HU230373B1 - Mitogén aktivitású Bv8-nukleinsavak és polipeptidek - Google Patents

Description

M tíogétt aktivitású és polipeptidek

A találmány tárg\át áhalában a mitogén aktivitású Bv8 feltétjét alkalmazó eljárások, készítmények .és vizsgálati eljárások képezik.·

BidotéHálissejíek

A lokális mlkrokömyézeí: nágytséAákbeti befolyásolja a vaszkuláris endofeilális sejtek növekedési tníajdonságalt szövet- vagy szervspeciEkos módon:, de s tófeáfe. Ifátsyhó szignálok tólnyomórészt ísmesetleaek. Minden kétségei: kizáró bizonyíték, vas arra, hogy a vaszknláris ettdotéliálls növekedési foktőt ί VEGE) és az endotéliális sejtésre specifikus növekedési foktőtök angiopoíetfe családjai esszenciálisak az embrionális fejlődés

1.0 és az angiegénezis szempontjából különfefe fiziológiái és patológiai kőblimények között (Ferrara· és Álltaid. Nafote Mediébe 3, 1359-13ö4. old:, (1999); -Casaelíet,. Nstnre Medlcine §, 389-395. óid. (209011. Az eadotélíáiis sejtek fenobpnsáoak és növekedésének lokális, szövet-specifikns szabályozására Is erÓs bizonylfek van [Aird és mtsaL J. Cell Biot. 13-8, 1 í 17-1124. old. (199?); Síewsrí és Wley, Dev. Biok 84, 183-192, old. (1.981}), Az endötéilális sejtek morfológiai és fonkeionáiis: luíajdosságal nagy mértékben eltérnek a különböző .15 szervekben [Slmioneseu és Simionesctí, Gell mid Tissne Eiology, 355-398, öld, kiad.: hirhan aod Sehwarzetoberg, Baltlmore (1988)1, Ezenfelül az alkalmazás helye még nagyobb mértékben meghatározza az_: áj erek mlájdosságaít, mint a teszteli angiogsnikns faktorok (Dellian és mtsai, Am. 3. Pathofogy 149, 39-71. old. (199ó); Róberté és mtsai, Ám, 3. Pathology 153, 1239-1248, öld. (!998}j. A lokális mlkrokőrnyezetnek az érrendszer talájdonságaira való essen befolyásának. a «mleknláris alapja ismeretien, de ügy vélik, hogy a specializált sztróma fontos szerepet játszik benne (Öeilian, mim fém). Elképzelhető, hogy sz ingerek integrált összjátéka — amely szbvet-speciílte szekretáh fehérjéket tsriaimsz. a sejtes és exlmeeliüidrls mátrix komponensek mellett — határozza: meg a helyi endotéllnm szerkezetét és működését, valamint mednlálja a •növekedései.

Ily módon, szükség van ölvén fokíöfök azonosítására és jellemzésére, amelyek befolyásolják az endötéilális sejtek növekedését és/vagy dlffereneiálődását. Amellett, hogy növelik az érrendszer kinlakulásátó! való tödástmksi, az ilyen vegyüietek hasznosak lehetnek a vassfodáris szövettel knpcsítlahsa betegségek diagnózisában és keze lésében .

Hoonont szekrsláló sejtek

Bár volt előrehaladás a tudomány és az ötvös! terápiák területén, továbbra, is szükség vas .áj kezelésekre a társadalom orvos! panaszainak: esetében. Egy megközelítési mód: új kezelések: kifej lesziésére annak tanulmányozása volt, hogyan működik a szervezet, közelebbről, érdekes,, hogyan szabályozzák a jeladó sejtek az organizmus viselkedését. Példán! az endokrin sejtek hormonoknak nevezett jeltovábbító moléknlákal szekreíáina k, és ezen hormonok: szekréciójának a tnüködészavara kblőnfele rendellenességekhez vezet,

A hormonok szekréciójára, specializált sejtek közé tartoznak az ivarszervek sejtjei, amelyek feszioszíeront (a bem Ixydig-seltlei), ősforogént (a petefészek tüszőinek te ísrezuö rétege) és progaszleront (a fetepeöt tüsző eoíptís &ma». sejtje) szekreíáinak. Míg vannak ktllóufefe: kezelések az orvosi terű leien, amelyek teszfoszíeron, ösztrogén és progeszferon külső beadását alkalmazzák, továbbra is szükség van azoknak a sejteknek a szabályozására, amelyek ezeket a hormonokat termelik.

Bormonszekréclóra specializált egyéb sejtek közé tartoznak a mellékvese sejtjei és az emésztőrendszer sejtjei. Például a mellékvese sejtjei epmefemt. noreplnefeint és szterold: hormonokat, mim: például

1901Ü8-6254-LT ·>

minensfokotaikoszíeroidokat és gbíkokoAikoszteroidökst szekretálsak. Köteösen jefenfosággeí W a tetszői, amely .8 mellékvese kérgében keletkezik, és amely befolyásolja sok sejüipas anyagcseréjét, Az emésztőrendszer sejtjei közé tartoznak a hasnyálmirigy .sejtj:ei, amelyek Iszaiint szekretálssk, Az tettet- a Langerhans-szígetek azekrstálják, és esszenciális: a széteárátök anyagcseréjében. inzulint stefeaznafe a diabétesz msilitusz kezelésére és szabályözására, azonban továbbra is szükség: van olyan rendellenességek hatékony kezelésére, mint példán! a diabétesz. A béltadszer és a tüdő egyéb jeientóséggel bírd botmonjei közé teszik a szerottea, endteis, sztnaatoszfete, gasxtrín, szekretfo, köfecisztöktnín, glukagos és hőmhez®.

Számos: olyas betegség, és rendellenesség van, amelyek hormojrszekretálö sejtekkel, különösen .az endokrin mirigyekben íaláfeíé szieroíslogés endotélíátfe sejtekkel kapcsolatosak. Tehát szükség fenne olyan növekedési faktorok azonosítására, amelyek sneeiftesan befolyásolják az ilyen eudötéüális sejteket. Az ilyen enáotélíális sejtekre speeiStes növekedési faktorok értékes eszközök fennének az ilyen seiítlpasokksl kapcsolatos rendellenességek diagnózisában és kezelésében, és az Ilyen betegségek diagnózisában és kezelésében hasznos további potenciális drogjeiöitek azonosításában.

.25

A. SvS egy kis fehérje, amelyet oredeíifeg a Eotete v.te<?g»ía béka bőrszekréínrnaíhbi izoláltak [Mollay és rnlsaí,, húr, X Pharmacot 374, I8Ö-196. old. (1999)1. A BvS több mint 48% azonosságot mutat a MIT-1 -gyei, amely egy kis fehérje a fekete mamha venomjából, amelyről fcteutátátíáfc, hogy nagyon hatásos intesztínShs összehúzódások kiváltására (Seteeltz és mísssi,, FEBS I.elL 461, 183-188. old.. (1999)), A Bv8 számos emlős homológját tnegklónotek egérből és emberből, és kinníteák, hogy azonos amíuossvszekvenciákai: tartalmaznak (Weehselberger es mtssh, FEBS Lett. 462, 177-181. old, (1999)]. Csakúgy 3íte a MT-l-röl, a barnán BvS-ról is kimutatták, hogy összehúzza a a gsstetetesztísális s'nnalzmokat, a szubnanontőlám tartományba eső BC_S() értékkel {Li ás mtsai., Moi. Ph&rm. 39, 692-698. old. (2681)]. A BvB két formáját azonosították emberben, amelyek közöl a hosszabb forma «gy alternatív ,,spliemg^M-ü exos jelenlétét: tükrözi. A hunján Bv& hosszabb formája megközelítőleg ?8^ö/«-ban homológ és 5;8%-ban. azonos a ¥RPA~vaL anjelyet: a 89/886242. számú ahverikai egyesüli államokbeli szabadalmi ixjetetesben tárnak fel.

A találmány a BvS: új: skffohásainsk az azonosításán alapul. Közelebbről, azt tatáitok, hogy a SvS eadotéliáiís sejtek proíiferáeMját indukálja, elősegíti az endotéllális sejtek töiéléset és elősegíti az angiogenezkí. Amint részletesen feltárjuk, a BvB-núkieinsavak és tatatteek száno/s vizsgálati: eljárásban, és endoíéiiátis sejtekkel kapcsolatos állapotok dfegmizisábas és kezelésében aikateazhstök.

Egv megvalósítási mód szerint a találmány tárgya in. vitro eljárás endótélíálls sejtek proliíeráeiójának máakáíására, esdötslíális sejtek túlélésének fokozására, vagy angfogenezis induhálására, amely eljárás magában foglalja a sejtek énetkezmtéséi olyan polipeptiödel, amely legalább 88%-ban azonos a 2. azooosítószám szerte vagy 4. azenosifoszárn szerinti /tenosav-szekveosiával vagy a polípeptidei kódoló nafcleípsav-mofeknlávat Egy megvslöshúsi mód szerint az eljá^sban sejteket hozunk érintkezésbe Bvteal aiysn mennyiségben, amely hatásos a sejtek pröliferteóteak az Indukálására, A eljárás tartalmazhatja továbbá a sejtek VEGF-fef történő érterszésbs hozását is. Egy másik megvalósítási möd szerint az eljárásban Bv8-;rt kódoló sukieinssvat juttatók be sejtekbe olyas mmmyíségben, amely hatásos sehprolubráeió redukálására. Ez az eljárás továbbá tartalmazhatja VEGF-et kódoló nukleinsav bejuttatását a. sejtekbe.

-3Egy megvafositási mód szerint a 8V8 smíiv szekveodájá BvS-poHpeptid; Előnyösen a natív szekveoelájó 8y8-^eh‘pepfsd natív barnán SvS-poHpepM A mtív Immárs EvS-pobpeptid ά 2. azomoriíószáin szerinti ami3ó.w-s?.skveaeiát vagy a 4, azososítószám szerinti wfeos&v-ssseskyeactát tartalmazhatja. Bgy másik megvalósítási móri szerint: a natív szekveneiájá Bv& a ő, azonoskószám szerinti amínosav-szekvencíát tartalmazza. Egy másik megyalósitásl mád szerint a BvS képes heparte kötésére. Egy még további megvalősMsí mód szériát a Bv§ egy :Bvfoímm«o&őfee.w. Egy további megvalósítási snőd szerint a BvS kiméi» SvS.

Egy megvalósítási mód. szerint a sejtek sriertedogés: mirigy .sejtjei.

Egy további megvalósítási mód szerint a taláiteáay tárgya a 2, azonositóssám szerinti vagy a 4, azonosrtószám szerinti jmhnosav-szekvenciával legalább S8%-bars azsws pölipeprid vagy g. pölipepíidet kódoló onkletesav-molekafo alkalmazása hornmníormelő szövetekkel kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására. Egy megvalósítási módszerint ás kezelésben előnyösen az emlősnek Bvfoal tartalmazó készítményt adónk be olyan: mennyiségben, am hatásos az állapot kezelésére. Egy másik megvalósítási mód szerint a kezelés továbbá VEGE vagy agomvtátának a beadását tartalmazza az emlősnek. Áz emlős előnyösen ember.

t5 Egy megvalósítási mód szerint a Bvk bspartef. kőt. Egy másik megvalósítási mód szerisí a Bv§ natív

Szekvenciád Bvk-mtepeprid, Előnyösen a natív szekvenciájö BvS-poiipeprid natív komán ©vS-polipepíld, A natív barnán Bvfopoiípeptíd »: 2. azöoosílószám szerinti smioosav-szekvenelót vagy a 4. azönösírőszám szerinti smteosav-szekveseiát tartalmazhatja. Egy másik megvalósítási mód szerint & oariv szekvenciája Bv8 a ö. azososítószám szerinti aftenosav-szekveneíár íarielmazza.

Egy még további megvalósítási mód szerint a találmány tárgya te elíró eljárás esdotéliáiis sejtek:

prolíféráclójánák, endotéllális sejtek telelésének, vagy anglögenezisnek a gátlására, amely eljárás, magában foglalja .a sejtek értetkeztetését olyan polipeptid ateágösistájával, amely legalább StWfean azonos a 2. azonosífoszám szerinti vagy 4, azenosííöszám szerinti amínosav-szekvencíávai, ahol a pölipeprid képes eo.dpséliális sejtek proíiforáeiójánkk tednkálására, eodotéiiális sejtek túlélésének fokozására, vagy angiogesezis tedakálásám, és ahol az ;mtagonísta ellenanyag, aotigéakötö: elienanyag-fragmeas, vagy antlszensz molekula. Egy megvalósítást mód szerint az. eljárásban az emteíéllális sejteket érintkezésbe kozzak 8vS-aníagosistával olyan mennyiségben, amely hatásos g sejtek proilferáriőjának a gátlására.

Egy még további megvalósítási mód szerint a ialáiteány tárgya a 2. azonositószíím szerinti vagy a 4. azonositószám szerinti amteosav-srékvencíávsl legalább 80%-ban azonos pölipeprid amagosisíájának az

3ö alkalmazása, ahol a pölipeptid képes endotéiiálls sejtek prolderáeióíának iadukálására. eudótélíábs sejtek telelésének fokozására, vagy spglogesezb tedakálására, rák emlősben való kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol az antagonista ellenanyag, astigénkSíő elleuanyag-Bagmeös, vagy antlszensz molektes, Á kezelés előnyösön Bvfoaniagenlsia beadását tartalmazza olyan mennyiségben, amely hatásos: a rák kezelésére. Egy megvalósítási mód szerint: a rák sommo-foggá rák. Egy másik megvalósítási mód szerint a rák hererák.

Egy másik megvalósítási mód szerint & rák mporitószervek rákja emlősben, előnyösen emberben. Egy megvalósítási mód szerint a kezelés Bvfoantagomsta beadását tartalmazza olyan mennyiségben, amely hatásos u rák kezelésére. A rák előnyösen hererák.

Egy fovábbi megváltási mód szerint, a találmány tárgya a 2. azcsmítósfoim: szerinti vagy a 4. szonosltószáín szerinti amitsosav-szekveneiávsi legalább 80%-ban azonos pölipeprid aníagomstájának sz alkalmazása, ahol a pslípe.piid képes smfeíéliálís sejtek prolíforádőjansk indukálására, éndotéliáiís sejtek

-4túlélésének fokozására, vagy aftgfogwsös iui&káiására etefe olyan betegségiek vagy áifepotáitak kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, amdy túlzott, uam kiváustös vagy szabályozatlan asgíögeuez&sei kapcoobtes, ahol az antagcwte ellenanyag, antigénkőtö slfengnyag^tagraens, vagy aniiszensz molekula.

Egy megvalósítás; mód szerint az eljárásban előnyösen sz emlősnek BvS-at vagy Sírnak agofostájsi 5 vagy gaísgösfetsíáí; tójuk be olyas mennyiségben, amely hatásos á betegség kezelésére, Az emlős előnyösen c;nber.

Egy még további raegvstósltásí mád szerhú a találmány tárgya a 2- íízoriesitőszám szerinti vagy a 4. azonositószam szerinti ammosav-szskvenciával legalább 80%-baíí azonos golípeptid aniagouistsiának sz alkalmazásit, ahol a polipeptid képes endoíéiiá-is sejtek praliferádójártak hfoukálására, endotéliáhs sejtek

1# túlélésének fokozására, vagy gngiogesezis redukálására, termékmiység: emlősben való szabályozására szolgáló gyógyszer gyártására, ahol az antegotssfós ellenanyag, sraigéokőtS «rietsmyagfragútens, vagy antiszessz molekula. Egy megvalósílásl mód szerint, a® emlős ember, A kezelés előnyösen Bvk-ánlágonista beadását Mtessa szerótoefc olyan mennyiségben, amely hatásos a terínéketsység szabályozására,

A szteröídhQromrttilSggó tendelkuessőg emlősben való kezelésére szolgáié megvalósítást módokban az '15 emlős előnyösen ember. A. szteroidsormön-Slggő rendellenesség előnyösen tsz: alábbiak feámielytke; Itpoiü kongmíáiis adrgttáíts hipcrplázla, temtekstleuség, szexuális érés, ssidrogén-flisgő daganatok, korai pubertás, MeCime-Aforigbt: szindróma, eongemfo vagy hipogona.dotwpikas blpogönadtzmus,

A. találmány egy· másik megvalositit»! mőápiaak tárgya eljárás BvS-aníagonista azonosítására oly módon, hogy potenciális vegyőfctet érintkezésbe hozunk a 2, azonositószána szerinti vagy a 4, traonosbőszám

2Ö szermti aminossv-szekvesraiával legalább SÖ/e-ban azonos amiuósav-szekveuc'iáí tartateszó polipeptiddei, megfeaíározmk a potigepüd képességét endotóliáíis sejtek proliferáclójának elősegítésére, eotiotéliáiis sejtek tálélésének fokozására, vagy augiogénezis indukálássra, és maeSftiráfc olyan potendális vegyltiete.t, amely gátolja az BvS antagonislájának endotelíális sejtek proliforádősaktivitását, eodotéliáiis sejtek tölálési aktivitását, vagy angiogenezis aktivitását, Egy megvalósítást mód szerint a Evá-aniagouisíát a Bv8 eudöféhálís sejtek preliferáelőiánsk stimulálására való kőpességéríek gátlásával azonosítjuk. Egy másik tnegvalósííásí mád szénát a BvS-tmiagedstái a Bu§ endotélláKs sejtek túlélésének elősegítésére való képességének gátlásával azonosítjuk.

Az aiábbiakbast rö viden israerteíjtik a leíráshoz tartozó ábrákat;

Az 1. ábrán Iramán ÖvS-homolőgot kódoló eÖHS sukieetid-szekvendand: (1,. azönosítőszámá szekvencia) matat) ok be, Vastag és aláhúzott betíiveí bemutatjuk a start és stopkodoook puzidöját is.

A 2. ábrán az 1. szösosltőszárnö szekvenciából származó humán BvSfoornofog pollpeptid amiaosavszekvenciáját (2. azonos kószára» szekvencia) mutatjuk be, A üti tételezett szignálszekveseía az 1~21, sotinosavakbói áll.

A 3. ábrán homárt Svk-bomolőg alternatív ,,sp.íiemg”-ő változatát kódoló eDfoS sokteotid-szekvesciáját

2.5 <3, azorsosíiőszánni szekvencia! mutasjak be, Vastag és aláhúzott behívd hemaíaíjsk a start és stopkodosok pozícióját Is.

A 4, ábrán: a 3, azsuosltószámú. szekvenciából származó humán SvS-homoíÓg poilgestid a;xtfoosavszekvenciáját (4. azorsoshószásrtú szekvencia) tuotatjuk be.

Az 5. ábrán egér 8v8~bomöióg nokíeeííd-szekvcucláját (5, azonosítószámú szekvencia) matatjuk be.

Vastag és aláhúzott bstúvel bomutaijuk a start és stöpkodormk pozícióját is.

- 5 A. 6;. ábrán az 5. azonosítószámú .szekvenciából. szármezó «gér SvE-homológ poiípepttd aminosavszekvenciáját,(§. azonosítóss-ámá szekvencia) mutatjuk be.

A 7, ábrán sz egér és barnán Bvá-homológ egymás, alá rendezését mutatjuk be. Egy potenciális heparlnkötő domőni bekeretezve mutatunk be. Amint jelszzök, ez a domés afecs j«lan az alternatív „splicíríg”-S íra-oszkripttímban. Az egér és humán Evő-homológ megközeiitöfeg 9ő%-ban azonos.

A 8, ábrás a humán Bv8 és EG-VEGF ammosav-székt'enciáiámsk az egymás alá rendezését mutatjuk be.. A'hömá» Bv8 tnegkörelííökg 60%-kas aaösos a htmuka EG-VEGE-el

A 9. ábrán humán RNS-atóaták Nortbem-bloí elemzését mutatjuk öe,« egyetlen, mégközchtöleg I ,E kb mérető transzkrípmmot mutatott. .Az expresszit a herében volt látható, Á sávok tartalmát a biot felett

1Ö jelezzük, és a mars töket (kb) a. jobb oldalon tönfei jök fel

A 10A. és 168. áferáköö BvS exprsssziöjának a Northcm-blol elemzését wtaijnk be égéiben és patkányban. Az egérben a BvS expresszíáját a szívben és a herében, láthatlak (ICA, ábra), A patkányban az expresszié csak a herében látható (108. ábra), .BasnfciSí a patkány herében egy kisebb. 0,8 kb csflc is látható.

A 1,1A.. és HS. ábrákon aztmatatjuk be, hogy a Bv-8 enáötéliálls sejtek probferáciőját indukálja. A 15 11 A.. ábrán azt mutatjuk be, hogy a Bvk beadása 1, 16 ás 50 »M koncentrációban növeli szarvasmarha metiákvesekéreg kapilláris endoíéisalis (ACE) sejtek prollferáclójáí. ellentétben a kezeletlen koftlreilokkal {„£”)Hasonlóképpen, a 118. ábrán azt mutatjuk be, hogy íniudbárom kotteestráoté növeli a szarvasmarha agyi kapilláris sejtek proliferácíóját, Mindkét esetben a Bv8 által mdakált prollleráció kisebb, mist a VEGE által indukált (.VG.

A 12, ábrán szí mutatjuk be, begy a Bv8 elősegíti az onáetéliáös sejtek felélését Az 5 vagy 25 nM

BvíBaí tartalmazó tápközeggel történő tskubálásí követően kevesebb szarvasmarha agyi kapilláris sejt volt: apoptoíikus, mint a 2% ECS-ben vagy EG-YEGF-ben történő inkubáiás után, A SYS és VEGE szinergísia hatást mutatott, kevesebb apoptotíkus sejt véli jeles, a tenyészetben a Bv§ és VBGB együttes mknbáiását követően, mint akármelyikkel kttlömkőlön.

A 13. ábrán azt mutatjuk be, hogy a ,Bv8 növelte az mterstfeiáhs kapilláris képződési csupasz egerek heréjében. Adensvirálís vektoroknak......amelyek Eu«7-t, VEGF~et, . BG-VBGE-et vagy .Sv8>st expresszáitsk -— az egerek heréjébe valő injekcióját követően a Bv8<ai kezelt állatokban az mtrateszíAolvrs prsllfetáelö növekedését fígyeLA ,n<.g.

3Ö Oeiiafclók

Hacsak másképpen nem áefísiáljuk, a találmány szerint alkalmazoö összes műszaki és tudományos kifejezés alatt ugyanazt értjük, amit az azon szakterületen jártas: szakember általánosan éri, amelyre a találmány vonatkozik. Lásd például Sisgíetoa és mísal, „EŰetionzry of Mtcrobiology ansl .Moteeulgr Eiolögy”, 2, kiadás, kiad,; 1 Wiley & Sons (New York, NY 1994): Sambreok és misei,. „Molecular Cionmg: A l-uboratory Msnpal”, kiad.; Gold Spring Eiarbor Éress (Goid Spring Barfeor, W (1989). A találmány céljából az alábbi kifejezéseket dsftűálitik,

A leírás szerből Metemfeen a „Bv8” és ,,Bv5-polipeptiíf’ klíej^seket felcserélhető módon: alkalmazzuk, és alattuk a natív szekvenciájó Bv§-at, BvS-variánsókal és kiméra Bv8-at értőnk, amelyeket az alábbiakban defeiánmk. Adott esetben a BvS sem tartalmaz natív glikoziláciőt. A „natív gllkoziláeiő” kifejezés alatt olyas szénhidrát moieksíarészeket értőnk, amelyek kovalensen kötve vannak a SvS-boa, amikor az az

-őeoPőssejtekbes termelődik, köfonásea -olyan -sejtekben, melyek: a íensészeiben ketetkazsek Ennek mágfefelően a nem hamás sejtekben tenned barnán BvS a Bv& olyan példája, amely „asm tana tesz natív gtiközílscióiX Néha 2 8v§ egyáltalán nem glikozilált, mint péídátd abbao azssetben, amikor pfokarlétákbnn, péköu: £. <?<zte batt vas előállítva.

$ A SvS-nukiemsav olyas RNS vagy DNS, amely fertt {fefímált Bvb-polípeptid&í kódol, vagy mely bibridizál ilyen ÖNS-hez vagy RHS-hez-. és stábban kötődve marad iához szttfetgeos feibrídizácíős líörnlmények közöd, és hosszabb, mint körölbeldl 10 rrakteotid, Szsfogm- körSlmésyek azok, amelyben 0) alaesony íöoerősséget és magas hőmérsékletet alkalmazönk mosásra, például 0,15 M NaCl/9,0? 5 M náteíum~eiteát/0,l% NaDodSÖ₄- $9 vagy (2) a lúbrtdlzálás folysssán őenatta-sloszett, mist például formamidoí alkalmazunk,

W például 5t)be(v/v %)· fermarsidoí ö,l% szam--ost»arha-szérunudbumfe/0_! t.% 7%ö//.'ÖJ% pobvlml-pirrölklon/óó mM nálriom-feszfet puiferbeo pH ma-ős 759 roM sátrium-ktofiddsl, 75 jsM ngtriusn-eitráttal 42 AT-os.

vgy nakiemsav működőképesen kapcsolt, amikor Pmkcíonstís kapcsolatban áll egy másik rmkfeinsavszakvedciával, Bvk-mfelsiasavst működőképesen kapcsölb&tenk egy másik Ímklomsav-szekvesciával egy vektorban oly módos, hogy exprosszálődjos egy adod ga?4aszfirvezatbes. Ezt a szakferSteten jól ismert eljárások slkahuazásával hajthatjuk végre, Példám egy pre-szekvenciát vagy szekréciós vezetőszekvopoiát kódoló DNS mSködÖképeses kapcsolt egy pobpeptió DNS-áhez, ha az olyan preproíemként sxprmzáSódsk, amely részi vesz a poüpsphd szekréeiójábas; egy promóter vagy ettfemser működőképesen kapcsolt egy kódoló sZékveneiához, ha feefolyásoija a szekvencia transzkripciójáp vagy egy nboszómá-kőíőhely működőképesen kapcsolt egy kódoló szekvenciához, ha ágy helyezkedik el, hogy elősegíti a transzlációt Általában a

2® „működőképesen kapcsolt’’ kifejezés alatt azt értjük, hogy az ősszekapesolt DW-szekveneiák összsDlggőefe ás --- szekréciós vezető szekvencia esetében — össze&tgsőek és azosos olvasási feisbaa vannak. Azonban az eammszereknek nem keli összefeggönck lenniük, A kapcsolást kényelmes resttíkeíős helyeken történő lígálással végezhetjük. Ha nem léteznek ilyen helyek, akkor szintetikus oilgonukleotíd-adapterekét vagy kapcsoiómotektdákst alkatemk hagyományos eljárások szerint

Λ „natív szekvenciáid Bvő” olyas pohpepíidaí tartalmaz, amelynek az aműmsay-szskvenciája azonos a természetből szártuszó Bvk-éval, PlggetfenűI annak előállítási mókától. Ily módos a natív szekvettetájó Bvk lehet a természetben előfordsló hordást .8v8, egér Bv8 vagy bármilyen más emlősfajböl származó Bvk ammosavszekveselája. Példám a X ábrás teljes hosszúságii natív szekveoeiajő barnán SvS amioosav-szokve.ncláját souíatiuk be (2, azonoslíőszámó szekvencia), Egy második teljes hosszúságú natív humán Bvk .szekvenciát oúdsbmk be a 4. ábrás 0. azooosttőszómú szekvencia). Ez a két szekvencia egy -&» alternatív „spitclttg^-jének SZ eredménye, amely egy kasosiküs bepartnkötő óotstéat kódol, ily módos az a natív szekvenelájű homárt SvS, amelynek az aminosav-szekveítciájót a 2. óhrárt mutatják be (X azonosítószámú szekvencia), tartalmaz heparmkötő sfeméot, mig a 4, ábrán bematatott natív szekvenciáid W8 0. azrmósiíószámű szekvencia) nem tartalmaz, A ő, ábrán rtetlv szekveneiájú egér Bvű ammosav-szekveíteiájáí matatjuk be ló. azonositőszámá '35 szekvencia). Humán és. egér 8v« szekvenciákat feltárnak péMáöl Weehsefeger és mtsai, [<FE8S tett, 402, 17X181, old, (1999)) és 12 és sósai. [Mól. Etem. 59, 692-098. old. (2Ő01 > is, Ilyen natív szekvetteiáiy 8v8-st a tcrtnészetfeői izoláíhdapk, vagy rekembmáns és/vagy szintetikas úton állíthatónk elő. A „natív szekvenciáié Bvb” kifejezés alatt speedskusan értendők a BvS természetben eiölbrdolő prepro-, pro- és érett formái, és csonkolt formái (például alternatí v „spltemg”-ő fermák, mint péld&ol a 4. ábrán besmteáott — 4, azonosítószámú

-7szekwscía.), és termeszeiben eiöíbrdtdö aUélikiis: vartasuk. Egy elősyös natív szekvenciája SvS szekvencia a 2, ábran be»mtatott teljes hosszúságú natív szekvenclájö humán Bv8 {2. azönosltöszáta szekvencia).

A _wBv8«vanátttsok” olyan biológiailag aktív Byő-poiipepdáek, síselyeknek az mulnssav-szekvenelája kídöshSstik a «stlv szekvenciáid SvS-4?oiipeptídétŐk mint például a 2., 4. ős 6, ábrán beatüíaíott humán és egér .5 ÖvS-szekvstteíáfoi (2., 4, és 6, azonosítószámú szekvencia), azálíal, hogy egy vagy több aminosav-oláaÜHO Inzertéivé, delei alva, nrőfettya ás/vagy sszubízífttMta van a natív szekvenciába®. A. Bvg-vtaánsoknak áttaíábasr kevesebb mint idö% a szekvendsmzouossága: a natív szekveaetéjú BvŐ-eai, mint példád a 2. ábrád bemutatott 8v8-c.il <2 aronoJtószarí.u szekvenciái Rendszerint azonban a bhílogmiíug aktív Bvk~variáo:sok amínösav-szekvescíája legalább körűtalití 78% amfcossv-szeks'eneis azöSKSsságot mutat a természetbe» előforduló 8vS, mint például a 2. ábrán besratatoít tan án Rv& stntasav-szekvsneiáidval (2, azo»osltös:ta^ szekvencia), etaySseo fegaíább kőrüítaS 75%, előnyösebbe» legalább ksröitaül 8ő%_>; még előayítabbe® legalább körülbelül S$%, még előnyösebbe® legalább körülbelül 94% szekvettctaazonosságot, egyre előnyösebben legalább körülbelül 95% és legalább körülbelül 99% antínssav-szckvencia szososság kőzötbig, í %-os lépésekbe®. A B vS-varíánsok közé tartörttafc íégalább 5 amtasav hosszúságú pepíidfragmeasek, amelyek: í 5 megtartják a megttaío natív szekvenciája Bví^pbliijpepdá biológiai .aktivitását A 8vS-variá»sok közé tartoznak olya® BvS-pollpeptÍtak is, amelyekben egy vagy több amtasüv-öltatar van hozzáadva a natív Bvg szekvenciának az bl- vagy C-íermisáfisához, vagy a közepébe. A ByS-vartánsok közé tartoznak továbbá olya® Bvk-pol.ipeptidek Is, arnelyekben néhány amisosav-oldaíláne deistáivá és adott esetben szubsztíttssáta van egy vagy több mtfiítosav-oiáálláseeal, A Bvtamítaök lehetnek kovalense® módosítva, például olyas tttolekuisrésszel szubszblöálvu, amely eltér a természetbe® elbtadniö ámmosavakíöl. vagy olyan. .ammosavöldaitaecsi lehet módosítva,, amely természetben nem előforduló aminosavat eredményez. A Bvd-varíátssok íartahnszhstnak hegarsnkötö dcanént

A „százalékos ammusav-szekvencia azonosság” alatt BvS szekvenciák vonatkozásában a találmány szerint egy* potescaiis sxckw&iábán azon amjnosav-öhialláneok százalékát értjük, amelyek azonosak a Bv8 szekvenciába® lévő oldsliáneöfekafi miután a szekveneiákat egymás alá rendeztük és szükség esetén réseket építettünk be a maximális: százalékos azonosság elérésére, sem figyelembe véve semmslye® konzervatív .szübsztitúcíőt a székvenela-azonosság,részéként.-A potaeláiís By§ szekvencia M-terrnínáHs, C-termínáíls, belső helyzetit sdálcíáit, deléslóit vágy inzerelőtt sem tekinthetjük a szekvencia-azonosságot vagy tamdágiáí befolyásolőnak. Az egymás: alá rendezésre szolgáló eljárások és számítógépi programok jói ismert a szateröíele®. Egy ilye® szásntagépí program az „Al 1GA^! 2”,amelyet a Gesenttaü Inc. eég irt, és amelyet az. Aínerikat Egyesült Államok Szerzői Jogi Hivamlaban: (Washington, B, C, 2Ö559) a telbasználóí dekusnetttácíóvsl együtt benyújtottak, ahol azt regisztrálták a TXt'5I4087 számé amerikai egyesült Síiaraokbeő regiszíráeiós szám alatt,

A „kiutas ByS-ösoleköia” olyas poíipepfid, amely teljes hosszüságő Bvk-al vagy annak egy vagy több dorhénjáí tartalmazza bcterológ pofi-pepiidhez tamuáltaívs vagy kapcsolva. A ktaéra. BvS-molektdának általában legalább egy biológiai tttbjéfowága megegyezik a természetbe»elófotduiö BvS-éval. Xtstaa 8v8möiekuia egy példája az, amely epíiöp-citnk&ve van tísrtítási célból:. Egy másik kiméra Bvk-molekula egy Bv8~lm®muadhezm,

Az „epőóp-eiíttkdzetí” kfiéjezés alatt a leírás: szerinti értelemben olyan kíméra pollpeptidet ériünk, amely „clmke-poiipeptidbta’ tataáRstött Bv8-st tatalmaz.. A címke pofipepttd elégendő száma oWlámot

IÖ

2ö tartalmaz hogy epítópot bíasesífsötij amely ellen ellenanyag íemiéiteíhetö, de mégis elegendő rövid ahhoz, hogy nem .zavarja a 8v8 biológiai aktivitását. A eimke-pőlípepíid előnyösen meglehetősen egyedi, annyim, hogy az eileae termeltetett ellenanyag sem kereszíreagál lényegese» más epltőgökkal. Alkalmas slmhepobpepridek általában legalább $ ssrisiösav'sidglfeácöl tartalmaznak, és rendszermi körülbelöl S-5Ö aminosavöldadáse között (előnyösen körülbelül 9-3Ö oldalláne kő'aött). Előnyösek a pöh-hlsztidin szekvenciák, amelyek nikkelhez kötődnek, lehetővé teve a. elnskézstt febérje izolálását Ni-MTA kromaíográfia alkalmazásával (lásd példán! bladsay és mtsai., Neorö» A. 571-574. old. (i 9S>ö) 1 „Izolált BvS” alatt azt értjük, hogy a BvS meg: lett tisztítva a. Övk forráséból, vagy rekooibináns vagy szintstikos eljárásokkal leit előállítva. és meg lett tisztítva, A lisztított Bv8 lényegében mentes más polipőplídekiől vagy popliáefctSI. A „lényegében mentes” kifejezés alatt a leírás szérmii; értoleníbes azt értjük, hogy' kövesebb, adni: kőrülbelSl 5%, előnyösen kevesebb, mint körülbelül 2%, előnyösebbe» kevesebb, mint körSlbelSl í%, még előnyösebben kevesebb, mint körtllfeelól: ő,5%, és tegelőnyösebbea kevesebb, mini körülbelül S:,l% szarrnyezodést tartalmaz ínás fehérjékből..

A „lényegében tiszta” lekérje aiaít olya» .készítményt értünk, amely legalább köritIhélSl 9S?á (iömegszázslék) fehérjét terfatasz, a készítmény teljes tömegére vonatkoztatva, előnyösen legalább körtiibelíil 95%, előnyösebben legalább körülbelöl 99%, és még előnyösebben legalább körülbelül 95% fehérjéi tartalmaz, A „lényegébes homogén” fehérje kifejezés alatt olyan készítményt értünk,, amely legalább körülbelül 99% (tömegszázalék) fehérjét tartalmaz, a készteiény teljes tömegére vonatkoztatva.

A „©vS-agonlstá;’'' olya» naefekniák v agy \ együletek, amelyek rendelkeznek a natív szekvendájú 8vS biológiai tulajdonságai közül eggyel vágj· többel. Ezek nem korlátozó példái közé tartoznak kis szerves molekulák, pspbcfek és ágonisía antl-Bv8 ellenanyagok.

Az „antagonlsta kifejezést a legtágabb értelembe» aikaltnazznk, ás beletartozik minden olyan molekula, amely részlegesen vagy teljesen blokkolja, gáteljá vagy semlegesíti a natív ©vS-polípaptíd egy bfolőglsi aktivitását Alkakw antagonisís molekulák közé tartoznak spedfíkussm az antagomsta ellenanyagok vagy eilsnimyagrtragyrssnsek, vagy natív fövS-polipepíidek aridoosav-szekvenda. variánsai, peptidek, kis szerves moleksdák, stb. Egy BvS-pohpeptld agonisiálnak lágy antagomstáinak az azonosítására szolgáié eljárások iartsbuazhaíják a Bvö-pdipepüd érmtkézásbe hozását egy potenciális agonista vagy anfegonista molekulával, és detektálható változás mérését egy vagy több olyan biológiát akti vitásban, amely normál esetbeit a Bv8pöilp&pddhez kapcsolható.

