NO331273B1 - GLP-1 fusjonsproteiner samt anvendelser derav. - Google Patents

GLP-1 fusjonsproteiner samt anvendelser derav. Download PDF

Info

Publication number
NO331273B1
NO331273B1 NO20032565A NO20032565A NO331273B1 NO 331273 B1 NO331273 B1 NO 331273B1 NO 20032565 A NO20032565 A NO 20032565A NO 20032565 A NO20032565 A NO 20032565A NO 331273 B1 NO331273 B1 NO 331273B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
glp
xaa
lys
glu
asp
Prior art date
Application number
NO20032565A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20032565L (no
NO20032565D0 (no
Inventor
Wolfgang Glaesner
Radmilla Micanovic
Sheng-Hung Rainbow Tschang
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22954069&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO331273(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of NO20032565D0 publication Critical patent/NO20032565D0/no
Publication of NO20032565L publication Critical patent/NO20032565L/no
Publication of NO331273B1 publication Critical patent/NO331273B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen er relatert til glukagonlike 1 forbindelser fusjonert til proteiner som har den virkning at de forlenger in vivo halveringstiden til peptidene. Disse fusjonspeptidene kan bli brukt til å behandle ikke-insulinavhengig diabetes mellitus så vel som flere forskjellige andre tilstander.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen angår glukagonlike peptider inkludert analoger og derivater av disse fusjonert til proteiner som forlenger in vivo halveringstiden til peptidene. Disse fusjonsproteinene kan bli anvendt til å behandle ikke-insulinavhengig diabetes mellitus så vel som forskjellige andre tilstander.
Glukagonlikt peptid 1 (GLP-1) er et 37 aminosyrepeptid som utskilles av L-cellene i tarmen etter matinntak. Det har blitt tunnet å stimulere insulinutskillelse (insulinotropisk effekt), for derved å forårsake glukoseopptak i celler og nedsatt serumglukose-nivåer [se f.eks Mojsov, S, (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333-343]. GLP-1 har imidlertid dårlig aktivitet. En senere endogen kutting mellom den 6. og 7. posisjon produserer et mer potent biologisk aktivt GLP-1 (7-37) OH peptid. Flere GLP-1 analoger og derivater er kjent og er referert heri som "GLP-1 sammensetninger". Disse GLP-1 analogene inkluderer eksedinene som er peptider funnet i giften til GILA-monster. Exedinene har sekvenshomologi til nativt GLP-1 og kan binde GLP-1 reseptoren og initiere signaltransduksjonskaskaden ansvarlig for de mange aktivitetene som har blitt tillagt GLP-1 (7-37) OH.
GLP-1 sammensetninger har forskjellige fysiologisk signifikante aktiviteter. For eksempel har det blitt bevist at GLP-1 stimulerer insulinutslipp, lavere glukagon-utskillelse, inhiberer gastrisk uttømming og forbedrer glukoseutnyttelse. [Nauck, M. A. et al (1993) Diabetologia 36:741-744; Gutniak, M et al (1992) New England J. of Med. 326-1316-1322; Nauck, MA. et al (1993) J. Clin. Invest. 91:301-307].
GLP-1 viser størst lovnad som en behandling for ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM). Det er flere orale legemidler på markedet for behandling av insulin-resistensen assosiert med NIDDM. Etter hvert som sykdommen utvikles må pasienten imidlertid føres over på behandling som stimulerer utslipp av insulin og eventuelt til behandling som involverer injeksjoner av insulin. Nåværende legemidler som stimulerer utslipp av insulin kan imidlertid også forårsake hypoglykemi slik som administrering av insulin kan. GLP-1 aktivitet er imidlertid kontrollert av blodglukosenivåer. Når nivåer går under en viss terskelverdi er GLP-1 ikke aktiv. Det er derfor ingen risiko for hypoglykemi i forbindelse med behandling som involverer GLP-1.
Nytten av terapi med GLP-1 peptider har imidlertid blitt begrenset av deres raske nedbrytning og korte halveringstid. GLP-1 (7-37) har f.eks en serumhalveringstid på bare 3 til 5 minutter. GLP-1 (7-36) amid har en virkning på bare omkring 50 minutter når administrert subkutant. Selv analoger og derivater som er resistente mot endogen proteasekutting har ikke halveringstider lange nok til å unngå repeterte administreringer i løpet av en 24 timers periode. Rask nedbrytning av et terapeutisk middel er uegnet i tilfeller hvor det ønskes å vedlikeholde et høyt blodnivå av midlet over en forlenget tidsperiode ettersom repeterte administreringer er nødvendig. Vider eer et lengevirkende middel spesielt viktig for diabetespasienter hvor tidligere behandlingsregimer har involvert bare oral medisinering. Disse pasientene har ofte en meget vanskelig tid når de går over til et regime som involverer multiple injeksjoner av medikamenter.
WO 00/69911 beskriver insulinotropiske peptider, deriblant GLP-1, som blir modifisert med kjemiske grupper som videre vil reagere med tilgjengelige funksjonaliteter på blodkomponenter. Ved det så dannede konjugat forlenges in vivo halveringstiden til den aktive ingrediens. Nevnte blodkomponent kan for eksempel være et antistoff.
US 5990077 beskriver GLP-2 og dets funksjon som en gastrointestinal vevsvekstfaktor. Anvendelse av GLP-2 ved behandling av blant annet diabetes er foreslått. Det er videre foreslått at GLP-2 peptidene kan utrykkes som fusjonsproteiner, der peptidet er frigjørbart bundet til et bærerprotein. Hensikten med et slikt fusjonsprotein er å lette isolering og forbedre stabilitet av ekspresjonsproduktet.
Den foreliggende oppfinnelse overvinner problemene assosiert med å levere en forbindelse som har en kort plasmahalveringstid. Forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen omfatter GLP-1 forbindelser fusjonert med andre proteiner med en lang sirkulsasjonshalveringstid slik som Fc delen av et immunoglobulin eller albumin.
Generelt er små terapeutiske peptider vanskelig å manipulere fordi selv små endringer i deres struktur kan affisere stabilitet og/eller biologisk aktivitet. Dette har vært spesielt sant for GLP-1 forbindelser for tiden i utvikling. GLP-1 (7-37) OH har f.eks en tendens til å gjennomgå en konformasjonsendring fra en primær alfaheliksstruktur til en primær beta sheet struktur. Denne beta sheet formen resulterer i aggregert materiale som man tror er inaktivt. Det var derfor overraskende at biologisk aktive GLP-1 fusjonsproteiner med økt halveringstid kunne utvikles. Dette var spesielt uventet gitt vanskeligheten med å arbeide med GLP-1 (7-37) OH alene og den større størrelsen av fusjonspartneren relativt til det lille GLP-1 peptidet på festet.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører et heterologt fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det omfatter et første polypeptid med en N-terminus og en C-terminus fusjonert til et andre polypeptid med en N-terminus og en C-terminus hvor det første polypeptidet er en GLP-1 forbindelse og det andre polypeptidet velges fra gruppen bestående av
a) Fc delen av et immunoglobulin,
b) en analog av Fc delen av et immunoglobulin; og
c) fragmenter av Fc delen av et immunoglobulin,
og hvor C-terminus til det første polypeptidet er fusjonert med N-terminus til det andre
polypeptidet.
I en foretrukket utførelsesform er C-terminus til det første polypeptidet fusjonert til N-terminus til det andre polypeptidet via en peptidlinker.
Det er foretrukket at peptidlinkeren velges fra gruppen bestående av:
a) et glysinrikt peptid; b) et peptid med sekvensen [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n hvor n er 1, 2, 3,4, 5 eller 6; og
c) et peptid med sekvensen [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
Generelt er det foretrukket at GLP-1 forbindelsen som er del av det heterologe fusjonsproteinet ikke har mer enn 6 aminosyrer som er forskjellige fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-1 (7-36)OH eller Exendin-4. Det er mer foretrukket at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 5 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-3 7)OH, GLP-1 (6-3 7)OH eller Exedin-4. Det er mest foretrukket at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 4, 3 eller 2 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-l(6-37)OH eller Exedin-4. Fortrinnsvis har en GLP-1 forbindelse som er del av det heterologe fusjonsproteinet glysin eller valin i posisjon 8.
Den foreliggende beskrivelse inkluderer også polynukleotider kodende for det heterologe fusjonsproteinet beskrevet heri, vektorer omfattende disse polynukleotider og vertsceller transfektert eller transformert med vektorene beskrevet heri. Også inkludert er en prosess for produksjon av et heterologt fusjonsprotein omfattende trinnene transkripsjon og translasjon av et polynukleotid beskrevet heri under betingelser hvor det heterologe fusjonsproteinet uttrykkes i detekterbare mengder.
Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også anvendelse av det heterologe fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av pasienter med ikke-insulin avhengig diabetes mellitus.
Videre omfatter foreliggende oppfinnelse også anvendelse av det heterologe fusjonsprotein for fremstilling av et medikament for behandling av pasienter med fedme.
Oppfinnelsen er videre illustrert med referanse til de følgende tegninger:
Figur 1: IgGl Fc aminosyresekvens omfattende hengselregionen, CH2 og CH3 domener.
Figur 2: Humant serumalbuminaminosyresekvens.
Figur 3: A. SDS-PAGE gel og immunoblot av samme gel illustrerende den molekylære vekten til IgGl-Fc og GLP-l-Fc fusjonsproteiner (Brønn 1, MW standarder; Brønn 2, renset Fc; Brønn 3, kontrolltransfektert media; Brønn 4, Val Q-GLP-l-Fc; Brønn 5: Exendin-4-Fc) B. SDS-PAGE gel og immunoblot av samme gel illustrerende den molekylære vekten til humant HSA og GLP-1-HSA fusjonsproteiner (Brønn 1, MW standarder; Brønn 2, renset HSA, Brønn 3, kontrolltransfektert media; Brønn 4, Val8-GLP-1-HSA; Brønn 5, Val8-GLP-l-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3; Brønn 6, Exendin-4-HSA; Brønn 7, Exendin-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA). Figur 4: SDS-PAGE gel av renset Fc, albumin og GLP-1 fusjonsproteiner (Brønn 1, MW standarder; Brønn 2, renset Fc; Brønn 3, Val8-GLP-1-Fc; Brønn 4, Exendin-4-Fc; Brønn 5, MW standard; Brønn 6, Val8-GLP-1-HSA; Brønn 7, Exendin-4-HSA; Brønn 8, Exendin-4-[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3-HSA). Figur 5: Ekspresjonskloningsvektor inneholdende Fc regionene illustrert i figur 1. Figur 6: Ekspresjonskloningsvektor inneholdende albuminsekvensen illustrert i figur 2. Figur 7: Ekspresjonskloningsvektor inneholdende DNA kodende en 15 aminosyrelinker fusjonert i leseramme og 5' av albuminsekvensen illustrert i figur 2.
Figur 8: In vitro doseresponsaktivitet til GLP-1 fusjonsproteiner.
Figur 9: Farmakokinetikk til GLP-1 Fc og HSA fusjonsproteiner.
Figur 10: Glukodynamisk respons til Exendin-Fc i to normalt fastende hunder.
Figur 11: Insulinotropisk respons til Exendin-Fc i to normalt fastende hunder.
Figur 12: DNA sekvens kodende en human IgGl Fc region
Figur 13: DNA sekvens kodende et humant albuminprotein.
De heterologe fusjonsproteinene ifølge den foreliggende oppfinnelsen omfatter en GLP-1-forbindelse fusjonert til Fc delen til et immunoglobulin, en analog til Fc delen til et immunoglobulin eller et fragment til Fc delen av et immunoglobulin. C-terminus til GLP-1 forbindelsen kan fusjoneres direkte eller fusjoneres via en peptidlinker til N-terminale delen til et Fc protein. Disse heterologe fusjonsproteinene er biologisk aktive og har en økt halveringstid sammenlignet med nativt GLP-1.
Det er foretrukket at GLP-1 forbindelsen som utgjør en del av det heterologe fusjonsproteinet omfatter polypeptider med omkring 24 til omkring 39 naturlig forekommende eller ikke-naturlig forekommende aminosyrer som har tilstrekkelig homologi til nativ GLP-1 (7-37)OH, slik at de viser insulinotropisk aktivitet ved binding til GLP-1 reseptoren på (3-celler i pankreas. En GLP-1 forbindelse omfatter typisk et polypeptid med aminosyresekevnsen til GLP-1 (7-3 7)OH, en analog til GLP-1 (7-3 7)OH, et fragment av GLP-l(7-37)OH, eller et fragment av en GLP-l(7-37)OH analog.
GLP-1 (7-37)OH har aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 1:
Ifølge tradisjon har aminosyreterminus til GLP-1 (7-3 7)OH blitt tildelt nummer residie 7 og karboksyterminus nummer 37. De andre aminosyrene i polypeptidet er nummerert etter hverandre som vist i sekvens id nr 1. For eksempel er posisjon 12 fenylalanin og posisjon 22 glysin.
GLP-1 forbindelser omfatter også "GLP-1 fragmenter". Et GLP-1 fragment er et polypeptid oppnådd etter trunkering av en eller flere aminosyrer fra N-terminus og/eller C- teminus til GLP-1 (7-3 7)0H eller en analog eller derivat av dette. Numenklaturet anvendt til å beskrive GLP-1 (7-3 7)OH, er også anvendbart til GLP-1 fragmenter. For eksempel betegner GLP-l(9-36)OH et GLP-1 fragment oppnådd ved trunkering av to aminosyrer fra N-terminus og en aminosyre fra C-terminus. Aminosyrene i fragmentet er betegnet ved det samme nummer som i den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH. For eksempel er den N-terminale glutaminsyren i GLP-1 (9-36)OH i posisjon 9; posisjon 12 er okkupert av fenylalanin; og posisjon 22 er okkupert av glysin, som i GLP-l(7-37)OH. For GLP-l(7-37)OH er glysinet i posisjon 37 til GLP-l(7-37)OH deletert.
GLP-1 forbindelser inkluderer også polypeptider hvor en eller flere aminosyrer legges til N-terminus og/eller C-terminus til GLP-1 (7-3 7)OH, eller fragmenter eller analoger av dette. Det er foretrukket at GLP-1 forbindelser av denne type har omkring 39 aminosyrer. Aminosyrene i den forlengede GLP-1 forbindelsen er betegnet ved de samme numrene som den tilsvarende aminosyren i GLP-l(7-37)OH. For eksempel, den N-terminale aminosyren til en GLP-1 forbindelse oppnådd ved å legge til to aminosyrer til N-terminalen til GLP-1 (7-37)OH er i posisjon 5; og den C-terminale aminosyren til en GLP-1 forbindelse oppnådd ved å legge til en aminosyre til C-terminus til GLP-1 (7-37)OH er i posisjon 38. Følgelig er posisjon 12 besatt av fenylalanin og posisjon 22 besatt av glysin i begge disse "forlengede" GLP-1 forbindelser, som i GLP-1 (7-3 7)OH. Aminosyrer 1-6 i en forlenget GLP-1 forbindelse er fortrinnsvis de samme som eller en konservativ substitusjon av aminosyren i den tilsvarende posisjonen i GLP-1 (7-37)OH. Aminosyre 38-45 i en forlenget GLP-1 forbindelse er fortrinnsvis de samme som eller en konservativ substitusjon av aminosyren i den tilsvarende posisjonen i glukagon eller Exendin-4.
GLP-1 forbindelser i den foreliggende oppfinnelsen omfatter "GLP-1 analoger". En GLP-1 analog har tilstrekkelig homologi til GLP-1 (7-3 7)OH eller et fragment av GLP-l(7-37)OH slik at analogen har insulinotropisk aktivitet. Fortrinnsvis har en GLP-1 analog aminosyresekvensen til GLP-1 (7-3 7)OH eller et fragment av dette, modifisert slik at fra en, to, tre, fire eller fem aminosyrer avviker fra aminosyren i den tilsvarende posisjon i GLP-1 (7-3 7)OH eller et fragment av GLP-1 (7-3 7)OH. I nomenklaturet anvendt til å angi GLP-1 forbindelser er den substituerende aminosyren og dens posisjon indikert før morstrukturen. For eksempel, Glu<22->GLP-l(7-37)OH angir en GLP-1 forbindelse hvor glysinet normalt funnet i posisjon 22 til GLP-1 (7-37)OH har blitt erstattet med glutaminsyre; Val<8->Glu<22->GLP-l(7-37)OH angir en GLP-1 forbindelse hvor alaninet normalt funnet i posisjon 8 og glysinet normalt funnet i posisjon 22 til GLP-1 (7-3 7)OH har blitt erstattet henholdsvis med valin og glutaminsyre.
GLP-1 forbindelser i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer også "GLP-1 derivater". Et GLP-1 derivat er definert som et molekyl med aminosyresekvensen til GLP-1 eller til en GLP-1 analog, men som i tillegg har kjemisk modifisering av en eller flere av dets aminosyresidegrupper, ct-karbonatomer, terminale aminogrupper eller terminale karboksylsyregrupper. En kjemisk modifikasjon inkluderer, men er ikke begrenset til, tillegg av kjemiske moiteter, dannelsen av nye bindinger og fjerning av kjemiske moiteter. Modifikasjoner av aminosyresidegrupper inkluderer, uten begrensning, acylering av lysin e-aminogrupper, N-alkylering av arginin, histidin eller lysin, alkylering av glutamin eller asparaginkarboksylsyregrupper, og deamidering av glutamin eller aspargin. Modifikasjoner av den terminale aminogruppen inkluderer, uten begrensning, dets amino, N-lavere alky, N-di-lavere alkyl, og N-acylmodifikasjoner. Modifikasjoner av den terminale karboksylgruppen inkluderer, uten begrensning, amid, lavere alkylamid, dialkylamid og lavere alkylestermodifikasjoner. Lavere alkyl er C1-C4alkyl. Videre, en eller flere sidegrupper, eller terminale grupper, kan beskyttes ved beskyttende grupper kjent for normalt fagutdannede proteinkjemikere. cc-karbonet i en aminosyre kan være mono- eller dimetylert.
En hvilken som helst GLP-1 forbindelse kan være del av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen så lengde GLP-1 forbindelse selv er i stand til å binde og indusere signalering gjennom GLP-1 reseptoren. GLP-1 reseptorbinding og signaltransduksjon kan bli bedømt ved å bruke in vitro assays slik som de beskrevet i EP 619,322 og US patent nr 5.120.712
Flere aktive GLP-1 fragmenter, analoger og derivater er kjent innen faget og enhver av disse analogene og derivatene kan også være del av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen. Noen eksempler på nye GLP-1 analoger så vel som GLP-1 analoger og derivater kjent innen faget er frembragt.
Noen GLP-1 analoger og GLP-1 fragmenter kjent innen faget inkluderer, for eksempel, GLP-1 (7-34) og GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-36), Gln<9->GLP-l(7-37), D-Gln<9->GLP-1(7-37), Thr<1>6-Lys1<8->GLP-l(7-37), og Lys<18>-GLP-l(7-37). GLP-1 analoger slik som GLP-1(7-34) og GLP-l(7-35) er fremlagt i US patent 5.118.666. Biologisk prosesserte former av GLP-1 som har insulinotropiske egenskaper, slik som GLP-l(7-36), er også kjent. Andre kjente biologisk aktive GLP-1 forbindelser er fremlagt i US patent nr 5.977.071 til Hoffmann et al, US patent 5.545.618 til Buckley et al, og Adelhorst et al, J. Biol. Chem. 269:6275 (1994).
En foretrukket gruppe av GLP-1 analoger er sammensatt av GLP-1 analoger i henhold til formel I (SEQ ID NO: 2)
hvor:
Xaa ved posisjon 8 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 9 er Glo, Asp, eller Lys;
Xaa ved position 11 er Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 14 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved position 16 er Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 17 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Gla, Asp, eller Lys;
Xaa ved position 18 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, eller Lys; Xaa ved posisjon 19 er Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin, eller Lys;
Xaa ved posisjon 20 er Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glo, Asp, Met, Trp, Tyr, eller Lys;
Xaa ved posisjon 21 er Glo, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 22 er Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glo, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 23 er Gin, Asn, Arg, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 24 er Ala, Gly, Ser, The, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 25 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 26 er Lys, Arg, Gin, Glu, Asp, eller His;
Xaa ved posisjon 27 er Leu, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 30 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 31 er Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 32 er Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 33 er Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 34 er Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, eller His;
Xaa ved posisjon 35 er Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 36 er Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, eller His;
Xaa ved posisjon 37 er Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Lee, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 38 er Ser, Arg, Lys, Gla, Asp, eller His, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 39 er Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, eller His, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 40 er Gly, Asp, Glu, eller Lys, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 41 er Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 42 er Ser, Pro, Lys, Gla, or Asp, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 43 er Ser, Pro, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert;
Xaa ved posisjon 44 er Gly, Pro, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert;
og
Xaa ved posisjon 45 er Ala, Ser, Val, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert;
gitt at når aminosyren i posisjon 37, 38, 39,40,41,42,43 eller 44 er deletert, så er hver aminosyre nedstrøms av den aminosyren også deletert.
