NO331375B1

NO331375B1 - DNA-molekyl kodende for sekretérbare peptider, protein, mulitkopivektor, plasmid, vertscelle, fremgangsmate for fermentering av proteiner og fremstilling av insulin

Info

Publication number: NO331375B1
Application number: NO20033671A
Authority: NO
Inventors: Paul Habermann
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2011-12-12
Also published as: MXPA03007115A; BR0207385A; DE10108100A1; WO2002066628A3; ATE320498T1; PE20020875A1; ES2258619T3; DK1364030T3; NO20033671D0; EP1364030A2; KR100858008B1; CN100575493C; CY1105696T1; NO20033671L; NZ527641A; PT1364030E; KR20030074832A; CA2438935C; AU2002247696B2; JP2004518442A

Abstract

Oppfinnelsen angår en ekspresjonskassett på formen Px-Sx-Bn-(ZR)-transportpeptid- (Z1Z2)- protein(Y)-(Z1Z2)-protein (Ym)-T der ekspresjonskassetten koder for et transportpeptid bundet via en sekvens Z,Z2 til et annet protein som i sin tur er bundet via Z,Z2 til et protein Yl som enten tilsvarer Y eller kan være forskjellig fira Y og transportpeptidet øker sekresjonshastigheten og Y og/eller Ym der Px er en hvilken som helst promoter DNA- sekvens utvalgt på en slik måte at optimale utbytter av proteinet av interesse blir oppnåelig, Sx er et hvilket som et hvilket som helst DNA som koder for et hvilket som helst signal- eller ledersekvens som muliggjør optimale utbytter, Bn er 1-15 genetisk kodbare aminosyrer eller en kjemisk binding, Z er kodonet for en aminosyre utvalgt fra gruppen bestående av Lys og Arg, Z1 er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen bestående av Lys og Arg, Z2 er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen bestående av Lys og Arg, protein Ym er en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst protein som kan produseres og utskilles av gjær (m = 1-5) eller en kjemisk binding (m = 0), R er et argininkodon, transportpeptid er en DNA-sekvens som koder for et peptid som kan transporteres effektivt og som kan passere membraner, protein Y er en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst protein som kan fremstilles og utskilles av gjær og der den biologiske aktiviteten, når Ym ikke er en kjemmisk binding, ikke er svekket av en basisk dipeptidforlengelse eller muliggjør degradering av forlengelsen av karboksypeptidaser, T er en utranslatert DNA-sekvens fordelaktig for ekspresjonen, og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av disse.

Description

Anvendelse av supersekreterbare peptider i fremgangsmåter for deres fremstilling og for parallell forbedring av de eksporterte former av polypeptider av interesse.

I lys av den økonomiske tilgjengelighet må fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytisk relevante proteiner føre til biologisk aktive produkter av den høyest mulige renhet. Ekspresjon av slike relevante proteiner i gjær anvendes mye her. Fremstilling av proteiner slik som insulin, GM-CSF ("Laukine") og hirudin ("Refludan") er et eksempel på vellykket utvikling av bioteknologiske fremgangsmåter som baseres på syntese av det spesielle protein eller forløper for denne i gjær. Vanligvis kan gjær syntetisere direkte spesielle hirudiner med godt utbytte i gramskala når Hansenula polymofa anbvendes (Weydemann et al., Appl. Microbiol Biotechnol. 44: 377 - 385, 1995) eller Pichia pastoris (Rosenfeld et al, Protein Expr. Purif:4, 476 - 82, 1996).

EP-A 0 324 712 beskriver hirudinderivatet ("Refludan") der den N-terminale aminosyre er leucin og dens konstitutive ekspresjon i Saccharomyces cerevisiae stamme Y79. EP-A 0 347 781 beskriver et mini-proinsulin og som eksempel dens ekspresjon i bakegjær. "Refludan" og insulin fremstilles ved å utføre to separate ekspresjoner.

