CN101328221B - 一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途，属于生物工程技术领域。本发明提供的技术方案通过添加特殊多肽序列，使所获得的融合多肽在大肠杆菌***获得高可溶性表达。该融合多肽及其衍生物比天然降糖多肽具有更高的稳定性和活性，在一定剂量下口服或注射均能产生明显的降血糖活性。

Description

一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途

技术领域

本发明涉及一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构及用途，属于生物工程技术领域。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)一词是描述一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。该病又可分为以下两种类型：一型糖尿病，又称为胰岛素依赖型糖尿病；二型糖尿病，又称为非胰岛素依赖型糖尿病。WHO统计得出目前糖尿病的发病率为2.8％，并预计到2030年该数值将会增加至4.8％。美国CDCP报告目前糖尿病患者占全美人口的6.8％，其中90-95％为二型糖尿病患者。随着生活水平的提高和老龄化的加重，我国糖尿病患者的数量在不断增加，而多种流行病学数据也表明，我国糖耐量降低(impaired glucose tolerance，IGT)患者数量远远大于糖尿病患者的数量，这个庞大的糖尿病后备军，会进一步发展成为真正的糖尿病患者。二型糖尿病是由于胰岛素分泌相对不足引起的。发病初期，外周组织对胰岛素敏感性降低，故而人体分泌胰岛素的量会代偿性的升高，到后期，胰岛素的分泌量无法满足自身的需要，此时病人即表现出糖尿病的症状。最近的一项研究发现，当症状出现时，胰岛60-70％的功能已经丧失。在二型糖尿病的初期，通过锻炼和控制饮食即可使血糖的水平维持在安全范围之内，但到后期则必须依靠药物的治疗来控制血糖水平。病人需要终身服药并不断监测血糖水平，生活质量受到较大影响。

人体进餐后，在食物的刺激下肠道会分泌葡萄糖依赖性胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)及胰高血糖素样肽(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)等肽类物质作用于胰岛的β细胞刺激胰岛素的分泌，这一***被称为肠降血糖素(incretin)***。该***是正常生理状态下刺激胰岛素分泌的一个必需条件，但在糖尿病患者群中，肠降血糖素***受到了严重的损伤，故而外源性的引入相关药物可以明显改善糖尿病的症状。

GLP-1主要有以下生物学活性：(1)血糖依赖性的促胰岛素分泌，当血糖浓度低于4.3mmol/L(77mg/dl)时，GLP的降糖作用丧失，这是它有别于普通降糖药物的最显著特征之一；(2)刺激胰岛β细胞再生，诱导前体细胞向β细胞的分化，抑制β细胞凋亡；(3)增加生长抑素的分泌，从而抑制胰高血糖素的分泌，该作用也是血糖依赖性的；(4)抑制胃酸分泌，延迟胃排空；(5)作用于中枢神经，抑制食欲等。近年来对GLP-1的神经保护作用的研究越来越多。目前针对二型糖尿病的治疗多是单途径的，均存在一定程度的副作用，而GLP-1对二型糖尿病的治疗效果是上述多种活性共同作用的结果，这也是GLP-1相对其它药物的优势之一。以上特点使得GLP-1分子成为治疗糖尿病的理想药物候选分子，但多年来天然GLP-1却一直未能应用于临床，这主要是因为GLP-1在体内作用时间极短，血浆半衰期不足2min，静脉给药后迅速被内源性的二肽基肽酶(DPPIV)从N末端切掉2个氨基酸而失活，且酶解后产生的片段GLP-1_3-30是天然GLP-1的拮抗剂，进一步抑制了GLP-1的作用。