A leírás szerinti éjfeknnbes 82' „aktív’* vagy „aktivitás” kifejezés alatt 8vS olyan: formáját értjük, amely megtartja a natív vagy iem-sészstben slőíbrditló 8v8 biológiai és/vagy immánológial aktivitását, ahol a „biológiai” aktivitás alatt biológiai (akár gátló, akár stimuláló) működést értőnk, amelyet a natív vagy természetben előforduló Bv8 okoz, és amely különbözik a natív vagy természetben előforduló Bv8 egy antígenfeus epííógjs eltel ellenanyag-termelés: indukálásának a képességétől, és „írmmmológiaf’ aktivitás alatt: s natív vagy természetben előforduló Bv§ egy antigsmfeís epitőpja elleni efewroag-íerndés imfekélásának a képességét: értjük..

«iíÁtfKVi ,,ονα sly m&don a· _>ypíQíö;§muag aktív” kifejts sbtt ugenisíáta vonatkozásában alkalmazzuk ...... olya» Syb-pohpeptláet értünk, amely natív szekvenciáid Sv effekfor fonkdójéval rendelkezik, A ő*8 egy alapvető effektor feskoínja az endotéliális sejtek pr»tlfemdőián& a képessége, Még: előnyösebben a biológiai aktivitás kapidáds endotebáhs sejtek proliferácidjának az indukál

-9képessége, előnyöseit sztetoidogén sejteké endokrin mirigyekben. A Bvd egy további effektor .fenkesója a képessége angíogonezis indnkálására,

A „biológiai tukpdoaság” kifejezés alatt — amikor ,,Bv§” vagy „izoláit 8vF vagy „ByS-agonístájm' von'atkozásában alkalmazzak olyaaeffi&tör vagy antigenikus felajdenságöt értünk, amelyet feözvetfenSl vagy

S közvetetten a nedv szekvenciája Bv8 okoz vagy végez (Bggeítetot -attól; hogy natív vagy denatorált s konformációja), Az sffektór ftmkttók közé tartozik az endotéliális sejtek pron&Melőjának fokozása és/vagy angtogenezís indökáiása.

A „Bv§ receptor” alatt olyas rrtöieknláí értünk, amelyhez a BvS kötődik, és amely közvetíti a Bv8 biológiai tokydonságait.

IÖ Az „eltoianyag” kikérést a lefess szerinti értefetnben a legtágabb értelemben alkalmazzuk, és specsStosan értendők atóia barnás, nem komán (példánl egér) és tomsoissáli monokfenálls ellenanyagok (beleértve a teljes hosszúságú monnklonáiis ellenanyagukat), poliklosális ellenanyagok, m«lii»p&elftkus eiteanysgek (példáid Pispeciíhm ellenanyagok) és efcnsnyag-togruensak, mindaddig, amíg matatják a kivárd fcfelógiai aktivitást,

Az „ellenanyagok” („Ab”) és „tonmnglobnlinok” („lg”) azonos szerkezed tulajdonságokkal rendelkező giikoprotemek. Míg az elfenanyagok kötösgesifsíásí matatnak spéeiííkas antigénekkel szemben, az immnnglobalísok közé tartoznak mind az ellenanyagait; mind más eiiensnyag-szeró moleknlak, amelyebiek nfees antigéa-speeibtása. Az «többi típusú polipeptidek példád! kis mennyiségben termelődnek a nyirokrendszerben, és nagyobb mennyiségben a mielómákbsa.

2& A „natív ellenanyagok” és „natív immtmglobtsimök” általában megközelítőleg 150008 ©a tnofefetlatötnegu heferoteíramef glikoprtrteísek, amelyek két azonos könnyőlánebói (t) és két azonos nebézláneből (H) állnak. Mindegyik könny titáné egy kovalens díszül tíd-kőléssei kapcsolódik egy nehézlánehoz, míg a dbzsirjd-kötések száma változik a különböző imtnanglőbaiin ízolipusók nebéziáneai között. Mindegyük debézktebam és kdmtyülánete szabályos közönként íáseon belüli dismdfíd-hldak is vannak. Mindegyik nehéziáítcnak az egyik végén variábilis dómén (V_H> vas, amelyet több államid dómén követ,. Mindegyik, kőnnydláncrtak egy va ímh > dómén: (VJ vas az: egyik végén és egy' állandó dómén a másik végen;: a köKny&iáne állandó uw?e egymás malieb helyezkedik el a nehéziánc első álbmH dpméprével, és a konnyöláne variábilis dómén egymás mellső helyezkedik el a nehéziáne variábilis domónjevel, Úgy gondolák, hogy bizönyos amwsavmídaí láncok haiár&filletet alkarnak a könny illanó és nehézioné variábilis áomének között.

A „variábilis” kifejezés arra a tényre atal, hogy a variábilis dómén bizonyos részletei nagymértékbe^ eltérnek. az ellenanyagok szekvenciái közölt, amelyek az egyes gdott cilenasyagnk kötését: és speciíitásáí határozzák meg. az adott: antigénnel szemben.. Azonban a variabilitás nem egyenletesen oszlik el 82 élte· anyagok variábilis doménjeitost. úárom szegmensre koncentrálódik, amelyeket hlpervaríábilís régiónak neveznek a könnytlláne és nehézltoe variábilis doménekfees, A variábilis: demések erősebben konzervált részleteit vázrégiöknak (ER) nevezik, A natív jmbézláncok és könnynláncek variábilis doméujei egyaránt négy FR-t tartalmaznak (FR1, ER2, FR3 és FR4), amelyek nagyjából β-redö koaflgaráciőjúak, melyeket három hipeivarláfetlis régió köt össze, amelyek torkokat alkotnak, és egyes esetekben a β-rmfös szerkezet részét képezik. Az egyes láncok hipervarlábtiis régióit szaros közelségben vannak az ER~ek révén, és — a másik lánc

4Ö hipervanáhtlis régióival együtt......hözzáíwinto az elfemtsyagok antigén-kötő bolyénak a, kialakításához [lásd

- 10Rabat és mísái., „Secgtenses of Frotem of femnnölögteai interest”, 5. kiadás, 647-669. old., kiad..; Pabbc Health Sendee, National festitetes ej Heahfe, Befesda, MD (I991)j, Az. állandó áoméóek ;ne;m vesznek részi közvetlenül az ellenanyag antigénhez történő kötésében, de különféle eífcktor fankeiókat hordoznak, mint példán 1 amikor az ellenanyag részt vesz az eilenartyag-ftíggb efetofehásban,

A Jnpervanábíils régió kifejezés alfe a leírás szerinti értelemben az eilgosaysg olyan aminosavofeilánssaí értjük, amelyek az feígémböíésért felelősek. A bipsrvaríábills régió a „komplementaritást meghatározó régid” vagy „CDR” amfeösav-pidáliáoeah tartalmazza (azaz a 24--34, (Ll), 50-56, (1,2)-és S9-97, (L3) íááaÖámökst a könnyüláse variábilis doménben és a 31-35, (Hl), 50-65, (H2) és 95-102, (H3) otelláneokat a nebézifee variábilis doménben; Rabat és rntsai,, „Seqnenees of Pfotelns; oí imatonologfé&i

ÍÖ interest”, 5. kiadás, kiad,; Fabiie RssRfe Service, National Institmss of Health, Befesda, kíÖ < 1991)[ és/vagy a. „bipervarláfeills borok” oldaBáhcaít [száz a 36-38, 50-52, (LÓ) és 91-96. <L3> ofeliáneokst a könnyniáne variábilis feméfem és a 26-32, (Hl), 53-55. (H2) és 96-101. (H3> oldallánetfef a mhézfeo variábilis donféhfes; Chefet és LesR 5. Möi, Bioi. 196,961-917. old. (1987)]. A „vázrégső” vagy ,,F.R” oldaifártoök azok a variábilis dómén sídalláneok, amelyek nem az itt defeiák hípervariábi.iis régiókban található oldslléseofe.

IS Az ellemmyagok p-apaines emésztése két szenes antigén-kötő fragmensl fez létre, amelyeket „Fab”

Oagmeosefeek nevezőnk, amelyek mindegyike egyetlen afegés-kötő helyet tartalmaz, és; egy rezidoális „Fe” fegnvmst, amelynek a neve ama ntal, hegy könnyes kristályosodik, A pepsxiaes. kezelés egy F(ab’h fragmefe eredményez; amelynek két antigén-kötő helye vas, és így képes antigén kereszífetésfe.

Az „Fv*’ az & minimális elisnssyag-lragmfe, amely teljes afegen-ífesmerö és -kötő helyet tartalmaz,

Bz a. régió egy nehézlásc és egy kősnyíílánc variábilis döntés dimerjét tartalmsazza szoros, nem kovalens kapcsoiafeü. Bhbes a kosrflgdráóíóbas az -egyes variábilis domének hárem hipervafiábiiis régiója kölesónfeat az antigén-kötő hely kialakítására a V^-Vj. díme? felszhfe. Összességében, a hat hipervsnáb.íis régió asfigén-kötö speciíltást biztosít a?,;«iieaanyag számára. Azonban még; egyetlen variábilis dómén is (vagy egy Fv egyik fele is, amely csak bárom hipervaríábills régiót tartatom;. amelyek egy antigénre speeifiteak) képes antigén felismerésére és kötésére, habár alacsonyabb fefetáss&h ofe a teljes kötőhely.

Az Fah fragmens továbbá tartalmazza a könnyáláne állandó döménját és a nehéziáss első állandó döménját (Cffi) is. Az Fab* féagmenssk néhány oidátláne fezzáadásával kölőnbödnek az Bab féagmeftsektől a nehéziífe CBI dómén karboxi-ferminális végénél, beleértve egy vagy több slszfeíoi az ellenanyag esnkiórégiójáfeöí, A leírás szerinti; értebmfeso 1W~BH s neve annak az Fsb’-nek, amelyben az állandó fenének risztéin oldallánfe szabad tlöl-csoportot tartalmaznak. .Az F(áb^?}> «fenanyag-lrtígmenseket eteóriilég FaV fegmöíisefs pácaiként állhatták elő, amelyek között esakiő-sredetS cisztísek voltak, Fi lenen sag-feagmensek rnás kémiai kapcsolásai is ismertek.

Bármilyen; fejből szanoazö ellenanyagok ílmmangfebaiinok) „kőnnyőiáncsir két egyórfetefe) megkSlönfeztefeíd tipor. egyikébe osztályozhatjuk, amelyeket kappa (s) ás lambda ;(λ) néven: nevezünk, azok állandó fenénjefek aminosav-szekveneiája alapján.

A nsbázláneyk állandó doménjének az ámmösav-szekvendájátói függően az tomanglöbahaokat különböző osztályokba sorolhatják be, Az immonglofelmoknak. öt fő osztálya van: IgA, IgH, IgE, IgG és IgM, ész ezek közül többet tovább essportosifefek alosztályoklya (izőílposok), pékkfe I-gG-1, lgö.2. IgGX fgö4, IgÁI és; lgA2. Az immoRgkfelfek különbőzé osztályainak megfelelő nehéziánc állandó dortíáneket sorrendben.

- η ~

8, δ, e, γ β ρ «éven nevezzük, Az anmsgfebulwk kölönbözó osztályainak az alegység-szerkezete és háromdimenziós' konSguráótöja jól rsmstt

Az „elteonyss-feagmensek” a teljes hosszdságd sllenaifesg egy részletét tertslofezzák,, általában annak tegémkőtS vagy variábilis demésjét. Aze.lteoasyag-fragmessek példái kézé tartóznák az Fafe, Fab\ F(a»^:L és

S Fv feagmsnsek; diatestek; lineáris ellenanyagok;' egyíámtó ellenanyag molekulák és sz ellenanyaga fesgntóosekhől álló mtol-speclflkus slfenanyagok,

A „monoklonális elfenanyag” kifejezés alatt leírás szerinti értelemben lényegében botnogén olfensoyogők. pqptóáelójáböi előállítod ellemmyogef értünk, a» a populációt alkotó egyedi «tfenssysgok azonosak, kivéve a természetben előlórdtóő lehetséges isaWtóksk. amelyek kismértékben jelén tehetnek, A

1Ö mönöklörsális etleosnyagök nagyon specífíkasak, mivel egyetlen aotigsoikas hely elfen Irányainak, Ezenfelül — ellentétben a hagyományos (poltkistolis) ellenaoyagAéstóiményekkek amelyek tipikusan kátösbóző determinánsok (epitópök) elleni: különböző ollensnysgokat lartalmaznok — mindegyik mönokhmálls eSetmyag az antigén egyetlen determinánsa elten irányai. A „ntonokteábs módosító jelzi az: ellenanyag azon jellegzetességét, hogy ellenanyag ellenanyagok egy lényegében tetősén popoláolőjáböl származik, és m éríetemzertdő égy, hegy az ellenanyagot bármilyen adott eljárással kellene előállítsak. Például a találmány szerint alkalmazható .ipooeklonáiis ellenanyagokat eíőálliítottek a híbrldőma eljárással, amelyet először KoRter és mtssk írtak: te (botoré 256, 495, oltó (1975)), vagy rekombináns DNS eljárásokkal is slőálfeteuk fissá: példáid .a. 4 816 567. száma amerikai egyes® államokbeli szabadalmi iratot). A „msaeklosáíls ellenssysgokaí” Izoláltoijtsk efeanyag-fegkőn^táritkből a Claefeos és mtsai, [Natúré 352. 624-628, old. (1991)) és Marka és mtstó, p, Moh Bioi. 222,5§ 1497. old. < 1991 )j által feirt módszerek altolmazasával.

A leírás szerinti értelemben a moteklonáíis ellenanyagok magokban foglalják a „klstóra” ellenanyagokat (ímmimglobeitekaíj, amelyekben a úehézlánc és/vagy kőonyíthinc· egy részlete azonos vagy homológ, egy adott fejből .származó vagy egy adott elienaítyag-ösAáiybg vagy alosztályba tartózó ellenanyag megfelelő szekverteiájsvak míg a láse(ok) fennmaradó része azonos vagy homalőg egy másik fejből származó vagy egy másik ellenanyag-osztályba vagy alosztályba tartozó ellenanyag, megfelelő szekvenciájával, valamint ilyen ellenanyagok. fragmensclt, mindaddig, amíg azok a kívánt biológiai aktivitást mutatják (4 Sió 567. számú amerikai egyesalt államokbeli szabadalmi irat; és Mornsett és tntsai., Prse. Natl. Asad. Seb USA 81,6851 -6655, old. (1984)1.

Nem tornán (példáid egér) ellenanyagok „humaoteálf' tormái olyast kímérá ellesmnvug, k amelyek minimális mennyiségit szekvenciát tartalmaznak a sem humán mmmngltettófeől, A legtöbb esetben a háfWife® eilénátiyagek barnán immaísglohalinek (reclpteos elteuatiyagok), amelyekben a rceipieus bipsrvariábílis régiós oldailáneái helyettesítve vasnak blpervariábíUs régiós oidaiiáncokkal egy sem; borsán fejből; (donor etesuyag), mint például egér, patkány, nyúl vagy sem tornád főemlős, amely a kívánt speeifeássa), sfelsiíássst és kapacitással rendelkezik. Bizonyos esetekben a humán hníuusgiobultó vszrsglé <FR>

oldálláneait: helyettesítjük a megfelelő nem tornán olőáliáneokkal. EzesfelSl a humanizált ellenanyagok fatolmszharnak olyan öldtoánc&kat, amelyek nem találhatók meg a. reeiptens slteoanyagton: vagy a donor elfenssyagfean, Székét a aiódoskásökní az efessyag: stófeődésóeek további imomtosa végett bájtjuk végre. Áltálában a toomsízáli ellenanyag, teftóímszhmfe legalább egy, és tipikusán kettő variábilis dómén lényegében egészét, amelyekben g hlpervartábilís régiek égésié vágy lényegében egésze megfelel a nem tornán tomnngtótohtótóak, és az FR-ek egésze vagy léhyegéton egésze meglétei a humán immtmgfebuhn székveseiának. A homamzók elfemmyag adott esetben tartalmazhatja immnnglóbulln állandó régió (Fej fegalábt egy részét, tlpifaria» a kutató imtetsnglöbaliríét, Tsvsbhi részletekért lásd'. Jones és mtsaL Matere 32.3., 522-525. old. :(198ö);: Rsiehtegns és ortsat,, Matere 332,323-329. old. (1988); és Fiesta, Cnrr. Op. Símet Bioi. 2,593-596 öld. (195X2).

és ezek a áomonek egyetlen polipé	ptld-láncon találhatók, Alt&iátó» az Fv poiipeprid továbbá tartalmaz egy
pollpeptld kspcsöldíKötekwlöí is a felvegye az anrigén-kStéstez sziíksé Fharteaeolögy oí Mosocltóaí Auíil	IÁ; és ¥;. áomének közöd, amely lehetővé teszt az sFV számára, hogy ;gés szerkezetet. Az sFv-t tárgyaié összefegldlésőrt lásd: Flacktlmn, „The Íödísá í 33, 269-315. old,, szerit.:: Rosöíbtng és Möore, kiad,: Springer-
Vsríag, W York (1994).

A ..diatestek” kifejezés ah	att kis «Itenanyög-feagmeaseket értőnk két anrigén-köíö hellyel, amely
Iragwnse.k nebézitóc variábilis dóm	érti (V5Í) tartslíaazrmk hoazákapesolva egy kősnyblásc variábilis dotnáshez

íeptld-iájíess íVs-V·,}- Olya®, kspcsoiomolekala aikahnazósával,. amely

hogy lehetővé tegye a km dómén p; doínénjével való párképzésre kénys	árképzését ogysstetzon a láncon, s öoménsfcrt a másik iám komplementer zertthetfök, két amigén-köta helyet kiaiakitvu. Diatesteket résztetesehheít
ismertetnek példás) az alábbi iroda)	ml helyeken;: EP4Ő4 097. szórná emopsi szabadalmi írat: WO 93/11 lói.
szórná nemzetközt közzétételi írat; i	és Melíluger és mtsai,., Froc. Matt. Ágad, Seb USA 90, 6444-6448. old.
(1993).
A ,,lineáris ellenanyag” kiri	jesés alatt a leírás szerinti értelemben a Zapata és mts=rt. (Protein Eng. 8,
1057-1062. old. (1995» által leírt c	llenanyagökat értjhk.. Röviden, ezek az eitensnyagök egy pár tandem M
szegmens! (VH-Cí., 1-7)--6)-4) teste #>? ΙίΦΛίΟίΧίί^-Λ'Λΐ'· Í/Mxwdx'l.olé' l*XCí\í\Z' !,y> LbiJC-'ii'·	imaznak, amelyek egy pár antigén-kötő régiót atemsk. A lineáris <>»,ÍS’<> «ΐΛΚΛΰΚΛΛ-'ίίνΗβίίν
VíK.ííítíiJ e^vK Az „epitáp kifejezés alatt i szántára szolgáló kötőhelyeket: értitek	. Υ<Λί0· jAívUvspv^i.UivuSíi.K' őhfirjeantigénsksa található eliessnyagek (moooklönáKx vagy poirklonálls)
Az „agosisía eifeoanyag ki	ifejezés alatt olyan ellenanyagot értünk, amely BvS-agotesía, és ily módon
tendffezik a nstív szekvenciójá 8v8	egy vagy több htalögmi tulajdonságával.
A „Svd-btstnnadbezin'’ kíl	iejezést felcserélhető teádon alkalmazzuk a „Sv& hnístteglotedía kiteéra
kifejezéssel, és olyast kánéra ars&ki	jlát ériösk alatte. maeiyfees a BvS-teölekula (siadv vagy variáns) legalább
egy részlete és égy iBMWgtefeulín s? gént szökségszerílen......mnmmgiob;	zekveneia van kotebisátva. Az imnmsgíöbuhn szekvencia előnyösen —- de uhn állandó dosten. Az imfnanadhezloek a humán ©l&nasyagek számos
értékes kémiai és biológiai telfedor	ságával «tedsikezheíoek. Mivel az itemusadteziheket kívánt spseiíitósá
humán fehMjeszekveoeiábói állíthat·	ink elő megfelelő humán Immnnglofenlin csokid és állandó dómén (Fel

mamimé sapcsmv^ a jsimsow:	gget mro xmospeennast rspessegeoen rummá Köteponenses ajwmaxasmt
érifejők < Az ilyen immrmadöeza	x;k csak msmmálb mértékben immoootterdfersafc a páciens számóm. ős

ügosafe krónikus vagy ts;

A terápiás aikahnazásm 1	dri hömomulrtteer immtmadhezmek. példái közé tartozik a CD4-lgG
kmmmadhezm a HÍV sejtfelszíni	CD4-hez Rrttdnő kötődésének a blokkolására. Egy 1. fezlsá klinikai
vizsgálatból — amelyebben CD4-4gí.	.»-$ adtak be terhes nőknek éppen a szülést megelőzően — nyert adatok azt
sagalják, begy ez az inmwadfeeri	in hasznos tehet a 541V anya-magzat közötti átadásnak a megelőzésére
(Ashkenszi és ártsál.,. tóéra, Rév. Irt	mmnoh lő, 219-227, old. <1993)]. Olyan immrtnadbexixrt is kifejlesztettek,

- ηamelyik a tamoraekrózís-táktorhöz <TMF) kötődik, A TNF egy prolnfiammatorikus chekín, amelyről kimutatták, hogy a szeptikus: sakk fS közvetfanysga, A szeptikus sekk egérmodellje alapján egy IWmseepíor mmmsdhezm ígéretesnek möteíköZötí a szeptikus sakk kezelésére klinikai afamazásokhsn (Asbkenazi, A. ás mtsaí, Píöc. háti. Akad. Sek USA 8§, 18535-10339. old. (1991)]. Az ENSftEL* (efaereept)......amely egy

TNF-reeepter szekvenciát IgG Ee-régióhoz: fözionáiiaiva tartalmazó nmanadfeéiáa — engedélyezve lett reumátok! arteifisz. kezelésére az Amerikai Egyesük Álfaek Élelmiszer és Gyógyszer Hivatala (FÖA) által 1998.. november 2-án. Az EM3R.EI.'* áj, kiterjesztett alkalmazását rmunatöid artririss .kezeteken 2StXI, jútaus 8-án engedélyezte az PDA. A ΓΝΡ-blokkoiókról, köztük sz OBREL®-rél szóló friss intörmáciőéri lásd: Löveti és mlsai., 19. Bngi. J. MM 342, 763-169. old. (2000), és a kapcsolódó szerkesztőségi köpmteniár a 8:1:8-81:1,

1Ö oldalon; és Weinblaö és tsísaí., N. Bogi. í, MM 34Ő, 253-259.. old (1999); amelyet Maisi: és Taylor (Anno, Rév.

Med. Sí, 297-229; öld. (2808)] referált.

Ha az immunadbezln-szerkezet két karja különböző speciítiású, az iwmnádfecfal „bispeeifrkas: ímmunadhezfenek” nevezzük a bispocífrkus «faanyagokkal való analógia alapján. öistfa és mtsal. p. Immunoi. Mcthoás 182,123. old. (1993)] bírnak ilyen bispeeifrkds bnmunadhszint, amely az B-szelekt® és F15 szelek!® adhéziós motekalók extraeelfeláris dménjeit konibinálják, amely szelektinuk a természetben ktfiöőbözŐ sejttípusokban expresszálódnak. Kötési vizsgálatok azt matatták, hogy az igy keletkezett blspecifíkus immun,globuíin fúziós fehérjéknek javított kötekspessége ven mfeloid sejívonalhez, összehasonlítva azokkal a tnesospécitífa Immtmadhezisekkel, amelyből szármáznák,

A „heteroedfeezhv’ kifejezést felcserélhető módón alkateazzük a „klméra beieromnltímer aáhezin” kifejezéssel, és kímérs molekulák (amlnosav-szekveneiák) olyan: komplexét értjük alatta, amely-fa ax egyes kfeéta moleksiak az egyes heierömalíimer mosmmerek biológiailag aktív részletét, psldáai az sxfraesllalsris dorfajét kombinálják egy mslfisfafaiös doménfa A. „nndiimerlzáciös dómén elősegíti a kiméra moísfalák stabil kőlesfaatásáí a heterorspítiser komplexben. A mukímerizáelós dománek Immunglobulin szekvefat, fcneírt-dpzár, hidreí&b régió, hidrofil régió vagy olyan szabad liöl-esopört révén léphetnek kölcsönhatásba, amely isfermolekaláris dísznlfrd-kötést alkot s kiméra Iteterömultlmer kimére molekulái között A mhímsrizáciös dómén ímtnunglöhnliü állandó dönteni faglmazhat Ezenfelül a mtdtimfasátáós dotnéht oly «tódon módosíthattak génsebészeti úton, hogy a térbeli kölcsönhatások ne csak elősegítsék a stabil kőlesöofeatást, hanem tovább fokozzák a Ireterodímfak kialakulását monomerek keverékéből, „Kfaemkedéseket .hozunk létre a featárfelsfel első polipeptíd-láncának kis snfasav-Oidailáítesisak nagyobb oláalláneukkai (például tírozinn&l vágy irtptofasál) történő belyefahésével. .Adott esetben a kliüremkédesekhcz hasonló mérető kiegészítő „üregeket” hozónk létre a második pofagíid határfelöfetén nagy ao^inosav-öláallsneoknak kisebbekkel (például sisnínnal vagy' íreonisnal) történő helyetfesítésévd, Az imnútngiobolis szekvencia előnyösen — de nem szükségszerűen ----- i®«mnglobaiin áfadó dómén. A találmány szerinti felmérők inmístegíobulfe molekslarészét fgö_5s lgG₂, ígG₃ vagy ígG„ altípusokból, IgA, ígü, IgD vagy

5 IgM osztályokból, de előnyösen lgG_:i vagy lgö₃ molekulából álliígtk elő,

A leirí® szcrmfi értelemben s „kezelés” mód jótékony vagy kívánt kihiikaí eredmények elérésére, A lettes szerinti értelemben a jótékony vagy kívánt: eredmények nem koHátoző példái közé tartozik a issetek enyhítése, betegség ^értekéitek csökkentése, betegség stabilizált (aza nem romló) állapota, a betegség: előrehaladásának késleltetése vagy lassítása, a betegség enyhítése vagy tfati kezelése, és remlsszlfr (akár részleges, akár teljes), függetlesol: attól, hogy detektálható vagy -sem detektálható, A „kezelés” alatt érthetjük a

.. :4tóiélés wghós&zafefefcásáí fe a várható túléléssel összehasonlítva, amennyiben nem atofeazapk kezelést A „kezelés” olyan; beavatkozás, amelyet rendeífenesség kórképének a. kiaiakalósáBak megelőzésére vagy megváltoztatására halmok végre, Bwk PíegfoblSen a „kezelés” alatt ártfiak terápiás: kezelésit es pröfilaktifeus vagy megelőző itrtézkedóseket is, A kezelésre szérűtök közé tartozttak azok, akik már a rendétessségheö szenvednek, valamint azok, akikben a rendellenesség megelőzendő, Közefobbrbi a kezelés közvetlenül megel&zhdk lelassíthatja vágy másképpen csökkenttel a teles degeneráció vagy károsodás kórképét, mto például daganatsejteket rakkezelésben, vagy a sej^^ érzékesyítheil órás terápiás ágensekkel történő kezelésre,

Á „szteroidogenozis” a szteroldhoímon-bloszmtézis: hormonálisán htöukált, cÁMF-közvetkett akut szabályozása „száerotdogén sejfoklxjte, amelyet s koleszterin mobilizálása jellemez a sejtbeli raktárakból a mitöfcöudtemok külső membrápjiába, és a traaszlokáclőját a belső meutöránba, ahol a koleszterin pregnsstoioaná történő átalakítása végbemegy,

A „szísíoiáogén szövet” alatt fölyan szövetet ériünk, amely szíeroid hormonökaí termel a sderotöögfifites folyamatában. Ezen szövetek példái közé tartozóak a mellékvese, a szuporltószervek, a bél és a légzőrenászer szövetei.

A krónikus” beadás alatt az ágensfek) folyamatos beadását értjük, ellestátöes az .atet: máddal, oly módón, kegy a kiiodnláta terápiás hatást (aktivitást) hosszabb időszakon keresztül Ibnntartjuk. A. „szakaszos” beadás olyast kezelés, amely sem megszakítás nélkül, egybefüggően vas végrehajtva, hanem ciklikus természete,

A kezelés szempontjából,,emlős” tM bármilyen emlősként osztályozott állatot értünk, mint például etnbert, onts főemlősöket, házi- és mezőgazdasági állatokat, és állatkerti, sport vagy keávtdésből tartott állatokat, átírd: például kutyákat, macskákat, szarvasmarhát, lovakat, juhot, sertéseket, kecskéket, nyilakat, stb. Az esnlös előnyösen ember.

A leírás szerinti, értelemben a „daganat” kifejezés akiit sz összes neopláziás sejtnövekedést és prolitertelöt értjük, akar rosszlfíáülatu, akár jóindulatú, és: az összes rak előtti és rákos sejt és szövetet,

A „rák” és „rákos” ktfejössések' alatt olyan dztolőgíai állapotot értőnk emlősökben, amelyeket tipikusan szabályozatlan sejtnövekedés jellemez. Különös jelentőséggel bíró rákok példái közé tartoznak a reproduktív szervek rákjai, például petefészekrák, hererák, tnéferák, méhnyakrák, prtwsbstek, a mellékvese rákjai, például a mellékvesekéreg rákjai (például adrenokortikálts karoinótna) és a mellékvesevelő rákjai, tneilékpaizsmirigy-rákj pajzsmirigyrák és esdüínetnálts kareinöma,

3(1 £gy betegség „patológiája’' magában foglalja az összes jelenséget, amely árt a páciens egészségének.

Rák eseleben ebbe korlátozás nélkül beletartozik az abnormális és szabályozhatatlan sejtaövekedés, metasztázis. szomszédos sejtek normális működésének a zavarása, cifokínök vagy egyéb szekréciós termékük abnormális szinte foísza&adlíása, gyulladásos vagy Iniínunolőgiai válasz szüppresszíója vagy súlyosbítása, stb.

Egy vagy több további terápiás ágenssel „együtt történő” beadásba beleértendő az egyidejű

3.5 (párhuzamos) és egymást kővető beadás hámnlyén sorrsRáben.

A leírás szerinti értelemben „hordozók’’alatt gyógy ászatilag elfogadható hordozókul, kötöszerekeí vagy stabilizálószerekot éritek, amelyek nem foxtosak azon sejt vagy emlős .számára, amelyet kitesztek unnak az alkateazott dózisokban és: kooccníráeiőkbím. <3yskrau a gyógyászatig elfogadható hordozó vizes, pB-puíforelt: sóoklaí. Á teológiailag elfogadható hordozók példái közé tartoznak poiYorsk, mint például foszfát, citrát, és egyéb szerves savak; antiovídánsok, mint: példást aszksrhíaszv; kis tteekulátömegii: pollptetek (kevesebb,

- 15 10 mint körülbelül 10 öláteSúnc}; lehérjék, reánt példád szérutpalbumín, zselatin, vagy ímsteuglöfeaímofc; hidrofil polimerek, mint például polivinilpírrcílidon; aminosavak, mint például glieln, gíitemm, aszpatagfo, argtRÍn vagy llzín: mvteíszaeehariöok, díszaechartdok, és egyéb szénhidrátok, mint például glukóz, nxumoz vagy áteírmefe kömpleteépző szerek, mint például EGTA; «ateaífeoholok, mist például manniísd vagy sorbifol: .sóképző· ellenlonok, mint például nátrium; és/vagy nemíonos feiüieíaktív anyagok, mait például TWE©Í’^M, polietilénglíkol (PBÖ) és PLURWCS™.

A ,,bposzöma” egy kis ysziktdum, amely kúlőnfofo típusú llpldekböl, foszfoílpídskből ésöagv ielületskíiv anyagokból áll, és amely alkalmas drog indát például Bv8-polipeptid és az ellesi ellenanyag) emlősbe, történő beíaítstására, A ílpsszöma komponensei általában kétrétegű tőrtRádőban reteszödnek el, hasönlő&n a biológiai menteápohbím a lipidek etendeződésábez.

„Kismolebjla” alatt a leírás szerinti értslembes körSlbelai 5Θ0 Da alatti mobkubtöínegtl rsolekulát érltok.

A „veszköláris endotéliáhs növekedési faktor”, „VBGF”, „VEGF polipeptid” és „YEÖF febétfe” kifejezés alatt a leírás szerinti ésAdemlxar pativ szekveneíájd VEGF-et és VEQF variánsokat éritek (amelyeket

ÍS tovább defeiálnnk alább). A VSQF polípeptidet fcölösíéte forrásekből izolálhatjuk, mlte például humán szövertlpusökból vagy egyéb fortősokfeől, vagy mkombmáns és/vagy szístetikus eljárásokksl állíthatjuk elő.

A „natív szekveneiáju VEGF” olyan polipeptldet tartalmaz, amelynek az. ímtlnosáv-vrekvenelája azosds a. tértnészetes eredetű VBGF-évei. Ilyen nstív szekvenelájú VBGf-et a lerntsszeiból isoláihattek, vagy rekofoblnáns· és/vagy szintetikus űton állteatetk élű,. A „natív szekvenciáid VEGF’ klfojezés alatt specifikusan temrészetben előforduló csonkolt. vagy szakreíált fonnákat (például estraceiíuláris dómén szekveneiát), íermészethes előforduló variáns formákat (például aliematív „splielsg’Mí formákat) és a VEGF természetben előforduló alléhkus variánsait értjük, A találmány egy megvalósítási módja szerfal a RSítv szekvendájű VEGF asz- őt ismert isoforsm egyike, amelyek sorrendben 12 i, 145, lőS, 1S9 és 206 amúíssav-oldslláncot tartahnazmak, amint art az alábbi irodák® helyeken ismertetik: 5 332 671, és 5 24ö 84& számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratok; WO 98/1SÖ71, számú nemzetközi közzétételi ipát; Leung és teste, Seienee 24b, 13tlő-13Ö9. öld, (1989); ás Keck és mtsai,, Setetee 24ő, 1309-1312, old; (1989),

A „VEGF varláss pőlípeptid” alatt alább definiált aktív VEGE polipepíideí értőnk, amelynek legalább egy körtekéiül Söfo, előnyösen legalább kÖraífeeíSi 85%. előnyösebben legalább kőrölhteti 9ít%, még éhben legalább hőrdlbeití! 95%, legelőnyösebben legalább köiölbeSül 98% az aswoste-'szekveteb azonossága a natív

IÖ szekvenciáin VBGF amiuosav-sKekvensisjával, Ilyen VE ül-' variáns pollpeptidok közé: tartaznstk azoíyan VEGF polipeptidek, amelyekben egy vagy több áínlnosav-eldalku'e vau addíelonálya vagy deistáivá a natív szekvencia N- és/vagy C-tefoiinálisán, valamint egy vágy több belső helyzetű dmnenjáben.

A VEGF szek'venéía-szonesságát (akár sntínosav, akár nukisissnv) ngyanolyao megközelítési mód, glkahnazáaával határozzuk meg, mint snúí specifikusa» ismsteettihsk a GvS~eal kapcsolatosan- flasoslőfeéppen, a

Bvk-sgonístáinak és antagonistáinak a definíciói — nem korfátezö példaként az eilesanyagek — alkalmazhatók a VEGF agösistáfcra és antagönistákra,

8, Eljárások a találmány kivitelezésére 1. Bv8-wlánsok azonosítása

A találniány szerinti teljes hosszúságú, natív szekvenciája BvS-polípeptidek melled a találmány tárgyát képezi, hogy' további Bvg-varfánsokst' azotesítbafonk, áíliíhaítmk elő és alkálmazbatunk a tteáhnánv szerint

- lő Bv8-v»riánsöksi: megfelelő tutkleötíd-váltőrtatásoknak a 8v& QNS-be történő beépítésével és/vagy a kívánt BvSpoiipeptld megszhítetizálásával áOftfeatstók elő. A szakember számára nyilvánvaló, hogy az amlnossvváltoztatások megváhoztatbaiják a BvS poszt-tfanszíáeiós lalyamatait, mist példád mogvahoztaíhatják a glikoziiáeiós helyek számát és pozícióját A BvR-variánsok előállítására szolgáló eljárások: előnyösen megegyeznek a natív szekvenciájá 8v8 előállítására alább részletese» ismertetőtekkel, csak az különbség, hogy a Svtewiánsf kódöiő aakleissavval Myetíesitj&k a .natív szekvenciájá BvR-at kódoló míkiebsavat

BvS-at kódoló ísukielnsav-molekulákat alkalmazunk a találmány szerinti eljárásokban. A hemán Bv§ két teljés hosszúságú variánsát kódoló cDNS-t tmmtítmk he o; L és. 2. ábrán (L és· 2. azösoshószámá szekvenciák és a megfelelő tókóvetkcztgt«d atuinosav-saekveticiákat a 2. és 4. ábrán mutatjuk be <2. és 4.

IÖ azöBöftilószáípu szekvencia). Az egér Bv8-at kódoló cÖMS~f mutatunk be az 5. ábrán <5. azonosítószámú szekvencia), és a megfelelő kikövetkertefetf aminosav-szekvenciáí a 6. ábrán mutatjuk be (ö. azönesítószánPi szekvencia), A taíáltnáöy szenet alkalmazott polinőkféotidokat a teafcterSteteá jártas szakember számára jól ismert eljárások alkalmazásával áilltbajsk elő, mini például hibridizációval, szkrteelésssl és FCR-mődszerekkel,

Bármilyen olyan síukfemsav-szekvencía alkalmazható a 8vS oxpresszlóját irányító mkemblnáns molekulák létrehozására» amely a BvS itminosav~szekven.cíáját kódolja, EzeafelSi a találmány szerinti eljárásokban olyat; fúziós polmukleotidóf Is alkalmazhaítmk, amely a Bvk kódoló szekvenciát és egy második, heterolőg fehérjét kódoló szekvenciát is tartalmaz.

Annak érdekében, hagy teljes hosszúságú homológ cÖNS-szekveneiák&f klónozzunk meg: bármily» tájból, amelyek a teljes Bv8 cDNS-t kódolják, vagy hogy családtagokat vagy variáns formákat klónozzunk, mint például sllélikus variánsokat, a találmány szerinti cDNS-szekvenciák bármelyik részének megfelelő fragmcmsékfeői: készítsd jelölt DNS-próbákat alkalmazhatunk olyas sejt- vagy szövettípus szkríneiésére, amelyről azt híszzúk, hogy 8vg~at expresszál. Közelebbről s különböző szekvencia 5’ vagy 3·* végének megfelelő oligoöskleotldokat alkalmazbahmk hosszabb oukleol’d szekvenciák előállítására.

Szükséges letet főbb, különböző szövetekből sza-tnííző cöNS-könyvtár sZkrútelésőrs a teljes hosszúságú cONS előállitásáboz. Abban, az esetben, ha nehéz olyan cWS-klónok azonosítása, amelyek a teljes 5’ végi kódoló régiót kódolják — ami gyakran előfordul eíSNS-ek klónozásakor ~~ a RAGÉ („Rapid Ampiliicalion ofcöNA Ends”) módszert alkalmazhatjuk. A. RAGÉ egy jól bejaratott BCR-alapü stratégia nem teljes cDbiS-ck 5’ végének az amplílikáfásárs, A Clónteeh cégtől kereskedelmi forgalomban beszerezhető az. .íú &fC£-fedá JWA smólyet egyedi horgotryszekv-ensiát sartaímazó humán placentából szintetizáltak A cö\S >

3Ö: végének előálhtSsóböz, FCR-t végzőnk sz .5 -&4όί<-/ό?οφ' cDNS-en a horgtmydánelndiíő és a ? Atíe ndsi.0 tdkalíp&steával. Azíteb egv második PCR-t baltánk végre a horgonyző fáadtete és egy beágyazott 3’ iánclndito alkalmazásával a gyártó utasításai szermt, 11» egyszer cióállitöttuk, s teljes hosszúságú cONSszekvencíát amlnosav-szekveociává bartszlslbatjuk,. és megvizsgálhatjuk bizonyos jellegzetességekre, mist például trssszlteiós ínieíáclös és terminációs telpekkel szegélyezett folyamatos nyílt leolvasási fázist», potenciális szigaáíszekveneiára és végezetei általános szerkezeti hasonlóságra a Saiáiníány szerinti Bvk szekvenciákhoz.

Más megoldásképpen jelzett próbát alkalmazhatnák hshrsb,n jelentőséggel bíró szervből származó genomiáíis könyvtár szkrfeelésére az. alább Ismertetett megfelelő s/trmgc o körülmények ídkatozásával.

.SvS kódoló szekvencia vagy homológ szekvencia Izolálását poiimerázdámtreakelőval (PCR) hajlhaljtsk:

végre kát dogencrált oilgonukleötid-ltesclndítókésziet alkalmazásával, amelyeket a találmány szerinti Bv& kódoló szekvenciák ategjás terveztünk. A -reakció tetuplálja Fevera-frattszkripeiövsl (RT) «Mtofc eöHS lehet,. amelyet példás! humán vagy nem barnán ^sejlwsaíakbéí álhttmk elő, vagy olyas szöveiekböl, amelyekről isméét, vagy szí gyáraik, hogy 8v&-gós aüélját expresszáife.

A PCR-terméket szubklónozhaijok és tnegszekvenálha^ok ammk biAosifúsáta, hogy az ampHfiltíűt 5 szekvenciák BvS kódoló szekvenciát reprezsfitáisak. A PGRH'ragsíeí’st azután teljes hosszúságú cDNS'klón izolálására ha&ználhaljok különféle eljárások alkalmazásával Példás? az aíoptlrikált feagmenst megselöíhetiük és bakteriofág--cDNS-feányvtár szkríseiésére használhatjuk. Más megoldásképpen a megjelölt Ifagmcnst genomiális klmtofc izolálására alkalmazhatjuk gcnonriálís könyvtár szfefueiése réven.

PCR-teelusoiőgiát alkalmazhatunk teljes hosszúságú oDNb-szekvenciák izolálására Is, Példán! RMS~í 10 izolálhatsak megfelelő sejtes vagy szöveti forrásból, szokásos- eljárások aikahoszásávái. RT reakciót végezhetünk az RNS<en sz amplifífeáit feagmens 5’ legvégére specifikus oligooakfeoííd-láneindhó alkalmazásával az első szál szintézisések megindítására, A kapod RNS/DNS hibridet azután „gúaniax&rokksi” láthatjuk el szokásos fennináktemztefáz reakció alkalmazásával, o hibridet megemészthetjük RNáz-H-vfe ás s második szál szintézisét azután poli-E iásémdkó: .alkalmazásával indíthatjuk trieg. Ily móáoa m antpürikált:

feagmensfö! leolvasással ellentétes Irányban íaláfbatő eDNS-szekveseiákat könnyedén Izolálbstiak.

A Bv8-gen mutáns vagy oÖé&as variánsának a eDNS-klósját például PCR ídkalmazásávíil izolálhatjuk, Ebben az esetben az első eíTNS-szálat egy oiigpwóT ofigosakteötídnak olyan wRNS-feez iSrtéab híbridizálásával szmfeíizálhafjuk meg, amelyet a mutáns SvS-ailék feltételezhetően hordozó egyénben: a 8v§~ alléít ismert módos vagy fehehetöteg expresszáló szövetből izoiálhmk. és az áj szálát reverz-íranszkrifázzsl kkerjeszíhesjök. A eDNS második szálát azután olyan oligounkleotíd alkalmazásával szmterizáljak í«eg, speelistesáa híhridizál a nörtnahs geo 5’ végéhez, Ennek a két lánctadítósak az alkalmazásával azután a terméket PCR-rel amplirikáyok, alkalmas vektorba klónozzuk,_: és; DNS-szekvettálásnak vefjhk alá a szakember számára jól ismert eljárások alkalmazásával. A mutáris SvS-allél D:NS-szehvesoíájá»ak: a normális BvS-sílél szekvenciájához történő ős&zehasunlitásáva! megállapíthatják a mutáns: Bvfegéntermék fsnteojáaak sz elvesztéséért vagy megváltozásáért felelés mufációfknjf.

Más megoldásképpen genomiálls könyvtárat állíthatunk elő olyas :öbS alkalmazásával, amelyet a mutáns: Bvfealfelt feltehetőleg -vagy ismert módon hordozó egyénből áUiíottunk elő, vagy cBNS-kösyvtáraf állíthatunk elé olyan: RNS alkalmazásával, amely a mutáns: BvS-slléii felíehrióieg vagy ismeri: módon hordozó egyénből származik. Azuíán egy sértetlen BvS-gént vagy annak: bonni íven megfelelő fragmensét megjolötheijdk és próbaként alkalmazhatjuk a wgtetelő mutáns Bvk-allel azonosítására ilyen i,Onyvtárakhan. A mutáns BwSgénszekverseiát tartalmazó klánokat ezután megtisztíthatjuk, és a szekvenciájukat elemezhetjük a szakember számára jó! ismert eljárások alkalmazásával.

Ezesfehíl expresszjós könyvtárat állkhstunk elő olyan e-ÖNS alkalmazásával, amelyet például az: ilyen matass BvR-allélt feltételezhetően: hordozó: egyébben a BvSraÜált Ismert médoa vagy feltehetőleg expresszálő szövetből teolálhmfc. Ezen a módos a feltehetőleg mutáns szövet által készíteti gémerraékeket sxprasszáltathatjuk és szkrínelhétjök szokásos eilenanyagos szkrínelő módszerek alkalmazásává! a nörsnálls BvS-géntemíék elten termeltetett eiteusnyagoktetl, amint alább feicíak.

A. leírás szerinti értelemben a nnfclesnsav, pöíkrakieötld és mfkteoíid kifejezéseket felcsetélheíő módod alkalmazzak, ő& 'feáwöyete mskfetexavat ériünk alattuk, függetlenül áltól, hogy dezösiribönukteozldokból vagy rshömskSeozsdakból áifcafee, és függetlenül attól, hogy Ibszfediésztsr-kötésekeí vagy módosított kötéseket

- 18 tartalmaznak, mist péidánl feszfeniésztsr, feszferaísidáí, szilexán, karbonát, kathommeíilészter, aeetamidát, ksarbantól, tioéter, áthidalt ibszforamldát, áthidalt metilén-íószfenái, áthidalt fesztörastiáát, áíbidalt ftoszfóramidal, áthidalt: metíléa-fósáfetó, losz&rotioát, meúlfoszfonát, ibszferodittoát, áthidalt foszforodnál: vagy sasiba kótéseket Mtaa< vagy ilyen kötések kombinációit.

A nukfemsav, pollnnkleotid és :»ukieoud kifejezések specifikus magukban foglalják .a biológiailag előforduló báasöktő! {adefon, gusnin, fonót, elfoztn és aracii) ehérő bázisokból álló nakleinssvakatis. Példáid a találmány szerinti pelmukfoottd legalább egy mőáositeíi bázist tartalmazhat az alábbi; nem korlátozd példák ktSzdh S-fluoro-irmcik 5-feremp-wcft, ő-kloro-praeH, ő-jodomraoil, hspöxsnón, xantin, 4-a«etil-eÍtozín, 5(kas6oxfeidfox!;!metil}--tbvcd₅ 5-karboxÍmsíilaminöKtetil-2-tfonrtdsn, o-karbcsómeíilgmínöínetíi-umoil, dibidroöracii, h«ía.-D-galaktozil~qse.ozfo,_: inszísg Nfoizöpentsnítofosshp DroetiNgoamn, i-metil-bozln, 2,2« dí«S-&wM 2-tneíil-adénm, Emtobbgqásfoí, l-íöetsbeiiozin, 5-m«!ilchozín, Nó-adenfo, Y-melíhgusnm, 5mfötíkmúnometii-uracii, 5-sftetoxiaminomed:l-2-íÍouraeil,_: 'oéts-'D-mnímozil-qoeosm, óN-metöxikarboxifneíílumeit 5-metoxÍ-amed, d-inetűtio-Nbuzopemenii-adenin, uraed-'ő-oxiecutsav tv), v -botoxo/m, pszcudoarccsu qnsozm, 2-doeitoz,ís, foíaeííl-zrtírsyracil, .2--fon?radl, őAiomeil, S-meíiknraeíl, uracíl-S-oxíeeétsáv-ötstílészter, aracil-S-oxiecetssv (v), 5-rsotil-2-dourscíl, 3<3nnoino-3~N-2karlx)xípropil)--uraciL (aep3>v vagy lífolamino·pttdsv

Ezenfelül a találmány szerinti polmukleofid legalább egy módosítod cokor-moléktilsrószf tartahwfcfe atnely nem korlátozó példaként arafemőz, ő-tluoro-arabinőz, xilufoz vagy 'tesóz bármelyike.

Ma® szasrdékank, hogy a találmány szerinti eljárásokat a poiinskleotld: forrása szerint korlátozzak. A polsíathfeetid humán vagy nem barnán emlősből származhat, származhat rekombbíáns: forrásból, msgszínfe&áfhaiö ót vfo-o vagy kémiai szintézissel, A snRleotid lehet DNS vagy RNS, és kétszálá, egyszáld vagy részlegesen kétszáfo formában lehet.

A találmány szerint afelmszbatő nuklefosavak nem korlátozó példát közé tartoznak obgomtk&otldok. mint példái?! aatom DNS és/vagy RKS, ribozimok, génterápiás DNS, DNS és/vagy R.NS kiméfofo a DNS kölönfefo szerkezeti; formái, mint példáid egyszálá DNS, kétszálü DNS, szuperfoltekeredert és/vagy tripla hélis DNS, Z-DNS, és hasonlók. A nokfemsavakat bármilyen hagyományos módszerrel előálllthatjok, amelyet öukieinsavak nagy mennyiségben történő előállítására szoktak használni. Példád DNS-ekéí és RNS-eket kémiát tkon szintetizáShatauk kereskedelmi forgalomban kapható reagensek és szintetizátorok alkalmazásával a szskterl&Bít jól ismert eljárások szerint (lásd például Gaig „Gligoormíeonde Synlhesis: A Prsetíeal Approaolf \ kiad.- ÍRD Press, Oxford, Eogkmd.(19S3)j. RNS-eket nagy kitermeléssel áhlffea&mk elő m vs«> transzkripcióval olyan plázfoidök alkáteazilsával, mint például az SPSS (Promega Corpöfotfen, Msdison, Wí ).

Bármüyest, mRNS-transzkripmtnmál kódolt BvS-nokleinsav~szekveneiát iiikalmazhalonk a találmány szerinti eljárásokban, beleértve: különösön mRNS prekarzerok alternatív „spiíeiog -jéőöl vagy feldolgozásából smstsz.ó mRNS-tomszkrspíamokaí.

Bizonyos kőrfemcnyék közölt, amikor mcgtfovekedett sokleáz-síabiikásm van szükség, módosított:

infer-nsklsezid-kőtéseket tartalmazó tmkfolssayák alkalmazása: Isisét előnyös. Módosítóit loteromleözíd^ kötéseket tartalmazó nokiehmvakat a szakterüfofeO: jól ismert reagensek ás eljárások alkalmazásával is szintetizálhatnák. Például foszfonát, foszforotfoál, foszferodítíoát, foszforanüdáő irsemletilAbszfortimidá!, formscetál, ílofermacétál, áiizopropil-szihi, acstamldát, karbamát, dimetiléa-szailid (-CHj-SőClh), dlmetlléo40 szülfoxid feCl-irSD-CfN), dimetílémszalfen (~eN₂-SÖ_rÖN>k 2 ’-ö-alkí 1 vagy 2’••deofo-'E-Baoro-foszforeboát

- 19iöter-iutkieozidköiéssket tartalmazó uökleinsavak szintetizálására szolgáló eljárásuk jel ismert a szakterületért pásü i.ihimann és tntsai.,. Chem. Rév. 98, -543-584-, ©Irt. (1998); Schneider és mtsai... 'Feterhertrot! Lett. 31, 335. old. (1980) és az azokban sd&ett hivatkozásokj.

A találmány bfeösyos. megvalósítási módjai szerint az alkalmazott nukleotid n-artomerikus nuklsökid, $ Bgy s-íínomerikus tutldeotid specifikus kéíszáló hibrideket alkot komplementer RNS-sei. amelyben — éllertíéíben a szokásos {Egysegekkel..... a szálak párhuzamosan futnak egymással föautíer es mtsal,, Nust

Aeisds Rss. ?$, Ó62S-Ó641. old. (1987)), A mskleoíid 2N-O-metii-ribontddeotid {ínoste és mtsai,Nucl. Acfefet Rés- 75.6131-Ó14S, old, (19S7){, vagy kiméra R.NS-DNS analóg [Inoue és mtsai., FEBS Lett. 275, 327-330 old.

lö A nuklemsísvakítt bármilyen alkalmas mádon megíiszritbíspik, amint az jól ismert: a szakterületen.

Például a aakleinsavekat fordítóit fázisa vagy ioncserélő HPLC-vel, mereíkízárásos krumatográiáva! vagy góíeiekboíorézissct tisztíthatjuk meg,. Természeteses a szakember számára nyilvánvaló, hogy a tisztítás módszere részbe® fegghet a fisztitanáó DNS méretétől,

A. Bv8- kódoló szekvencia vagy ksunpletaesttere legalább 18 míideottdjáí tartalma® izolált vagy tíszxltod poiinakieutidokat (azaz kibrsdizáfódó részieteket) is tókalmazfeato'nfc- a találmány szériát! eljárásokban. Más megvalósítási módok szerbi a polinákleotirtok a Bv8 kódoló szekvencia legalább 25 (összefúggő) ntiRIeetídját, 180 nukieotidjáfc, ISÖ nrtkíeot^át vagy 288 nakleotírtjáí tartalmazzák, vagy a teljes hosszúságú Bv8 kódoló szekvenciát. A nuklemsavak lehetnek egyszálóak vagy kéíszáluák, Ezenfelül a találmátty tárgyát ofysm polisKkleetldok kepezik, amelyek szelektíven tóbridisáltták a fenti kódoló szekvenciák

7j) kotrtplsmemerehez, Előnyös megvalósítási módok szerint a polinakleotidok legalább 18,23, 58, 188,. 158 vagy 2ÓÖ nnkí.eotidot tartalmaznak, vagy tartalmazzák a Svk kódoló: szekvencia teljes bosszúságát.

Olyas míkleotid-szekveneíák is hasznosak lehetnek a találmány szermti eljárásokban, amelyek: Svb mutánst, SyS- peptirt-íragmenseit, BvS csonkolt fertnálí, és BvS ?c-hérjóket kódolnak. A fezlős fehérjéket kódoló tfelsotidok nem korlátozó példái közé tartoznak teljes hosszúsága Bv8 szekvenciákat, 8v8 csonkolt fermótl vagy' Bv8 pepbd-ífagmenseit kódoló nufcleoddok fuziosáltatva nem rokon fehérjébez vagy pepiidhez, tniní példás! egy dómén fúzlonáltatva lg Fc-doménhez, amely növeli a kapott felős fehérje stabilitását és tfeletiáejéí (például SvSrtg) a véráramban: vagy enzimhez, mist például fluoreszcens fehérjéhez vagy lumineszcens fehérjéhez, amely nsarkerként alkalmazható.

Ezenfelül olyan BvS poíinnkleortd variánsokat is aikahoazburunk a találmány szerbül eljárásokban, amelyeket -- legalább részben -- Irányított evolúcióval, például -génkeveréssel es/'vagy rekurzív szekvenciarekombinációval (5 605 793, és 5 827 458. számé amerikai egyesíti! államokbeli szabadalmi iratok) állíthatunk elő. Például ilyen módszer alkalmazásánál egy BvS kódoló szekvenciát vagy több 8v8 kódoló szekvenciát n.ik.ahnazbaivínk áj szekvenciák létrehozásának kilrulaíópontjakéní, amelyek funkcionálisan és/vagy szerkezetileg hasonló fehérjéké! kódolnak, amelyeknek megváltoztak a funkcionális és/vagy szerkezeti tulajdonságai.

A fent: ismertetett Bvk-at kódoló pohoukleotid-szekvenctákkal erősen rokon géshomoíégok is alkalmazhatók a találmány szerint. Erősen rokon génhomológok olyan fehérje-kódoló pelinokleotidok, amelyeknek legalább 8ö% az ammosav-szekvencla azonossága természetben előforduló Bvk, trónt például a. 2. vagy* 4. ábrán bemutatott érett humán BvS (2, és 4, azonosítószám szerinti aminosav-szekvencla) ammosavszekvenciájával és egyre előnyösebbek legalább körülbelül 85% és legalább körtdbeiti! 99% aminosav-2 bszekvencia azonossággal, 1%. lépésenként, Eresen rokon homológok a BvS funkcionális aktivitásaival rendelkező fehérjékéi kódolhatnak,

A találmány szedatí eljárásokban alkalmazhatunk fa) olyas DölS-vektorokat, amelyek a fenti Bv8 kódoló szekvenciák és/vagy komplementereik (azaz antiszeoxz's bármelyikét lafíateaz?#; (h): -olyas IMS5 vektorokat, amelyek a fenti kódoló szekvenciák bámnelyikét tartalmazzák működőképesen kapcsolva olyan szabályozó elemekkel,, amelyek a kódoló szekvenciák éxpressziójál irányítják: (e) olyan génsebészeti úton módosított gazdagépeket, amelyek a fenti Bvk kódoló szekvenciák bármelyikét tartalmazzak működőképese® kapcsolva olyan szabályozó eiemekkeh amelyek a kódoló szekvenciák expressziója· Irányítják a gazdassjtfeen: és (dl dlysn génsebészeti úton módosított gazdasejteket, amelyek endogén 8v8-geot expresszáhrak oxogés módon bejuttatott szabályozó elem szabályozása alatt (azaz génaktiválás).

A natív szekvenciáid Bv3 vagy a találmány szerinti BvS különféle doménjeínek a variációst például elöíUliíbafjttk a konzervatív és ttom konzervatív mutációk előállítására szolgáló bármilyen módszer alkabnazásílvai, mfei például azokkal, amelyeket: az: 5 3Ő4 934, szántó amerikai egyesalt államokbeli szabadalmi: íratbítst: fetnérleíuek, A variáció fehet a Bvá egy vagy több kodonjánsk a sztíbszlltóelóia, dsléclója vagy

IS ínzerclöja, ami a BvS ammosav-szekvenelájának a megváltozását eredményezi, összehasonlítva a ttatív szeievénciájú BvS-eal, Adolf esetben a variáció legalább egy aminosav szubsztitúciója bármilyen más amínosávval a Bv§ egv vagy főbb dotnénjébeo. Annak meghatározására szolgáló iránymutatást, hogy melyik _v amímosav-oldaliáneo! lehet; ioxerfáfet, szobszíitaálni vagy deletálm a kívánt aktivitás káros befolyásolása nélkül, a Bv& szekvoneíájáttak Ismert homológ íéhérjcmelekulák szekvenciájával töttónó összehasonlításával találhatunk, mmimaiizálva a nagyon homológ régiókban végzett aíKmosav-szekvescta változtatások szúrnák Amltípsav-szohsztltűclók lehetnek egy amínosavnuk egy másik, hasonló szerkezetű és/vagy kémiai tulajdonságú armrtosavval történő helyettesítésének az eredményei, mint például lenéin szőrűméi történd helyettesítése,, azaz konzervatív aminosav-heiyefíssítések. Az iuzerciók és deléeiók adóit esetben körülbelül 1-5 sminosav hosszúságúak lehetnék. A megengedett variációt a szekvenciában aminosavak szisztematikusan végzett.

inzerclöinak, delécióisak Vagy szubszdtűelölnsk a végrehajtásával határozhatjuk meg, és tesztelve a kapott: variánsokat a. teljes hosszúságú vagy érett natív szekvencia által mutatott aktivitásra,.

övS-pelipeptid-feagmessek szintén alkalmazhatók a találmány szerinti eljárásokban. Az ilyen ftagrnensek lehetnek csonkoltak az NAermmáiisotr vagy a C-íermioállson, vagy például hiányozhatnak belőlük belső helyzetű oldaihfecok, amikor összehasonlítjuk azokat a teljes hosszúságú fehérjével. Bizonyos tragmensek nem tartalmaznak olyan amlnosavakaí, amely nem «sszesoiáhsak a BvS-pnlípeptíd kívánt biológiai aktivitásához,

Bv8 feagmeosefeet bármilyen hagyományos módszerrel előállíthatunk. Kívánt pepildfeagmenseket kémiai úton szintetizálhatunk. Egy alternatív megközelítési mód szerint Bvk fragmeuseket enzimatikus emésztéssel úllltunk elő, például: a fehérjéi olya» enzimmel kezeljük, amely ismert módon meghatározott adott íiminosav-oldalláseőknál hasítja a fehérjéket, vagy a DNS-t megfelelő restrikciós enzimekkel emésztjük és izoláljuk a kívánt feagmeost. Egy még másik alkalmas módszer szerint kívánt poispepíiá-feagmenst: kódoló DBSíragmeosf izolálunk és amplíukálusk pslímeráz-lánereakeíova! (PCR). Λ DMS-iragmens kívánt végett meghatározó ohgonukfeoíldokat alkalmazunk S^s és 3’ láncioditókkési a PCR-bep, Előnyösen a BvS-polipeptidIfagtoeuseknek legalább egy biológiai: és/vagy immunológiai aktivitása megegyezik a natív Bvg-pobpepttdévsi.

-21 Előnyös megvalósítási módok szerint a jelentőséggel bíró konzervatív szubszíitüelóksh a® 1 táblázatban m«taíjak be az előnyös szubsztitúciók oszlopában. Ha ilyen szubsztitúciók a biológiai aktivitás megváltozását ere.'dmőnyedk, akkor lényegesebb váhozásokat — amelyeket az I, táblázatban szemléltető sznbszotéeiőlíéíú: mutatunk lse vagy az alábbiakban teszletcsebben ismertettek......építünk he a szkrinelt termékekbe.

i Táblázat

Eredeti eldadtetc	Szemléltető szubsztitúció	Előnyős szöbsztitaeló
Ab (A)	val; lés; ile	val
ArgáR) Asn (Ni	lys; gin ; asm gin hís; lys; stg	lys gin
Asp (Dl	gla	gin
•W)	ser	ser
Gte (Q)	asn	asn
Giu(E)	asp	asp
Oly (Öl ?.K<> Z'Lí Y	pro; ab	ab
MIS <:Mí Ibii)	asn;gm; lys; arg lea; vas; met; aia ; phe; norleucltí	»rg len
LeufU	norteacin; He; vai met; ala; phe	ile
LystK)	argtgín; ,asa	arg
Met(M)	len; phe; ile	lett
Phe(F)	len; val; de; aia; tyr	len
Erői?) Ser (S)	alá thr	ab thr
wm Trp (W) Tv-; VI	ser tyr; phe	ser tyr
Val(V)	|;í»íVj wíím. <ΛΚ·£. de; len; rneí; phe ab; nőtlenem	tea

Á Svg-potípeptid órnkciojának vagy immimolögisi iabjdonságauiak a lényeges módosításait elvan szíjósztitáslók kiválasztásával valósítjuk meg» amelyek szigttirihánsan különbőznek a hatásukfeau az alábbiak

1Ö iemiíartására.; (a) a poilpeptiá-gerine szerkezete a szubsztitúció tételétén, például redő vagy hélis konformáció, (b) a molekula töltése vagy iíidrofofeitása a célzott helyen, vagy (ej az oldailásc snéreie. A természetben előforduló öidallánsokaí csoportokba osztjuk az oldailfoxcok közös tulajdonságai afejpjám (Íj hidröfób; noríeucitp met, ab, vak len, de;

(2) semleges fesdroflf; cys, ser, thr;

(3) savas: asp, gin;

(4j bábkus: asm gin, hís, lys, arg;

(5) a lánc irányát befolyásoló oldaUáneok:: giy, pro; és (éj aromás; trp, tyr, phe.

-3.2A -bot konzervatív szubsztitúciók esetéit ezeknek az. osztályoknak as egyikébe fertőző ammosavaí egy m-ásik osztályba tartozóval: cserélünk kt Az ilyet). szuhsztifeált: ©Idalláneökat beépíthetjük a konzervatív szrAsztfíáeiés helyekre is, vagy......előnyösebben -.....a megmaradó (nem konzervaífe) helyekre.

A variációkat a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával állíthatjuk elő, ndní: példán! 5 .öl igosokfeötiáAfenyüöit (belyspecíőkns) muíagertezissel, aísnfe^szkenneiássci és PCR-omtagsneztssel.

Helyspoelnkas rsaiageoezis [Carte? és sásai,. Nuci, Adós Reá. 13, 4231. old, (1986); Zeller és mtsaL, Náci, Acids Rés. lő, §487. old. (1987)], kazePa-mtagsifeZís [Wells ás mtsat, Gene 34, 315. old, 0985)], resírlketős szsdéketós: íauíagertezss (Wells és mtssl., Philos. írass. R. Sec, London, SerA, 317, 415, pld, <íWŐ)l, vagy más ísntert módszerek hajthatók végre a klónozott DNS-ert a variáns Bv§ Ö-HS előállításához,

Szkcnnelő amino&av-siemzést is alkalmazhatunk egy vágy több aminosav azonosítására egy ŐsszeÜlggS szekvencia nmén. Az előnyős szkenselő atulnosavak a viszonylag kis méretű, semleges ammosavúk. Ilyen armnosavak az alanin, glíem. szedő és fesztem. Az alsóm a tipikusan előnyős szkennelő aminosav ebből a csoportból, őrivel ciunínálja az efdailáneot a Iráía-szénatosron tál, és kevésbé valősfesrö, hogy msgváltoztaíja variáns lő iáncáttsk & konformációját jCuntöfíghato és Wells, Science 244, lőkl-WS. öld. (1989)). Az alanín tipikusan azért is előnyös, mart a leggyakoribb aminosav. Ezenfelül gyakran megtalálható mind eltemefeü, mint elérhető pozíciókban [Creíghton, „l'he IhwiasR kia<k: W, B. hreeman <& Co, N.Y.- Choíbla,). Mól, Biok 150., t old, (1975)]. Ha az. álmái szubsztitúció nem eredményez elegendő mennyiségű variánst, ízosztérikus amístösavaf alfedmazhiitimk.

A Sv§ és Bvá-vadánsok előállítására alkalmas módszerek jól ismert a szakterületet;. Mivel az előnyős módszerek ugyanazok a Bv8 és Rvg-vísriánsek esetében,, az alább ismertetett módszerek alkalmazhatok a. Bv8~ variánsokra, valamint a mrtiv azekvenoíájá BvS-ra is.

Az előnyös előállítási eljárások közé fertőzik a Bv& izolálása a. golipepfid endogén forrásából, jtepBdszintézB (pepiid-szmíelizátör alkalmazásával} és rékornbháns módszerek (vagy' ezeknek a. tnódszerekoek

Iwrnlyea kombinációja!.

Az alábbi tárgyalás legnagyobb része Bv8 rskömbmáns előállítására vonatkozik BvSmuklemsavat tartalmazó vektorral Pansz&rroált sejtek tenyésztésével és a polipoptíd visszanyerésével a Sőjőeuy&zetből. Azonban a szakember számára nyilvánvaló, hogy sok más mód létezik Bv8 előállítására.

Röviden, ez az eljárás BvS-at kódoló gént lartafemaő elsődleges humán sejtek feaószibrmálását foglalja 30 magában olyan konstrukfeőval (azaz vektorral), amely egy ampliftkálható gátit [mmt például dihidroíoiáb rednkíází (BHFR.) vagy egyéb, alább fergyalt gént] ás legalább egy, legalább 150 bp hosszúságú szegélyező régiót tartalmaz, amely utóbbi homológ a BvR-gén kódoló régiójában található DNS-spekveneiával, ily módon biztosítva a Svő-gén ampliőkáoiöját. Az amplifskálbaíó génnek olyan helyen kell elnnie, amely sem zavarja & Bv^gén expressgálődását A transzformálást olyan módos végezzük, hogy a konstrukció homológ módim fefegráiődíok sz elsődleges sejtek gsnemjába, ampiinkáihstő régiót meghatározva.

A koasírukeiól lartateazö: elsődleges sejteket azután szelektáljad az aruphílkálbsíó gép vagy a konstrnkclőban megtalálható más markar réved. A marksrgéu jelenléte, biztosítja a konstrukció jelenlétét ás integrálódását a gazda genomjába. Nincs szükség az elsődleges sejtek további szelekciójára, mivel: a szelekció a második gazdában fog történni. Kívánt esetben a homulog rekombinációs esemény megtörténtél.

meghatározhatjuk RCR alkalmazásával és vsgy a kapóit ampllfikálí DNS-szekvenci&k megszekveuálásávsk

-23vagy a FCR-fragsiens megfelelő hosszának a megbaíárossisávaí, amikor a korrekt homológ integtánsokbői származó ©MS· jele» vas. és csak az ilyen feagmensekef tartalmazó sejteket szaporítjuk. Kívánt esetben továbbá a kiszelektált sejteket ennél a pontnál ampíifikálhaljak a sejtek slresszelésével: a megfelelő ampIiSkáfó ágenssel (mim példásai tnetöirexártak ha az amplfdkátató gén DHFR), oly módon, hogy a eélgén több példányát kapjuk.

Előnyősén azottfean az an?phftkáelós lépési nem végezzék el az alább ismerteteti második. transzfórtnációig.

.A szelekciós lépés után a genom DNS részleteit amelyek elegendően nagyok ahhoz, hogy tartalmazzak a t«íjcs ampli.ftkálbafó régiót — izoláljuk a. kiszéfektáli elsődleges sejtekből. Azután másodiagos emlős expresszíós gazdasejteket trttsszíöttnáfenk ezekkel a genomiábs DNS-részlétekkeí, klónozzuk azokat, és olyan klánokat szetektálank ki, amelyek tartelmazzák az atttplif?kálhaíő .régiót Azután az. smplifiká&tő régiói smpSSiká|uk ainpllftkáiö ágens alkalmazásával, ha rtssit tettük még meg ezt az elsődleges sejtekben. Végezetül tenyésztjük a másodlagos expressztős gázdasejfeket, amelyek már tartalmazzák a 8v8-at tartalmazó smpilftkáfhaíó régió több példányát, oly módsn, hogy azok expresszélják és géni és termeljék a fehérjét.

A. BvS-sí kódoló i3NS-í bármilyen olyan cDNS-könyvtárbői előáMístpfk· amelyről azt gondoljuk, hegy isrtafenazzs a ByS mRNB-t: és óetekíálbató mértékben expressz&ija azt. Ennek megfelelően a BvS DNS-í kényehnesen slőátiiihaijök például többlété hatná». szövetből előállítóit: pDW-kőnyvtárhól, A BvS-at kódoló géni genontiális könyvtárból is előállíthatjuk, vagy oiigonnkteotid-szinfézíssel.

Könyvtárakat szkrtnelöuk próbákkal (mini például BvS ellent ellenanyagokkal vagy körűibe® 2ΜΘ bázis hosszúságit ötigönukteotíáokkai), amelyeket a jelentőséggel bitó gén vagy az általa kódolt fehérje azonosítására, iervezítetk, A cDNS- vagy genömiális kőnyvtárssk: kiválasztod: próbává! történő szkrínelését szokásos eljárások alkalmazásával végezhetjsk, mrtelyekct Sambrook és mtsai. („Moleeular Cloning: A tata-gíory Mannal, kiad,; New Yosfc Cold Spring Harbor Esfeorsíory Press (1989)] könyvének Í1M2. fejezeteiben ismertetnek. A Svtat kódoló gén izolálásának alternatív módjában PCR-mődszert alkalmaznak, amelyet Sambrookés mtsaí. (mini fest) könyvének 14, fejezetében ismerteinek.

A Byd cDNS izolálásának előnyös módszere gondosan kiválasztott ollgooukleadd-ízekveneták alkalmazása különféle humán szövetekből származó oDNS-könyvtárak szkrínelésére. A kiválasztott oiigontdtleoiió-székvenciáknak elégendő bosszönak és elegendően egyértelműnek kot! lenttisk althoz, hogy a fals pozitívokat minimalizáljtík. Előnyös szekvenciákat a leírásban ismertetett, fémrészéiben előforduló Bvg-ből állítunk elő.

Az öbgosnkleortdöt meg kell jetölnönk oly módé®, hogy az detektálható tegyen a szkrlne'tí könyvárban található DNÍS-bez történő hibridizáció után. A jelölés előnyös módszere a '^?·.Ρ-νο1 jelzett A TE és poltakleottdkinéz ataltnazása, amint: az jól ismert: a szakterületen ollgpnukltaid radteakíív jelölésére. Azonban más eljárásokat Is nlkalmazbstunk: az ofígenukteoiid jelölésére, nem: ksrtatozó példaként beleértve a bfetíntlslást vagy enzimes jelölést.

A SvS-af kódoló nuktemsavat {például sÖNS-t vagy genomiábs ONS-í) replíkálődő vektorba mzertáljuk további klónozás (a DNS ampbftkáláss) vagy ezpresszsltatás eéljábel. Sok vektor áll rendelkozéSíinkre, A vektör-kom|xsnensek nem korlátozó példát közé tartozik egy vagy több az alábbiak közöl: szignálszekvetscía, replikációs origó, egy vagy több markargén, enbamzer efcnr, promöter vagy transzkripciós termitrációs szekvencia.

A íaláfmáay szerinti: 3v8-at nemcsak tózvettettül, hanem heterolőg fehérjével alkotott fúziós poíipegddkéut Is előállíthatjuk rekembináns ötön, amely beteroiőg fehérje előnyösen szignálszekvencia vagy

-24más olyan polipopíicí, amelynek Specifikus hasítási helye van az éreti fehérje vágy pelipeptid N-teradaáíi,sánát, ÁltaIában a s.d£náí»zckveocia a vektor komponense tehet, vagy annak a δν·8 DNS-nek tehet a része, amelyet a vektorba Inzertálunk. Λ heterológ szignálszekvencia előnyösen olyas, amelyet a gazdasejt felismer és feldolgoz (azaz hasítja egy szlgnál-peptidáz.s. Olyan prokarióta gaxdasejiek esetében, amelyek nem ismerik .fel és m dolgozzák lel a natív Bv^vtógnálszekveneiáí., a smgnáb/ekv;. m:ku kiválasztott prokarióta szignálszckvenmával helyettesítjük, például alkallkus: fosz&táz, pewíllfoáz, Ipp vagy hóstabil ebterötoxíh-E vezetőszckveneíajának bármely iké\ el Élesztőben történő szekréció esetében a natív szignálszckvenelát például az élesztő iovertáz vczefószekvenciájával heiyetieslihetjük :[géldánl SwAflwy«' és ®mo'erfuf?yoaf n-fakíor vezotószskvenciákkai, amely utóbbit az 5 018 183. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban

Ki ismertetik (1991. április 23.), vagy savas, foszíátáz vezetőszekvenclávsh a C A®íw giukoamliáz vezotöszekveneiávaí [EP3Ő2 179. számú európai szabadalmi irat (1990, április 4,)j, vagy a WO 9ö;13646, számit nemzetközi közzétételi iratban: (1998, november 11> ismertetett szígnálszskvenciávsl. Emlössejts® expzesszsós rendszerben a natív szígsálszekvencia (például a Bv§ pre-szckvencla, amely .normális esetben a Sv& szekrécióját irányítja humán sejtekből m v,w) megfelelő. habár más emlős sztgááíszekveociák. is alkalmasak tehetnek, mint például más állati BvS-polipeptídek szignálszekvenciái, és sszonos wgy más fajok szekretált peírpepddjsinek a szignálszekvesciái, valamint viráhs szekretorikas vezetöszökveneiák, például a ffepev záppfec glA-szignálszekveacia.

Az ilyen preknszor régió DNS~éí fázisban Egáljuk az éreti BvS-at vagy annak oldható variánsát kódoló DNS-hez.

2Ö Az expresszié» vektorok ős klónozó vektorok is tartalmaznak olyan mikiemsav-szekveneiát, amely lehetővé teszi a vektor replikáé iáját egy vagy' több kiválasztott gazdasej íbers. Általában a klónozd vektorokban ez a szekvencia olyan, amely lehetővé teszi azt, hogy a vektor függetlenül replikálódfort a gazda kroraoszőmáits DHS-étól, és replikáeíős origókat vagy autonóm replikúeiós szekvenciákat tartalmaz, ilyen szekvenciák jói istitotlék tóiönfelé báktőrlnmokbói, élesztőből és vírusokból, A pB.8.322 piázmid replikáolős origója megfelelő a legtöbb Grarh-uegativ baktériumban, a 3p plazntld origója megfelelő élesztő; esetében, és: különféle vlrálls origók (SV40, goliőma, adenovirus, VSV vagy BPV) alkalmazhatok emlőssejtekbe való klónozó vektorokban:. Általában a replikáeíős komponens origója nent szükséges: emlős expressziős vektor esetében (tipikusan az SV48 origót csak azért sikalnrazhatjuk, mert tartnhnazza u korai grontetert).

A legtöbb expresszíós vektor „ingázó vektor”, azaz képesek rephteáeiőra legalább egy egyfajta organizmusban^ de íranszfektúlbatók egy másik fajte organizmusba expresszié céljából, Például egy vektort £ eo/teban klónozunk, és azután íjgyanazi: a vektort transzfektáljuk élesztőbe vagy emlőssejtekbe expresszié végett, üteg akkor Is, ha sz nem képe» függetlenül repíikálóám a gazdasejt kromoszómájától.

DNS-t ampiilikáihattmk a gazda kromoszómájába történő snzerelövnl Is, Ezt könnyedén elérhetjük gazdaként Baetetó faj alkalmazásával, például a vektorba olyan ÖNS-szekvemba .beépítésével, amely komplementer a Sxcitózt genoralalis DMSbéhen található szekvenciával. A .Sacf//«s transzfektálúsa a vektorral a genommal történő homológ rstómbinációt eredményez, és a BvS DNS Inzerciöját. Azonban a BvS-at kódoló ggnomtahs DhlS visszanyerése benyúl uhabb, mint az sxógeh módón replikálódö vektoré, mivel restrikciós enzimes emésztésre van szükség a Bv8 DNS kivágásihoz.

Az expressziéi és klónozó vektornak tartalmazniuk kell egy szelekciós gént, amelyet szelektálható markernek is nevezünk. Ez a gén olyan fehérjét kódol, amely szükséges a transzformált gazdasejték. túléléséhez

-25és növekedéséhez szelektív tenyésztő iápközegbesn A -szelekciós géni tartaimazö vektorral nem: transzförmált gazsdasejíek nem. étnek túl a tenyésztő tápkóze^sen, Tipikus szelekciós gének olyan fehérjét kódolnak, amely (a) aníibiotlkam vagy más toxífl elfeni rezisztenciát okoz, példád ampfeühs, neotnicís, metoírexáf vagy ietractklin, (b) auvotróf hibát kompfetneniái, vagy (e> kritikus tápanyagokat biztosít, amelyek nem hozzáférhetők a komplex tápfe'Szegbök például Secr/As-ok esetében a D-alanln-racemáA kódoló gén,

Szetekeiós tetna egy példájában drogot alkalmaznak a gazdasejt növekedésének megálldására, A heterológ génnel sikeresen blanszfonnált sejtek olyan fehérjéi tennslaeh, amely drog-rezíszíenclái okoz, és ily módon táléit a szelekc-ós kezelést. Ilyen domináns szelekció példája a neomiein, mikofönolsav és bigroSncia drogok alkalmazása,

Az esslóssejtefeben alkalmazható inegíetelö szelektálható markerek egv másik példája olyan, amely lehetővé: teszi a Ev8-sukleinsav felvételére képes sejtek azonosítását, mint például OHFR vagy íimidin-ksnáz. A transzformált emlőssejteket olyan szelekciós nyomás alá helyezzük, hogy csak a transzformánsok adaptálódnak a marikét felvétele által a túlélésre. A szelekciós -nyomást a rtanszformánsok olyan körülmények között történő feayósrtésével érjük el, amelyekben a szelekciós ágens kottceatóciója a íápközegben fokozatosan változik,

Ϊ 5 ezáltal a szelekciós gén ás a Bvg-at kódoló DNS ampa fikáeióját érjük el, Az ampitdkáeiő az a folyamat, amely átel a növekedéshez kritikus fehérje termeléséhez jobban szükséges gének tandem megismétlődnek a rekotabínáss sejtek egymást köveié generációinak a kromoszómám. Az atsplifíkált DNS-ről & Bv8 megnövekedeti mennyiségben színtetizákMík, Az ampkdkálható gének más példái közé tartozik a ntétallotíonein-f és -11, előnyösen főemlős metállofiönefo gének, adenozin-deammáz, oraitm-dekarboxíláz, stb.

Egy előnyös vektorrendszert: ismertetnek az 5 Sói Ő53, számú amerikai egyes ölt államokbeli szabadalmi ítatb&a, Példás! a DDFR szelekciós génnel transzformált sejteket e'oször az összes feanszformáss olyan íápkózegben történő tenyésztésével: azonosítjuk, amely metötrexak í (Mt\) tartalmaz, amely a DBFR kompetiflv agonístája. Amikor vad típusú OTFfe-t alkalmazunk, megfelelő gazdasejí a kínai hörcsög petefészek (CMC) sejtvönsl, amely deffeiens DHFR-áktivItásfa. ez; á »ejlvonalaí IJriattb és mtsat. leírása .szerint Silifjúk elő és szaporítjuk [Proc, Natl. Acad. Sei USA ??, 4216. old (1980)], A Panszfbrraált sejteket azután növekvő mennyiségű metotrexát hatásának teszzök ki. E? a DHFR gén több példányának a szintéziséhez, vezet, és ennek következtében az expressziős vektorokban található más DNS, mint például a Bv8-at kódoló DNS több példányához ss Ezt az ampliíikáclós módszert alkalmazhatjuk bármilyen más alkalmas gazdával is, példáid az. ATGC No.. CCEöí CtíO-K t sejtekkel, függetlenül az endogén 034FR jelenlététől, ha például az Míx-te erősen reKtszlens mutáns DSFR gént alkalmazunk (EP 1 í? öőík számú európai szabadalmi Irat),

Mas megoldásképpen olyat) gazdasejteket fkSlSsősen endogén DHFE-t tartalmazó vad: típusú gazdasejíeket) szefektálbstak ki, amelyek transzforntów vannak BvS-at, vad típusú OF1FR fehérjét: és egy másik szelektálható markért, márt például ammogilkozid-a’-fosztetranszferazt íAEfl) kódoló DNSszekvenciákkal, olyan íápközegen történő tenyésztéssel, amely a szelektálható marker szelekciós ágenset, mint .3.5- például amiímglíkozid: antíbiofikumot, például kanamieint, neomicíst vagy <3418-rt tartalmaz (lásd a 4 965 199, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot).

Élesztőben alkalmazható szelekciós gén az VRp? élesztö-plazmidon jelen lévő irpl gén [Stinchcomb és mtsai., Hature 282, 39. old. (Iv29)j. A teljes gén szsiekeiös markért tartalmaz olyan mutáns élesztő törzs számára, amely sem képes növekedni triptofás: hiányában, mint például az ATCC Ne. 44Ö7S vagy PE3M-1 tötzs [Jones, Geaefics 85, 12, old. Í19?7)'j. A ppl hiba jelenléte az élesztő gazdasejt genomjában hatékony

2δ környezetét bifeosrt s íranszförmácló detektálására. tríptefe blányábím történő tenyésztés révén. Hasonlóképpen, a őíSí2-deőcfens élesztő törzsek (ATCC 20 622 vagy 38 626) kompteutentál hatók a Ica? gént hordozó ismert pfezmidokkai.

Ezenfelül a pKD! l,ő gm etrkidáris gfezmidböl sztornó- vektorok alkalmazbalók k'&yvero»?y<?es 5 élesztők temszfermáiására {Sfesehl és mim,, Curr. Génét 12, 185. »10. (19S7)), líjábban rekömbfeáns borjú ktmozln nagyléptékű előállítására: szolgáié expresszlós. módszert ismertettek A fecrts esetében (Van dea Berg, Btö/Tschnology S, 135, old. (1990)). Érett rekombináns komáit széramalbotam szekréciójára szolgáló, stabil, több példányszámú expressziás vékíorőkat is feltártak A6ow?rzvg;m ipart törzseinek az alkalmazásával (Fle«r és mísak, BiözTeekrtoiogy 9, 968-975. old. (199i )1.

l ö Az expressziés és kibaszó vektorok általában olyan promótart tartateazaak, amelyet felismer a gazdaszervezet, és működőképesen kapcsolva ven a Bv8-sukteinssvboz. A promóterek nem transzlálódó szekvenciák a steuktúrgás start kadetjától {általában körülbelül 198-1Ö0Ó bp-on belől) leolvasással eltesléíes irányban (S’j, amelyek szabályozzák azon adod nakteínsav-szekveneia, mint példán! Bvk-nukfemsav-szekvenafe transzkripcióját és transzláciöyát, amelyhez működőképesen kapcsolva -varnak, Az ilyen promófetek tipikusan .15 kés össdáíybá tartoznak, indukálható és koastibrtív pramóKrek. Az indnkálhatő promáterek olyan premőterek, amelyek egy DNS megsövekedstl szántó teássztolpéiőjáí kezdik meg valamilyen tenyésztési kőíóuhény megváltozásának a hatására, példáid egy- tápanyag jelenléte vagy hiánya, vagy a hőmérséklet változása hatására. Jelenleg nagyszómó, kólönfete potenciális gazdasejt által felismert promőíér ismeretes. Ezeket a prométereket működőképesen kapcsoljuk Bv8-at kódoló DNS~hez ágy, hogy eRávoiiljnk a promötert a forrásai szolgáló DNS20 bői restrikciós enzimes, emésztéssel, és az. izolált promőter-szekvenesát bslnzvrtáijuk & vektorba, Mind a natív BvS promőter-szekvesefe, mind számos heterológ premőter alkalmazható a Bt 8 DNS közvetlen arsplifikálásárs és/vagy expresszáitafesára, Azonban a bsteroióg promőrérek az előnyösek, mivel azok általában nagyobb mértékű tmszfcrtpoiől és Bvg magasabb kitermelését teszik lehetővé, összehasonlítva a natív BvS promőterrel.

A prokariófe g&zdasejtekben alkalmazható promóterék közé fertőzik a β-laktamáz és laktőz promóter25 rendszer (Cbasg és mísak, Matere 275, 615. old. (1978)}; Goeddei és mtssi., Háíure 281, 544. old, (1979)1, alkallkus Toszfstáz, trtpíofán (tep) promőtérrendszer [Goeddel, bteotefe Ae.ids Rés.. 8, 4Ö57. old, (1980); E.F 36 776. számé európai szabadalmi kai}, és h ibrd promóterek, mint például» tec pronrőter (deBoer és misak, Broe. Natl. Acad, Sci. HSA. 80, 21-25. old. (1983)}. Azonban más ismert bakteriális promöterck is alkalmazhatók. Ezek nuktestid-szekvencláját leközöltek, ezáltal fehérévé teszik s szakember számára, hogy működőképesen kapcsolja azokat a Bv8-at kódoló DNSMtez jSiebenlisí és misai,, Gell 20, 2ő9, old- (70&S)K kapcsölömofekniák és adapterek áikölmazásával bárntílysn szükséges restrikciós hely biztosítására, A feakterláfe rendszerekben alkalmazbsté promőterek tartalmazhatnak Shine-DalgsrríO (S. B.) szskveneiát Is, működőképesen kapcsolva a By8-at kódoló DNS-bez.

Ismeretesek premóíér-szekveneiák enkarlőták esőiében is. Gyakorlatilag az összes eukariófe génben van egy AT~gszdag, régió megkőselűóleg 25-39 bázssnyim a leolvasással eílentéfes irányban a transzkripció ífiteiácies helyétől. Egy másik, sok gén tmnsztópeiös starthelyétől 7Ö-8Ö bázisnylra a leolvasással ellentétes irányban található szekvencia a -CXCAAT régió, ahol X jelentése bármilyen nnkleotld tehet. A legtöbb eukadófe gén 3’ végén van egy ÁATAAÁ szekvencia, amely a kódoló szekvencia 3’ végéhez a poii-A tárok hozzáadásának tehet a szignálja. Ezeknek a szekvenciáknak a bármelyikéi megfelelő modort hemzertáihatfek

4Ö eukartóta expresszióx vektorokba.

Élesztő gazdasejfckben aikalmazfeafó promóter szekvenciák példái közé tartoznak a. 3-fosziöglicerátkirtáz [Hiízenran és mtsai., J. Bioi, Cbem. 255, 2073, old. 11980/ vagy más ghkolitlkns enzimek promóíerei (Etess és mtsai., í. Adv. Enzyme Reg. 7, 149. old. (1968); Hollandi, Dinchesnistry {?, 498Ő. old. (1978)], mint példáol esoiáz, :g!íee!-áidehid-3-tbsztát-dehídrogenáz, hexokiház, plruvát-dekíffbomláz, Rsszlhírukrokmáz, glrs-kőz-6-főszfát/zemeráz, 3-fbSzfegiiceráí-matáz, piruvát-kínáz, Iríözíbszlát-izomciáz, foszlbglukóz-izomeráz vagy giukokínáz.

Egyéb élesztő promóíerek, amelyek olyan indukálható promőterek, ahol további előny az, hogy a transzkripciót a. tenyésztési körülmények szabályozzák, az alábbi gének promőterer: alkohol-debiőrögenáz-2,_: izoOÍtokróm-C, savas tbszfaíáz, a niirogémaoyagcserével kapcsolatos lebontó enzisnek, metalfotíenein:, gli:ceraláshíd-3-foszfát-dehidrogenáz, és a máltőz és galaktóz felhasználásáért felelős enzimek. Élesztő expresssíobso alkalmazható vektorokat és gromötereket ismertetnek tovább az BR73Ő57, számú európai szabadalmi ímlfean. Élesztő enbanszerek is előnyösen alkalmazhatók az élesztő promöíerekket

A Hv8 vektorokról történő ímszkfipclójat emlős gazdasejtekben például vírusok gesomjából előállítóit prömöserekkei szabályozhatjuk, mint például poliöma vírusból, baromfilnmiő vírusból (DK 2 2.11 504. számú brit szabadalmi irat, 1989. július 5,), ndennvirusbol (mint pékiánl AdenovÍrtJS-2), szarvasmarha papillömavínishói, madár szarkámé vírusból, cilőmcgalovirtssbök reírövirusbói, bepatitisz-B vírusból és legelőnyösebben 4ö~es raalsunvírusből (SV48) származókkal, betérőkig emlős promöterekkel, mint például az aktin vagy nmmingiobaiis promóterrek és a BvS szekvenciához normális esetben kapcsolódó premőterröl, amennyiben az ilyen promőterek kompatibilisek a gszdssejí-rendszerrel,

Az SV48 vírus korai és késői promőtereii kényelmesen elöáliithatjnk, mim egy olyan: restrikciós fmgtnesst, amely tartalmazza az BV4ö virális repllkáeíós origót is (Fim és mtsai.. Natúré 273,113, old, (1978); Mrtltigan; és mtsai,, Science: 269, 1422-1427, old. (1988); Pavlakis és mtsai.₅ Froc, blatt. Aesd. Seb USA 78, 7398-7482, old. (1981)]. A humán citomegalovíms azonnali korai promóterét kényelmesen előáliúbaíjak Hindiül restrikciós iragmesském (Greenavvay és mtsai.,, <3eúe 18, 35S-3Ó8, óid. (1982)]. DNS emlösgazdábas történő sxpresszáhstására szolgáló rendszert .ismertetnek a 4 4Γ9 446. számú amerikai egyesük államokbeli szabadalmi iratban szarvasmarha papillómavírus vektorként történő alkalmazásúval, Ennek a rendszernek á módosítását ismertetik a 4 681 978, számú afncrikaí egyesüli államokbeli szabadalmi iratban. Lásd még: Gray és mtsai.. Natúré 295, 583-508, old. (1982) interferont kódoló DNS msiomsejtekbeo történő expresszaltuíasurók Reyes es sntsaí,. Natúré 297, 598-őöL edd, (7982) butnán(p-ínterfertm e©NS expresszáímnisáröl egérbe». Atepm ,zö«/?,tec vírusból származó tímidin-kínáz p.romóter szabályozása alatt; Canaani és mtsai.,, Froc, Matt Aead. Seb HSA 79, 5106-5178. old. (1982) humán interferon gén expresszállatásáról tenyésztett egér és ttyúl sejtekbe!/ és Gorman és: mtsai., Froc Nati, Acad. Sci, USA 79,6777--678-1. old. (19823 bakteriális CAT szekvenciák sxpresszáltatásáról CV--1 majom véséseitekben, cs irke embrionális Bbföblasztökban, kínai hörcsög pete teszek sejtekben, Heka sejtekben és egér NH1-3T3 sejtekben a Rens szarkónta vírus bosszú terminális ismétlődésének promőterként történő alkalmazásával.

A Hv8-at kódoló DNS transzkripcióját magssabferendS enkariőtákban gyakran megnöveli enbanszer szekvenciának a vektorba történő betnzertálása. Az enhuúszerék cisz hatású DNS-elemék, smelyék áltálában 10390 bp hosszúságúnk, és amelyek a proíuőierre hatnak a transzkripció növelésével. Az enbanszerek az irányítottságtól és pozíciótól viszonylag függetlenek, és megtalálhatók 5’ [Laimins és mtsái,, Broc, Null. Acad.

Sci. USA 78, 993, old.. (1983)] és 3’ (kusicy és nússl., Alól. Célt Dió. 3, 1198. old, (1983)] irányban a

-28transzkripciós egységhez képest, 1ηί?οηο» belül [Banerji és mtsaí,, Ceti 33, 729. old. (1903)), valamint magán a kódoló szekvenciát! belül [Ösbome és nttsal., Moh Coll Bio, 4, 1293. old. (1934)]. Sok enhanszer-szekvoncia ismert emlős génekből (glohin, elászláz, alfeantin, ü-feteproíein és bizalmi. Azonban tipikusan eskanóía sejt virrtsábói származó eobanszto alkalmamnak. A példák közé tartozik az SV48 enhausxer a rephkíteiós: origó késói;

oldalán (180-270. bp), a cltomegaiovírus korai premötef enbaaszere, a pottáraa enhat-szer a replikádős origó késői oldalán és aáenovírus snhanszerek. Lásd még Yaniv közleményé! (Natúré 297, 17-18. old. (1982)) az eakar séta promóíerek aktiválására szolgáló eshanszer eteekrőL Az enbaoszen a BvS-at kódoló szekvenciától; 5' vágy é’ pozfelőbsa iszertálbatjuk a vektorba, de előnyösen a prostöiertől 5' irányban íalálbíítö.

Az eakartőta gazdaseitekben (élesztő, gombák, rovarok, növények, állatok, ember vagy többsejtő organizmusokból származó sejtaagos sejtek) alkalmazott expressziós vektorok tartalmazhatnak a transzkripció terrtúnácíójához és az mRNS stabilizálásához szükséges szekvenciákat is, Az ilyen szekvenciák általában az eukarióta vagy virálís ÖNS vagy ©DNS nem transzlálódó régióinak az 5 ’ végén, és néha a 3 ^X végén találhatók. Ezek a régiók a Bvk-st kódoló mRMS nem traoszláiödó részén pslladenflált fragmensskként ábrádé ntikleöbőszegmenseket tartalmaznák,

Egy vagy több font felsorolt komponenst tartalmazó megfelelő vektorok előállításához szokásos lígáeiés módszerek alhaltoaztmk. Izolált piazrnldokat vagy DNS-feagmenseket hasítunk, szabunk és újra ligátok a kívánt; formásra a szükséges plazmái előállítására.

Az elöálliioit plazrnidokhao található helyes szekvenciák elemzéshez a ligácios keverékeket A, tat K12 294-es törzs (ATCC 3 í 446) transzformálására alkalmazzuk, és sikeres transzformássokat szelektálunk ki szükség szerint amplciíiía vagy setraeíkün rezisztenciával. A trauszfennánsokböl ptaraidoksí állítunk elő, testrikcíós cndonukleázos emésztéssel elemezzük és/vagy szehveoáljuk Messing és mtsat. (Nncfeíe Acids Rés. 9, 309. old. (i^Q8í)l vagy Mnxam és ottani, [Methods m Bnzymology ő5, 499; old. (1988)) eljárásának az alkalmazásával,

Különösen alkatotok a Bv8 vagy Bvfovartasok előállítására azok az expressziós vektorok, amelyek a

BvS-at kódoló 8B tranziens expresszíóját biztosítják emlőssejtekben. Általában a tranziens expresszié magában foglalja olyan expressziós vektor alkalmazását, amely képes hatékonyan replikálödsí gazdascifben, oly módon, hogy a gazdssejtbon az expressziós vektor sok másolata felszaporodik, és azóta .magas szinten szintetizálja az expressziós vektor által kódolt kívánt potipeptidet (Samhroofc és ratsai., mint fent, I 6,17-16. 22. old.). A tranziens expressziós rendszerek, amelyek megfelelő expressziós vektort és gííz.dasejtet tartonazaak, lehetővé teszik a kiónozott DNS-ek által kódolt poiipeptidek kényelmes pozmv azonosítását, valamint az ilyen poiipeptidek gyors szkrinelését kívánt biológiai vagy tlziologio tulajdonságokra, ily módon a tranziens expressziöx rendszerek különösen alkalmasak a találmány szerint a Bv8 olyan analógjainak és variánsainak az azonosítására, amelyek biológiailag aktív Bvk-ak.

A Bv8 rekomblnáos gerinces sejüesyészetbee történő szintézisére adaptálható egyéb eljárások, vektorok és gazdasejtek leírása megtalálható a alábbi irodalmi helyeken: öetbing és sntsaí,, Natúré 293,628-625. old. (1981); Maotei és mtsal., Natúré 231, 40-46, old. (1979); az EP 117 068. és EP 117 058. számú európai szabadalmi tank. Egy különösén alkalmas plazmái a BvS emlős séjhenyészetbéh: történő expressziójára a pRK.5 (EP 387247. száma earópai szabadalmi irat) vagy SV16B (Wö 91/08291. számú nemzetközi közzétételi irat, 1991. június 13.).

A találmány szerimi vektorokban lévő: DNS klönozására vagy expresszaltatására alkalmas gazdasejtek prrxksriöta, élesztő vagy msgásabbrendü eakaríéta sejtek. Az erre a célra alkalmas prokadőtáfc közé tarieznttk az fej&öfeíe, mint például Gram-ncgativ vagy Gram-pozitiv organizmusok, például Astet-őhíseíertocene, mint például Ascfevfehra, példás! A. coA, &;Vre«fec.W, Amsífe, A'Áfefeltó, Froíess, AáAnóoefép pélrklul SaAsoíKí/fe fj.’p/ííWÍ<rf;íí?!j ^éfrofjfe: példáéi érőmön J«ww és Sótgelfe, valamint BocíIöo', mint példás! A. sköíIíís és <9, (például a § liehtmíförmis 419, amelyet a DD 2őö 710. számé szabadalmi iratban tárnak fel, 19S9. április 12.), /^gW< «««ως mint példás; Λ öerayúazm és ÍSfígríotBycav, Egy előnyös: £ eoA klónozó gazda szél co/*‘ 294-es törzs (ATCC .31446), habár más törzsek is, mint például az £. -cott 8, £. coll XI776 (ATCC 31537) és £ vo/i W311Ö (ATCC 27325) is alkalmazhíitö. Ezek a példák szemléltetők, semmint korlátozók. A W311Ö

H) törzs, különösen előnyös gazda vagy szölőgazda, mivel egy gyakori gazdatörzs rekomblnáus DNS termékek: fermentálására, bidnyösea a gazdasejtnek minimális mensylségö proféoilílkus enzimet szakad szekretálnis. Példás! a W31I0 törzsei módosltbatjuk: oly módon, hogy genetikai mutációt épitsank be a fehérjékéi: kódold génekbe*, például elvan gazdákba, snrní E, W31 iö 27C7 törzsébe. A 27C7 törzs teljes genotípusa íorsAAptr3phoAAl!5ísrgF-!ao)169ompTAdegF4lkaa', A 27C7 törzset 1991. október 30-án helyezték letétbe: az ’Aswwb Type Cukoré ColleebonMáí ATCC No, 55244 szám: alatt. Más megoldásképpen mutáns penplazmafekss proteázzal rendelkező, a 4 946 783. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi: iratban <7990, augusztus 7.) Ismerteted < coo törzset alkaimazbaiunk.

A prokurióták mellett: eekarlóta mikrobák, mint példát;! kmalas gombák vagy élesztők is alkalmasak BvB-at kódölő vektorok klónozására vágy expmsazáltatásárá. A. (fecoóoronpvrs eerewmc, vagy közönséges sStoéiesztÖ a. leggyakrabban alkalmazott alacsöoyabhrendü etikát fosa gazda-mlkroorganizmus. Azonban számos más nemzetség, fej: és törzs hozzáférhető és aikateazhatő a találmány szeren, mint példán! s ScbAftsaechűremveer pombe (Beacb és hnsai·, Natöre 290, 140, old, (1931); BP 139 363..· számú európai szabadalmi irat (1935. május 2,)}; A'/mverornyem’ gazdák (4 943 529, számú amerikai egyesült államokbeli: szabadalmi irat; Pleer és mtsal., mint fent) mint példán! K. faatis [M4V9&-8C, CBS683, CBS4574. Louveneöort és .cotsat., J. Bacfériol. 73? (19S3)j, K. fragilis- (ATCC 12424), A. .és/garfcw (ATCC lő 045), K. wickeratmí (ATCC 24 178), £ w&t/ (ATCC 56 509), A'. dfatsaphiiarwi (ATCC 36:906; Van den Berg és mtsal., tslnt fent), JC ihertíioteieretts és A, mt&w,jwwmw (Eb402 226. számú európai szabadakul irat); Bfebút pas/or/s IBP 183 070, számú európai szabadalmi irat; Sreeferishna es jruat. J Ba-we Muuobvú 28, 265-2~8 old. 11988)1; l. ’Wk’w r , >> 7 >« , *„ , 24t 2 < 5 %>u .a tót, r< . szefeda m, m ' Wp ;·., > t [Ca--*, és mtsut,

Proe. Mail. Arad, Seb GSA 76, 5259.5263. old. (1979)}; ócAavmnAjínyeus, mini: például átcfevppfíídsg’ees oemrámíidb ΙΈΡ394 538. számú earöpái szabadalmi: Irat (1990. öklébe;· 31.)]:; és fonalas gombák, mint: példán! ATt^osporn, /feííííóímví, TíJApocfédíH»: (WO 91/00357. szántó nemzetközi közzététel) ;rat i1991, január 10.), és .•ijpcf-gl/hö' gazdák, mint például A «hfetes [Baflance és rafsak, Blöcbem. bíóphys, kés. Commnn. 112, .284-289, old. (1983); Tilbum és tutsaí, Gese 26, 205-221, old. (1983); Volton és tutsat., Fene. féatl. Aead. Sói.

USA 81, Í4?0~i4?4. o!d, (1084)jésA. «(gén(Kelly és mtsal, EMBO i. 4,475-479. old. (1985)(.

Gbközllálf Bv8 expresszálfétására alkalmas gazdasejtek többsejtű otganlzmusokböl származnak. Az ilyen gazdasejtekképesek bonyolult feldolgozásra és giikoz;lúeiós aktivitásra. Elvileg bármilyen ímtgítsabbwdd esskanőta seltteeyészst múköáhei, akár gerine.es, akár gerinctelen tenyészetből. A gerinctelen sqtsk közé tartoznak riövényi és rovar sejtek. Számos: hakulovírus törzset és vsuiánsr és megfelelő pern^vr, rovar

4Ö g&zdasejíeket azonos kották, mint például .φοοΒρίοηο ybigípecHO (hernyó), ztefey oegypb (szúnyog):, dedós

-5ö~ ofemzferio (szönyog), »5&feHOgítxó?r (mosiinca) és feoróyv móri [lásd például iatckow és mísai,,

HWFésáasöíögy· 6, 47-55. síd. (1988): Miller és mtsat, „Génébe Pmglneéring”, szerk.:: Setlow és mtsai,, 8. kötet, 277-279. old., kiad.: Pfen«m Pubisshing (1986);. és Maeda és mtsafe Natúré 315, 592-594. síd, (1983)'. Különféle, írasszfeketóra szolgáló virális törzsek feritefők bözzá nyilvánosan. példáéi azAaíegrcípfe ctá$zrwca

MFV L-l variánsa, és a >s.v?5yz »fotó NPV Bm-5 törzse, és ílyert vírusok aikaimazhaídfe találmány szerinti vírusként, különösen sejtek feimszfektáíására.öyapnt, kukertea, bargönya, .szójabab, petúnia, paradicsom és dohány növényi: sejttenyészetei alkaimazhaták gazdaként, I'tpikssaö növényi sejteket olyan dgroőoofeAm» bakteriam bizonyos törzseivel történő fekííbáiássai tmszfekíálank, amelyeket korábban ágy manipuláltunk, hogy SvS-aí kőtldló

IÖ DNS-t iartalíúazzöR. A növényi tenyészet J. mnyúewr-ssl íöriónő mkubálása folyamán a Bvk-át kódoló SNS. átadódik a növényi gazdasejtbe, amely Ily Riódon tmszfektált lesz, és megfelelő körülmények közóit expresszáljn. a Bv8-af kódoló DNS-t, Ezenfelül a növényi sejtekkel kompatibilis szabályozó és szigpátezékveseisk hozzáferiíetőh, mint például nopalin-szmtáz promöfer és poliadeniláeiós szignálszekveneklk [Depiete és mísaí,,. X. Mai AppL Gén. t. Sói. old. (1982)), Ezenfelül a T-SNS 780 génjének leolvasással

ÍS ellentétes Irányban található régiójából izolált DNS-szegmensek képesek növényben expresszáfoatö gének: aktiválására vagy transzkripciós színijének a növelésére a rekombináns DNS-t tartalmazó növényi szövetekben (El* 321 W. szántó earópai szabadalmi irat (19®9; június 2Xy

Asmban a gerinces sejteknek a legnagyobb a jelentősége, és a gerinces sejtek tenyészetben történő szaporítása (szövettenyészet) rutin eb árassá vált [lásd például „Tissue Culture’', szsítk,: Krnse és Pattersöa, kiad.:

Aeademfe Press·’1973)j. Alkalmas emlős gszda-sejivonalak az alábbiak; CVi Rtaíomvese sejtvossl SWEael tonszfenálvá (€08-7, ATCC CM, iőSj): húíóáú embrionális vese vonal [293 vagy 293 sejtek szaszgetóés tenyészetben szabkiónozva, Grsham és mtsaL X Genomi-álls. Vitai. 36,59, old, (19?7)j; bébihőresög. vesesejtsk (BHK, ATCC CGI, lö); kínai hörcsög pőtefeszék sejtek /'DHER [CTfö, IJriatíb és mfoaí,, Eres, Kati. Aead. Sct USA 77, 42lő, old. (1930)1; egér sertől: sejtek [TM4, MMtsr, Biok Repród. 23, 243-251. old. (19SÖ)[; majom vésesejtek (CVi ATCC CCL 7Ö); afeikai zöldmajom vesesejfek (VE8D-76, ATCC CSL-1587); humán méhnyak karamőma sejtek (HEEA, ATCC CCL 2); kutya vesesejtek (MDCK, ATCC CüE 34); böíéoypatkány májsejtek (BRI, 3A, ATCC CRI, 1442); humán íüdösejtek (WI38, ATCC CCL 75); komán májsejtek {Bep G2. UB 8Ö65); egér emlődaganat sejtek ÍMMT öőö5ő2, ATCC CCE51); TRií sejtek (Mather és rotsal.., Amafe N.Y. Acad, Sri. 383,44-68. old- (1982)1; MRC-5 soífefe; PS4 sejtek és hatóan hepatóma sejíveoal (Hep G2).

A gazdasejíeket tr&nszfektóijuk és elönyősefi transzformáljuk a fest ismertetett Bvd-ternteiésre szolgáló expressziós vagy kiésozö véktort-kkal, és hagyományos tenyésztő tápközegekbe» tenyésztjük, amelyeket a promóterek teáakálásra. traoszfermánsok kiszelefeáíksára vagy s kívánt szekvenciák amphrikálására megfelelő módon módösúodtmk.

Transzfekció alatt az expresszlös vektor gazdasejí általi felvételéi értjük, (üggetfenöl attól,. hogy bámúfele kódoló szekvencia espresszáládik-e. Számos tóanszfekeiős eljárás ismeri a szakember számára, például a CaKA eljárás és eiekíröporSstó, A sikeres transzfekclóf általában okkor ismerjük fel, amikor a vektor működésének bármilyen jele megfigyelhető a gazdasejíben.

Tnmszfortnacíö alatt DNS bejüítótását ér-tók egy organíZínusba oly módon, hogy a DNS képes legye® replikáriőra, tikár kromoszómán kívüli elemként -kar integrálódva a kromoszómába. Az alkalmazott gszdasejtíől függően a transzfomtóclót az ilyen sejtek, esetében szokásos módszerekkel hajtják végre. A

-31 Sambrook és mísai. (mint fent) által az 1,82, oldalon ismerteteti,. kslcium'-klondlt alkalmazó kateámas kezelést vagy ölekfroporációt alkalmazunk általaim prokariőták vagy -más olyan sejtek eseteben, amelyek jelentős sejtfalat tartalmaznak. Az AgreóűíVeí-amí óa«gfecí<?«s-sél történő fertőzési alkalmazzuk a transzformációra bizonyos növényi sejtek esetében, amint Shaw és masai, (Gene 23, 315. old. (I983)j és a WO 89/05859. számú nemzetközi közzétételi irat <1989. június 29.) leírták. Ezenfelül növényeket iranszfektáihatunk szokásos tsitrahanges kezeléssel, amint a Wö 91(09358, száma nemzetközi köazététgli icajtet (1991, január II),) ismertetik.

Ilyen sejtfalat nem tartalmazó emlőssejtek esetében a Graham és mtsai. (Virology 52, 456*457. old. (19781) kslotum-fősziátös klcsapáss eljárása az előnyös. Az emlőssejtes gazda-rendszerekben alkalmazható trattssfortnáoiők általános vonásait a 4 399 216. számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi iratban (1983. augusztus 16.) ismertették. Az élesztőbe történő íranszfermációi tipikusan Van Sólitsgest és tnisai, |X Baeí. 13Ö, 946. old, (1977)) és Hsiao és mtsak (Erős. Natl. Aoad. Sei. USA 76. 3829, old. (1979)] eljárásai szerint hajtjuk végre. Azonban: SMS sejtekbe történő bejoítatására szolgáló más eljárásokat is alkalmazhatunk, mint példás! nokdeárts mikrolnjekclöt, slektroporáeiők intakt sejtekkel végzett bakteriális proíoplaszt-fSziát, vagy' pnlikstloHokaf, például pelibrén,. pofi-órmtfe stb, M emlőssejtek transzformálására szolgáló különféle eljárások leírásáért lásd rieown és mtsal (Methods in Enzymology 185, 527-537. old, (1999)) és Mansotsr és mtssi, [Níriare 336,348-352, old. (1988)) közleményeit.