Overraskende har vi nå funnet at hirudinderivater og mini-proinsulinderivater kan oppnås fra et felles forløperprotein ved å fusjonere forløperproteinet med en signal- eller ledersekvens, som gjenkjennes av gjær som et sekresjonssignal, via et basisk dipeptid, fortrinnsvis Lys - Arg, og likeså introdusere mellom det N-terminale hirudinderivat og mini-proinsulinderivatet et spaltingssete som gjenkjennes av en gjær endoprotease. Her foretrekkes også et basisisk dipeptid, for eksempel Lys - Arg. Etter ekspresjon finnes et hirudinderivat forlenget med Lys - Arg og mini-proinsulinderivatet som starter med den første aminosyren til insulin B-kjeden i supernatanten. Overraskende har vi funnet at utbyttet av mini-proinsulin forbedres betydelig sammenliknet med utbytte som oppnås ved direkte signal- mini-prosinulinekspresjon, mens utbyttet av hirudinderivatet forblir omtrent på samme nivå. Følgelig virker hirudin overraskende som et slags henhancer peptid med hensyn på utbytte av mini-proinsulin.

Peptider som kan virke som enhancerproteiner er vanligvis de som er relativt små og som naturlig utskilles i store mengder over en kort periode, for eksempel fra kjertelvev. Peptider av denne type som for eksempel inkluderer slangegift eller eglin C eller TAP (tykt antikoagulant peptid) utmerker seg ved sin ekstremt gode eksportkompatibilitet. Oppfinnelsen angår også slike proteiner.

En annen fordel kan være at hirudinderivatet har tilsvarende eller bedre farmasøytiske egenskaper sammenliknet med det hirudin som allerede anvendes i farmasøytiske midler. I dette tilfelle er det mulig å fremstille to eller også flere farmasøytiske midler fra en og samme fermentering. Som en konsekvens er det behov for mindre fermenteringskapasitet. Dette er en direkte fordel med hensyn på produksjonskostnader.

Produksjonen av flere produkter er imidlertid valgfritt. Mengden nødvendig av "Refludan" er for eksempel mindre enn for insulin, og dette kan resultere i prosesser der en av de farmasøytisk interessante substansene kastes.

For å øke utbytte er det mulig, som antydet i patentsøknad EP-A 0 200 655 å plassere en kort peptidsekvens via Lys- Arg N-terminalt foran hirudinderivatet, som en linker til signal- eller ledersekvensen. Det er også åpenbart for fagpersoner innen teknikken at valget av signal- eller ledersekvens direkte påvirker utbytte av proteinet av interesse. Utvelgelsen av en slik sekvens er gjenstand for ytterligere optimalisering. Sekvensen lokalisert ved den 3' ende av ekspresjoenskassetten påvirker også direkte utbytte ved å påvirke mRNA-stabiliteten. Også her er det åpenbart for fagpersoner innen teknikken at sekvensen kan optimaliseres for hvert protein av interesse som skal uttrykkes. Dette er også tilfelle for valget av en egnet promoter, som kan være induserbar eller konstitutivt aktiv. Valget av vektorsystem og vertssystem er like viktig for utbyttet. Følgelig er det, i stedet for bakegjær som er anvendt som et eksempel, mulig å anvende gjærtypene Pichia pastoris, Hanssenula polymorpha eller K. lactis sammen med vektorer eller ekspresjonskassetter, som i hvert tilfelle er optimalisert med hensyn på ulik fysiologi.

En annen fordel ved fremgangsmåter som muliggjør sekresjon til mediet er den enklere proteinkjemiske opparbeiding av proteinet av interesse. Vi har overraskende funnet at mini-proinsulin kan konsentreres i nærvær av hirudin ved filtrering gjennom membraner med en eksklusjonsgrense for molekyler på en molekylvekt større enn 10 kDa. Molekylene finnes nesten utelukkende i retentatet. Det er åpenbart for fagpersoner innen teknikken at utviklingen av nye seperasjonsteknikker og nye kombinasjoner av fremgangsmåtetrinn alltid gjør det mulig å forbedre renseprosessene. Dette er en direkte fordel med hensyn på utbytte og dermed også produksjonskostnadene.

