjon i det endogene JH-segmentet som hindrer genomleiring i muselocuset.

Alternativt kan man bruke fagpresenterende teknologi (McCafferty et al, Nature 348: 552-553 (1990)) for å produsere humane antistoffer og antistoffragmenter irt vitro fra immunoglobulinvariable (V) domene genrepertoarer fra uimmuniserte donorer. Ifølge denne teknikken blir antistoff V-domenegener klonet i ramme enten i et større eller mindre kappeproteingen fra en trådformet bakteriofag så som Ml3 eller fd, og så presentert som et funksjonelt antistoffragment på overflaten av fagpartikkelen. Ettersom den trådformede partikkelen inneholder en enkelttrådet DNA-kopi av faggenomet, så vil en seleksjon basert på antistoffets funksjonelle egenskaper resultere i en seleksjon av det genet som koder antistoff med disse egenskapene. Nevnte fag vil således etterligne enkelte av egenskapene til B-cellen. Fagpresentasjon kan utføres på en rekke forskjellige måter, for en oversikt se for eksempel Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan brukes for fagpresentasjon. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) isolerte en divers matrise av anti-oksazolonantistoffer fra et lite vilkårlig kombinatorisk bibliotek av V-gener avledet fra milten hos immuniserte mus. Et utvalg av V-gener fra uimmuniserte humane donorer kan konstrueres, og antistoffer til et stort utvalg av antigener (inklusive selv-antigener) kan isoleres ved i alt vesentlig å følge den teknikken som er beskrevet av Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993). I en naturlig immunreaksjon vil antistoffgener akkumulere mutasjoner med høy hastighet (somatisk hypermutasjon). Enkelte av de forandringer som derved oppstår vil gi høyere affinitet, og B-celler som viser høyaffinitets overflateimmunoglobuliner blir fortrinnsvis replikert og differensiert under den etterfølgende antigeneksponeringen. Denne naturlige prosessen kan etterlignes ved å bruke en teknikk som er kjent som "kjedestokking"

(Marks et al, Bio/ Technol. 10: 779-783 [1992]). I denne fremgangsmåten blir affiniteten for de "primære" humane antistoffene som er oppnådd ved fagpresentasjon, bedret ved sekvensmessig å erstatte de tung- og lettkjedede V-områdegenene med et utvalg av naturlig forekommende varianter (repertoar) av V-domenegener som er oppnådd fra uimmuniserte donorer. Denne teknikken gjør det mulig å fremstille antistoffer og antistoffragmenter med affiniteter i nM-området. En strategi for å fremstille meget store fagantistoffbiblioteker (også kjent som "alle bibliotekers mor") er blitt beskrevet av Waterhouse et al, Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993), og isolering av et humant antistoff med høy affinitet direkte fra et slikt stort fagbibliotek er rapportert av Griffith et al, EMBO J. (1994), in press. Genstokking kan også brukes for å avlede humane antistoffer fra gnagerantistoffer hvor det humane antistoffet har like affiniteter og spesifisiteter som det

gnagerantistoffet som ble brukt i utgangspunktet. Ifølge denne fremgangsmåten som også betegnes som en "epitoppreging", blir det tung- og lettkjedede V-domenegenet i gnagerantistoffer, fremstilt ved fagpresentasjonsteknikk, erstattet med et utvalg av humane V-domenegener hvorved man skaper gnager-humane kimærer. En seleksjon med antigen vil resultere i isolasjon av humane variable domener som er i stand til å

gjenskape et funksjonelt antigenbindende sete, det vil si den epitopen som styrer (preger) valget av partner. Når denne fremgangsmåten ble gjentatt for å erstatte det gjenværende gnager V-domenet, så oppnår man et humant antistoff (se PCT-patentsøknad WO 93/06213, publisert 1. april 1993). I motsetning til tradisjonell humanisering av gnagerantistoffer ved CDR-poding, så gir denne teknikken hele og fullstendige humane antistoffer som ikke har noe rammeverk eller noen CDR-residua av gnageropprinnelse.

( v) Bispesifikke antistoffer

Bispesifikke antistoffer er monoklonale, fortrinnsvis humane eller humaniserte antistoffer med bindingsspesifisiteter for minst to forskjellige antigener. Fremgangsmåter for fremstilling av slike bispesifikke antistoffer er velkjente. Tradisjonelt blir rekombinant produksjon av bispesifikke antistoffer basert på en samekspresjon av to immunoglobulin tungkjede-lettkjedepar hvor de to tunge kjedene har forskjellige spesifisiteter (Millstein og Cuello, Nature 305, 537-539

(1983)). På grunn av det vilkårlige utvalget av de tunge og lette kjedene i immunoglobulinet, så vil disse hybridomene (kvadromer) produsere eller gi en potensiell blanding av 10 forskjellige antistoffmolekyler, hvorav ett har den riktige bispesifikke strukturen. Rensingen av det korrekte molekylet, noe som vanligvis gjøres ved affinitetskromatografitrinn, er relativt arbeidskrevende og produktutbyttene er lave. Lignende fremgangsmåter er beskrevet i PCT-søknad publikasjon nr. WO 93/08829 (publisert 13. mai 1993) og i Traunecker et ai, EMBO 10, 3655-3659 (1991).

Ifølge en annen og mer foretrukket fremgangsmåte, blir antistoffvariable domener med de forønskede bindingsspesifisiteter (antistoff-antigenkombinerende seter) fusjonert til immunoglobulinkonstante domenesekvenser. Denne fusjonen bør fortrinnsvis skje med et immunoglobulin tung kjede konstant domene som omfatter i det minste en del av hengselen, CH2- og CH3-områdene. Det er foretrukket å ha det første kjedekonstante området (CH1) som inneholder setet som er nødvendig for binding av den lette kjeden, tilstedeværende i minste en av disse fusjonene. DNA-molekyler som koder immunoglobulin tungkjedefusjoner og, hvis det er ønskelig, også den lette kjeden i immunoglobulinet, innsettes i separate ekspresjonsvektorer og samtransfekteres over i en egnet vertsorganisme. Dette gir større fleksibilitet med hensyn til å justere de gjensidige delene av de tre polypeptidfragmentene, i utførelser hvor ulike forhold mellom de tre polypeptidkjedene som brukes i konstruktet gir optimale utbytter. Det er imidlertid også mulig å innsette kodende sekvenser for to eller alle tre polypeptidkj edene i en ekspresjonsvektor, når ekspresjonen av minst to polypeptidkj eder i et likt forhold resulterer i høyere utbytter, eller når forholdene ikke er av spesiell signifikans. I en foretrukket utførelse av denne fremgangsmåten er de bispesifikke antistoffene sammensatt av en tung kjede fra et hybrid immunoglobulin hvor nevnte kjede har en første bindingsspesifisitet i en arm, og et hybrid immunoglobulin med et tungkjede-lettkjedepar (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) i den andre armen. Man har funnet at denne asymmetriske strukturen letter separasjonen av den forønskede bispesifikke forbindelsen fra de uønskede kjedekombinasjonene i immunoglobulinet, ettersom nærværet av en immunoglobulin lett kjede i bare halvparten av de bispesifikke molekylene gjør at separasjonen er meget lett. Denne fremgangsmåten er beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 94/04690 publisert 3. mars 1994.

Ytterligere detaljer for å utvikle bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al. Methods in Enzymology 121. 210 (1986).

( vi) Heterokonjugate antistoffer

Heterokonjugate antistoffer er sammensatt av to kovalent sammenknyttede antistoffer. Det er for eksempel foreslått at slike antistoffer kan føre immunsystemceller til uønskede celler (U.S. patent nr. 4,676,980) og at de kan brukes for behandling av HIV-infeksjon (PCT-søknad publikasjon nr. WO 91/00360 og WO 92/200373; EP 03089). Heterkonjugate antistoffer kan fremstilles ved å bruke enhver hensiktsmessig tverrbindingsmetode. Egnede tverrbindingsmidler er velkjente innen bioteknologien og er blant annet beskrevet i U.S. patent nr. 4,676,980 sammen med en rekke forskjellige tverrbindingsteknikker.

( vii) Antistoffragmenter

I visse utførelser så er Bv8-agonistantistoffet (og heri inngår muse, humane og humaniserte antistoffer og antistoffvarianter) et antistoffragment. Det er utviklet forskjellige teknikker for å produsere antistoffragmenter. Vanligvis blir disse fragmentene fremstilt via proteolytisk kutting av intakte antistoffer (se for eksempel Morimoto et al, J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) og Brennan et al, Science 229: 81 (1985)). Disse fragmentene kan imidlertid nå fremstilles direkte ved hjelp av rekombinante vertsceller. For eksempel kan Fab'-SH-fragmenter direkte innvinnes fra E. coli og kjemisk kobles slik at det dannes F(ab')2-fragmenter (Carter et al, Bio/ Technology 10: 163-167 (1992)). I en annen utførelse blir F(ab')2dannet ved å bruke leukinzipperen GCN4 for å fremme en sammensetning av F(ab')2-molekylet. Ifølge en annen fremgangsmåte kan Fv-, Fab- eller F(ab')2-fragmenter isoleres direkte fra rekombinante vertscellekulturer. Andre teknikker for produksjon av antistoffragmenter tør være kjent for personer med innsikt i fagfeltet.

( viii) Identifikasjon av agonistantistoffer

Bv8-agonistantistoffer blir vanligvis identifisert basert på deres biologiske aktivitet. I en utførelse blir Bv8-agonistantistoffer identifisert ved deres evne til å indusere formering av endotelceller slik det er beskrevet i eksempel 2.1 en annen utførelse blir Bv8-agonistantistoffer identifisert ved deres evne til å indusere angiogenese, slik det er beskrevet i eksempel 4.

