JP4361791B2 - マイトジェン活性を有するBv8核酸及びポリペプチド - Google Patents
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Description
一般に本発明は***促進活性を持つタンパク質Bv8を使用する方法、組成物及びアッセイに関する。
内皮細胞
局所的微小環境は血管内皮細胞のフェノタイプ及び成長特性に組織又は器官特異的な形で大いに影響を及ぼすが、局所的指令シグナルの性質は大部分が未知である。血管内皮成長因子(VEGF)及び内皮細胞特異的成長因子のアンジオポエチンファミリーは様々な生理学的及び病理的環境における胚発達及び脈管形成に対して不可欠であるという有力な証拠がある(Ferrara及びAlitalo, Nature Medicine, 5:1359-1364 (1999);Carmeliet, Nature Medicine, 6:389-395 (2000))。内皮細胞フェノタイプ及び成長の局所的な組織特異的調節には強力な証拠がある(Aird等, J Cell Biol., 138:1117-1124 (1997); Stewart及びWiley, Dev. Biol., 84:183-192 (1981))。内皮細胞の形態学的及び機能的特性は器官が異なると広範囲に変わる(Simionescu及びSimionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988) pp.355-398)。更に、適用部位は、試験された血管形成因子のタイプよりも更に大なる度合いで新しい血管の性質を決定する(Dellian等, Am. J. Pathology, 149:59-71 (1996);Roberts等, Am. J. Pathology, 153:1239-1248 (1998))。脈管構造の性質に対する局所的微小環境のこの影響に対する分子的根拠は未知であるが、特化した間質が主要な役割を担っていると考えられている(上掲のDellian)。おそらくは、刺激の統合ネットワークは、細胞性及び細胞外マトリックス成分に加えて組織特異的分泌タンパク質を含みうるが、常在性内皮の構造と機能を決定しまた成長を調節するように機能する。
科学と医療の向上には進歩があるが、社会の内科的病気(medical ailments)の新しい治療法がなお必要とされている。新しい治療法を見出す一つのアプローチ法は如何に器官が働くかを研究することであった。特に、興味はシグナル伝達細胞が生物の行動を如何に制御するかにある。例えば、内分泌細胞はホルモンと呼ばれるシグナル伝達分子を分泌し、これらホルモンの分泌が機能障害に陥ると様々な疾患を生じうる。
ホルモンの分泌のために特化した細胞には、生殖腺、分泌性テストステロン(精巣のライディッヒ細胞)、エストロゲン(卵胞の卵胞膜内細胞)及びプロゲステロン(破裂した卵胞の黄体細胞)の細胞が含まれる。テストステロン、エストロゲン及びプロゲステロンの外因的投与を利用する様々な治療法が医療分野にはあるが、これらのホルモンを産生する細胞を調節する必要性が残っている。
ホルモン分泌細胞、特に内分泌腺中のステロイド産生内皮細胞に関連する多くの疾病及び疾患がある。従って、そのような内皮細胞に特異的に影響を及ぼす成長因子を同定することが望ましい。そのような内皮細胞特異的成長因子はそのような細胞型に関連する疾患を診断・治療し、そのような疾病の診断及び治療に有用な更なる候補薬剤を同定するための貴重なツールである。
Bv8はカエルのキバラスズガエル(Bombina variegata)の皮膚分泌物から元々は単離された小タンパク質である(Mollay等, Eur. J. Pharmacol. 374:189-196 (1999))。Bv8は腸管収縮の誘導が非常に強力なことが示されているコブラ科マンバ(black mamba)の毒由来の小タンパク質MIT-1と40%を越える同一性を示す(Schweitz等, FEBS Lett. 461:183-188 (1999))。Bv8の幾つかの哺乳動物ホモログはマウス及びヒトからクローニングされ、同一のアミノ末端配列を有していることが分かっている(Wechselberger等, FEBS Lett. 462:177-181 (1999))。MIT-1と同様に、ヒトBv8は、サブナノモル範囲のEC50をもって、胃腸平滑筋を強力に収縮させることが示されている(Li等 Mol. Pharm. 59:692-698 (2001) )。二つの型のBv8がヒトにおいて同定されており、長い型は選択的スプライスエキソンの存在を反映している。ヒトBv8の長い型は、米国特許出願第09/886242号に記載されているように、VRPAとおよそ78%相同性と58%の同一性を有する。
本発明はBv8の新規な活性の同定に基づいている。特に、Bv8は内皮細胞において増殖を誘導し、内皮細胞の生存を促進し、血管形成を促進することが見出された。ここに詳細に記載されるように、Bv8核酸及びポリペプチドは多くのアッセイにおいて及び内皮細胞に関連する症状の診断及び治療において使用することができる。
一側面では、本発明は細胞増殖を誘導する方法を提供する。一実施態様では、本方法は細胞の増殖を誘導するのに有効な量のBv8に細胞を接触させることを含む。該方法は細胞をVEGFに接触させることを更に含む。他の実施態様では、本発明は細胞の増殖を誘導するのに有効な量のBv8コード化核酸を細胞中に導入することを含む。この方法はVEGFコード化核酸を細胞中に導入することを更に含みうる。
一実施態様では、細胞は内皮細胞、より好ましくはステロイド産生内皮細胞、例えばステロイド産生腺の細胞である。
一実施態様では、Bv8は天然配列Bv8ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Bv8ポリペプチドは天然ヒトBv8ポリペプチドである。天然ヒトBv8ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Bv8は配列番号:6のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Bv8はヘパリン結合性である。
細胞は好ましくは内皮細胞、より好ましくはステロイド産生内皮細胞、例えばステロイド産生腺の細胞である。
一実施態様では、Bv8はヘパリン結合性である。他の実施態様では、Bv8は天然配列Bv8ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Bv8ポリペプチドは天然ヒトBv8ポリペプチドである。天然ヒトBv8ポリペプチドは配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:4のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Bv8は配列番号:6のアミノ酸配列を含む。
また更なる側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトのBv8に応答性の細胞における癌を治療する方法を提供する。該方法は好ましくはBv8アンタゴニストを、癌を治療するのに有効な量で投与することを含む。一実施態様では、癌はホルモン依存性癌である。他の実施態様では、癌は睾丸癌である。
他の側面では、本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトの生殖器官の癌を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法はBv8アンタゴニストを、癌を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。癌は好ましくは睾丸癌である。
更なる側面では、過剰の望ましくない又は調節できない血管形成を伴う症状について哺乳動物を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、好ましくは、Bv8又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、その疾病を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物は好ましくはヒトである。
また更なる側面では、本発明は哺乳動物において受精を調節する方法を提供する。一実施態様では哺乳動物はヒトである。該方法は好ましくはBv8アンタゴニストを、受精を調節するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。
他の側面では、本発明は哺乳動物におけるステロイドホルモン依存性疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、該方法はBv8又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、ステロイドホルモン依存性疾患を治療するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。好ましくは哺乳動物はヒトである。ステロイドホルモン依存性疾患は、好ましくは、リポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性的成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性的早熟、マッククーネ-アルブライト症候群、先天性副腎発育不全、及び低ゴナドトロピン性性機能低下症からなる群から選択される。
本発明の他の側面は、Bv8アンタゴニストを同定するための方法であって、候補化合物をBv8に接触させ、Bv8の生物活性に対する化合物の効果を決定し、Bv8生物活性が阻害されるアンタゴニストを同定することによる方法を提供する。一実施態様では、Bv8アンタゴニストは内皮細胞増殖を刺激するBv8の能力を阻害することによって同定される。他の実施態様では、Bv8アンタゴニストは内皮細胞の生存を促進するBv8の能力を阻害することによって同定される。
I.定義
特に他の定義をしない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するところと同じ意味を持つ。例えば、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989 )。本発明のために、次の用語を下記のように定義する。
ここで用いられる場合、「Bv8」及び「Bv8ポリペプチド」は、互いに交換可能に使用され、天然配列Bv8;Bv8変異体;及びキメラBv8を意味し、そそれぞれをここで定義する。場合によっては、Bv8は天然のグリコシル化を伴わない。「天然のグリコシル化」とは、哺乳動物細胞、特に天然に産生された細胞において産生されるときにBv8に共有結合的に結合している糖質部分を言う。したがって、非ヒト細胞において産生されたヒトBv8は、「天然のグリコシル化を伴わない」であろうBv8の例である。しばしば、Bv8は、例えば大腸菌のような原核生物において産生される場合のように、全くグリコシル化されていない場合がある。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、Bv8が「タグポリペプチド」に融合したキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはBv8の生物学的活性を阻害しないように充分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、該タグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8−50のアミノ酸残基(好ましくは約9−30の残基)を有する。好ましいものは、ニッケルに結合し、タグタンパク質を、例えば記載されているように(Lindsay等 Neuron 17:571-574 (1996))、Ni-NTAクロマトグラフィーで分離することを可能にするポリ-ヒスチジン配列である。