Exendin-4是一个由39个氨基酸组成的多肽，与GLP-1有53％的同源性。最初由美洲巨蜥的唾液中提取获得，现已通过固相合成或是基因表达的手段制备。它也是通过与GLP-1受体结合其作用，由于第二位氨基酸为Gly，Exendin-4可以有效的抵抗DPPIV的酶解，皮下注射时其半衰期达到了3.3-4h。Exendin-4可以有效的控制血糖水平并适度减轻体重，其主要不良反应为恶心和呕吐。有研究表明，对C57BL/6小鼠腹腔注射100pmol/kg，每天一次，持续给药两周，结果胰岛体积扩增1.7倍。以腹腔注射的方式对雄性SD大鼠给药Exendin-4，1nmol/kg，每天一次，持续10天，结果发现Exendin-4可以明显增加胰岛β细胞的数目。它还可以有效的抑制胰岛β细胞的凋亡。但即便可以抵抗DPP4的酶解，Exendin-4的半衰期仍然较短，病人每天需要注射两次，依从性较差。

公开号为CN 1483041A的名为GLP-1融合蛋白的专利提出了两种GLP-1融合蛋白的结构，分别是在GLP-1的C末端融合白蛋白或是免疫球蛋白的Fc部分，其目的主要在于延长GLP-1注射给药时的体内半衰期且不涉及口服给药。公开号为CN 1587385A的名为高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌及其构建方法和应用的专利提出一种通过串联GLP-1基因实现高效表达的方法，其主要目的在于提高GLP-1的表达量。公开号为CN 1703424A的名为GLP-1衍生物及其经粘膜吸收的制剂的专利提出了一种可跨膜吸收的GLP-1衍生物，并通过相应的制剂进一步提高其跨膜效率，它主要通过在GLP-1的C末端添加碱性短肽序列实现跨膜吸收的。公开号为CN 1832944A的名为用于口服传递胰高血糖素样肽(GLP)-1化合物或黑色素皮质激素4受体(MC4)激动剂肽的化合物、方法和制剂的专利提供了一种化合物的结构，该化合物具有利于GLP-1口服传递的效果，它是以药物组合物的形式出现在药物复方中的。公开号为CN 1297888A的名为GLP-1及其类似物与人溶菌酶融合的重组蛋白及其用途的专利提供了一种GLP-1及其类似物的融合蛋白的结构，该融合蛋白是在GLP-1及其类似物的N端或是C端添加人溶菌酶序列构成的。其主要目的有两个，一是延长GLP-1及其类似物的体内半衰期，二是使融合蛋白同时起到降血糖及抗感染的作用。

目前，虽然这两种多肽及其类似物的研究已经取得了较大的进展，但在以下方面仍存在问题：(1)此类多肽的制备不论是采用普通的固相合成还是重组表达都存在成本较高、难度较大的问题；(2)此类多肽本身并不稳定，但溶液状态下极易形成聚集体而失活，尤其是在酸性溶液中；(3)此类多肽原形的半衰期较短，但在临床上给药时多采用注射的手段，病人依从性极差。

本专利提供了一种可以提高降糖多肽稳定性的融合蛋白及其衍生物，该融合蛋白在大肠杆菌可以实现高表达，每升发酵液经纯化后可获得目的蛋白560mg，且在一定剂量下口服或注射具有明显的降血糖活性。融合蛋白经化学修饰后获得的衍生物具有更高的稳定性、更强的疏水性以及更高的口服有效性。融合蛋白衍生物的酶切产物较原形多肽具有更高的稳定性、更好的生物学活性，在糖尿病等疾病的治疗中是一个极具潜力的分子

发明内容

肠降血糖素***是人体代谢调控网络中的重要一员，葡萄糖依赖性促胰岛素分泌肽(glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP)及胰高血糖素样肽(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)是其两个具有代表性的分子。人体内源性GLP-1存在两种形式：GLP-1(7-36)及GLP-1(7-37)，这两种分子在生物性活性上无显著性差异。Exendin-4是源于美洲巨蜥唾液的一种多肽，它与GLP-1在序列上有53％的同源性，是GLP-1受体的天然激动剂。本发明立足于此类多肽及其类似物，采用融合蛋白的形式进行重组制备，可以实现可溶性高表达，每升发酵液获得的目的蛋白高达560mg。通过在融合序列与目的多肽之间添加特定的Linker结构，并加以相应的衍生化，可实现融合蛋白直接口服给药。该融合蛋白及其衍生物在口服给药时具有较高的生物利用度，其降血糖活力显著。融合蛋白衍生物的酶切产物亦具有具有显著的降血糖活性，而且该酶切产物在口服给药时有相对较高的生物利用度，该分子稳定性较高、半衰期较长、制备方法较为简单，在糖尿病等疾病的治疗中有一定的价值。

本发明的第一个目的是提出一种降糖多肽融合蛋白及其衍生物的结构，该结构具有以下特征：

其中多肽2为可促进多肽1可溶性表达、高表达或利于纯化的多肽序列，本专利优选为TrxA、GST或者His-Tag但不局限于此。Linker为可以被蛋白酶特异性识别并切断的1～5个氨基酸序列，本专利优选为Lys、Arg或者Asp-Asp-Asp-Asp-Lys但不局限于此。多肽1为具有降糖作用的30～50氨基酸的多肽序列，包括但不限于GLP-1、Exendin-4及其类似物。

所述衍生物的其进一步特征在于，R1可以不存在或为可提高融合蛋白稳定性、疏水性的聚合物，包括但不仅限于聚乙二醇及其衍生物、多聚唾液酸、棕榈酸或月桂酸及它们的衍生物。

所述衍生物的进一步特征在于，R2可以缺失或为促进融合蛋白或多肽跨膜转运的小分子化学物质，包括但不限于维生素B12、泛酸、硫辛酸或生物素。

本发明的第二个目的在于提出融合蛋白衍生物的酶切产物的结构。融合蛋白衍生物的酶切产物是通过在融合蛋白序列中的Linker处进行特异性酶切所获得的，该产物可口服给药且具有制备方法简单易行、稳定性高、半衰期长等优点。所述酶切产物的进一步特征在于，当采用聚乙二醇、生物素化聚乙二醇或是多聚唾液酸进行衍生化时，酶切后获得的产物稳定性得到了显著的提升，在口服或是注射给药后其体内半衰期延长显著；当采用月桂酸、棕榈酸进行融合蛋白的衍生化时，酶切后获得的产物疏水性提升显著，在口服或是注射给药时生物利用度得到显著提高，体内半衰期延长显著；当采用维生素B12、泛酸、硫辛酸或生物素进行融合蛋白衍生化时，酶切产物可直接用于口服给药，具有显著的生物学活性。

酶切产物的制备方法如下：

第一步：根据大肠杆菌密码子偏爱性合成降糖多肽的基因。

第二步：将该基因与融合序列的基因进行串联。

第三步：将串联后的基因重组入表达载体，克隆入宿主菌后进行诱导表达。

第四步：采用融合蛋白上的HisTag标签进行亲和纯化获得融合蛋白。

第五步：对融合蛋白进行相应的衍生化反应。

第六步：融合蛋白衍生化产物在Linker处进行酶切，获得酶切产物。

本发明的第三个目的是提出此类降糖多肽融合蛋白、融合蛋白衍生物及衍生物的酶切产物的用途，它们可在糖尿病、肥胖症、老年痴呆症及心肌梗塞中得到应用。

本专利所提出的降糖多肽融合蛋白及其衍生物结构中的降糖多肽是在GLP-1及Exendin-4分子基础上进行较大改构获得的，它与GLP-1受体具有更高的亲和力其在胃肠道及血液中的稳定性明显高于GLP-1或Exendin-4原形。本专利所提出的融合蛋白是在降糖多肽的N端融合相应的多肽序列，其主要目的一是利于融合蛋白的表达与纯化，二是在口服给药时起到保护降糖多肽免受酶解的作用。通过对融合蛋白进行进一步的衍生化可提高其稳定性，增加其口服生物利用度。融合蛋白衍生物在Linker处进行酶切后的产物口服给药或是注射给药均具有显著的降血糖活性。在口服给药时其生物利用度较高，胃肠道稳定性显著高于原形多肽。静脉注射给药时，该酶切产物较原形多肽有更长的半衰期。