5. Screeningsprøver for proteiner som virker sammen med Bv8

Enhver fremgangsmåte som er egnet for å påvise protein-proteininteraksjoner kan brukes for å identifisere proteiner eller andre molekyler, og dette inkluderer, men er ikke begrenset til, transmembrane eller intracellulære proteiner som virker sammen med Bv8. Blant de tradisjonelle fremgangsmåter og metoder som kan brukes, er samimmunoutfelling, tverrbinding og samrensing ved hjelp av gradienter eller kromatografiske kolonner for derved å kunne identifisere proteiner som virker sammen med Bv8. For slike prøver kan Bv8-komponenten være et fullengde protein, et løselig derivat av dette, et peptid som tilsvarer et domene av interesse, eller et fusjonsprotein som inneholder visse områder av Bv8.

Det er fordelaktig å bruke fremgangsmåter som gir en samtidig identifikasjon av gener som koder proteiner som er i stand til å virke sammen med Bv8. Disse fremgangsmåtene innbefatter for eksempel en probing av ekspresjonsbiblioteker, på samme måte som den velkjente teknikken for antistoffprobing av 8gtl 1-biblioteker ved å bruke merket Bv8 eller varianter av dette.

En fremgangsmåte som påviser proteininteraksjoner in vivo, tohybridsystemet, er beskrevet i detalj for illustrerende formål uten at dette begrenser oppfinnelsen som sådan. En versjon av dette systemet er beskrevet (Chien et al, 1991, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88: 9578-9582) og er kommersielt tilgjengelig fra Clontech (Palo Alto, CA).

Et slikt system bruker kort fortalt plasmider som er konstruert slik at de koder to hybridproteiner: Ett plasmid som består av nukleotider som koder det DNA-bindende domenet i et transkripsjonsaktivatorprotein som er fusjonert til en nukleotidsekvens som koder Bv8 eller et polypeptid, peptid eller fusjonsprotein av dette, og et annet plasmid som omfatter nukleotider som koder transkripsjonsaktivatorproteinets aktiverende domene fusjonert til et cDNA som koder et ukjent protein som er blitt rekombinert i dette plasmidet som en del av et cDNA-bibliotek. Det DNA-bindende domenefusjonsplasmidet og cDNA-biblioteket er transformert over i en stamme av gjæren Saccharomyces cerevisiae som inneholder et reportergen (for eksempel HBS eller lacZ), hvis regulerende område inneholder bindingssetet for transkripsjonsaktivatoren. Ingen av hybridproteinene kan aktivere transkripsjonen av reportergenet: Det vil si at den DNA-bindende domenehybriden kan ikke gjøre dette fordi den ikke tilveiebringer aktiveringsfunksjon, og aktiveringsdomenehybriden kan ikke aktivere transkripsjonen fordi den ikke kan lokalisere aktivatorens bindingssete. Interaksjonen mellom de to hybridproteinene rekonstituerer det funksjonelle aktivatorproteinet, noe som resulterer i ekspresjon av reportergenet som så påvises ved en prøve på produktet fra reportergenet.

Tohybridsystemet eller tilsvarende metode kan brukes for å screene aktiveringsdomenebiblioteker for proteiner som virker sammen med "åte eller lokkemiddel"-genproduktet. Som et eksempel, dog uten begrensning, kan Bv8 brukes som lokkemiddelgenproduktet. Totale genomiske eller cDNA-sekvenser kan fusjoneres til det DNA som koder et aktiveringsdomene. Dette biblioteket og et plasmid som koder en hybrid av et lokkemiddel Bv8-genprodukt blir så fusjonert til det DNA-bindende domenet og blir deretter samtransformert over i en gjærreporterstamme hvoretter de resulterende transformantene blir screenet for de som uttrykker reportergenet. For eksempel uten at dette begrenser oppfinnelsen, så kan en lokkemiddel Bv8-gensekvens, det vil si gener som åpner leserammen, klones inn i en vektor slik at de translatert blir fusjonert til DNA som koder det DNA-bindende domenet i GAL4-proteinet. Disse koloniene blir så renset og bibliotekplasmidene som er ansvarlige for reportergenekspresjonen blir så isolert. DNA-sekvensering blir så brukt for å identifisere de proteinene som er kodet av bibliotekplasmidene.

Et cDNA-bibliotek i en cellelinje hvor man ønsker å påvise de proteiner som virker sammen med lokkemiddel Bv8-genproduktet, kan utføres ved å bruke fremgangsmåter som rutinemessig praktiseres innenfor bioteknologien. Ifølge det spesielle systemet som her er beskrevet kan for eksempel cDNA-fragmentene innsettes i en vektor slik at de translatert blir fusjonert til det transkriberende aktiveringsdomenet i GAL4. Dette biblioteket kan så samtransformeres sammen med lokkemiddel Bv8-gen-GAL4-fusjonsplasmidet i en gjærstamme som inneholder et /acZ-gen som drives av en promotor som inneholder et GAL4-aktiveringssekvens. Et cDNA-kodet protein som er fusjonert til nevnte GAL4-transkriberende aktiveringsdomene som virker sammen med lokkemiddel Bv8-genproduktet, vil rekonstituere et aktivt GAL4-protein og derved drive ekspresjonen. Kolonier som driver ekspresjon kan påvises ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Nevnte cDNA kan så renses fra disse stammene og deretter brukes for å produsere og isolere det lokkemiddel Bv8-geninteragerende proteinet ved hjelp av teknikker og fremgangsmåter som rutinemessig brukes innenfor bioteknologien.

a. Prøver for forbindelser som modulerer Bv8- ekspresjon eller - aktivitet De følgende prøver er utformet for identifikasjon av forbindelser som virker sammen med (for eksempel binder seg til) Bv8, forbindelser som påvirker interaksjonen mellom Bv8 og dens bindingspartnere, enten disse er kognate eller reseptorer, og forbindelser som modulerer aktiviteten for Bv8-genekspresjonen (det vil si modulerer nivået med hensyn til Bv8-genekspresjon) eller modulerer eller kontrollerer nivåene av Bv8 i kroppen. Prøvene kan dessuten brukes for å

identifisere forbindelser som binder seg til Bv8-genregulerende sekvenser (for eksempel promotorsekvenser) og følgelig kan modulere Bv8-genekspresjon. Se for eksempel Platt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269: 28558-28562.

Forbindelsene som kan screenes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, peptider, antistoffer og fragmenter av disse, eller andre organiske forbindleser (for eksempel peptidomimetika) som binder seg til et Bv8 eller en Bv8-reseptor og enten etterligner den aktiviteten som utløses av en naturlig ligand (det vil si agonister) eller hemmer den aktiviteten som utløses av en naturlig ligand (det vil si antagonister).

Slike forbindelser kan innbefatte, men er ikke begrenset til, peptider som for eksempel løselige peptider, noe som inkluderer, men som ikke er begrenset til, peptider fra vilkårlige peptidbiblioteker (se for eksempel Lam, K.S. et al, 1991, Nature, 354: 82-84; Houghten, R. et al, 1991, Nature 354: 84-86) og kombinerte kjemisk avledede molekylbiblioteker fremstilt av aminosyrer enten i D- og/eller i L-konfigurasjon, fosfopeptider (inklusive, men ikke begrenset til, peptider fra vilkårlige eller delvis degenererte, styrte fosfopeptidbiblioteker; se for eksempel Songyang, Z. et al, 1993, Cell 72: 727-778), antistoffer (som inkluderer, men som ikke er begrenset til, polyklonale, monoklonale, humaniserte, antiidiotypiske, kimærte eller enkeltkjedede antistoffer, og Fab, F(abN)2og fragmenter fra Fab-ekspresjonsbiblioteker, og epitopbindende fragmenter av disse) og små organiske eller uorganiske molekyler.

Andre forbindelser som kan screenes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse innbefatter, men er ikke begrenset til, små organiske molekyler som er i stand til å trenge inn i en passende celle (for eksempel en endotelcelle) og påvirke ekspresjonen av et Bv8-gen eller et annet gen som inngår i en Bv8-kontrollert reaksjonsvei (for eksempel ved å virke sammen med faktorer som har med det regulerende området eller selve transkripsjonen som inngår i genekspresjonen); eller slike forbindelser som påvirker eller delvis erstatter aktiviteten for Bv8, eller aktiviteten for eventuelle andre intracellulære faktorer som inngår i en Bv8-signaloverføring, foruten katabole og metabole reaksjonsveier.

Datamodellering og søketeknologier gjør det i dag mulig å identifisere forbindelser eller bedre allerede identifiserte forbindelser som kan modulere Bv8-ekspresjon eller aktivitet. Så snart man har identifisert en slik forbindelse eller sammensetning, kan de aktive seter eller områder identifiseres. Slike aktive seter vil ofte typisk være ligandbindende seter. De aktive setene kan identifiseres ved å bruke fremgangsmåter som i seg selv er kjente, for eksempel ut fra aminosyresekvensen for peptider, fra nukleotidsekvensene i nukleinsyrer eller fra undersøkelse av komplekser av den relevante forbindelsen eller sammensetningen med dens naturlige ligand. I sistnevnte tilfelle kan kjemiske eller røntgenkrystallografiske metoder brukes for å finne det aktive setet ved å finne ut hvor faktoren på den komplekse liganden forefinnes.

Deretter blir den tredimensjonale geometriske strukturen på det aktive setet bestemt. Dette kan utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter så som røntgenkrystallografi som kan bestemme en fullstendig molekylstruktur. På den annen side kan fast eller flytende fase NMR brukes for å bestemme visse intramolekylære avstander. Enhver eksperimentell fremgangsmåte for strukturbestemmelse kan brukes for å oppnå delvise eller fullstendige geometriske strukturer. De geometriske strukturene kan måles med en kompleksdannet ligand, enten den er naturlig eller kunstig, for derved å øke nøyaktigheten på den bestemte aktive sete strukturen.