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の全重量基準で少なくとも約90重量%、好ましくは少なくとも約95重量%、より好ましくは少なくとも約90重量%、更により好ましくは少なくとも約95重量%のタンパク質を含む組成物(composition:構成物)を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、構成物の全重量に対して少なくとも約99重量%のタンパク質を含む組成物を意味する。
Bv8「アゴニスト」は、天然配列Bv8の生物学的活性の一又は複数を有する分子又は化合物である。これらには、限定されるものではないが、小有機分子、ペプチド、及びアゴニスト抗Bv8抗体が含まれうる。
ここでの目的において「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるBv8の生物学的及び/又は免疫学的活性を保持しているBv8の形態を意味し、ここで「生物学的」活性とは、天然又は自然に生じるBv8によって引き起こされる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は自然に生じるBv8が有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は自然に生じるBv8が有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を意味する。
「生物学的性質」は、これが「Bv8」あるいは「単離されたBv8」あるいはBv8の「アゴニスト」について用いられる場合、(天然か変性されたコンフォメーションかにかかわらず)天然配列Bv8によって直接又は間接に引き起こされ又はなされるエフェクターあるいは抗原機能又は活性を有することを意味する。エフェクター機能には、内皮細胞の増殖及び/又は血管形成の誘導の向上が含まれる。
ここでの「抗体」という用語は最も広義で使用され、ヒト、非ヒト(例えばマウス)及びヒト化モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を示す限りは抗体断片を特に包含する。
「抗体」(Abs)と「免疫グロブリン」(Igs)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンには、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの3つの高頻度可変領域が相互に作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的に、6つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つの高頻度可変領域のみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低いが、抗原を認識して結合する能力を有している。
任意の脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる二つの明確に異なる型の一方に分類される。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に又はドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFRsがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細について、Jones等, Nature 321, 522-525(1986);Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH-VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖上の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404097号;国際公開第93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の(モノクローナル又はポリクローナル)抗体との結合部位を指すために使用される。
「アゴニスト抗体」とは、Bv8アゴニストである抗体を意味し、よって天然配列Bv8の生物学的性質の一又は複数を有する。
「Bv8イムノアドヘシン」なる用語は、「Bv8免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、Bv8分子(天然又は変異体)の少なくとも一部を免疫グロブリン配列と組合わせるキメラ分子を意味する。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなければならないものではない。イムノアドヘシンはヒト抗体の多くの貴重な化学的及び生物学的性質を有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン(Fc)配列に結合した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、対象の結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。かかるイムノアドヘシンは患者には最小に免疫原性であり、慢性的な又は繰り返しの使用に対して安全である。
「ステロイド産生組織」はステロイド産生過程によってステロイドホルモンを生産する組織を意味する。その例には、副腎、生殖器官、腸及び気道組織の組織が含まれる。
「慢性」投与とは、急性態様とは異なり、初期の治療効果(活性)を長時間にわたって維持するようにする、連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断なく連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療である。
治療目的たる「哺乳動物」は、ヒト、他の高等霊長類、家庭及び酪農用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等々を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。ここで特に興味がある癌の例には、生殖器官の癌、例えば卵巣癌、睾丸癌、子宮癌、子宮頸癌;前立腺癌;副腎皮質(例えば副腎皮質癌腫)及び副腎髄質の癌を含む副腎の癌;甲状腺癌;副甲状腺癌;膵癌;及び子宮内膜癌が含まれる。
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時(一時)及び任意の順序での連続投与を含む。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物(Bv8ポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
「天然配列VEGF」には、天然に由来するVEGFと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。そのような天然配列VEGFは自然界から単離することができるか、又は組換え及び/又は合成法によって生産される。「天然配列VEGF」という用語には、特にVEGFの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様では、天然配列VEGFは、例えば、米国特許第5332671号及び第5240848号;PCT公報国際公開第98/10071号;Leung等, Science 246: 1306-1309(1989);及びKeck等, Science 246: 1309-1312(1989)に記載の、それぞれ121、145、165、189、206のアミノ酸残基からなる5つの既知のアイソフォームの一つである。
VEGFに関する配列同一性(アミノ酸又は核酸の何れか)は、特にBv8に関して記載されているのと同じ手法を用いて決定される。同様に、Bv8のアゴニスト及びアンタゴニストのための定義は、限定されるものではないが抗体を含み、VEGFアゴニスト及びアンタゴニストへ適用する。
1.Bv8変異体の同定
ここに記載した完全長天然配列Bv8ポリペプチドに加えて、Bv8変異体を同定し、調製し、本発明において使用することができると考えられる。Bv8変異体は、Bv8DNA中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のBv8ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者であれば、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化のように、アミノ酸変化がBv8の翻訳後過程を改変しうることを理解するであろう。Bv8変異体の生産方法は、好ましくは、以下に詳細に記載する天然配列Bv8についてのものと同じであり、唯一の違いは天然配列Bv8をコードしている核酸を、Bv8変異体をコードしている核酸に置き換えることである。
Bv8をコードする核酸分子が本発明の方法において使用される。ヒトBv8の二つの完全長変異体をコードしているcDNAsは図1及び2(配列番号:1及び2)に提供され、対応する推定アミノ酸配列は図2及び4(配列番号:2及び4)に提供されている。マウスBv8をコードしているcDNAは図5(配列番号:5)に提供され、対応する推定アミノ酸配列は図6(配列番号:6)に提供されている。本発明において使用されるポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーションスクリーニング及びPCR法のような、当業者によく知られている標準的な方法を用いて得ることができる。
Bv8cDNA全体をコードしている任意の種からの完全長の相同cDNA配列をクローニングするために、あるいは対立遺伝子変異体のような変異体型又はファミリーメンバーをクローニングするために、ここで開示されたcDNA配列の任意の部分に対応する断片から構築された標識DNAプローブを用いて、Bv8を発現すると思われる細胞又は組織型から誘導されたcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。より詳細には、コード化配列の5'又は3'末端の何れかに対応するオリゴヌクレオチドを用いて、より長いヌクレオチド配列を得ることができる。
Bv8コード化配列又は相同配列の単離は、ここに開示されるBv8コード化配列を元にして構築された二つの変性オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって実施することができる。反応の鋳型は、例えばBv8遺伝子の対立遺伝子を発現することが知られているか又は発現すると思われるヒト又は非ヒト細胞株又は組織から調製されたmRNAの逆転写(RT)によって得られるcDNAでありうる。
PCR産物は、増幅した配列がBv8コード化配列の配列を表すようにサブクローニングされ配列決定されうる。ついで、PCR産物は様々な方法により完全長cDNAクローンを単離するために使用することができる。例えば、増幅断片は標識され、バクテリオファージcDNAライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。あるいは、標識された断片はゲノムライブラリーのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために使用することができる。