Det er foretrukket at GLP-1 forbindelsen i formel I inneholder mindre enn seks aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-3 7)OH eller Exendin-4. Det er mer foretrukket at mindre enn fem aminosyrer skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-3 7)OH eller Exendin-4. Det er enda mer foretrukket at mindre enn fire aminosyrer skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH eller Exendin-4.
GLP-1 forbindelser i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer derivater av formel I slik som en C-l-6-ester eller amid eller C-l-6-alkylamid eller C-l-6-dialkylamid av disse. WO 99/43706 beskriver derivater av GLP-1 forbindelser av formel I. Forbindelsene i formel I utledet som beskrevet i WO 99/43706 og ikke utledet omfattet i den foreliggende oppfinnelsen.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser er sammensatt av GLP-1 analoger i henhold til formel II (SEQ ID NO: 3):
hvor:
Xaa at position 7 is: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-amino-histidin, P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluorometylhistidin eller a-metylhistidin;
Xaa ved posisjon 8 er: Gly Ala, Val, Leu, Ile, Ser eller Thr;
Xaa ved posisjon 9 er: Thr, Ser, Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Glu eller His;
Xaa ved posisjon 11 er: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, eller His;
Xaa ved posisjon 12 er: His, Thr, Phe, eller Tyr;
Xaa ved posisjon 16 er: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Tyr, Glu, eller Ala; Xaa ved posisjon 18 er: His, Pro, Asp, Glu, Arg, Ser, Ala, eller Lys;
Xaa ved posisjon 22 er: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, eller Cys;
Xaa ved posisjon 23 er: His, Asp, Lys, Glu, Gin, eller Arg;
Xaa ved posisjon 24 er: Glu, Arg, Ala, eller Lys;
Xaa ved posisjon 26 er: Trp, Tyr, Phe, Asp, Lys, Glu, eller His;
Xaa ved posisjon 27 er: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, eller Lys;
Xaa ved posisjon 30 er: Ala, Glu, Asp, Ser, eller His;
Xaa ved posisjon 31 er: Asp, Glu, Ser, Thr, Arg, Trp, eller Lys;
Xaa ved posisjon 33 er: Asp, Arg, Cal, Lys, Ala, Gly, eller Glu;
Xaa ved posisjon 34 er: Glu, Lys, eller Asp;
Xaa ved posisjon 35 er: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, eller Glu; Xaa ved posisjon 36 er: Thr, Ser, Asp, Trp, Tyr, Phe, Arg, Glu, eller His;
R ved posisjon 37 er: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, eller er deletert.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser er sammensatt av GLP-1 analoger i henhold til formel III (SEQ ID NO: 4):
hvor:
Xaa ved posisjon 7 er: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin, P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluormetylhistidin eller a-metylhistidin;
Xaa ved posisjon 8 er: Gly, Ala, Cal, Leu, Ile, Ser, eller Thr;
Xaa ved posisjon 11 er: Asp, Glu, Arg, Thr, Ala, Lys, eller His;
Xaa ved posisjon 12 er: His, Trp, Phe, eller Tyr;
Xaa ved posisjon 16 er: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, eller Ala;
Xaa ved posisjon 22 er: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, eller Cys;
Xaa ved posisjon 23 er: His, Asp, Lys, Glu, eller Gin;
Xaa ved posisjon 24 er: Glu, His, Ala, eller Lys;
Xaa ved posisjon 25 er: Asp, Lys, Glu, eller His;
Xaa ved posisjon 27 er: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, eller Lys;
Xaa ved posisjon 30 er: Ala, Glu, Asp, Ser, eller His;
Xaa ved posisjon 33 er: Asp, Arg, Val, Lys, Ala, Gly, eller Glu;
Xaa ved posisjon 34 er: Glu, Lys, eller Asp;
Xaa ved posisjon 35 er: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, eller Glu; Xaa ved posisjon 36 er: Arg, Glu, eller His;
R ved posisjon 37 er: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, eller er deletert.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser er sammensatt av GLP-1 analoger i henhold til formel IV (SEQ ID NO: 5):
hvor:
Xaa ved posisjon 7 is: L-histidin, D-histidin, desaminohistidine, 2-amino-histidine, P-hydroxy-histidin, homohistidin, a-fluorometylhistidin eller a-metylhistidin;
Xaa ved posisjon 8 er: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Mer, eller Thr;
Xaa ved posisjon 12 er: His, Trp, Phe, eller Tyr;
Xaa ved posisjon 16 er: Leu, Ser, Thr, Trp, His, Phe, Asp, Val, Glu, eller Ala;
Xaa ved posisjon 22 er: Gly, Asp, Glo, Gla, Asn, Lys, Arg, eller Cys;
Xaa ved posisjon 23 er: His, Asp, Lys, Glu, eller Gin;
Xaa ved posisjon 26 er: Asp, Lys, Glu, eller His;
Xaa ved posisjon 30 er: Ala, Glo, Asp, Ser, eller His;
Xaa ved posisjon 35 er: Thr, Ser, Lys, Arg, Trp, Tyr, Phe, Asp, Gly, Pro, His, eller Glu; R ved posisjon 37 er: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, eller er deletert.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser er sammensatt av GLP-1 analoger av formel V (SEQ ID NO: 6):
hvor:
Xaa ved posisjon 7 is: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidine, P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluorometylhistidin or a-methylhistidine;
Xaa ved posisjon 8 er: Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, eller Thr;
Xaa ved posisjon 22 er: Gly, Asp, Glu, Gin, Asn, Lys, Arg, eller Cys;
Xaa ved posisjon 23 er: His, Asp, Lys, Glu, eller Gin;
Xaa ved posisjon 24 er: Ala, Glu, His, Phe, Tyr, Trp, Arg, eller Lys;
Xaa ved posisjon 30 er: Ala, Glu, Asp, Ser, eller His;
R ved posisjon 37 er: Lys, Arg, Thr, Ser, Glu, Asp, Trp, Tyr, Phe, His, Gly, Gly-Pro, eller er deletert.
Foretrukne GLP-1 forbindelser i henhold til formlene I, II, III, IV og V omfatter GLP-1 analoger eller fragmenter av GLP-1 analoger hvor analogene eller fragmentene inneholder en aminosyre forskjellig fra alanin i posisjon 8 (posisjon 8 analoger). Det er å foretrekke at disse posisjon 8 analogene inneholder en eller flere tilleggsendringer i posisjonene 9,11,12,16,18,22, 23,24,26,27, 30, 31, 33, 34, 35, 36 og 37 sammenlignet med den tilsvarende aminosyren i nativt GLP-1 (7-3 7)OH. Det er også å foretrekke at disse analogene har 6 eller fære endringer sammenlignet med de tilsvarende aminosyrene i nativt GLP-l(7-37)OH eller GLP-1 (7-36)OH. Mer foretrukne analoger har 5 eller færre endringer sammenlignet med de tilsvarende aminosyrene i nativt GLP-l(7-37)OH eller GLP-l(7-36)OH eller har 4 eller færre endringer sammenlignet med de tilsvarende aminosyrene i nativt GLP-1 (7-3 7)OH eller GLP-1 (7-36)OH. Det er mer foretrukket at disse analogene har 3 eller færre endringer sammenlignet med de tilsvarende aminosyrene i nativt GLP-1 (7-3 7)OH eller GLP-1 (7-36)OH. Det er mest foretrukket at disse analogene har 2 eller færre endringer sammenlignet med de tilsvarende aminosyrene i nativt GLP-1 (7-3 7)OH.
Det har blitt runnet at forbindelsene i henhold til formel II, III, IV og V har en redusert tilbøyelighet til å aggregere og generere uløselige former. Dette er også viktig i sammenheng med et fusjonsprotein hvor det relativt lille GLP-1 peptidet må beholde en aktiv konformasjon på tross av fusjonen med et meget større protein. Foretrukne GLP-1 forbindelser i henhold til formlene II, III, IV og V omfattet av fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen omfatter GLP-1 analoger eller fragmenter av GLP-1 analoger hvor glysin i posisjon 22 og fortrinnsvis alanin i posisjon 8 har blitt erstattet med en annen aminosyre.
Når posisjon 22 er asparaginsyre, glutamin, arginin eller lysin, er posisjon 8 fortrinnsvis glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin. Når posisjon 22 er en sulfosyre slik som cysteinsyre, er posisjon 8 fortrinnsvis lysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller lysin.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer GLP-1 analoger ifølge formel IV (SEQ ID NO: 5) hvor analogene har sekvensen til GLP-1 (7-37)OH bortsett fra at aminosyren i posisjon 8 fortrinnsvis er glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin og posisjon 37 er glutaminsyre, asparaginsyre, serin eller histidin og mer fortrinnsvis glutaminsyre.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer GLP-1 analoger ifølge formel IV (SEQ ID NO: 5) hvor analogene har sekvensen til GLP-l(7-37)OH bortsett fra at aminosyren i posisjon 8 fortrinnsvis er glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin og posisjon 37 er histidin, lysin, arginin, treonin, serin, glutaminsyre, asparaginsyre, tryptofan, tyrosin, fenylalanin og mer fortrinnsvis histidin.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer GLP-1 analoger ifølge formel IV (SEQ ID NO: 5) hvor analogene har sekvensen til GLP-1 (7-37)OH bortsett fra at aminosyren i posisjon 8 fortrinnsvis er glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin og posisjon 22 er glutaminsyre, lysin, asparaginsyre eller arginin og mer fortrinnsvis glutaminsyre eller lysin og posisjon 23 er lysin, arginin, glutaminsyre, asparaginsyre og histidin og mer fortrinnsvis lysin eller glutaminsyre.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer GLP-1 analoger ifølge formel (SEQ ID NO: 6) hvor analogene har sekvensen til GLP-l(7-37)OH bortsett fra at aminosyren i posisjon 8 fortrinnsvis er glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin og posisjon 22 er glutaminsyre, lysin, asparaginsyre eller arginin og mer fortrinnsvis glutainsyre eller lysin og posisjon 27 er alanin, lysin, arginin, tryptofan, tyrosin, fenylalanin eller histidin og mer fortrinnsvis alanin.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer GLP-1 analoger ifølge formel II hvor analogene har sekvensen til GLP-1 (7-3 7)OH bortsett fra at aminosyren i posisjon 8 og en, to eller tre aminosyrer valgt fra gruppen bestående av posisjon 9, posisjon 11, posisjon 12, posisjon 16, posisjon 18, posisjon 22, posisjon 23, posisjon 24, posisjon 26, posisjon 27, posisjon 30, posisjon 31, posisjon 33, posisjon 34, posisjon 35, posisjon 36 og posisjon 37, er forskjellige fra aminosyren i den tilsvarende posisjon i nativt GLP-l(7-37)OH.
Andre foretrukne GLP-1 forbindelser ifølge formel II inkluderer:
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 analoger og derivater for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen sammensettes av molekyler ifølge formel VI (SEQ ID NO: 7)
hvor:
Ri velges fra gruppen bestående av L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-amino-histidin, P-hydroksyhistidin, homohistidin, alfafluormetylhistidin og alfametylhistidin; X velges fra gruppen bestående av Ala, Gly, Val, Thr, Ile og alfametyl-Ala; Y velges fra gruppen bestående av Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly; Z velges fra gruppen bestående av Glu, Gin, Ala, Thr, Ser og Gly; og R2er Gly-OH.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen er fremlagt i WO 91/11457, og består i hovedsak av GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35), GLP-1 (7-3 6), GLP-1 (7-3 7), eller amidfonnen av disse, og farmasøytisk aksepterbare salter av disse, med minst en modifikasjon valgt fra gruppen bestående av: (a) substitusjon av glysin, serin, cystein, treonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, arginin eller D-lysin med lysin i posisjon 26 og/eller posisjon 34; eller substitusjon av glysin, serin, cystein, treonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin, fenylalanin, lysin eller D-arginin med arginin i posisjon 36; (b) substitusjon av en oksydasjonsresistent aminosyre med tryptofan i posisjon 31; (c) substitusjon av minst en av: tyrosin med valin i posisjon 16; lysin med serin i posisjon 18; asparagin for glutaminsyre i posisjon 21; serin med glysin i posisjon 22; arginin med glutamin i posisjon 23; arginin med alanin i posisjon 24 og glutamin i lysin i posisjon 26; og (d) substitusjon av minst en av: glysin, serin eller cystein med alanin i posisjon 8; asparaginsyre, glysin, serin, cystein, treonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin eller fenylalanin med glutaminsyre i posisjon 9; serin, cystein, treonin, asparagin, glutamin, tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin eller fenylalanin med glysin i posisjon 10; og glutaminsyre for asparaginsyre i posisjon 15; og (e) substitusjon av glysin, serin, cystein, treonin, asparagin, glutamin,
tyrosin, alanin, valin, isoleucin, leucin, metionin eller fenylalanin, eller den D- eller N-acylerte eller alkylerte formen av histidin mot histidin i posisjon 7;
hvor, i substitusjonene (a), (b), (d) og (e), de substituerte aminosyrene valgtfritt kan være i D-formen og aminosyrene substituert i posisjon 7 kan valgfritt være i den N-acetylerte eller N-alkylerte formen.
Fordi enzymet dipeptidyl-peptidase IV (DPP IV), kan være ansvarlig for den observerte raske in vivo aktiveringen av administrert GLP-1 [se f.eks Mentlein, R. et al, Eur. J. Biochem., 214:829-835 (1993)], er GLP-1 analoger og derivater som er beskyttet fra aktiviteten til DPP IV foretrukket i forbindelse med et fusjonsprotein, og fusjonsproteiner hvor GLP-1 forbindelsen er Gly<8->GLP-l(7-37)OH, Val<8->GLP-l(7-37)OH, a-metyl-Ala<8->GLP-l(7-37)OH eller Gly8-Gln21 -GLP-1 (7-37)OH er mer foretrukket.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelse for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen består av forbindelsene på formelen VII (SEQ ID NO: 8) påberobt i US patent nr 5.512.549.
hvor R<1>velges fra gruppen bestående av 4-imidazaopropionyl, 4-imidazoacetyl eller 4-imidazo-a.adimetylacetyl; R<2>velges fra gruppen bestående av C6-C10uforgrenet acyl eller er fraværende; R<3>velges fra gruppen bestående av Gly-OH eller NH2; og Xaa er Lys eller Arg.
Mer foretrukne forbindelser av formel IV for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen er de hvor Xaa er Arg og R<2>er C6-C10uforgrenet acyl. Enda mer foretrukne forbindelser på formel IV for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen er de hvor Xaa er Arg, R<2>er C6-C10uforgrenet acyl og R3 er Gly-OH. Andre høyt foretrukne forbindelser på formel IV for anvendelse i den foreliggende oppfinnelsen er de hvor Xaa er Arg, R<2>er C6-C10uforgrenet acyl, R<3>er Gly-OH, og R<1>er 4-imidazolpropionyl. En spesielt foretrukket forbindelse av formel IV for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse er de hvor Xaa er Arg, R<2>er C»uforgrenet acyl, R3 er Gly-OH og R<1>er 4-imidazolpropionyl.
Fortrinnsvis omfatter GLP-1 forbindelsene GLP-1 analoger hvor skjelettet for slike analoger eller fragmenter inneholder en aminosyre forskjellig fra alanin i posisjon 8 (posisjon 8 analoger). Skjelettet kan også inkludere L-histidin, D-histidin eller modifiserte former av histidin slik som desaminohistidin, 2-aminohistidin, P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluormetylhistidin eller a-metylhistidin i posisjon 7. Det er foretrukket at disse posisjon 8 analogene inneholder en eller flere tilleggsendringer i posisjonene 12,16,18, 19, 20, 22, 25, 27, 30, 33 og 37 sammenlignet med den tilsvarende aminosyren i nativt GLP-1 (7-37)OH. Det er mer foretrukket at disse posisjon 8 analogene inneholder en eller flere tilleggsendringer i posisjonene 16,18,22,25 og 33 sammenlignet med den tilsvarende aminosyren i nativt GLP-1 (7-37)OH.
I en foretrukket utførelsesform GLP-1 analogen er GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 12 velges fra gruppen bestående av tryptofan eller tyrosin. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 12 så substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer foretrinnsvis valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 12 og 8 at aminosyren i posisjon 22 substitueres med glutaimsyre.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 16 velges fra gruppen bestående av tryptofan, isoleucin, leucin, fenylalanin eller tyrosin. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 16, så substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjonene 16 og 8, så substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjonene 16 og 8, så substitueres aminosyren i posisjonen 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 16 og 8, så substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (3-37)OH hvor aminosyren i posisjon 18 velges fra gruppen bestående av tryptofan, tyrosin, fenylalanin, lysin, leucin eller isoleucin, fortrinnsvis tryptofan, tyrosin og isoleucin. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 18 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 18 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 18 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 18 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 18 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 19 velges fra gruppen bestående av tryptofan eller fenylalanin, fortrinnsvis tryptofan. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjonene 19 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer foretrukket valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 19 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 19 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjone 19 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 20 er fenylalanin, tyrosin eller tryptofan. Det er også mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 20 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer fortrinnsvis valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 20 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 20 og 8 su bstitueres aminosyren i posisjon 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 20 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 25 velges fra gruppen bestående av valin, isoleucin og leucin, fortrinnsvis valin. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 25 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer foretrukket valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjonene 25 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 25 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjonene 25 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor amionsyren i posisjon 27 velges fra gruppen bestående av isoleucin eller alanin. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitusjonen i posisjon 27 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer foretrukket valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 27 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 27 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitusjonene i posisjonene 27 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
I en annen foretrukket utførelsesform er GLP-1 analogen GLP-1 (7-3 7)OH hvor aminosyren i posisjon 33 er isoleucin. Det er mer foretrukket at i tillegg til substitsjonen i posisjon 33 substitueres aminosyren i posisjon 8 med glysin, valin, leucin, isoleucin, serin, treonin eller metionin og mer foretrukket valin eller glysin. Det er enda mer foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjonene 33 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 22 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjoner 33 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 30 med glutaminsyre. Det er også foretrukket at i tillegg til substitsjonene i posisjonene 33 og 8 substitueres aminosyren i posisjon 37 med histidin.
GLP-1 forbindelsene har modifikasjoner på en eller flere av de følgende posisjonene: 8, 12,16,18,19,20,22, 25,27, 30, 33 og 37. Disse GLP-1 forbindelsene viser økt potens sammenlignet med GLP-1 (7-3 7)OH og omfatter amionsyresekvensen av formel IX
(SEQ ID NO: 12)
hvor:
Xaa7er: L-histidin-D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidin,
P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluormetylhistidin eller
a-metylhistidin
Xaa8er: Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Ser eller Thr;
Xaai2er: Phe, Trp eller Tyr;
Xaai6er: Val, Trp, Ile, Leu, Phe eller Tyr;
Xaaig er: Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
Xaai9er: Tyr, Trp eller Phe;
Xaa2o er: Leu, Phe, Tyr eller Trp;
Xaa22er: Gly, Glu, Asp, eller Lys;
Xaa25er: Ala, Val, Ile eller Leu;
Xaa27er: Glu, Ile eller Ala;
Xaa3o er: Ala eller Glu;
Xa33er: Val eller Ile; og
Xaa37er: Gly, His, NH2eller er fraværende.
Noen foretrukne GLP-1 forbindelser i henhold til formel IX inkluderer
Noen foretrukne GLP-1 forbindelser i henhold til formel IX med multipple substitusjoner inkluderer GLP-1 (7-37)OH hvor posisjon 8 er valin eller glysin, posisjon 22 er glutaminsyre, posisjon 16 er tyrosin, leucin eller tryptofan, posisjon 18 er tyrosin, tryptofan eller isoleucin, posisjon 25 er valin og posisjon 33 er isoleucin. Andre foretrukne GLP-1 forbindelser inkluderer de følgende: Val<8->Tyr<16->GLP-1(7-
GLP-1 forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen omfatter også Exedin forbindelser. Exedin-3 og Exedin-4 er biologisk aktive peptider først isolert fra Helodermatidae lizard gift og har vært vist å binde GLP-1 reseptoren og stimulere cAMP-avhengig H+ produksjon i mammalske paritalceller. Exedin-3 og Exedin-4 er begge 39 aminosyrepeptider som har omtrent 53 % homologi til GLP-1. De virker som potente agonister av GLP-1 aktivitet. Særlig er et N-terminalt trunkert derivat av Exedin, kjent som Exedin (9-39 aminosyrer), en inhibitor av Exedin-3, Exedin-4 og GLP-1.
En Exedinforbindelse omfatter typisk et polypeptid med aminosyresekvensen til Exedin-3, Exedin-4 eller en analog eller et fragment av disse. Exedin-3 og Exedin-4 er fremlagt i US patent nr 5.424.286.