本发明的优点在于：(1)与现有技术相比，本发明所提出的降糖多肽的融合蛋白、融合蛋白的衍生物及衍生物的酶切产物均可直接口服给药，其生物利用度较高，可显著减轻病人的痛苦，提高病人的依从性；(2)本发明所提出的融合蛋白衍生物的酶切产物在注射给药时具有更高的稳定性、更低的免疫原性及更长的体内半衰期；(3)与现有技术相比，本发明提供融合方式能使降糖多肽获得高可溶性表达，经优化后每升发酵液在纯化后可获得560mg高纯可溶融合蛋白，其成本低廉，操作简单。

附图说明

图1：TrxA-mGLP-1融合蛋白的SDS-PAGE图及Western-Blot鉴定

图2：TrxA-mGLP-1融合蛋白聚乙二醇衍生物及其酶切产物的SDS-PAGE图

图3：融合蛋白口服给药的降血糖活性

图4：融合蛋白聚乙二醇衍生物酶切产物的降血糖活性

具体实施方式

下面结合实施例，进一步详述本发明。说明书及实施例中采用的菌株、质粒、化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

                                实施例1

降糖多肽1融合蛋白的制备

第一步：按照降糖多肽1的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，在基因的上游设计入DDDDK序列，两端分别添加Kpn1和Hind3的识别序列。该基因与TrxA融合后的氨基酸序列如下：TrxA-HisTag-DDDDK-HGEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR PSSGA PPPS

第二步：将合成后的基因与pET32a载体分别用Kpn1和Hind3进行双酶切，酶切后的产物16度连接8小时，按照《分子克隆》给出的标准方法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆。测序验证***基因的准确性。

第三步：将阳性克隆37度以LB培养基培养过夜做种子液，培养基中添加50μg/ml氨苄青霉素做选择性压力。按1％接种量将种子液转接至100ml LB培养基，37度培养至OD600达到0.6-1.0，添加0.2-1mmol/L IPTG进行诱导，诱导培养4-10小时后结束培养。

第四步：4000转20分钟离心收获菌体沉淀，超声波破壁后以Ni-IMAC进行层析纯化，获得纯化后的融合蛋白，以SDS-PAGE检测纯度高于95％。表达及纯化过程的SDS-PAGE结果详见附图1，其中左侧为SDS-PAGE结果，右侧为Western Blot鉴定结果。

第五步：选取雄性KM小鼠24只，测定空腹血糖，将空腹血糖值接近的小鼠分为一组，共分三组，分别为高糖组、对照组及高糖加融合蛋白组。高糖加融合蛋白组按0.5μmol/kg剂量灌胃给融合蛋白，其余两组只给生理盐水。20分钟后高糖组和高糖加融合蛋白组均按18mmol/kg腹腔注射葡萄糖，对照组则注射生理盐水。分别于注射后的0分钟、10分钟、20分钟、30分钟及60分钟采集血样测定血糖含量。测定结果见附图3。

                                     实施例2

降糖多肽2融合蛋白、单链聚乙二醇化融合蛋白衍生物、衍生物的酶切产物的制备及降糖活性测定。

按照降糖多肽2的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，在基因的上游设计入DDDDK序列，两端分别添加Kpn1和Hind3的识别序列。该基因与TrxA融合后的氨基酸序列如下：TrxA-HisTag-DDDDK HGEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGRC

TrxA-GLP-1(Gly8，Cys37)融合蛋白的基因的重组构建、转化及表达和纯化同实施例1，SDS-PAGE检测表明纯化获得的融合蛋白纯度高于95％。将纯化后的蛋白稀释至1mg/ml，按摩尔比10∶1的条件加入马来酰亚胺化单链聚乙二醇5000，4-37度搅拌反应2-24小时，反应液以20mmol/L PBS pH7.2透析过夜。透析后的反应液以Q-Sepharose Fast Flow层析柱进行纯化获得融合蛋白的衍生物，SDS-PAGE检测该衍生物的纯度高于90％。