Bv8遺伝子の対立遺伝子変異体又は突然変異体のcDNAクローンを、例えばPCRを用いて単離することができる。この場合、第一cDNA鎖は変異体Bv8対立遺伝子を有していると推定される個体中でBv8を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離されたmRNAにオリゴ-dTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新しい鎖を伸長させることによって合成されうる。ついで、cDNAの第二鎖は正常遺伝子の5'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成される。ついで、これらの二つのプライマーを使用して、産物をPCRを介して増幅させ、適切なベクターにクローニングし、当業者によく知られている方法によってDNA配列分析を行う。突然変異Bv8対立遺伝子のDNA配列を正常なBv8対立遺伝子のものと比較することによって、突然変異Bv8遺伝子産物の機能の喪失又は改変を生じる突然変異(群)を確実にすることができる。
また、変異体Bv8対立遺伝子を有するものと思われるか有することが知られている個体において変異体Bv8対立遺伝子を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離されたRNAから例えば合成されたcDNAを使用して発現ライブラリーを構築することができる。このようにして、推定される変異体組織によって産生された遺伝子産物を発現させ、以下に記載するような、通常のBv8遺伝子産物に対する抗体と組み合わせて、標準的な抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングすることができる。
本発明の方法はポリヌクレオチドの供給源によって制限されることは意図されていない。ポリヌクレオチドはヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり、任意の組換え体供給源から誘導され、インビトロで又は化学合成によって合成され得る。ヌクレオチドはDNA又はRNAであり得、二本鎖、単鎖又は部分的に二本鎖の形態で存在しうる。
本発明において有用な核酸には、限定することなく例示すると、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスDNAs及び/又はRNAs;リボザイム;遺伝子療法のためのDNA;DNA及び/又はRNAキメラ;単鎖DNA、二本鎖DNA、高次コイルDNA及び/又は三重らせん体DNA;Z-DNA等々が含まれる。核酸は多量に核酸を調製するために典型的に使用される任意の常套的手段によって調製することができる。例えば、DNAs及びRNAsは当該分野でよく知られた方法によって市販試薬及びシンセサイザーを使用して化学的に合成することができる(例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandを参照)。RNAsはSP65のようなプラスミド(Promega Corporation, Madison, WI)を使用してインビトロ転写を介して高収量で産生させることができる。
ヌクレアーゼ安定性の増加が望まれている場合のような、ある状況では、改変されたヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましい。改変されたヌクレオシド間結合を含む核酸はまた当該分野においてよく知られた試薬と方法を使用して合成することができる。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン-スルフィド(-CH2-S-CH2)、ジメチレン-スルホキシド(-CH2-SO-CH2)、ジメチレン-スルホン(-CH2-SO2-CH2)、2'-O-アルキル、及び2'-デオキシ-2'-フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法は当該分野でよく知られている(Uhlmann等, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider等, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335及びそこで引用された文献)。
核酸は当該分野においてよく知られているように任意の適切な手段によって精製することができる。例えば、核酸は逆相又はイオン交換HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によって精製することができる。勿論、当業者であれば、精製方法は精製すべきDNAのサイズに部分的に依存することは認識しているであろう。
更に、米国特許第5605793号及び第5837458号に記載されている、遺伝子シャフリング及び/又は繰り返し配列組換えのような、ある形態の定方向進化によって、少なくとも部分的に産生されたBv8ポリヌクレオチド変異体を本発明の方法において使用することができる。例えば、そのような技術を使用して、改変された機能及び/又は構造的特徴を有する機能的に及び/又は構造的に類似のタンパク質をコードしている新規配列の生成のための出発点としてBv8コード化配列、又は複数のBv8コード化配列を使用することができる。
本発明の方法はまた(a)前記のBv8コード化配列及び/又はその相補鎖(すなわち、アンチセンス)の何れかを含むDNAベクター;(b)コード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Bv8コード化配列の何れかを含むDNA発現ベクター;(c)宿主細胞中におけるコード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Bv8コード化配列の何れかを含む遺伝子操作した宿主細胞;及び(d)外因的に導入された調節エレメント(すなわち、遺伝子活性化)の制御下で内因性Bv8遺伝子を発現する遺伝子操作された宿主細胞を使用することによって恩恵を受ける。
Bv8断片は多くの従来の方法の任意のものによって調製することができる。所望のペプチド断片を化学的に合成してもよい。他のアプローチ法は、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定まる部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理するか、適当な制限酵素でDNAを消化させることによりBv8断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをPCRにおける5'及び3'プライマーに使用する。好ましくは、Bv8ポリペプチド断片は、天然Bv8ポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発(Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987))、カセット突然変異誘発(Wells等, Gene, 34: 315 (1985))、制限的選択突然変異誘発(Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986))又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してBv8変異体DNAを作製することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることもできる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である(Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989))。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の双方に見出されることが多い(Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976))。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリックな(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
Bv8及びBv8変異体の生産に適した技術は当該分野においてよく知られている。好適な技術はBv8とBv8変異体に対して同一であるので、以下に記載する技術はBv8変異体並びに天然配列Bv8に適用される。
好適な生産方法には、ポリペプチドの内因性源からのBv8の単離、(ペプチドシンセサイザーを用いた)ペプチド合成及び組換え技術(又はこれらの技術の任意の組み合わせ)が含まれる。
以下の検討の殆どは、Bv8核酸を含むベクターで形質転換された細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによりBv8を組換え生産することに関する。しかし、当業者であれば、Bv8の製造には多くの方法があることは分かっているであろう。
Bv8をコードしているDNAは、Bv8mRNAを有し、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製したcDNAライブラリーから得ることができる。従って、Bv8のDNAは、例えば複数のヒト組織から調製されたcDNAライブラリーから簡便に得ることができる。Bv8をコードしている遺伝子はゲノムライブラリーあるいはオリゴヌクレオチド合成法によってもまた得ることができる。
Bv8のcDNAを単離する好ましい方法は、注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用して様々なヒト組織由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることである。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最小限に抑えられるように十分な長さを持ちかつ十分に明瞭でなければならない。好ましい配列はここに開示された天然に生じるBv8から得ることができる。
Bv8をコードしている核酸(例えばcDNA又はゲノムDNA)は更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能ベクター中に挿入される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる:シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
このような前駆体領域のDNAは、成熟型Bv8又はその可溶型変異体をコードするDNAに読み枠を一致させて結合される。
またDNAは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムDNAに見られる配列と相補的なDNA配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同組換え及びBv8 DNAの挿入をもたらす。しかし、Bv8をコードするゲノムDNAの回収は、Bv8 DNAを切除するのに制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
選択技術の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与し、選択工程で生存するタンパク質を産生する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