Exedin-3 har amionsyresekvensen gitt i SEQ ID NO: 9:
Exedin-4 har aminosyresekvensen gitt i SEQ ID NO: 10:
GLP-1 forbindelser inkluderer også Exidinfragmenter som er polypeptider oppnådd etter trunkering av en eller flere aminosyrer fra N-terminus og/eller C-terminus til Exedin eller en Exedinanalog. Videre inkluderer GLP forbindelser Exedinpolypeptider hvor en eller flere aminosyrer har blitt lagt til N-terminus og/eller C-terminus til Exedin eller fragmenter av denne. Exedinforbindelser av denne type har oppmot omkring 44 aminosyrer.
GLP-1 forbindelser inkluderer også "Exedinanaloger". En Exedinanalog har
tilstrekkelig homologi til Exedin-4, Exedin-3 eller et fragment av disse slik at analogen har insulinotropisk aktivitet. Aktiviteten av Exedinfragmenter og/eller analoger kan bli bedømt ved å anvende in vitro assays slik som de beskrevet i EP 619.322 og US patent nr 5.120.712.
Fortrinnsvis har en Exedinanalog aminosyresekvensen til Exedin-4 eller et fragment av dette, modifisert slik at fra en, to, tre, fire eller fem aminosyrer adskiller seg fra aminosyren i tilsvarende posisjon i Exedin-4 eller Exedin-4 fragmentet. I nomenklaturet anvendt her for å betgnet Exedinforbindelser er den substituerende amiosyren og dens posisjon indikert før morstrukturen. for eksempel, Val<8->Exedin-4 angir en Exedinforbindelse hvor glysinet normalt funnet i posisjon 8 i Exedin 4 har blitt erstattet med valin.
En annen foretrukket gruppe av GLP-1 forbindelser er sammensatt av GLP-1/Exedin-4 analogeri henhold til formel VIII (SEQ ID NO: 11).
hvor: Xaa at position 7 is: L-histidin, D-histidin, desaminohistidin, 2-aminohistidine,
P-hydroksyhistidin, homohistidin, a-fluorometylhistidin eller a-methylhistidin;
Xaa ved posisjon 8 is: Gly, Ala, eller Val;
Xaa ved posisjon 16 er: Leu eller Val;
Xaa ved posisjon 18 er Lys eller Ser;
Xaa ved posisjon 19 er: Gin eller Tyr;
Xaa ved posisjon 20 er: Met eller Leu;
Xaa ved posisjon 22 er: Glu eller Gin;
Xaa ved posisjon 23 er: Glu eller Gin;
Xaa ved posisjon 25 er: Val eller Ala;
Xaa ved posisjon 26 er: Arg eller Lys;
Xaa ved posisjon 27 er Leu eller Glu;
Xaa ved posisjon 30 er: Glu eller Ala;
Xaa ved posisjon 33 er: Val eller Lys;
Xaa ved posisjon 34 er: Asn eller Lys;
Xaa ved posisjon 36 er: Gly eller Arg; og
R ved posisjon 37 er: Gly, Pro, Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, eller fraværende. Aktiviteten til 18 forskjellige arter som faller innenfor denne slekten er tilveiebragt i tabell 6.
Andre Exedinanaloger som er nyttige for den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i PCT patentpublikasjoner WO 99/25728 (Beeley et al), WO 99/25737 (Beeley et al), WO 98/05351 (Young et al), WO 99/40788 (Young et al), WO 99/07404 (Beeley et al), og WO 99/43708 (Knudsen et al).
GLP-1 fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte glykosylerings-seter. Glykosylering er en kjemisk modifikasjon hvor sukkermoiteter er lagt til proteinet på spesifikke plasser. Glykosylering av proteiner spiller en rolle i å sikre korrekt ladning, konformasjon og stabilitet til proteiner under modning og kan sende proteinet til celleoverflaten og eventuell utskillelse av proteinet. Mest viktig påvirker glykosylering in vivo nedbrytningsrate for mange proteiner. Sukker kan være O-bundet eller N-bundet. Generelt er O-bundede sukkere lagt til hydroksylgruppeoksygenet til serin og treonin, mens N-bundede sukkere er lagt til amidnitrogenet til asparagin. Konsensussetet for N-glykosylering er Asn XI X2 hvor XI er enhver aminosyre med unntak av Pro og X2 er Ser eller Thr.
GLP-1 forbindelser er generelt ikke glykosylert in vivo, men GLP-1 fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen som omfatter en GLP-1 forbindelse med en C-terminal forlengelse fusjonert til en Fc sekvens er imidlertid glykosylert på det siste serinet i den C-terminale forlengelsen (SSGAPPS<*>) og på treoninet i posisjon 11 i den N-terminale regionen til Fc (AEPKSCDKTHT<*>CPPC...).
Heterologe Fc fusjonsproteiner:
GLP-1 forbindelsene beskrevet ovenfor kan bli fusjonert direkte eller via en peptidlinker til Fc delen til et immunoglobulin.
Immunoglobuliner er molekyler inneholdende polypeptidkjeder holdt sammen ved disulfidbindinger, typisk med to lette kjeder og to tunge kjeder. I hver kjede har et domene (V) en variabel aminosyresekvens avhengig av antistoffspesifiteten til molekylet. De andre domenene (C) har en nok så konstant sekvens felles for molekyler i den samme klassen.
Som anvendt heri har Fc delen av et immunoglobulin den meningen normalt gitt til betegnelsen innenfor feltet immunologi. Denne betegnelsen refererer spesielt til et anti-stoffragment som er oppnådd ved å fjerne de to antigenbindende regionene (Fab fragmenter) fra antistoffet. En måte å fjerne Fab fragmentene er å behandle immunoglobulinet med papainprotease. Følgelig er Fc delen dannet fra omtrent like store fragmenter fra den konstante regionen fra begge tunge kjeder, som igjen assosierer gjennom ikke-kovalente interaksjoner og disulfidbindinger. Fc delen kan inkludere hengselregionene og strekke seg gjennom CH2 og CH3 domenene til C-terminus til antistoffet. Representative hengselregioner for humane musimmunoglobuliner kan bli funnet i Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K, ed., W.H. Freeman and Co., 1992. Fc delen kan videre inkludere en eller flere glykosyleirngsseter. Aminosyresekvensen til et representativt Fc protein inneholdende en hengselregion, CH2 og CH3 domener og et N-glykosyleringssete i posisjon 82 er vist i figur 1.
Det finnes fem typer humane immunoglobulin Fc regioner med forskjellige effektor-farmakokinetiske egenskaper: IgG, IgA, IgM, IgD og IgE. IgG er det mest tallrike immunoglobulinet i serum, IgG har også den lengste halveringstiden i serum av alle immunoglobuliner (23 dager). Til forskjell fra andre immunoglobuliner er IgG effektivt resirkulert etter binding til en Fc reseptor. Det er fire IgG underklasser Gl, G2, G3 og G4, hver av dem med forskjellige effektorfunskjoner. Gl, G2 og G3 kan binde Clq og fiksere komplement mens G4 kan ikke. Selv om G3 er i stand til å binde Clq mer effektivt enn Gl, så er Gl mer effektivt i å mediere komplement-styrt cellelysis. G2 fikserer komplement meget ineffektivt. Clq bindingssetene i IgG er lokalisert ved den karbok-syterminale regionen til CH2 domenet.
Alle IgG underklasser er i stand til å binde Fc reseptorer (CD16, CD32, CD64), hvor Gl og G3 er mer effektive enn G2 og G4. Fc reseptorbindingsregionen til IgG er dannet av residier lokalisert i både hengsels og karboksyterminalregionene til CH2 domenet.
IgA kan eksistere både i en monomerisk og dimerisk form holdt sammen av en J-kjede. IgA er det andre mest tallrike immunoglobulinet i serum, men har en halveringstid på bare 6 dager. IgA har tre effektorfunskjoner. Det binder til en IgA spesifikk reseptor på makrofager og eosinofiler, som stimulerer henholdsvis fagocytose og degranulering. Det kan også fiksere komplement via en ukjent alternativ reaksjonsvei.
IgM er uttrykt enten som en pentamer eller en heksamer, begge holdt sammen av en J-kjede. IgM har en serumhalveringstid på 5 dager. Det binder svakt til Clq via et
bindingssete lokalisert i dets CH3 domene. IgD har en halveringstid på 3 dager i serum. Det er uklart hvilken effektorfunksjon som kan tillegges dette immunoglobulinet. IgE er et monomerisk immunoglobulin og har en serumhalveringstid på 2,5 dager. IgE binder to Fc reseptorer som stimulerer degranulering og resulterer i utslipp av pro-inflammatoriske midler.
Avhengig av den ønskede in vivo virkningen kan de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen inneholde enhver av isotypene beskrevet ovenfor og kan inneholde muterte Fc regioner hvor komplementet og/eller Fc reseptorbindings-funksjoner har blitt endret. Følgelig kan de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen inneholde hele Fc deler av et immunoglobulin, fragmenter av Fc delen av et immunoglobulin eller analoger av disse fusjonert til en GLP-1 forbindelse.
Fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan bestå av enkeltkjedeproteiner eller som multikjedepolypeptider. To eller flere Fc fusjonsproteiner kan produseres slik at de interagerer gjennom disulfidbindinger som naturlig dannes mellom Fc regioner. Disse multimerene kan være homogene med hensyn på GLP-1 forbindelsen eller de kan inneholde forskjellige GLP-1 forbindelser fusjonert ved N-terminus til Fc delen av fusjonsproteinet.
Uten hensyn til den endelige strukturen til fusjonsproteinet må den Fc eller Fc-like regionen forlenge in vivo plasmahalveringstid til GLP-1 forbindelsen fusjonert ved N-terminus. Videre må den fusjonerte GLP-1 forbindelsen bibeholde noe biologisk aktivitet. Økt halveringstid kan bli påvist ved å bruke metoder beskrevet i eksempel 7 hvor halveringstiden til fusjonsproteinet er sammenlignet med halveringstiden til GLP-1 forbindelsene alene. Biologisk aktivitet kan bli bestemt ved in vitro og in vivometoder kjent innen fagfeltet. Representative biologiske assays er beskrevet i eksemplene 6, 8 og 9.
Ettersom Fc regionene til IgG produsert ved proteolyse har samme in vivo halveringstid som de intakte IgG molekylene og Fab fragmentene raskt er degradert tror man at den relevante sekvensen for forlenging av halveringstid ligger i CH2 og/eller CH3 domenene. Det har videre vært vist i litteraturen at de katabolske ratene til IgG variater som ikke binder høy affinitets Fc reseptoren eller Clq ikke er til å skjelne fra spaltningsraten til vildtype morantistoffet, noe som indkerer at det katabolske setet er forskjellige fra setene involvert i Fc reseptor eller Clq binding. [Wawrzynczak et al,
(1992), Molecular Immunology 29:221]. Setespesifikk mutagenesestudier med en munn IgGl Fc region antydet at setet i IgGl Fc regionen som kontrollerer den katabolske raten er lokalisert i CH2-CH3 domenekontaktflaten.
Basert på disse studiene kan Fc regioner modifiseres i det katabolske setet for å optimalisere halveringstiden til fusjonsproteinene. Det er foretrukket at Fc regionen anvendt i de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen er utledet fra en IgGl eller IgG4 Fc region. Det er enda mer foretrukket at Fc regionen er IgG4 eller utledet fra IgG4. Fortrinnsvis inneholder IgG Fc regionen både CH2 og CH3 regionene inkludert hengselregionen.
Generelle metoder for å lage de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen
Selv om de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan lages ved hjelp av flere forskjellige metoder, så er rekombinante metoder foretrukket. Med hensyn på den foreliggende oppfinnelsen, som fremlagt og påberopt heri, er følgende generelle molekylærbiologiske begreper og forkortelser definert nedenfor. Begrepene og for kortelsene anvendt i dette dokumentet har normal mening med mindre annet er nevnt. For eksempel "°C" viser til grader Celsius; "mmol" viser millimol; "mg" viser til milligram; "ul" viser til mikrogram; "ml eller mL" viser til milliliter; og "ul eller uL" viser til mikroliter. Aminosyreforkortelser er framvist i 37 c.f.r. § 1.822 (b) (2) (1994).
"Basepar" eller "bp" som anvendt heri viser til DNA eller RNA. Forkortelsene A, C, G og T korresponderer til 5'-monofosfatformene til deoksyribonukleosidene (deoksy)adenosin, (deoksy)cytidin, (deoksy)guanosin og tymidin når de forekommer i DNA molekyler. Forkortelsene U, C, G og A korresponderer til 5'-monofosfatformene til ribonukleosidene uridin, cytidin, guanosin og adenosin når de forekommer i RNA molekyler. I dobbelttrådet DNA kan basepar vise til et partnerskap mellom A og T eller C og G. I en DNA/RNA heterodupleks kan basepar vise til et partnerskap mellom A og U eller C med G. (se definisjonen av komplementær, infra).
"Nedbrytning/bespisning" ("Digestion") eller "restriksjon" av DNA viser til katalytisk klyøving av DNA med et restriksjonsenzym virker bare på visse sekvenser i DNAet ("sekvensspesifikke endonukleaser"). De forskjellige restriksjonsenzymene anvendt er kommersielt tilgjengelig og deres reaksjonsbetingelser, kofaktorer og andre krav ble anvendt som kjent for en fagperson innen teknikken. Passende buffere og substrat-mengder for spesielle restriksjonsenzymer er spesifisert av tilvirkeren eller kan lett finnes i litteraturen.
"Ligering" viser til prosessen med å danne fosfodiesterbindinger mellom to dobbelt-trådede nukleinsyrefragmenter. Hvis annet ikke er fremlagt kan ligering utføres ved å bruke kjente buffere og betingelser med en DNA ligase slik som T4 DNA ligase.
"Plasmid" viser til et ekstrakromosomalt (normalt) selvreplikerende genetisk element. Plasmider angis generelt ved en liten "p" fulgt av bokstaver og/eller nummer. Utgangs-plasmidene heri er enten kommersielt tilgjengelig, offentlig tilgjengelig på en ubegrenset basis eller kan bli konstruert fra tilgjengelige plasmider i henhold til publiserte prosedyrer. I tillegg er ekvivalente plasmider til de beskrevet kjent innen faget og vil være tydelig for fagpersonen.
"Rekombinant DNA kloningsvektor" som anvendt heri viser til enhver autonomt replikerende agent, inkludert, men ikke begrenset til, plasmider og fag, omfattende et DNA molekyl hvor en eller flere tilleggs DNA segmenter kan eller har blitt lagt til.
"Rekombinant DNA ekspresjonsvektor" som anvendt heri viser til enhver rekombinant DNA kloningsvektor hvor en promoter for å kontrollere transkripsjonen av det innsatte DNA har blitt inkorporert.
"Transkripsjon" viser til prosessen hvor informasjonen inneholdt i en nukleotid sekvens til DNA overføres til en komplementær RNA sekvens.
"Transfeksjon" viser til opptak av en ekspresjonvektor av en vertcelle uansett om en kodet sekvens er eller ikke er faktisk uttrykt. Et antall metoder for transfeksjon er kjent for fagfolk, f.eks kalsiumfosfat kopresipitering, liposomtransfeksjon og elektroporering. Vellykket transfeksjon anerkjennes generelt når en hvilken som helst indikasjon på virksomhet av denne vektor opptrer innen vertcellen.
"Transformering" viser til introduksjon av DNA i en organisme slik at DNAet er replikerbart, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved kromosomal integrering. Metoder for transformering av bakterielle og eukaryote verter er velkjent innen teknikken og mange av disse metodene, slik som kjerneinjeksjon, protoplastfusjon eller kalsiumbehandling ved kalsiumklorid, er oppsummert i J. Sambrook et al, Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1989). Generelt brukes betegnelsen transformasjon, og ikke betegnelsen transfeksjon, når DNA introduseres i gjær.
'Translasjon" som anvendt heri viser til prosessen hvor genetisk informasjon fra budbringer RNA (mRNA) anvendes til å spesifisere og lede syntesen av en polypeptid-kjede.
"Vektor" viser til en nukleinsyreforbindelse anvendt i transfeksjonen og/eller transfor-masjonen av celler ved genmanipulering bærende på polynukleotidsekvenser kodende egnede proteinmolekyler som, når kombinert med egnede kontrollsekvenser, overfører spesifikke egenskaper til vertcellen som transfekteres og/eller transformeres. Plasmider, virus og bakteriofag er egnede vektorer. Kunstige vektorer konstrueres ved kutting og sammenføyning av DNA molekyler fra forskjellige kiler ved å bruke restriksjonsenzymer og ligaser. Betegnelsen "vektor" som anvendt heri inkluderer rekombinant DNA kloningsvektorer og rekombinante DNA ekspresjonsvektorer.
"Komplementær" eller "komplementaritet", som anvendt heri, viser til basepar (puriner og pyrimidiner) som assosierer gjennom hydrogenbindinger til en dobbeltrådet nuklein-
syre. De følgende basepar er komplementære: guanin og cytosin; adenin og tymin; og adenin og uracil.
"Hybridisering" som anvendt heri viser til en prosess hvor en nukleinsyretråd slår seg sammen med en komplementær tråd gjennom baseparring. Betingelsene anvendt ved hybridiseringen av to ikke-identiske, men meget like, komplementære nukleinsyrer varierer med graden av komplementaritet av de to trådene og lengden av trådene. Slike teknikker og betingelser er velkjent for praktikere innen dette feltet.
"Isolert aminosyresekvens" viser til enhver aminosyresekvens, hvorledes enn konstruert eller syntetisert, som lokaliseirngsmessig er forskjellige fra den naturlig forekommende sekvensen.
"Isolert DNA forbindelse" viser til enhver DNA sekvens, hvorledes enn konstruert eller syntetisert, som er lokaliseringsmessig forskjellige fra dets naturlige lokalisering i genomisk DNA.
"Isolert nukleinsyreforbindelse" viser en hvert RNA eller DNA sekvens, hvorledes enn konstruert eller syntetisert, som lokaliseirngsmessig er forskjellige fra dets naturlig lokalisering.
"Primer" viser til et nukleinsyrefragment som fungerer som et initierende substrat for enzymatisk eller syntetisk elongering.
"Protomer" viser til en DNA sekvens som styrer transkripsjon av DNA til RNA.
"Probe" viser til en nukleinsyreforbindelse eller et fragment av dette som hybridiserer med en annen nukleinsyreforbindelse.
"Stringens" av hybridiseringsreaksjoner kan lett bestemmes av en fagmann i feltet og er generelt en empirisk kalkulering avhengig av probelengde, vasketemperatur og salt-konsentrasjon. Generelt krever lengre prober høyere temperaturer for korrekt "annealing", mens kortere prober krever lave temperaturer. Hybridisering er generelt ahengig av evnen til denaturert DNA til å re-anneal når komplementære tråder er tilgjengelige i et miljø under deres smeltetemperatur. Jo høyere graden av ønsket homologi mellom proben og hybridiseringssekvens, jo høyere relativ temperatur kan anvendes. Det følger som et resultat at høyere relative temperaturer tenderer til å gjøre
reaksjonene mer stringente, mens lavere temperaturer mindre så. For tilleggsdetaljer og forklaring av stringens til hybridiseringsreaksjoner, se Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscience Publishers, 1995.
"Stringente betingelser" eller "høystringente betingelser", som definert heri, kan identifiseres av de som (1) anvender lavionisk styrke og høy temperatur ved vasking, f.eks, 1,5 mm natriumklorid/1,5 mm natriumcitrat/0,1 % natriumdodecylsulfat ved 50°C; (2) anvender et denatureirngsmiddel under hybridisering, slik som formamid, f.eks, 50 % (v/v) formamid med 0,1 % bovint serumalbumin/0,1 % ficoll/0,1 % polyvinylpyrrolidin/50 mm natriumfosfatbuffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid/75 mm natriumcitrat ved 42°C; eller (3) anvender 50 % formamid, 5x SSC (750 mm natriumklorid/75 mm natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat 5X Denhardts oppløsning, sonikert laksesperm DNA (50 |J.g/ml), 0,1 % SDS og 10 % dekstransulfat ved 42°C med vasking ved 42°C i0,lX SCC (30 mM natriumklorid/3 mM natriumcitrat) og 50 % formamid ved 55°C, fulgt av en høy-stringent vask bestående av 0,1 X SSC inneholdnede EDTA ved 55°C.
"Moderat stringente betingelser" kan identifiseres som beskrevet av Sambrook et al.
[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York; Cold Spring Harbor Press,
(1989), og inkluderer anvendelsen av vaskeløsning og hybridiseringsbetingelser (f.eks temperatur, ionisk styrke og % SDS) mindre stringente enn de beskrevet ovenfor. Et
eksempel på moderat stringente betingelser er overnatt inkubering ved 37°C i en løsning bestående av: 20 % formamid, 5X SSC (750 mM natriumklorid, 75 mM natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat ved pH 7,6, 5X Denhardts oppløsning, 10 % dekstransulfat og 20 mg/ml denaturert oppkuttet laksesperm DNA, fulgt av vasking av filtrene i IX SSC ved omkring 37 til 50°C. En normalt begavet fagperson vil vite hvordan justere temperaturen, ionisk styrke, etc som nødvendig for å imøtekomme faktorer slik som problengde og dets like.