采用截留分子量为10KD的超滤膜对纯化后的融合蛋白聚乙二醇衍生物进行浓缩，将浓缩后的蛋白浓度调节至2mg/ml。按1mg/ml比例加入肠激酶，4-37度酶切4-24小时。酶切产物采用制备型C18RP-HPLC进行纯化并冷冻干燥。融合蛋白聚乙二醇衍生物及衍生物的酶切产物的SDS-PAGE结果见附图2.酶切产物按下面的方法进行降血糖活性测定。

选取雄性KM小鼠24只，测定空腹血糖，将空腹血糖值接近的小鼠分为一组，共分三组，分别为高糖组、对照组及给药组。高糖组按18mmol/kg剂量腹腔注射葡萄糖，给药组则在同剂量的葡萄糖溶液中按50nmol/kg溶解酶切产物后给药，对照组只给予生理盐水。给药体积均控制在8ml/kg。给药后分别于0分钟、10分钟、20分钟、30分钟及60分钟采集血样测定血糖含量。测定结果见附图4。

                                 实施例3

降糖多肽3融合蛋白、生物素化融合蛋白衍生物的制备及降血糖活性测定。

第一步：按照降糖多肽3的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，在基因的上游设计入一个Arg的密码子，两端分别添加BamH1和Hind3的识别序列。该基因与HisTag构成的融合蛋白的氨基酸序列如下：

GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAQEFIAWLVKGR

第二步：将合成后的基因与pET28a载体分别用BamH1和Hind3进行双酶切，酶切后的产物16度连接8小时，按照《分子克隆》给出的标准方法将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆。测序验证***基因的准确性。

第三步：将阳性克隆37度以LB培养基培养过夜做种子液，培养基中添加50μg/ml卡那霉素做选择性压力。按1％接种量将种子液转接至100ml LB培养基，37度培养至OD600达到0.6-1.0，添加0.2-1mmol/L IPTG进行诱导，诱导培养4-10小时后结束培养。

第四步：4000转20分钟离心收获菌体沉淀，超声波破壁后以Ni-IMAC进行层析纯化，获得纯化后的融合蛋白，以Tricine-SDS-PAGE检测纯度高于95％。

第五步：按摩尔比10∶1添加琥珀酸亚胺活化后的生物素，反应pH5-10，温度4-37摄氏度，反应2-24小时以使反应充分进行。

第六步：反应产物经20mmol/L Tris-HCl缓冲液透析后上Q-Sepharose Fast Flow层析柱纯化。初步纯化后的产物经RP-HPLC进行进一步纯化制的精品并冷冻干燥。活性测定方法同实施例1。

                                    实施例4

降糖多肽4融合蛋白、棕榈酸化融合蛋白衍生物的制备

按照降糖多肽4的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，在基因的上游设计入一个Arg的密码子，两端分别添加BamH1和Hind3的识别序列。该基因与HisTag构成的融合蛋白的氨基酸序列如下：

GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR

重组质粒的构建、转化及表达与纯化等步骤同实施例3，纯化获得的融合蛋白经Tricine-SDS-PAGE检测纯度高于95％，按摩尔比10∶1添加琥珀酸亚胺活化后的棕榈酸，控制pH5-10，温度4-37摄氏度，充分反应2-24小时。棕榈酸化降糖多肽4融合蛋白衍生物的纯化及活力测定方法同实施例3。

                                实施例5

降糖多肽5融合蛋白、泛酸化融合蛋白衍生物的制备

按照降糖多肽5的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，在基因的上游设计入一个Arg密码子。两端分别添加BamH1和Hind3的识别序列。该基因与HisTag融合后的氨基酸序列如下：

GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSRHGEGTFTSDLSKQMEEEAVALFIEWLKNGGPSSGAPPPS

表达载体采用pET28a，表达及纯化的具体步骤同实施例3。纯化后的融合蛋白稀释至1mg/ml。按摩尔比10∶1添加琥珀酸亚胺活化的泛酸，控制pH5-10，温度在4-37摄氏度条件下充分反应2-24小时。泛酸化降糖多肽5融合蛋白的纯化步骤及活性测定同实施例3。

                                实施例6

降糖多肽6融合蛋白衍生物及衍生物酶切产物的制备

按照降糖多肽6的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，上游添加DDDDK序列，两端分别添加Kpn1和Hind3的识别序列。该基因与TrxA融合后的氨基酸序列如下：

TrxA-HisTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRPSSGAPPPC

表达载体采用pET32a，表达及纯化的具体步骤同实施例3。SDS-PAGE检测表明融合蛋白电泳纯度高于95％。调节融合蛋白的浓度至1mg/ml，按摩尔比10∶1添加马来酰亚胺活化的聚乙二醇5000，控制pH6-8，充分反应2-24小时后透析除去小分子物质。以RP-HPLC对融合蛋白聚乙二醇衍生物进行纯化。调节调节聚乙二醇衍生化后的融合蛋白浓度至2mg/ml，按1mg/IU添加EK酶，控制pH5-8，在4-37摄氏度条件下酶解4-24小时。酶切产物的纯化采用C18RP-HPLC。调节酶切产物浓度至1mg/ml，按摩尔比20∶1添加N羟基琥珀酰亚胺活化后的生物素，控制pH5-10，充分反应2-24小时后透析除去小分子杂质，产物经RP-HPLC纯化后冷冻干燥。活性测定方法参见实施例1。

                                实施例7

降糖多肽7融合蛋白及融合蛋白酶切产物的制备

按照降糖多肽7的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，上游添加DDDDK序列，在两端分别添加BamH1和Hind3的识别序列。该基因与GST融合后的氨基酸序列如下：

GST-HisTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS

表达载体采用pGEX-KG，表达及纯化的具体步骤同实施例1。SDS-PAGE检测显示纯化后融合蛋白的纯度高于95％。调节蛋白浓度至2mg/ml，按1mg/IU添加EK进行酶切反应，控制pH5-8，在4-37摄氏度条件下酶解4-24小时。酶切产物的纯化采用C18RP-HPLC，冷冻干燥。活性测定方法参加实施例2。

                            实施例8

降糖多肽8融合蛋白、融合蛋白酶切产物及双链聚乙二醇化酶切产物衍生物的制备及降血糖活性测定

按照降糖多肽8的氨基酸序列，参考大肠杆菌密码子偏爱性合成其基因序列，上游添加DDDDK序列，两端分别添加Kpn1和Hind3的识别序列。该基因与TrxA融合后的氨基酸序列如下：

TrxA-HisTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAREFIAWLVKGRPSSGAPPPS

表达载体采用pET32a，表达及纯化的具体步骤同实施例1。SDS-PAGE检测纯化后融合蛋白的纯度高于95％。调节融合蛋白的浓度至2mg/ml，按1mg/IU添加EK酶，控制pH5-10，在4-37摄氏度的条件下充分酶切4-24小时。酶切产物的纯化采用C18RP-HPLC。纯化后的酶切产物按摩尔比10∶1添加琥珀酸亚胺活化的双链聚乙二醇10K，控制反应温度4-37摄氏度条件下充分反应4-24小时，反应物经透析后以Q-Sepharose Fast Flow树脂纯化获得双链聚乙二醇化酶切产物的衍生物，冷冻干燥后-20度保存。降血糖活性的具体测定步骤同实施例2。

                      序列表

Claims (1)

1.一种降糖多肽融合蛋白，其组成如下：

TrxA-HisTag-DDDDKHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC。

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