あるいは、Bv8をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照。
更に、1.6μmの円形プラスミドpKD1由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。Bianchi等, Curr. Genet., 12:185(1987)。より最近では、組換え子ウシキモシンの大量生産のための発現系がK.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer等, Bio/Technology,9:968-975(1991)。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Xが任意のヌクレオチドであるCXCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターである、他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP73657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はDNA断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC31446)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び/又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
組換え脊椎動物細胞培養でのBv8の合成に適合化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP117060; 及びEP117058に記載されている。Bv8の哺乳動物細胞での培養発現のための特に有用なプラスミドはpRK5(EP307247)又はpSVI6Bである。1991年6月13日に公開の国際公開91/08291。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られている。例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、DNAが複製可能であるように生物体中にDNAを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等のセクション1.82に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に使用される。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に公開された国際公開91/00358に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。
Bv8ポリペプチドを産生するために使用される原核細胞は上掲のSambrook等に一般的に記載されているようにして、好適な培地中で培養される。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、ここに記載されたようにして調製することができる。
Bv8がヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、Bv8はヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Bv8に関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからBv8を精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Bv8を、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;免疫親和性;エピトープタグ結合樹脂;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;及びIgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラムである。
Bv8及びBv8変異体の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、Bv8ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、Bv8のN末端又はC末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることである。二官能性試薬による誘導体形成は、例えば、抗Bv8抗体を精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのBv8の架橋に有用であり、またその逆も同様である。通常使用される架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンのような二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートのような試薬が含まれる。
本発明の範囲内に含まれるBv8ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、(化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化部位の除去又はグリコシル化の欠失の何れかによって)天然配列Bv8に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び/又は天然配列Bv8に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。また、その語句には、性質の変化及び存在する様々な糖鎖部分の割合を含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化が含まれる。
Bv8ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は1987年9月11日公開の国際特許出願第WO87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
Bv8の共有結合的修飾の他の型は、米国特許第4640835号;第4496689号;第4301144号;第4670417号;第4791192号又は第4179337号に記載されているように、Bv8ポリペプチドを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含んでいる。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのBv8の融合体を含む。エピトープタグは一般にBv8のアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Bv8のこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Bv8を抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。様々なタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ポリヒスチジン(poly-his)又はポリヒスチジングリシン(poly-his-gly)タグ;fluHAタグポリペプチドとその抗体12CA5(Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988));c-mycタグとそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体(Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985));及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクD(gD)タグとその抗体(Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553(1990))が含まれる。他のタグポリペプチドには、Flagペプチド(Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210(1988));KT3エピトープペプチド(Martin等, Science, 255:192-194(1992));αチューブリンエピトープペプチド(Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991));及びT7遺伝子10タンパクペプチドタグ(Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、「アドヘシン」タンパク質の結合ドメインを免疫グロブリン重鎖のヒンジ及びFc領域と組み合わせるものである。通常は、本発明における使用のためにBv8-免疫グロブリンキメラを調製する場合、Bv8をコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のN末端をコードする核酸にC末端的に融合させるが、N末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。
ある実施態様では、Bv8-免疫グロブリンキメラは単量体として、又はヘテロ多量体もしくはホモ多量体として、特に国際公開第91/08298号に本質的に例証されているように二量体又は四量体として構築される。
好適な実施態様では、Bv8配列は、例えば免疫グロブリンG1(IgG1)のような免疫グロブリンのエフェクター機能を含む抗体のC末端部分(特にFcドメイン)のN末端に融合される。Bv8配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、(IgGのFcを化学的に定める;重鎖定常領域の最初の残基を114として残基216、又は他の免疫グロブリンの類似部位)パパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列が融合において使用される。特に好適な実施態様では、Bv8アミノ酸配列はIgG1、IgG2又はIgG3重鎖のヒンジ領域及びCH2及びCH3又はCH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではなく、最適な部位は日常的な実験により決定することができる。
あるいは、Bv8配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、Bv8配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3’末端に、ヒンジとCH2ドメインの間、又はCH2とCH3ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