A Ö v8-poiipeptid termelésére alkalmazott prokariöta sejteket megfelelő tápközegben tenyésztjük, amist azokat Sarabrööfe és: ratsak (mist: feni) általánosan Ismertetik.

A találmány szerinti Ev8 előállítására alkalmazott emlős gazdasejteket különféle fápkőzegekhen tenyészthetjük. A. gazáássjfek isGyésztésére különféle kereskedelmi forgalomban kapható íápközegek alkalmazhatók, mint például a Ham féle FIÖ íSigtna), minimális esszenciális tápkőzeg (MÉM, Sigma), RPMI1640 tápközeg (Sigmat és Dm’óeeev's AW{/W£<?g/t?'s Afeífáwt (DMEM, Sigma). Ezenfelül az alábbi Irodalmi helyeken ismertetett bármelyik tápközeget alkalmazhatjuk: Haas és mtsak, Maiit, Enz, 58, 44. old, (1979% 25 Barnes és másak, Án&k Előéltem. 162, 255, old. (198Ö), 4 76? 794.' 4 657 866.; 4 92? 762.; 4 560 635. vagy 5 122 <69. számú amerikai egyesült államokbeli .szabadalmi iratok; a WO 91W3431). és WÖ 87/0ÖI95. számú nortízofkezi közzétételi iratok; vagy a 36985, száma amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. Ezen tápközegek bármelyikét szükség szerint kiegészíthetjük hormonokkal esfvagy egyéb növekedési faktorokkal (mint példára Inzulinnal, transzferrtne! vagy epiderm&lls növekedési taktorml). sókkal (mint például nátriumul'} kloriddak kalcimmal, tnagnézimmmd és foszfátial),. pufferekkel (mist például FIEEÉS-sel), nakteozidokkai: (mint például adenozinnal és rioridibnel), aotihlotikumökkal (mint példán! GE^ITAMYCIN™ droggal), nronielearekkel <. amelyek olyan szervetlen vegyületek, amelyek mikromőlós tartományba eső segkonoeniráviodaíi vannak jelűn), és glükóz vagy ekvivalens energiafetzás. Bármilyen más szükséges kiegészítő anyagot: is alkalmazhatunk megfelelő köneenrtáeiókbart, ami ismert a szaketnber számára, A tenyésztési: körülmények — mint például Itőmérséklei,. pl·! és hasonlók.....azonosak az e.spressziőra kiválasztott gazdaseitefe esetében korábban léirtakkáb és nyilvánvalóak a szakember szántára,.

Az emlős sejííenyészetak temteiékettvaégénak maximalizálásának az általános elveit, protokolljait és gyakorlati módszereit megtalálhatlak a „Mamma.'ae Coll Sioteehnology: a föaetieal ApproaclA c Imit könyvben (szerk. M. Bntier, kiad.: IRL Press (I«9í ;j.

V»

- 52 A leírásban alkalmazott gazdassjtsk közé beleértendők a tenyészetben -lévő sejtek, valamint a gazdnállatban található sejtek is,

A géB-amplifiíkációf és/vagy -cxpresszlór a mintában mérhetjük közvetlenül, példnnl hagyományos Soufkemddöííai vagy Nörtxhern-bíOttai, hogy meghatározzuk az. mRKS featíszkripcíájúnak a mértékét [Tbontas, ftsoc. Natl, Acad, Sci. USA 77,S2ÖI-52O5. old, (íŐ80)j, doí-ölottal (DNS-elemzés), vagy in. situ kíőrtdizáeiővaí, snegfelelően jelölt próba alkalmazásával, a találmány szerinti szekvenciák alapján. Külöufeíe jelzéseket alkalntazltatmtk, leggyakrabban radioaktív izotópokat, különösen ^:2P-t, Azonban más módszereket is alkalfnazbatnok, mint például bioimnál módosított nukleotidok poimukleotsdha történő beépítését. A biotin avidio vagy ellenanyagok kötődésének a helyeként szolgál, amelyeket különböző jelzésektei jelölhetünk, mint

ÍÖ például radkranklidokkaí, fluoreszcens jelzőkkel, enzimekkel és hasonlókkal. Más megoldásképpen olyan etíertsnyagökat alkalmazhatunk, amelyek specifikus duplexeket ismernek fel, mint például Ö'NS-dupfexekeí, RNS-duplexeket és DNS-RNS hibrid duplexeket: vagy DbiS-fehérje duplexeket. Az elienanyssgökat megjelölhetjük, és a vizsgálati eljárást úgy hajthatjuk végre, hogy a duplexet: egy felszínre kötjük, oly módon, hogy & duplex felszínen történő kialakulása esetén a duplexhez kötődött ellenanyag jelenlététét detektálhat)uk..

Más megadásképpen mérbsíjök a génexpfesszíót infernnolögiaí eljárásokkal, mint például szöveti metszetek ímmunhisztokémiai festésével és sejttenyészeí vagy testfolyadékok vizsgálatával, annak érdekében, hogy közvetlenül meghatározzuk a géntermék expresszíöját, Az immunhísztokáíníai festési módszerek esetében sejtrniutát állítunk elő, tipikusan dehidráiássai és rögzítéssel, majd azt jelzett ellenanyagokkal xeagáiisfjak, amelyek specifikusak a kapcsolódó géstermékre, ahol a jelölések általában vizuálisan detektálható:^ mint

2:Ö példám eszimaíikus jelölések, fluoreszcens jelölések, lumíneszesns jelölések, és hasonlók. Egy különösen érzékeny, találmány szerint alkalmazható festési módszert Ismertetnek Hsu és mtsai, {Am. 1 Clín. Fath. 75, 73473Ő, old. (1480)).

Az immmthiszíekénfixi festésre és/vagy vizsgálati eljárásban aikahnaxhaíő ellenanyagok lehetnek monöklonáíis vágy políklonális eiienanyagsk, és a bírás szedni i femerteteít módon állíthatjuk elő: azokat.

A ByS-at előnyösen: a tenyésztő tápközegből áílípuk elő. mint szekretáit polipeptidek habár visszanyerhetjük a gaxdaselfek Üzátumaiból ís. Ha a. Bvd membránhoz kötött, a membránról megfelelő detergens oldat: (például Tritoo-X 100} alkalmazásával szabadíthatjuk fel, .Amikor a BvS-at nem emberi eredetű rekomblnáns sejtbe» állítjuk elő, a Bv8 teljesen mentes emberi: eredetű fehérjéktől és poijpepddekföl. Azonban szükség van a BvS megtisztítására axekombináss sejt fehérjéitől

3Ö vagy- polipeptídjeitöl, hogy olyan: keszlimzhsyeket állítsunk elő, amelyek lényegében homogének Bvk tekintetében, Első lépésként a tenyésztő tápközeget vagy llzáfnmof iecettínfUgálhatjyk, hogy eitávolltsnk a darabos sesfiötmeiéksket. Azután: a BvS-at megtisztíthatjuk a mellette található oldható fehérjéktől és polipepddekiől az alábbi eljárások alkalmazásával, amelyek a megfelelő tisztítási módszereket szendéifeiíkt ioncserélő oszlopon végzett írskelonálás: etanolos kiesapás; fordított fázisú BPLC; szíiíkán végzett kromatögráíia; kromaíofökus.'ókk; ímmunaffinitás; epitóp-eímkét kötő gyanta; SÖS-EAGB; ammóniámszöifefös kicsapás; geNzures, például Bsphadex G-75 alkalmazásával; és pröteio-A-SkpÁmwe oszlopok alkalmazása a szemíye/odesck, miül például IgG eltávolítására.

Osluiódpsltesa

-33 A Bv8 és Bv§-vatiá53sok kovalens módosításai is a találmány bltató körébe tartoznak. A kovalens módosítás egy típusa szerte a BvS-golipeptíd: egy célzott imhnosav-oldslláncát szerves duixtezáfé ágenssel F83_;géÚstpte, amely képes reagálni a Bv8 kiválasztott d'dalíáneaival. vagy az N- vagy C-tenrsrshs oldaliáneávol, A. felftiskciós ágensekkel történő dersvalizáció hasznos, például Bv8 keresztkötésére vízben oldhatatlan hordezőmátrixhoz vagy felszínhez, asti-BvS eltesanyagok tisztítására szolgáló eljárásban történő alkalmazásra. Gyakran alkalmazott keresztkíhö ágensek közé tartozik például az l.l-blsZ“ídíázoaeetil)-2-feí«fette, glatáraldehsd, .N-hldroxiszukcsnímid-észterek, például é-azídoszalíehsáv észterei, femobifenkeíös smidoészterek, például dlszaikehrlmídil-észterek, mint például 3,3’-d!tíe“bisz-(szrdíetemldibproplönáí), bl&nfeeiös maieteidek, mint például bisz-bl-tsalelmido-feS-Oktán és olyan ágensek, mist például: ®etil-3-'{(p1Θ azídolsnilj-ditlöj-propioitedát.

Egyéb módosítások közé tartozik a gteminii és siszpáragsuii oldalláneak deantidálása a megfelelő glu tamil és aszpartil oldalláneokká, prbho és Szín hidroxilálása, szeri? vagy íreonil oldálíáneok hidroxllesopöítjaisak & , foszfor? látása, a lizm, arginia és feisztidin eidalláncak a-amino-esoportjaíhak a metsiiáiása [I, E. CriHghíon, „Profeiss:; Structure aítd Molecobr Éropertíes”, 79W. old., kiad.: W. II· Bréemsn & Ca, San

Francisco (19§3)], az N-tertninálls ami» aeetiláíása, és s G-termlnálls karboxíl-csopört amidálása.

A. Sv8-pollpept»íi egy másik típusú kovalens módosítása a találmány szerint a poiípeptid natív giikoziláelás mteázaíának a megváitöztatása. A „natív glikoziiáciös mintázat megváltoztatása” kifejezés alatt a leírás: szerinti értelemben a natív szekvenciám Bv8 egy vagy több szénhidrát roolekuferészének a deletálását értjük (akár a glihoziládős helye eltávolításával, akár a gükoziláeió megszüntetésével kémiai és/vagy enzimatítes toi)i és/vagy egy vagy több olyan gíihöziiáeíős hely addícioiát, amely nincs jelen a natív szekvenciája BvB-bam Ezenfelül a kifejezés alatt értjük a natív fehérjék gííkoziláeiójának a minőségi megváltozását is, amely a különféle jelen lévő szénhidrát melekularészek természetének és arányának megváltozás-ál foglalja magában,

Qhközíláeios helyek addíeiójái a BvS-poiipeptidhez az aihibosáv-szekvencla megváltoztatásával érbeíjük et A megváltoztatást például egy vagy több szerin vagy treonin oldallứ addieíójávai vagy szubszíítáeiőlával végezhetjük a natív szekvenciáié Bv8«ban {O-kapcsoli glikoziiáciös helyek esetében). A Bvk aminosav-szekvenclát adott esetben megváltoztathatjuk a DNS-szinten történő változtatásokkal is, különösen a BvS~pplipeptldet kódoló DNS mutáltatásávaí előre kiválasztott bázlsekpái, oly módom, hogy a keletkezett fedőnek a kívánt ambosavakká mmszlálodjmmk,

3Θ Égy másik megoldás a Bv8-pohpeptlden taláihstö szénhidrái moiekukirészek számának a növelésére glíkozlüek kémiai vagy enzmiatíkus hozzákapcsolása a polípeptidhez. Ilyen eljárások Ismertek a szakterületem fed pe daui a V-0 557 b > >?0 szán u ncsrzrekön kövéret?· iratot (1^87 ve>te ezer 11 > es Apun es Vtesion temilmányát [CRC Erit. Rév, Bbehem, 259-3ÖÓ. old. (1981)].

A SvS-pofípepdden jelen lévő szénhidrái moteknlarészSfc. eitávrdliását kémiai vagy' enzimatikus úíott végezhetjük, vagy a glíközíláció célpontjaként szolgáié samtosav-oidaHánsokaí 'kódoló kodoltok mutációs szubsztitúciójával. Kémiát degiikoziláeiös módszerek ismertek a szakterületen, és ezeket példáid Hakimuddin és mlsai, jjArch. Blochem. Siophys, 25® 52. old. (1987)]ős Bdge és mteai, [Által Bíocheta. I18,13L old. (1981)] ismertetik, Pöispeptid szénhidrát molefenlaíészelnek az: enzímatiktiS: lehasitását kuiőofefe endo- és ex©gíiközidázok alkalmazásával érhetjük el, amint Tboíateura és mtsai. jAfeíh, Enzymol. 138. 350:, old. (1987)) ismertetik.

BvS egy másik, típusa kovalens módosítása szerint á BvS-p&Sípepádet küíönfele nem feherjetermészeíö polimerek valamelyikéhez kapcsoljuk, muri példán! poliéíilén-gliltoihoz (FEG), pollpropílérs-glíkolhoz vagy pollexíalkiléftekbez^ amint azt a 4 690 835.; 4 496 089.; 4 361 144,; 4670417,- 4 795 192, vagy 4 179 337, számú amerikai egyesüli államokbeli szabadalmi iratokban feltárják, $ A teíslmásy szerinti Bvfeat oly módón is módosíthatjuk, hogy kístera molekulát siakfemk ki; amely

Bv8-af tartalmaz faziosálíatva egy másik, heíerolőg poSbxtpíidhez vagy aminosav-szekvenéiához..

Egy megvalósítási mód szerint az ilye® Iáméra molekula BvS és címke-polípeptid fúzióját tartatom, amely olyan epítépot biztosít, amelyhez címke-eíteoes ellenanyag szelektíven képes kötődni. Ax epítőp-elmkeí általában; a. Sv8 amlno- vagy karhösíl-termínábsárs helyezzük, .A Sv8 ilyen, epitóp-efetkézeö tormáinak a jelenlétét a rimke-geitpeptid elleni ellenanyag alkalmazásával detektálhatjuk. Az epitóp-címke jelenléte lehetővé teszi- azt is, hogy a Bvd-at könnyedért megtssztítsök affinitást tisztítással: címke-ellenes ellenanyag y»®f másfajta: típusa affinitást mátrix alkalmazásával, amely kötődik az epíióp-címkéhez. A szakterületen ismertek különféle eímke-polípepfidek és az azokhoz kötődő ellenanyagok, Ά példák közé tartoznak a polfibIsztidin (poli~ bis) vagy polifeisztidln-glísis (pol?-his-gly)_: címkék; a fiue HA elmke-poíipepttd és aunak 12CA5 ellenanyaga [Eleid és rntsai., Mól, Gél? Bioi, 8, 2159-2163. old. (1988)1 : a c-myc címke és a SF9, 3Ü7, 6610, 64, B7 és 9F.10 ellenanyagok ellene (Bvá® ás mtsat, Möfectdar and Galblar Biology 5, 3619-361.6, old:, (í9S54|; és a éferpes tímpfer vírus glíkopreíem-B (gö) címke és az ellenanyaga jFahsrsky és mtsai,, Protein Bngmeerirtg 3, 547-553. old, (199Ö)j. Más éímks-pollpeptióek közé tartozik a·. Hág pepiid (Hopp és taísai,, BkvTedmoiógy 6, I2Ö4-I21Ö old. í^88)l, a KT3 ep-top p«pod (Maun. és mtsaj, Scumc? 2\A 197 '94 old il^A?)* u-tubuln epitóp peptid [Skrnner és: mtsai,, J. Biot. Ghem. 206, ?St63-151 66. old. (1991)3; és a T7 10-es fehérje géniének, peptíd-eintkeje Π utz-Freyermüíh és ntísai., Froe. Matí. Aead. Sd. USA 87,6393-6397,. old. (1990)].

Egy alternatív megvalósítási mód szerint, a kiméra molekula Bv8 fúzióját tartalmazhatja imntttsglobölmnai, vagy egy immunglobulin adod régiójával. A kunéra molekula bívalens formája esetében, (amit „Immusadhsziöuek is novezank). az ilyen fibié egy Igö molekula Fc-régíójavai lehet,

A legegyszerább immasadhezm szerkezetben: az „adhezln” fehérje köiSrégíób kombináljuk az immunglobulin nehózláne csukló és Fe régiójával. Rendszerint amikor Bvd-ímmungiobulín kímérákat állítunk elő a találmány szerinti alkalmazásra, Bv8~at kódoló nukleínsavat fiizlonákatunk G-fenPinális helyzetben az imníutiglobulln állandó dómén szskvsoda hl-lertomáifeáí kódoló rsukfeinsavhoz, azonban N-ierntínátls fúziók is lehetségesek,

Tipikusan az ilyen fúziókban s kódolt kíméra poilpepísd megtartja, az Immangiobolfe nehézláne államié régiójának legalább a fcnkcíohátísan aktív csakSÓ és CBS és CHS doménjait. Fúziókat készlthetSnk egy állandó dómén Fc-részletének a C-tenainálisához, vagy kozseíleutd a öefeézláne CHí részének az H-íérmíöáSlsához, vagy a kötmyöláhe megfelelő régiójához.

A lúzíő elkészítésének a pontos helye nem kritikus; specifikus helyek jól ismertek, és kiválaszthatók annak érdekében, hogy optimalizáljuk a Bv8-immunglóbuiin khnérák biológiai akíivsíásást.

Blzostyos megvalósítási módok szerint a Svg-huísuaglebulín krmérákat monomerekként állítjuk össze, vagy hetero- vagy t?©mo-muiiimsrekkéut különösén a festek és tetramerek esetében: — amint a Wö 91/Ö8298, számú nemzetközi közzétételi Iratban ismertetik.

Egy előnyős megvalósítási: mód szerint a S-v8 szekvenciát egy ellenauyag C-íermmálls: részletének (előnyösen az Fc-dömésmefe) az fí-termmállsához íuzianá|iáíjuk,_: amely tartalmazza az immanglobuib:, például

- 35 hnmusgiohBHrnGi (ÍgGl) eifekíar lunkelóit. Az is lehetséges, hegy a teljes nehézlsne állandó régiót fezíOúáhaíjulí a BvS szekvenciához, „Azonban előnyösebben a papain hasítási helyhez képest éppen leolvasással ellentétes irányban található csuklőrégiőban kezdődő szekvenciát (amely kémiailag definiálja az lgG-Εε-ί; a 21 ő. olilriliénc, ha a tsehézláne állandó régió első öldállánca a 1 1:4., vagy más Immanglobnllnek analóg helye)

S alkztksazzak a láziéban, Egy különösen előnyös: niegvalösitásl mód szerint a Bvk amínosav-szekveaciái egy IgGt, ígÖ2 vagy tgG3 nehézláne esőidé és CH2 és CHX vagy a GH1, csukló, CMS és: CHS dóménjefe fözionáifa-jnk. A fúzió elkészítésének a pontos helye neot kritikus, és az optimális helyet rutin kísérletezéssel megbstárezbatjgk.

Bizonyos megvalósítási módok szerint a SvS-tnrnnjngiohuhn kimérákat mnitimerként állíthatjuk össze, 10 különösen home-áimerekként és telramerekként.. Általában ezeknek az összeállított imntunglobshrsuknak ismert alegység-szerkezete lehet Egy alapvető négylsncó szerkezeti egység az a forrna, amelyben az IgG, IgB és IgE létezik. Egy négyes egység ismétlődik a nagyobb moleknlatömegü irnintísglobsiinokban; az IgM általában négyes egységek pentaísorjefeént létezik, amelyet dísz-rtfíd-hidak tartanak össze. Az- IgA glőbaiin, és esetenként az ígG glehaiin: is létezhet mulílmer formában a szérumban, A mulíimerek esetében mindegyik négyes egység fehst azonos vagy különböző:.

Más megoldásképpen a. Sv8 szekveneiá· immunglobulin sehéziáne és könnyüláne szekvenciák közé inzeriálhatjuk, oly módon, hogy kimére neltézióneot tartalmazó immunglobulin keletkezzen. Ezen megyalősitási mód szerint a BvS szekvenciát immunglobulin nehezlánc 3’ végéhez fhzionáltatjnk az Immunglobulin minden karjában, akár a csukló: és GH2 dómén közöd, akár a CH3 és CH3 domének között Hasonló konstrakciókaí közöltek teHoogenfeoom és misei, (Moh immunok 28, IÖ27-IÖ37. old. (1991,)):.

Habár az immunglobulin körmyüláne jelenléte m szükséges a találmány szerinti immtmadlmzfeekben, mmounglobaim könoyulánc jelen lehet akár kovalensen kapcsolva a BvS-imnmnglohuiin nehézfec fúziós poitpepíídhsz, akár kőzvetlenöi a Bvk-hoz füzionálratva. Az előbbi esetben az Immunglobulin könnyuláneot kódoló DNS-f tipikusan együtt expresszáhatjuk: a BvMmmnngiohuhn néhézláne ftu os fehérjéi kódoló ENS-sel.

Szekréció esetén a hibrid nebézlánc és a körntyülánc kovalensen kapcscfods, olyan inmmngiohulm-szcrii szerkezeten biztosítva, amely két, disznliM-kÖtÖtt krammgiobulin nehézláoc párt tartalmaz. Áz ilyen szerkezetek előállítására alkalmas eljárásokat tárnak fel például a 4 Sió SŐT. szántó amerikai egyosúlt államokbeli szabadalmi iratban (198$. március 2k.).

kar ek !>:)'·. nogvatevtiu mód ve ír italain un -ven tti ttntnu i.sdt ez ttok rteAíntasara Alkalmazott imruungfebts'nn szekvenciák IgG immunglobulin nebézlánc állandó döntésből származsak. Humán immtmadhezinek esetéiien a humán ígGl és igG3 immunglobulin szekvenciák az előnyösek. Ág ÍgGl alkalmazásának a fő előnye az, hogy az immtmaiífsezlnek hatékonyan tisztíthatok isímobiüzáit proíein-A-p, Ezzel ellentetben az lgG3 tisztításához pröteln-G-re van szükség, amely szignifikánsan kevésbe sokoldalú anyag. Azonban az immunglöWiook más szerkezed és funkcionális tulajdonságait Is figyelembe keli vennünk, amikor .az ígö fözlós partnert ki választjuk egy adott, smmaaadhezin konstrukció esetében, Eétdául az, lgö3 csukló hosszabb és hajlékonyabb, ily módon nagyobb adkeain döméneket képes elfogadni, amelyek nem lekeresnének fel vágy működnének helyesen IgGl-hez fbzionáitaíva. Egy másik ntegfentolandó kérdés fehet a valencia; az IgG ImmuRadhezhek bivnlcns homodimerek, míg az lg aitipnsok, mint például IgA és: IgM az alapvető lg temodwfter egységekből álló Elmer vagy pemamsr szerkezeteket alkothatnak. Az ín rám alkalmazásra tervezek

Svg-hnmuriadheztnek esetében az fc-regio állal meghatározott fermakökineriksi tulajdonságok és eífeklor <36funkciók is fontosak. HaW az igG 1, lgG2 és ígÖ4 mindegyikének 21 nap az f« vivő teléieíiíleje, a viszöityfegos hatásosságuk a fcmrtplemeni-rendszer aktiválására különböző, Az lgG4 nem aktiválja a komplementet, és .a® tgG2 szigjHfi&feas gyengébben a komplement aktiválásában, mást az IgGl. EzenfelQt.....ellentétben azígGlgjtói ~~ az ígG2 ne-nt kötődik a. menonukleárls sejteken és neoírsStóken található Fc-recepiorokhoz, Mig az

S l<gG3 optimális a fesnipeteeni aktiválására, az /« wc féiéletideje megközelítőleg egyharmada a többi IgG Íjtípusénak. Égy másik fontos meggondolandó tényező a humán terápiás szentek tervezett tmírnsnaebezinek esetében az adod ízotipas allötípíkas variánsainak a száma. Általában a kevesebb szerológísilag meghatározott allöíípsssal rendelkező IgG izoílpusok az előnyösek, Példánl az IgGi-nefc csak négy szerolőgíáilag meghatározón aliotipikus helye van, amelyek közül kenő (Gim és 2) található az Fe-régíóbzn; és ezen helyek egyike, a öl®!, sem temmogeníkus. Ezzel ellentétben az IgGő-bsn 12 szereíőgísilag, meghatározott aHotfpus vart, amelyek mindegyike -.az Ee-régíőban található’ ezek kÖzSEa helyek közül csak háromban (G3m5, 11 és 21) vart egy adótípus, amely sem inmmnögeníkus, ily módon egy y3 mmmnadhezin potenciális Immunógenitása nagyobb, mht sgy yl imnmnadheziné,

A sztói feammglohaltóok vonatkozásában alkalmas kapcsolási pont található éppen Isoívasássaí ellentétes irányban a csukló eíszlfejsítől, amelyek a dlszöffid-fcöíésí alkotják a két nehézlánc között. Egy gyakran alkalmazott szerkezetben a molekula BvS részének a C-ienrnnáíts oldalláncú· kódoló kodont az. IgGl esaklórégiőjának DKTlf fGPPCF szekvenciáját kódoló kodonoklől közvetlenül leolvasással ellentétes hányban helyezzük el.

Az ámnmsadbeziseki előállítására és sxpzesszálíaíására alkalmas általános eljárások ugyanazok, mint amelyeket fentebb ismertettünk a Βνδ-eai kapcsolatban, Á BvS-h®nunaáhezíncket legkényelmesebben a BvS részletet kpdelő cDNS-sgekveítciának egy .lg cDNS-szekvenslával fázisban történő fezionálíatásávül állíthatónk elő. Azonban genomíábs fg-feagnaeasekhcz_: való fcíooáltatást is aikalmazbatunk [lásd példást Gasetúgtss és tuísssL Erofe M. Aeud, Seb USA 84, 293Ó-294Ö, old. <1987); Aruííb és rntstó., Célt ól, 1303-1313. old, (1990); Stameukevic és nrtsai,, Cel^ 66, '1133-1144, old, (1991)}. Ez utóbbi típusú fúzió esetében lg szabályozó szekvenciák, jelenlétére van szükség az expresszióhoz. ígG nehézlánc állandó régiókat kódoló cDNS-t izolálhatunk syiivúaös szekvenciák alkalmazásával {épből vagy perifériás limíbehákből származó cDfíSkönyvtárakbők hibridizációs vagy pollmeráz-íánereakelós: (FCR> módszerekkel. Az immunadhezis BvS és: lg részeit kódoló cöNS-efeeí egymást követően beinzertálpík olyast plaznddvekterba, amely hatékony expressziét irányít, a kiválasztett gazáasejtekben. Emlőssejtekben végzett expresszi esetében pfeKő-alapú vektorokat [Scball és nrtsai,, Célt öt 3Ő1 -37ö. oltó <1990)] és CDMfoalapú vektorokat (Seed, Hatóre 329, S4Ö. old. (1989)1 álkalmazitötuhk, A pontos kapcsolódási helyet a tewtótt kapcsolódás} ködösök közötti felesleges szekvenciák eltávolításával Itóritatjsk létre oiígoöakfeotíd-irányltott deléciós mutagenezis alkalmazásával [Zoíler és misei., Ntscfeíe Aelds fess, iö, ő4&7, old. (19S2); Capon éy mtsal., Natúré 337, 525-534, old. (1989)]., Olyan szintetikus oligönckisetiáokíd alkíílmazbatónk. amelyekben mindegyik fél komplementer a kívánt kapcsolódási hely valamelyik oldalán található szekvenciával; ideális esetben ezek 36-48-t3gú olígonukfeotidok. Más megoldásképpen ECR-ínődszescket alkalmazhatnak a. molekula két: részének tózlslw történő összekapcsolására egy megfelelő vektorban.

A gazda sejivona) kiválasztása a Bvg-immanadheztóek espresszálfetására főleg az-expresszíós vektortól fegg. Egy másik jnegfontolantó) tényező a .szükséges: fehérje mennyisége. Miligrammny i meítóyiségsket gyakran elöállllhaiuhk tranziens tracszfekciőkkal.. Például az El A adenovírussai transzferuiált 293-as barnán embrionális vesse s^Évesateí tranziensen pfeKő-alapú vektorokkal a kaldum-foszfet: eljárás módosításával, arai batekosy iBrmufiadbeziti-expressüőt lesz lehetővé. CDMS-álapó vektorokat alkalmazhatunk COS sejtek p-safiszfektálássrá a OB/XE-áextrán eljárás sikahnazásávai fAruITo és mtsal., Ceti 61,_; 1.303-1313, old, (1990); gferttnteissl és sötsaL. DMA Ceíl Bioi, US 9, 397-353, old. (1990)), Ha nagyobb mennyiségű. fehérjére vas sztSkség, sz i-oíHojiaőhezíní gazda-sejtvonal stabil őaosz&keíója utsn expresszáhathatiuk. Példtfel pR.RS-alapü ycsktert jöáathafook be kínai hörcsög petefészek (CEO) sejtekbe egy további plazmid jélesfetébea, amely díShdrofelát-rodaktázt (DHFR) kódol és Ü418 ellesi rezisztenciát okoz, A G418-ra rezisztens klánokat tesByésssdw szelektálhatják ki; ezeket a kiónokat növekvő mennyiségit ntetoírexát {DHFRünhíbiior} jelenlétében növeszthetjük; és olyan klánokat szelektálunk ki, amelyekben a. DOTR-ΐ és az imswntdhezin10 szekvenciákat kódoló gésköpiák szánta ampliflkáiődotí, Ha az ímroumtdhaziu hidrolbb vezotőszekvenciót tartalmaz sz H-termlnádsán, valószínű, hogy feldoigozodlk és szebetálődlk a trasszfekiáll: sejtekbe». A boanyofeifabb szerkezetű inxotünadhezinek exprosszálíatása egyedileg illesztett gazdasejteket Igényelhet, példán! olyan komponenseket, mint például egy könayidárc vagy J-iánc bizíosllfeatsak bizonyos mieloma vagy' hibtidóroa gazdasejtek (Gascsígne és missk, mint fent) Mártin és misai., X Vírol. 67,3SóÍ-33ő8. old. (1993)}.

Immmsadttezinefcet kényelmesen üsztitbaiunk sffhtkási kroatatográfía alkalmazásával. A. protem-A affinitást ligandumként való alkalmazhatósága a kiroérábas alfedmazott immnrtgiöbulin Fc-domén. fajtájától és izotwsátói felgg. A protein-A-t elvan immunadhezipek tisztitássra aikslmazbatjuk, amelyek humán γΐ, γ2 vagy y4 pehézláneokon alapulnak [tisdmark és mtsaí., X Immanoi. Meth, 62, 1-43, éld. (1983)], A· prolein-G az összes egér ízotlpas és humán y3 esetében javasolt (Guss és mtssk, 8M8Ö X 5, 1563·· 1575. old, (1940)3, Az a mátrix, amelyhez az, aífeitásd ligandtunoí kapcsoljuk, leggyakrabban agaróz, azonban inas mátrixok is gfedteazfertiék. Mechanikáén» stabil málrhofe, mint példád szabályozott pórasnteretü üveg vagy poi Mártírén» divírtllfbenzoi nagyobb áramlási sebességeket és: rövidebb feldolgozási időt tesznek lehetővé, mint miket agarózzal elérhetünk. Az immuoadhezfo protefo-A vagy -G afrodíási osziopboz törtéoó kötődésének a körülményeit teljes mértékben az Fe-domén: jellegzetességei határozzák meg, azaz annak fojlápt és ízotíptssa.

.25 Általában amikor a megfeleld ligasdttmot választjuk ki, hatékony kötődés következik be közvetlenül a nem kondíefortált; tenyésztő: közegből is, Az imotonadhezktek egy megkülönböztető tulajdonsága az, hogy a hamárt yl molekulák esetében a pmete-A kötökapaertása valamelyes csökken az ugyanolyan Fe-tipusö ellenanyaghoz viszonyítva, A megkötődött immanadhezínt hatékonyan etólharínk vagy savas pH (3,0 vagy a. felett), vagy enyhén kaofropikuS: sőt tartalmazó semleges pH-ja puffer alkalmazásával. Ez a kromatogarSás lépés olyan tmmuaadhezm készítményt eredményezhet, melynek tisztasága >95%.

Más eljárások is ismertek a szakterületen protein-A~n vagy -<3-s történő afliniiási krömatögrália helyett vagy tecílétí az: itthnttttadltezmek tisztítására. Az tmmsnadbesmek az ellenmtyagokhos hasonlóan viselkednek flödUgéferomatogtáfla: során [Botehens és falsai., Anal. Üiochem. 1:59, 217-226, old. (iWSjj vagy hntnobülzáií fete-kelát kromafegráfí:ában jAl-Mashíkhl és roissi., X öairy Sci. 71, 1756-17Ő3. old. (IW)j, Az ellenanyagokkal ellentétben azonban az ioncserélő oszlopokon való viselkedésükéi nemcsak az izoelétemos pontjuk, hanem a iölíésdipőlasnk is befolyásolja, amely létezhet a kiméra természetük miatt

Kívánt esetben az immossdhezfook lehetnek blspscifíkusak is, ily módon a találutásy szerinti imrítonaálicztsekbert Bv§ doméní és egy másik deméní, mint példáid egy másik növekedési, faktorból származó áomóot köíabinálhahmk. Síspeclísfois molekulák esetében: az olyan felmer molekulák előnyösek, amelyeknek az egyik, kútja kiméra. elfenanyag--ftehéziá»eot és a másik karja kiméra ellenanyag ncbéziáíte-könuyöláne párt

-38írártaimaz az eitesanyag-szerő szerkezeiében, a tisztítás megkönnyítése miatt, Elletsisíben ax elfesny&g-termelő fe^afemákhai, amelyeket hagyományosan alkalmaztak bíspeeiffe.m immtmaábezinek előállítására, és tíz teÁrsmer keverékét termelik, a trimer feímunadhezin-szerkexet három láneáí kódoló mtklemsavval teanszfektálí ssejtek csak három molekula keverékét termelik, és s kívánt termék, tisztításé ebből a keverékből esnek m egíeteiőett Rőmtyebh.

Lk24föÍlftés3^azonöskása

A találmány tárgyát képezik továbbá eljárás vegyületek szkrínélésére is, hogy azonosítsuk szokat, amelyek·, utánozzák vagy fokozzák a 8 vb egy vagy több biológiát aktivitását (agomsták) vagy megakaáályózzák á Sv8· hatását (sstagemsíák), A Bvk-agönlstákat és -aptagonistákat BvR'msdalsisroknsk is íteveszük. Amagosisia drogjeiöltek szkrineiését olyan, vegydletek: azonosítására ten-ezík, amely kötődnek a ®vk~ pöfípepíldekhez vagy kömpteset: képeznek. azokkal vagy más módon zavasyák a Sv8 kölcsőabatssáí más sejtheti OmjékM

A kis,molekulák képesek lehetnek B'vS-agömstakéat vagy antagonisíaként mtíködnl, és ily módon terápiása hasznosak tehetnek. Az ilyen kmoiekakík közé tartósnak természetben elöiórdoló kísmolekökík, szistetikas szerves vagy szervetlen: vegySletek és peptidek. Azonban, a. találmány szerinti kismofeknlák nem: ksríátozódnak ezekre s tormákra. Klstsölekulák nagyméretű könyvtárat kereskedelmi Ihrgalombaa kaphatók, és sokféle vizsgálati eljárás: ismert a szaktertlleten ezen molekulák sskrínelésóre skívánt aktivitásra.

Pötenmáks Bvh-agrmista vagy arttagomste. kismolekulákat előnyösen először olyan vizsgálati eljárásban azonosítunk, amely tehetővé teszi Bvk aktivitás potenciális uitsdulátomíaak a gyors azonosítását, ilyet: vizsgálati eljárás egy példája egy feherje-fehétje kötési vizsgálati eljárás, amelyben mérjük a potenetáits vegyidet képességét egy BvS-reeeptorhoz. yalő kötődésre. Egy másik példában a potenciális mötekslák képességét mérjük

Egy előnyős megvalósítási mód szerint klsmolektóss KvS-agosísíáRai azon képességűk alapiért azonosítunk, hegy utánozzák. a BvS egy vagy több biológiai aktivitását Példáéi kísmolekulákst szErisetek eodoíéliálís sejtek proiiferáeióját indukáló vagy endotéliális: sejtek túléléséi elősegítő képességekre,. amist az alábbi 2> és 3, példában bemutatjuk, vagy míglogenezist mdnkálő képességökte, túróst az alábbi 4, példában bemutatjuk.

Egy másik megvalósítási mód szerint kismotekuláS BvS-aníagosístákat azon képességük alapján azóhosfemk, feotry g^olják s Bvb egy vagy több biológiai aktivitását. Ezért a potenciális vegyiitetei érintkezésbe hozzuk Bvk-eak Azután meghatározzuk a BvS biológiai aktivitását. Egy tnegvalőstiásl mód szerint meghatározzuk a BvS endotéliális sejtek proliferáetéjának síimnlálására. való képességét, mint a 2, példában bemutaSjuk, Egy másik megvalósítási mőd szerint meghaíárözzak a BvS endotéliális sejtek túlélésének az elősegítésére való képességét, amint a 3, példában bemutstjuk, Egy vegyöleteí antegomstskeni azonosítunk, ha a Bvf biológiai aktivitásit: gátolt.

A BvS agomstsjaként vagy tmtegmtísífekéní azonosított vegyüléteket alkalmazhatjuk a találmány szerfeíi eljárásokban. Például BvS-antagotrislát alkalmazhatunk rák kezelésére, ő. sífeuönyogok eföátfá&sii ér <p«esSás«

-39A Sv8 biológiai tulajdonságai; utánzó agonteta fcamác és nem barnás poííkfemáíis és mönoklonalls ellenanyagok (beleértve néni feöirtá» monokíosális eltenunyagok bámanMW formáit A) is a találmány tárgykörébe tartoznak, Ezek közé tartozóak amlnösav-szekvencla variánsok, gllkuziiáetos variánsok és elfeaanyag-trsgmessek. Az ilyen elkmanyagok előállítására és az ngonlsís eltesanyagok kíszdektáfosáro szó Igáié általános módszerek jól ismert a szaktertlieien, fe azokat alább rövidet! be is mutálják.

,<A ^of Afoedfe eókwíWgiA

Eljárások pobklonális ellenanyagok előállítására Ismertek a szaktertlléteo, Polikfesális_: elletsanyagbkat tertmehetheföak például emlősben, például immunizáló ágens.....és kívánt esetben .adjuváns — egy vagy több injekciójával. Tipikusan az immunizáló ágenst és/vagy adjuvánsí több szubkután vagy inteaperítoneáite

1Ö injekcióval adjak be az emlősnek, Hasznos lehet az Immnmzáíő ágenst olyan lehérjfeez kónisgálnl, amelyről födött, hogy ímmanogenikss az immunizált állatban, mint példás! szérnmalbummboz, vagy szóin rtlpszmiokíhitorhoz. Az alkalmazható odjovánsok példái közé tartozik a Freund-fee komplett adjováns és az MÉLTÓM.

(íiö Aíonö&má/A e/femwgöá

Í5 Monokksnábs eikiunsagekat a blbridöma eljárással állíthatunk elő, amelyet először Kókler és mtssi.

jNaxure 2SÓ, 495. o,d , Iθ'**» »f ríak te, vagy rekombináns DNS eljárásokkal állíthatjuk old azokat <4 Rió 5ó?. számú amerikai egyesölt államokbeli szabadalmi irat).

A hlbridöms eljárásban egeret vagy megfelelő gazdaálfaíoí, mint például hörcsögéi vagy wkákőmajmot immunteslunk a fent teirt módon olyan límíociták mdokálására, amelyek az immunizáláshoz alkalmazóit fehérjéhez speclbkusan kötődd ellenanyagok állítanak elő vagy annak előállítására képesek. Más megoldásképpen limfodiákat m viir& is immunizálhatunk, Azután a limfociíákat tezíbnáltatjuk mteldma sejtekkel tseg&telö bíziosábatő ágens alkalmazásával,: mint például póltetllén-glíkolial, hibrídóma sejtet előállítva ÍGodiag, „Monoelohsl Anfibodtes: Prínclples and Eractice·59-103. old. kiad..; Academte Press 0980)1,

Az Így előállított hibridőmá sejteket alkalmas tenyésztő tápkőzegbe oltjuk te és növesztjük, amely előnyösen egy vagy több olyan anyagot tartalmaz, amely gátolja a nem fúzionátetotl, szőlői ntielómn sejtek növekedését és túlélését, Például ha a. szőlői mlelöma sejtek nem tartalmazzák a feipoxantin-gíjanin-foszforiböziítraszíéráz (hlöPRT vág}·· HPRT) enzimet, a blferidótnák tenyésztő tápközege tipikusan hipoxantínt, snsinopterlnl és ítmiámí tartalmazhat (HAT tápközeg), olyan körtdmények között, amelyek között a PlGE&T-defteiens sejtek

3Ö növekedése gátolt

Előnyős mlefoma sejtek szsfe amelyek hatékonyan fuzionálnak, stabil magas szlntő elteaanyagíermelést biztosítanak a kiszelektált ellenanyag-termelő sejtek által, és érzékenyek s fápiíőzegre, mint például HAT tápközegre. Ezek közti! előnyős mtelőma aejtvonalak az cgérmtelóma sejtvonalak, mint például az MOP21 és M.C.-I1 egérdagasaíokböl származók, amelyek beszerezhetők a ’Ealk fösdínte Cél! Disrtibwtion Center töl .(San Diego, Caüfbmía OSÁ), és az SE-2 vagy Xő3-Ag8-ö53 sejtek, amelyek beszerezhetők az 'Amertean Type CAse ColtóíonMoi (Roekvílie, Maryland USA), Humán mielőmu és egér-humán he;sr&mieifön& sejlvonalakaf A leírtak humán osondkfonáhs ellenanyagok, előállítására í'Kozlmr, 1 immunoi, 133, 3QöL oki (1984); Brodeur és mfsaí., „Monoétömd Antibody Eröduction Teebnioues and Applieatlons”, 51 -63. old., kiad.; Mareel Decker, íné., New York(i9S7.i:,

- 4ί)Áz síyan tenyésztő tápközeget, amelyben hibridóma sejtek tata, megvizsgáhók az antigén elleni nuenoktenálís ellesanysgok termelésére, Előnyöseit a hlbriddma sejtek által termált menoktaáíss ellenanyagok kClíőspectSíásáí immurspreeipítáclóval vagy ú? »fím kötődési vizsgálati elírással határozzuk meg, mint például rszlioaktív immunológiai vizsgálat! eljussál (RlAj vagy shzite-kspesoit itanmadszorbens vizsgálati eljárással (BUSA).

A monokkmáiis ellesauysg kötési afítaásál például a Seatchard-eiemzéssel halározhatjök meg, atsfelyrtMunsön ős mtsai. jAta, Dioehem, 197,220. old, (1980)1 írtak te.

Mintás azonosítottunk olyan híbridőma sejteket, amelyek kívánt speeifiiáső, aííluhású és/vagy aktivitású ellenanyagukat termeinek, a sejteket szubklónozhatjuk: korlstozö hígítást módszerekkel, és szokásos eljdrásokksl teuyésrthedök azokat jöoámg, „hfotsoelonal Anhbodies: Friueípíes: sóst Ernctíee”, 59-103, old, htate Academte Press (lüSötj, Az erre a célra megfelelő tápközegek közé tartozik például a DME.M vagy S'FMl-té40: íápközeg, Ezenfelül a hibrídoma sejteket m vivő is. tenyészthetjük állatban aszeitesz daganatokban.

A szubklónok által szakmáit monsklonális ellenanyagokat megfeleld mádon elválaszthatjuk a íonyésztő tápközegtőí, aszelteaz-fölyadéktöl vagy szérumtól hagyományos immunglofedín-riszíúási eljérásokkah mmt példán! .jsntón-A^^mw, hidroxíapafií kromatográfiávaí, gételetaofe>!éz!ssel dístassel vagy slTmitáss kromatográfiávsi,

A stöooklonális ellesanyagokaí kódoló ÖNSM: könnyen izolálhatjuk és szekvenáíhatjuk hagyományos elj&úsok alkalmazásával' (példáid olyan olígonökfeortd-próbák alkalmazásával, amelyek képesek specifikusan kötődni a munoktenálís ellenanyagok oehézktasit és tamyataeaif kódoló génekhez), A httadóma sejtek az ilyen DBS előnyös forrásaiként szolgáltat- Ha egyszer Izoláltuk, a DNS-I «xpmsszios vektorokba helyezhetjük, amelyeket ezután gazdaseítekbe, fnlot példáéi D eoA sejtekbe, majom COS sejtekbe, kita hörcsög peisfeszék (CHÖ) sejtekbe vagy olyan mislóma sejtekbe írasszfektálhatunk, amelyék egyébként nem tennétek immunglöbulhr iehérjét, hogy elértük a motsokSonáiss eltesanyagok szintézisét a rekomblnáns gazdasejtekhe®. A DKS-í módosíthatjuk például a humán nebézíáno és könnydláse állandó derűének kódoló szekvenciájának behelyettesSésével a homológ egér szekvenciák helyére (Mcmsea és .mtsai., Proe, Null, Acta Sei, USA 81, b§51. old, (1984 )1, vagy kovalensen kapcsolhatjuk azimmunglobulin kódoló szskveneíáhoznem immaogldbuhn pollpepíid kódoló szekvenciájának egészéi vagy egy részét. Dy módon „kunéra” vagy „hibrid” eltenasysgtó állítunk elő, amelyek « talál» teay szerinti Bvk-agönisia nmooklunális ellenanyag kötdspecífiíásával rendelkeznek.

Kiméra vagy hibrid eífettsnyagekar eíöálíUhatak és záró is a szintetikus fehésjekemiában ístnert:

eljárások alkalmazásával, beleértve a keresztkdfő ágensek alkalmazását Is. Például Immánötoxinokat állíthatunk elő disadííá-eserés reakeló alkalmazásával vagy tteóteuköfes kialakításával. Az erre a oólrs alkalmas reagensek példái közé tartozik az houxmolát és a nretíl-h-merkapíobutirtmidst

Az ellenanyagok rekotebmáss cISállltásáirésziöfesehben is meríerihk később.

5 /hri //muotash e/temmypgok

Általába® egy humanizált eltenanysgba egy vagy több, nem tanán lorrásből származó ammosavoldalíánc van beépítve. Ezeket a nem humán atnítmsav-oídaháoeokaí: gyakran „import” öidsihteökask nevezzük, amelyeket tipikusan egy „import” variábilis doménkőí veszítek. A humanizálást lényegében Wínter és snisai, eljárásának alapján végezhetjük el pones és mtsai,, Bátoré 321, 522-525, old. (í9W); Rtechmanu ás

-45 írttisai., Natúré 332, 323-327. old. (198®); Vsrhoeyen és mtsai,, Sefetsce 239, 1534-5530. old. {1988}], í&gcsáM CföR-sk vagy CÜfoszskveociák szabsztitőelójávsl a humán. ellenanyag xaegfolelő szekvenciái helyére,

Esnek megfelelően az' ilyen „humanizált” ellenanyagok kimére ellenanyagok (Csbilly, mint fexrt), aírtíelyekben lényegesen kevesebb, mint egy intakt homárt variábilis dómén lett sztfbsziltöálva egy t-em barnán faj «vegfalelb szekvenciájával, A gyakorlatban a humanizált ellenanyagok tipikusan olyas humán ellenanyagok, artnslyekben bizonyos CÖR oldalláneok és esetleg bizonyos FR oldalfecok szufesztltuálva vannak fogcsáló eFfenaayagok analóg helyeiről származó öldallfeokksl.

Fontos, hogy ellenssyagökat bamanlzálbatsrtk az antigén iránti magas affinitás és egyéb kedvező bí«ö|öglai tulajdonságok megtartásával is. Ezen: cél elérése érdekében egy előnyös eljárás szerük humamzálí «11 euanyagokat a szőlői szekvenciák és kőlősféíe konceptuális humanizált termékek elenxzéss árián állítunk «10, a szőlői és humanizált szekvenciák háromdimenziós modelljeinek alkuímazárttval, Háromdimenziós ta.msngkfoulirt-modeilek általánosan hozzáférhetők és ismertek a szakember számára, Beszerezhetők olyast szákmitógépi programok, amelyek hentataíják ás ábrázolják a kiválasztott potexiciális xmoxánglóboSin-szekvenoiák. valószínű háromdimenziós konformációs szerkezeteik Ezen ábrázolások tanulmányozása lehetővé teszi .az:

ohisíláneok valószínű szerepének az elemzését a potenciális immunglobulin-szekvencia mákódcsebets, azaz szón okíalláncok elemzését, amelyek befolyásolják a potenciális immunglobulin képességét az antlgésjébez való kötődésre. Hy taédsa FR-oldalláncökst válasziratunk ki, és .kombinálhatjuk szokat a konszenzus és import szekvenciákból, oly módon, hogy «létjak s kívánt etlenártyag-tuiajdortságot, mmt például a megnövekedőit affinitást a eébníigéuCek) Iránt. Általánosságban a CDE^ldalláhcok közvetlenül és leglényegesebb módon részt vosssék az antigénkötés befolyásolásában, 3'ovábbi részletekért lásd a 03/934 373. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentési (1992, augusztus 21), amely a 07/715 272. számú amerikai egyesült állrtrnokbeíí szabadalmi Irat (1991 Jűulus 14) részbeni folytatása.

rtyl /foísfoscí/csííuví^ök

Humán möuokionáiis ellehoííysgö.kat eloálkthafonk a hlfertdoma eljárás alkalmazásává;. Humán.

mieíőma és egér-humán feeteroísieiőma selivonafokat leírtak humán, monoklösális ellenanyagok előállítására, például az alábbi irodalmi helyeken: Kézbőr ás mtsai,, 1 Imámról. 133, 3001. old (1984) és Hrodcu? és mlssú, „Moisodöstat Andbody foodurtios Teehnlqnes and Applicaifonx’’, 5 1-63. old., kiad.', Maróéi Decker, Inc,, New York ( 1997).

Ma már lehetséges íranszgenikus állatok (például egerek) előállítása, amelyek immunizálás hatására képesek humán ellenanyagok készletének az előállításra endogén mmdmglofeulm-teönelés hiányéban. Például foírtrtk, hogy az cllénanyog nehszláne kapesolórégió {.ifo gén homozigóta deíécsőis kimőra és esbsvonal-mntáns egerekben: az endogén sllcnanyag-lermelés: teljes gátlását eredményezi. A humán csírsvonaí ímniunglobulin génkészlet átvitele az ilyen eslravoual-mutáns egerekbe humán ellenanyagok termelését eredmáayezi antigénnel; való találkozás hatására Pásti például dakobovits és mtsai,, Proc. Mail, Acad,. Sei, VSA 98. 2551-255. old,

0 993); lakobövits és mtsai., Natúré .362,255-238. old. 0993)1.

Mcadéz és mtsai. {Matuhe Geseéics 15, 146-156. old. (I997)j tovább javították a technológiát, és olyan transzgemkas egétvOsalgt állítottak elő ·-— amelyet ,_:Áédí>mes.m /F’-nek nevezték el.....·, amely antigénnel találkozva magas affántású teljesen humán ellewxyagokat tértnél. Ezt s tanán nebézláac és köonyuléne mgsházis lókusz olyan egerek csiravonalába törtértő beépítésével érték cl, amelyekben az endogén Jj₅· szegmens deletálva volt, amint térti: leírtuk. A Atawíwg /7 hordozza a humán aeházláne lokosz 1Ö2Ö; kb-át, amelv

-42nne^cSsscihőfog óó V® géni, a teljes Dk és £» régiókat és hárem· különböző állandó régiói iní, Ó és χ), és továbbá tartalmaz 800 kb-í s komán ^:tc fokuszbői, amely 32 V_K gém, 3,- szegmenseket és C;. génekéi Is hordoz, .Az ezekbe» a# egetekben termek ellenanyagok nagyon hasonlítanak gz smbc'ekben Htegíaltilhatőkta, beleértve gteoáíresdezést, összeállítási és tepertőéit A humán ellenanyagok preferenciái,san expresszálöának az endogén eklesssyagok helyed, az endogén .¾ szegmensben lévő dsléció miatt, &mj snegakadályozza a génátrenáézódésí azt egér lóksazpn.

Más· megoldásképpen foggtezentációs technológiát [McCaffotty és tsísttl, Wure 348. S$2~SS3. old, (W9S)j nlkaSwzhaíiink humán: elisnanyagok és elfenanyag-fcagmensek. á? váró előállítására, az immunizált donorokból sztlrmazó írvmunglófenlin variábilis (V) döntenek génkészletéből. Ezek tsbtászer szerint, ellenanyag

V-domén géneket klónozunk fázisban fonalas bakteriofág, mint például M13 vagy íd fo~ vagy mellékbtizokféhérje génjébe, amelyek a fágrészecske .fotósén möködbképes eiíénanyag-fragmensekként prezantálódssk. Mivel a fonalas részecske tartalmazza a: fog-geaom egyszáSó SHEonásoísták az foteoanysg fetkcioaáiís tulajdonságai; alapján végzett szelekció az Ilyen ttdaidönságokaí multiió ellenanyagot: kódéi» gén kiszetekíá&át Is jelem!, ily módbp a fog a B-sejték egyes tulajdonságait tdánözza. A fogprezentációt különféle fomtáíumokbaa hajthatjuk végre; ezek összefoglalásáért lásd például jóbítson, teevin: S. és Chissveii, Dávid ,k (Cntreut Opisfon is Strucfural Bfofogy 3.,. 5Ő4-S71. old. (19§3)j közeteenyét. V-gémzegmensok febb forrását alkírim&zhsijök fogprezestácíőra. Chefem és tníssi. (Katim 353., 624-028. old. (1991}} atíti-osazefon ellenanyagok változatos készletét Izolálták immunizált egerek légeiből származó V-gének kisméretű véteftenszerti kombinatorikös könyvíáráhők fonsmnizáfetkm formás donorokból számazó V-géneket állíthatsnk elő, és változatos antigének (keiéértve saját aatigénék) slfotó ellenanyagokat izolálhatonk lényegében a Marks és mtsto. p. Mól, Bioi. 222,5:81-597, old. fWl}) vagy öriffith ás misei (EMBO X .12, 725-734, old. (1993)] által leüt módszerek követésével A természetes immunválasz folyamán az eileuanytig-gének nagy gyakorisággal halmoznak tol mutációkat fozemaíikus hipermufáció). A beépülő változások némelyike magasabb affinitást okozhat, és a magas affinitásó: fefezfoi wsunglobnliöökat prezentáló S-scjíek proforeociális® replikálódnak és diSorenofolódnsk az antigénnel való: találkozást, kővetően. Ezt a természetes foiyatotitot a ,,láss-keverés néven ismert módszer alkalmazásával atásozbatjök (Marka és mtsaí., Sio/Tedmol 10,779-783. old. (1992)(. Ebben az eljárásban a fogprezeníáeióval előállítod „elsődleges barnán ellenanyagok affisuiásfo javíthatjuk a nehézlánc és kSuayőláac V~régiós gének -sorozatos helyettesítésével Immtmizáfatiaít donorokból származó V-domés gének természetben: előforduló variánsaival (készleteivel!. Ez a módszer lehetővé teszt _a oM taritmtányban lévő

3Ö affinitásé ellenanyagok és ellenanyag-íragmettsek elóálEíását. Nagyon nagy méretű fog elleoaayag-készistek (más óéven „műiden könyvtárak anyja) elöáHífosára szolgáló stratégiái Írtak le Waterhouse és ínfsai, (Nnci. Acids Rés, 21, 22Ö5-22ÓÓ. old, (1993 !.|. és magas affinítesn hutnán eifemtttyagok közvetlenül ilyen nagy méretű fogkőnyváárakfeól történő izolálásáról is beszámoltak (Grtffifo és mtsai., EMBÖ 3. (1994( közlés alatti. A géskewést alkalmazhatjuk komán: ellenanyagok előállítására rágcsáló ellesauyagókkők ahol a komán ellenanyagnak hasonló sz affinitása és speeffitásaa kiindulási rágcsáló ellenanyagokéhoz. Ezen eljárás szerint — amelyet „eplíop-tóvésődésnek” Is neveznek — a fogprezefeáéiós módszerrel előállított rágcsáló ellenanyagok oehézlfec és könnyükbe V-gónjeit keiyettesitplk tartán V-donten gének készletével, rágcsáló-ember kfoterákat létrehozva.. Anfigénen való szelekció oly® humán variábilis domének Izolálását eredményezi, amelyek képesek a tonkelonáks antigén-kötő hely helyreállítására, azaz sz episóp irányítja (be vési) a partner választását. Amikor a folyamatot megismételjék a tormmarado rágcsáló V-ítomének helyettesítése érdekében:, foínffio elfcnaayagsf

-43 kapwsk (lásd a WÖ93/Ö6213. számú nemzetközi közzétételi iratot (1993, április k), Eifontétbou a rágcsáló ellenanyagok „€_:DR~graSmg'--gai végzett hagyományos bumanlzáiásvai, ezzel: a módszerre) uijssea humán eítenanyagőkat állíthatunk elő, amelyeknek nincsenek rágcsáló-eredetű vázrégió- vagy CláR-ökMáncai. jfo ^IfoecyBss eáesenyűgoá

A hispeeíSkBs elleöarsyagok. mönőkionáhs, előnyössé! humán vagy humanizált ellenanyagok, aroelyfeasek legalább két antigénre van irtjtöspecirtiása. Bfepeefokus ellenanyagok előállítására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen. Hagyományosaira bíspeeiíikus ellenanyagok rekombínáns: előállítása két imzanunglóhulm nehezlsne-kömiyűláne pár együttes expresszióján alapszik, ahol a ké t nehézláncnak különböző a spectfítása [Mi&íein és Cneils, Náture 305, 537-539, old. :(1983)). Az Immunglobulin nehéz- és könnyűláneok:

W véletlenszerű választéka miatt, ezek a fohridómák íkvaárőtnák) 10 különböző ellenanyag-molekula potenciális keverékéi termelik, amelyek közül csak egysek van meg a helyes feispeciílkns szerkezete, A helyes molekula tisztítása — amit: általában affinitást kromatográfiás lépésekkel végeznek......eléggé fáradságos, és a tennék kitermelése alacsony. Hasonló eljárásokat ismertetnek a Wö 93/Ö8829, szórná, nemzetközi közzétételi Írathat! 0» május 13,χ és Ttauuecker és mtsai, (EMBO1 1:0, 3ú5fo3S59. old,,(1991)).

Egy: másik és előnyösebb megvalösításí mód szedni kívánt körespecíBtású ellenanyag variábilis doménekei (eilenahyag-astigén kötődési helyeket): Ibziouáltatnak immunglöbulín állandó döntőn szekvenciákhoz. A fúziót előnyösen mmamgiöbulm nehézlánc állandó doroénneí végezzük, amc-ly a csukló, CH2 és CHS régiók legalább egy részéi tartalmazza. Előnyös, ha a fúziók legalább egyikében jeled van az fesd nehézlánc állandó dómén (CH3), amely tartalmazza a kőnnyöiánc dómén kötéséhez szükséges helyet. Aa immunglobulin nehézlánc fúziókat és — kívánt esetben — az immunglobulin könnySláncoí kódoló DNS-eket különálló expressziós vektorokba inzertáljnk be, és együtt Srauszfektáiíuk tneglélelő gazda organizmusba. Ez nagy' rugalmasságot biztosit a három poílpeptid-őagmess kölcsönös arányának a szabályozására azokban a snógvalósiíási módokban, ahol. a konstrukcióban aikalmszott három pokpeptídlánc egyenlőtlen aránya biztosítja nz óptímúiis eredményt, Azonban lehetséges az is^ hogy két vagy mindhárom poligeppdiáneot kódoló szekvenciát egy exprsssziós vektorba Inzertáijuk: be, amikor legalább két polipeptidláne expressziójánsk azonos: mértéke magas kitermelést erednfouyes, ha az arány ítém különösebben fontos. Ezen megközelítési mód egy megvalósítási módja szénát á bispecirtkus efaanyagnk hibrid: immunglobulin oehézkmeot tartalmaznak, amelynek egy első kStÖspecíffiása vau az első karján, és egy hibrid immunglobulin nehézláne-könnyülánc-pár (amely -egy második fc&iőspeeí&bt blztosh) a m.áslk karján. Az találták, hogy ez az aszimmetrikus szerkezet elősegíti a kívánt bispecirtkus vegyidet elválasztását a nem kívánt immunglobulin-láne kombinációktól, mivel az imrnungiohuhn könnyüláne jelenléte a blspeeííikus molekuláknak csak az egyik felében az elválasztásra könnyű lehetőséget biztosít. Ezt a megközelítési módot a WO 94fo4ó9Ö. szátó nemzetközi közzétételi iratban tárják fel (1994. március 3.).

A bispecítikus ellenanyagok létrehozásának további: részleteiért lásd például Suresh és mtsai.

közleményét jMethod» m En/ymology 121,210. old. (19$ő)j.

(víz .á&hröfefosgdh e&wpvmpá

A heterdkonjügáít cltenasyagok két kovalensen kötőit ellenanyagot tartalmaznak. Az Ilyen ellenanyagokat például immunrendszert sejtek nem kívánt sejtek iránti célzására javasolták (4 ő7ö 989. számú amerikai egyesük.államokbeli szabadalmi smt3, es HÍV fertőzés kezelésére (WQ 91/ÖO360, és WÖ92/2Ö037X számú nemzetközi, közzétételi irtbök; 1 p «3 089. számú európai szabadalmi írat). A heterokonjugált «44clfenaayagolíat bármilyen hagyományos keresztkötő égte alkalmazásával siOállithatíuk. Megfelelő feereszíkötő ágertsek. jól ismertek a szakterületen, és ilyenek i-áer fel a 4b?ő 98ö. számú anrerikíú egyesük államokbeli szábadalrai hat, együtt több keresztkötesl módszerrel.

fertő SténaímagytogérsíMStte:

Bizouyos megvalósítási módok szerint a Bv8~agönistu ellenanyag {beleértve egét, barnán és lmutaoizált ellenanyagokat és ellenanyag-varíáusokaí) agy dlewtyag-fegmsos. KSlőnfefe módszereket fejlesztettek ki ellemnyag-fragmemsek előállítására. Hagyományosan ezeket a iragmeosekeí intakt ellenanyagok proteölitilrtís emésztésével állkoöák elő (lásd például Aferimoto és totsak, 1, Biochem. Biophys. Methoós 24, 1ŐM17. old. (1992) és Srenoan és mlsaL, Science 229, 81, old. (1985)], Azonban, ezeket a fragmsnseket már k.őzveífenúl

ÍO elói%lllíhatjok rekotubmáns gazdasejtek alkalmazásával is. Például Fafe’-Sl-Í If&gmeosekei közvetlenül visszanyerhetitek. £. c&fí sejtekből, ős kémiai dics kaposófeartuk E(ab’)2 írsgsnensekeí előállítva (Carior és mfetti., Eio/Teclmoiogy 10, 103-167. old, (1992(1. Egy másik megvalósítási mód szerint az F(ab^!)s feagmeost a <1094 lenein-eipzár alkalmazásával alakítjuk ki, amely elősegíti az Ffeb’jj molekula ősszeálbtásáf, Egy' másik megközelítési arád szerint: Fv, Fab vagy F(ah’)₂ íragmenseket izolálhatunk közvetlenül a rekömbináns gazdasejt'· tenyészetből is. Az ellemmyag-fragmensck előállítására szolgáló egyéb módszerek nyilvánvalóak szakember számára, fertt) dgöteu «.teűsyagcíá: ösrswftew

Bvk-agöthsta eltenanysgokat azok biológiai aktivitása alapján azonosítunk. Egy megvalósítást mód szerint a BvR-agomsta ellenanyagokat azok endötéliáíis sejtek ptolifeáciojának indukálására váló képessége a^pj#: azonosítjuk, amint a 2. példában beimtejok. Egy másik megvalósítási mód szerint s ByS-agönísta eiénányagokat: azok angiogenezs indukálására. való képessége alapján azonosítjuk, amint a 4, példában bemtuíaíjuk.

3. Szkrlnejő vszs ‘tökre

Bármilyen olyan megfelelő eljárást alkalmazhatunk fehérje-fehérje kölcsönhatások detektálására, amely alkalmas BvS-cal kölcsönhatásba lépd fehérjék vagy egyéb nmlskulák nem korlátozó példaként beleértve tmnszmembrán vagy iniracsllnláris fehérjéket — azonosítására. Az alkalmazható hagyományos eljárások közé tartozik az együttes ímtnnnptecipitáció, keresztkőtés és együttes tisztítás: gradiensen vagy kromatográfiás oszlopon, olyan fehérjék azonosítására, amelyek köfesönhaiásba lépnek Svö-eal. Ilyen vizsgálati eljárásuk esetében a Bv8 komponens lehel teljes hosszúságú: fehérje,, annak oldható származéka, a jelentőséggel bíró doménsek megfelelő peptid vagy a Bv8 bizoityos: régióit tartalmazó íúziós

Olyas eljárásokat alkalmazhatunk, amelyek a BvS-sal kölcsönhatásba lépni képes fehérjéket kódoló gének egyidőjü azonosítását is: eredményezik. Ezen eljárások közé fertőzik például evpreasziős könyvtárak próbázása, hasonló módon a kgtil könyvtárak ellenanyag-prőházásáuak jói ismert módszeréhez, jalzetí Evk vagy annak variánsának alkalmazásával.

Részletesen hemutafenk egy olyan eljárást, amely fehérje kölcsönhatásokat deteklái fe vfeo, s kéí-hihrid rendszert, de csuk szemléltetésként, nem korlátozásként. Ezen rendszer egy változatát leírták IChlea és: rotsak. Ette Halt. Acad. Set US A 88,9578-9582. old, <1991 jj, és kereskedelmi forgalomban kapható a Clouíech cégtől (Faló Alsó, €A).

-45Rövíden, az ilyen rendszer alkalmazásakor olyan piazmidókat szerkesztitek, amelyek két felfedd fehérjéi kódotok; az egyik plazmid transzkripciós aktivátor fehérje ENS-köíó doraénjáí kódoló ntederaidokaí tartalmaz foziónákatva BvS-at, vagy ártok peptidjét vagy fúziós fehérjéiéi sődoló nukleotid-szskveneíálraz, és a másik plazraid a transzkripciós atövátor fehérje aktivá» doménját kódoló nokleoüdokte tartalmaz krzlosálírava egy ismeretlen fehérjét kódoló eÖNS-bez, amelyet egy cDblS-kÖnyvfer részeként mzertáltimk ebbe a plazmidba. A DfeíS-kóíö dómén föriös plazraklol és a cDNS-könyvtárat a ótocharornyoas carmme élesztő olyas törzsébe fraaszfbrtojak, amely jelzögént (például HBS-t vagy loeZ-t) tartalmaz, amelynek a szabályozó régiója tartalmazza a transzkripciós aktivátor kötőhelyét. Egyik hibrid fehérje sem képes önmagában aktiválni a jelzőgén transzkripcióját: a ÖNS-kőtő dómén hibrid azért, mert. sincs aktiváló fenkciőla, és az aktiváló dómén hibrid sem,

ÍÖ mert sem képes lokalízáfat az aktivátor kötőhelyét, A két hibrid fehérje kölcsönhatása rekonstruálja a működőképes aktivátor fehérjét, és a jeizogén exgressziőlát eredményezi, amit a jelzögén termékének detektálására szolgáié vizsgálati eljárással detektálunk.

A kétdóbríd rendszert vagy hasonló: módszert alkalmazhatjuk aktivációs dómén könyvtárak szfcrínelésére, olyan fehérjék esetében, amelyek kölcsönhatásba lépnek a „csali” génterafekkei, Szeadéiíefeskent

...... és sem korlátozásul —BvS-aí alkálmazhatsnk csali géntermékkéht. Teljes genomlális vagy cDNS szekvenciákat fez.ienáhaftetonk az aktivációs döntést kódoló DNS-hez. Ezt, a könyvtárat, és a csalt Ev8géntertsékst a DfeS-kötó doménbez fuzionálhatva tartalmazó hibridet kódoló plzxmídot együtt iranszfermájak élesztő jelzótörzábe, és ? kapott sranszformánsoksí szkrisetjdk azokra, amelyek expresszáiják a jelzőgéüf. Például — én nem kor.uiozáskénf — 2 csalt Bvb-szekvonciáí, például a nyílt leolvasási fázis génjeit, klónozhatjuk egy vektorba oly módon, hogy a transzlációsat; fúziós áltatva legyen a OAI..4 fehérje DNS-kötS döménjéí kódoló ÖNS-hez, Ezeket a kolóniákat megtisztítják és a jelzógén expressziéjáéd felelős könyvtári plararsidokat izoláljuk. Azután DHS-szckvenálásí alkalmazunk a könyvtári plszmídok által kódolt fehérjék azonosítására.

A szakterületen rstjoszerüen alkalraszoít: eljárások alkalmazásával előáliítbatunk abból a sejívozsdbői származó cDNS-könyvtárat, amelyből a detektálandó csali BvÓ-génnel kölcsönhatásba lépő fehérjék szátmtazsak. A leírás szerinti rendszer szerint például a eDNS-bsgmenseket oly módon iúzertálhatjük be a plazmidba, hogy azok transzlációsán: fetooátelva legyenek a ÖAL4 transzkripciós aktivációs doraénjébez. Ezt a könyvtárat együtt trauszfermátotjuk a csali Bvő-gén—Ö Akd fúziós plaznriddal olyao élesztő törzsire, amelyik totaímazza a. tol? gént, amelyet a GAL4 aktivációs szekvenciát tartalmazó promóter irányit, A CÖMS által kódolt feltétje......amely fuzionhlíato van a ÖAL4 transzkripciós aktivációs doménbez. ás kólcsősbaíásba lép a csali Bvg-géraermékkel — helyreállítja az aktív GAt,4 fehérjét, és ezáltal irányítja az expressziéit, Az czpresszálódó kolóniákat a szakterületen rmteszbriies alksimaztet eljárások alkalntszásávíd detektálhatjuk, A cDNS-5 széfen megtisztíthatjuk ezekből a törzsekből, és alkalmazhatjuk a csali Bvk-génnei kölcsönhatásba lépő fehérje előállítására és izolálására a szakterületen míim/cmen alkalmazott eljárasok: alkalmazásával.

«: ri AvŐtopras.toyd? wgy nktotohto «{ödtote? svsptorari v/cíyáfeo e^dnewí

Az alábbi vtzsgátefí eljárásokat olyan vegydleíefc azonosítására terveztek, amelyek kölcsönhatásba lépnek Bv8-eal (például kötődnek hozzá), amelyek zavarják a Bv8 kölesóohatásáí á köfőgartnereivei vagy receptorával és amelyek modulálják a Bvó-génexpresszio aktivitását (azaz modulálják a Bv8-géuexpressztó szintjét) vsgy modulálják a öv» szintjét a szervezetben, Olyan vizsgálati: eljárásokat is atkalmadfetenk továbbá,

4Ö amelyek Bvfegánf szabályost szekvenciákhoz (például promőfeo-szekveneiákhozi kötődnek, és ennek

- 46 következtóbsn stoduláshatják a Bv8~géa axgrssszióját (lásd például Piait, K. A„ i, Bíol, Chem. :269, 2855828562, oki. (i 99é;i.

A találmány szerbi szkríneltóő vegylíistek nem korlátozó példás közé tartoznak peptidek, ellenanyagok és azok úagmeasei, ás xnás szerves· vegyölc-tek t például peptiáomímetikamtík), amelyek kötődnek

S Bv8~hox vagy Byg-reeeptorhoz, és vagy utánozzák a természetben előforduló ligandum ától kiváltóit aktivitást (azaz agönisíák), vagy gátolják a természetben előforduló ligandw által kiváltait aktivitást (azaz antagonisták).

Az Ilyen vegyuletek nem: korlátozd példái közé tartoznak például pepíidek, mint például oldható peptidekv nem korlátozó példaként beleértve véletlenszert! peptídkönyvtárak (lásd például Lant, K, S, és mtsai,, Ökttotre 354, §2-84, old. (1991); Houghten, R. és mtsai,, Natúré 354, 84-86, old. (1991)3,. és kombinatorikus

W kémiai eredeté, D- és/vagy L-konfigurácIójú amktos&yakból készített molekuláris könyvtár tagjait, Idszföpeplidefcet. (nem korlátozó példaként beleértve véletlenszerű vagy részben degeneralt, irányított foszfopeptíd könyvtárakat; lásd például Songvang, Z, és mtsai,. Coll 72, 767-778. old, (1993)1, ellenanyagokat (nem korlátozó példaként beleértve pulik lonális, monokionáiis, humanizált, aml-ldiotípus, kunéra vagy egy láncú ellestartvagnkat, es * An \ab\y es F \b expressz os btgtnsttse-e, e> azok eplíópkötó íragmeusetlj, és .15 ktsmsolékuiás: szerves és szervetlen molekulákat.

Találmány szerint szkrinelfeető egyéb vegyítletek nem korlátozó példái közé tartoznak kis szerves molúkslák, amelyek képesek bejutni a megfelelő sejtbe (például endotéiiális sejtbe), és képesek, 'betolj ásótó a BvS-gért,, vagy egy Bv8 által közvetített útvonalban szerepet játszó másik: gén expresszióját (példán! a gén expresszsójában részt vevő szabályozó régióval vagy transzkripciós: faktorokkal: w|ó kölosönbatás révén); vagy

2Ö olyan vegyüleíek, amelyek befolyásolják vagy helyettesítik a BvS aktivitását vagy más olyan húaeelluláris faktor aktivitását, amely részt vesz a Bv8 jeltovábbításában, kafafeollkus vagy metaboííkus út vonaliban.

A számítógépes modellezési és keresési technológiák lehetővé teszik olyan vegyüietek azonosítását, vagy·' tnár azonosított vegybletek javítását, amelyek képesek modulálni a Bv8 expresszioját vagy aktivitását ilyen vegyúiet vagy készítmény azonosítását követően; azonosítják az aktív itélyékeí vagy régiókat. Az ilyen aktív helyek tipikusan llgandumkötó helyek lehetnek. Az: aktív helyet a szakterúleten ismert eljárások alkalmazásával azonosíthatjuk, példán! peptkiek anílnosav-szekvcnetujából,, nnkleínsavak nukleobdszekvenciájából, vagy a releváns vegyütet vagy készítmény természetben előforduló Itgaudutujúval alkotott komplexének tanuímáayozásából, Ez utóbbi esetlton kémiai vágy rönígen-dílfrakclds eljárásokat alkalmazhatunk az aktív iselyntogtalálásáhoss, «Jy módos, hogy megkemssSk. azt a helyet á faktoron, ahová a ligaodaxn íalálhatő,

Azt követően meghatározzák az aktív hely háromdimenziós geometriát szerkezetet. Ezt ismert eljárások alkalmazásával végezhetjük, mint például :rőstgen-ktísAallográílavoi, amellyel meghatározható a teljés molekuláris szerkezet, Másrészről, szilárd- vagy íolyadekiázísü NMR-t hajthatunk: végre bizonyos íráramoíeksiárís távolságok ntoghaíározásárs. Bármilyen más szerkezet-meghatározó kísérleti eljárást elkalmazbaftmk részleges vagy teiejs geometriai szerkezetek elóáilítására.. A geometriai szerkezeteket mérítotjük olyan komplexált llgandutu mai.....természetben, előfordulóval vagy mesterségessel.....-,. amely növelheti az aktív hely meghatározott szerkezetének a pontosságát.

fia sem teljes vagy elégteleunl pontos szerkezetet határozunk meg, a. számítógép!: numerikus modellezés eljárások afelmazfeatjuk n szerkezet kiegészítésére vagy a pontosságának a javítására, A szakterületet! ismert bárorilyen medeilezó eljárást alkalmazhatunk, beleértve a paraméteres, modelleket, amelyek adott bíópnlunerekre specifikusak, mint például fehérjékre vagy naklemxavakra, molekuláris dinamikai

-47©delieket, amelyek molekuláris mozgások modellezésé® abpalsak, síafisztikaí mechanikai moíhllekct, amely temsíis adatokon alapulnak, vagy kombinált modelleket, A legtöbb modell esetében standard molekuláris erők figylembevátelére ws. szükség, amelyek .a feléphö atomok és csoportok közötti erőket reprezentálják, és a itzíkaokéfoiábao ismert erők közül választhatok ki, A nem teljes vagy kevésbé pontos kísérletes szerkezetek o ezekkel a modellező eljárásokkal számított teljes vagy pontosabb szerkezetek paramétereiként szolgálhatnak.

Végezetük mintáit meshatároztsk az aktív hely (vagy kötőhely) szerkezetét, akár kísérletesen, akár modellezéssel, vagy ezek kombinációjával, potenciális moduláló vegyóleteket azoBosítlratenk s vegyttleteket és a rnolekpláris szerkezetüket Wtsteoá adatbázisok lekérdezésével, Az ilyen keresés olyas vegyóleísk után kutat, amelyek ílleszkedtte.k az aktív hely meghatározott szerkezetéhez, és amelyek kölcsönhatásba lépnek az

ÍŐ aktív helyét meghatározó csoportokkal, Az ilyen keresés lehet rrtanoáils, de előnyösen számítógépi, Az ebben a keresésben megtalált vegyöletek a B vS-áktlvitás potenciális mödalátörai.

Más megoldásképpen ezeket az eljárásokat alkalmazhatjuk javított moduláló vegyöíetek szonosltásám egy már Ismert íncsdeiáló vegyüieí. vagy ligandum. alkalmazásával. Az ismert vagyaiét összetételét módosíthatjuk és a módosítás szerkezeti hatásait megbatárözhatjnk kísérletes és számítógépi: modellező eljárások alkalmazásával, amelyeket fed ismertettünk az új készítmény esetében, A megváíieziaföíí szerkezetet azután összehasonlítjuk a vegyidet aktív helyének a szerkezetével annak meghatározására, hogy javult-c az illeszkedés vagy a kölcsönhatás. Ily módón az összetétel szisztematikus változtatásával, mist például az eláalesoporiok variálásával gyorsas értékelhetjük a kapott, javított speeiölásö vagy' aktivitású módosított modnláló vegyhleteket vagy ligsndumokaí.

További kísérletes és számítógépi modellező eljárások nyilvánvalóak a szakember számára,: amelyek alkalmazhatók mcdtiláló vegyöteei azonosítására a. Bv8 és rohan trasszdukciős és transzkripciós faktorok aktív helyei (vagy kötőhelyei} alapján.

Molekuláris moáeíezó rendszerek példái a_; C/édháán és 0tőfiVT4 programok (Folygen Cörpömílön, Waltham, MAI A öfefiWfe energla-mmlnsalizálást és molekuláris dinamikai feukcíóRat végez. A (ÍUfiVDf végzi a molekuláris szerkezet előállítását, grafikus modellezését és elemzését. A gUíATA lehetővé teszi a molekulák egymás közötti viselkedésesek interaktív létrhosását, módosítását, vízualizálását és elemzését,.

Számos közlemény ismerteti a specifikus fehérjékkel kölcsönhatásba lépő drogok számítógépi rrtodeliezéséf. Roíívben, és rsfeai., A«a Pharmaeentíeal Fcnnfca 97, 154-lőő, old, 0 48S); Rípka, New Seientist 54-57. old, 0988, június lő.); McKinaiy ás Rossmrm, Anna, Rév. Phármacel. Toxícíot. 2Ö, 113-122. old,

0989); tery és Davis®, „OSAR; Quant’tative Strueture-Áctlvity Retóossifips in Drug Design”, 189- 193. old.,_: kiad,; .Aktit R. hiss, luc. (1989); hewís és Dean, Proc, R. hoc. kösd, 22ő, 125-.HÖ. és 141-162. old. (1989); és a nnkieinssv-komponessek modell-mceptora vonatkozásában; As&ew, és mixak, .?. Am, Ghem. Sóé. 113, 39821098. old. (1989). Vegyszerek szkrinelésére és grafikus megjelenítésére szolgáló egyéb programok beszerezhetők az alábbi cégektől, is; RíoDesígö, Inc. (Pasadena, CÁ, Allélíx, Inc, (felississauga, Ontario, Cansda) és Hypereabe, Inc. (Cambridge, Ontario). Habár ezeket elsősorban adott fehérjékre specifikus drogokkal kapcsolatos alkalmazásra tervezték, adaptálhatók DNS vagy RNS régióim specifikus drogok tervezésére, ha egyszer ezeket a régiókat azonosítottak,

Habár lent« kötődés megváltoztatására képes vegyítetek tervezését és létrehozását mutattuk be, ismeri vegyílfeiek könyvtarait, beleértve: természetben előforduló termékekéi vagy szintetikus vegyszereket, és

-4§ hibtögfeíiag aktív anyagokat, beleértve a fehérjéket Is szldínelljetütik olyan yegyüfetökre, amelyek ishibttorofc ygsgy akdvátorék,

A test ismerteted vizsgálatieljárásokkal azösosítoltvegyületek alkalmazhatok például BvS-gósterrnék bi. elógiai fhnkciójánsk a megvilágítására, Ilyen vegyületeket beadhatunk egy páciensnek terápiásán hatásos dősshaa különféle fiziológiai rendellenességek bármelyikéjiek kezelésére. A terápiásán hatásos dózis alatt a vssgyölet azon mennyiségét értjük, amely elegendő bármilyen hibíógkíi tikiét bármilyen mértékű enylútésére, m^akadáiyozásárs, megelőzésére vagy megváltoztatására,

A ŰvS-te áafediryegyktefeá vizsgáját? effdrám 'fervezhetítnk rendszereket Bv&cal kölcsönhatásba tépő (például ahhoz kötődő) vagy azt utánzó 10 vevőietek azonosítására, vagy olyan vegyületek azosösítására, amelyek képesek zavarai a Bv.S kötődéséi a receptorához, kötőpartneréhez vagy .wbsztrátjához. Az szonosítoít vegyületek alkalmazhatók például vad típusa és/vagy mutáns Bvfegérdermékek aktivitásának ntexlelálására, alkalmazhatók a Bv8 biológiai fenkcísjának vizsgálatára, alkíjlmszhatők olyan vegyületek azonosítására szolgáló: szkrinelésefchen. amelyek megzavarják a.

normális 8v8 kölcsönhatásokat, vagy maguk zavarják vagy aktiválják az ilyea kölcsönhatásokat.

A BvSrboz, SvS-recepiorokfeöz vagy szükssrátokhos kötődő vegyületek azonosítására szolgáló vizsgálati eljárások élve magában foglalja azt, hogy BvS-at és teszívegyüfetet tartalmazó reakciőelegyet állítunk elő olyas körtlimények között és annyi időn keresztéi, ami lehetővé teszi: a kei komptwns köfesörthatásái és kötődését, ily módon olyan komplex k lalakahfeái, amely eltávolítható a reskeiöefegyhől és/vagy detektálható a reafelöelegybes. Az afalmazoit Bv8 -fajta változhat a szfcrtrsslő vizsgálati eljárás: természetétől függően. Például amikor a természetben előforduló receptor agonisláját kívánjuk előállítani, teljés bosszúsága Bv8-at vagy oldfeaíé csehkolt BvS-át, pepiidet, vagy egy vágy több ©vS dornőní olyas pelipepíidhez vagy fehérjéhez fezíensltatva tartalmazó fúziós fehérjét alkalmazhatunk, amely előnyős a vizsgáim; rendszerben (például jelölést, a kasod komplex izolálását eredményező, stb.). Amikor a Bvfecai közvetlenül kölcsönhatásba léjfet vegyületeket kivárnánk előőllltaul, a Bvfesak vagy Bvk-at tartalmazó ferós fehérjéknek megfelelő pcptideket alkateazhatunk.

_:A szkífeelő vizsgálati eljárást különféle módokon hajthatjuk végre Például egy Ilyen vizsgálati eljárás végrehajtására szolgáló eljárás: szerint a Bv8-at, poispeptideí, pepiidet vagy azokból: álló feziós fehérjéi, vagy tesztvcgyületet lelmrgonyzúök szilárdíáztsra, és detektáljuk a sziiárdlazísra lehorgonyzóit BvS/íeszívegyüIst kortvpfexeket a reakció végén. Ilyen eljárás egy megvalósítási módja szerint a .reagáló Bvk-at lehorgonyozhatjuk szilArdiazssra,: és a íeszívegydletet, amely nincs lehorgonyozva, megjelölhetjük, akár közvetlenül, akár közvetve,

A gyakorlatban tnikrotiterlemezeket aíkaltnazhaiunk sziferdtósfcéat A leborgonyzoft komponenseket nem kovalens vagy kovalens kapcsolással immobíiizáihatjuk. A m kovalens kapcsolást a szdárdfázisnak a fehérje oldatával történő bevonásával és szárításával érhetjük el. Más megoldásképpen az ímmabíhzábndó fehérjére specifikus untnobilizák ellenanyagot, előnyösen monokkmális ellenanyagot alkalmazhatok a fehérjének a szálárdfázisra íőríénó fehorgonyzására. A felszíneket előre elkészíthetjük és tárolhatjuk.

A vizsgálati eljárás végrehajtásának érdekében a nem ímmobilszák komponenst hozzáadjuk a lehorgönyzolt komponenssel bevottl felszínhez. Miután a reakció befejeződött, az el nem reagált kosnponensekst eltávolítjuk (például mosással): olyan körülmények közöd, hegy a. kialakult komplexek immóbrllzálva maradjanak a szilárd felszínért. A. szilárd felszínre lehorgonyozott komplexek; detektálását többféle módos hajthatjuk végre. Amikor á korábban nem immobiljzálí komponensek előre jelölve vannak, a felszínre

..49-.

immobllizált jelző detektálása azt jelzi,. hegy a komplexek kialakultak. Amikor a korábbas nem hwöbifeálí komponens nincs előre jelölve, közvetett jelzőt alkalmazhatunk a felszínre imffiöbíllzsit komplexek detektálására, például a korábban nem immobílfeák komponensre specifikus jelzett, ellenanyag afKalmazásávai (az ellenanyagot pedig közvetlenül jelölhetjük, vagy közvetetten jelölhetjük anfi-lg efaanyaggai).

Más- megoldásképpen a reakciót felyadéklázisbaa hajthatjuk vegre, a. reakelötemtékeket elválasztjuk az el m reagált komponensektől, és a komplexeket deféktáliuk; például BvS fehérjére, polipeptídre, pepiidre vagy féziüs fehérjére vagy? az oldatban kialakult komplexek tehorgonyzására alkalmazod igsztvegyületckre specifikus ismsohílízáll ellenanyag alkalmazásával, és a lehetséges komplex másik komponensére specifikus jelzett ellenanyag: alkalmazásával a lehorgonyzót! komplex: detektálása végett,

e. ,4 ábfessp/mfekr zuvuró vcgytöcíek viargólaír &)'át'sxaí

Ezen tárgyalás céljából a BvS-esl kőlesönhatásba lépő makromelokuiákat „kölöparhtoreteek” nevezzük. Ezek a kötöparfeerek vaiöszhróleg részt vesznek a Bv& által közvetített biológiai «tvonalakhso. Ezákai kívánatos olyan: vegyöletek: azonosítása, melyek zavarják vagy felbomlassnák az. olyan kötőpartserek kölcsönhatását, amelyek alkalntazhatők BvS-aktívkás szabályozására vagy fokozására: a szervezetben, és/vagy ezzel az akítvkással kapcsolatos rendellenességek (vagy azok hiányának) szabályozására.

A Bv.8 és egy koíőpartser vagy kőtőparínerek közötti kölcsönhatást zavaró vegyületek azonosítására alkalmazotl vizsgálati rendszer alapeivc magában foglalja olyan regkelóélegy elnállitásáí,. mely Sv8«si vagy sttnsk valamilyen variánsát és a kSíŐpartneri tartalmazza, olyan körüitaények között és: arittyi idős keresztül, amely lehetővé tesz) a két komponens kőksőnhatásáí, es ezáltal komplex kialakulását, & vegyülsi gátló aktivitásának tesztelése eráekében a. reakelóelegyet a tesztvegyüfet jelenlétében: és hiányában: álhtink elő. A. tesztyegySletet kezdetben belerakhatjuk a reakcióelsgybe, vagy később adhrdjuk, a Svá és kötöparisere hozzáadása után, A kontroli reakciöefegyskei a. tesztvsgyíllet nélkül vagy placebóval inkubáljok. Azután: detektáljuk a BvS és a kőtöpartssr közötti bármilyen komplex kialakulását. A komplex kialakulása: a kontroll reakcióban, de nem a teszivegyölotet íaríalmszó reakeiőefegy'bes azt jelzi, hogy a vegyötet zavarja a BvS és a kötöpartúer kölcsönhatásét. Ezenfehll a komplex kialakulását a iesztvegyületet és normális Bvk fehérjét tartalmazó reakctóelegyekben összehassalithatjök a komplex: kialakulásával olyan reakcíőefégyekfeen, amelyek a tesztvegyületet és mutáns Svg-at: tartalmazsak. Ez sz összehasonlítás fontos lobot azokban az esetekben, sorikor kívánatos olyan vegyületek azonosítása, amelyek specifikusan megzavarják a muífcs vagy mutáteoít BvS, de nem a normális fehérjék köfesönbatásait.

A Bv8 és kötöparínerek közötti kölcsönhatást megzavaró vegyületek vizsgálati eljárását hsteregén vagy homogén Ibrmáíumban hajthatjuk végre, A heterogén vizsgálati’ eljárások vagy a Bv8,_: vagy a. kötőpartner fehorgonyzásái foglalják msguklw szllárdfelsra, ás a szilárdfezisra lehorgonyzód komplexeket detektáljuk a reakció végén, A homogén vizsgálati eljárásokban a teljes reakciót folyadékfáxíshan hajtjuk végre. Mindkét megközelítést mód szerint a reagensek hozzáadásának a sorrendje változtatható a tesztelt vegyületekről különböző Islbrmácie szerzése érdekében. Például a kölcsönhatási kornpeíleió zavaró teszróegyölefeket ügy azonosíthatunk, hogy a reakciót a teszfvegyüfci jelenlétében hajtjuk végre, a tesztvegyüSeinek a reakcióélégyhez történő hoízáadásával a Bv8 és kötőpartner hozzáadása előd vagy azzal egyidejűleg. Mas nregoklásképpen a má> kialakult komplexeket megzavaró íesztvegyőfeteket,. például magasabb kötés? állandóval rendelkező olyan vegyülefeket tesztelhetünk. a tesztyegyö leinek a reakeiőefegybcz történő hozzáadásával a

-50ko*mglsx«k kiaktoláss mán, amelyek leszoriíjíák a komponenseket a fempteről. .A különféle íbrmátitmokat röviden iswm^Sk az· alábbiakban,

Egy' heierolőg vizsgálati renászerbett vagy a BvS-at, vagy * kőtőparfeetei ímrgenyözzuk te szilárd fél szinte, inig. a sem lehorgonyzóit komponenst mogjelöljük., akár közvetlenül, akár közvetetten·· A gyakorlatban mkkrodtertemezekct kényelmesen alkalmazhatunk. A lehorgonyzóit komponenseket ne® kovalens vagy kelless kapcsolással unmobíltzálbatjuk. A ne® ksvstens kapcsolást egyszerűen a szilárdfezlsnak á BvS vagy kd&öpaFtasr oldatával történd bevonásával és szárításával érhetjük el Más megoldásképpen a lehorgonyzóit köímpsnenste specifikus imtnobilizáh ellenanyagot afaltnazbalunk a komponens szilárd felszínre történő lehorgonyzására. A. fétezineket előre elkászhhétjSk és iárolhatjuk.

l ö A vizsgálat! eljárás végrehajtása érdekében az immobilizált komponens párját érintkezésbe hozzuk a tessdvegyüieféi tartalmazó vagy nem törtólmazó bevont felszínnel. Mintán a reakció befejeződött, az el nem reagált komponenseket eltávolítjuk (például mosással), és a kiaiafcalt komplexek Immobilizálvu maradnak a szilárd felszínen, A szilárd felszínre lehorgonyozott komplexek detektálását többféle módon hajthatjuk végre. Ásáskor a nem. immohilízált komponensek előre jelölve vannak, a felszínre mmtobtltzO JeM detektálása azt

I5 jefei, hagy a komplexek kialakultak. Antikéra ne® immobilizált komponens mws «lőre jelölve, közvetett jelzőt Mktehnídtatunk s felszínre Immebifealt komplexek detektálására,, például a kezdetben nem ímmobllfzóh: komponensre specifikus jelzett ellenanyag alkalmazásával (az ellenanyagot pedig közveífénSl jelölhetjük, vagy közvetetten jelölhetjük unióig ellenanyaggal). A reakció komponense,lsek hozzáadást sorrendjétől függően a komplex kialakulását gátló, vagy a már kialakult komplexeket felbontó tesztvegyűletcket detektálhatunk·

Más megoldásképpen a reakciói íóSyadékfázfeban hajthatok végre a fesztvegyüleí jelenlétében vagy hiányában, a makeiőfemtékekei elválaszthatjuk a sem reagált komponensektől, és a komplexekéi detektálhatjuk;, péidféul a kötődő komponensek egyikére specifikus immobülzált ellenanyaggal tehorgonyozhatjuk az oldatban kialakult komplexekéi, és a másik partnerre specifikus jelöli ellenanyagot alkalmazhatunk: a lehorgonyzóit komplexek detektálására, A reagensek felyadékfeískoz: való hozzáadásának sorrendjétől függőén ebben az esetben a komplex kialakulását gátló, vagy a már kialakult komplexeket felbontó teszívegyüteteket detektálhatunk.

A találmány egy alternatív megvalósítási módja szerint homogén vizsgálati: eljárást aikahrsazhatnnk.

Ezen megközelítési mód szerint Bvk és kölőpartpere mát kialakult komplexét......amelyben akár a BvÜ, akár a.

kötöparioer inog vas jelölve áll ifjak elő, de «jelző által létrehozott jel le van csillapítva a komplex kialakulása miatt (lásd példáid a 4 1ÖŐ 49ő, számé amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (feubensteín), amely ezt a megfóteelíiési: módot immunológiai vizsgálati élj áfásokra alkalmazza). Az előre kialakult komplex egyik .komponensével versengő vagy azt leszorító tesztvegyüiet hozzáadása, a háttér feletti: értékű szignál kialakulását etedményezheii. Ily módon a kölcsönhatási megzavaró anyagokat azonosíthatunk.

Fgy előnyös megvalósítási mód szerint SvU-fuziót állíthatunk dó az unmobíbzáláshoz. Pékiául BvÜ-at vagy annak peptídfesgmonséf fuxionáltatjuk gltttation-S-temszieráz tosi t génhez föziös vektor, ennipéldául pö£X~SX-Í alkalmazásával, oly módon, hogy a „kőtösktlvitáss megmarad a kapott: fúziós fehérjében. A kótöparinert megíisriítbsffek és moneklönálfe ellenanyag termeltetésére alkaSfeazháijuk, a szakterületen rutinszerűen alkalmazott és feni ismertetett eljárások alkalmazásával. Ezt az ellenanyagot megjelölhetjük például ^UI radioaktív izotóppal, például & szakterületen rutinszerűen alkalmazott eljárások sikabnnzásával, Heterogén vizsgálati eljárásban a fúziós fehérjét lehorgonyozhatják gloiaííon-agaröz: gyöngyökhöz, A kötöpartnert azután hozzáadhatjuk a tcsztvegyüíet jelenlétében vagy hiányában elv módon, hogy az lehetővé tegye a kölcsönhatást és a kötődés létrejöttét A reakcióidő letekével a, sem kötődött anyagot: elmoshatjuk, és a jelzett ömnokfesális ellenanyagot hozzáadhatjuk a: rendszerhez és hagyhatjuk kötődni a komplexéit komponensekhez. A BvS és a kötöpartner közötti kölcsönhatást a giut&tioo-agaróz gyöngyökhöz kapósok radloakrivitás menuyíságé&ek

csökkenését eredményezhsl;

Más megoldásképpen a GST fúziós fehérjét és a kőtőparineri összekeverhetjük folyadékban, .a szilárd giuiaiiöü-sgsróz gyöngyök nélkül is,. A íesztvegyöletet a komponensek kölcsönhatásának megtörténte alatt vagy azután adhatjuk a reakcióhoz. Ezt. a keveréket azután hozzáadjuk a gluiaíion-agaróz gyöngyökhöz, és a sem kötődön anyagot élmossuk, A Sv§ és a köíopartner közötti köfesöíjfealást a jelzett ellenanyag hozzáadásával, és a gyöitgyökhöz kapcsolt radioaktivitás mérésével határozhatjuk meg.

Á találmány egy másik megvalósítási módja szerint ugyanezekben a módszerekben olyan, peptídfeagmemket irikalmazhaissk, amelyek a Sv& és/vagy a kötSpaöner kölődoraenjének felelnek meg (azokban^ az esetekben, amikor a kötőpartnsr fehérje j, az egyik vagy mindkét teljes hosszúságú fehérje helyett, A szakterületen rntfeszerifen alkalmazott bármilyen eljárást alkalmazhatunk a kötőhelyek azonosítására és izolálására. Baea eljárások nem korlátozó példái közé tartozik a valamelyik felségét kódísló gén maíagenezise, és a kötődés zavmnak a szkrlseiése együttes imstúspreeipttációs vizsgálati eljárásban. Azután kiszelektálhatunk kompssizaíő mutációt: a komplex második komponensét fcőáöló génben, A megfelelő fehérjéket kódoló gének szekvoscia-elemzése feltárhat olyas mutációkat, amelyek megfelelnék a fehérje azon régiójának, amely feszt

2Ö vesz a kölcsönhatásban. Más megoldásképpen az egyik fehérjét leborgsnyozha^uk, szilárd felszínre a fent ismertetett eljárások alkalmazásával, ós hagyhatjuk' kölcsönhatásba lépni és kötődni a jelzett kötSpartneréveí, amelyet preteolitikas enzimmel, mint például tripszimtél kezeltünk, A mosás titán egy viszonylag rövid, jelzett psptid maradhat kötődve a szilárd anyaghoz, amely tartalmazza a kőtödoméat, és amely izolálható és azonositfeaió sminosav-szekvenálássak Ha egyszer az is&aeeMáris kőtőpsrisert kődöSÖ gént: eiöáilitotink, rövid génszegmeusete állíthatunk el génsebészeti áton, amelyek .a fehérje peptidfeagmenseíí expresszáljsk, amely eket azután fesztelfeaíöak kötőaktívitásra és megtisztíthatunk vagy megsziatetizálhafusk.

hasííbúíjafc, A hasítási termékeket azután hozzáadhatjuk a lehorgonyzód fúziós, fehérjéhez, és hagyhatjuk kötődni, A asm kötődött pepíidek elmosása után a kötődött jelzett anyagot —amely az fetraceMSáris

6. Gyógyászati. készítmények

A találmány szerinti Bvfepoiipeptiífekof és azok modulátorait alkalmazhatjuk terápiás szerekként. A találmány szerinti BvS-polipepfiaekcí és BvS-mőduláiorokat ismeri eljárásuk szerint szerelhetjük kí

összekeverésével állítják elő opcionális Szjolőgiásan elfogadható hordozökkál, kőíőszerckkel és sföbilizálöszfirekkel („Msmíngios’s Pbamiseeurfeal ScfeneesX mint fart), IfefiHrtlt por vagy vizes oldotok iprtaájábaö. Az elfogadható hordozók, kötöszerek vagy sfabiíizáiőszerek nem toxikusuk a sejt vagy emlős számára, «melyet kiíeszünk az: aikabnszott dózisoknak és koneenfráciőknak. Ezek példái közé tartósnak, puí&efc, mint például foszfát, nitrát, és egyéb szerves savak; arítioxldánsok. mim például aszkorbídsav; kis mísfeknlatömegü polipeptidek (kevesebb, mint kőrtilbelül 1Θ oldal lánc); fehérjék, mint például szésumaibnmio, zselatin, vagy hmnuogtobulinok; hidrofil poíiiúcrek, mint például· pöíívűdlpirtolídös; amisosavsk. mint például glfeln, glfoamfo, aszparsgin, grgfeín vagy lízin; monöszaecbariddk, díszaocharidek, és egyéb szénhidrátok, mist például glukóz, matmőz vagy dmdrfoek; komplexképző szerek, mist példást EDTA; euko.raíköböfok, adut W például mannáéi vagy .szerbitől; sóképző eüenlosok, műit például nátrium; ésiuagy hemfenos felületaktív anyagok, mint például TWEEN, Fhuonic™ vagy PBG,

Az fo vivő beadásra alkalmazott 8v8~nak Aertfoek keli lennie:, Ezt köttnyed^a megvslőskhatjnk bármilyen szafctefofefen ismert eljárás alkalmazásával, mint például steril szőrökön kereszteli átszüréssel, a liöíifeálásí és ájrafefeidást megelőzően vagy azt kővetően,. A Bvfosí liofilizákformában fároihatipk. A terápiás .1.5 Bv'8-készitményekef általában olyan tartályba helyezzük, amelynek, steril bemeneti nyílása van, mint például intravénás oldatos zaesfcó, vagy olyan fiola, amelynek a dugója stszűrhaíó Injekciós tővel.

A SvS-aí adott esetben más trövekedés! faktorokkal kombináljuk vagy együtt adjuk be, Fáiddal köirtbmá&atjuk BG-ECÜP-fei vagy VEGF-fel,

A Bvk-at slkateazhatiuk rák kezelésére szolgáid más hagyományos terápiákban.

A beadás ismert eljárások szerint történik, például intravénás, infraperítonsáiis,_; intraeerebrális, míramuszkuláris, íntraokulárís, iohsariertéhs vagy iotrafezlooáks utakon történő infekcióval vagy intfeióvsl, helyi beadással, vagy fenntartott feíszahadoiású rendszerekkek

A. találmány szerinti gyógyászati készítmények dózisai és kívánt drogköríoenlrásiői változhattak az elképzelt alkalmazástól függően. A megfelelő dózis: és beadási ót meghatározása a szakember köteles tudásához 25 tartozik. Az áilaíldsédetek megbízható iránymutatást nyájfenak a humán terápiára szolgáló hatásos dózisok meghatározására. Á hatásos dózisok fejők közötti meghatározását az alábbi imdateii helye® lefektetett elvék. követésével hajthatjuk végre: ktedeufe I, és Chappeit, W., „The use of mserspectes seaiing Is tóeokfeeffeFk 42-96. old., „Toxíesklneífes aad New örug Deveiopmeaf, art.: Yáeobi és mtsai., kiad.: Pergamen Press, New York (1989).

Amikor SvS-pufipepfid vagy -modulátor fenntartott felszabadulási! beadására vari igény olyan kiszerelésben, amelynek felszabadulási jellegzetességei alkalmasak a BvS~po!ípeptid beadását igénylő betegség vagy reuáelieaesség kezelésére, a. Svk-polipeptid vagy -modulátor mlkröenkápszulácfeju is találmáuy rárgykörébe tartozik. Például a iísziífott formában lévő Bvk-at bezártságuk olyan mikrokapszulákba, asnelyekeí például cseppképzéses módszerekkel vágy· határfelületi politnerizációval áilifotnmk elő (például hidrox!mertl35 cellnlöz vagy zselatin raikrokápszulákba és poii-hneííhnetakríláí) rníkrokawalákbak kolloid feogszáillíó rendszerekbe (példáid llposzómskba, albumin mikrogömfeökbe, mlkmemfoziókba, osoorészecskékbe ás nanofeapszuiákba) vagy tnikroeinufeíőkba,. Ilyen módszereket Ismertéinek s „Remingfon’s Eharmseeuticül Söfences” irodalmi helyen (16. kiadás, szerk.: A.Ösolh

A Svg-at terápiás célra szolgáló fenntartod: felszabadulási) készítményekbe építhetjük be. A fenntartott felszabadá&ú készidséayek megfelelő példái közé íartezssak féligáteresztő polimer-mátrixok alakra formált

- 53 eászközök, példán! filmek, lídkrökapszulák formájában. A fentrtartöfí feíszstóáaíású mátrixok példát közé ta^rtozuak poliészterek, hídrögélek [például poli-íX-hidroKietil-ntetakrilát), amint az alábbi irodától helyeken le Írják; Lángét: és mtsai,, J. Biomed. Mater, Rés. 15, 167-277. óid. (198 i) és henger, Chem, Tech. 12,98^-105, of á. 09t2}} vagy poK-(visstókehol), polilakftdok (3 ?73 919. számú amerikai egyesSit államokbeli szabadalmi irsat, Ef 58 481. számú earópaí szabadalmi itat), Etóihammsav és gamma-ötíi-L-glataöíáí köpoümerjei [Sidmap és sasai, Biepöiymers 22, 547, old, (1983)); nem degradálható etilén-vioibacetáí (tanger és ítúsai, totó fent) váugr de^adálhaió íejsav-giíkelsav köpolhnerek, mint például a Leprán Dep&t™ (iejsav-glikölsav kopoltmerböl és feuproSldmcetáfoői álló injefóáíhaíó míkrsgősnbök), és pölá~D(-}~3-hídroxivajsav (EP¹133 988, számú európai szsabaáaító irat).

@ Mig. polimerek, mint például etilén-vlnüaeeíát és: fojsav-glikolsav lehetővé teszik molekulák 100 tóften.

fúl tartó felszabadulását, bizonyos hidrogélek rövidek!? időn keresztül szabadítanak fel fehérjéket. Amikor a beszart fehérjék hosszú időn teresztal megmaradnak a testben, azok dsnsmralódh&íBafc vagy aggregálódhstnak a ueClhesség. utód 37 ^:C-on, sasi a biológiai aktivitás elvesztéséhez és az: immunogemíás lehetséges változásaihoz vssesthet. Racionális stratégiákat dolgozatnak ki a fehérjék stabilizációjára, a szerepet: játszó ínecbatózmusíól

1.5 fegggöe®, Felááttl ha az aggregácló meebanitonusáró! felismertek, hegy az tóransolekuláris S-S· kötések kialakulása riö-díszalEd kicserélődésen kérésztől, a sttsbilizálást elérhetjük a szulfbíáril-oldalhfeeok módosításával, saysgs oldatokból történő lioSilsálóssal, a nedvesság-híruiem szahályozásávak megfelelő adtóékanyagok áikaimázSsávai, és speciritós polimer-mátrix készitoényelí kifejlesZáásévék

Á fenntartott fofezabadnlásó BvS-fcészitménvek tartalmazhatnak lípeszórtókba bezárt :Bv8-at is. Sv§~at tefcetazé hposzómákat a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával állíthatunk elő {Epsteín és mtsai., Proe. Natl Acad, Seb HSA 82,3688. old. t1985); Hwng és mtsai., Free. Natl. Acad, Seí, USA 77,4030, old. (1980); a í»h 3.21 S 121 A, számú nemet szabadalmi írat; sz EB 52 322 A; £F 36 676 A; SP 88 046· A; BP 143 949 A ; EP 142 441 A számú eatópai szabadalmi tótok; a S3-1V80Ö8. számú japán szabgdalmi bejelentés; a 4 485 045 . és 4 544 545, szarná amerikai egyesült áilamokbrii szabadalmi íratok; és az EP 102 324 A számú európai szabsdáhni tót). Rendszerint a bposzótsák kisméretű (körülbelül 20-80 nm) entiamelláris flpasúalí, amelyek lipidíartalma nagyobb totó: körülbelül 30 moBk koiesztótó. A kiválasztott arányt atánáhíthatjuk az optimális BvS terápia érdekében.

Helyi afetószás esetében a Bv8~af alkalmasan kombinálhatjuk más alkotóelemekkel, mint például hordozókkal és/vagy adjuvánsókkal. Nincs korlátozás az ilyen egyéb alkotóelemek természetére, kivéve azt, hogy azoknak fíziotöglásmi álfegadhatóknsk és a tervezett beadásra hatásosnak kell lenniük, és nem csökkenthetik a készítmény hatóanyagainak az aktivitását, A megfelelő vívőanyagok példái közé tartoznak kenőcsök, krémek, gélek vagy szíjszpenziók, tisztított kollagénnel vagy anélkül, A készítményekkel Impregnálhatonk transzdermáhs mpaszakag fíastotoofest és pólyákat is, előnyösen folyékony vsgy felfólyékony formáfeas,

Gól kiszerelés előállítása érdekében a folyékony készítménybe kiszerelt Svg-at összekeverhetjük, yizöldhaíö színtetikus polimer, mint például FEG hatásos íwmylségével megfelelő viszkozitású gél előállítása érdekében, nmei} et helyileg uíkafeazlíamnk, Az alkalnwitató pöliszaceharid lehet péidáúl eellalőz-szárutazek, mint például éterezett céliutóz-sztónszék, például alkíLeelhdózök, bidroxíaikil-egllalőzok és alkllhidroxiaikileetólőzök, például metíhcellulóz, hidtóxietil-celfotáz, karimimetií-cellufoz, hldroxipropil-metílcsIMőz és

4Ö hidfökípropll-eellulőz; keményítő ás tókcfonált keményítő; ugar, algasav és alghíátssk; guntóráfeikum; puilullán;

-54.«jgssrőxj kafragecaan; déxtránek; dextrteík; frúktánok; inulte rnannánok; xdteok; arabfeánsk; kitozábbk; gltogéirek; glukások és szmíetikns biopohmérek; vsfemte gumik, mte péídtó xaütán-gute; gategute:; nűkbab-gumi;: gumiarábiksm; tegakaní-gamt és karaya-gumi; és ezek származékai és keverékei. A találmány szerinti előnyős gélesítő ágess olyas, amely ínért a biológiai rendszerben, neki tovite, egyszcrb az eOÍMss, .5 ős nem tál folyós vagy viszkózus, és nem destabilizálja a benne lévő Bvk-at.

ElösySses a pobszaccharíd éterezett cellulóz-származék, előnyösebben jót defeíált, tisztdölí és az

USP-ben listázott celhrlóz-szártnazék, például mctílccilulöz és a bldroxiaikil-cellulóz szsttnazákok, mte például hííáfoxipropii-celluiéz, bidwfeíil-ceilulóz és hjdroxlprspji-öredlcellulőz. A legelőnyösebb a találmány szerte a jnteöcssíéíőz,

Á gélesiiésre alkalmazható pólteíílte-gilköl tipikusait alacsony és magas melekalaíSmegó PbCI-ek keveréke, a megfelelő viszkozitás előállítása értfekébem Például 40Ő-dö6 mofektilatőmegü és 1500· mteehslsísteegíl Pbö-ek keveréke hatásos tehet erre a eétea, amikor a megfelelő arányban össze vas keverve pép előállítása érdekében.,

A „vízaidható’’ kifejezés alatt pöllszacebarkiök és: PBG-ek Vonatkozásában kőitek! okiatokat és diszperziókat te éránk. Általában a cellulóz-származékok oldhatóságát az éter-csoportok szubszbfeelőjával határozzuk meg, és a találmány szerte alkalmazható síafeiíizálőszeraek elegendő mennyiségű ííyea étercsoporté· kell tartalmaznia a eellnldz anhidro-giuköz egységeiként ahhoz, hegy a számmékot yfeölditeóvá tegye, Az anhidro-ghifeóz: egységenként legalább <35 éter-csoport értékű éter-szubsztiíácíő mértéke általában elegendő, Ezeufelöl a eeteíóz-szárstazékök lehetnek aikáiífernsók, mini például Lg Na, & vagy Cs sók fomaájábars,

Hs rsetifeeöaiózt alkalmazunk s gélben, sz előnyösén kdrüíbeidl 2-5%, előnyösebben körülbelül 3% a gélben, és a BvS körülbelül 3ŐŐ-IÖŐÖ mgőnl mennyiségben van j elen,.

Féligáteresztő, beültethető xnembráneszhözők alkalmasak drogok hejurtstására bizonyos feSrSfeények kőBött Például 8 Bvítet, Ste-vtefesökat, Hyd-kimérákaí vagy BvS-aggn istákat vagy -aníagofesfefeat szekretálő sejteket teltetek he, és ilyen eszközöket beSlteíhetünk egy páciensbe. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezi eljárás rák megelőzésére vagy kezelésére, amely szerte 8vd-at, vagy az adott állapot szerte szükséges módon annak, agonístáját vagy antagonistd|st szekretálö sejteket: ültetünk he az annak, szükségét: szenvedő páciens testébe. Végül a találmány tárgyát képezi eszköz rák megelőzésére vagy kezelésére teplaníáíera páciensbe történd beültetés révén, amely eszköz féligáteresztő membránt és olyan sejteket tartalmaz, amelyek

BvS-at (vagy· aa adott álfepöí szerint szükséges mádon annak, aganistáját vagy antagonistáját) szekretalnak a memferános hete, és s_: membrán átjárható a Ste (vagy annak ágon istája vagy antagosistája) számára, és áfjárhattesn a páciensből származó, a sejtekre káros fektorok számára, A. páciens 'saját,. Bvd-termelésére ex vteo transzförmsií sejtjeit közvetlenül beültethetjük a páciensbe, adott esetben ilyen enkapszulácié néikül. Az élő sejtek membrános bezárására szolgáló; módszerek ismertek az átlagos képességd szakember számára, és a bezárt:

sejtek előállítása és a páciensbe, történő beültetésük elvégezhető indokolatlan kísérletezgette nélkül,

A BvS-at vagy Svtl-agöoistáí vagy -antagonlstát tartalmazó gyógyászati: készítményekéi: előnyősén:

megfeleld tartályban helyezzük el. A fertály mellé előnyösen a gyógyászati készítmény megfelelő alkalmazását és dózisát részletező utasításokat adunk; A szakember számára nyilvánvalő, hogy ezek az utasítások váltómnak a kezelés módjától függően.

A ialálmány szetted terápiás ágenseket szunw kezelésben alkalmazhatlak, A kezelések közé tartozik emelés, előnyösen ember kezelése 'normoníermelő szövettel vagy endokrin nslrigyskkel kapcsolatos állapot ásAagy túlzott, nem kívánatos vagy szabályozatlan angtogenezíssel kapcsolatos állapot kezelésére. Egy megvalósítási mód szerisi Bv8-at vagy BvS-agönisíát adunk be az annak szükségéi szenvedő emlősnek az áll rtpöt kezelésére hatásos stonsylségbea, A BvS-at polipepíid vagy nakleissav fenábas adhatjuk be. Előnyösen a JBv&ai vagy BvS-agonistáí: akkor alkalmazzuk, amikor az állapot olyas, amely egy adott honnoni temelő sej tek túlélésének vagy számának növelését teszi szükségessé. Ax ilyen, állapotok példái köze tartózik a dktóétesz. Egyéb állapotok közé tartoznak azok, amelyekben kívánatos a szaporítöszétvsk, mint például a here sej tjei a számának vagy túlélésének a növelése. Egyéb állapotok közé tartoznak azok. amelyekben kívánatos új

1Ö vér-erek kkdakniásnak a csökkentése. Az ilyen állapotok péIdái közé tartoznak daganatok, mint például hererák.

A Bv8«ax beadhatjuk egy másik vegyldettsl vagy késziínténnyel együtt. Egy megvalósítási mód szerint a vegyidet VEGE vagy' annak agordxiájs vagy' antogonistája, Adott esetben a vegytttet: lehet a pöílpeptídet, mint pél <dá«l VBGF-et kódoló nukletesav.

Egy megvalósítási mód szerint a férni < és x szakaszban ismertetett szktínelö vizsgálati eljárásokban azmnssított vsgytttetekeí alkalmazhatunk a Svk-aktivitás vagy -expresszié szintjének a ínodtóálására. Közelebbről a ByJksgonisískéní vagy Bvlbnak a receptorához való- kötődésének stiumlálására képesként azivRösiinlt vegyítetek alkalmazhatók tehernek, olyan kezelésekben,, amelyekben rnegnövekedett 8v$mktiyííásra van. szükség. llasoslöképpen, a Svk-gésexpressziö növelésére képesként azonosított vegyületek is alkalmazhatók tehetnek ilyen típusú kezelésre, '20 Előnyösen a SvS-at vagy annak agonistáját vagy aníagónistájáí beadhatják olyan állapéiban szenvedő egyénnek, amely bormonteneiő szövőitől vagy endokrin mirigyekkel kapcsolatos, amely előnyösen olyan állapot, amely egy adott hormont termelő sejtek számának a csökkentését, a sejtek protlíbráelójának csökkentését vagy áss angtogenezis csökkentését teszi szükségessé. Például a találmány tárgyat képezi egy személy' teorfekesységénök a szabályozására szolgáló eljárás, amely szedői a személynek Bvk-atrtagomstáí adunk be a termékenység szabályezására tesíásos mennyiségben, BvS-mttagottlstákát beadhatunk ciszták és a hoíTrtontermeiő szövetek túlzott probfbráeiójával kapcsolatos állapotok kezelésére is.

Szleroidhomöu-lttggő rendellenességeket te kezélbetónk a találmány szerimi készítmények és eljárások alkalmazásával. Ilyen rendellenességek közé tartozik a lípoid kongenítális adrenálts hiperpiázia, terméketlenség, szexuális érés, aBárogén-fdggö daganatok, komi pubertás, MeCune-Albrlgbt szindróma, odrena/ 'fopepfagfa

3& cöipgmíö'a vagy bipogonadotropikus hipogonadízmus.

A találmány szerinti ágensekkel és kószíiményekkel kezelhető specifikus állapot a rák, különösen szélerőid-, például androgén-íüggő rák. Egy, a találmány szerinti, rák kezelésére szolgáló előnyös eljárás szerbi fívk-antegonisiáí adunk be rákos vagy veszélyeztetett személynek a rák kezelésére hatásos mennyiségben. Egy megvalíteiíási m<sd szerint a rák hererák.

Egy további megvalósítási mód szerint Bvk-antsgonisíát adunk be páciensnek egy vagy töisb ksB3öterápiás ágenssel együtt, mim például rák kezelésében, .A találmány tárgykörébe tartozik az is, hogy a Bvkaí hoadhaíjbfe a kemoterápiás ágenssel történő kezdés előtt, alatt és után. oly módón, hogy g terápiás hatékonyság növekedjem Előnyös kemoterápiás ágensek nem korlátozó példái köze tartozik a viakrisztup oiszplaíin, meíolrexát, 3*-«£Ítíö-3M©2s>xUl«siáxni, taxánok (például pschtaxei íf?k>l\ Enstöl-Myers Squibb öfiCölogy, Erinceton, tel) és dpxetaxei lEf-őte/'f.'.kteF Ehone-Eoulsne Eprsr, Asiony, Péattcé}) és/vagy

- 56 mrt®cikl® ;®tibiötíkumok, Á gyártók aíssitássdi követhetjük az ilyen kemoterápiás ágensek eSŐáíiításáuak és adagolás! májének a meghatározására, vagy·· azokat a. szakember eotpirikasim is íortgáílapiíhatja. Az ilyen ketnöterápis elosUltesát és adagolási rendjei? ismertetik a „Chemötherapy Service” jszsrk.: M, C. Perry, kiad,: Wiüiauts ^Wlllems, Baltlmore, MD f 1 992)j irodain» helyen is.

KyíMwátó, hogy a sehprolherácíó növelésére és a. sejtproliferáeiö gátlására szolgáiét eljárásokat te vb·» és te vrfeo is végrehajthatjuk. Bizonyos esetekben kívánatos lehet a Svá-at in hozzáadni egy sejtmistához, hogy stimuláljuk agy specifikus sejttípus prolimráelőiát. A Bv8-eai kezelt mintát: azután alkalmazhatjuk szteinela vizsgálati eljárásokban vagy íranszpltmláihatiuk kezelésre szoruló személybe vagy á Hat i modellben.

A terápiást® sfefeumnáó BvS vagy Bvk-agonista vagy -aníagemstn hatásos mennyisége higg például a terápiás céltól, a. beadás htjától és páciens állapotától. Ennek megfelelően a kezelőorvos számára szükséges lehet a dózis bírálása és a beadás. átjártak a módosítása az optimális terápiás hatás elérés érdekében. Tipikussá a klinikái feezdfarvos addig adja a Bvk-at, amíg a dózisa eléri a kívánt hatást. A szisztémás kezelés tipikus nap? dózisa változhat kőrtübelül lő ng/kg és körülbelül 18Ő mgtkg vagy nagyobb érték között .áss emlős testtömegére vwdkoztzíva, a beadás- utjának íüggvónyében. Feltételezhető, hogy különböző kiszerelések tehetnek hatásosak különböző kezelési vegyStetek és különböző rendellenességek esetében, és hogy az egyik szervet vagy szövetet célzó beadás különböző bmitítntást tehet szükségessé, mint: egy másik szervé vagy szöveté,

Alternatív sitalásos javallatként a BvS~af olyan dózisban szerelhetjük ki és jutathatjuk a célhelyre vagy szövethez, amely képes olyan Byk-szíxttel létrehozni s szövetben, amely hatásos, do ne® mdokoteíiamd toxikus.

Ezt a szöveten belüli koncentrációt fenn kell tartani tehetőség szerint folyamatos infázióval, fenntartott felszabadulással, helyi alkalmazással, Bvfoat expresszáló sejtek beültetésével, vagy empirikusan meghatározott időközönkénti mjekdövai, A terápia hatását könnyedéit motfoorozhatjyk hagyományos vizsgálati eijártfeckkai.

Az adagolási rendet az egyedi körülmények alapján keli meghatározni, Azonban egy előnyös megvalósítási mód szerint a Bv-S-at vagy BvE-agomstát vagy -önísgonisíát naponta adjuk be, előnyösebben minden másnap, vagy még etóoyösebbes hetente kétszer, A kezelést előnyösen hat hósapou keresztül tblytsíjuk, előnyösebben egy hónapon .keresztül, és még előnyösebben legalább két héten kereszt®. A szakember számé® nyilvánvaló, hogy a pontos adagolási rendet a kezelőorvosnak kell meghatároznia az egyedi körülmények alapján,

BvS-pöbpepiiáet kódoló nukieisssvat génterápiám is aikaltnazbahmk, A geoterapíás alkaltnazásokbas a géneket juttatunk be sejtekbe, ásnák érdekében, hogy a terápiásán hatásos genetikai termék úr vb-o szintézisét érjük el. például hibás gén helyéííesitssére. A „génterapkf kifejezés alatt értendő mind a hagyományos génterápia, amelyben tartós hatást érünk el egyetlen kezeléssel, mind a génterápiás ágensek beadása, amely magában foglalja: terápiásán hatásos ÖNS vagy mfeteS egyszeri vagy ismételt beadását, Aofiszensz-RNS-eket és OteS-ekeí alkalmtszhatank terápiás ágensként bizonyos gének te vmó sxprcssziőj&tak a gátlására, Kimutatták, hogy rövid autiszossz ohgonukteolidókat vihetünk be sejtekbe, ahol azok inhibitorként működnek, z Sííjtmembmnou keresztül törtesd korlstpzeh felvételük miatti alacsony mtraceilfoárte koncentrációjuk ellenére is jEamecíuh és rntsaL, Proe, Mait Aead, Sej, USA 83, 4143-4140. old. fí98S)j, Az olágosukleotídökat mődösiíbstjük a felvételük fokozására, például a negatívan töltött foszfodiészíer-esoporfjaih helyettesítésével töltetlen csoportokkal.

- 57 ··

Különféle módszerek áiissk rendelkezésre opkieinsavsk életképes sejtekbe történő bejuttatására. A módszerek változnak attól függően, hogy a nnkleínsavat í« vöro tenyésztett sejtekbe juttatjak-e be, vagy fe vföo a tervezett gazda sejtjeibe. Nukíelnsavak emlőssejtekbe történő bejatíatására alkalmas: fe_: W/ro módszerek közé tartozik lipssszömák alkalmazása, elektröporáctó, mikrolstjekcm. sejtfórtő, DEAE-dextrán, kalcsum-fos^t:

ktes&pásss eljárás, stb. A. jelenleg preferált fe vive génátviteli módszerek köze tartozik transziékció virális (tiplkssaa rcírovirfe) vektorokkal és virális burokféhérje-bposzoma által közvetített iranszfékcio (Dzau és mtsak, Trenás in Bimeeimotogy ki, 205-219, elő, (:993)]. Bizonyos esetekbe® kívánatos lehet a rmklemsavforrásí: olyaságensben biztosítani, amely célozza a célsejteket, mint például sejtfeisziai membránfehéíjére vagy a célsejtre specifikus elicnanyaggal, a célsejtén található receptor hgandsunjávai, stb. Amikor liposzómákaí alkalmazunk, az eodoeitózisban részt vevő sejtfelszíni memhránfehérjéhez kötődő fehérjéket aikabnazlíatunk a célzásra és/vagy a felvétel elősegítésére, például olyan kapszlő-fetójékef vagy -ffagm&nsfeket, amelyeknek íropizmusa van az adott sejttípus írást, olyan fehérjék elleni ellénanyagok&t, amelyek ciklikusan internalizálödsak, vagy olyan fehérjéket, amelyek az lotraeelluláris elhelyezkedést célozzák, és fokozzák az bfraeelluláris féiéletidöt, A reeeptöí -közvetített endocitozis módszerét az alábbi irodalmi helyeken ismerfetífet

Wu és mtsal,, 1 Bioi.. Ckent. 2S2,4429-4432. óid, (1987) és feaguer és mtsah, Eroe, Kati. Acaá^:. Sci, USA 87, 3410-3414. old. (1990). A génmarkeres és génterápiás protokollok összefoglalásáért lásd Andersen ás raisai. (Science 25§, 898-813. old. (1992jj közleményét.

A 8vS szekvenciákat: alkalmazhatjuk diagnosztikai eljárásokbacr is. A Bv8 túltermelése szaperltőszerv cisztáját vagy rákját jelezheti. Ezenfelül pácienstől ssárruaző mintát eiernszhetösk tnofáií vagy sféködésképtelen .20 Bv8~ra, Á Hatóban az ilyen eljárások közé tartozik, páciensből származó minta Bv& espresszáójáunk őssz:öhíísosh'tása kontroliéval.

8. Gylrtmányok

A találmány ismertet gyártmányt is, amely betegség vagy rendellenesség kezelésére vagy megelőzésére, vagy terptékööység szabályozására alkalmas anyagokat tartalmaz, A gyártmány előnyösen tartályt, és címkét vagy tájékoztatót tartalmaz a tartályon vagy amellett A megfelelő tartályok közé tartoznak például üvegek, fiolák, fecskendők, stb. A tartályokat különféle anyagokból, mint példán! üvegből vagy műanyagból aiaídthaíjuk ki. A tartályban övS-at vagy annak agonistáját vagy amagonlstáját tartalmazó készítmény található, és a címke vagy a mellékelt tájékoztató előnyösen utasításokat tartalmaz: a: Bv8 vagy annak ogonistúja vagy aofagomstája alkalmazására. Egy megvalösíídsi műd: szerint a gyártmány Bvk-agonistáí és: utasításokat iastaimsz a Sv$30 agörtista alkalmazására rak kezelésére vagy megelőzésére. Egy másik megvalósítási mód szerint a gyártmány BvS-at és utasításokat tartalmaz a Bv8 alkalmazására olyas állapot kezelésére vagy megelőzésére, amely hourumtermelS enáoíáilális szövettel kapcsolatos. Egy még másik megvalósítási: mód szerint a gyártmány Bv8notagosistát és utasításokat tartalmaz a Bvk-aniagomsía alkalmazására termékenység szabályozására. A tájékoztatón féltüntetbctjük a megfelelő adagolási rendet: Is, Egy megvalósítási mód szerint a tájékoztatón art

3 flintetjtik fél, hogy a készítményt: körülbelül 9,91 pgdíg és 59 mg/kg közötti dózisban kell alkalmazni.

A példákban említeti kereskedelmi forgalomban kapható reagenseket a. gyártó utasításai szerint alkalmaztok, hacsak másképpen sem jelezzük. Az alábbi példákban — és a teljes leírásban......ATCC elérési számokkal azonosított sejtek forrása az ’A.merieas Type C! étere Celleetin»¹ (Manassss, VA).

-5S.LdtéMé

A őv« espresszíős místázgiáJtek megvilágltására Nörthent-blot elemzést tóttottunk végre külöufete humán, egér és patkány szövetekből származó RNS alkalmazásával. A barnán SNS-biototeí ^j2P-ve! jelzett, a humán 8vS szekvenciáján alapuló DNS-próbával blbfidszálíuk, míg sz egér és patkány RNS-bloíokat ‘^k-vel jelzett, az egér Svgszekveitsiáján alapuló BNS-próhával híisridizúltuk..

A N’orílíem-bloí eternzést a szakterületen jól ismert eljárások alkalmazásával hajtottuk végre. Például cWS-prőháköi áillíottenk elő 38-50 stg hantán vagy egér eOXS-írsgnws úlkalmazásávai a Btóí-Btemu // reagenskésziettel (Aruersbam), 38Ö8 pCl/mmol ^3JP~dCTP (Amershmn) alkalmazásával,. A próbákat Supánőtó

ΙΘ G5Ö ceatriíbgás oszlopokon (Fhamtaela) tisztítóitok meg, és; a hibridiztólét 68; ''Ο-οη végeztúk &pre«s//yő híbrldszáteős oldatban (Stratagene). Egy másik példában s biotokat és a bibrldizáelós próbákat hlbndízáteós püffedten (5 X SSEE; ,2X Denbsrdí-okfet; 188 mgZtnl denaturál lazaesperma DNS; 58% formájúid; 2% SOS) inkoháiíak. ól) órán kérésztől 42 '^JC-os, A biotokat több aikálostjrsal megmostuk 2X SSC: 8,05% SBS püffedten 1 órán kérésztől szobahőmérsékletem majd 38 perees keresztül mostuk azokat 8,1 X SSC; 8_sí% 'S©$ pnlferrel

59 ^oCöU, A biotokat éjszakás keresztül hívtuk elő pdmápkörAvoge?' elemzéssel (Fuji), Az ekvivalens RMSBtennyiségef kontroll aklm-pröbával iörtóBő bibrjdízálással állapítottuk meg.

BvS tuRNS-transzkrlptumokat defektáíhujk. A 9. ábrán szí mutatjuk. be, hogy egyetlen, 1$ kb mérető rnRNS-t detektáltunk hantán herében humán SvS próbával,. Nem detektáltunk expressziét egyik másik elemzett bttjuán szövetben sem. A 1ÖÁ. ábrán ezt mutálják be, hogy egyetlen mfeNS-t detektáltunk; egér herében ás szívben, A 18B. ábrán azt jsníatjuk be, hogy 1,9 kb és 8,S kb méretű mwakripíumök vannak jelen a patkány heréjében, de símének jelen; más patkány szövetekben, Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy « here s Bvk snRN’S expresszlósának a ® helye,

2. példa

Áz. adott sejttípusok ByS-ra valót rsagáíásástak meghatározásához. szarvasmarha JuelíékveBekereg kapilláris endőfelíáhs sejteket (ACE) és szarvasmarha agyi kapilláris endotébálís sejteket (SBC) vizsgáltunk prohlMcíss válaszra.

Röviden, ACE (mellékvesékére» kapilláris esdöfeliáüs sejt) és BBC (szarvasmarha agyi kapilláris) endotélíáhs sejteket tenyésztettünk alacssmy koncentrációjú glükózt tartalmazó DMEM tápközegben, amely ki volt egészítve 18% borjúszérummal, A sejtproliferaelós vizsgától eljáráshoz ÓŐÖÖ sejtet szélesztetíünk 12tnéróhelygs nokrotiferfemep mindep egyes mérőhelyére a fenti tápközegbeu, minden nélkül konteolikéní („C’¹ a 11. ábrán), 18 ngÁnl VECF-fel („V” a 11. ábrán), és 58, 18 vagy 1 oM fövS-Gd (Fe-temfeéztet rekombmtós fehérje). A teljes sejtszámot I hét leteltével Cbsíter számlálóval áiiapítolípk useg. A sejtszám megtöbbszöröződését az önkényesen 1 értékűnek választott kontroll körülményekben víszonyitölmk, A íápközegeket és az egyéb sejttenyészto reagenseket a Life Teetóolgies, iné, cégtől szemzőik be, A vizsgálati eljárás végrehajtásáért lásd példát!) Arnvind és Koonin {Curr. Bioi. 9,477-47S. old, (199§)j közleményét.

Előzetes eredményeket mutabmk be a 11 A. és 11.8, ábrákon, amelyek á sejtszám növekedését mutatják a köüítöffiuz viszonyítva. A BvB növekedést okozott a sejíprolifeáeiőbíín a vizsgák koucentráteókfean, a maximális hatást az 50 uM koticenfeációnái Egyelíök meg. A VEGE (pozitív teüroll) a kezeltetett koteröíihoz

4Ö viszonyítva otegközekfeisg háromszoros proliferáteot okozott az ACE és; a. 8CC sejtekben.

-59Beittálélásl vizsgálati eljárás

Megmértük a 8v8 hatása’ endotéliális sejtek túlélésére. Megközelítőleg. 2x ló⁵ szarvasmarha s^yi 5 kapilláris (BBC) sejtet szeleszteitünk ó-nrérőhélyss mikrotáerlsmez minden egyes, teljes· tápközeget faríalutaző mérőhelyére (amint a fenti 2. példában leírtok), A kővetkező napoa a teljes tápközeget leszivairák, és & sejteket rsurtden nélküli, vagy az alábbi komponenseket tartalmazó tápközegekbes tenyésztettük; 2% FGS, lö% FCS, 29. ng/nd VEOr f V” a 12, ábrán). 5 e.M BvS, 25 nM BvS, 26 ng/ml V.EGF 4 55 _!;M BvS ζ,ν-r-Bvk” a 12. ábrán) vagy 25 n.M BQ-VFGF, 48 órás inkubáció teás a sejteket eltávolitörtok. tripszimzácsóvai, és rögzítettük több óráu át 76% hideg eiaitöllal. A. sejteket azteáu szobábőtnérsékleteu megfestettük 2-4 árán kérésztől 5 pg/nd propídióunjedlddíii és 28 sgámi .RNázzal PBS-hem A sejtek szbb-Cl prefslját FA:C5 elemzéssel határoztuk meg. A sejípopuláeiö ezen százalékát: ábrázoltuk: az apoptőzbos sejtek százalékaként a függőleges tengelyeit a 12, ábra grafikonján.

Amint a 1:2, ábrából. látható, a BvS fokozta a BBC endötéilális sejtek íöléléséf. Közelebbről, kevesebb

1.5 apopiösnsos sejt volt: látbaié: a. tenyészetben a BvS bármilyen koncentrációja melleit, mint 254 FCS vagy 25 oM

SG-VEGF jelenlétében, ,4 BvS és VEGF színergjsrá hatást: mutatott, a két vegyidet komlúnáeiöjávsí á sejtek túlélése jobban növekedett, mini akármelyik nö vekedési iáktoríól önmagában, vagy W% FCS-en,

4, példa

Mertek a BvS képességé? angtogenezis indukálására, Egy- kísérleisorozatbun meghatároztuk a BvS hatását az mtrateszíikteáris vaszknláris prolsíéráeióra .fíejge csupasz bitn egerek heréjében,

LkscZ-1, VF'GF-e? es EG-VFC-F-e; kódoló adcnovámsnkas korábban mar leírtak p e» ot.íer. Natúré 412, 877-84, old, (2001:)), A BvS-at kódoló adenovirns elöállltásánoz a humán BvS 81 andnosav hesszüságn formáját kódoló eBNS-t klemoztauk a CMV ingázó vektorba (Sizatagese), és: a gyártó wsílásau köveitúk a nekombmatts adenovlrn» vektor és rekotnhmáns vírus: előállítására. A vírust a Virapnr cégtől (Carlsbaáj GA) származó nagyléptékű tisztítási reageaskészlet alkalmazásával íúziltoíiukmeg, és megtitráítek.

áz ó? vívó vtesgálafökhoz adenovíros vektorokat (BaeZ, VF.GF, EG-VEGF és Bv8) injektáltunk s Btege csupaszegerek Imréjébe IdMíÁ pót mennyiségben fn -- 5). Hét nap elteltével az állatukat leéltük, és a heréket rögzítettük és szövettanilag feldolgoztuk,

3Ö Amint a 13, ábrán látható, -a BvS -- hasonlóan a VFOF-hez és EG-V EG E-hez......megnövelte az ö? vteo mterstteiáik kapíliártsképzödésí a csupasz egerek Iteresejfjeiben, Nem figyeltük meg az interstíólálís: kapillárisképzödésí vagy angiogenezist sem a FBS, sem a l.aeZ adenovirns kontroll csoportokban. Sok kezelt állatban íübuláris atröfiáí is megfigyeltünk, A íukulárís aftóiia sz mtorsticláhs nyomás megnövekedéséből származhat, ami az sagiugenezis ind akarásának az eredménye:,

A lenti leírást elegendőnek tekintjük abhez, h egy a szakember számira lehetővé tegye a találmány gyakorlatba vételét. Azonban a_: leírásban bemutatott és feltárt találmány különböző módosításai nyilvánvalóvá válnak a szakember számára a fenti leírásból.

Claims (16)

1. Szabadalmi igénypontok

   1, In vitro eljárás endotéliális sejtek proliferációjának indukálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozására, vagy angiogenezis indukálására, amely eljárás magában foglalja a sejtek érlntkeztetését vagy olyan 8v8 pollpeptiddel, amely legalább 80%-ban azonos a 2, azonosítöszám szerinti vagy 4. azonosítöszám szerinti aminosavotldet kódoló nukleinsav-molekulávai.

   1, igénypont szerinti eljárás, amely mg foglalja a érlntkeztetését VEGF-ei vagy VBCSF-et kódoló nukleinsauvai,

   10 3, In vitro eljárás endotéliális sejtek proliferációjának, endotéliális sejtek túlélésének, vagy angiogenezisnek a gátlására, amely eljárás magában foglalja a sejtek éri étkeztetését olyan BvS pollpeptid antagonistájávai, amely legalább 60%-ban azonos a 2. azonositószám szerinti vagy 4. azonositószám szerinti amirmsav-szekvendával, ahol a pollpeptid képes endotéliális sejtek proliferációjának indukálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozására,

   15 vagy angiogenezis indukálására, és ahol az antagonists anfi-BvS ellenanyag, antígénkötő anti'BvS ellenanyagdragmens, vagy BvS-at kódoló nukieinsav elleni aníiszensz molekula,

   4, Az 1-3, Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az endotéliális sejtek szteroidogén mirigyből származó sejtek.

   5, A 2. azonositószám szerinti vagy a 4, azonosítószám szerinti amino$av~ 20 szekvenciával legalább ®%~ban azonos BvS pollpeptid anfagonistájának az alkalmazása, ahol a pollpeptid képes endotéliális sejtek proliferációjának indukálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozáséra, vagy angiogenezis indukálására, termekenység szabályozására szolgáló gyógyszer gyártására emlősben, ahol ez antagonista anti-BvB ellenanyag, antigénkötő anlbbvS ellenanyag-fragmens, vagy BvS-at kódoló nukieinsav elleni anflszensz

   25 molekula.

   6, A 2. azonositószám szerinti vagy a 4, azonosítószám szerinti aminosavszekvenciával legalább B0%-ban azonos SvS pollpeptid vagy a poiipeptidet kódoló nukléinsav-molskola alkalmazása emlősben hormontermelő szövetekkel kapcsolatos állapotok kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására,

   30 7, A 7. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az állapot sztoróidbormon -függő rendel

   S, A 5, igénypont szerinti alkalmazás, ahol az állapot iipoid kongenítáiis adrooálls hlperpiázia, terméketlenség, szexuális érés» anórogén-foggő daganat, korai pubertás, MeCene-Aibright szindróma, adrenai-hypophsla congenita vagy hipogonadotroplkus

   S IÁ 6-S. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az emlős ember.

   10, A 6-9» igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer V£Gf-et vagy

   VFGF-et kódoló nukieinsevaf tartalmas.

   11. A 2. azonosítószám szerinti vagy a 4. azonosítószám szerinti aminosav* szekvenciával legalább 80%-ben azonos 8v8 polipepí:id óntagonlstájának az alkalmazása, ahol íö a polipeptld képes endötéliális sejtek prohferációjának indukálására, endotéiiáíis sejtek túlélésének fokozására, vagy angiogenezís Indukálására, emlős olyan betegségének vagy állapotának kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, amely túlzott, nem kívánatos vagy szabályozatlan angiogenozissel kapcsolatos, ahol az antagonista anti-8v8 ellenanyag, antigénkötő anti-BvS eOenanyag-fragmens, vagy BvS-at kódoló nukieinsav elleni antlszensz

   15 molekula, ahol az antagonista ellenanyag, antigénkötő ellenanyag-fragmens, vagy antlszensz molekula.

   12» A 2. azonosltószám szerinti vagy a 4. azonosítószám szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban azonos 8v8 polipeptld entagonistájának az alkalmazása, ahol a polipeptld képes endotéiiáíis sejtek prolderációjának indukálására, endotéiiáíis sejtek
2. 2Ő túlélésének fokozására, vagy angiogenezís indukálására, rák emlősben való kezelésére szolgáló gyógyszer gyártására, ahol az antagonista entl-8v8 ellenanyag,· antigénkötő anti«8v8 eilenanyag-fragmens, vagy BvS-at kódoló nukieinsav elleni antlszensz molekula.

   13, A12, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rák hormonfüggő rák.

   14» A12, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a rák szaporítószerv rákja,

   25 15, A 14. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol a szaporítószerv petefészek, here, méh vagy méhnyak.

   15, A 11*15» igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer VEGF antegonistát tartalmaz, és az antagonista aotbVEGF ellenanyag, anfigénkötő anti-VEGF ellenanyag-'fragmens, vagy VEGE-et kódoló nukieinsav elleni antlszensz molekula.

   30 17, Az 1-4. igénypontok bármelyike szormb eljárás vagy az 5-15. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a SvS polipeptld natív szekvenciáié BvS polipeptld.

   IS, A 17. igénypont szerinti eljárás vagy alkalmazás, ahol a BvS polípeptid natív humán 8vS polípeptid.

   19, A 17, Igénypont szerinti eljárás vagy alkalmazás, ahol a 8v8 polípeptid aminosav» szekvenciája a 2.,, 4, vagy 6, azonoaitószám szerinti szekvencia.
3. 5 20, Az X'4, Igénypontok bármelyike szerinti eljárás vagy az $-i& igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a 8vS polípeptid heparlnt kei.

   21, Az 1, vagy 2, igénypont szerinti eljárás vagy az 6-10, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a BvS polípeptid kiméra polípeptid vagy immunadbezín.

   22, Az 1, vagy 2, igénypont szerinti eljárás vagy az 6-10, igénypontok bármelyike
4. 10 szerinti alkalmazás, ahol a 8vS polipeptidet kódoló noklsinsav-molekola az 1.

   azonosítószámú szekvencia 11-400, nokielnsavait, a 3, azonosítószámű szekvencia 10-338, nokielnsavait; vagy az 5. azonosítószámű szekvencia S7-484. nokielnsavait tartalmazza,

   23, kijárás 8vS antagonistájának azonosítására, amely eljárás magában foglalja:

   a) potenciális mOlékoíajeíölt érinlkeztetését a 2, azonositöszám szerinti vagy a 4.
5. 15 azonosítószám szerinti szekvenciával legalább 80%-han azonos aminosév-szekvenciát tartalmazd 8v8 poiipeptiddei;

   bj a pohpepfití endotéliáfís sejtek prolifsrácíójénak, endotéliális sejtek túlélésének vagy angíogenezls elősegítésére való képességének meghatározását; és ej és olyan potenciális vegyüíet azonosítását 8v8 antagonistájaként, amely gátolja a a
6. 20 polípeptid endotéliális sejtek prokferáclós aktivitását, endotéilális sejtek túlélési aktivitását, vagy angiogenezis aktivitását,
7. 24, A 2, azonosítószám szerinti vagy a 4. azonosítószám szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban azonos 8v8 polípeptid antagonistája, ahol a polípeptid képes endotéliális sejtek proliíeráeiójáoak indokálására, endotéilális sejtek túlélésének fokozására,
8. 25 vagy angíogenezls indukáíására, termékenység szabályozásában történő alkalmazásra emlősben, ahol az antagonísta anti-8v8 ellenanyag, antigénkotő anti-SvS ellenanyagíragmens, vagy 8v8-at kódoló nukleínsav elleni antíszensz molekula,

   25, A 2, azonosítószám szerinti vagy a 4, azonosítószám szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%-ban azonos 8v8 polípeptid vagy a polipeptidet kódoló

   30 nokleinsav-moiekola, emlősben hormontermeló szövetekkel kapcsolatos állapotok kezelésében történő alkalmazásra.

   ~ 63
9. 26. A 2. wnosítószám szerinti Vágy a 4. azonositőszám szerinti aminosavszekvenciával legalább 6Ö%~ban azonos BvB polipeptld antagonistája, ahol a polipeptld képes endotéliális sejtek ptoliferáelőjának Ihdükálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozására,, vagy anglogenezls indokálásáre, emlős olyan betegségének vagy állapotának kezelésében történő alkalmazásra, amely túlzott, nem kívánatos vagy szabályozatlan angiogenezlssei kapcsolatos, ahol az antagonista anti-BvB ellenanyag,, antigénkötő anti-8v8 ellenanyagfragmens, vagy BuB-at kódoló nukleinsav elleni antlszensz molekula, ahol az antagonista ellenanyag, antigénkötő eilenanyag-fragmens, vagy antlszensz molekula,
10. 27, A 2, azonositőszám szerinti vagy a 4. azonositőszám szerinti aminosavszekvenciával legalább 80%~ban azonos BvS polipeptld antagonistája, ahol a polipeptld képes endotéliális sejtek ptoliferáelőjának irsdokálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozására., vagy anglogenezls indukálására, rák emlősben való kezelésében történő alkalmazásra, ahol az antagonista anti-BvB ellenanyag, antigénkötő snti-Βνβ ellenanyag-fragmens, vagy 8v8~at kódold nukleinsav elleni antlszensz molekula.

    15
11. 28. A 27. igénypont szerinti antagonista rák emlősben való kezelésben történd alkalmazásra, ahol a rák bormonfűggő rák.
12. 29, A 27, igénypont szerinti antagonista rák emlősben való kezelésben történő alkalmazásra, ahol a rák szaporítószerv rákja,
13. 30, A 27. igénypont szerinti antagonista rák emlősben való kezelésben történő

    20 alkalmazásra, ahol a szaporítőszerv petefészek, here, méh vagy méhnyak,
14. 31, A 27, igénypont szerinti antagonista emlős olyan betegségének vagy állapotának kezelésében történd alkalmazásra, amely túlzott, nem kívánatos vagy szabályozatlan angiogenezlssei kapcsolatos, vagy a 2.7-30. Igénypontok bármelyike szerinti antagonista rák emlősben való kezelésben történő alkalmazásra, amely V8SF antagonlslávai együtt történő

    2,5 alkalmazásra szolgál, ahol a V68F antagonista antl-VEGF ellenanyag, antigénkötö anti-VEGP ellenanyag-fragmens, vagy Bv8-at kódoló nukleinsav elleni antlszensz molekula,
15. 32, Készítmény, amely BvB antagonisfát tartalmaz együtt gyögyászatllag elfogadható hordozóval, ahol a készítmény a 24, és 2B-32, igénypontok bármelyikében definiált alkalmazásra szolgál; és ahol az BvB antagonista a 2, vagy a 4. azonositőszám szerinti

    30 aminosav-szekveneiával legalább 80%-bsn azonos BvS polipeptld antagonistája, ahol a polipeptld képes endotéliális sejtek ptoliferáelőjának Indukálására, endotéliális sejtek túlélésének fokozására, vagy anglogenezls indukálására, ahol az antagonista anti-BvB ~ 84ellenanyag, antigéokőtő anti-BvS ehenanyag-ffagmens, vagy BvB-at kódoló nokleinsav elleni antbtensz molekula.
16. 33, Á B~S, és 11-20, Igénypontok bármelyike szerinti eljárás vagy alkalmazás, vagy a 24, és 201. Igénypontok bármelyike szerinti éntagonbta, ahol a BvS antagonbte ellenanyag ellenanyag-trag dfskos.