Foreliggende oppfinnelsen angår således et DNA-molekyl (alternativ betegnelse: ekspresjonskassett) kjennetegnet ved at det er på formen: Px-Sx-Bn-(ZR)-transportpeptid-(ZiZ2)-protein(Y)-(ZiZ2)-protein(Ym)-T; der DNA molekylet koder for et transportpeptid bundet via en sekvens Z1Z2til et annet protein som er bundet via Z1Z2til et protein Yl som enten tilsvarer Y eller kan være forskjellig fra Y og transportpeptidet forbedrer sekresjonshastigheten til Y og/eller Ym, der: Pxer en hvilken som helst promoter DNA-sekvens utvalgt på en slik måte at optimale utbytter av proteinet av interesse blir oppnåelig;

Sxer et hvilket som helst DNA som koder for en signal- eller ledersekvens som muliggjør optimale utbytter;

Bn er 1 - 15 genetisk kodede aminosyrer eller en kjemisk binding;

Z er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg;

Zi er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg;

Z2er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg;

protein Ym er en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst protein som kan produseres og utskilles av gjær (m = 1-5) eller en kjemisk binding (m = 0);

R er et argininkodon;

transportpeptidet er en DNA-sekvens som koder for hirudin eller et hirudinderivat; protein Y er en DNA-sekvens som koder for proinsulin og derivater av dette som kan fremstilles og utskilles av gjær og der dets biologiske aktivitet, når Ymikke er en kjemisk binding, ikke er svekket av en basisk dipeptidforlengelse eller muliggjør degradering av ekstensjonen ved karboksypeptidaser;

T er en utranslatert DNA-sekvens som er fordelaktig for ekspresjonen.

Foreliggende oppfinnesle omfatter også proteiner, kjennetegnet ved at de er kodet av en hvilken som helst av DNA-molekylene ifølge kravene 1 eller 2.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse multikopivektor, kjennetegnet ved at den omfatter DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2.

Omfattet av oppfinnelsen er også plasmid, kjennetegnet ved at det omfatter DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, en multikopivektor ifølge krav 4 og/eller et plasmid ifølge krav 5, som en del av sitt kromosom, som en del av et minikromosom eller ekstrakromosomalt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåte for fermentering av proteiner ifølge krav 3, kjennetegnet ved at den omfatter (a) et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, en multikopivektor ifølge krav 4, eller et plasmid ifølge krav 5 uttrykkes i en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8 og;

(b) de uttrykte proteiner isoleres fra cellekulturens supernatant.

Omfattet er også fremgangsmåte for å fremstille insulin, kjennetegnet ved at den omfatter

(a) proinsulin uttrykkes som protein (Y) i ekspresjonskassetten ifølge krav 1 ved en

fremgangsmåte ifølge kravene 9 eller 10;

(b) proinsulinet fra trinn (a) isoleres og behandles med trypsin og karboksypeptidase

B; og

(c) insulinisoleres fra reaksjonsblandingen i trinn (b).

En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en vertscelle som omfatter det ovennevnte DNA-molekyl eller den ovennevnte multikopivektor eller det ovennevnte plasmid som en del av dets kromosom som en del av et minikromosom eller ekstrakromosomalt hvori den nevnte vertscelle fortrinnsvis er en gjær spesielt utvalgt fra gruppen omfattende S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha og P. pastoris.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er ovennevnte fremgangsmåte, der vertscellene etter at de er separert fra fermenteringssupernatanten, dyrkes gjentatte ganger i friskt medium, og det frigitte fusjonsprotein isoleres fra hver supernatant oppnådd under dyrkingen.

En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den ovennevnte fremgangsmåte der fremgangsmåtetrinnet for konsentrering av det uttrykte protein i supernatanten etter utfelling utvelges fra gruppen bestående av mikrofiltrering,

hydrofobinteraksjonskromatografi og ionebyttekromatografi.

Utførelsesformen ifølge oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å fremstille insulin, der (a) proinsulin uttrykkes som protein (Y) ifølge ovennevnte ekspresjonskassett i

ovennevnte fremgangsmåte;

B; og

(c) insulin isoleres fra reaksjonsblandingen fra trinn (b),

spesielt der transportpeptidet er hirudin eller et hirudinderivat som ødelegges eller biologisk inaktiveres etter trinn (a) eller (b).

En ytterligere utførelsesform ifølge oppfinnelsen er et protein der proteinet er et hirudinderivat med to basiske aminosyrerester ved dens C-terminale ende.