イムノアドヘシンの構築と発現に適した一般的な方法はBv8に関して上に開示したものと同じである。Bv8イムノアドヘシンは、最も簡便には、Bv8部分をコードするcDNA配列をIg cDNA配列にインフレームとなるように融合させることによって構築される。しかしながら、ゲノムIg断片との融合体もまた使用することができる(例えばGascoigne等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic等, Cell, 66:1133-1144 (1991)を参照)。後者のタイプの融合には発現のためのIg調節配列が存在する必要がある。IgG重鎖定常領域をコードしているcDNAsは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、脾臓又は末梢血リンパ球由来のcDNAライブラリーからの刊行された配列に基づいて単離することができる。イムノアドヘシンのIg部分及びBv8をコードしているcDNAsを、選択された宿主細胞中での効率的な発現を指令するプラスミドベクター中にタンデムで挿入する。哺乳動物細胞での発現には、pRK5ベースのベクター(Schall等, Cell, 61:361-370 (1990))及びCDM8ベースのベクター(Seed, Nature, 329:840 (1989))を使用することができる。正確な接合部はオリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異誘発を使用して設計された接合コドン間の余分な配列を除去することによってつくることができる(Zoller等, Nucleic Acids Res., 10:6487 (1982); Capon等, Nature, 337:525-531 (1989))。それぞれ半分が所望の接合部の各側の配列に相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができ;これらは理想的には36から48量体である。あるいは、PCR法を使用して、適切なベクターにインフレームになるように分子の二つの部分を接合することができる。
望まれるならば、イムノアドヘシンは二重特異的になされ得る。よって、本発明のイムノアドヘシンはBv8ドメイン及び他の成長因子由来のドメインのようなドメインを組合せうる。二重特異的分子では、その抗体様構造の一方のアームがキメラ抗体重鎖で他方のアームがキメラ抗体重鎖-軽鎖対からなる三量体分子が、精製が簡単であるので有利である。10の四量体の混合物をつくり出す、二重特異的イムノアドヘシンの産生に伝統的に使用されている抗体産生クアドローマと異なり、三量体イムノアドヘシン構造の3つの鎖をコードしている核酸を形質移入した細胞は、3つの分子のみの混合物を生産し、よってこの混合物からの所望される産物の精製は簡単である。
本発明はまたBv8の一又は複数の生物学的活性を模倣又は亢進し(アゴニスト)あるいはBv8の効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するために化合物をスクリーニングする方法をも包含する。Bv8アゴニスト及びアンタゴニストはまたBv8モジュレーターと呼ばれる。アンタゴニスト薬物候補のスクリーニングアッセイはBv8ポリペプチドに結合し又はそれと複合体を形成し、あるいは他の細胞性タンパク質とのBv8の相互作用に干渉等する化合物を同定するように設計される。
小分子は、Bv8アゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる能力を持ち得、よって治療的に有用でありうる。かかる小分子には、天然に生じる小分子、合成の有機又は無機化合物及びペプチドが含まれうる。しかし、本発明の小分子はこれらの形態に限定されるものではない。小分子の広範なライブラリーが商業的に利用でき、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングするための様々なアッセイ法が当該分野でよく知られている。
候補Bv8アゴニスト又はアンタゴニスト小分子は、好ましくは、Bv8活性の潜在的なモジュレーターの迅速な同定を可能にするアッセイで最初に同定される。そのようなアッセイの例は、Bv8レセプターに候補分子が結合する能力が測定されるタンパク質-タンパク質結合アッセイである。他の例では、Bv8レセプターへのBv8の結合を妨害する候補分子の能力が測定される。
他の実施態様では、小分子Bv8アンタゴニストはBv8の生物学的活性の一又は複数を阻害するその能力によって同定される。よって、候補化合物はBv8と接触させられる。ついでBv8の生物学的活性が評価される。一実施態様では、例えば実施例2に記載されているように、内皮細胞の増殖を刺激するBv8の能力が決定される。他の実施態様では、例えば実施例3に記載されているように、内皮細胞の生存を促進するBv8の能力が決定される。化合物は、Bv8の生物学的活性が阻害されるアンタゴニストとして同定される。
Bv8アゴニスト又はアンタゴニストとして同定される化合物は本発明の方法において使用することができる。例えばBv8アンタゴニストは癌を治療するために使用できる。
Bv8の生物学的性質を模倣するアゴニストヒト及び非ヒトポリクローナル及びモノクローナル抗体(非ヒトモノクローナル抗体のヒト化型を含む)もまた本発明において考慮される。これらにはアミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体及び抗体断片が含まれる。そのような抗体の生産とアゴニスト抗体の選択のための一般的な技術は当該分野において知られており、以下に簡単に説明する。
(i)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野で知られている。例えば、ポリクローナル抗体は、免疫剤の一又は複数回、そして所望するならばアジュバントの注入によって哺乳動物で産生することができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントが複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫剤を免疫化した哺乳動物にとって免疫原性であることが知られているタンパク質、例えば血清アルブミン、又は大豆トリプシンインヒビターと結合させることが有益であり得る。用いられ得るアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びMPL-TDMが含まれる。
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
所望の特異性、親和性、及び/又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、該細胞を限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、DMEM又はRPMI-1640培地を包含する。また、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
抗体の組換え生産は以下に更に詳細に説明する。
一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的にはWinterと共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))の方法に従って、齧歯類CDRs又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(Cabilly, 上掲)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のCDR残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は,例えば,Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993);Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり面倒であり、産物の収率は低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開93/08829、及びTraunecker等, EMBO 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4676980号)及びHIV感染の治療のために(PCT出願国際公開91/00360;国際公開92/200373;EP03089)提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を用いて作製することができる。適した架橋剤は当該分野でよく知られており、米国特許第4676980号に、多くの架橋方法と共に開示されている。
ある実施態様では、Bv8アゴニスト抗体(マウス、ヒト及びヒト化抗体、及び抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導される(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他の実施態様では、F(ab')2分子の組立を促進するロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2が形成される。他のアプローチ法では、Fv、Fab又はF(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。
(viii)アゴニスト抗体の同定
Bv8アゴニスト抗体はその生物学的活性に基づいて同定される。一実施態様では、Bv8アゴニスト抗体は、実施例2に記載されているように、内皮細胞の増殖を誘導するその能力によって同定される。他の実施態様では、Bv8アゴニスト抗体は実施例4に記載されているように、血管形成を誘導するその能力によって同定される。
タンパク質-タンパク質相互作用を検出するのに適した任意の方法を、Bv8と相互作用する、限定するものではないが膜貫通又は細胞内タンパク質を含む、タンパク質又は他の分子を同定するために使用することができる。使用することができる伝統的な方法としては、Bv8と相互作用するタンパク質を同定するための免疫共沈降、架橋及び勾配又はクロマトグラフィーカラムでの同時精製である。このようなアッセイにおいては、Bv8成分は完全長タンパク質、その可溶型誘導体、対象のドメインに対応するペプチド、又はBv8のある領域を含む融合タンパク質でありうる。
Bv8と相互作用可能なタンパク質をコードする遺伝子の同時の同定を可能にする方法を用いることができる。これらの方法には、例えば、標識Bv8又はその変異体を使用して、8gt11ライブラリーの抗体探索のよく知られた方法と同様な形で、発現ライブラリーを探索することが含まれる。
簡単に述べると、このような系を使用して、一方のプラスミドが、Bv8、又はそれ由来のポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列に融合した転写活性化因子タンパク質のDNA結合ドメインをコードしているヌクレオチドからなり、他方のプラスミドが、cDNAライブラリーの一部としてこのプラスミド中に組み込まれた未知のタンパク質をコードしているcDNAに融合した転写活性化因子タンパク質のドメインをコードしているヌクレオチドからなる2ハイブリッドタンパク質をコードしているプラスミドが構築される。DNA結合ドメイン融合プラスミドとcDNAライブラリーは、その調節領域が転写活性化因子の結合部位を含むレポーター遺伝子(例えばHBS又はlacZ)を含む酵母サッカロミセス・セレビシェの株に形質転換される。何れかのハイブリッドタンパク質だけではレポーター遺伝子の転写を活性化できない:DNA結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないので、活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、活性化因子の結合部位に局在化できないので、活性化できない。2ハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的活性化因子タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現を生じ、該レポーター遺伝子はレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される。
次のアッセイは、Bv8と相互作用する(例えば結合する)化合物、その結合対、同族体又はレセプターとのBv8の相互作用を妨害する化合物、及びBv8遺伝子の発現の活性を調節する(つまりBv8遺伝子の発現レベルを調節する)か又は体中のBv8のレベルを調節する化合物を同定するように設計されている。Bv8遺伝子調節配列(例えばプロモーター配列)に結合し、従ってBv8遺伝子の発現を調節しうる化合物を同定するアッセイもまた利用できる。例えばPlatt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562を参照のこと。
本発明によってスクリーニングすることができる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、抗体とその断片、及びBv8又はBv8レセプターに結合し天然リガンド(つまりアゴニスト)によって惹起された活性を模倣するか又は天然リガンド(つまりアンタゴニスト)によって惹起された活性を阻害する他の有機化合物(例えばペプチドミメティックス)が含まれる。
本発明によってスクリーニングできる他の化合物には、限定されるものではないが、適切な細胞(例えば内皮細胞)中に進入し得、Bv8遺伝子又はBv8媒介経路に関与するある種の他の遺伝子に(例えば遺伝子発現に関与する転写因子又は調節領域との相互作用によって)影響を及ぼす小有機分子;又はBv8の活性又はBv8シグナル伝達、異化、又は代謝経路に関与するある種の他の細胞内因子の活性に影響を及ぼし又はそれに代わる化合物が含まれる。
次に、活性な部位の3次元幾何構造が決定される。これは、完全な分子構造を決定することができる、X線結晶構造解析を含む既知の方法によってなすことができる。他方、固相又は液相NMRを用いて、ある分子内距離を決定することができる。構造決定の任意の他の実験的方法を使用して、部分的な又は完全な幾何構造を得ることができる。幾何構造は、天然又は人工の複合体化リガンドを用いて測定することができ、これは決定される活性部位構造の精度を増大しうる。
最後に、実験的であれ、モデリングによってであれ、又は組合せによってであれ、活性な部位(又は結合部位)の構造を決定すると、その分子構造に関する情報に沿って化合物を含むデータベースを検索することによって候補の調節化合物を同定することができる。そのような検索は、決定された活性な部位の構造に一致し、活性な部位を定める基と相互作用する構造を持つ化合物を探す。そのような検索はマニュアルであってもよいが、好ましくはコンピュータ支援のものである。この検索から見出されたこれらの化合物はBv8活性の潜在的なモジュレーターである。
Bv8の活性部位(又は結合部位)の同定に基づいて調節化合物、及び関連した伝達及び転写因子を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピュータモデリング法は当業者には明らかであろう。
分子モデリング系の例はCHARMm及びQUANTAプログラム(Polygen Corporation, Waltham, MA)である。CHARMmはエネルギー最小化及び分子力学関数を実行する。QUANTAは分子構造の構築、グラフモデリング及び解析を実行する。QUANTAは相互作用構造、修飾、可視化及び分子の互いの挙動の解析を可能にする。
ここに記載されるもののようなアッセイによって同定される化合物は、例えばBv8遺伝子産物の生物学的機能を解明するのに有用であろう。そのような化合物は様々な生理学的疾患の何れかを治療するために治療的に有効な用量で患者に投与することができる。治療的に有効な用量とは、何れかの生物学的徴候のあらゆる改善、障害、防止又は改変を生じるのに十分な化合物の量を意味する。
Bv8と相互作用し(例えば結合し)又はBv8を模倣することができ、あるいは同族体レセプター、結合対又は基質へのBv8の結合を妨害することができる化合物を同定するシステムが設計できる。同定される化合物は、例えば野生型及び/又は変異体Bv8遺伝子産物の活性を調節するのに有用であり得;Bv8の生物学的機能を詳しく調べるのに有用であり得;正常なBv8の相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングに使用し得、あるいはそのような相互作用をそれ自身が破壊し又は活性化させうる。
Bv8又はBv8同族体レセプター又は基質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、Bv8と試験化合物の反応混合物を、二つの化合物が相互作用し結合し、よって除去され及び/又は反応混合物において検出され得る複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。使用されるBv8種はスクリーニングアッセイの目標に応じて変わりうる。例えば、天然レセプターのアゴニストが所望される場合は、完全長Bv8、又は可溶型切断Bv8、ペプチド、又はアッセイ系において利点を生じるタンパク質又はポリペプチド(例えば標識、得られた複合体の単離等々)に融合した一又は複数のBv8ドメインを含む融合タンパク質を用いることができる。Bv8と直接相互作用する化合物が探索されている場合は、Bv8に対応するペプチド及びBv8を含む融合タンパク質を用いることができる。
実際には、マイクロタイタープレートを固相として簡便に利用することができる。固着成分は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にタンパク質の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化されるタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体は固体表面にタンパク質を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
あるいは、反応を液相中で実施することができ、反応産物は未反応成分から分離され、複合体が、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固着させるためにBv8タンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を、固着した複合体を検出するために可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、検出される。
Bv8と相互作用する巨大分子は、この検討の目的では「結合対」と称する。これらの結合対はBv8媒介生物学的経路に関与している可能性が高い。従って、体内におけるBv8活性を調節し又は増大させ、及び/又はこの活性(又はその欠乏)に関連する疾患を制御するのに有用でありうるそのような結合対の相互作用に干渉し又はこれを破壊する化合物を同定することが望ましい。
Bv8と結合対又は結合対類間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ系の基本的原理は、Bv8又はそのある種の変異体と、その結合対の反応混合物を、二つが相互作用し結合し、よって複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。試験化合物は反応混合物中に最初から含められるか、又はBv8とその結合対の添加に続いて添加されうる。コントロール反応混合物は試験化合物を含めないで又はプラシーボと共にインキュベートされる。ついでBv8と結合対の間のあらゆる複合体の形成を検出する。試験化合物を含む反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、化合物がBv8と相互作用結合対の相互作用を妨害することを示している。また、試験化合物と通常のBv8タンパク質を含む反応混合物内における複合体の形成は、また試験化合物と変異体Bv8を含む反応混合物内の複合体形成と比較されうる。この比較は、通常のタンパク質ではなく変異体、又は変異されたBv8の相互作用を特異的に破壊する化合物を同定することが望まれる場合に重要でありうる。
不均一アッセイ系では、Bv8又は相互作用性結合対の何れかが固体表面に固着される一方、非固着種が直接的にか間接的に標識される。実際には、マイクロタイタープレートを簡便に利用することができる。固着種は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にBv8又は結合対の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化される種に特異的な固定化抗体を、固体表面に種を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
アッセイを実施するために、固定化種の対を、試験化合物を被覆した又は被覆していない表面に暴露する。反応が完了した後、未反応の成分を(例えば洗浄により)除去し、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたまま残る。固体表面に固着した複合体の検出は多くの方法で達成することができる。非固定化種が事前に標識されている場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が事前に標識されていない場合は、間接的な標識を用いて、例えば最初の非固定化種に特異的な標識抗体(該抗体はついで直接的に標識され又は間接的に標識抗Ig抗体で標識されうる)を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害し又は前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
本発明の他の実施態様では、均一アッセイを用いることができる。このアプローチ法では、Bv8と相互作用結合対の前もって形成された複合体で、Bv8又はその結合対の何れかが標識されているが、標識によって生じるシグナルが複合体の形成のためにクエンチされるものが調製される(例えばイムノアッセイにこの方法を利用しているRubensteinの米国特許第4109496号を参照のこと)。前もって形成された複合体と競合し、それから種の一つを置換する試験物質の付加により、バックグラウンドを超えるシグナルが生成される。このようにして、相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
あるいは、GST融合タンパク質と相互作用性結合対は固体グルタチオン-アガロースビーズの不存在下で液体中で互いに混合することができる。試験化合物は種が相互作用させられる間又はその後に加えることができる。ついで、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに加えることができ、未結合物質を洗い流す。再び、Bv8と結合対間の相互作用の阻害度は、標識抗体を加え、ビーズに付随する放射能を測定することによって検出することができる。
例えば、限定するものではないが、Bv8は、GST融合タンパク質を作製し、それをグルタチオンアガロースビーズに結合させることにより、上述のような固形物質に固着させることができる。相互作用性結合対は35Sのような放射性同位元素で標識し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で開裂させることができる。ついで、開裂産物を固着融合タンパク質に加え、結合させることができる。未結合ペプチドを洗って除去した後、細胞内結合対結合ドメインを表す標識された結合物質を、よく知られた方法によって溶離させ、精製し、そのアミノ酸配列を分析することができる。このようにして同定されたペプチドは、合成的に製造し又は組換えDNA法を使用して適切な有益な(facilitative)タンパク質に融合させることができる。
ここに記載したBv8ポリペプチド及びそのモジュレーターは治療剤として用いることができる。本発明のBv8ポリペプチド及びBv8モジュレーターは、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って処方することができ、ここでのBv8産物は製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合されて組み合わされる。Bv8の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ、好ましくは本質的に純粋なBv8を、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、任意成分の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製される(上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences)。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で暴露される細胞又は哺乳動物に非毒性である。例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又はトゥイーン(TWEEN)、プルロニクス(Pluronics)、又はPEG等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
Bv8は場合によっては他の成長因子と組み合わされ、又はそれと併せて投与される。例えばEG-ECGF又はVEGFと組み合わされうる。
Bv8は癌治療の他の一般的な治療法と共に使用してもよい。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変わりうる。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
Bv8は治療用に使用するために徐放性調製物中に導入してもよい。徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されたようなヒドロゲル(例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第3773919号、EP58481)、L-グルタミン酸とエチル-γ-L-グルタメートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983))、非分解性エチレン酢酸ビニル(上掲のLanger等)又は分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP133988)が含まれる。
また、持続放出Bv8組成物はリポソーム的に封入されたBv8を含む。Bv8を含有するリポソームは、それ自体周知である方法(Epstein等, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang等, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030;独国特許出願公開第3218121号;欧州特許出願公開第52322号;同第36676号;同第88046号;同第143949号;同第142641号;日本国特許出願第83−118008号;米国特許第4485045号及び同第4544545号;及び欧州特許出願公開第102324号)によって調製される。通常、リポソームは、脂質含有量が約30モル%以上コレステロールであり、選択される割合が最適なBv8治療法に対して調節された微小(約200-800オングストローム)な単ラメラ状のものである。
ゲル製剤を得るためには、液体組成物に製剤したBv8を、有効量の水溶性多糖類又はPEGなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース;デンプン及び分留デンプン;寒天;アルギン酸及びアルギン酸塩;アラビアゴム;プルラン;アガロース;カラゲナン;デキストラン;デキストリン;フルクタン;イヌリン;マンナン;キシラン;アラビナン;キトサン;グリコーゲン;グルカン;及び合成バイオポリマー;並びにガム、例えばキサンタンガム;グアーガム;イナゴマメガム;アラビアゴム;トラガカントガム;及びカラヤガム;及びそれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が簡単で、なおかつ流動性がありすぎず粘性すぎず、そこに保持されるBv8を不安定にさせないものである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低分子量及び高分子量のPEGsの混合物である。例えば、分子量400−600のPEGと分子量1500のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
多糖類及びPEGsに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物を含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解度はエーテル基の置換度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当りに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当りに少なくとも0.35のエーテル基というエーテル置換度が一般に十分である。また、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばLi、Na、K、又はCs塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約2−5%、より好ましくは約3%を含み、Bv8はゲル1ml当たりに約300−1000mgの量で存在する。
Bv8又はBv8アゴニスト又はアンタゴニストを含む製薬的組成物は好ましくは適切な容器中に配される。容器には好ましくは製薬組成物の適切な使用法と用量を詳細に記載した指示書が添付される。当業者には、これらの指示書は治療方法に応じて変わることが分かるであろう。
ここで提供される治療剤は多くの治療に使用することができる。その治療は、ホルモン産生組織又は内分泌腺に関連する症状及び/又は過剰な望まれない又は調節されない血管形成を伴う症状を持つ哺乳動物、好ましくはヒトを治療することを含む。一側面では、Bv8又はBv8アゴニストは症状を治療するのに有効な量が、それを必要とする哺乳動物に投与される。Bv8は、ポリペプチド又は核酸の形態で投与することができる。好ましくは、Bv8又はBv8アゴニストは、症状が特定のホルモンを産生する細胞の生存又は数の増加を必要とするものである場合に使用される。そのような症状の例には糖尿病が含まれる。他の症状には、精巣の細胞のような生殖器官の細胞の数を増加させ、又は細胞の生存を亢進することが望まれるものが含まれる。他の症状には、新しい血管の形成を減じることが望まれるものが含まれる。そのような症状の例には、腫瘍、例えば睾丸癌が含まれる。
Bv8は他の化合物又は組成物と共に投与してもよい。一実施態様では、その化合物はVEGF又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。場合によっては、化合物はVEGFのようなポリペプチドをコードする核酸であってもよい。
好ましくは、Bv8又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、ホルモン産生組織又は内分泌腺に関連した症状、好ましくは特定のホルモンを生産する細胞の数の減少を、細胞増殖の減少又は血管形成の減少を必要とする症状を持つ個体に投与される。例えば、受精率を調節するのに有効な量でBv8アンタゴニストを個体に投与することを含む、個体における受精率を調節する方法がここで提供される。Bv8アンタゴニストは嚢胞及びホルモン産生組織における過剰増殖に関連する他の症状を治療するために投与することもできる。
ステロイドホルモン依存性疾患もまた本発明の組成物及び方法を使用して対処できる。そのような疾患には、リポイド先天性副腎皮質過形成、不妊症、性的成熟、アンドロゲン依存性腫瘍、性的早熟、マッククーネ-アルブライト症候群、先天性副腎発育不全、又は低ゴナドトロピン性性機能低下症が含まれる。
更なる実施態様では、Bv8アンタゴニストは、例えば癌の治療において、一又は複数の化学療法剤と組み合わせて患者に投与される。治療効果が増大するように、化学療法剤での治療の前、治療の間、又は治療の後にBv8を投与することができる。好適な化学療法剤には、限定されるものではないが、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、3'-アジド-3'-デオキシチミジン、タキサン類(例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France))及び/又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製物及び投与計画を決定する際には製造者の指示書に従ってもよいし、又は熟練した医療専門家が経験的に決定してもよい。そのような化学療法のための調製物と投与計画はまたChemotherapy Service編, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
細胞増殖を増加させ細胞増殖を阻害する方法はインビボ又はインビトロで実施することができると理解される。ある場合には、インビトロで細胞試料にBv8を加え、特定の細胞タイプの増殖を刺激することが望ましいであろう。ついで、Bv8処置試料をスクリーニングアッセイで使用し、又は治療を必要とする個体又は動物モデル中に移植することができる。
別の一般的な計画として、Bv8は、効果的であるが過度に毒性ではないBv8レベルを組織に形成することができる用量で標的部位又は組織に処方され送達される。この組織内濃度は、可能ならば連続注入、持続放出、局所適用、Bv8発現細胞移植、又は経験的に決定した頻度で注射により維持されなければならない。この治療法の経過は一般的なアッセイによって容易にモニターされる。
Bv8ポリペプチドをコードしている核酸をまた遺伝子治療法において使用することもできる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」には、1回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの一回又は繰り返しの投与の、遺伝子治療剤の投与とが含まれる。アンチセンスRNAs及びDNAsを、ある種の遺伝子のインビボでの発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それがインヒビターとして作用する細胞中に移入できることは既に示されている。(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって、その取込みを促進するように修飾してもよい。
Bv8配列もまた診断方法において使用することができる。Bv8の過剰発現は生殖器官の嚢胞又は癌の徴候である。更に、変異型又は機能障害Bv8について、患者からの試料を分析することができる。一般に、そのような方法は患者からの試料中のBv8の発現をコントロールの発現と比較することを含む。