"PCR" viser til den meget kjente polymerasekjedereaksjonen som anvender en termisk stabil DNA polymerase.
"Ledersekvens" viser til en sekvens av aminosyrer som kan fjernes enzymatisk eller kjemisk for å produsere det ønskede polypeptidet.
"Sekresjonssignalsekvens" viser til en sekvens av aminosyrer generelt tilstede på den N-terminale region til et stort polypeptid som fungerer til å initiere assosiering av dette
polypeptidet med cellemembranavdelinger som det endoplasmatiske reticulum og utskillelse av dette polypeptidet gjennom plasmamembranen.
Konstruksjon av DNA kodende de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen: Villtype immunoglobulinproteiner kan oppnås fra flere forskjellige kilder. For eksempel kan disse proteinene oppnås fra et cDNA bibliotek fremstilt fra vev eller celler som uttrykker mRANet av interesse på et detekterbart nivå. Biblioteker kan bli screenet med prober designet ved å anvende den publiserte DNA eller proteinsekvensen for det enkelte proteinet av interesse. Immunoglobulin lett eller tungkjede konstante regioner beskrives, f.eks, i Adams et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet et al
(1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:7862-7862; Falkner et al. (1982) Nature 298:286-288; og Morrison et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256.
Screening av cDNA eller genomiske biblioteker med den valgte proben kan bli utført ved å anvende standard prosedyrer slik som beskrevet i Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989). En alternativ måte å isolere et gen kodende et immunoglobulinprotein er å bruke PCR metodologi [Sambrook et al, supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1995)]. PCR primere kan designes basert på publiserte sekvenser.
Fullengde villtypesekvensene klonet fra en spesiell art kan generelt fungere som et templat for å danne analoger, fragmenter og derivater som bibeholder evnen til å gi en lengre plasmahalveringstid til GLP-1 forbindelsen som er del av fusjonsproteinet. Det er foretrukket at Fc delene av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen utledes fra den native humane sekvensen for å redusere risikoen for eventuell immunogensitet til fusjonsproteinet i mennesket.
Spesielt er det foretrukket at immunoglobulindelen av et fusjonsprotein omfavnet av den foreliggende oppfinnelsen inneholder bare et Fc fragment av immunoglobulinet. Avhengig av hvorvidt spesielle effektorfunksjoner er ønsket og de strukturelle karakteri-stika av fusjonsproteinet, så kan et Fc fragment inneholde hengselsregionen sammen med CH2 og CH3 domenene eller en annen kombinasjon av disse. Disse Fc fragmentene kan dannes ved å anvende PCR teknikker med primere designet til å hybridisere til sekvenser samsvarende med de ønskede endene av fragmentet.
DNA kodende GLP-1 forbindelsene i den foreliggende oppfinnelsen kan lages ved flere forskjellige metoder inkludert kloningsmetoder slik som de beskrevet ovenfor så vel som kjemisk syntetisert DNA. Kjemisk syntese kan være attraktivt gitt den korte lengden av det kodete peptidet. Aminosyresekvensen til GLP-1 har blitt publisert så vel som sekvensen av preproglukagongenet. [Lopez et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei., USA 80:5485-5489; Bell et al. (1983) Nature, 302:716-718; Heinrich, G. et al. (1984) Endocrinol, 115:2176-2181; Ghiglione, M. et al. (1984) Diabetologia 27:599-600]. Følgelig, kan primere designes til PCR native GLP-1 forbindelser og fragmenter av disse.
Genet kodende et fusjonsprotein kan så konstrueres ved å ligere DNA kodende en GLP-1 forbindelse i leseramme med DNA kodende et Fc protein. Genet kodende GLP-1 forbindelsen og genet kodende Fc proteinet kan også bli sammenført i leseramme via DNA kodende et linkerpeptid.
In vivo funksjonen og stabiliteten til de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan optimaliseres ved å legge til små peptidlinkere for å forhindre potensielt uønskede domeneinteraksjoner. Selv om disse linkerene potensielt kan være
av enhver lengde og bestå av enhver kombinasjon av aminosyrer, så er det foretrukket at lengden ikke er lengre enn nødvendig for å unngå uønsket domeneinteraksjoner og/eller optimalisere biologisk aktivitet og/eller stabilitet. Generelt bør linkerene ikke inneholde aminosyrer med ekstremt store sidekjeder eller aminosyrer som med sannsynlighet
introduserer signifikante sekundære strukturer. Det er foretrukket at linkeren er serin-glysinrik og mindre enn 30 aminosyrer i lengde. Det er også foretrukket at linkeren ikke er mer enn 20 aminosyrer i lengde. Det er enda mer foretrukket at linkeren ikke er mer enn 15 aminosyrer i lengde. En foretrukket linker inneholder repetisjoner av sekvensen Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Det er foretrukket at det er mellom 2 og 6 repetisjoner av denne sekvensen. Det er ennå mer foretrukket at det er mellom 3 og 4 repetisjoner av denne sekvensen.
DNA kodende villtype GLP-1 og Fc polypeptider og fragmenter av disse kan muteres enten før ligering eller i sammenheng med et cDNA kodende et helt fusjonsprotein. Flere forskjellige mutageneseteknikker er velkjent innen fagfeltet. For eksempel utnytter trådoverlappingsforlengelse for å skape spesifikke basemutasjoner i den hensikt å endre en spesifikk aminosyresekvens i det samsvarende proteinet. Denne PCR mutagenesen krever anvendelsen av fire primere, to i foroverrettet orientering (primere A og C) og to i motsatt orientering (primere B og D). Et mutert gen er amplifisert fra villtypetemplatet i to forskjellige trinn. Den første reaksjonen amplifiserer genet i to deler ved å utføre en A til B reaksjon og en separat C til D reaksjon hvor B og C primerene er rettet mot området av genet som skal muteres. Når disse primerene sammenstilles med målområdet inneholder de mismatch for de basene som skal endres. Etter at A til B og C til D reaksjonene er utført isoleres og blandes reaksjonsproduktene for anvendelse som templat for A til D reaksjonen. Denne reaksjonen gir så det fulle muterte produktet.
Etter at et gen kodende for hele fusjonsproteinet er produsert kan det klones inn i en egnet ekspresjonsvektor. Spesifikke strategier som kan anvendes for å lage GLP-1 fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen er beskrevet i eksempel 1.
Generelle metoder for rekombinant ekspresjon av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen: Vertceller transfekteres eller transformeres med ekspresjons- eller kloningsvektorene beskrevet heri for heterolog fusjonsproteinproduksjon og dyrkes i vanlige næringsmedia modifisert for å indusere promotere, selektere transformanter eller amplifisere genene kodende de ønskede sekvensene. Kulturbetingelsene, slik som media, temperatur, pH og dets like, kan velges av en normalt begavet fagperson uten unødig eksperimentering. Generelt kan prinsipper, protokoller og praktiske teknikker for maksimalisering av produktiviteten til cellekulturer finnes i Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed (IRL Press, 1991) og Sambrook et al, supra. Transfeksjons-metoder er kjent for gjennomsnittsfagmannen, f.eks, CaP04og elektroporering. Generelle aspekter ved mammalske vertcellesytemtransformasjoner har blitt beskrevet i US patent nr 4.399.216. Transformasjoner inn i gjær utføres typisk i henhold til metoden til van Solingen et al., J Bact. 120(2): 946-7 (1977) og Hsiao et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76(8): 3829 (1979). Andre metoder for å introdusere DNA inn i celler kan imidlertid også anvendes, slik som nukleær mikroinjeksjon, elektroporering, bakteriell protoplastfusjon med intragene celler eller polykationer, f.eks polybren eller polyomitin. For forskjellige teknikker for transformasjon av animalske celler, se Keown et al., Methods in Enzymology 185: 517-37 (1990) og Mansour et al, Nature 336(6197): 348-52 (1988)
Egnede vertceller for kloning eller ekspresjon av nukleinsyre (f.eks DNA) i vektorene heri inkluderer prokaryote, gjær eller høyere eukaryote celler. Egnede prokaryoter inkluderer men er ikke begrenset til eubakterie, slik som Gram negative eller Gram positive organismer, f.eks, Enterobacteriacea slik som E.coli. Forskjellige E.coli stammer er å finne tilgjengelig, slik som E. coli Kl 2 stamme MM294 (ATCC 3 1.446); E. coli stamme W3 110 (ATCC 27.325) og K5 772 (ATCC 53.635) Andre egnede prokaryote vertceller inkluderer Enterobacteriaceae slik som Escherichia, f.eks E. coli Enterobacter, Erwinia, Klebisella, Proteus, Salmonella, f.eks Salmonella typhimurium, Serratia, f.eks Serratia marcescans og Shigeila, så vel som Bacilli slik som B. subtilis og B lichentformis (f.eks B licheniformis 4 1 P fremlagt i DD266, 7, 10 publisert 12 april 1989), Pseudomonas slik som O. aeruginosa og Streptomyces. Disse eksemplene er illustrative heller enn begrensende. Stamme W3110 er en spesielt foretrukket vert eller morvert fordi det er en vanlig vertsstamme for rekombinant DNA produktfermentering. Fortrinnsvis utskiller vertscellen minimale mengder av proteolytiske enzymer. For eksempel kan stamme W3 110 modifiseres til å forårsake en genetisk mutasjon i genene kodende proteiner endogene for verten, eksempler på slike verter inkluderer E. coli W3110 stamme 1A2, som har den fullstendige genotypen ronA; E. coli W3 110 stamme 9E4, som har den fullstendige genotypen ton4 ptr3; E. coli W3110 stamme 27C7 (ATCC 55.244), som har den fullstendige genotypen tonA, ptr3 phoA El 5 (argF-lac) 169 degP ompT /can'; E. coli W3110 stamme 40B4, som er stamme 37D6 med en ikke-kanamycin resistent degP delesjonsmutasjon; og en E. coli stamme med mutert periplasmatisk protease fremlagt i US patent nr 4.946.783 gitt 7 august 1990. Alternativt er in vivo kloningsmetoder, f.eks PCR eller andre nukleinsyrepolemerasereaksjoner, egnet.
I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober slik som filamentøse fungi eller gjær egnede klonings eller ekspresjons verter for fusjonsproteinvektorer. Saccharomyces cerevisiae er en ofte anvendt lavere eukaryot vertsmikroorganisme. Andre inkluderer Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse, Nature 290: 140-3 (1981); EP 139.383 publisert 2 mai 1995]; Muyveromyces verter [US patent nr 4.943.529; Fleer et al, Bio/Technlogy 9(10): 968-75 (1991)] slik som f.eks K lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574 [de Louvencourt et al, J. Bavteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fiagilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K wickeramii (ATCC 24.178), K waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906) [Van den Berg et al., Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)]; K thermotoierans og K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070) [Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol. 28(4): 265-78 (1988)]; Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa [Case, et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces slik som Schwanniomyces occidentulis (EP 349.538 publisert 31 oktober 1990); og filamentøse fungi slik som f.eks Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publisert 10 januar 1991) og Aspergillus verter slik som A. nidulans [Ballance et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilburn et al, Gene 26(2-3); 205-21 (1983); Yelton et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81(5): 1470-4 (1984)) og A. niger [Kelly and Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Metylotrofe gjærceller velges fra slektene bestående av Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotoruia. En liste av spesifikke arter som er eksempler på denne klassen av gjær kan finnes i C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs 269 (1982).
Egnede vertsceller for ekspresjonen av fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen likeledes fra multicellulære organismer. Eksempler på invertebrate celler
inkluder insektceller slik som Drosophila S2 og Spodoptera Sp, Spodoptera high5 så vel som planteceller. Eksempler på nyttige mammalske vertscellelinjer inkluderer kinesiske hamsterovarie (CHO) og COS celler. Mer spesifikke eksempler inkluderer apenyre CV1 linje transformert med SC40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humane embryonisk nyrelinje [293 eller 293 celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, Graham et al, J. Gen.
Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; kinesisk hamster ovarieceller /-DHFR [CHO, Urlaub and Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]; muse sertoliceller [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1): 243-52 (1980)]; humane lungeceller (W138. ATCC CCL 75); humane leverceller (Hep G2, HB 8065); og muse mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Valg av den egnede vertscellen anses å være innenfor fagkunnskapen.
Fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan produseres rekombinant direkte eller som et protein med en signalsekvens eller andre tilleggssekvenser som skaper et spesifikt kløyvingssete i N-terminus til det modne fusjonsproteinet. Generelt kan signalsekvensen være en komponent av vektoren eller den kan være en del av det fusjonsproteinkodende DNA som er innsatt i vektoren. Signalsekvensen kan være en prokaryotisk signalsekvens valgt, f.eks, fra gruppen av alkaliske fosfataser, penicillinase, lpp eller varmestabile enterotoksin II ledersekvenser. For gjærutskillelse kan signalsekvensen være, f.eks gjærinvertaseledersekvensen, alfafaktorlederen (inkludert Saccharomyces og Kluyveromyces å-faktorledere, den siste beskrevet i US patent nr 5.010.182) eller syrefosfataselederen, eller C. albicans glukoamylaselederen (EP 362.179) eller signalet beskrevet i WO 90/13646. Ved mammalsk celleekspresjon kan mammalske signalsekvenser anvendes for å styre utskillelsen av proteinet, slik som signalsekvenser fra utskilte polypeptider av samme eller beslektede arter så vel som virale sekretoriske ledersekvenser.
Både ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som setter vektoren i stand til å replikere i en eller flere utvalgte vertsorganismer. Slike sekvenser er velkjente for flere forskjellige bakterier, gjær og vimser. Replikasjonsorigo fra plasmidet pBR322 er egnet for de fleste Gram negative bakterier, 2u plasmid origo er egnet for gjær og forskjellige virale origos (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er nyttige for kloningsvektorer i mammalceller.
Ekspresjon- og kloningsvektorer inneholder typisk et seleksjonsgen, også kalt en seleksjonsmarkør. Typiske seleksjonsgener inneholder proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre toksiner, f.eks ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetracyklin, (b) komplementerer autotrofe mangler eller (c) forsyner kritiske nærings-stoffer ikke tilstede i komplekse media, f.eks genet kodende D-alanin racemase for Bacilli.
Et eksempel på egnede seleksjonsmarkører for mammalske celler er de som gjør mulig identifikasjonen av celler kompetente til å ta opp den fusjonsproteinkodende nuklein-syren, slik som DHFR eller thymidin kinase. En egnet vertscelle når villtype DHFR anvendes er CHO cellelinjen manglende DHFR aktivitet, fremstilt og dyrket som beskrevet [Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77(7): 4216-20 (1980)]. Et egnet seleksjonsgen for anvendelse i gjær er trpl genet tilstede i gjærplasmidet YRp7 [Stinchcomb et al, Nature 282(5743): 39-43 (1979); Kingsman et al, Gene 7(2): 141-52
(1979); Tschumper et al, Gene 10(2): 157-66 (1980)]. trpl genet gir en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær manglende evnen til å vokse i tryptofan, f.eks ATCC nr 44076 eller PEPC1 [Jones Genetics 85: 23-33 (1977)].
Ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder normalt en promoter operasjonsmessig linket til den fusjonsproteinkodende nukleinsyresekvensen for å styre mRNA syntesen. Promotoren gjenkjent av flere forskjellige potensielle vertsceller er velkjente. Promotere egnet for anvendelse i prokaryote verter inkluderer pMaktamase og laktosepromoter-systemene [Chang et al, Nature 275(5681)] 617-24 (1978); Goeddel et al, Nature 281(5732): 544-8 (1979)], alkalisk fosfatase, et tryptofan (up) promotersystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8(18): 4057-74 (1980); EP 36.776 publisert 30 september 1981)] og hybride promotere slik som tat promoteren [deBoer et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80(1): 21-5 (1983)]. Promotere for anvendelse i bakterielle systemer inne holder også en Shine-Dalgarno (S.D.) sekvens funksjonelt linket til DNA kodende for fusjonsproteinet.
Eksempler på egnede promotersekvenser for anvendelse i gjærverter inkluderer promoterene for 3-fosfoglyserat kinase [Hitzeman et al, J. Biol. Chem. 255(24): 12073-80 (1980)] eller andre glykolytiske enzymer [Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149
(1968); Holland, Biochemistry 17(23): 4900-7 (1978)] slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.
Andre gjærpromoterer som er induserbare med tilleggsfordelen av transkripsjons-kontroll ved vekstbetingelser, er promotoerregionene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogen-metabolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer ansvarlige for maltose og galaktoseutnyttelse. Egnede vektorer og promotorer for anvendelse i gjærekspresjon er videre beskrevet i EP 73.657. Transkripsjon av fusjonsproteinkodende mRNA fra vektorer i mammalske vertsceller kan kontrolleres, f.eks, ved promoterer oppnådd fra genomene til virus slik som polyoma virus, fowlpox virus, adenovirus (slik som Adenovirus 2), bovine papilloma virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt B virus og Simian Virus 40 (SV40) fra heterologe mammalske promoterer, f.eks aktinpromoteren eller en immunoglobulin-promoter og fra varmesjokkpromotere, gitt at slike promotere er kompatible med verts-cellesystemene.
Transkripsjon av et polynukleotid kodende et fusjonsprotein i høyere eukaryoter kan økes ved å sette inn en enhancer sekvens inn i vektoren. Enhancersekvenser er cis-virkende DNA elementer, vanligvis på omkring 10 til 300 basepar, som virker på en promoter for å øke dens transkripsjon. Mange enhancersekvenser er nå kjent fra mammalske gener (globin, elastase, albumin, a-ketoprotein og insulin). Man vil imidlertid bruke en enhancersekvens fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40 enhanceren på den sene siden av replikasjonsorigo (bp 100-270), cytomegalovirus tidlig promoter enhancer, polyomaenhanceren på den sene siden av replikasjonsorigo og adenovirusenhancersekvenser. Enhanceren kan spleises inn i vektoren i en posisjon 5' eller 3' til den fusjonsproteinkodende sekvensen, men er fortrinnsvis lokalisert 5' for promoteren.
Ekspresjonsvektorer anvendt i eukaryote vertsceller (gjær, fungi, insekt, plante, dyr, menneske eller nukleære celler fra andre multicellulære organismer) inneholder også sekvenser nødvendig for terminering av transkripsjon og for stabilisering av mRNA. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige i de 5' og av og til 3' utranslaterte regionene til eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse regionene inneholder nukleotid-segmenter transkribert som polyadenylerte fragmenter i den utranslaterte delen av mRNA kodende fusjonsproteinet.
Forskjellige former av et fusjonsprotein kan utvinnes fra kulturmedium eller fra vertscellelysater. Hvis membranbundet kan det bli frigitt fra membranen ved å anvende en egnet detergent løsning (f.eks Triton-X 100) eller ved enzymatisk kløyving. Celler anvendt i ekspresjon av et fusjonsprotein kan ødelegges ved forskjellige fysiske eller kjemiske metoder, slik som fryse-smelte sykluser, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller cellelysismidler.
Rensing av det heterologe fusjonsproteinet i den foreliggende oppfinnelsen:
Når de heterologe fusjonsproteinene innenfor denne oppfinnelsen uttrykkes i de egnede vertscellene kan analogene isoleres og renses. Følgende prosedyrer er eksempler på egnede rensningsprosedyrer: fraksjonering på karboksymetylcellulose; gelfiltrering slik som Sephadex G-75; anionbytteresin slik som DEAE eller Mono-Q; kationbytte slik som CM eller Mono-S; protein A sefarose for å fjerne kontaminanter slik som IgG; metallchelerende kolonner for å binde epitope-merkede former av polypeptidet; reversfase HPLC; kromatofokusering; silikagel; etanolpresipitering og ammoniumsulfat-presipitering.
Forskjellige proteinrensingsmetoder kan anvendes og slike metoder er kjent innen fagfeltet og beskrevet, f.eks, i Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) og Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Rensingstrinnene valgt vil være avhengig av naturen til produksjonsprosessen anvendt og det enkelte fusjonsproteinet produsert. Fusjonsproteiner omfattende et Fc fragment kan f.eks effektivt renses ved å anvende et protein A eller protein G affinitetsmatriks. Lav eller høy pH buffere kan anvendes til å eluere fusjonsproteinet fra affinitets-matrikset. Milde elueringsbetingelser vil hjelpe forebyggelsen av irreversibel denaturering av fusjonsproteinet. Imidazolinneholdende buffere kan også anvendes. Eksempel 3 beskriver noen vellykkede renseprotokoller for fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen.
Karakterisering av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen
Flere metoder eksisterer for å karakterisere fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen. Noen av disse metodene inkluderer: SDS-PAGE koblet med protein fargingsmetoder eller immunoblotting med anti-IgG eller anti-HSA antistoffer. Andre metoder inkluderer matriksassistert laser desorpsjon/ioniserende massespektroskopi (MALDI-MS), væskekromatografi/massespektroskopi, isoelektrisk fokusering, analytisk anionbytte, kromatofokusering og sirkulær dikroisme for å angi noen få. Et representativt antall heterologe fusjonsproteiner blekarakterisert vedhjelp av SDS-PAGE koblet med immunoblotting så vel som massespektroskopi )se eksemplene 4 og 5 og figurene 3 og 4).