Igler av typen Hirudo har for eksempel utviklet ulike isoformer av trombininhibitoren hirudin. Hirudin er blitt optimalisert for farmasøytiske behov ved syntetisk variering av molekylet, for eksempel ved å bytte ut den N-terminale aminosyren (for eksempel EP 0 324 712). Oppfinnelsen inkluderer anvendelse av hirudin og hirudinvarianter. Spesielle utførelsesesformer ifølge oppfinnelsen anvender en av (de naturlige hirudinisoformene, de naturlige isoformene er felles betegnet "hirudin"). En naturlig isoform er for eksempel Val-Val-hirudin eller Ile- Thr-hirudin. Andre utførelssesformer ifølge oppfinnelsen anvender en variant av en naturlig hirudinisoform. En variant er avledet fra en naturlig hirudinisoform men inneholder for eksempel ytterligere aminosyrer og/eller aminosyredelesjoner og/eller aminosyreutbyttinger sammenliknet med den naturlige isoformen. En hirudinvariant kan inneholde alternative peptidsekvenser fra naturlig hirudinisoformer og nye aminosyrer. Hirudinvarianter er kjent og beskrevet for eksempel i DE 3 430 556. Hirudinvarianter er kommersielt tilgjengelige i form av proteiner (Calbiochem Biochemicals, kat. nr. 377-853, -950, - 960). Betegnelsen "hirudinderivat" angir sekvenser som er minst 40% homologe med naturlig hirudin.

Eksepresjonskassetten introduseres fortrinnsvis i gjær slik som S. cerevisae, K. lactis, H. polymorpha eller P. pastoris. Nevnte ekspresjonskassett kan ha en eller flere kopier stabilt integrert i det spesielle gjærgenomet eller kan være til stede ekstrakromosomalt på en multikopivektor. Det er åpenbart for fagpersoner innen teknikken at denne teknikk også er anvendbar på andre systemer slik som en dyrecellekultur eller planteceller. Dette er også et aspekt ifølge oppfinnelsen.

Ekspresjonssystemet beskrevet ovenfor fungerer som et eksempel. Det er åpenbart for fagpersoner innen teknikken at for å introdusere ekspresjonskassetten inn i det utvalgte system må hensiktsmessige rekombinante DNA-konstruksjoner lages avhengig av det utvalgte vertssystem. Følgelig kan industriell fermentering optimaliseres i forhold til det utvalgte verts/vektorsystem.

Eksempel 1: Konstruksjon av et gjærekspresjonsplasmid som koder for hirudin ("Refludan") - Lys-Arg-mini-proinsulin.

Utgangsmaterialene er plasmidene pK152 (PCT/EPOO/08537), pSW3 (EP-A 0 347 781) og det rekombinante gjærplasmidderivatet som koder for bovint interleukin 2 (Price et al. Gene 55,1987). Gjærplasmidet kjennetegnes ved faktum at det bærer a-faktorledersekvensen under kontroll av gjær ADH2-promoteren. Sekvensen etterfølges av den bovine interleukin 2-cDNA-sekvensen som er bundet via et kpnl/Nocol-restrilcsjonsenzymsgjenkjennelsessete og som inneholder, etter manipulering, et Ncol-restiksjonsenzymsgjenkjennelsessete i den utranslaterte 3' ende som er unik i vektoren. Følgelig kan cDNA-sekvensen enkelt fjernes fra plasmidet via Kpnl/NcoI-spalting. Siden gode ekspresjonsutbytter er rapportert, kan det antas at den gjenværende 3' interleukin 2-sekvensen (som T) har en stabiliserende effekt på mRNA og følgelig ikke trenger å fjernes eller erstattes av en gjærterminatorsekvens. Plasmid pK 152 bærer DNA-sekvensen som koder for Leu-hirudin ("Refludan") og plasmid pSW3 bærer DNA-sekvensen som koder for mini-proinsulin. Gensekvensen som skal kode for hirudin- Lys-Arg-mini-proinsulin tilberedes først ved hjelp av PCR-teknologi. For denne hensikt tilberedes 4 primere ved hjelp av "Expedite"-DNA-syntesesystemet: Primeren hir_insfk beskriver forbindelsen mellom kodonene for de terminale aminosyrene til hirudin (59-65) og insulinsekvensen B1-B7 via Lys-Arg-likeren. Primeren hirjnsrevkr er 100% komplementær til dette. Primeren hirfl kodr for starten av hirudingenet forlenget til Kpnl-spaltingssetet slik beskrevet i EP-a 0 324 712.