他の側面では、本発明は、疾病又は疾患の治療又は予防のため、あるいは受精率を調節するために有用な物質を含む製造物品を考える。製造物品は好ましくは容器及び容器上の又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス及びプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器はBv8又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含有する組成物を収容し、ラベル又はパッケージ挿入物は好ましくはBv8又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用するための指示書を提供する。一実施態様では、製造物品はBv8アンタゴニストと、そのBv8アンタゴニストを癌の治療又は予防のために使用するための指示書を含んでいる。他の実施態様では、製造物品はBv8と、ホルモン産生内皮組織に関連する症状を治療又は予防するためにBv8を使用するための指示書を含んでいる。更に他の実施態様では、製造物品はBv8アンタゴニストと、受精率を調節するためにBv8アンタゴニストを使用するための指示書を含んでいる。パッケージ挿入物はまた適切な投薬計画を示していてもよい。一実施態様では、挿入物は、組成物が約0.01μg/kgから50mg/kgの間の用量で投与されるべきであることを示す。
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従って使用した。ATCC受託番号により以下の実施例及び明細書を通して特定された細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、VAである。
ノーザンブロット分析
Bv8の発現パターンを解明するために、様々なヒト、マウス及びラット組織からのRNAを使用してノーザンブロット分析を実施した。ヒトRNAブロットは、ヒトBv8 cDNAをベースにした32P標識DNAプローブにハイブリダイズさせ、マウス及びラットRNAブロットを、マウスBv8 cDNAをベースにした32P標識DNAプローブにハイブリダイズさせた。
ノーザンブロット分析を、当該分野でよく知られている方法に従って実施した。例えば、cDNAプローブは、32P-dCTP3000μCi/mmol(Amersham)を使用して、Redi-Prime IIキット(Amersham)で、30−50ngのヒト又はマウスcDNA断片を用いてcDNAプローブを調製した。プローブはセファデックスG50スピンカラム(Pharmacia)で精製し、ハイブリダイゼーションをExpressHybハイブリダイゼーション液(Stratagene)中で68℃にて実施した。他の実施例では、ブロットを、ハイブリダイゼーションバッファー(5XのSSPE;2Xのデンハート液;100mg/mLの変性剪断サケ***DNA;50%のホルムアミド;2%のSDS)中でプローブと共に42℃で60時間インキュベートした。ブロットを2XのSSC;0.05%のSDS中で室温にて1時間、数回洗浄し、続いて0.1XのSSC;0.1%のSDS中で50℃にて30分洗浄した。ブロットをホスフォイメージャー分析(Fuji)によって一晩露出させた後に現像した。等価なRNA充填物を、コントロールアクチンプローブを用いたハイブリダイゼーションによって評価した。
Bv8 mRNA転写物を検出した。図9は、1.8kbの単一mRNA種がヒトBv8プローブを用いてヒト精巣中で検出されたことを示している。分析された他のヒト組織の何れにも発現は検出されなかった。図10Aは、単一mRNA種がマウス精巣及び心臓中で検出されたことを示している。図10Bは、1.8kb及び0.8kbの転写物がラットの精巣中に存在しているが、他のラットの組織中には存在していないことを示している。総じると、これらの知見は、精巣がBv8のmRNAの発現の主要な部位であることを示している。
細胞増殖アッセイ
Bv8に対する特定の細胞タイプの応答性を決定するために、ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞(ACE)及びウシ脳毛細血管内皮細胞(BBC)を増殖応答性についてアッセイした。
簡単に述べると、ACE(副腎皮質毛細血管内皮細胞)及びBBC(ウシ脳毛細血管)を、10%仔ウシ血清を補填した低グルコースDMEM中で培養した。細胞増殖アッセイのために、6000の細胞を上記培地の12ウェルプレートの各ウェルに蒔いたが、コントロールでは添加をせず(図11の「C」)、他は10ng/mlのVEGF(図11の「V」)、50、10又は1nMのBv8(Fcタグ組換えタンパク質)である。Coulterカウンターを用いて1週間後に全細胞カウント数を得た。細胞数の増加倍数は1の値に任意に設定されたコントロール条件に対するものである。培地及び他の細胞培養試薬はLife Technologies, Inc.から得た。アッセイの性能については、Aravind及びKoonin, Curr. Biol. 8:477-478(1998)をまた参照のこと。
予備結果は図11A及び11Bに示されており、これはコントロールに対する細胞数の増加を示している。Bv8は試験した全ての濃度において細胞増殖の増加をつくり出し、観察された最大の効果は50nMの濃度においてであった。正のコントロールであるVEGFは未処理コントロールと比較してACE及びBCC細胞の双方の増殖においてほぼ三倍の増加を誘導した。
細胞生存アッセイ
内皮細胞の生存に対するBv8の効果を測定した。およそ2x105のウシ脳毛細血管(BBC)細胞を、完全培地(上の実施例2に記載)を含む6ウェルプレートの各ウェルに蒔いた。次の日に、完全培地を吸引し、細胞を、何も添加していない培地中又は次の成分の一つを含有する培地中で培養した:2%のFCS、10%のFCS、20ng/mlのVEGF(図12の「V」)、5nMのBv8、25nMのBv8、20ng/mlのVEGF+25nMのBv8(図12の「V+Bv8」)、又は25nMのEG-VEGF。48時間のインキュベーションの後、トリプシン処理によって細胞を取り除き、冷70%エタノール中で数時間、固定した。ついで、細胞を、PBS中の20ng/mlのRNA分解酵素及び5μg/mlのプロピジウムヨウ素を用いて2−4時間、室温にて染色した。細胞のサブ-G1プロフィールをFACS分析によって決定した。細胞集団のこのパーセントを図12のグラフの縦軸にアポトーシス細胞パーセントとしてプロットした。
図12から分かるように、Bv8はBBC内皮細胞の生存を向上させた。特に、培養物中に可視できたアポトーシス細胞は、2%のFCS又は25nMのEG-VEGFの存在下でよりも何れかの濃度のBv8の存在下で少なかった。Bv8とVEGFは相乗効果を示し、2つの化合物の併用は、成長因子をそれだけか10%のFCSの何れよりも大なる程度に細胞生存を増大させた。
血管形成のインビボでの誘導
血管形成応答を誘導するBv8の能力を測定した。一連の実験で、ベージュヌード雄マウスの精巣中の精巣内血管増殖に対するBv8の効果を定量した。
LacZ、VEGF及びEG-VEGFをコードするアデノウイルスは過去に記載されている(LeCouter, Nature, 412: 877-84, 2001)。Bv8をコードしているアデノウイルスの生産のために、マウスBv8の81アミノ酸アイソフォームをコードしているcDNAをCMVシャトルベクター(Stratagene)中にクローニングし、製造者の指示書に従って、組換えアデノウイルスベクター及び組換えウイルスを製造した。ウイルスを、Virapur(Carlsbad, CA)の大規模なキットを使用して精製し、力価を決めた。
インビボ実験に対して、アデノウイルスベクター(LacZ、VEGF、EG-VEGF及びBv8)を、107−108pfu(n=5)でベージュヌードマウスの精巣中に注入した。7日後に、動物を殺し、精巣を固定し組織観察のために加工した。
図13から分かるように、Bv8は、VEGF及びEG-VEGFと同様に、ヌードマウスの精巣細胞中でインビボでの間質毛細血管形成を増大させた。PBS又はLacZアデノウイルスコントロール群の何れにも間質毛細血管生成又は血管形成の増加は観察されなかった。多くの処理した動物において、管状萎縮がまた観察された。管状萎縮は血管形成応答の誘導から生じる間質圧力の増加から生じうる。
Claims (21)
- Bv8又はBv8をコードする核酸分子を含んでなる、内皮細胞増殖の誘導、又は内皮細胞生存の亢進に使用するための医薬であって、前記Bv8は、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、内皮細胞の増殖を誘導するものである、医薬。
- VEGF又はVEGFをコードする核酸分子を更に含んでなる、請求項1に記載の医薬。
- 内皮細胞増殖、内皮細胞生存、又は血管新生の抑制に使用するための医薬において、Bv8アンタゴニストを含んでなる医薬であって、前記Bv8は、配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、内皮細胞の増殖を誘導し、前記アンタゴニストは抗体、抗原結合抗体断片又はアンチセンス分子である、医薬。
- 内皮細胞が血管内皮細胞を含む、請求項1又は3に記載の医薬。
- 癌の治療に使用するための医薬であって、Bv8アンタゴニストを含み、前記アンタゴニストは抗体、抗原結合抗体断片又はアンチセンス分子である、医薬。
- 癌がホルモン依存性癌又は生殖器官系癌である、請求項5に記載の医薬。
- 生殖器官が精巣又は卵巣である、請求項6に記載の医薬。
- VEGFアンタゴニストを更に含んでなり、前記アンタゴニストは抗体、抗原結合抗体断片又はアンチセンス分子である、請求項5ないし7の何れか一項に記載の医薬。
- ヒトの治療のためのものである、請求項1ないし8のいずれか一項に記載の医薬。
- Bv8が天然配列のBv8である、請求項1ないし9のいずれか一項に記載の医薬。
- Bv8が配列番号:6のアミノ酸配列を含んでなる、請求項10に記載の医薬。
- Bv8がヒトBv8である、請求項10に記載の医薬。
- Bv8が配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列を含んでなる、請求項12に記載の医薬。
- Bv8が配列番号:2又は配列番号:4のアミノ酸配列に少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、内皮細胞の増殖を誘導し、ヘパリンに結合する、請求項11ないし13に記載の医薬。
- Bv8がキメラBv8を含む、請求項11ないし14に記載の医薬。
- キメラBv8がイムノアドヘシンを含む、請求項14に記載の医薬。
- Bv8アンタゴニストを同定する方法であって、
a)候補化合物をBv8に接触させ;
b)内皮細胞増殖、内皮細胞生存、又は血管新生を抑制する候補化合物の能力を決定する
ことを含んでなる方法。 - 抗体断片がFab、Fab’、F(ab’)2又はFv断片を含む、請求項3、5及び8の何れか一項に記載の医薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項3、5及び8の何れか一項に記載の医薬。
- 抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項3、5及び8の何れか一項に記載の医薬。
- 抗体が二重特異性抗体、単鎖抗体、ダイアボディー又は線形抗体である、請求項3、5及び8の何れか一項に記載の医薬。
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