For eksempel illustrerer tabell 3 (se eksempel 5) den kalkulerte molekylære massen for et representativt antall av fusjonsproteiner så vel som massen som fastsatt ved massespektroskopi. I tillegg illustrerer figurene 3 og 4 molekylære vekter til et representativt antall fusjonsproteiner som fastsatt ved SDS-PAGE. Alle heterologe fusjonsproteiner testet ble uttrykt og utskilt transient. I tillegg ble IgK signal sekvensen kuttet for å gi proteiner med korrekt N-terminus.
Videre illustrerer tabell 3 at i noen tilfeller er massen fastsatt ved massespektroskopi større enn forventet. Dette er et resultat av glykosylering av Fc delen og den C-terminale forlengelsen. Enzymatisk nedbrytning av fusjonsproteinene fulgt av reversfase HPLC og massespektroskopi kan identifisere peptidfraksjoner som inneholder sukkermoiteter. Disse fraksjonene kan så bli N-terminal aminosyresekvensert for identifikasjon av det potensielle glykosyleirngssetet. For eksempel, karakterisering av Exendin-4-Fc (SEQ ID NO: 29) viser at serinet i posisjon 39 og treoninet i posisjon 50 er O-linket glykosylert og asparaginet i posisjon 122 er N-linket glykosylert.
Et representativt antall av GLP-1 fusjonsproteiner ble også testet for aktivitet. Flere
metoder eksisterer for å detektere GLP-1 aktivitet in vitro og in vivo (se eksemplene 6, 7, 8 og 9). Tabell 4 (eksempel 6) illustrerer GLP-1 reseptoraktivitet assosiert med flere GLP-1 fusjoner. Numrene er relative til aktiviteten assosiert med Val<8->GLP-l(7-37)OH. Alle fusjonsproteiner testet hadde GLP-1 reseptoraktivitet. Et lavt nivå av in vitro aktivitet er nødvendigvis ikke en indikasjon på svak effekt in vivo. På grunn av den vesentlig økningen i halveringstid for disse fusjonsproteinene er svak in vitro aktivitet generelt ikke predikerende på svak in vivo aktivitet. Figur 7 og eksempel 7 illustrerer
den forlengede halveringstiden forbundet med fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen. For eksempel hadde Val<8->GLP-1-Fc en halveringstid på omtrent 45 timer i ape, Val<8->GLP-1-HSA hadde en halveringstid på omkring 87 timer i ape, Gly<8->Glu<22->GLP-l-CEx-Linker-IgGl hadde en halveringstid etter IV administrering på omkring 55 timer i hunder, og Gly<8->Glu<22->GLP-l-Cex-Linker-IgGl hadde en halveringstid etter SC administrering på omkring 38 timer i hunder.
Sammensetninger i oppfinnelsen:
Fysisk stabilitet er også et essensielt trekk ved terapeutiske proteinformuleringer. GLP-1 forbindelser har vært spesielt vanskelige å fremstille og formulere på grunn av de strukturelle endringer som skjer under prosessen. For eksempel har noen GLP-1 forbindelser en generell tendens til å aggregere. I tillegg har det vært vist at noen GLP-1 konverterer fra en løselig og aktiv a-heliks til en uløselig og potensielt inaktiv P-plate form. Fusjonen av GLP-1 forbindelser til store proteiner slik som Fc regionen til et IgG fører ikke bare til økt halveringstid for GLP-1 forbindelsen, men bidrar også til den fysiske og konformasjonsmessige stabiliteten til GLP-1 forbindelsen. For eksempel er Val<8->GLP-1-Linker-HSA i PBS stabil ved 37°C frem til omkring 30 dager.
De heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan formuleres med en eller flere bindemidler. De aktive fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan kombineres med en farmasøytisk akseptabel buffer, og pH justert for å gi akseptabel stabilitet, og en pH akseptabel for administrering slik som parenteral administrering.
En eller flere farmasøytisk akseptable anti-mikrobielle midler kan valgfritt legges til. Meta-kresol og fenol er foretrukne farmasøytisk akseptable mikrobielle midler. Et eller flere farmasøytisk akseptable salter kan legges til for å justere den ioniske styren eller tonisitet. En eller flere bindemidler kan legges til for å videre justere isotonisiteten til formuleringen. Glyserin er et eksempel på et isotonisitetsjusterende bindemiddel. Farmasøytisk akseptabel betyr egnet for administrering til et menneske eller annet dyr og derved inneholder ikke toksiske elementer eller uønskede kontaminanter og interfererer ikke med aktiviteten til den aktive forbindelsen heri.
En farmasøytisk akseptabel saltform av de heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i den foreliggende oppfinnelsen. Syrer vanligvis anvendt for o danne syreaddisjonssalter er uorganiske syrer slik som saltsyre, bromsyre, hydroiodidsyre, svovelsyre, fosforsyre og dets like, og organiske syrer slik som p-toluensulfonsyre, metansulfonsyre, oksalsyre, p-bromfenylsulfonsyre, karbon-syre, ravsyre, sitronsyre, benzosyre, eddiksyre og dets like. Foretrukne syreaddisjonssalter er de dannet med mineralsyrer slik som saltsyre og hydrobromsyre.
Baseaddisjonssalter inkluderer de utledet fra uorganiske faser slik som ammonium eller alkali eller alkaliske jordmetaller hydroksyder, karbonater, bikarbonater og dets like. Baser nyttige i fremstilling av saltene i denne oppfinnelsen inkluderer dermed natrium-hydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniumhydroksyd, kaliumkarbonat og dets like.
Administrering av sammensetningene:
Administrering kan gjøres via enhver rute kjent å være effektiv av gjennomsnittslegen. Perifer, parenteral er en slik metode. Parenteral administrering er vanligvis forstått i den medisinske litteraturen som injeksjonen av en doseform inn i kroppen med en steril nål eller en annen mekanisk innretning slik som en infusjonspumpe. Perifere parenterale ruter inkluderer intravenøse, intramuskulære, subkutane og intraperetoneale administreringsruter.
De heterologe fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan også rettes mot administrering via orale, rektale, nasale eller nedre respiratoriske ruter, som er ikke-parenterale ruter. Av disse ikke-parenterale rutene er den lavere respiratoriske ruten og den orale ruten foretrukket.
Fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen kan bli anvendt for å behandle flere forskjellige sykdommer og tilstander. Fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen utøver deres biologiske virkninger primært ved å virke som en reseptor kalt "GLP-1 reseptoren". Individer med sykdommer og/eller tilstander som responderer gunstig på GLP-1 reseptorstimulering eller på administrering av GLP-1 forbindelser kan derfor behandles med GLP-1 fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen. Disse individene sies å "være trengende for behandling med GLP-1 forbindelser" eller "trengende for GLP-1 reseptorstimulering". Inkludert er individer med ikke-insulin avhengig diabetes, insulinavhengig diabetes, slag (se WO 00/16797), myokardisk infarkt (se WO 98/08531), fedme (se WO 98/19698), katabolske endringer etter kirurgi (se US patent nr 6.006.753), funksjonell dyspepsi og irritabelt tarmsyndrom (se WO 99/64060). Også inkludert er individer trengende profylaktisk behandling med en GLP-1 forbindelse, f.eks individer med risiko for utvikling av ikke-insulinavhengig diabetes (se WO 00/07617). Individer med svekket glykosetoleranse eller svekket fastende glykose, individer hvor kroppsvekten er omkring 25 % over normal kroppsvekt for personens høyde og kroppsbygning, individer med en delvis pancreatectomy, individer med en eller flere foreldre med ikke-insulinavhengig diabetes, individer som har hatt svangerskapsdiabetes og individer som har hatt akutt eller kronisk pankreatitt er i fare for å utvikle ikke-insulinavhengig diabetes.
En "effektiv mengde" av en GLP-1 forbindelse er kvantiteten som resulterer i en ønsket terapeutisk og/eller profylaktisk virkning uten å forårsake uaksepterbare bivirkninger når administrert til et individ trengende GLP-1 reseptorstimulering. En "ønsket terapeutisk virkning" inkluderer en eller flere av følgende: 1) forbedring av symptomene assosiert med sykdommen eller tilstanden; 2) forsinkelse i begynnelsen av symptomer assosiert med sykdommen eller tilstanden; 3) økt levealder sammenlignet med fravær av behandlingen; og 4) større livskvalitet sammenlignet med fraværet av behandlingen. For eksempel er en "effektiv mengde" av en GLP-1 forbindelse for behandlingen av diabetes kvantiteten som ville resultere i større kontroll av blod-glykosekonsentrasjon enn i fraværet av behandling, dermed resulterende i en forsinkelse i begynnelsen av diabetes komplikasjoner slik som retinopati, neuropati eller nyre-sykdom. En "effektiv mengde" av en GLP-1 forbindelse for forebyggingen av diabetes er kvantiteten som ville forsinke, sammenlignet med fraværet av behandling, innsettingen av eleverte blodglukosenivåer som krever behandling med anti-hypoglykemiske legemidler slik som sulfonyl ureas, tiazolidindioner, insulin og/eller bisguanidiner.
Dosen av fusjonsproteiner nødvendig for å normalisere en pasients blodglukose vil avhenge av flere faktorer, hvor disse er inkludert, uten begrensning, individets kjønn, vekt og alder, grad av mangel på evne til å regulere blodglukose, administreringsrute og biotilgjengelighet, den farmakokinetiske profilen til fusjonsproteinet, potensen og formuleringen.
Den foreliggende oppfinnelsen omfatter GLP-1 forbindelser som har forbedrede bio-kjemiske og biofysiske egenskaper i kraft av å være fusjonert med et Fc protein, et Fc fragment eller en Fc analog. Disse heterologe proteinene kan med heldig resultat uttrykkes i vertsceller, bibeholde signaleringsaktivitet assosiert med aktivering av GLP-1 reseptoren og ha forlenget halveringstid.
De følgende eksempler er presentert for å videre beskrive den foreliggende oppfinnelsen.
Eksempel 1: Konstruksjon av DNA kodende heterologe fusjonsproteiner
Eksempel la. Konstruksjon av DNA kodende Val<8->GLP-l(7-37)-Fc:
En Fc del av humant IgGl ble isolert fra et cDNA bibliotek og inneholder hele hengselregionen og CH2 og CH3 domenene. Et fragment inneholdende 696 basepar fra denne Fc delen av humant IgGl ble subklonet inn i Nhel og Eco47III setene til mammalsk ekspresjonsvektor pJB02 for å danne pJB02/Fc (se figur 5). DNA kodende IgKsekresjonssignalsekvensen fusjonert til Val<Q->GLP-1(7-37) ble dannet ved in vitro hybridisering av fire overlappende og komplementære oligonukleotider:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført ved å anvende ekvivalente mengder av hver oligo-nukleotid (1 pm/ul endelig konsentrasjon av hver oligo). Blandingen av oligonukleotider ble oppvarmet i 5 minutter ved 100°C i ligeringsbuffer (50 med mer Tris-HC1, pH 7,5,10 med mer MgCl2,10 med mer DTT, 1 mm ATP, 25 ug/ml bovint serumalbumin) og så avkjølt i løpet av minst 2 timer ved 30°C.
Det resulterende hybridiseringsproduktet ble ligert i 2 timer ved romtemperatur eller over natt ved 16°C til pJB02/Fc vektor skjelettet som hadde blitt behandlet med Nhel og Eco47III. Ligeringsproduktene ble anvendt til å transformere kompetente XL-1 Blue celler (Stratagene). Rekombinante plasmider ble screenet for tilstedeværelsen av peptid-kodende insersjoner ved å bespise kloner med Ncol (kodende Kozak sekvensen og første Met i signalpeptidet) og sekvensert. Det resulterende ekspresjonsplasmidet anvendt for transfeksjonsassayet ble betegnet pJB02-V8-GLP-l-Fc (Figur 5).
Eksempel lb. Konstruksjon av DNA kodende Val<8->GLP-l(7-37-HSA:
Plasmidet HSA/pcDNA3.1GS ble innkjøpt fra Invitrogen (Catalog # H-M12523M-pcDNA3.1/GS) og brukt som et templat for å isolere cDNA kodende humant serumalbumin (HSA). HSA cDNA ble fremstilt ved å bruke PCR hvor den DNA kodende ledersekvensen så vel som de seks aminosyrepropeptidene ble fjernet fra 5' enden. I tillegg ble stoppkodon lagt til direkte på 3' enden til HSA kodende sekvensen. Til slutt ble restriksjonsenzymseter lagd ved 5' og 3' enden for å lette kloning. HSA DNA sekvensen tilstede i den originale vektoren innkjøpt fra Invitrogen inneholdt en enkelt baseendring i 3' regionen til genet (posisjon 667) sammenlignet med den native humane sekvensen. Denne endringen ville resutlere i et kodon for Asn istedenfor Asp. Ved å bruke trådoverlappings PCR mutagensemetoden diskutert ovenfor ble kodonet endret til å kode for Asp i denne posisjonen. Det resulterende HSA kodende DNA ble klonet inn i Nhel og Hindlll setene til pJB02 for å danne pJB02-HSA (figur 6).
IgKledersekvensen fusjonert til Val<8->GLP-l(7-37) sekvensen ble generert som diskutert i eksempel la. Dette DNA ble ligert inn i Nhel og Fspl setene til pJB02-HSA for å danne pJB02 - Val<8->GLP-1-HSA.
Eksempel lc. Konstruksjon av DNA kodende Val<8->GLP-l(7-37)-linker HSA: Vektoren pJB02-HSA ble fremstilt som diskutert i eksempel lb. DNA kodende linkersekvensen [GGGGS]3ble ligert i leseramme til 5' enden til det HSA kodende DNA for å danne pJB02-linker HSA (figur 7). DNA kodende IgKledersekvensen og fusjonert til Val<8->GLP-l(7-37) sekvensen og 5' delen av linkersekvensen ble generert som diskutert i eksempel la. Dette DNA ble ligert inn i Nhel og BspEI setene til pJB02 for å danne pJB02-Val<8->GLP-l-linker-HSA.
Eksempel ld. Konstruksjon av DNA kodende Exendin-4-Fc:
Plasmidet pJB02/Fc ble fremstilt som beskrevet la. DNA kodende IgKsignalsekvensen fusjonert til Exendin-4 ble lagt ved in vitro hybridisering til de følgende overlappende og komplementære oligonukleotidene:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel la. Hybridiseringsproduktet ble ligert til pJB02 vektoren som hadde blitt bespist med Nhel og Eco47III som beskrevet i eksempel la for å danne pJB02-Exendin-4-Fc.
Eksempel le. Konstruksjon av DNA kodende Exendin-4-HSA:
Plasmidet pJB02-HSA ble fremstilt som beskrevet i eksempel lb. DNA kodende IgKsignalsekvensen fusjonert til Exedin-4 ble dannet ved in vitro hybridisering av de samme overlappende og komplementære oligonukleotidene beskrevet i eksempel ld. Hybridiseringsreaksjonene ble også utført som beskrevet ovenfor. DNA ble klonet inn i unike Nhel og Fspl seter i pJB02-HSA for å danne pJB02-Exendin-4-HSA.
Eksempel lf. Konstruksjon av DNA kodende Exendin-4-linker-HSA:
Plasmidet pJB02-linker-HSA ble konstruert som beskrevet i eksempel lc. DNA kodende IgKsignalsekvensen fusjonert til Exendin-4 og 5' delen av linkersekvensen ble laget som i eksempel ld. Dette DNA ble klonet inn i unike Nhel og BspEI seter i pJB02-linker-HSA for å danne pJB02-Exendin-4-linker-HSA.
Eksempel lg. Konstruksjon av DNA kodende Val-GLP-l-Ex-Fc:
Plasmidet pJB02-Exedin-4-Fc ble fremstilt som beskrevet i eksempel ld. Exendin-4 kodende DNA ble kuttet fra vektoren med Agel og Eco47III. Val<8->GLP-1/C-Ex kodende DNA ble dannet ved in vitro hybridisering av de følgende overlappende og komplementære oligonukleotidene:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel la. Det hybridiserte produktet ble ligert i stedet for Exendin-4 i pJB02-Exendin-4-Fc ekspresjonsvektoren for å danne pJB02-Val<8->GLP-l/C-ex-Fc.
Eksempel lh. Konstruksjon av DNA kodende Val<8->Glu<22->GLP-1-Fc:
Plasmidet pJB02-Exendin-4-Fc ble fremstilt som beskrevet i eksempel ld. Exendin-4 kodende DNA ble kuttet ut fra vektoren med Agel og Eco47III. Val<8->Glu<22->GLP-1 kodende DNA ble lagt ved in vitro hybridisering av de følgende overlappende og komplementære oligonukleotidene:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel la. Hybridiseringsproduktet ble ligert i sstedet for Exendin-4 i pJB02-Exendin-4-Fc ekspresjonsvektoren for å danne pJB02-Val<8->Glu<22->GLP-l-Fc.
Eksempel li. Konstruksjon av DNA kodende Val<8->Glu<22->GLP-1/C-Ex-Fc
Plasmidet pJB02-Exendin-4-Fc ble fremstilt som beskrevet i eksempel ld. Exendin-4 kodende DNA ble kuttet ut fra vektoren med Agel og Eco47III. Val<8->Glu<22>GLP-l/C-Ex kodende DNA ble lagt ved in vitro hybridisering av de følgende overlappende og komplementære oligonukleotidene:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel la. Hybridiseringsproduktet ble ligert i stendetfor Exendin-4 i pJB02-Exendin-4-Fc ekspresjonsvektoren for å danne pJB02-Val<8->Glu<22->GLP-l/C-Ex-Fc.
Eksempel lj. Konstruksjon av DNA kodende Gly -GLP-l-Fc:
Plasmidet pJB02-Exendin-4-Fc ble fremstilt som beskrevet i eksempel ld. Exendin-4 kodende DNA ble kuttet ut fra vektoren med Agel og Eco47III. Gly<8->GLP-1 kodende DNA ble generert ved in vitro hybridisering av de følgende overlappende og komplementære oligonukleotidene:
Hybridiseringsreaksjonen ble utført som beskrevet i eksempel la. Det hybridiserte produktet ble ligert i stedet for Exendin-4 i pJB02-Exendin-4-Fc ekspresjonsvektoren for å danne pJB02-Gly<8->GLP-l-Fc.
Eksempel 2: Ekspresjon av heterologe fusjonsproteiner
Ekspresjon av fusjonsproteinene kodet av DNA konstruktene fra eksempel 1 ble utført ved transient transfeksjon av HEK 293EBNA celler (både cellelag og suspensjon). Celle ble telt og utsådd 24 timer før transfeksjonen. Transfeksjonscocktailen ble fremstilt ved å blånede FuGene™ transfeksjonsreagens (Roche Molecular Biochemicals, catalog # 1814443) med OptiMEM (Gibco/BRL) og inkubert ved romtemperatur i 5 minutter hvorved DNA ble lagt til og cocktailen ble inkubert i ennå 15 minutter. Rett før transfeksjon ble ferkst vekstmedium lagt til platen. Tabellene 1 og 2 viser videre transfeksj onsdetalj er.
Ved små skalatransfeksjoner (25 mm - 10 mm beholdere) ble cellene renset med PBS og satt om til høstningsmedium 24 timer etter transfeksjon og medium ble samlet og erstattet hver 24 time i flere dager. Ved stor skalatransfeksjoner(700 cm<2>rulleflasker) ble rulleflaskene renset med PBS 48 timer etter transfeksjon og satt om til høstnings-medium. Medium ble samlet og skiftet hver 24 time i minst 10 påfølgende dager. Rutinemessig ble bare 10 høstninger anvendt i den påfølgende proteinrensingen.
Eksempel 3: Rensing av heterologe fusjonsproteiner
Eksempel 3 a: rensing av Val<8->GLP-1-Fc
Omtrent 4,5 liter av kondisjonert medium (fusjonsprotein ekspresjonsnivå omtrent 20 (j.g/ml) fra storskalatransfeksjoner ble filtrert ved å bruke et CUNO filtersystem og konsentrert til 250 ml ved å bruke et ProFlux tangential flow filtreringssystem med en 10 K filtermembran. Val<8->GLP-1-Fc ble fanget med en 5 ml HiTrap Protein A kolonne i 1 x PBS, pH 7,4 ved en flowrate på 2 ml/min og eluert med 50 mM sitronsyre pH 3,3. Fraksjonene (1 ml) ble samlet i reagensrør inneholdende 4 ml 1 x PBS og 100 ul 1 M Tris pH 8.