Primeren insncoirev markerer den 3' ende av det syntetiske mini-priinsulin ifølge EPa-0 347 782. To standard polymerase kjedereaksjoner utføres ved hjelp av primerparene hirfl/hir_insrevkr med DNA til plasmid pK 152 som templat oghir_insfkr/insncoirev med DNA til plasmid pSW3 som templat. Reaksjonene utføres i 100 fil PCR buffer med 1 hvert tilfelle, 200 nmol primer., 1 ul polymerase og 100 ng vektor. Trinn 1 er en 2-minutters inkubering ved 95°C. Dette etterfølges deretter ved 25 sykluser av 30" ved 95°C, 30" ved 55°C og 30" ved 72°C. Den siste syklusen etterfølges av en inkubering ved 72°C i 3 minutter, og reaksjonen stoppes deretter.

Siden primerene hir_insrevk og hir_insfkr er 100% komplementære overlapper DNA-produktene til de to produktene i henhold til sekvensen slik at i en tredje reaksjon, som anvender produktene fra de første to reaksjonene som templater og primerne hirfl og insnvoirev, dannes et DNA-fragment som koder for hirudin og mini-proinsulin atskilt ved Lys-Arg. PCR-fragmentet spaltes ved enzymene Kpnl og Ncol og deretter, i en T4 ligasereaksjon, innføyest i paADH2-vektoren åpnet av Kpnl/Ncol. Analogt med eksempel 7 i EP-A 0 347 781 transformeres deretter kompetente E. coli celler fra stammen MM294 med ligeringsblandingen. Plasmid-DNA isoleres deretter fra to klonr for karakterisering ved hjelp av DNA-sekvensanalyser. Etter bekreftelse på den innføyde DNA-sekvens anvendes DNA fra en plasmidtilberedning for å transformere celler fra bakegjærstammen i 79, ifølge nevnte eksempel. Når paADH2-vektoren anvendes etterfølges imidlertid introduksjon av vektoren av utvelgelse for komplementering av trpl-l-mutasjonen i motsetning til nevnte eksempel. For en annen kontroll resioleres plasmid-DNA fra gjærtransformasjonene og analyseres ved hjelp av restriksjonsanalyse. Ekspresjonsvektoren som er konstruert betegnes pADH2Hir_KR_ins. Ekspresjonen utføres ifølge eksempel 4.

Eksempel 2: Konstruksjon av et gjærekspresjonsplasmid so koder for hirudin (Refludan)-Lys-Arg-insulin B-kjede-Lys-Arg-insulin A-kjede

Patentsøknad EP-A 0 195 691 beskriver proinsulinderivater som kan innholde dipeptidet XY, der X og Y hver tilsvarer Lys eller Arg, som en linker mellom B- og A- kjedene til isulin. Det følgende eksempel beskriver tilberedningen av en ekspresjonsvektor for pro-insulinderivatene av denne type. En DNA-sekvens som koder for et proinsulinderivat på formen Bkjede - Lys-Arg - A-kjede utvelges ved eksempler og syntetiseres.

Syntesen av gensegmentet utføres ifølge eksempel 1. Oligonukleotidsekvensene som anvendes er hirfl og insncoirev. Oligonukleotidene B_KR_Afl og B_KR-Arevl syntetiseres de novo.

Den delen som vises i uthevet skrift av de to avbildede primerne antyder den delvis overlappende sekvens. Begge primerne parrres eksakt med sekvensen til mini-proinsulingenet ifølge EP-A 0 347 781, med unntak av de 6 understrekede nukleotidene. Den understrekede delen tilsvarer kodonene for Lys og Arg. DNA til plasmidet pADH2Hir_KR_Ins konstruert ifølge eksempel 1 fungerer som templat i PCR.

Som beskrevet i eksempel 2 utføres to polymerasekjedereaksjoner ved anvendelse av primerparene hirfl/B_KR_Arev og insncoirev / B_KR-Afl. Templaten i hvert tilfelle er DNA til plasmidet pADH2Hir_KR-Ins konstruert i eksempel 1. Produktene fra begge reaksjoner fungere som templat i en tredje PCR som anvender primerparet hirfl og insncol. Reaksjonsproduktet fra PCR 3 spaltes med Ncol/Sall og innføyes i den åpne paADH2-vektoren. Etter sekvens- og restriksjonsanalyser betegnes det korrekte plasmidet som pADHHirKRBKRA.

Eksempel 3:Konstruksjon av et gjærplasmid som koder for hirudin - Lys-Arg - apeproinsulin.

Patentsøknad nr. EP-A 489 780 beskriver et plasmid, pINT9d, som inneholder cDNA av apeprosinulin (Wetekam et al, Gene 19 side 179-183,1982). DNA til plasmidet og

DNA til plasmidet og DNA til plasmid pK152 fungerer som templater. Ptrimeren Hirfl beskrevet i eksempel 1 anvendes og tre ytterligere primere syntetiseres.

Primeren insncorev binder reverst til 3' region av insulingenet klonet i pINT90d og har sekvensen 5 '-TTTTTTCCATGGTCATGTTTGACAGCTTATCAT-3' (SEQ ID NO: 9) Den understrekede sekvens antyder gjenkjennelsessete for restriksjonsenzymet Ncol.

Primeren hir_insfkr har sekvensen:

Her indikerer nukleotidene i uthevet skrift Lys-Arg-linkeren mellom hirudin og proinsulin.

Primeren hirjnsrevkr er fullstendig komplementær med primeren hir_inskr og har sekvensen:

I likhet med eksempel 1 utføres to polymrasekjedereaksjoner. Primerparet hirfl/hir_insrevkr /hir_insrevkr reageres med DNA til plasmid pK 152 og primerparet hir_insfkr/insncorev reageres med DNA fra plasmidet pINT91d. Som beskrevet i eksempel 1 fungerer produktene fra begge reaksjoner som templat i en tredje PCR som anvender primerparet hirfl/insncorev. DNA-produktet fra denne reaksjonen inkluderer sekvensen for hirudin_Lys-Arg_proinsulin. Dette spaltes deretter med enzymet Ncol og Kpnl og, i likhet med eksempel 1, innføyes dette i plasmid paADH2. Følgelig kan ekspresjonsvektor for et hvilket som helst naturlig proinsulinderivat konstrueres.

Eksempel 4: Ekspresjon av de rekombinante produkter

Ekspresjonen inndeles i to faser. Først dyrkes en prekultur i gjær minimalt medium. Mediet har en følgende sammensetning per 11:

Hovedkulturen eller ekspresjonskulturen inokuleres med en alikvot av prekulturen. Hovedkulturmediet innholder per liter.

Ved anvendelse av mediene beskrevet ovenfor utføres ekspresjon i risteflaske på følgende måte: 0,3 ml av en prekultur som er dyrket over natten fortynnes med 80 ml av et forvarmet medium og inkuberes med kraftig risting ved 30°C i ca. 24 timer. I hvert tilfelle sentrifugeres 1 ml av kulturen som er fremstilt på denne måten etter bestemmelse av den optiske tetthet, og etter fjerning av cellene, blir supernatanten lyofilisert og analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Det biologisk aktive hirudininnholdet bestemmes ved å utføre en trominhibisjonsanalyse.

I en alternativ fermenteringsprotokoll fjernes cellene ved filtrering eller forsiktig sentrifugering. Mens proteinet av interesse isoleres fra mediet omsettes cellene med frisk forvarmet hovedkulturmedium inneholdende alkohol og ikke mer enn 0,5% glukose som karbonkilde, og fermenteringen fortsetter deretter uten forstyrrelser. Dette trinnet kan gjentas opp til 5 ganger.

Eksempel 5: Trombininhibisjonstest

Hirudinkonsentrasjonen bestemmes ifølge fremgangsmåten til (Griebpach et al.

(Trombosis Research 37, s 347 - 350, 1985). For dette formål inkluderes særskilte mengder av en Refludan standard i målingene for å etablere en kalibreirngskurve fra hvilket utbytte i mg/l kan bestemmes direkte.

Eksempel 6: Kloning og ekspresjon av hirudin - Lys-Arg .- mini-proinsulinfusjonsprotein i P. pastorissystemet.