Hvis en ufullstendig eller utilstrekkelig struktur er bestemt, så kan forskjellige databaserte numeriske modellsystemer brukes for å få en fullstendig struktur eller bedre dens nøyaktighet. Enhver modellmetode for gjenkjennelse kan brukes, heri inngår også såkalte parameteriserte modeller som er spesifikke for visse biopolymerer så som proteiner eller nukleinsyrer, molekylære dynamiske modeller basert på databehandling av molekylbevegelser, statistiske mekaniske modeller basert på varmeelementer eller kombinerte modeller. For de fleste typer av modeller så er det nødvendig med standard molekylære kraftfelt som representerer kreftene mellom de enkelte atomene og gruppene, og disse kan finnes og velges ut fra kraftfelt som kjent innenfor den fysikalske kjemien. De ufullstendige eller mindre nøyaktige eksperimentelle strukturene kan tjene som begrensninger på de mer fullstendige og mer nøyaktige strukturene som er beregnet ved hjelp av disse modelleringsmetodene.

Etter å ha bestemt strukturen på det aktive setet (eller bindingssetet), enten eksperimentelt eller ved modellering eller ved en kombinasjon av disse, kan endelig kandidatmodellerende forbindelser identifiseres ved å søke i databaser som inneholder forbindelser sammen med informasjon om deres molekylstruktur. I et slikt søk vil man lete etter forbindelser som har strukturer som tilsvarer den bestemte aktive setestrukturen og som virker sammen med grupper som definerer selve det aktive setet. Et slikt søk kan være manuelt, men blir fortrinnsvis utført ved hjelp av et dataprogram. De forbindelsene som finnes ved hjelp av dette søket er mulige modulatorer av Bv8-aktivitet.

Alternativt kan disse fremgangsmåtene brukes for å identifisere forbedrede modulerende forbindelser fra allerede kjente modulerende forbindelser eller ligander. Sammensetningen til en kjent forbindelse kan modifiseres og de strukturelle effektene av modifikasjonen kan bestemmes ut fra eksperimentelle eller datamodellerende metoder som er beskrevet ovenfor som så kan anvendes på den nye sammensetningen. Den endrede strukturen blir så sammenlignet med strukturen til det aktive setet i forbindelsen for derved å bestemme hvorvidt man har oppnådd en bedret tilpasning eller interaksjon. På denne måten kan man raskt bedømme systematiske variasjoner i sammensetning, for eksempel ved å variere sidegrupper for derved å kunne modifisere modulerende forbindelser eller ligander og oppnå bedret spesifisitet eller aktivitet.

Ytterligere eksperimentelle og databaserte modelleringsmetoder som kan brukes for å identifisere modulerende forbindelser basert på identifikasjon av det eller de aktive seter (eller bindingsseter) for Bv8 og relaterte overførings- og transkripsjonsfaktorer, er velkjente innenfor bioteknologien.

Eksempler på molekylære modelleringssystemer er CHARMm- og QUANTA-programmene (Polygen Corporation, Waltham, MA). CHARMm utfører energiminimalisering og molekylære dynamiske funksjoner. QUANTA utfører konstruksjon, grafisk modellering og analyse av molekylstrukturer. QUANTA muliggjør en interaktiv konstruksjon, modifikasjon, visualisering og en analyse av hvordan molekylene opptrer i forhold til hverandre.

Det foreligger en rekke oversiktsartikler som behandler datamodellering av medikamenter og forbindelser som er interaktive med spesifikke proteiner så som Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (16. juni 1988); McKinaly og Rossmann, 1989, Annu Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111-122; Perry og Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design sidene 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis og Dean, 1989 Proe. R. Soc. Lond. 236: 125-140 og 141-162; og med hensyn til en modellreseptor for nukleinsyrekomponenter, Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082-1090. Andre dataprogrammer som screener og grafisk viser kjemiske forbindelser er tilgjengelige fra firmaer så som BioDesign, Inc. (Pasadena, CA), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada) og Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Skjønt disse primært er utformet for å anvendes på medikamenter som er spesifikke for visse proteiner, så kan de også tilpasses for utforming av medikamenter som er spesifikke for områder i DNA eller RNA så snart området er identifisert.

Skjønt det som er beskrevet ovenfor henviser til utforming og utvikling av forbindelser som kan endre binding, så kan disse programmene også brukes for å screene biblioteker av kjente forbindelser, heri inngår naturlige produkter eller syntetiske kjemiske forbindelser og biologisk aktive materialer og stoffer så som proteiner, for forbindelser som er inhibitorer eller aktivatorer.

Forbindelser identifisert via prøver av den type som er beskrevet her kan for eksempel brukes for å belyse den biologiske funksjonen for et Bv8-genprodukt. Slike forbindelser kan administreres en pasient i terapeutisk effektive doser for å behandle en rekke forskjellige fysiologiske lidelser og sykdommer. En terapeutisk effektiv dose refererer seg her til den mengden av en forbindelse som er tilstrekkelig til å resultere i enhver lindring, hindring eller endring av ethvert biologisk symptom.

b. Prøver for forbindelser som binder seg til Bv8

Det kan utformes systemer som identifiserer forbindelser som er i stand til å virke sammen med (for eksempel binde seg til) eller etterligne Bv8, eller som er i stand til å påvirke bindingen av Bv8 til en kognat reseptor, bindingspartner eller substrat. De identifiserte forbindelsene kan for eksempel brukes for å modulere aktiviteten av villtype og/eller mutante Bv8-genprodukter; og de kan brukes for å utrede eller belyse den biologiske funksjonen til Bv8; og de kan brukes i undersøkelser for å identifisere forbindelser som bryter de normale Bv8-interaksjonene; eller de kan i seg selv bryte opp eller aktive slike interaksjoner.

Prinsippet for disse prøvene som brukes for å identifisere forbindelser som binder seg til Bv8 eller Bv8-kognatreseptorer eller substrater, innbefatter å fremstille en reaksjonsblanding av Bv8 og prøveforbindelsen under betingelser og i et tilstrekkelig tidsrom til at de to komponentene kan virke sammen og eventuelt binde seg til hverandre, og således danne et kompleks som deretter kan fjernes og/eller påvises i reaksjonsblandingen. De Bv8-molekyler eller komplekser som brukes vil variere med hensyn til hva man ønsker å få ut av screeningsprøven. Når for eksempel det er ønskelig å få identifisert agonister for en naturlig reseptor, så kan man bruke fullengde Bv8 eller et løselig forkortet Bv8, et peptid eller et fusjonsprotein som inneholder ett eller flere Bv8-domener fusjonert til et protein eller polypeptid som er fordelaktige i prøvesystemet (for eksempel merking, isolering av det resulterende komplekset etc). Når det søkes etter forbindelser som direkte virker sammen med Bv8, kan man bruke peptider som tilsvarer nevnte Bv8 og fusjonsproteiner som inneholder Bv8.

Screeningsprøvene kan utføres på en rekke forskjellige måter. En måte å utføre en slik prøve på, vil for eksempel innbefatte å forankre Bv8, polypeptidet, peptidet eller fusjonsproteinet av dette eller et prøvestoff eller forbindelse på en fast fase og deretter påvise kompleksene av Bv8/prøveforbindelsen som er festet eller forankret på den faste fasen ved slutten av reaksjonen. I en utførelse av denne fremgangsmåten vil Bv8-reaktanten kunne være festet på en fast overflate, mens prøveforbindelsen som ikke er tilfestet eller forankret kan være merket, enten direkte eller indirekte.

I praksis kan mikrotitreringsplater hensiktsmessig brukes som den faste fasen. Den forankrede komponenten kan være immobilisert ved en ikke-kovalent eller kovalent tilknytning. Ikke-kovalent tilknytning kan utføres ved ganske enkelt å belegge den faste overflaten med en løsning av proteinet med etterfølgende tørking. Alternativt kan et immobilisert antistoff, fortrinnsvis et monoklonalt antistoff, som er spesifikt for det proteinet som skal immobiliseres, brukes for å feste proteinet på den faste overflaten. Overflatene kan fremstilles på forhånd og lagres.

For å utføre prøven blir den ikke-immobiliserte komponenten tilsatt den belagte overflaten som inneholder den tilfestede komponenten. Etter at reaksjonen er fullstendig, blir uomsatte komponenter fjernet (for eksempel ved vasking) under slike betingelser at eventuelle komplekser som er dannet vil forbli immobilisert på den faste overflaten. Påvisning av komplekser som er festet på den faste overflaten kan gjøres på en rekke forskjellige måter. I de tilfeller hvor den på forhånd ikke-immobiliserte komponenten er merket, kan påvisning av markøren som er immobilisert på overflaten indikere at det er dannet komplekser. I de tilfeller hvor den på forhånd ikke-immobiliserte komponenten ikke er merket, kan en indirekte markør brukes for å påvise komplekser som er festet på overflaten, for eksempel ved å bruke et merket antistoff som er spesifikt for den på forhånd ikke-immobiliserte komponenten (antistoffet kan så igjen enten direkte merkes eller indirekte merkes med et merket anti-Ig-antistoff).

Alternativt kan det utføres en reaksjon i en væskefase hvor reaksjonsproduktene blir skilt fra uomsatte komponenter, og hvoretter kompleksene blir påvist, for eksempel ved å bruke et immobilisert antistoff som er spesifikt for et Bv8-protein, polypeptid, peptid eller fusjonsprotein eller en testforbindelse for å feste eventuelle komplekser som er dannet i løsningen, hvoretter man bruker et merket antistoff som er spesifikt for den andre komponenten i det mulige komplekset for å påvise tilfestede eller forankrede komplekser. c. Prøver for forbindelser som påvirker Bv8- inter aksjoner Makromolekyler som virker sammen med Bv8 er i den foreliggende beskrivelse og diskusjon betegnet som "bindingspartnere". Disse bindingspartnerne er sannsynligvis involvert i de Bv8-kontrollerte biologiske reaksjonsveiene. Det er derfor ønskelig å kunne identifisere forbindelser som påvirker eller bryter interaksjonen mellom Bv8 og slike bindingspartnere, fordi dette kan brukes for å regulere eller forsterke Bv8-aktivitet i kroppen og/eller for å kontrollere sykdommer som er assosiert med denne aktiviteten (eller en sviktende aktivitet).