Fraksjonene inneholdende fusjonsproteinet, som bestmt ved SDS-PAGE og reversfase HPLC på Zorbax C8 ble samlet og tilsatt en Superdex 75 60/60 kolonne i 1 x PBS pH 7,4 ved en flowrate på 10 ml/min. Positive fraksjoner (20 ml/reagensrør) ble samlet og slått sammen. Sammenslåtte fraksjoner ble så underlagt C4 reversfasekromatografi i 0,1 % TF A vann ved en flowrate på 3 ml/min. Val<8->GLP-1-Fc ble eluert ved å bruke en gradient fra 5 % B (0,1 % TF A i acetonitril) til 100 % B i 70 minutter. Eluerings- fraksjoner (3 ml/reagensrør) ble samlet. Acetonitril ble fjernet ved vakuumtørking og 1 ml H2O ble tilsatt. Den rensede prøven (omtrent 32 ml) ble dialysert to ganger mot 4 liter med 1 x PBS pH 7,4.
Den dialyserte prøven ble så filtrert ved å bruke en MILLEX-GV 0,22 um Filter enhet og konsentrasjon ble bestemt ved absorpsjon ved 280 nm.
Eksempel 3b. Rensing av Val<8->GLP-1-HSA eller Val<8->GLP-1-Linker-HSA
Omtrent 6,5 liter av kondisjonert medium (fusjonsproteinekspresjonsnivå omtrent 10 ug/ml) ble filtrert ved å bruke et CUNO flltersystem og konsentrert til 380 ml ved å bruke et ProFlux tangential flow filtreringssystem med en 10 K filtermembran.
Fusjonsproteinet ble fanget ved å bruke en 50 ml Fast Flow Q kolonne (Pharmacia) i 2 mM Tris pH 7,5 med en flow rate på 5 ml/min. Proteinen ble eluert ved å bruke en gradient: fra 0 % til 50 % 20 mM Tris pH 7,4,1 M NaCl i 10 CV, så til 100 % B i 2 CV.
Fraksjonene inneholdende fusjonsproteinet ble slått sammen og underlagt C4 reversfasekromatografi i 0,1 % TF A vann ved en flow rate på 5 ml/min. Fusjonsproteinet ble eluert ved å bruke en gradient fra 20 % B (0,1 % TF A i acetonitril) til 90 % B i 120 min. Fraksjonene (3,5 ml/tube) ble samlet. Acetonitril ble fjernet ved vakuum-tørking.
Omtrent 9 ml sammenslått prøve ble fortynnet med l x PBS pH 7,4 til 40 ml og dialysert mot 4 liter 1 x PBS pH 7,4 over natt. Prøven ble filtrert og konsentrasjonen ble bestemt ved absorpsjon ved 280 nm.
Eksempel 3c. Rensing av Exendin-4-Fc:
Omtrent 4 liter med kondisjonert medium (fusjonsproteinekspresjonsnivå omtrent 8 ug/ml) ble filtrert med et CUNO flltersystem og konsentrert til 250 ml med et ProFlux tangential flow filtreringssystem med en 30 K filtermembran.
Exendin-4-Fc ble fanget med en 5 ml HiTrap protein A kolonne i 1 x PBS, pH 7,4 ved en flowrate på 2 ml/min og eluert med 50 mM sitronsyre pH 3,3. Fraksjoner inneholdende fusjonsproteinet ble sammenslått, filtrert og dialysert mot 4 liter 1 x PBS over natt. Den dialyserte prøven ble så tilsatt en Superdex 75 /60/60 kolonne i 1 x PBS pH 7,4, 0,5 M NaCl ved en flow rate på 10 ml/min. Fraksjonene (20 ml/reagensglass) inneholdende fusjonsproteinet ble samlet, sammenslått og konsentrert til omkring 1 mg/ml. Konsentrerte prøver ble så filtrert med en MILLEX-GV 0,22 um Filter enhet.
Eksempel 3d. Rensing av Exendin-4-HSA og Exendin-4-linker-HSA:
Omtrent 1,1 liter med kondisjonert medium (fusjonsproteinekspresjonsnivå omtrent 6 (xg/ml) ble filtrert med et CUNO flltersystem og konsentrert til 175 ml med et ProFlux tangential flow filtreringssystem med en 30 K filtermembran.
Fusjonsproteinet ble fanget i en 5 ml HiTrap Q-sepharosekolonne (Pharmacia) ved en flowrate på 2 ml/min. Protein ble eluert med en gradient fra 0 % til 50 % 20 mM Tris Ph 7,4,1 M NaCl i 12 CV og så til 100 % B i 4 CV.
Fraksjoner inneholdende fusjonsproteinet ble slått sammen og underlagt C4 reversfasekromatografi i 0,1 % TF A vann ved en flow rate på 5 ml/min. Fusjonsproteinet ble eluert med en gradient fra 10 % B (0,1 % TF A i acetonitril) til 100 % B i 70 min. Fraksjoner (10 ml/reagensglass) inneholdende fusjonsproteinet ble samlet. Acetonitril ble fjernet ved hjelp av en vakuumtørker.
Omkring 8 ml sammenslått prøve ble dialysert mot 4 liter 1 x BPS pH 7,4 over natt. Prøven ble filtrert og konsentrasjonen ble bestemt ved absorpsjon ved 280 nm. Den dialyserte prøven ble så satt til en Superdex 200 26/60 kolonne i 1 x PBS pH 7,4, 0,5 M NaCl ved en flow rate på 2 ml/min. Fraksjoner (3 ml/reagensglass) inneholdende fusjonsproteinet ble samlet, sammenslått, konsentrert og filtrert.
Eksempel 4: Karakterisering av fusjonsproteinene ved SDS PA GE:
SDS-PAGE fulgt av immunoblotting ble anvendt til å analysere både renset fusjonsprotein så vel som kondisjonert medium fra celler transfektert med forskjellige fusjons-proteinekspresjonvektorer. SDS-PAGE ble utført på et Novex Powerease 500 system med Novex 10 % Tris-Glycine Precast gels (EC6498), running buffer (10 x, LC2675) og prøvebuffer (L2676). Prøvene ble redusert med 50 mM DTT og varmet 3-5 min ved 95 °C før loading.
Etter kjøring av SDS-PAGE gel vann og transferbuffer (IX Tris-Glycine Seprabuff (Owl Scientific Cat. No ER26-S) med 20 % metanol) ble brukt for å rense SDS fra gelen. Et Novex transferapparat ble brukt med PVDF (BioRad, Cat. No. 162-0174) og
nitrocellulosemembraner (BioRad, Cat. No. 1703965 eller 1703932). Transfer ble utført ved romtemperatur i 90 minutter ved 30-30 V. Membranene ble blokket i IX PBS med 0,1 % Tween-20 (Sigma, Cat. No. P-7949) og 5 % melk (BioRad, Cat. No. 170-6404) i 1-12 timer ved 4°C. Antistoffer ble fortynnet i IX PBS +5 % melk og blottene ble inkubert i disse løsningene i 1 til 2 timer ved 4°C. Mellom inkubasjonene ble blottene vasket fire ganger i 5 min med 1 X PBS og 0,2 % Tween-20 ved romtemperatur. PBS ble lagd fra enten GIBCO 10X PBS (Cat No. 70111) for å gi en endelig konsentrasjon på 1 mM monobasik natriumfosfat, 3 mM dibasisk natriumfosfat, 153 mM natriumklorid, pH 7,4 elle PBS poser fra Sigma (Cat No. 1000-3) for å gi 120 mM NaCl, 2,7 mM KC1 og 10 mM fosfat, pH 7,4 ved 25°C.
De primære antistoffene var enten et polyklonalt geit anti IgGl eller kanin anti-HSA. Det sekundære antistoffet var enten et anti-geit IgG HRP eller et anti-kanin IgG HRP. Det sekundære antistoffet ble fortynnet 1:5000. Et ECL system (Amersham Pharmacia Biotech, Cat. No. RN2108 og Cat. No. RPN1674H) ble anvendt for å fremkalle blottene.
Figur 3A sammenligner renset Fc protein mot kondisjonert media fra pJB02-Val o-GLP-l-Fc og pJB02-Exendin-4-Fc transfekterte celler. Reduksjonen i mobilitet er konsistent med den økte størrelsen på grunn av GLP-1 delen av fusjonsproteinet. Figur 3B sammenligner på samme måte renset HSA med kondisjonert medium fra celler transfektert med pJB02-Val<8->GLP-l-HSA, pJB02-Val<8->GLP-l-Linker-HSA, pJB02-Exendin-4-HSA eller pJB02-Exendin-4-Linker-HSA. Figur 4 identifiserer rensede tusj onsproteintilberedninger.
Eksempel 5: Karakterisering av fusjonsproteiner med massespektroskopi:
Alle eksperimenter ble utført på et Micromass TofSpec-2E massespektrometer utstyrt med Time Lag fokuserende elektronikk, en reflektron (anvendt i analyse av 0-8000 Da peptidområdet), en linjær detektor (brukt under høymasse/godt signal analyse) og en post akselerasjonsdetektor (eller P.A.D., brukt i høymasse/ekstremt lav signal analyse). Den effektive sporlengden til instrumentet i lineær modus er 1,2 meter, i reflektron-modus 2,3 meter. To doble mikrokanalplatedetektorer er satt inn for linjær og reflektronmodusdeteksjon. Laseren anvendt er en Laser Science Inc. VSL-337i nitrogenlaser som opererer ved 337 nm ved 5 laserskudd per sekund. Alle data ble oppnådd ved å bruke en 2 GHz, 8 bit intern digitaliserer og opp til 50 laserskudd var gjenomsnittet per spektrum.
Instrumentet ble kjørt i lineært modus for analysen av GLP-1 fusjonsproteinene til undersøkelse. Den lineære detektoren er en innretning som detekterer ioner som reiser ned flight røret til MALDI-ToF-MS instrumentet. Det måler ionetallrikheten over tid og sender et signal til digitalisereren for konvertering. Digitalisereren er en analog til digital konverter som tillater signalet fra massespektrometeret å bli overført til computeren, hvor det ble rekonstruert inn i et anvendbart m/z spektrum.
En rekrystallisert mettet sinapinsyreløsning (fortynnet i 50/50 Acn/F^O og 0,1 % TF A) ble utnyttet som ioniseringsmatrisk. Sinapinsyre er et egnet matrisk for proteiner over 10 kDa. Masseegnede referanseproteiner ble anvendt i interne og eksterne kalibrerings-filter for å oppnå nøyaktig massebestemmelser for analysen av prøvene. Prøvene ble alle analysert ved en 1:2 prøve til matriksfortynning. Instrumentet ble i utgangspunktet satt opp med de følgende lineære detektorbetingelsene: Kildespenning: 20,0 keV
Ekspresjonsspenning: 20 keV
Fokusspenning: 16,0 keV
Lineær detektor: 3,7 keV
P.A.D.: (offline)
Pulsspenning: 3,0 keV Laser Coarse: 50 Laser Fine: 50
Disse innstillingene ble modifisert (ved behov) for å gi det beste signal/støy forholdet og den høyeste oppløsningen. Tabell 3 viser karakterisering av forskjellige GLP-1 fusjonsproteiner.
CEx viser til en C-terminal forlengelse og omfatter sekvensen til Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser.
Eksempel 6: Aktivitet av heterologe fusjonsproteiner:
Evnen til fusjonsproteinene i den foreliggende oppfinnelsen til å aktivere GLP-1 reseptoren ble bedømt ved in vitro assays slik som de beskrevet i EP 619.322 til
Gelfand et al, og US patent nr 5.120.712. Aktiviteten av disse forbindelsene i forhold til aktiviteten til Val<8->GLP-l(7-37)OH rapporteres i tabell 4. Figur 8 representerer in vitro doseresponskurver for Val<8->GLP-1 og Exendin-4 fusjonsproteiner. I tillegg viser tabell 5a og 5b in vitro aktiviteten til en stor gruppe av GLP-1 analoger som kan fusjoneres med et Fc eller albuminprotein for å lage biologisk aktive fusjonsproteiner. Disse aktivitetene er sammenlignet med GLP-1 (7-3 7)OH.
CEx viser til en C-terminal forlengelse omfatter sekvensen Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser.
Aminosyresekvensene til fusjonsproteinene beskrevet i tabellene 3 og 4 er representert i SEQ ID NO: 13 til SEQ ID NO: 31.
Val Q-GLP-1-humanserumalbuminaminsyresekvensen er representert ved SEQ ID NO: 13.
Eksempel 7: In vivo farmakokinetikk til Val<8->GLP-l-IgGl og Val<8->GLP-1-HSA: En farmakokinetisk studie av Val<8->GLP-l-IgGl og Val<8->GLP-1-HSA ble utført på cynomologus aper. Aper ble dosert ved 5,6 nmol/kg med enten renset Val -GLP-1-IgGl eller Val<8->GLP-1-HSA. Forbindelsene ble administrert som en intravenøs bolus administrering. Blod ble samlet før dosen og ved 0,083, 0,25, 0,5,1,4, 8,12,24,48, 72,96,120,144,168 og 216 timer etter dosen i reagensglass inneholdende EDTA. Plasmakonsentrasjonene av immunoreaktivt Val<8->GLP-1 ble bestemt ved å bruke et radioimmunoassay som utnyttet et polyklonalt antiserum hvis primære spesifitet er for den N-terminale (7-16) regionen til Val<8->GLP-1(7-37). Figur 9 viser plasma-konsentrasjonen til Val<8->GLP-1-Fc og Val<8->GLP-1-Linker-HSA etter en enkel intra-venøs dose til to cynomologus aper. Fc fusjonsproteinet hadde en halveringstid på omtrent 45 timer og albuminfusjonsproteinet hadd en halveringstid på omtrent 87 timer.
Eksempel 8: ln vivo farmakodynamikk til Exendin-4-IgGl:
To kronisk kanylerte normale hann beagle hunder ble studert etter fasting over natt. Arterielle og venøse vaskulære adkomståpninger ble aksessert og et kateter ble innsatt perkutant inn i en cefalisk åre og sikret. Dyrene ble plassert i bur og deres kateter ble festet til et tether system. En løsning inneholdende fusjonsproteinet Exendin-4-IgG 1 (11,8 uM) ble injisert intravenøst (1,0 nmol/kg) gjennom det cefaliske årekateteret. Kateteret ble så vasket med 10 ml saltløsning. To timer senere ble en hyperglykemisk (150 mg/dl) "clamp" initiert og videreført i 3 timer. Arterielle blodprøver ble tatt i den 5 timers perioden for bestemmelse av plasmakonsentrasjoner av fusjonsproteinet, glykose og insulin.
Resultatet av denne studien ble sammenlignet med de fra en lignende tidligere studie hvor begge dyrene hadde mottatt en bolus av saltløsning og 3 timer senere studert ved å bruke en 3 timers hyperglykemisk (150 mg/dl) "clamp".
I begge studiene ble plasmaglukosekonsentrasjonene bestemt med en Beckman glukose-analysemaskin. Plasmainsulinkonsentrasjoner ble bestemt av ansatte hos Linco Research Inc. med et RIA kit utviklet i deres laboratorier. Data er illustrert i figurene 10 og 11.
Eksempel 9: In vivo farmakokinetikk til Gly<8->Glu<22->GLP-l-CEx-Linker-IgGl
To grupper av tre normale hann beagle hunder mottok 0,1 mg/kg med Gly<8->Glu<22->GLP-1-CEx-Linker-IgGl ved subkutan (SC) eller intravenøs (IV) administrering. Plasmakonsentrasjonene av Gly<8->Glu<22->GLP-l-CEx-Linker-IgGlimmunoreaktivitet ble bestemt ved radioimmunoassay i prøver tatt fra 30 minutter før dosen til 216 timer etter dosen for både IV og SC gruppene. Disse konsentrasjonene ble senere anvendt til å bestemme rapporerte farmakokinetikkparametere. Gjennomsnittlig ehminerings-halveringstid til IV administrert Gly<8->Glu<22->GLP-l-CEx-Linker-IgGl var omkring 55 timer og den totale kroppsnedbrytning var 1,5 ml/time/kg. Gjennomsnittlig elimineringshalveringstid til SC administrert Gly<8->Glu<22->GLP-l-CEx-Linker-IgGl var omkring 38 timer.

Claims (11)

1. Heterologt fusjonsprotein,karakterisert vedat det omfatter et første polypeptid med en N-terminus og en C-terminus fusjonert til et andre polypeptid med en N-terminus og en C-terminus hvor det første polypeptidet er en GLP-1 forbindelse og det andre polypeptidet velges fra gruppen bestående av a) Fc delen av et immunoglobulin, b) en analog av Fc delen av et immunoglobulin; og c) fragmenter av Fc delen av et immunoglobulin, og hvor C-terminus til det første polypeptidet er fusjonert med N-terminus til det andre polypeptidet.
2. Heterologt fusjonsprotein ifølge krav 1,karakterisertv e d at det omfatter et første polypeptid med en N-terminus og en C-terminus fusjonert til et andre polypeptid med en N-terminus og en C-terminus hvor det første polypeptidet er en GLP-1 forbindelse og det andre polypeptidet velges fra gruppen bestående av a) Fc delen av et immunoglobulin; b) en analog av Fc delen til et immunoglobulin; og c) fragmenter av Fc delen av et immunoglobulin, og hvor C-terminus til det første polypeptidet er fusjonert til N-terminus til det andre polypeptidet via en peptidlinker.
3. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 2,karakterisertv e d at peptidlinkeren velges fra gruppen bestående av: a) et glysinrikt peptid; b) et peptid med sekvensen [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]nhvor n er 1,2, 3,4,5 eller 6; og c) et peptid med sekvensen [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]3.
4. Heterologt fusjonsprotein i henhold til et hvilket som helst av kravene 1,2 eller 3,karakterisert vedat GLP-1 forbindelsen omfatter sekvensen ifølge formel I (SEQ ID NO: 2)
hvor: Xaa ved posisjon 8 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 9 er Glo, Asp, eller Lys; Xaa ved position 11 er Thr, Ala, Gly, Ser, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 14 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved position 16 er Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Tyr, Glu, Asp, Trp, eller Lys; Xaa ved posisjon 17 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved position 18 er Ser, Ala, Gly, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, Trp, Tyr, eller Lys; Xaa ved posisjon 19 er Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp, Gin, eller Lys; Xaa ved posisjon 20 er Leu, Ala, Gly, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, Met, Trp, Tyr, eller Lys; Xaa ved posisjon 21 er Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 22 er Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 23 er Gin, Asn, Arg, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 24 er Ala, Gly, Ser, The, Leu, Ile, Val, Arg, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 25 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 26 er Lys, Arg, Gin, Glu, Asp, eller His; Xaa ved posisjon 27 er Leu, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 30 er Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 31 er Trp, Phe, Tyr, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 32 er Leu, Gly, Ala, Ser, Thr, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 33 er Val, Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 34 er Asn, Lys, Arg, Glu, Asp, eller His; Xaa ved posisjon 35 er Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys; Xaa ved posisjon 36 er Gly, Arg, Lys, Glu, Asp, eller His; Xaa ved posisjon 37 er Pro, Gly, Ala, Ser, Thr, Lee, Ile, Val, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert; Xaa ved posisjon 38 er Ser, Arg, Lys, Gla, Asp, eller His, eller er deletert; Xaa ved posisjon 39 er Ser, Arg, Lys, Glu, Asp, eller His, eller er deletert; Xaa ved posisjon 40 er Gly, Asp, Glu, eller Lys, eller er deletert; Xaa ved posisjon 41 er Ala, Phe, Trp, Tyr, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert; Xaa ved posisjon 42 er Ser, Pro, Lys, Gla, or Asp, eller er deletert; Xaa ved posisjon 43 er Ser, Pro, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert; Xaa ved posisjon 44 er Gly, Pro, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert; og Xaa ved posisjon 45 er Ala, Ser, Val, Glu, Asp, eller Lys, eller er deletert; gitt at når aminosyren i posisjon 37, 38, 39, 40,41,42,43 eller 44 er deletert, så er hver aminosyre nedstrøms av den aminosyren også deletert.
5. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 4,karakterisertved at GLP-1 forbindelsen ikke harmer enn 6 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-1 (7-36)OH eller Exendin-4.
6. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 5,karakterisertv e d at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 5 aminosyrer som skiller fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-l(7-36)OH eller Exendin-4.
7. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 6,karakterisertved at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 4 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-3 7)OH, GLP-1 (7-3 6)OH eller Exendin-4.
8. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 7,karakterisertv e d at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 3 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-1 (7-36)OH eller Exendin-4.
9. Heterologt fusjonsprotein i henhold til krav 8,karakterisertv e d at GLP-1 forbindelsen ikke har mer enn 2 aminosyrer som skiller seg fra den tilsvarende aminosyren i GLP-1 (7-37)OH, GLP-1 (7-36)OH eller Exendin-4.
10. Anvendelse av heterologt fusjonsprotein i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av et medikament for behandling av pasienter med ikke-insulin avhengig diabetes mellitus.
11. Anvendelse av heterologt fusjonsprotein i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for fremstilling av et medikament for behandling av pasienter med fedme.