"Invitrogen" selger et klonings- og ekspresjonskitt for fremstilling av rekombinante proteiner som anvender P.pastoris som vertssystem. For dette finnes en detaljert teknisk protokoll som angår fremstilling og etterfølgende ekspresjon av et P. pastorissystem for fremstilling av et ønsket rekombinant protein slik at kun konstruksjonen av ekspresjonsvektoren som koder det ønskede protein må beskrives når den nevnte protokoll følges. "EasySelect" Pichia ekspresjonskitt (katalog nr. Kl 740-01) anvendes.

pPICZa-vektoren er en del av dette kittet. Åpning av vektoren ved restriksjonsenzymene Xhol og SacII gjør det mulig å tilføre, i likhet med eksempel 1, et protein av interesse til alfa-faktorledersekvenen og å undersøke sekresjonen til supernatanten. Kloningen trenger to primere. Primeren pichia_H_lfl (SEQ ID NO: 12) har sekvensen:

Templatet som anvendes er DNA fra plasmid pADH2Hir_KR_Ins. En standard PCR med begge primere produserer et DNA-produkt som inneholder sekvensen hirudin - Lys-Arg - mini-proinsulin forlenget med Xhol- og SacII-integreringssetene. Dersom DNA-produktet spaltes tilfredsstillende fragmentet isoleres kan nevnte fragment innføyes i den åpne DNA-vektoren i en T4 DNA-ligasereaksjon. Avvikende fra produsentens protokoll transformeres E. col-stammen MM294, beskrevet i eksempel 1, med en ligeringsblanding og rekombinante kolonierscreenes på zeocin seleksjonsplater. Plasmid-DNA reisoleres fra klonene og karakteriseres deretter ved hjelp av restriksjons-og DNA-sekvensanalyser. Ved anvendelse av plasmiet konstruert på denne måten tilberedes således en P. pastoris ekspresjonsklon for produksjon av peptidet ifølge produsentens bruksanvisning.

Eksempel 7: Rensing av mini-proinsulin og hirudin

Rensingen krever separasjon av de to proteinene på et tidlig stadium. Etter endt ekspresjon analyseres mediet ved hjelp av analytisk RP-HPLC. I motsetning til de fleste andre polypeptider som finnes i supernatanten på grunn av enten spontan lyse av gjærceller eller sekresjon, utfelles ikke de to proteinene hirudin og mini-proinsulin ved pH 2,5-3. Kulturmediet surgjøres derfor på en hensiktsmessig måte og deretter, etter avsluttet utfelling, fjernes presipitatet og cellene ved sentrifugering. Etter sentrifugering justeres pH til 3,5-7 og de to komponentene hirudin og mini-proinsulin separeres fra hverandre ved hjelp av hydrofobkromatografi, for eksempel ved anvendelse av en kromatografikolonne fylt med "Diaion HP20"-materiale. Hirudin kan deretter isoleres fra de hirudin-inneholdende faraksjonene ifølge EP-A 0 549 915 og insulin kan isoleres fra de mini-proinsulin-inneholdende fraksjonene ifølge EP-A 0 347 781.

Eksempel 8: Tilberedning av insulin fra mini-proinsulin

Ved slutten av ekspresjonsperioden justeres pH i kulturmediet til pH 6,8 og trypsin tilsettes deretter ved omrøring slik at en sluttkonsentrasjon på 4-8 mg per liter etableres. Etter inkubering i ca. 4 timer justeres pH i fermenteringsløsningen som er behandlet på denne måten til pH 2,5-3. Etter 1-6 timers utfelling fjernes presipitatet. Det dannede mono-Arg-insulin isoleres deretter via ionebyttekromatografi, for eksempel på "S-Sepharose" i en buffer av 50 mM melkesyre og 30% isopropanol (pH 3,5). Eluering utføres ved hjelp av en NaCl gradient på 0,05-0,5 M salt. De produktinneholdende fraksjonene fortynnes 1:1 med vann og ZnCb tilsettes deretter, slik at en 0,1% styrke av ZnCtø Løsning dannes- ;pmp-Arg-insulin felles ved pH 6,8 og konverteres eksempelvis til insulin ifølge EP-A 0 324 712.

Eksempel 9: Fremstilling av insulin fra mini-proinsulin etter filtrering.

Etter endt ekspresjonsperiode fjernes celler og supernatantkomponenter ved utfelling ed pH 2,5 til 3. Mediet konsentreres deretter ved filtrering gjennom membraner med en en eksklusjonsgrense på 10 kDa. Som hirudinderivatet finnes mini-proinsulin i vesentlig mengde i retentatet og kan deretter prosesseres til insulin ifølge eksempel 8.

Claims

1. DNA molekyl,karakterisert vedat det er på formen: Px-Sx-Bn-(ZR)-transportpeptid-(ZiZ2)-protein(Y)-(ZiZ2)-protein(Ym)-T; der DNA molekylet koder for et transportpeptid bundet via en sekvens Z1Z2til et annet protein som er bundet via ZiZ2til et protein Yl som enten tilsvarer Y eller kan være forskjellig fra Y og transportpeptidet forbedrer sekresjonshastigheten til Y og/eller Yra, der: Pxer en hvilken som helst promoter DNA-sekvens utvalgt på en slik måte at optimale utbytter av proteinet av interesse blir oppnåelig; Sxer et hvilket som helst DNA som koder for en signal- eller ledersekvens som muliggjør optimale utbytter; Bn er 1 - 15 genetisk kodede aminosyrer eller en kjemisk binding; Z er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg; Zi er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg; Z2er kodonet til en aminosyre utvalgt fra gruppen omfattende Lys og Arg; protein Ym er en DNA-sekvens som koder for et hvilket som helst protein som kan produseres og utskilles av gjær (m = 1-5) eller en kjemisk binding (m = 0); R er et argininkodon; transportpeptidet er en DNA-sekvens som koder for hirudin eller et hirudinderivat; protein Y er en DNA-sekvens som koder for proinsulin og derivater av dette som kan fremstilles og utskilles av gjær og der dets biologiske aktivitet, når Yraikke er en kjemisk binding, ikke er svekket av en basisk dipeptidforlengelse eller muliggjør degradering av ekstensjonen ved karboksypeptidaser; T er en utranslatert DNA-sekvens som er fordelaktig for ekspresjonen.

2. DNA-molekyl ifølge krav 1,karakterisert vedat (Y) er et farmasøytisk relevant protein omfattende proinsulin og derivater av dette.

3. Proteiner,karakterisert vedat de er kodet av en hvilken som helst av DNA-molekylene ifølge kravene 1 eller 2.

4. Multikopivektor,karakterisert vedat den omfatter DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2.

5. Plasmid,karakterisert vedat det omfatter DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2.

6. Vertscelle,karakterisert vedat det omfatter et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, en multikopivektor ifølge krav 4 og/eller et plasmid ifølge krav 5, som en del av sitt kromosom, som en del av et minikromosom eller ekstrakromosomalt.

7. Vertscelle ifølge krav 6,karakterisert vedat vertscellen er en gjærcelle.

8. Vertscelle ifølge krav 7,karakterisert vedat den er valgt fra gruppen omfattende S. cerevisiae, K. lactis, H. polymorpha og P. pastoris.

9. Fremgangsmåte for fermentering av proteiner ifølge krav 3,karakterisert vedat den omfatter (c) et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, en multikopivektor ifølge krav 4, eller et plasmid ifølge krav 5 uttrykkes i en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 6 til 8 og; (d) de uttrykte proteiner isoleres fra cellekulturens supernatant.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat pH, etter endt fermentering, justeres til 2,5-3,5 for å utfelle uønskede proteiner og de uttrykte proteiner isoleres fra supernatanten.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat vertscellene, etter separasjon fra fermenteringssupernatanten, dyrkes gjentakende i friskt medium, og det frigitte fusjonsprotein isoleres fra hver supernatant oppnådd under dyrkingen.

12. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 9 til 11,karakterisert vedat et fremgangsmåtetrinn for konsentrering av det uttrykte protein i supernatanten etter utfelling er utvalgt fra en gruppe omfattende mikrofiltrering, hydrofob interaksjonskromatografi og ionebyttekromatografi.

13. Fremgangsmåte for å fremstille insulin,karakterisertved at den omfatter (d) proinsulin uttrykkes som protein (Y) i ekspresjonskassetten ifølge krav 1 ved en fremgangsmåte ifølge kravene 9 eller 10; (e) proinsulinet fra trinn (a) isoleres og behandles med trypsin og karboksypeptidase B; og (f) insulinisoleres fra reaksjonsblandingen i trinn (b).

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat transportpeptidet er hirudin eller et hirudinderivat som ødelegges eller inaktiveres biologisk etter trinn (a) eller (b).

15. Protein ifølge krav 3,karakterisert vedat proteinet er et hirudinderivat med to basiske aminosyrerester ved den C-terminale ende.