Det grunnleggende prinsippet for prøvesystemene er å identifisere forbindelser som påvirker interaksjonen mellom Bv8 og en bindingspartner eller -partnere, innbefatter å fremstille en reaksjonsblanding som inneholder Bv8 eller en variant av dette og bindingspartneren under betingelser i et tilstrekkelig tidsrom til at man får en interaksjon mellom de to, og deretter binde det således fremstilte komplekset. For å undersøke hvorvidt en forbindelse har hemmende aktivitet, kan reaksjonen fremstilles i nærværet eller fraværet av prøveforbindelsen. Prøveforbindelsen kan først tilsettes reaksjonsblandingen, eller kan tilsettes på et tidspunkt etter tilsetningen av Bv8 og dens bindingspartner. Kontrollerte reaksjonsblandinger kan innkuberes med prøveforbindelsen eller med en placebo. Dannelsen av eventuelle komplekser med Bv8 og bindingspartneren kan så påvises. Dannelsen av et kompleks i kontrollreaksjonen, men ikke i reaksjonsblandingen som inneholder prøveforbindelsen, indikerer at forbindelsen påvirker interaksjonen mellom Bv8 og den interaktive bindingspartneren. Videre kan kompleksdannelse i reaksjonsblandingen som inneholder prøveforbindelsen og normalt Bv8-protein også sammenlignes med kompleksdannelse i reaksjonsblandinger som inneholder prøveforbindelsen og et mutant Bv8. Denne sammenligningen kan være viktig i de tilfeller hvor det er ønskelig å kunne identifisere forbindelser som spesifikt bryter interaksjoner for mutante eller muterte Bv8, men ikke de normale proteinene.

Prøven for forbindelser som påvirker interaksjonen mellom Bv8 og bindingspartnere kan utføres i et heterogent eller homogent format. Heterogene prøver innbefatter å forankre eller feste enten Bv8 eller bindingspartneren til en fast fase og så påvise komplekser som er festet på denne fasen ved slutten av reaksjonen. I homogene prøver blir hele reaksjonen utført i en væskefase. I hver fremgangsmåte kan tilsetningsrekkefølgen for reaktantene varieres for derved å oppnå forskjellig informasjon om de forbindelsene som undersøkes. For eksempel kan prøveforbindelsene som påvirker interaksjonen ved konkurranse identifiseres ved å utføre reaksjonen i nærværet av prøvestoffet eller forbindelsen, det vil si ved å tilsette dette til reaksjonsblandingen før eller samtidig med Bv8 eller den interaktive bindingspartneren. Alternativt kan prøveforbindelser som bryter de på forhånd dannede kompleksene, det vil si forbindelser med høyere bindingskonstanter slik at de erstatter en av komponentene i komplekset, testes ved å tilsette prøveforbindelsen til reaksjonsblandingen etter at kompleksene er blitt dannet. De forskjellige formatene er kort beskrevet i det etterfølgende.

I et heterogent prøvesystem blir enten Bv8 eller en interaktiv bindingspartner festet eller forankret til en fast overflate, mens den ikke tilfestede forbindelsen eller stoffet blir merket, enten direkte eller indirekte. I praksis vil man hensiktsmessig bruke mikrotitreringsplater. De forankrede forbindelsene kan immobiliseres ved ikke-kovalent eller kovalent tilfesting. Ikke-kovalent tilfesting kan oppnås ganske enkelt ved å belegge den faste overflaten med en løsning av Bv8 eller bindingspartneren og så tørke platen. Alternativt kan et immobilisert antistoff som er spesifikt for den forbindelsen eller det proteinet som skal festes, brukes for å feste forbindelsen til den faste overflaten. Overflatene kan fremstilles på forhånd og lagres.

For å gjennomføre prøven blir partneren for det immobiliserte proteinet eller forbindelsen eksponert på den belagte overflaten med eller uten prøveforbindelsen. Etter at reaksjonen er gjennomført blir uomsatte komponenter fjernet (for eksempel ved vasking) mens eventuelle komplekser som er dannet vil forbli immobilisert på den faste overflaten. Påvisningen av komplekser som er festet på den faste overflaten kan oppnås på en rekke forskjellige måter. Når den ikke-immobiliserte forbindelsen eller proteinet er merket på forhånd, så vil en påvisning av markøren immobilisert på overflaten indikere at det er dannet komplekser. Når den ikke-immobiliserte komponenten ikke er merket på forhånd, kan en indirekte markør brukes for å påvise komplekser som er festet på overflaten, for eksempel ved å bruke et merket antistoff som er spesifikt for den opprinnelige ikke-immobiliserte komponenten (det vil si antistoffet som så igjen direkte kan merkes eller indirekte merkes med et merket anti-Ig-antistoff). Avhengig av rekkefølgen ved tilsetning av reaksjonskomponentene, kan man påvise prøveforbindelser som hemmer kompleks dannelsen eller bryter opp på forhånd dannede komplekser.

Alternativ kan reaksjonen utføres i en væskefase i nærværet eller fraværet av prøveforbindelsen, hvoretter reaksjonsproduktene skilles ut fra uomsatte komponenter, hvoretter kompleksene påvises for eksempel ved å bruke et immobilisert antistoff som er spesifikt for en av bindingskomponentene for tilfesting til eventuelle komplekser som måtte være dannet i løsningen, hvoretter forankrede komplekser kan påvises ved hjelp av et merket antistoff som er spesifikt for den andre partneren. Igjen avhengig av tilsetningsrekkefølgen for reaktantene i væskefasen, vil man kunne identifisere prøveforbindelser som hemmer kompleksdannelse eller som bryter opp allerede dannede komplekser.

I en alternativ utførelse av oppfinnelsen, kan man bruke en homogen prøve. I denne metoden blir et på forhånd dannet kompleks av Bv8 og en interaktiv bindingspartner fremstilt hvor enten Bv8 eller bindingspartneren er merket, men hvor det signalet som blir utviklet av markøren blir eliminert på grunn av dannelsen av komplekset (se for eksempel U.S. patent nr. 4,109,496 til Rubenstein som bruker denne metoden for immunoprøver). Tilsetning av et prøvestoff som konkurrerer med og erstatter en av komponentene i det på forhånd dannede komplekset, vil resultere i utviklingen av et signal som ligger over bakgrunnssignalet. På denne måten kan man identifisere de prøvestoffene som bryter opp eller svekker interaksjonen.

I en spesiell utførelse kan en Bv8-fusjon fremstilles for immobilisering. For eksempel kan Bv8 eller et peptidfragment av dette fusjoneres til et glutation-S-transferase (GST) gen ved å bruke en fusjonsvektor så som pGEX-5X-l på en slik måte at dens bindingsaktivitet blir opprettholdt i det resulterende fusjonsproteinet. Den interaktive bindingspartneren kan renses og brukes for å utvikle et monoklonalt antistoff ved å bruke fremgangsmåter som rutinemessig brukes innenfor bioteknologien og som er beskrevet ovenfor. Dette antistoffet kan merkes med en radioaktiv isotop125I, ved kjente fremgangsmåter. I en heterogen prøve vil fusjonsproteinet kunne festes til glutation-agaroseperler. Den interaktive bindingspartneren kan så tilsettes i nærvær eller fravær av prøveforbindelsen på en slik måte at det muliggjør interaksjon og binding. Etter at reaksjonen er fullstendig, kan ubundet materiale vaskes vekk og det merkede monoklonale antistoffet kan tilsettes systemet og vil så binde seg til de kompleks dannede komponentene. Interaksjonen mellom Bv8 og den interaktive bindingspartneren kan så måles ved å måle mengden av radioaktivitet som forblir assosiert med glutation-agaroseperlene. En vellykket inhibering av interaksjonen av prøveforbindelsen vil resultere i en senkning av den målte radioaktiviteten.

Alternativ kan GST-fusjonsproteinet og den interaktive bindingspartneren blandes i væske i fravær av faste glutation-agaroseperler. Prøveforbindelsen kan tilsettes enten under eller etter at komponentene har reagert. Denne blandingen kan så tilsettes glutation-agaroseperlene, hvoretter ubundne komponenter vaskes vekk. Igjen vil graden av inhibering av interaksjonen mellom Bv8 og bindingspartneren kunne påvises ved å tilsette det merkede antistoffet og måle radioaktiviteten som er assosiert med perlene.

I en annen utførelse av oppfinnelsen kan de samme teknikkene brukes ved å anvende peptidfragmenter som tilsvarer de bindende domenene i Bv8 og/eller den interaktive eller bindende partneren (i de tilfeller hvor bindingspartneren er et protein) i stedet for ett eller begge fullengde proteinene. En rekke kjente fremgangsmåter kan brukes for å identifisere og isolere bindingssetene. Disse fremgangsmåtene innbefatter, men er ikke begrenset til, mutagenese av det genet som koder ett av proteinene og så screene for en oppbrytning av bindingen i en samimmunoutfellingsprøve. Kompensatoriske mutasjoner i det genet som koder den andre komponenten i komplekset kan så selekteres. Sekvensanalyser av de genene som koder de respektive proteinene vil avsløre eller vise de mutasjoner som tilsvarer det området av proteinet som inngikk i den interaktive bindingen. Alternativt kan ett protein festes til en fast overflate som beskrevet ovenfor, og deretter interagere og binde seg til sin merkede bindingspartner som på forhånd er blitt behandlet med et proteolytisk enzym så som trypsin. Etter vasking vil et relativt kort merket peptid som omfatter det bindende domenet forbli assosiert med det faste materialet som så kan isoleres og identifiseres ved aminosyresekvensering. Så snart man har oppnådd det genet som koder den intracellulære bindingspartneren, kan et kort gensegment manipuleres slik at det uttrykker peptidfragmenter av proteinet som så kan testes for bindingsaffinitet og deretter renses eller syntetiseres.

For eksempel, uten at dette begrenser oppfinnelsen som sådan, kan Bv8 festes til et fast materiale som beskrevet ovenfor, ved å fremstille et GST-fusjonsprotein og la dette binde seg til glutation-agaroseperler. Den interaktive bindingspartneren kan merkes med en radioaktiv isotop så som<35>S og så spaltes med et proteolytisk enzym så som trypsin. Spaltningsproduktene kan så tilsettes det tilfestede fusjonsproteinet og eventuelt binde seg til dette. Etter at ubundne peptider er vasket vekk, kan merket bundet materiale som representerer den intracellulære bindingspartnerens bindingsdomene elueres, renses og analyseres for aminosyresekvens ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Peptider som er identifisert på denne måten kan så fremstilles syntetisk eller fusjoneres til passende proteiner ved å bruke rekombinant DNA-teknologi.

6. Farmasøytiske sammensetninger

De Bv8-polypeptider og deres modulatorer som er beskrevet her kan brukes som terapeutiske midler. Bv8-polypeptidene og Bv8-modulatorene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan opparbeides ved hjelp av kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk brukbare sammensetninger, hvor Bv8-produktet blir kombinert i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Terapeutiske preparater som inneholder Bv8 kan fremstilles ved å blande Bv8 med den forønskede renhetsgraden, fortrinnsvis i alt vesentlig helt rent, med eventuelle fysiologisk akseptable bærerstoffer, fortynningsmidler eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) i form av et frysetørket produkt eller som vandige løsninger. Man vil i denne sammenhengen selvsagt anvende akseptable bærere, fortynningsmidler eller stabilisatorer som er ikke-toksiske for den cellen eller det pattedyret som skal eksponeres overfor dosen. Eksempler innbefatter buffere så som fosfat, citrat og andre organiske syrer; antioksidanter så som askorbinsyre; lavmolekylære (det vil si mindre enn 10 residua) polypeptider; proteiner så som serum albumin, gelatin eller immunoglobuliner; hydrofile polymerer så som polyvinylpyrrolidon, aminosyrer så som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin; monosakkarider, disakkarider eller andre karbohydrater så som glukose, mannose eller dekstriner; gelateringsmidler så som EDTA; sukkeralkoholer så som mannitol eller sorbitol; saltdannende motioner så som natrium; og/eller ikke-ioniske overfiateaktive midler så som Tween, Pluronics eller PEG.

Det Bv8 som skal brukes for in vivo administrering må være sterilt. Dette kan lett oppnås ved hjelp av kjente fremgangsmåter, for eksempel ved filtrering gjennom sterile filtreringsmembraner før eller etter frysetørking og rekonstituering. Bv8 kan lagres i frysetørket form. Terapeutiske Bv8-sammensetninger vil vanligvis være plassert i en beholder med en steril åpning, for eksempel i en intravenøs løsningspose eller ampulle med en forsegling som lar seg gjennomtrenge av en hypodermisk injeksjonsnål.

Bv8 kan eventuelt kombineres med eller administreres sammen med andre vekstfaktorer. For eksempel kan det eventuelt kombineres med EG-ECGF eller

VEGF.

Bv8 kan brukes sammen med andre kjente terapier for behandling av cancer.

Administreringsveien er i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter, for eksempel ved injeksjon eller infusjon ved intravenøs, intraperitoneal, intracerebral, intramuskulær, intraokulær, intraarteriell eller intralesionalt, topikal administrering eller ved hjelp av systemer som gir vedvarende eller forsinket frigjøring.

Doser og ønskelige medikamentkonsentrasjoner i de farmasøytiske sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan variere avhengig av den bruk man forestiller seg. Bestemmelsen av passende doser og administreringsvei vil vanligvis bli avgjort av den behandlende elgen. Dyreeksperimenter vil kunne gi pålitelige retningslinjer for å bestemme effektive doser for human terapi. En interartsoppskalering av effektive doser kan utføres ved å bruke de prinsippene som er beskrevet av Mordenti, J. og Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" i Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., red., Pergamon Press, New York 1989, sidene 42-96.

I de tilfeller hvor det er ønskelig med en forlenget eller vedvarende administrering av et Bv8-polypeptid eller en modulator, så kan dette gjøres ved hjelp av preparater med frigjøringsegenskaper som er egnet for behandlingen av enhver sykdom eller lidelse som krever administrering av et Bv8-polypeptid, for eksempel ved hjelp av mikro innkapsling av Bv8-polypeptidet eller en modulator. For eksempel kan Bv8 i renset form innfanges i mikrokapsler, for eksempel fremstilt ved en såkalt innleiringsteknikk eller såkalt interfacial polymerisering (for eksempel hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler og poly-(metylmetacylat)-mikrokapsler henholdsvis, i kolloidale tilførselssystemer for medikamenter (for eksempel liposomer, albumin mikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler eller nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, 1980 (A. Osol, red).

Bv8 kan også inkorporeres i lengevirkende preparater for terapeutisk anvendelse. Egnede eksempler på slike preparater med vedvarende frigjøring innbefatter semipermeable polymermatriser i form av formede artikler som for eksempel filmer eller mikrokapsler. Eksempler på matriser som gir vedvarende frigjøring er polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetylmetakrylat) slik det for eksempel er beskrevet av Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-227 (1981) og Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982) eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (U.S. patent nr. 3,773,919, EP 58,481), sampolymerer av L-glutaminsyre og gamma etyl-L-glutamat (Sidman, et al, Biopolymers 22: 547 (1983)), ikke-nedbrytbart etylenvinylacetat (Langer, et al, supra) eller nedbrytbare melkesyre-glykolinsyre-sampolymerer så som Lupron Depot™ (injiserbare mikrokuler sammensatt av melkesyre-glykolinsyre-sampolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre (EP 133,988).

Mens polymerer så som etylenvinylacetat og melkesyre-glykolinsyre gjør det mulig med en frigjøring av molekyler i løpet av en 100 dagers periode, så vil visse hydrogeler frigjøre proteinene i kortere tidsrom. Når innkapslede proteiner forblir i kroppen i et lengre tidsrom, så kan de ble denaturert eller aggregere seg som et resultat av en eksponering overfor fuktighet ved 37°C, noe som resulterer i et tap av biologisk aktivitet og mulige forandringer i immunogenitet. Rasjonelle strategier kan i så henseende utvikles for proteinstabilisering avhengig av den mekanisme som inngår. Hvis man for eksempel oppdager at aggregeringsmekanismen skyldes en dannelse av en intermolekylær S-S-binding via en tiodisulfidutbytting, så kan stabilisering oppnås ved å modifisere sulfhydrylresidua, frysetørking fra sure løsninger, kontroll av fuktighetsinnholdet, bruk av passende additiver og utvikle spesifikke polymermatrisesammensetninger.

Sammensetninger for vedvarende frigjøring av Bv8 kan også innbefatte liposomalt innfanget Bv8. Liposomer om inneholder Bv8 kan fremstilles ved hjelp av kjente fremgangsmåter. (Epstein, et al., 1985, Proe. Nati. Acid. Sei. 82: 3688; Hwang, et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77: 4030; DE 3. 218. 121 A; EP 52322A; EP 36676A; EP 88046A; EP 143949A; EP 142641A; japansk patentsøknad nr. 83-118008; U.S. patent nr. 4. 485. 045 og 4. 544. 545: og EP 102,324A). Vanligvis er liposomene små (ca 200-800 Ångstrøm) og av en unilaminær type hvor lipidinnholdet er større enn ca 30 mol% kolesterol, og hvor det valgte forholdet justeres for optimal Bv8-terapi.

For topisk anvendelse kan Bv8 egnet blandes med andre ingredienser så som bærerstoffer og/eller adjuvanser. Det er ingen begrensninger med hensyn til slike andre bestanddeler, bortsett fra at de må være fysiologisk akseptable og effektive for deres påtenkte administrering og må ikke svekke aktiviteten på de aktive bestanddelene i sammensetningen. Eksempler på egnede bærervæsker eller bærerstoffer innbefatter salver, kremer, geler eller suspensjoner med eller uten renset collagen. Sammensetningene kan også impregneres for fremstilling av transdermale plastertyper, bandasjer og lignende, fortrinnsvis i en flytende eller semiflytende form.

For fremstilling av et gelpreparat, kan Bv8 opparbeides i en flytende sammensetning som kan blandes med en effektiv mengde av et vannløselig polysakkarid eller syntetisk polymer så som PEG for fremstilling av en gel med passende viskositet som kan påføres topikalt. Det anvendte polysakkaridet kan for eksempel være cellulosederivater så som foretrede cellulosederivater inklusive alkylcelluloser, hydroksyalkylcelluloser og alkylhydroksyalkylcelluloser, for eksempel metylcellulose og hydroksyetylcellulose, karboksymetylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose og hydroksypropylcellulose; stivelse og fraksjonert stivelse; agar; algininsyre og alginater; gummi arabikum; pullulan; agarose; carrageenan; dekstraner; dekstriner; fruktaner; inulin; mannaner; xylaner; arabinaner; kitosaner; glykogener; glukaner; og syntetiske biopolymerer; så vel som forskjellige gummityper så som xantangummi; guargummi; johannesbrødgummi; gummi arabikum; tragakantgummi; og karaya; og derivater og blandinger av disse. Det foretrukne geldannende middelet er et som er inert i biologiske systemer, er ikke-toksisk, er enkelt å fremstille og er ikke for viskøst eller for rennende og vil ikke destabilisere Bv8 i gelen.

Det er foretrukket at polysakkaridet er et foreteret cellulosederivat, mest foretrukket et som er godt definert, renset og angitt i USP, for eksempel metylcellulose og hydroksyalkylcellulosederivater så som hydroksypropylcellulose, hydroksyetylcellulose og hydroksypropylmetylcellulose. Mest foretrukket er det å bruke metylcellulose.

Polyetylenglykol som kan brukes for geldannelsen er vanligvis en blanding av lav-og høymolekylære PEG for å oppnå passende viskositet. For eksempel vil en blanding av en PEG med en molekylvekt på mellom 400 og 600 med en som har en molekylvekt på 1500 være effektivt for dette formålet når de blandes i et passende forhold slik at man får fremstilt en pasta.

Begrepet "vannløselig" slik det anvendes i forbindelse med polysakkarider og nevnte PEG, innbefatter kolloidale løsninger og dispersjoner. Vanligvis vil cellulosederivatenes løselighet være bestemt av substitusjonsgraden på etergruppene, og stabiliserende derivater som kan brukes i foreliggende oppfinnelse bør ha tilstrekkelige mengder av slike etergrupper pr anhydroglukoseenhet i cellulosekjeden til at derivatene blir vannløselige. En etersubstitusjonsgrad på minst 0,35 etergrupper pr anhydroglukoseenhet er vanligvis tilstrekkelig. Videre kan cellulosederivatene være i form av alkalimetallsalter, for eksempel Li-, Na-, K- eller Cs-saltene.

Hvis metylcellulose brukes i gelen, så bør den fortrinnsvis utgjøre 2-5%, mer foretrukket omtrent 3% av gelen, og Bv8 bør være tilstede i en mengde på omtrent 300-1000 mg pr ml av gelen.

Semipermeable implanterbare membrananordninger kan brukes som anordninger for å tilføre medikamentene under visse omstendigheter. For eksempel kan celler som skiller ut Bv8, Bv8-varianter, Bv8-kimærer eller Bv8-agonister eller -antagonister innkapsles og slike anordninger kan så implanteres i en pasient. Oppfinnelsen innbefatter følgelig en fremgangsmåte for å hindre eller å behandle cancer som omfatter å implantere celler som skiller ut Bv8, dens agonister eller antagonister etter behov for den spesielle tilstanden som behandles i kroppen til pasienter som har behov for dette. Endelig innbefatter den foreliggende oppfinnelsen en anordning for å hindre eller behandle cancer ved at det i en pasient implanteres et implantat som omfatter en semipermeabel membran og celler som skiller ut Bv8 (eller dets agonister eller antagonister etter behov for den spesielle tilstand som behandles) innkapslet inne i nevnte membran, og hvor denne er permeabel for Bv8 (eller dets agonister eller antagonister), og impermeabel for faktorer fra pasienten som måtte være skadelig for cellene. Pasientens egne celler transformert til å produsere Bv8 ex vivo bør implanteres direkte i pasienten, eventuelt uten en slik innkapsling. Fremgangsmåter for membran innkapsling av levende celler er velkjent innenfor bioteknologien og fremstillingen av innkapslede celler og deres implantering i pasienter kan utføres uten for omfattende eksperimentering.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter Bv8 eller en Bv8-agonist eller -antagonist er fortrinnsvis plassert i en egnet beholder. Beholderen kan fortrinnsvis være fulgt av instruksjoner som detaljert forklarer bruken og doseringen av den farmasøytiske sammensetningen. Det tør være innlysende at disse instruksjonene vil variere avhengig av hvilken behandlingsmetode som anvendes.

7. Behandlingsmetoder

De terapeutiske midler som er tilveiebrakt her, kan brukes ved en rekke behandlinger. Behandlingene innbefatter å behandle et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, med en tilstand som er assosiert med hormonproduserende vev eller endokrine kjertler og/eller med tilstander som er assosiert med for omfattende, uønsket eller ukontrollert angiogenese. I ett aspekt blir Bv8 eller en Bv8-agonist administrert til et pattedyr som har behov for dette i en mengde som effektivt behandler tilstanden. Bv8 kan administreres i en polypeptid- eller nukleinsyreform. Bv8 eller en Bv8-agonist blir fortrinnsvis brukt når tilstanden er en som krever en overlevelse eller et økende antall celler som produserer et spesielt hormon. Eksempler på slike tilstander innbefatter diabetes. Andre tilstander innbefatter de hvor det er ønskelig å øke antallet av eller bedre overlevelsen av cellene i reproduksjonsorganene, for eksempel cellene i testiklene. Andre tilstander innbefatter de hvor det er ønskelig å øke dannelsen av nye blodkar. Eksempler på slike tilstander innbefatter tumorer, for eksempel cancer i testiklene.

Bv8 kan administreres sammen med en annen forbindelse eller sammensetning. I en utførelse er sammensetningen VEGF eller en agonist eller antagonist av denne. Eventuelt kan forbindelsen være en nukleinsyre som koder et polypeptid så som

VEGF.

I en utførelse kan forbindelser, for eksempel de som er identifisert ved de screeningsprøver som er beskrevet i avsnittene 4 og 5 ovenfor, brukes for å modulere nivået av Bv8-aktivitet eller -ekspresjon. Mer spesifikt kan forbindelser som er identifisert som Bv8-agonister eller som er i stand til å stimulere bindingen av Bv8 til sin reseptor, brukes for behandlinger hvor det er ønskelig med et forhøyet Bv8-aktivitetsnivå. På lignende måte kan forbindelser som er identifisert til å være i stand til å øke Bv8-genekspresjonen brukes for denne typen behandling. Fortrinnvis blir Bv8 eller en agonist eller antagonist av denne administrert et individ med en tilstand som er assosiert med hormonproduserende vev eller endokrine kjertler, fortrinnsvis en tilstand som krever en nedsettelse av antallet celler som produserer et spesielt hormon, en senkning av celledelingen eller en senket angiogenese. Oppfinnelsen tilveiebringer således en fremgangsmåte for å regulere fertilitet i et individ som omfatter å administrere en Bv8-antagonist til et individ i en tilstrekkelig mengde som effektivt regulerer fertiliteten. Bv8-antagonister kan også administreres for å behandle cyster eller andre tilstander som er assosiert med en for sterk celledeling i hormonproduserende vev.

Steroid hormonavhengige lidelser kan også behandles ved å bruke sammensetninger og fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Slike lidelser innbefatter lipoid kongenital adrenal hyperplasi, ufruktbarhet, seksuell modning, androgenavhengige tumorer, prekokiøs pubertet, McCune-Albrights syndrom, adrenal-hypoplasi congentia eller hypogonadotropisk hypogonadisme.

En spesifikk tilstand som kan behandles ved hjelp av de midler og sammensetninger som er tilveiebrakt her, er cancer, da spesielt steroid-, for eksempel androgenavhengig cancer. En foretrukket fremgangsmåte for å behandle cancer som tilveiebrakt her, innbefatter å administrere en Bv8-antagonist til et individ som har eller som har en risiko for å ha cancer, i en tilstrekkelig effektiv mengde til å behandle canceren. I en utførelse er canceren testikkelkreft.

I en ytterligere utførelse kan en Bv8-antagonist administreres en pasient i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler, for eksempel ved behandlingen av cancer. Således kan Bv8 administreres før, under eller etter behandlingen med kjemoterapeutiske midler slik at den terapeutiske effekten blir bedret. Foretrukne kjemoterapeutiske midler innbefatter, men er ikke begrenset til, vinkristin, cisplatin, metotreksat, 3'-azido-3-'deoksytymidin, taksaner (for eksempel paklitaksel (TAXOL<®>, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og doksetaksel (TAXOTERE<®>, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike) og/eller antrasyklinantibiotika. Veiledning tilveiebrakt av fabrikanten vil bestemme type av preparat og doseringsregime for slike kjemoterapeutiske midler, eller de kan bestemmes empirisk ved hjelp av egnet personale. Fremstilling og doseringsregimer for slike kjemoterapeutiske behandlinger er også beskrevet i Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Det er underforstått at fremgangsmåtene for å øke celledelingen og eventuelt hemme celledeling kan utføres in vivo eller in vitro. I enkelte tilfeller kan det være ønskelig å tilsette Bv8 til en celleprøve in vitro for å stimulere delingen av en spesifikk celletype. Den Bv8-behandlede prøven kan så brukes i screeningsprøver eller transplanteres over i et individ som har behov for behandling eller brukes i en dyremodell.

Hvilken effektiv mengde av Bv8 eller en Bv8-agonist eller -antagonist som skal anvendes terapeutisk vil for eksempel være avhengig av de terapeutiske hensikter, administrasjons veien og pasientens tilstand. Følgelig vil det være nødvendig for den behandlende legen å justere dosen og modifisere administrasjonsveien etter behov for å oppnå den optimale terapeutiske effekten. Typisk vil legen administrere Bv8 inntil man når en dose som gir den forønskede effekt. En typisk daglig dose for systemisk behandling kan variere fra ca 10 ng/kg til 100 mg/kg av pasientens kroppsvekt eller mer pr dag, fortrinnsvis ca 1 u.g/kg/dag til 10 mg/kg/dag avhengig av administrasjonsveien. Det er underforstått at forskjellige preparater vil være effektive for de enkelte forskjellige behandlende forbindelsene og forskjellige lidelser, og at administrering som er rettet inn mot et organ eller vev vil være forskjellig fra det som ble anvendt i forhold til et annet organ eller vev.

Som en alternativ fremgangsmåte kan Bv8 opparbeides og tilføres det søkte stedet eller vevet i en dose som gjør det mulig i vevet å etablere et Bv8-nivå som er effektivt, men ikke for toksiske. Konsentrasjonen i vevet bør opprettholdes hvis mulig ved kontinuerlig infusjon, vedvarende frigjøring, topikal anvendelse, implantering av Bv8-uttrykkende celler eller injeksjon ved empirisk bestemte frekvenser. Utviklingen av denne terapien kan lett kontrolleres ved hjelp av vanlig kjente prøver.

Doseringsregimet må bestemmes basert på individuelle omstendigheter. I en foretrukket utførelse blir imidlertid Bv8 eller en Bv8-agonist eller antagonist administrert hver dag, fortrinnsvis annenhver dag og mer foretrukket minst to ganger i uken. Behandlingen bør fortrinnsvis fortsette i 6 måneder, mer foretrukket i 1 måned og mest foretrukket i minst 2 uker. Det er underforstått at det nøyaktige doseringsregimet må bestemmes av den behandlende legen basert på individuelle omstendigheter.

Nukleinsyre som koder et Bv8-polypeptid kan også brukes i genterapi. I genterapimetoder blir genene innført i celler for å oppnå en in vivo syntese av et terapeutisk effektivt genprodukt, for eksempel som erstatning for et ødelagt eller sviktende gen. "Genterapi" innbefatter både vanlig genterapi hvor man oppnår en varig effekt ved en enkelt behandling, eller administreringen av genterapeutiske midler som innbefatter en engangs eller gjentatte administreringer av et terapeutisk effektiv DNA eller mRNA. Antisens RNA-molekyler og DNA-molekyler kan brukes som terapeutiske midler for å blokkere ekspresjonen av visse gener in vivo. Det er allerede vist at korte antisens oligonukleotider kan føres inn i celler hvor de virker som inhibitorer, dette til tross for deres lave intracellulære konsentrasjoner, noe som skyldes deres begrensede opptak av cellemembranen (Zamecnik et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83: 4143-4146 [1986]). Oligonukleotidene kan modifiseres for å bedre deres opptak, for eksempel ved å erstatte deres negativt ladede fosfodiestergrupper med uladede grupper.

Det er kjent en rekke forskjellige teknikker for å føre nukleinsyrer inn i levende celler. Disse teknikkene vil variere hvorvidt nukleinsyren skal overføres til dyrkede celler in vitro, eller in vivo i cellene hos den påtenkte verten. Teknikker som er egnet for overføring av nukleinsyre til pattedyrceller in vitro innbefatter bruken av liposomer, elektroporering, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfatutfellingsmetoden osv. De for tiden foretrukne in vivo genoverføringsteknikkene innbefatter transfeksjon med virale (typisk retrovirale) vektorer og viralbelagt proteinliposomkontrollert transfeksjon (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)). I enkelte situasjoner vil det være ønskelig å tilveiebringe nukleinsyrekilden sammen med et middel som søker seg til de målsatte cellene, for eksempel et antistoff som er spesifikt for et celleoverflatemembranprotein eller den søkte cellen, en ligand for en reseptor på målcellen etc. I de tilfeller hvor man anvender liposomer, er det mulig å bruke proteiner som binder seg til et celleoverflatemembranprotein som er assosiert med endocytose for å lettere søke frem til og/eller lette opptaket, det vil si kapsidproteiner eller fragmenter av disse som er tropiske for en spesiell celletype, antistoffer for proteiner som internt blir tatt opp i cellen under syklisering, proteiner som søker seg til intracellulære posisjoner og bedrer det intracellulære halvlivet. Denne teknikken med reseptorkontrollert eller -styrt endocytose er for eksempel beskrevet av Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); og Wagner et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87. 3410-3414 (1990). For en oversikt over genmerking og genterapiprotokoller, se Anderson et al., Science 256. 808-813 (1992).

Bv8-sekvensene kan også brukes i forskjellige diagnostiske metoder. Overekspresjon av Bv8 kan indikere en cyste eller cancer i et reproduksjonsorgan. Videre kan en prøve fra en pasient analyseres for mutert eller dysfungerende Bv8. Slike fremgangsmåter innbefatter generelt en sammenligning av Bv8-ekspresjonen i en prøve fra en pasient i forhold til en kontroll.

8. Fremstilte produkter

I et annet aspekt angår oppfinnelsen et fremstilt produkt som innbefatter materialer som kan brukes for å behandle eller hindre en sykdom eller lidelse eller for å regulere fruktbarhet. Det fremstilte produktet omfatter fortrinnsvis en beholder og en merkelapp eller en pakning som er innsatt i eller på annen måte er assosiert med beholderen. Egnede beholdere innbefatter for eksempel flasker, ampuller, sprøyter etc. Beholderne kan fremstilles av forskjellige typer materialer så som glass og plast. Beholderen kan inneholde en sammensetning som omfatter Bv8 eller en agonist eller antagonist av dette, og en merkelapp eller en bruksanvisning som angir hvordan Bv8 eller den agonist eller antagonist skal brukes. I en utførelse vil den fremstilte artikkelen omfatte en Bv8-antagonist og bruksanvisninger for å anvende nevnte Bv8-antagonist for å behandle eller hindre cancer. I en annen utførelse omfatter det fremstilte produktet Bv8 og bruksanvisninger for å bruke Bv8 for å behandle eller å hindre en tilstand som er assosiert med et hormonproduserende endotelvev. I en ytterligere utførelse vil den fremstilte artikkelen omfatte en Bv8-antagonist og instruksjoner og bruksanvisninger for å bruke Bv8-antagonisten for å regulere fruktbarhet. Bruksanvisningene kan også indikere et passende doseringsregime. I en utførelse vil bruksanvisningen indikere at sammensetningen kan administreres i en dose på mellom 0,01 u.g/kg og 50 mg/kg kroppsvekt.

EKSEMPLER

Kommersielt tilgjengelige reagenser som er omtalt i eksemplene ble brukt som angitt av fabrikanten hvis intet annet er angitt. Kilden for de cellene som er beskrevet og identifisert i de følgende eksemplene og i hele beskrivelsen ved ATCC-tilvekstnumre, er fra the American Type Culture Collection, Manassas, VA.

EKSEMPEL 1

Northern blotanalyse

For å belyse ekspresjonsmønsteret for Bv8 ble det gjennomført en Northern blotanalyse ved å bruke RNA fra en rekke forskjellige vev fra mennesker, mus og rotter. Flere humane RNA-blot ble hybridisert til en<32>P-merket DNA-probe som var basert på humant Bv8 cDNA, mens tilsvarende RNA-blot fra mus og rotter ble hybridisert til en<32>P-merket DNA-probe basert på muse Bv8 cDNA.

Northern blotanalysen ble gjennomført ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. For eksempel ble cDNA-prober fremstilt ved å bruke 30-50 ng av humane eller muse cDNA-fragmenter med Redi-Prime II-settet (Amersham) ve då bruke<32>P-dCTP 3000 u.Ci/mmol (Amersham). Probene ble renset på Sephadex G50 spinnkolonner (Pharmacia) og hybridisering ble utført ved 68°C i ExpressHyb hybridiseringsløsning (Stratagene). I et annet eksempel ble membranene innkubert med prober i hybridiseringsbuffer (5 X SSPE; 2 X Denhardts løsning; 100 mg/ml DNA fra denaturerte skårne laksesædceller; 50% formamid; 2% SDS) i 60 timer ved 42°C. Membranene ble vasket flere ganger med 2 X SSC; 0,05% SDS i 1 time ved romtemperatur fulgt av en 30 minutters vasking i 0,1 X SSC; 0,1% SDS ved 50°C. Membranene ble fremkalt over natten ved hjelp av en fosforbilleddannende analyse (Fuji). Tilsvarende RNA-belastning ble bedømt ved hybridisering med en kontrollaktinprobe.

Bv8 mRNA-transkripter ble påvist. Figur 9 viser at en enkelt mRNA-sekvens på 1,8 kb ble påvist i humane testikler ved hjelp av en human Bv8-probe. Ingen ekspresjon ble påvist i noe annet humant vev som ble analysert. Figur 10A viser at en enkel mRNA-sekvens ble påvist både i hjerter og testikler fra mus. Figur 10B viser at transkripter på 1,8 kb og 0,8 kb var tilstede i testikler hos rotter, men ikke i noen andre typer rottevev. Disse resultatene indikerer til sammen at testiklene er det viktigste stede for ekspresjon av Bv8 mRNA.

EKSEMPEL 2

Celledelingsprøver

For å bestemme reaksjonsfølsomheten for visse celletyper for Bv8, ble storfebinyre kapillære endotelceller fra hjernebarken (ACE) og storfekapillære endotelceller fra hjernen (BBC) undersøkt for sine celledelingsreaksjoner.

Kort fortalt ble ACE (adrenale kapillære endotelceller i hjernebarken) og BBC (storfekapillære endotelceller fra hjernen) dyrket i et lavglukose DMEM supplert med 10% storfekalveserum. For celledelingsprøver ble 6000 celler utplatet i hver brønn på 12 brønners plater i ovennevnte media uten noen tilsetning for kontroll ("C" på figur 11), 10 ng/ml VEGF ("V" på figur 11), 50, 10 eller 1 nM Bv8 (Fc-merket rekombinant protein). Alle cellene ble så telt etter 1 uke ved å bruke en Coulterteller. Økningen i celletallet er i forhold til kontrolltilstanden som vilkårlig ble satt til 1. Media og andre celledyrkningsreagenser ble kjøpt fra Life Technologies, Inc. For gjennomføring av prøven, se også Aravind og Koonin, Curr. Biol. 8: 477-478 (1998).

De preliminære resultatene som er vist på figurene 1 IA og 1 IB, indikerer et økende celleantall i forhold til kontrollene. Bv8 ga en økende celledeling ved alle de undersøkte konsentrasjonene og med en maksimal effekt ved en konsentrasjon på 50 nM. VEGF, en positiv kontroll, induserte en nesten tre gangers økning av celledelingen både i ACE- og BCC-celler sammenlignet med den ubehandlede kontrollen.

EKSEMPEL 3

Celleoverlevelsesprøve

Effekten av Bv8 på overlevelsen av endotelceller ble målt. Ca 2 x IO<5>storfekapillære celler fra hjernen (BBC) ble utplatet i hver brønn på 6 brønners plater som inneholdt fullstendige media (som beskrevet i eksempel 2 ovenfor). Den påfølgende dagen ble dette mediet suget opp og cellene ble dyrket i medium uten tilsetning, eller i media som inneholdt en av de følgende komponentene: 2% FCS, 10% FCS, 20 ng/ml VEGF ("V" på figur 12), 5 nM Bv8, 25 nM Bv8, 20 ng/ml VEGF + 25 nM Bv8 ("V+Bv8" på figur 12) eller 25 nM EG-VEGF. Etter innkubering i 48 timer, ble cellene fjernet ved trypsinisering og fiksert i kald 70% etanol i flere timer. Cellene ble så farget ved romtemperatur i 2-4 timer med 5 u.g/ml propidiumjod i 20 ng/ml RN ase i PBS. Sub-Gl-profilen for cellene ble bestemt ved en FACS-analyse. Denne prosenten av cellepopulasjonen ble avsatt som prosent apoptotiske celler på den vertikale aksen for diagrammet på figur 12. Det fremgår av figur 12 at Bv8 bedret overlevelsen av BBC-epiteliske celler. Spesielt var færre apoptotiske celler synlige i kultur i nærværet av en hvilken som helst konsentrasjon av Bv8 enn i nærværet av 2% FCS eller 25 nM EG-VEGF. Bv8 og VEGF viste en synergistisk effekt hvor en kombinasjon av de to forbindelsene økte celleoverlevelsen i større grad enn den enkelte vekstfaktoren alene, eller i forhold til 10% FCS.

EKSEMPEL 4

In vivo induksjon av angiogenese

Evnen til Bv8 til å indusere en angiogen reaksjon ble målt. I et sett av eksperimenter bestemte man effekten av Bv8 på den intratestikulære vaskulære celledelingen i testiklene hos Beige nakne hannmus.

Det er tidligere beskrevet adenovirus som koder LacZ, VEGF og EG-VEGF (LeCouter, Nature, 412: 877-84, 2001). For produksjon av adenovirus som koder Bv8, så ble et cDNA som koder den humane Bv8 81-aminosyreisoformen klonet inn i CMV "shuttle"-vektoren (Stratagene), hvoretter fabrikantens veiledning ble fulgt for å fremstille rekombinant adenovirus vektor og rekombinante virus. Virus ble renset ved å bruke storskalasettet fra Virapur (Carlsbad, CA) og titrert.

For in vivo undersøkelser ble adenovirale vektorer (LacZ, VEGF, EG-VEGF og Bv8) injisert i testiklene hos beige nakne mus i en mengde på IO<7->IO<8>pfu(n = 5). Etter 7 dager ble dyrene avlivet og testiklene ble fiksert og bearbeidet for histologi.

Det fremgår av figur 13 at Bv8 på lignende måte som VEGF og EG-VEGF økte in vivo interstitial kapillærdannelse i testikkelceller hos nakne mus. Man kunne ikke

observere noen økning med hensyn til interstitial kapillærdannelse eller angiogenese hverken i PBS eller LacZ adenoviruskontrollgruppene. I en rekke av de behandlede dyrene kunne man også observere tubulær atrofi. Denne tubulære atrofien kan være et resultat av et økende interstitialt trykk som igjen er et resultat av den induserte angiogene reaksjonen.

Den foregående beskrivelsen anses å være tilstrekkelig til at en person med innsikt i fagfeltet kan praktisere oppfinnelsen. Forskjellige modifikasjoner ifølge oppfinnelsen i tillegg til de som er vist og beskrevet her, vil imidlertid lett kunne utføres ut fra den foregående beskrivelsen og faller som sådan innenfor beskrivelsens intensjon slik denne fremgår av de etterfølgende krav.

Claims

1. In vitro-fremgangsmåte for inhibering av deling av endotelceller, overlevelse av endotelceller, eller angiogenese, som omfatter å kontakte celler med en antagonist av et Bv8-polypeptid som har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller, eller indusere angiogenese, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der nevnte endotelceller er celler fra en steroidogen kjertel.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der anti-Bv8-antistoffet eller anti-Bv8-antistoffragmentet er monoklonalt, humanisert, humant, kimært eller bispesifikt.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der det antigenbindende anti-Bv8-antistoffragmentet omfatter et Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller Fv-fragment.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, som ytterligere omfatter å kontakte nevnte celler med en antagonist av VEGF.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, der VEGF-antagonisten omfatter et anti-VEGF-antistoff, antigenbindende anti-VEGF-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for VEGF.

7. Fremgangsmåte ifølge ett av kravene 1-6, der Bv8-polypeptidet er et naturlig sekvens Bv8-polypeptid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, der Bv8-polypeptidet er et naturlig humant Bv8-polypeptid.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, der Bv8-polypeptidet omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR.2, SEKV.ID. NR.4 eller SEKV.ID. NR.6.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, der Bv8-polypeptidet binder heparin.

11. Anvendelse av en antagonist av et Bv8-polypeptid som har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR:4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere celledeling for endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller eller indusere angiogenese, for fremstillingen av et medikament for behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling, for behandling av tumor eller cancer, eller regulering av fertilitet hos et pattedyr, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor medikamentet er til regulering av fertilitet hos et pattedyr.

13. Anvendelse ifølge krav 11, hvor medikamentet er for behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling hos et pattedyr.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor medikamentet er for behandling av tumor eller cancer hos et pattedyr.

15. Anvendelse ifølge krav 14, der canceren er hormonavhengig cancer.

16. Anvendelse ifølge krav 14, der canceren er cancer i et reproduktivt organ.

17. Anvendelse ifølge krav 16, der det reproduktive organet er ovarie, testikler, livmor eller cervix.

18. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 11 til 17, der pattedyret er menneske.

19. Anvendelse ifølge krav 11, der anti-Bv8-antistoffet eller anti-Bv8-antistoffragmentet er monoklonalt, humanisert, humant, kimært eller bispesifikt.

20. Anvendelse ifølge krav 11, der det antigenbindende anti-Bv8-antistoffragmentet omfatter et Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller Fv-fragment.

21. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 11 til 20, der medikamentet omfatter en antagonist av VEGF.

22. Anvendelse ifølge krav 21, der VEGF-antagonisten omfatter et anti-VEGF-antistoff, antigenbindende anti-VEGF-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for VEGF.

23. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 11 til 22, der Bv8-polypeptidet er et naturlig sekvens Bv8-polypeptid.

24. Anvendelse ifølge krav 23, der Bv8-polypeptidet er et naturlig humant Bv8-polypeptid.

25. Anvendelse ifølge krav 23, der Bv8-polypeptidet omfatter aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID. NR.2, SEKV.ID. NR.4 eller SEKV.ID. NR.6.

26. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 12 til 23, der Bv8-polypeptidet binder heparin.

27. Fremgangsmåte for identifisering av en antagonist av Bv8, som omfatter: a) å kontakte et kandidatmolekyl med et Bv8-polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som har minst 80 prosent identitet med SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, b) bestemme polypeptidets evne til å fremme endotelcelledeling, endotelcelleoverlevelse, eller angiogenese, og c) identifisere et kandidatmolekyl som inhiberer endotelcelledelingsaktiviteten, endotelcelleoverlevelsesaktiviteten, eller angiogeneseaktiviteten for polypeptidet som en antagonist for Bv8, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff eller et antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment.

28. Antagonist av et Bv8-polypeptid som har minst 80 prosent identitet med SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4, der nevnte polypeptid er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse av endotelceller eller indusere angiogenese, til anvendelse i behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling, for behandling av tumor eller cancer, eller regulering av fertilitet hos et pattedyr, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

29. Antagonist ifølge krav 28, som er til anvendelse i regulering av fertilitet hos et pattedyr.

30. Antagonist ifølge krav 28, som er til anvendelse i behandling av en sykdom eller tilstand som er assosiert med overskridende, uønsket eller ukontrollert angiogenese eller endotelcelledeling hos et pattedyr.

31. Antagonist ifølge krav 28, som er til anvendelse i behandling av tumor eller cancer hos et pattedyr.

32. Antagonist ifølge krav 31, der canceren er hormonavhengig cancer.

33. Antagonist ifølge krav 31, der canceren er cancer i et reproduktivt organ.

34. Antagonist ifølge krav 33, der det reproduktive organet er ovarie, testikler, livmor eller cervix.

35. Antagonist ifølge ethvert av kravene 28 til 34, der pattedyret er menneske.

36. Antagonist ifølge krav 28, der anti-Bv8-antistoffet eller anti-Bv8-antistoffragmentet er monoklonalt, humanisert, humant, kimært eller bispesifikt.

37. Antagonist ifølge krav 28, der det antigenbindende anti-Bv8-antistoffragmentet omfatter et Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller Fv-fragment.

38. Antagonist ifølge ethvert av kravene 28 til 37, som er til anvendelse med en antagonist av VEGF.

39. Antagonist ifølge krav 38, der VEGF-antagonisten omfatter et anti-VEGF-antistoff, antigenbindende anti-VEGF-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for VEGF.

40. Sammensetning som omfatter en antagonist av et Bv8-polypeptid i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærervehikkel, der sammensetningen er til anvendelse som definert i ethvert av kravene 28 til 34, og der Bv8-polypeptidet har minst 80 prosent identitet med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR.2 eller SEKV.ID. NR.4 og er i stand til å indusere deling av endotelceller, forbedre overlevelse for endotelceller eller indusere angiogenese, der antagonisten omfatter et anti-Bv8-antistoff, antigenbindende anti-Bv8-antistoffragment, eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for Bv8.

41. Sammensetning ifølge krav 40, der anti-Bv8-antistoffet eller anti-Bv8-antistoffragmentet er monoklonalt, humanisert, humant, kimært eller bispesifikt.

42. Sammensetning ifølge krav 40, der det antigenbindende anti-Bv8-antistoffragmentet omfatter et Fab-, Fab'-, F(ab')2- eller Fv-fragment.

43. Sammensetning ifølge ethvert av kravene 40 til 42, der sammensetningen omfatter en antagonist av VEGF.

44. Sammensetning ifølge krav 43, der VEGF-antagonisten omfatter et anti-VEGF-antistoff, antigenbindende anti-VEGF-antistoffragment eller antisensmolekyl rettet mot nukleinsyre som koder for VEGF.