NO20032565A 2000-12-07 2003-06-05 GLP-1 fusjonsproteiner samt anvendelser derav. NO331273B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25195400P 2000-12-07 2000-12-07
PCT/US2001/043165 WO2002046227A2 (en) 2000-12-07 2001-11-29 Glp-1 fusion proteins

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO20032565D0 NO20032565D0 (no) 2003-06-05
NO20032565L NO20032565L (no) 2003-08-01
NO331273B1 true NO331273B1 (no) 2011-11-14

Family

ID=22954069

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20032565A NO331273B1 (no) 2000-12-07 2003-06-05 GLP-1 fusjonsproteiner samt anvendelser derav.
NO20101602A NO20101602L (no) 2000-12-07 2010-11-15 GLP-1 fusjonsproteiner
NO20111369A NO332221B1 (no) 2000-12-07 2011-10-10 GLP-1 fusjonsproteiner og anvendelse av disse for fremstilling av medikamenter

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20101602A NO20101602L (no) 2000-12-07 2010-11-15 GLP-1 fusjonsproteiner
NO20111369A NO332221B1 (no) 2000-12-07 2011-10-10 GLP-1 fusjonsproteiner og anvendelse av disse for fremstilling av medikamenter

Country Status (30)

Country Link
US (1) US7271149B2 (no)
EP (2) EP1355942B1 (no)
JP (2) JP2004528014A (no)
KR (2) KR20080085082A (no)
CN (2) CN101712722A (no)
AT (2) ATE437891T1 (no)
AU (2) AU2002226897B2 (no)
BR (1) BR0116024A (no)
CA (2) CA2716959A1 (no)
CY (2) CY1108485T1 (no)
CZ (2) CZ308214B6 (no)
DE (2) DE60139430D1 (no)
DK (2) DK1724284T3 (no)
EA (1) EA005584B1 (no)
EC (1) ECSP064643A (no)
ES (2) ES2311560T3 (no)
HK (1) HK1061411A1 (no)
HR (1) HRP20030455A2 (no)
HU (2) HU230603B1 (no)
IL (3) IL155812A0 (no)
MX (1) MXPA03005036A (no)
NO (3) NO331273B1 (no)
NZ (1) NZ525577A (no)
PL (2) PL393178A1 (no)
PT (2) PT1355942E (no)
SI (2) SI1355942T1 (no)
SK (2) SK288342B6 (no)
UA (2) UA81897C2 (no)
WO (1) WO2002046227A2 (no)
ZA (1) ZA200303642B (no)

Families Citing this family (321)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444788B1 (en) 1999-03-15 2002-09-03 Novo Nordisk A/S Ion exchange chromatography of GLP-1, analogs and derivatives thereof
US6924264B1 (en) * 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001266557A1 (en) * 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ATE424413T1 (de) * 2000-06-16 2009-03-15 Lilly Co Eli Analoge des glucagon-ähnlichen peptids-1
JP4280803B2 (ja) 2000-12-08 2009-06-17 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 慢性リンパ性白血病細胞株および抗体を産生するためのその使用
US20060057651A1 (en) 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US7408041B2 (en) 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
AU2002228608A1 (en) * 2000-12-13 2002-06-24 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
DE60228972D1 (de) * 2001-07-31 2008-10-30 Us Gov Health & Human Serv Glp 1 exendin 4 peptidanaloga und deren verwendungen
EP1432730A4 (en) * 2001-08-23 2006-10-11 Lilly Co Eli GLP-1 ANALOGUES (GLUCAGON-LIKE PEPTIDE 1)
US7176278B2 (en) * 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
US8129504B2 (en) 2001-08-30 2012-03-06 Biorexis Technology, Inc. Oral delivery of modified transferrin fusion proteins
IL160917A0 (en) * 2001-10-18 2004-08-31 Bristol Myers Squibb Co Human glucagon-like-peptide-1 mimics and their use in the treatment of diabetes and related conditions
WO2003059934A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) * 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
WO2003058203A2 (en) * 2002-01-08 2003-07-17 Eli Lilly And Company Extended glucagon-like peptide-1 analogs
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
EP1532261B1 (en) * 2002-05-24 2010-02-10 Medtronic, Inc. Methods and dna constructs for high yield production of polypeptides
WO2004002417A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Centocor, Inc. Mammalian ch1 deleted mimetibodies, compositions, methods and uses
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CN102268094A (zh) * 2002-08-30 2011-12-07 比奥雷克西斯药物公司 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
EP1569682A2 (en) * 2002-12-03 2005-09-07 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
EP1688148A1 (en) * 2002-12-03 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Combination treatment using exendin-4 and thiazolidinediones
US7655618B2 (en) 2002-12-27 2010-02-02 Diobex, Inc. Compositions and methods for the prevention and control of insulin-induced hypoglycemia
KR20050086948A (ko) 2002-12-27 2005-08-30 디오벡스, 인코포레이티드 인슐린으로 인한 저혈당증을 예방하고 조절하기 위한조성물 및 방법
AU2003292685A1 (en) * 2003-01-10 2004-08-10 Niigata Tlo Corporation Vector for gene therapy and method of quantifying target protein in mammal or cultured cells with the administration of the vector for gene theraphy
WO2004069862A1 (ja) * 2003-02-06 2004-08-19 Keio University ペプチド結合体
PT1605897E (pt) * 2003-03-19 2012-09-10 Lilly Co Eli Compostos de glp-1 ligado a polietilenoglicol
BRPI0408978B8 (pt) 2003-04-08 2021-07-27 Novo Nordisk As processos para regenerar uma fase estacionária cromatográfica
WO2004089985A1 (en) * 2003-04-11 2004-10-21 Novo Nordisk A/S Stable pharmaceutical compositions
WO2004103390A2 (en) 2003-05-15 2004-12-02 Trustees Of Tufts College Stable analogs of peptide and polypeptide therapeutics
KR100758755B1 (ko) 2003-06-12 2007-09-14 일라이 릴리 앤드 캄파니 Ｇｌｐ-1 유사체 융합 단백질
DE602004011770T2 (de) * 2003-06-12 2009-02-05 Eli Lilly And Co., Indianapolis Fusionsproteine
TW200526254A (en) * 2003-09-19 2005-08-16 Novo Nordisk As Novel GLP-1 derivatives
WO2005028516A2 (en) 2003-09-19 2005-03-31 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
JP4870569B2 (ja) 2003-11-13 2012-02-08 ハンミ ホールディングス カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片を用いた蛋白質結合体およびその製造方法
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US20090238838A1 (en) * 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
US8263084B2 (en) * 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
CA2545034C (en) 2003-11-20 2013-03-05 Novo Nordisk A/S Propylene glycol-containing peptide formulations which are optimal for production and for use in injection devices
JP4865565B2 (ja) 2003-12-09 2012-02-01 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アゴニストを用いた食物選択の制御
CN101665538A (zh) * 2003-12-18 2010-03-10 诺沃挪第克公司 与白蛋白样物质相连的新glp-1类似物
US20060252693A1 (en) * 2004-01-29 2006-11-09 Wolfgang Glaesner Glucagon-like peptide-1 analogs
CN1980687B (zh) * 2004-02-09 2015-05-13 人类基因科学公司 清蛋白融合蛋白
HUE027902T2 (en) * 2004-02-09 2016-11-28 Human Genome Sciences Inc Corp Service Company Albumin fusion proteins
US8076288B2 (en) 2004-02-11 2011-12-13 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides having glucose lowering activity
BRPI0507594A (pt) * 2004-02-11 2007-07-03 Amylin Pharmaceuticals Inc polipetìdeos hìbridos com propriedades selecionáveis
EP1789440A4 (en) 2004-02-11 2008-03-12 Amylin Pharmaceuticals Inc REASONS FOR THE FAMILY OF PANCREATIC POLYPEPTIDES AND POLYPEPTIDES CONTAINING THEM
AU2005231359A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Centocor, Inc. Human GLP-1 mimetibodies, compositions, methods and uses
HUE039448T2 (hu) 2004-04-21 2018-12-28 Alexion Pharma Inc Csontba szállító konjugátumok és alkalmazási módszerük a fehérjék csontba juttatására
SI1751184T1 (sl) 2004-05-13 2010-01-29 Lilly Co Eli Fgf-21 fuzijski proteini
EP2316446A1 (en) 2004-06-11 2011-05-04 Novo Nordisk A/S Counteracting drug-induced obesity using GLP-1 agonists
JP2008515856A (ja) 2004-10-07 2008-05-15 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 遅延性ｇｌｐ−１化合物
EP1799711B1 (en) 2004-10-07 2012-06-20 Novo Nordisk A/S Protracted exendin-4 compounds
KR20070094909A (ko) * 2004-12-02 2007-09-27 도만티스 리미티드 혈청 알부민 및 ｇｌｐ-1 또는 ｐｙｙ를 표적으로 삼는이중특이성 도메인을 갖는 항체
WO2006068910A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Eli Lilly And Company Glp-1 analog fusion protein formulations
JP2008525477A (ja) * 2004-12-22 2008-07-17 セントカー・インコーポレーテツド Ｇｌｐ−１アゴニスト、組成物、方法および使用
WO2007022123A2 (en) * 2005-08-11 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
US20090016959A1 (en) * 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
TWI372629B (en) 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
CN101128214A (zh) * 2005-03-18 2008-02-20 诺和诺德公司 长效glp-1化合物
MX2007011975A (es) * 2005-03-28 2008-03-14 Johnson & Johnson Mimeticuerpos de peptido similar a glucagon-1 humanos, composiciones, metodos y usos.
LT2650020T (lt) * 2005-05-06 2016-12-12 Providence Health & Services - Oregon Trimerinio ox40-immunoglobulino sulietas baltymas ir naudojimo būdai
US8183340B2 (en) * 2005-05-13 2012-05-22 Eli Lilly And Company GLP-1 pegylated compounds
WO2007012188A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Qinghua Wang GLP/1/EXENDM 4 IgG Fc FUSION CONSTRUCTS FOR TREATMENT OF DIABETES
CA2616551A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-15 Amprotein Corporation Chimeric therapeutic agents
WO2007016764A1 (en) * 2005-08-06 2007-02-15 Qinghua Wang Composition and method for prevention and treatment of type i diabetes
JP2009504681A (ja) * 2005-08-11 2009-02-05 アミリン・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 選択可能な特性を有するハイブリッドポリペプチド
ES2336575T3 (es) * 2005-09-22 2010-04-14 Biocompatibles Uk Limited Polipeptidos de fusion glp-1 (peptido-1 similar al glucagon) con resistencia aumentada a la peptidasa.
US20090286724A1 (en) * 2005-10-26 2009-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Aggregable glp-1 analogue and sustained-release pharmaceutical composition
HUE029798T2 (en) * 2005-11-04 2017-03-28 Glaxosmithkline Llc Methods of administering hypoglycemic agents
US8039432B2 (en) 2005-11-09 2011-10-18 Conjuchem, Llc Method of treatment of diabetes and/or obesity with reduced nausea side effect
CN1962695B (zh) * 2005-11-09 2011-08-31 浙江德清安平生物制药有限公司 类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途
US20080280328A1 (en) * 2005-11-18 2008-11-13 Novozymes A/S Glucoamylase Variants
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬
US8293869B2 (en) 2005-12-16 2012-10-23 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of GLP-1
US8841255B2 (en) 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
CA2634034A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
DK2463305T3 (en) 2006-01-12 2016-08-29 Alexion Pharma Inc Antibodies to OX-2 / CD200 and uses thereof
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US7553941B2 (en) * 2006-02-03 2009-06-30 Modigene Inc Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8946155B2 (en) 2006-02-03 2015-02-03 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US8759292B2 (en) 2006-02-03 2014-06-24 Prolor Biotech, Llc Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US8476234B2 (en) * 2006-02-03 2013-07-02 Prolor Biotech Inc. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10351615B2 (en) 2006-02-03 2019-07-16 Opko Biologics Ltd. Methods of treatment with long-acting growth hormone
US9458444B2 (en) 2006-02-03 2016-10-04 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
EP1816201A1 (en) * 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
CN101003574B (zh) * 2006-02-21 2010-12-15 大连帝恩生物工程有限公司 长效降血糖肽的重组表达及其在糖尿病治疗药物中的应用
WO2007124461A2 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Amgen Inc. Glp-1 compounds
DE602006009631D1 (de) 2006-05-10 2009-11-19 Biocompatibles Uk Ltd GLP-1 Peptide enthaltende kugelförmige Mikrokapseln, deren Produktion und deren Verwendung
MX2008015107A (es) 2006-05-26 2008-12-09 Amylin Pharmaceuticals Inc Composicion y metodos para el tratamiento de insuficiecia cardiaca congestiva.
EP2474318A1 (en) 2006-06-07 2012-07-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AR061930A1 (es) 2006-07-18 2008-10-01 Centocor Inc Mimeticuerpos de glp-1 humanos, composiciones, metodos y usos
AU2007278994B2 (en) 2006-07-24 2013-08-15 Biorexis Pharmaceutical Corporation Exendin fusion proteins
CL2007002502A1 (es) 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
JP4958975B2 (ja) * 2006-08-31 2012-06-20 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー インスリン様増殖因子ｉの製造方法
US20110039776A1 (en) * 2006-09-06 2011-02-17 Ashutosh Chilkoti Fusion peptide therapeutic compositions
TWI430806B (zh) * 2006-09-13 2014-03-21 Smithkline Beecham Corp 用於投與長效降血糖藥劑之方法
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
AU2011254001B2 (en) * 2007-01-05 2012-08-02 Covx Technologies Ireland Limited Glucagon-like protein-1 receptor (GLP-1R) agonist compounds
US20090098130A1 (en) * 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
EP1972349A1 (en) * 2007-03-21 2008-09-24 Biocompatibles UK Limited GLP-1 fusion peptides conjugated to polymer(s), their production and use
EP1975176A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-01 Biocompatibles UK Limited Novel glp-1 fusion peptides, their production and use
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
AU2008244523B2 (en) 2007-04-23 2012-02-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof
JP2009019027A (ja) * 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
KR20100036362A (ko) 2007-07-25 2010-04-07 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 자가면역 질환 치료 방법 및 조성물
EP3260129A1 (en) 2007-08-03 2017-12-27 Eli Lilly and Company An fgf-21 compound and a glp-1 compound for use in the treatment of obesity
WO2009030774A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Truncated glp-1 derivatives and their therapeutical use
CN101842109B (zh) 2007-09-05 2014-01-29 诺沃-诺迪斯克有限公司 用a-b-c-d-衍生的肽和它们的治疗用途
US8895694B2 (en) 2007-09-05 2014-11-25 Novo Nordisk A/S Glucagon-Like Peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use
MX2010003099A (es) 2007-09-21 2010-05-17 Univ California Interferon de objetivo demuestra actividades potentes apoptoticas y antitumorales.
EP2214700A4 (en) * 2007-11-02 2012-08-22 Janssen Biotech Inc HALF-SYNTHETIC GLP-1 PEPTIDE FUSION CONSTRUCTS, METHOD AND USES
SG189682A1 (en) * 2008-03-31 2013-05-31 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2009121551A1 (en) * 2008-04-03 2009-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Pegylated insulin-like-growth-factor assay
CN101328221B (zh) * 2008-04-14 2011-03-23 中国药科大学 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途
EP2926825A1 (en) 2008-06-27 2015-10-07 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
RU2526804C2 (ru) 2008-08-06 2014-08-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Конъюгированные белки с пролонгированным действием in vivo
US20100075897A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Jinan University Method for sustainedly releasing bioactive peptides and application thereof
MX2011004017A (es) 2008-10-15 2011-06-24 Angiochem Inc Conjugados de agonistas glp-1 y usos de los mismos.
CN102307897B (zh) 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
CA2745524C (en) 2008-12-05 2020-06-09 Angiochem Inc. Conjugates of neurotensin or neurotensin analogs and uses thereof
PL2373681T3 (pl) 2008-12-10 2017-07-31 Glaxosmithkline Llc Kompozycje farmaceutyczne albiglutydu
RU2539797C2 (ru) 2009-01-22 2015-01-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Производное гормона роста человека с повышенной стабильностью к протеолитическому разрушению, способ получения такого производного, его применение, способ лечения и фармацевтическая композиция
SG2014012918A (en) 2009-02-11 2014-04-28 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants and conjugates
US9238878B2 (en) 2009-02-17 2016-01-19 Redwood Bioscience, Inc. Aldehyde-tagged protein-based drug carriers and methods of use
TW201100104A (en) 2009-03-27 2011-01-01 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
US9173891B2 (en) 2009-04-20 2015-11-03 Angiochem, Inc. Treatment of ovarian cancer using an anticancer agent conjugated to an angiopep-2 analog
IN2012DN00248A (no) 2009-07-02 2015-05-01 Angiochem Inc
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
CN102612376A (zh) 2009-08-06 2012-07-25 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
SG10201407329RA (en) 2009-08-14 2015-01-29 Phasebio Pharmaceuticals Inc Modified vasoactive intestinal peptides
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
CN101993496B (zh) * 2009-08-20 2013-06-05 重庆富进生物医药有限公司 双重调节血糖血脂融合蛋白及其制法和用途
US20120276098A1 (en) 2009-09-30 2012-11-01 Bruce Hamilton Drug fusions and conjugates with extended half life
WO2011043530A1 (ko) * 2009-10-09 2011-04-14 (주)알테오젠 Ｇｌｐ-1 유사체의 융합체, 및 이를 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물
US8697648B2 (en) 2009-10-20 2014-04-15 Georgia State University Research Foundation, Inc. Protein agent for diabetes treatment and β cell imaging
RU2607374C2 (ru) 2009-10-30 2017-01-10 Новозаймс Байофарма Дк А/С Варианты альбумина
CN102070717B (zh) * 2009-11-19 2013-04-10 东莞太力生物工程有限公司 融合蛋白及其制备方法、编码该蛋白的dna序列、表达载体、宿主细胞、含有该蛋白的药物组合物
EA024441B1 (ru) 2009-12-08 2016-09-30 Тева Фармасьютикал Индастриз Лтд. СЛИТЫЙ БЕЛОК BChE-АЛЬБУМИН ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЯ КОКАИНОМ
SI2525834T1 (sl) 2010-01-22 2019-10-30 Novo Nordisk Healthcare Ag Rastni hormoni s podaljšano in vivo učinkovitostjo
EP2525833A2 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Novo Nordisk Health Care AG Stable growth hormone compounds
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
WO2011124718A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Novozymes A/S Albumin derivatives and variants
CN101875700B (zh) * 2010-04-09 2012-09-26 无锡和邦生物科技有限公司 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
WO2011123943A1 (en) 2010-04-09 2011-10-13 Mount Sinai Hospital Methods for treating disorders of the gastrointestinal tract using a glp-1 agonist
RU2012151296A (ru) 2010-04-30 2014-06-10 Санва Кагаку Кенкюсо Ко., Лтд Пептид для улучшения биостабильности биоактивного вещества и биоактивное вещество, имеющее повышенную биостабильность
EP2566502A4 (en) 2010-05-04 2013-10-09 Glaxosmithkline Llc METHODS OF TREATING OR PREVENTING CARDIOVASCULAR DISORDERS AND PROVIDING CARDIOVASCULAR PROTECTION
WO2011153642A1 (en) * 2010-06-10 2011-12-15 Angiochem Inc. Leptin and leptin analog conjugates and fusion proteins and uses thereof
CN101891823B (zh) * 2010-06-11 2012-10-03 北京东方百泰生物科技有限公司 一种Exendin-4及其类似物融合蛋白
WO2011162830A2 (en) * 2010-06-24 2011-12-29 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
CN103080125A (zh) 2010-07-02 2013-05-01 安吉奥开米公司 用于治疗性结合物的短且含d氨基酸的多肽及其使用
CN102311501A (zh) * 2010-07-08 2012-01-11 天津药物研究院 含有glp-1或其类似物的融合蛋白、制备方法及其应用
CN101906158B (zh) * 2010-07-14 2013-10-23 中国药科大学 一种聚乙二醇化降糖多肽及其制法和用途
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102532323B (zh) * 2010-12-09 2014-07-23 天津药物研究院 一种多肽复合物、药物组合物、其制备方法和应用
PT2651398T (pt) 2010-12-16 2018-03-09 Novo Nordisk As Composições sólidas compreendendo um agonista de glp-1 e um sal de ácido n-(8-(2-hidroxibenzoil)amino) caprílico
CN102533655A (zh) * 2010-12-21 2012-07-04 青岛黄海制药有限责任公司 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法
EP2658979B1 (en) * 2010-12-27 2018-02-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
EP2663647A4 (en) 2011-01-14 2015-08-19 Redwood Bioscience Inc POLYPEPTIDE IMMUNOGLOBULINS WITH ALDEHYDIC MARKING AND THEIR USE METHOD
JP5948683B2 (ja) 2011-02-28 2016-07-06 国立研究開発法人国立循環器病研究センター 悪性腫瘍転移抑制用医薬
CA2828811C (en) 2011-03-03 2021-09-21 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
EP2696687B1 (en) 2011-04-12 2016-10-26 Novo Nordisk A/S Double-acylated glp-1 derivatives
US9561262B2 (en) 2011-06-06 2017-02-07 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
IN2013MN02441A (no) 2011-06-28 2015-06-12 Inhibrx Llc
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
KR20140068861A (ko) * 2011-06-28 2014-06-09 인히브릭스 엘엘씨 Wap 도메인 융합 폴리펩티드 및 이의 이용 방법
JP2014522641A (ja) 2011-07-01 2014-09-08 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング リラキシン融合ポリペプチドおよびその使用
MX2014000316A (es) 2011-07-08 2014-02-19 Bayer Ip Gmbh Proteinas de fusion liberadoras de relaxina y usos de las mismas.
CN103764165A (zh) 2011-08-19 2014-04-30 独立行政法人国立循环器病研究中心 组合利尿钠肽受体gc-a激动剂以及gc-b激动剂而成的用于防止恶性肿瘤恶化的药品
EP2749883A4 (en) * 2011-08-25 2015-05-27 Lsi Medience Corp METHOD FOR DETERMINING GLP-1 (GLUCAGON-LIKE PEPTIDE-1), AND KIT FOR USE THEREIN
US9758560B2 (en) 2011-09-06 2017-09-12 Novo Nordisk A/S GLP-1 derivatives
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
JP2015500823A (ja) 2011-12-09 2015-01-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｇｌｐ−１アゴニスト
KR101895047B1 (ko) 2011-12-30 2018-09-06 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 위치 특이적 글루카곤 유사 펩타이드-2 약물 결합체
CN104204218A (zh) 2012-01-26 2014-12-10 安姆根有限公司 生长分化因子15 (gdf-15)多肽
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
PL2825556T3 (pl) 2012-03-16 2018-10-31 Albumedix A/S Warianty albuminy
HUE062740T2 (hu) 2012-03-22 2023-12-28 Novo Nordisk As GLP-1 peptidek készítményei és elõállításuk
PT2827845T (pt) 2012-03-22 2019-03-29 Novo Nordisk As Composições compreendendo um agente de entrega e sua preparação
MY167814A (en) 2012-04-19 2018-09-26 Opko Biologics Ltd Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
RU2014150850A (ru) 2012-05-16 2016-07-10 Глэксо Груп Лимитед Нагруженные полипептидом роса-наночастицы для перорального введения
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
CN112142855A (zh) * 2012-05-18 2020-12-29 爱德迪安（北京）生物技术有限公司 用于糖尿病治疗的蛋白、蛋白缀合物及其应用
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
TR201808753T4 (tr) 2012-06-08 2018-07-23 Alkermes Pharma Ireland Ltd Agonistler ve antagonistler olarak dairesel permütasyon tarafından modifiye edilmiş ligandlar.
JP6517690B2 (ja) 2012-06-20 2019-05-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス ペプチド及び送達剤を含む錠剤製剤
CA2878640C (en) 2012-07-13 2023-10-24 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs
AR091902A1 (es) * 2012-07-25 2015-03-11 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada
AR092862A1 (es) * 2012-07-25 2015-05-06 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulacion liquida de insulina de accion prolongada y un peptido insulinotropico y metodo de preparacion
AR094821A1 (es) * 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
CA2890766A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
BR122020018510B1 (pt) 2012-11-20 2023-03-14 Opko Biologics Ltd Método para aumentar incrementalmente o tamanho hidrodinâmico de um fator de coagulação ativado viia
WO2014089354A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
MA38276B1 (fr) 2012-12-21 2018-03-30 Sanofi Sa Dérivés de l'exendine 4 pour l’utilisation dans le traitement des troubles du syndrome metabolique, y compris le diabete et l'obesite, ainsi que la reduction de l'apport alimentaire excessif.
CA2896793A1 (en) 2013-01-15 2014-07-24 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Formulations of albu-bche, preparation and uses thereof
US9546203B2 (en) * 2013-03-14 2017-01-17 Amgen Inc. Aglycosylated Fc-containing polypeptides with cysteine substitutions
JP6464145B2 (ja) 2013-04-05 2019-02-06 ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー 成長ホルモン化合物製剤
US10093745B2 (en) 2013-05-29 2018-10-09 The Regents Of The University Of California Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
CN104277112B (zh) 2013-07-04 2018-01-26 嘉和生物药业有限公司 长效降血糖融合蛋白
MA38873B1 (fr) * 2013-07-31 2018-11-30 Amgen Inc Constructions contenant le facteur 15 de différentiation de croissance (gdf-15)
CN103408669B (zh) * 2013-08-01 2016-01-20 江苏泰康生物医药有限公司 Glp-1类似物融合蛋白，及其制备方法和用途
CN104371019B (zh) 2013-08-13 2019-09-10 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 一种能与glp-1r特异性结合的抗体及其与glp-1的融合蛋白质
EP3033355A1 (en) * 2013-08-16 2016-06-22 Medimmune Limited Gip and glp-1 receptor dual-agonists for the treatment of diabetes
CA2926087C (en) 2013-10-10 2023-03-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Tm4sf1 binding proteins and methods of using same
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2015086548A1 (en) * 2013-12-10 2015-06-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of the binding domain of a subunit of a multi-subunit structure for targeted delivery of pharmaceutically active entities to the multi-subunit structure
WO2015086728A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
EP3080154B1 (en) 2013-12-13 2018-02-07 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
MY192248A (en) * 2014-03-31 2022-08-10 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
NO2776305T3 (no) 2014-04-23 2018-01-27
US11052132B2 (en) 2014-05-08 2021-07-06 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cystic fibrosis
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
CN104558198A (zh) * 2014-07-25 2015-04-29 成都贝爱特生物科技有限公司 GLP-1类似物和amylin类似物的融合蛋白制备及其用途
CN104257696B (zh) * 2014-09-04 2017-08-25 西安国誉生物科技有限公司 一种降糖稳糖酵母菌粉及其制备方法和应用
EP3189072B1 (en) 2014-09-05 2018-07-18 University of Copenhagen Gip peptide analogues
WO2016055610A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Novo Nordisk A/S Stable glp-1 based glp-1/glucagon receptor co-agonists
CN104327187B (zh) * 2014-10-11 2018-06-08 上海兴迪金生物技术有限公司 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 治療用ビタミンｄコンジュゲート
AU2015343048A1 (en) * 2014-11-06 2017-05-18 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Immunotherapeutics for cancer and autoimmune diseases
JP6787894B2 (ja) 2014-12-05 2020-11-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 組換えアルカリホスファターゼを用いた発作の処置
CA2968987C (en) * 2014-12-08 2022-05-10 1Globe Biomedical Co., Ltd. Soluble universal adcc-enhancing synthetic fusion gene and peptide technology and its use thereof
WO2016118577A1 (en) * 2015-01-22 2016-07-28 Medimmune, Llc Thymosin-beta-four fusion proteins
AU2016211447B2 (en) 2015-01-28 2021-09-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
CN114652817A (zh) 2015-02-09 2022-06-24 费斯生物制药公司 用于治疗肌肉疾病和病症的方法和组合物
WO2016127887A1 (zh) 2015-02-11 2016-08-18 杭州鸿运华宁生物医药工程有限公司 一种药用glp-1r抗体融合蛋白的稳定溶液制剂
EA201792084A8 (ru) * 2015-04-01 2019-06-28 Зе Скриппс Рисёрч Инститьют Способы и композиции, связанные с полипептидами - агонистами gpcr
UA126270C2 (uk) 2015-04-10 2022-09-14 Емджен Інк. Мутеїни інтерлейкіну-2 для росту регуляторних t-клітин
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
EP3307326B9 (en) 2015-06-15 2021-02-24 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
ES2893616T3 (es) 2015-06-19 2022-02-09 Opko Biologics Ltd Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para la producción de los mismos
AR105284A1 (es) 2015-07-10 2017-09-20 Sanofi Sa Derivados de exendina-4 como agonistas peptídicos duales específicos de los receptores de glp-1 / glucagón
KR102644116B1 (ko) 2015-08-17 2024-03-05 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 알칼린 포스파타제의 제조
CA2989966C (en) 2015-08-20 2024-04-30 Albumedix A/S Albumin variants and conjugates
WO2017041001A2 (en) 2015-09-04 2017-03-09 The California Institute For Biomedical Research Insulin immunoglobulin fusion proteins
EP3355904A4 (en) 2015-09-28 2019-06-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. IDENTIFICATION OF EFFECTIVE DOSE SHEETS FOR TISSUE-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE ENZYMERSAT THERAPY OF HYPOPHOSPHATASIA
EP3368062A4 (en) 2015-10-30 2019-07-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING CRANIOSYNOSTOSIS IN A PATIENT
CN105367664B (zh) * 2015-11-04 2019-09-20 成都贝爱特生物科技有限公司 激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途
EP3960760A1 (en) * 2015-11-16 2022-03-02 Ubiprotein, Corp. A method for extending half-life of a protein
BR112018010535A2 (pt) 2015-11-24 2018-11-13 Transfert Plus Sec compostos peptídicos e conjugados peptídicos para o tratamento de câncer por quimioterapia com mediação por um receptor
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING HYPOPHOSPHATASE IN CHILDREN
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
MX2018011833A (es) 2016-04-01 2019-02-13 Alexion Pharma Inc Tratamiento para la debilidad muscular con fosfatasas alcalinas.
CA3019398A1 (en) 2016-04-26 2017-11-02 R.P. Scherer Technologies, Llc Antibody conjugates and methods of making and using the same
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
AU2017296352A1 (en) 2016-07-11 2019-02-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factor VII and methods of producing same
CN106046176B (zh) 2016-08-16 2019-09-10 中国药科大学 一种高活性长效降糖融合蛋白及其制备方法与医药用途
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
WO2018045872A1 (zh) * 2016-09-06 2018-03-15 中国药科大学 一种多肽及其用途
CN106279400A (zh) * 2016-09-06 2017-01-04 中国药科大学 P8降糖肽的设计及其用途
CN109200273B (zh) * 2017-07-04 2021-02-19 中国药科大学 一种多肽用于制备预防或治疗脂肪肝病药物的用途
CN110582302A (zh) * 2016-12-14 2019-12-17 利甘达尔股份有限公司 用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法
CN106519016A (zh) * 2016-12-20 2017-03-22 中国药科大学 降糖调脂肽——Progly肽的设计及其用途
CN107033234B (zh) * 2017-01-03 2018-06-26 北京凯因科技股份有限公司 酰化的glp-1衍生物
WO2018138170A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Medimmune, Llc Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
AU2018243320A1 (en) 2017-03-31 2019-10-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
CN108727486A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 长效神经生长因子、制备方法及其组合物
WO2018213928A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds, conjugate compounds and uses thereof for treating inflammatory diseases
JP2020521784A (ja) 2017-05-31 2020-07-27 ユニバーシティ オブ コペンハーゲン 長時間作用性ｇｉｐペプチド類似体
PL3474820T3 (pl) 2017-08-24 2024-05-13 Novo Nordisk A/S Kompozycje glp-1 i ich zastosowania
WO2019067499A1 (en) 2017-09-27 2019-04-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. BIOMARKER SIGNATURE FOR PREDICTING A TUMOR RESPONSE TO ANTI-CD200 THERAPY
CA3082625A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Eli Lilly And Company Methods of using and compositions containing dulaglutide
CN109836504B (zh) * 2017-11-24 2022-08-02 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN116143939A (zh) * 2017-11-24 2023-05-23 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多重活性蛋白
WO2019119673A1 (zh) 2017-12-19 2019-06-27 北京吉源生物科技有限公司 一种双基因修饰的干细胞及其用途
CN113603794B (zh) * 2018-01-11 2024-01-16 安源医药科技（上海）有限公司 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
WO2019140021A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Eli Lilly And Company Combination therapy
CN110092835A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 上海惠盾生物技术有限公司 一种glp-1类似物-col3a1融合蛋白
BR112020014624A2 (pt) 2018-02-02 2020-12-08 Novo Nordisk A/S Composições sólidas compreendendo agonista de glp-1, sal de ácido n-(8-(2-hidroxibenzoil) amino)caprílico e lubrificante
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
HUE060135T2 (hu) 2018-04-05 2023-02-28 Sun Pharmaceutical Ind Ltd Új GLP-1 analógok
PE20201350A1 (es) 2018-04-09 2020-11-30 Amgen Inc Proteinas de fusion del factor de diferenciacion de crecimiento 15
WO2019200594A1 (zh) 2018-04-19 2019-10-24 杭州先为达生物科技有限公司 酰化的glp-1衍生物
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
MX2021004665A (es) * 2018-10-22 2021-08-24 Janssen Pharmaceutica Nv Proteinas de fusion de peptido similar al glucagon 1 (glp1)-factor de diferenciacion de crecimiento 15 (gdf15) y usos de estas.
EP3891173A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Antag Therapeutics ApS Modified gip peptide analogues
WO2020118843A1 (zh) * 2018-12-12 2020-06-18 四川利通科创生物医药科技有限公司 一种glp-1突变体及其制备方法和用途
CA3123979A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific protein
CA3056663C (en) 2019-04-05 2022-10-18 Jeffrey S. RIESMEYER Use of dulaglutide in reducing risk of cardiovascular events in patients with type 2 diabetes mellitus
CN110151980B (zh) * 2019-06-30 2022-12-09 中国药科大学 Glp-1受体激动剂融合蛋白在制备预防或治疗高血脂药物中的应用
EP4106724A1 (en) 2020-02-18 2022-12-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 compositions and uses thereof
AU2021224412A1 (en) 2020-02-22 2022-09-15 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Human transferrin receptor binding peptide
CN115925994B (zh) * 2020-09-30 2023-09-22 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物和使用方法
EP4317174A1 (en) 2021-03-22 2024-02-07 Peptiaid Inc Peptide and peptide-containing composition
TW202305012A (zh) 2021-03-22 2023-02-01 日商肽夢想股份有限公司 c-Met 蛋白質結合肽複合物
CN113150172B (zh) * 2021-04-28 2023-09-22 中国药科大学 Glp-1r/gipr双靶点激动剂融合蛋白及其制备方法与应用
CN117677628A (zh) 2021-06-18 2024-03-08 肽梦想株式会社 Ghr结合未决肽及包含所述肽的组合物
WO2023022234A1 (ja) 2021-08-19 2023-02-23 ペプチドリーム株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
CA3229962A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Peptidream Inc. Human transferrin receptor-binding antibody-peptide conjugate
AU2022355276A1 (en) 2021-09-30 2024-05-16 Peptidream Inc. Peptide
CN113801853B (zh) * 2021-11-19 2022-03-15 山东兴瑞生物科技有限公司 Exendin-4融合基因修饰的MSC及其应用
CN117241821B (zh) * 2022-03-25 2024-04-09 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物的药物组合物及其使用方法
CN116848243B (zh) * 2022-03-30 2024-03-19 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物的液体药物组合物和其使用方法
CN114774496B (zh) * 2022-06-21 2022-10-04 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高密度发酵制备glp-1类似物的方法

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
FR2650598B1 (fr) * 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
FR2686900B1 (fr) 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
BR9507505A (pt) * 1994-04-22 1997-09-02 Corixa Corp Molécula de dna isolada vetor de expressão recombinante célula hospedeira método para preparar um polipeptídeo que estimula uma resposta imunológica th1 em células mononucleares do sangue periférico obtidas a partir de um individuo infectado com leishmania polipeptídeo método para avaliar a capacidade de um paciente de gerar uma resposta imunológica método para melhorar uma resposta imunológica celular e/ou humoral a um antígeno de um paciente método para estimular a produção de anticorpos em um
US5990077A (en) * 1995-04-14 1999-11-23 1149336 Ontario Inc. Glucagon-like peptide-2 and its therapeutic use
US5925351A (en) * 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
AR008077A1 (es) * 1996-07-26 1999-12-09 Talarico Salinas Laura Beatriz Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector.
AU4063697A (en) 1996-08-08 1998-02-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Methods for regulating gastrointestinal motility
CA2468374C (en) * 1996-08-30 2010-12-21 Novo-Nordisk A/S Glp-1 derivatives
UA65549C2 (uk) * 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
US6190909B1 (en) * 1997-04-17 2001-02-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TH2-specific gene
EP0887061A1 (en) * 1997-06-28 1998-12-30 The Procter & Gamble Company Faecal collector
WO1999007404A1 (en) 1997-08-08 1999-02-18 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
ATE381939T1 (de) 1997-11-14 2008-01-15 Amylin Pharmaceuticals Inc Neuartige exendin agonisten
AU756836B2 (en) 1997-11-14 2003-01-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel exendin agonist compounds
WO1999040788A1 (en) 1998-02-13 1999-08-19 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Inotropic and diuretic effects of exendin and glp-1
AU2610799A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives with helix-content exceeding 25 per cent, forming partially structured micellar-like aggregates
EP1062240B1 (en) * 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S N-terminally modified glp-1 derivatives
EP1056775B1 (en) 1998-02-27 2010-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives of glp-1 and exendin with protracted profile of action
AU2610699A (en) 1998-02-27 1999-09-15 Novo Nordisk A/S Derivatives of glp-1 analogs
EP1088084B1 (en) * 1998-06-15 2006-09-13 GTC Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
DK1137941T4 (da) * 1998-12-10 2014-01-06 Brystol Myers Squibb Company Protein-scaffolds til antistof-mimetika og andre bindingsproteiner
DE60006100T2 (de) * 1999-05-17 2004-07-01 Conjuchem, Inc., Montreal Lang wirkende insulinotrope peptide
US6514500B1 (en) * 1999-10-15 2003-02-04 Conjuchem, Inc. Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!}
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
WO2003059934A2 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004528014A (ja) 2004-09-16
BR0116024A (pt) 2005-12-13
EP1724284A3 (en) 2007-04-18
NO20101602L (no) 2003-08-01
CZ308214B6 (cs) 2020-03-04
EA005584B1 (ru) 2005-04-28
CA2434237A1 (en) 2002-06-13
HUP0302529A3 (en) 2009-03-30
ATE437891T1 (de) 2009-08-15
CA2716959A1 (en) 2002-06-13
WO2002046227A2 (en) 2002-06-13
EP1355942B1 (en) 2008-08-27
IL184429A0 (en) 2007-10-31
WO2002046227A3 (en) 2003-04-24
HUP1300326A2 (en) 2003-10-28
NO20032565L (no) 2003-08-01
NZ525577A (en) 2005-05-27
PL366208A1 (en) 2005-01-24
NO20111369L (no) 2003-08-01
UA81897C2 (uk) 2008-02-25
AU2689702A (en) 2002-06-18
MXPA03005036A (es) 2003-09-05
CN1483041A (zh) 2004-03-17
SI1724284T1 (sl) 2009-12-31
CA2434237C (en) 2012-05-15
PT1724284E (pt) 2009-09-30
DK1355942T3 (da) 2008-11-17
DK1724284T3 (da) 2009-11-02
ES2328510T3 (es) 2009-11-13
US20040053370A1 (en) 2004-03-18
HUP0302529A2 (hu) 2003-10-28
CY1109377T1 (el) 2014-07-02
NO20032565D0 (no) 2003-06-05
PT1355942E (pt) 2008-11-21
EP1355942A2 (en) 2003-10-29
CZ306180B6 (cs) 2016-09-14
IL155812A (en) 2009-09-22
ZA200303642B (en) 2004-08-12
DE60139430D1 (de) 2009-09-10
NO332221B1 (no) 2012-07-30
IL184429A (en) 2010-04-15
HRP20030455A2 (en) 2004-08-31
ECSP064643A (es) 2009-07-25
EP1724284B1 (en) 2009-07-29
CN101712722A (zh) 2010-05-26
KR100942864B1 (ko) 2010-02-17
CZ20031602A3 (cs) 2006-04-12
CY1108485T1 (el) 2014-04-09
DE60135581D1 (de) 2008-10-09
HU229218B1 (en) 2013-09-30
ES2311560T3 (es) 2009-02-16
AU2002226897B2 (en) 2007-10-25
KR20080085082A (ko) 2008-09-22
US7271149B2 (en) 2007-09-18
IL155812A0 (en) 2003-12-23
CZ2014740A3 (no) 2006-04-12
EA200300644A1 (ru) 2003-12-25
HK1061411A1 (en) 2004-09-17
HU230603B1 (hu) 2017-03-28
ATE406384T1 (de) 2008-09-15
PL209550B1 (pl) 2011-09-30
SK288088B6 (sk) 2013-06-03
JP2011006447A (ja) 2011-01-13
UA93662C2 (uk) 2011-03-10
SK6702003A3 (en) 2004-08-03
PL393178A1 (pl) 2011-02-14
SI1355942T1 (sl) 2009-02-28
EP1724284A2 (en) 2006-11-22
KR20040038901A (ko) 2004-05-08
SK288342B6 (en) 2016-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1724284B1 (en) GLP-1 fusion proteins
US20070161087A1 (en) Glp-1 fusion proteins
AU2002226897A1 (en) GLP-1 fusion proteins
JP4629047B2 (ja) Ｇｌｐ−１アナログ複合タンパク質
AU2004247042A1 (en) Fusion proteins
AU2007231863A1 (en) GLP-1 Fusion Proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired