NO330769B1 - Polypeptid isolert fra H. medicinalis, isolert polynukleotid, ekspresjonsvektor, vertscelle, ekspresjonssystem, fremgangsmate for fremstilling av et polypeptid, antistoff, farmasoytisk preparat, anvendelse av et polypeptid, fremstilling av et medikament for behandling av tromboemboliske sykdommer. - Google Patents

Description

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptid isolert fra H. medicinalis, isolert polynukleotid, ekspresjonsvektor, vertscelle, ekspresjonssystem, fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, antistoff, farmasøytisk preparat, anvendelse av et polypeptid, fremstilling av et medikament for behandling av tromboemboliske sykdommer.

Det beskrives et naturlig forekommende protein isolert fra spytt fra den medisinske igle Hirudo medicinalis, som sterkt bindes til kollagen og således virker som en inhibitor for naturlig blodblateadhesjon til kollagen. Proteinet har en molekylvekt på ca. 12000, et surt isoelektrisk punkt og inneholder seks cysteiner. Proteinet ble sekvensert, og genet ble klonet fra et H. medicinalis-cDNA-bibliotek. Fremgangsmåter for fremstilling av et slikt polypeptid ved hjelp av rekombinante teknikker er beskrevet. De rekombinante og naturlig forekommende proteiner er sterke inhibitorer for kollagenavhengig blodplateadhesjon og derfor anvendbare for den terapeutiske behandling av forskjellige tilstander relatert til hjertesykdom og sykdommer i blodomløpet. Dessuten er proteinet anvendbart til belegging av naturlige eller kunstige kollagenoverflater for å gjøre dem ikke-adhesive for celler og forhindre aktiveringen av celler.

Oppfinnelsens område

Ved hemostase eller trombose fester blodplater seg til den celle-ekstracellulære matriks i det skadde kar og dekker overflaten til det skadde området. Forhindring av dette viktige starttrinn i patogenesen av trombose og arteriell okklusjon burde være av terapeutisk gunst i anstrengelsen for å forhindre trombotiske sykdommer. Kollagen anses for å være den mest trombogene overflatekomponent og er blitt påvist å være en sterk stimulant for blodplateadhesjon, -aggregasjon og frigjørelsen av deres granuler som fører til rekrutteringen av ytterligere blodplater til dette området slik at det dannes aggregater eller en trombe (Ruggeri, Z.M. et al., Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39). Den innledende kontakt mellom blodplatene og kar-overflaten formidles av kollagenbundet von Willebrand-faktor (vWF) og en spesifikk vWF-reseptor på blodplater, glykoprotein Ib-V-IX-komplekset. I tillegg driver ADP, epinefrin og koagula- sjonsfaktorer i omløp den videre aktiveringsprosess for blodplater samtidig som en økning i trombinaktivitet bidrar til dannelsen av det kryssbundne fibrinkoagel. Blodplate-blodplateaggregasjon understøtter denne prosessen og drives hovedsakelig av fibrinogen som en mediator som binder sammen celler gjennom glykoprotein Ilb/IIIa-reseptoren.

Denne normale fysiologiske respons er ganske avgjørende under den patologiske prosess hvor blodplater fester seg til kollagener som eksponeres i sklerotiske lesjoner (Van der Rest, M. et al., FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23) og starter å bygge opp okklusjoner. Avhengig av lokaliseringen og omfanget av okklusjonen kan alvorlige komplikasjoner, slik som hjerteinfarkt, slag, betennelse eller lungeembolisme være det alvorlige utfall av denne prosessen.

Som et direkte virkende antitrombotisk middel er heparin, som blokkerer trombinaktiviteten og således forhindrer dannelsen av fibrinrike tromber, det for tiden mest velkjente legemiddel som brukes ved antitrombotiske intervensjoner. Heparin er mye brukt ved slike indikasjoner som: ustabil angina og akutt hjerteinfarkt. Til tross for den omfattende bruk er imidlertid flere alvorlige utilstrekkeligheter, slik som intra-venøs applikasjon, behov for antitrombin-III som en kofaktor, redusert affinitet for koagelbundet trombin, dets inaktivering ved hjelp av flere plasmaproteiner, den av og til forekommende induksjon av trombocytopeni og dets biologiske heterogenitet, stadig uløst. Som en følge har resultatene av å bruke heparin i den kliniske sammenheng ikke vært overveldende hittil.

Nylig utvikling av heparin med lav molekylvekt har bidratt til en versjon for subkutan applikasjon, den terapeutiske fordel i forhold til standardheparinet har imidlertid vært beskjeden. Dessverre gjelder det samme for de øvrige direkte virkende antitrombiner, slik som hirudin, hirulog og warfarin. Det viste seg at ett av hovedproblemene synes å være relatert til den forøkte produksjon av trombin under antitrombotisk behandling (Rao, A.K. et al., Circulation, 1996, 94, 389-2395).

WO 95/01375 Al vedrører en inhibitor av kollagenstimulert blodplateaggregering isolert fra H. medicinalis.

Andre nyere strategier er derfor blitt fokusert på prosessen ved protrombinaktivering som drives av faktor Xa. Hovedutfordringen er utformingen av passende inhibitorer rettet mot denne faktoren. Oppsummert vil man derfor argumentere med at det fulle terapeutiske potensialet til denne type intervensjon ennå ikke er blitt realisert.

Et annet panel av terapeutika representeres av de trombolytiske regimer og har vært fokusert på utviklingen av stafylokinase, streptokinase, plasminogenaktivator av urokinase-type, plasminogenaktivator av vevstype og anisoylert plasmino-gen-streptokinaseaktivatorkompleks. Forskjellene i tid som er nødvendig for å indusere reperfusjon, er bemerkelsesverdig forskjellige for hvert av disse trombolytiske midlene, bidraget når det gjelder å redusere den totale dødelighet er imidlertid likt for alle produktene. I tillegg er reokklusjon eller forlenget blødning hyppige komplikasjoner. Dette kan skyldes forholdsvis lav spesifisitet for fibrin og den korte plasmahalveringstiden for disse forbindelsene. For tiden testes forskjellige applika-sjonsregimer og kombinasjoner av forskjellige fibrinolytiske prinsipper for å overvinne noen av de nåværende mangelfullheter ved trombolytisk terapi. Forbedringen som forventes, er imidlertid ganske liten. Nylig oppstod det en ny gruppe pasienter med slike problemer som akutt trombotisk okklusjon og senere restenose på grunn av slike fremgangsmåter som angioplasti, aterektomi, arterieimplantasjon eller karveggstenting. De mulige terapeutiske intervensjonene omfatter antiblodplate-, antitrombotiske og trombolytiske strategier. Forskjellige andre midler, slik som tiklopidin, som virker som ADP-antagonister, eller kalsiumionofor A-23187 og spesielt aspirin, har en direkte påvirkning på blodplatefunksjonen, og har vært foreslått eller brukt til å forhindre eller minimalisere blodplateaggregasjon. Det nye antiblodplateadhesjonsstoffet ifølge denne oppfinnelsen kan også hjelpe til å overvinne disse kliniske komplikasjonene når det appliseres under kirurgi.

En annen komplikasjon som er relatert til dette punktet, oppstår dersom kunstige overflater kommer i kontakt med blod, det er da forøkt tilbøyelighet til å indusere trombotiske hendelser ved aktivering av blodplater og/eller induksjon av koagulasjon. Disse effektene kan forårsake svikt i karimplan- tater, hjerteventiler, stenter, katetre eller enhver annen anordning eller ethvert annet materiale som kommer i kontakt med blod. Evnen til proteinet som er beskrevet her når det gjelder å skape ikke-trombogene overflater, kan derfor utnyttes videre ved hjelp av immobilisering av dette proteinet på materialene og anordningene som er beskrevet ovenfor. En slik behandling burde gjøre slike materialer eller anordninger biokompatible og tromberesistente.

På grunn av begrensningene som er forbundet med de tilgjengelige antitrombotiske midler, er det et faktisk behov for nye alternative strategier og terapeutika.

Oppfinnelsens bakgrunn

Et potensial for fremtidige forbedringer ved behandlingen av hjerte- og karforstyrrelser kan fås ved hjelp av fremgangsmåter som beskrevet ved denne oppfinnelsen, som direkte virker inn på kollagen og/eller den vWF-faktorinduserte blodplateadhesjon. Flere nye inhibitorer som forhindrer blodplateadhesjon, er monoklonale antistoffer rettet mot vWF. Det er også blitt foreslått at glykoprotein Ilb/IIIa-inhibitorer kan være gunstige for inhibering av blodplateadhesjon. Noen av disse inhibitorene, som det monoklonale antistoff c7E3, er allerede blitt testet klinisk, mens andre, som KGD- og RGDF-inhibitorene, fortsatt er gjenstand for undersøkelse. Spesifisiteten til de fleste av disse nye inhibitorene er imidlertid ikke særlig godt undersøkt, spekteret av bivirkninger som vil bli indusert ved å anvende disse inhibitorene er således fortsatt åpent og for-tjener nøye undersøkelser.

En rik kilde for screeningen av nye forbindelser som virker inn på kollagenindusert blodplateadhesjon, er gitt i naturen gjennom blodsugende dyr. Flere inhibitorer er blitt isolert fra naturen, som beskrevet i litteraturen: et 65 kD stort protein kalt calin, isolert fra Hirudo medicinalis (US 5 587 360, WO 92/07005 (Munro, R. et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) og et 16 kD (LAPP) protein, isolert fra spyttkjertlene til iglen Haementeria officinalis (US 5 324 715). Begge proteinene er blitt beskrevet som aggregasjonsinhibitorer, som testet i statiske analyser av kollagenavhengig blodplateaggregasjon.

Til tross for bevist aktivitet in vitro virket LAPP ikke i flere godt etablerte in vivo-modeller (Schaffer, L.W. et al., Arterioscler. Thromb., 193, 13, 1593-1601, og Connolly, T.M. et al., Thromb. Haemostas., 1993, 69, 589). Den myke blodmidd, Ornithodoros moubata, inneholder også et antiblod-plateprotein (moubatin) som er aktivt når det gjelder å forhindre kollagenstimulert blodplateaggregasjon (Waxman, L. et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 5445-49). En annen inhibitor for blodplateaggregasjon fra et blodsugende insekt ble beskrevet i WO 93/09137 av Noeske-Jungblut, C. et al. Smith et al. har isolert et 50 kDa stort protein fra slangegift, og et 19 kDa stort protein ble isolert fra spyttet til Triatoma pallidi-pennis, et blodsugende insekt. Proteinet ble funnet å inneholde en faktor som spesifikt inhiberer kollagenindusert blodplateaggregasjon. Det 19 kDa store protein kalt pallidipin inhiberer kollagenmediert aggregasjon av blodplater i plasma. Ingen inhibering av aggregasjon stimulert ved hjelp av andre effek-torer (ADP, trombin, tromboksan A2-etterligning U46619, forbol-ester) ble påvist. Pallidipin hadde ingen effekt på blodplateadhesjon til kollagen, men inhiberte ATP-frigjørelse fra blodplater. Det reagerte reversibelt med blodplater og kan ha et felles mål med kollagen på dem. Den nøyaktige virkningsmekanisme og den terapeutiske fordel ved dette proteinet er under under-søkelse. Gan et al. beskrev echistatin som en inhibitor som bindes til fibrinogenreseptoren GP-IIa/IIIb (J. Biol. Chem., 1988, 263, 19827-32).

Til tross for disse spennende utviklinger foreligger det stadig et behov for å tilveiebringe ytterligere anti-koagulanter og antitrombin som har forøkt virkningsfullhet ved inhiberingen av koageldannelse, den vWF-induserte blodplateaktivering eller endotelcelleaktivering, og som kan anvendes farmasøytisk og fremstilles i kommersielt passende mengder.

Ettersom ingen av de kjente proteinene som hittil har vært beskrevet har utviklet seg til en forbindelse med ideell terapeutisk profil, besluttet oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse å gå videre med en ny screeningsstrategi for å påvise mer relevante proteiner.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter polypeptid isolert fra H. medicinalis, kjennetegnet ved at det har en molekylvekt på ca. 12000 D + 1 kD med biologisk aktivitet til en inhibitor for kollagenavhengig blodplateadhesjon, som er minst 80 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 over sin hele lengde.

Oppfinnelsen omfatter også isolert polynukleotid, kjennetegnet ved at det koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, som består av en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO: 1, eller en DNA-sekvens som er komplementær til DNA-sekvensen.

Også omfattet av oppfinnelsen er ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen omfatter også vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter oppfinnelsen er ekspresjonssystem, kjennetegnet ved at det omfatter en vertscelle ifølge oppfinnelsen .

Også omfattet av oppfinnelsen er fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at at den omfatter at en vert ifølge oppfinnelsen dyrkes under betingelser som er tilstrekkelige for fremstillingen av polypeptidet, og polypeptidet utvinnes fra kultursupernatanten eller celleresten.

Oppfinnelsen omfatter også atntistoff, kjennetegnet ved at det er immunologisk spesifikt for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 2.

Videre omfatter oppfinnelsen farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et polypeptid oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens for dette.

Til slutt omfatter oppfinnelsen anvendelse av et polypeptid ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et medikament for behandling av tromboemboliske sykdommer.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Ved denne oppfinnelsen er det beskrevet en inhibitor isolert fra H. medicinalis, som virker direkte på kollagen-blodplateinteraksjonen og derved inhiberer blodplateaktivering og tidlig blodplate-blodplateinteraksjon.

Hittil har det ikke vært et positivt eksempel i litteraturen som indikerer at man ved å anvende en screenings-fremgangsmåte som vil utelukke aggregasjonsinhibitorer samt lytiske proteiner fra en kilde av naturlig forekommende forbindelser, kunne identifisere nye antiadhesive mekanismer eller forbindelser. Denne strategien ble imidlertid brukt ved denne oppfinnelsen. Ettersom minst seks forskjellige blodplate-overflateglykoproteiner er kjent for å være involvert i kolla-genadhesjon, og i tillegg flere blodplateavledede forbindelser, slik som Willebrand-faktor, fibronektin og trombospondin, er blitt påvist å være involvert som indirekte mediatorer for kollagen-blodplateadhesjon, har det vært liten optimisme i begynnelsen for å identifisere nye adhesjonsinhibitorer.

Ikke desto mindre ble denne fremgangsmåten brukt til å screene Hirudo medicinalis- spytt fordi man visste at ikke alle de dokumenterte eller ukjente vWF-relaterte inhibitorer samt forbindelser som virker direkte på blodplatereseptorer, kunne utelukkes. Resultatet av screeningen var således en overraskel-se: et nytt protein kalt saratin med antiadhesiv aktivitet for blodplater som kan isoleres fra vev og sekreter fra godt under-søkt igle av arten Hirudo medicinalis.

Foreliggende oppfinnelse omfatter det aktive polypeptid saratin isolert fra iglen Hirudo medicinalis. Proteinet ble isolert fra spytt ved hjelp av en kombinasjon av dialyse under trykk og minst ett kromatografitrinn, som anionbytterkromato-grafi, og minst ett trinn med reversfasekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC). Trykkdialysetrinnet viste seg å være av absolutt avgjørende betydning under utvinningen av saratin fra spytt, ettersom den sterke konsentrasjonen av spytt hjalp til å overvinne det ellers svært store tap av bioaktivt saratin. Det isolerte saratin bindes sterkt til flere kollagener og blokkerer adhesjonen av blodplater til kollagen belagt på slike overflater på en doseavhengig måte.

For å optimalisere screeningskaskaden er det blitt utviklet for tiden tilgjengelige teknikker for å skjelne mellom blodplateadhesjon og blodplateaggregasjon: blodplaters evne til å retardere eller stanse strømning gjennom fibrer, bidraget fra blodplater ved in vitro koageldannelse, glasskuleadhesjons-laboratorier eller helblodsstrømninger gjennom filteret og blod- plateadhesjonen av antikoagulert, blodplaterikt plasma til filteret sammensatt av glassfibrer eller kollagen under en regulert trykkgradient.

Proteinet (kalt saratin) er kjennetegnet ved aminosyresekvensene vist i sekvensen (SEQ ID NO: 2) og utgjøres av 103 aminosyrer som gir en teoretisk relativ molekylvekt på ca. 12068 dalton + 1 kDa. Proteinet har en unik primærstruktur uten noen signifikant likhet med andre, tidligere beskrevne sekvenser. Proteinet er rikt på asparaginsyre og glutaminsyre, noe som bidrar til molekylets lave isoelektriske punkt på pH 3,7 + 0,5, som målt ved hjelp av IEF-PAGE.

SDS-PAGE-analyse demonstrerte et sterkt skifte i mobilitet etter reduksjon av proteinet før elektroforese, noe som indikerer posttranslasjonelle modifikasjoner. Sekvensering av polypeptidet hadde avslørt seks cysteinmolekyler som kunne utgjøre posttranslasjonelle modifikasjoner i proteinet. Elektro-spraymassespektrometri av saratin avslørte en faktisk molekylvekt på 12061, noe som indikerer at opptil tre disulfidbindinger er involvert i dannelsen av sekundærstrukturen til den naturlige form av proteinet. Adhesjonsinhibitoren ifølge foreliggende oppfinnelse er ny, ettersom den atskiller seg fra kjente aggregasjonsinhibitorer isolert fra igler, spesielt fra calin eller LAPP, i molekylvekt, isoelektrisk punkt og aminosyresekvens, og i biologiske aktiviteter.

Det beskrives også isolert DNA som omfatter et polynukleotid som koder for den igleavledede blodplateadhesjons-inhibitor som har aminosyresekvensen som vist for proteinet. Nukleotidsekvensen som utgjør cDNA-klonen, er vist i SEQ ID NO: 1. Stillingene 1-63 i nukleotidsekvensen utgjør en putativ 21-aminosyrers ledersekvens, og stillingene 64-372 inneholder en åpen leseramme som koder for et polypeptid med 103 aminosyre-rester, og en aminosyresekvens som vist for det modne protein i

SEQ ID NO: 2.

Det beskrives også rekombinante vektorer som omfatter det syntetiske gen som koder for den igleavledede blodplate-adhes j onsinhibitor ifølge foreliggende oppfinnelse, og en vertscelle som inneholder de rekombinante vektorene. Fremgangsmåter for utvinning og isolering av de uttrykte proteiner har vært basert på tag-teknologi og/eller er blitt tilpasset fra rense- skjemaet utviklet for det naturlig forekommende saratin. Avhengig av de individuelle protokollene som brukes for ekstra-cellulær eller intracellulær ekspresjon i gjærceller, insektceller, babyhamsternyreceller og E. coli- celler transformert med de passende vektorer, må trinnene for utvinning av det rekombinante protein fra supernatanten eller sedimentene tilpasses ved hjelp av teknikker som er kjent for eksperten. Utmerket ekspresjon ble funnet i E. coli som vert, hvor det ble bidratt til periplasmaekspresjon ved innføyelse av en pelB-ledersekvens. Produkter utvunnet fra Escherichia coli ( E. coli) ble oppnådd (rundt 5 mg/l) etter osmolyse og sentrifugering. Sacharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae) (> 10 mg/l dyrknings-væske) med den alternative gjæropptatte vektor ble brukt i et parallellforsøk. Det utskilte materialet ble isolert ved sentrifugering. Rensing ble oppnådd ved hjelp av krysstrøm-ningsfiltrering og ionebytterkromatografi. Ved andre ekspre-sjonsfremgangsmåter under anvendelse av enten COS-celler eller CHO-celler var produktekspresjon ca. 750 ng/ml. Det rensede rekombinante materialet viste seg å være rent og homogent ved elektroforetisk og kromatografisk analyse og identisk med spytt-avledet saratin, som demonstrert ved hjelp av aminosyresekven-sering og molekylvektbestemmelse.

Det beskrives også fremgangsmåter for rensing av det aktive protein fra urenset spytt fra iglen og måling av dets aktivitet mot blodplater ved hjelp av statiske og dynamiske analysemetoder, samt anvendelsen av denne fremgangsmåten til å isolere rekombinant protein.

Teknikker for fremstillingen av saratin omfatter eksemplene 6, 7, 8 og 13. Ekspresjonsmetodene som skal anvendes, er imidlertid ikke begrenset til disse eksemplene. For eksempel kan også transgene mus eller andre organismer, inkludert andre pattedyr, brukes til å uttrykke saratin.

Proteiner som beskrevet heri omfatter varianter som konserverer aktiviteten til de beskrevne sekvenser, inkludert fragmenter eller underenheter, naturlig forekommende varianter, allelvarianter, vilkårlig genererte kunstige mutanter og påtenkte sekvensvariasjoner, slik som addering som konserverer aktivitet. Fragmenter eller underenheter henviser til hvilken som helst del av sekvensen som inneholder færre aminosyrer enn det komplette protein, f.eks. partielle sekvenser som utelukker deler av N- og/eller C-endene av det fullstendige protein.

Det beskrives videre hybridproteiner, slik som fusjons-proteiner, eller proteiner som skriver seg fra ekspresjonen av multiple gener i ekspresjonsvektoren, og kan omfatte et polypeptid som har den spesifikke aktivitet til et beskrevet protein bundet ved hjelp av peptidbindinger til et andre polypeptid. Også andre varianter av proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse er inkludert, spesielt alle varianter som atskiller seg fra det isolerte protein bare ved hjelp av konservativ amino-syresubstitusjon. Slike konservative aminosyresubstitusjoner er definert av Taylor et al., J. Mol. Biol., 1986, 188, 233.

Også inkludert er fremgangsmåter for anvendelse av proteinene for å forhindre eller forsinke blodplateaktivering ved inhibering av kollagen-blodplateinteraksjoner. Proteinet er nyttig ved forhindringen, profylaksen, terapien og behandlingen av trombotiske sykdommer. I motsetning til alle disse tidligere beskrevne proteiner, som virker ved forskjellige overflate-proteiner på blodplaten, har proteinet fra denne oppfinnelsen en unik virkningsmekanisme. Det bindes tett til kollagenoverflaten, og én virkningsmekanisme gis ved dekningen av spesifikke kolla-gensider som ikke lenger er tilgjengelig for interaksjoner og binding av blodplater. Denne typen ny mekanisme har den store fordel at blodplatene forblir funksjonelt intakte under applika-sjonen av proteinet, slik at det forventes svært lav eller til og med ingen blødningstilbøyelighet fra denne behandlingen.

Et annet viktig område for anvendelse er behandlingen av forskjellige overflater med proteinet for å gjøre dem ikke-adhesive for blodplater, og derved skape blodkompatible anordninger .

Som angitt ovenfor, er polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse egnet som farmasøytisk effektive forbindelser i farmasøytiske preparater og kombinasjoner. De farmasøytiske preparatene som beskrevet heri kan eventuelt omfatte ytterligere aktive bestanddeler som aspirin, antikoagulasjonsmidler, slik som hirudin eller heparin, eller trombolytiske midler, slik som plasminogenaktivator eller streptokinase.

Det nye polypeptidet beskrevet heri kan danne farma-søytisk akseptable salter med enhver ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Uorganiske syrer er f.eks. saltsyre, hydr-bromsyre, svovelsyre eller fosforsyre, og slike sure metall-salter som natriummonohydrogenortofosfat og kaliumhydrogen-sulfat. Eksempler på organiske syrer er mono-, di- og tri-karboksylsyrene, slik som eddiksyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eple-syre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, maleinsyre, hydroksy-maleinsyre, benzosyre, hydroksybenzosyre, fenyleddiksyre, kanel-syre, salisylsyre og sulfonsyrer, slik som metansulfonsyre. Salter av den karboksyterminale aminosyrerest omfatter de ikke-toksiske karboksylsyresaltene som dannes med hvilke som helst egnede uorganiske eller organiske baser. Disse saltene omfatter f.eks. slike alkalimetaller som natrium og kalium, jordalkali-metaller, slik som kalsium og magnesium, lettmetaller fra gruppe Illa, inkludert aluminium, og organiske primære, sekundære og tertiære aminer, slik som trialkylaminer, inkludert trietylamin, prokain, dibenzylamin, 1-etenamin, N,N'-dibenzyletylendiamin, dihydroabietylamin og N-alkylpiperidin.

Slik det her er brukt, betyr uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" et inert, ikke-toksisk, fast eller flytende fyllstoff, fortynningsmiddel eller innkapslingsmateriale som ikke reagerer på ugunstig måte med den aktive forbindelse eller med pasienten. Passende, fortrinnsvis flytende, bærere er vel kjent innen teknikken, slik som sterilt vann, saltoppløsning, vandig dekstrose, sukkeroppløsninger, etanol, glykoler og oljer, inkludert dem av jordolje-, animalsk, vegetabilsk eller syntet-isk opprinnelse, f.eks. peanøttolje, soyabønneolje og mineral-olje.

Preparatene som beskrives heri kan administreres som enhetsdoser som inneholder vanlige, ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable bærere, fortynnere, adjuvanser og vehikler som er typiske for parenteral administrering.

Uttrykket "parenteral" omfatter her subkutan, intra-venøs, intraartikulær og intratrakeal injeksjon, og infusjons-teknikker. Også andre administreringsmåter, slik som oral administrering og topisk applikasjon, er egnet. Parenterale preparater og kombinasjoner administreres helst intravenøst, enten i en bolusform eller som en konstant innsprøyting i henhold til kjente fremgangsmåter.

Tabletter og kapsler for oral administrering inneholder vanlige eksipienser, slik som bindemidler, fyllstoffer, fortyn-ningsmidler, tabletteringsmidler, smøremidler, desintegrasjons-midler og fuktemidler. Tablettene kan belegges i henhold til metoder som er vel kjent innen teknikken.

Orale flytende preparater kan være i form av vann-eller oljesuspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper eller eliksirer, eller kan presenteres som et tørrprodukt for re-konstituering med vann eller annet egnet vehikkel før bruk. Slike flytende preparater kan inneholde vanlige additiver som oppslemmingsmidler, emulgeringsmidler, ikke-vandige vehikler og konserveringsmidler. Topiske applikasjoner kan være i form av vann- eller oljesuspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, geleer eller fortrinnsvis emulsjonssalver.

Enhetsdoser kan inneholde daglig påkrevde mengder av proteinet som beskrevet heri, eller undermultipler derav som til sammen utgjør den ønskede dose. Den optimale, terapeutisk akseptable dosering og dosehastighet for en bestemt pasient (pattedyr, inkludert mennesker) avhenger av mange forskjellige faktorer, slik som aktiviteten til det bestemte aktive materialet som anvendes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjønnet, kosten, administreringstiden og -veien, utskillingshastigheten, formålet for behandling, det vil si terapi eller profylakse, og typen av den trombotiske sykdom som skal behandles, antiblodplate- eller antikoagulasjonsaktivitet.

I preparater og kombinasjoner som kan anvendes som antitrombotiske midler hos en behandlet pasient ( in vivo), er derfor den farmasøytisk effektive daglige dose av peptidene beskrevet heri mellom ca. 0,01 og 100 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis mellom 0,1 og 10 mg/kg kroppsvekt. Alt etter appli-kasjonsformene kan én enkeltdose inneholde mellom 0,5 og 10 mg av trombininhibitoren. For å oppnå en antikoagulasjonseffekt i utenomkroppslig blod er en farmasøytisk effektiv mengde av peptidene mellom 0,2 og 150 mg/l, fortrinnsvis mellom 1 mg og 10 mg/l utenomkroppslig blod.

Det er også et formål å tilveiebringe en implanterbar eller utenomkroppslig medisinsk anordning for bruk i kontakt med kroppsvæsker, for å gjøre anordningsoverflaten i det vesentlige tromboresistent, belagt med et immobilisert polypeptid som definert ovenfor og i kravene. Polypeptidet beskrevet heri immobiliseres på en medisinsk anordning for å gjøre overflaten biokompatibel og tromberesistent. Slike anordninger har noen ganger overflateegenskaper som typisk induserer blodplate-aggregas jon, noe som er en ulempe ved deres påtenkte anvendelser i implanterbare og utenomkroppslige anordninger i kontakt med blod eller andre kroppsvæsker. Eksempler på slike anordninger som vanligvis lages av plastmaterialer og syntetiske fibrer, er proteser, kunstige organer, øyelinser, suturer, kunstige vaskulære segmenter, katetre, dialysedeler, rør og kar som bærer blod.

Posterior kapselopasifisering (PCO) er en vanlig komplikasjon etter kataraktekstraksjon, til tross for de moderne kirurgiske teknikker og linser som anvendes til denne fremgangsmåten. PCO forårsakes av proliferasjonen og migreringen av linseepitelceller over posteriorkapselen, som derved reduserer synsskarpheten. Fysiske behandlinger samt kjemisk modifiserte linser har vært foreslått for å redusere dannelsen av PCO. Heparinlinsebelegg eller topiske heparinøyedråper er blitt brukt til å redusere PCO, noe som indikerer at trombogene mekanismer er involvert i dannelsen av PCO.

Saratin er blitt påvist å ha signifikante fordeler sammenlignet med heparin ved forhindring og blokkering av trombogenisitet. Det er derfor et annet trekk ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe et belegg som omfatter saratin, som reduserer trombogenisitet i linsematerialet brukt til lys-brytende øyeimplantater for fremre eller bakre kammer, som kan implanteres kirurgisk i øyet. Denne nye typen belegg unngår problemer som fås ved stimulert cellevekst. I kombinasjon med andre medikamenter som f.eks. bidrar til celledød, hjelper saratinbelegg til å fullstendig overvinne posterior kapsel-opasif isering.

Kort beskrivelse av figurene

Detaljer i figurene er forklart i eksemplene 1-10.

Figur 1

Separasjon av spyttkomponenter. Eluering av saratin er merket med<*>. ;a) viser separasjonsprofilen for spytt etter DEAE-anionbytting. Saratinfraksjoner er blitt samlet opp fra topp 3 ;(eksempel 2). ;b) viser rekromatografi av sammenslåtte fraksjoner på mono Q HR5/5. Prøver er blitt tatt fra den siste delen av hovedtoppen, som angitt ved hjelp av stolpe (eksempel 2). c) viser siste kromatografitrinn på halvpreparativ analytisk RP-HPLC av positive fraksjoner av saratin samlet opp ;fra mono Q HR5/5 (eksempel 2). Aktivt saratin ble utvunnet fra hovedtoppen (topp 3). ;Figur 2 ;SDS-PAGE av fraksjoner samlet opp fra RP-HPLC. Positive fraksjoner av saratin er merket<*>(eksemplene 2 og 3).

Figur 3

E. coli-ekspresjonsvektor for saratin (eksempel 7).

Figur 4

Baculodonorplasmid for saratin (eksempel 8).

Figur 5

Helblod er blitt eksponert for en kunstig kollagen-overflate og blodplateadhesjon er blitt visualisert ved farging. Saratin er blitt brukt som en inhibitor (protein nr. 607)

(eksempel 9).

Figur 6

Inhibering av blodplateadhesjon på kollagentype III-belagte dekkglass under skjærbetingelser. Sammenligning av spytt og saratin (eksempel 9).

Figur 7

Saratin utviser doseavhengig inhibering av blodplate-bindingsadhesjon til kollagen, type III-belagte dekkglass under skjærbetingelser (eksempel 9) .

Figur 8

Gjærekspresjonsvektor for saratin (eksempel 13).

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Eksempel 1

Screening av adhesjonsinhibitorer

Blodplateadhesjon til kollagen har vært den funksjonelle bakgrunn for screening av salivakomponenter. I tillegg er fire ytterligere tester som er tilgjengelige for fastleggelsen av forskjellige virkninger av antitrombotiske legemidler, slik som AZOCOLL-analysen, amidaseaktivitetsanalysen, von Willebrand-avhengig bindingsanalyse og blodplateaggregasjonsanalyse, blitt brukt til å utelukke funksjonelle egenskaper som ideelt sett ikke ville bli forbundet med en adhesjonsinhibitor. Selv om flesteparten av disse analysene som her er brukt er standard-analyser, måtte blodplateadhesjonsanalysen modifiseres for å passe til våre spesifikke behov. I korte trekk: Hornkollagen (Nycomed) er blitt belagt på 96-brønners plater (Nunc) ved å anvende surgjort kollagen ved en konsentrasjon på 20 ug/ml, og inkubere platene over natten. Etter vasking av platene tre ganger med PBS er restoverflaten til brønnene blitt blokkert med 1 % BSA. Blodplater nyisolert fra humant sitronylert blod er blitt tilsatt samtidig med fraksjoner utvunnet fra de individuelle kolonnetrinn. Når det har vært påkrevd, er foraktiver-ing av blodplater blitt utført ved å inkubere blodplater før bruk i TBS i nærvær av toverdige magnesiumioner. Råspytt, standardisert til en total proteinkonsentrasjon på 200^g/ml er blitt brukt som en standard for å sammenligne med hensyn til inhibitoraktivitet. Blodplateinhiberingsanalysen viste seg å være svært ømfintlig for bufferendringer og forhøyede salt-konsentrasjoner. Ettersom alle prøvene er blitt bearbeidet ved hjelp av ionebytterkromatografi, viste den direkte testing av fraksjonene i inhiberingsanalysen seg å være komplisert og upålitelig. Alle prøvene som skulle testes, er derfor blitt ført til et Centricon-basert konsentrasjonstrinn som samtidig redu-serte ionestyrke og understøtter konsentrering før måling.

Eksempel 2

Rensing av en naturlig inhibitor

Oppfinnelsen gjorde bruk av spytt samlet fra H. medicinalis, som er kjent for å inneholde en rekke bioaktive proteiner, slik som hirudin, elastaseinhibitorer, kollagenaser og blodplateaggregasjonsinhibitorer, slik som calin (Munro, R. et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) og LAPP (Schaffer, L.W. et al., Arterioscler. Thromb., 193, 13, 1593-1601). Foruten disse karakteriserte proteiner er hoveddelen av de omtrent 80 proteiner som er påvisbare ved hjelp av SDS-PAGE, fortsatt ukjente. Ved foreliggende oppfinnelse ble det fraksjonerte spytt og screeningsstrategien som beskrevet i eksempel 1 brukt for å screene med hensyn til de nye proteinene som virker inn direkte på blodplatekollageninteraksjon.

Separasjon av en adhesjonsinhibitoraktivitet fra urenset spytt viste seg å være en kritisk oppgave, hovedsakelig på grunn av det irreversible tap av mesteparten av adhesjons-inhibitoraktiviteten i det første kromatografiske trinn. Additiver, slik som 12 % etanol og toverdige kationer som anbefalt av Munro, R. et al., forbedret ikke situasjonen. Den høye salt-konsentrasjonen i spyttet i kombinasjon med den lave totale proteinkonsentrasjonen (190-250 ug/ml) krevde imidlertid en startkonsentrasjon eller et bufferbyttetrinn. Flere strategier for anrikning, konsentrering eller bufferutbytting ble således undersøkt. Tradisjonell dialyse førte til fullstendig tap av aktivitet. Flesteparten av de øvrige standardteknikker, slik som ionebyttere, affinitetskolonner, størrelsesutelukkelse (tap var uavhengig av kolonneharpiksen) var mislykket, uavhengig av typen separasjonsteknikk eller bufferen og additivene som ble brukt. Overraskende viste det seg at dialyse under trykk av 500 ml spytt var en vellykket metode for å konsentrere spyttproteinene (ca. 30-40 ganger), og samtidig bli kvitt de uønskede buffer-komponenter. Uventet var spyttråmaterialet som ble bearbeidet på denne måten, et ideelt utgangsmateriale for videre rensing, og utvinningen av bioaktive antiadhesive komponenter fra spyttet var ikke lenger et virkelig problem. Ettersom kationbyttere eller affinitetskolonner viste seg å være et utilstrekkelig rensetrinn, ble det brukt svak anionbytter, slik som DEAE-Fast-flow eller EMD-DEAE-Fractogel. 12 % etanol og toverdige kationer ble testet, resultatene var imidlertid like med eller uten disse additivene. Videre optimalisering av kromatografitrinnene førte til en sekvens med DEAE-kolonne, mono Q-kolonne og som et slutt-trinn en reversfase-RP18-kolonne. Optimalisering av de kromatografiske betingelsene er blitt utført på et BiaCore kromatografisk system under anvendelse av analytiske kolonner som er tilgjengelige fra Pharmacia. Gradientene som ble brukt for å operere DEAE-kolonnen, mono Q-kolonnen og RP18-kolonnene, er gjengitt i figurene la, b, c. Den BiaCore-baserte separasjon er blitt oppskalert ved å anvende FPLC-teknikker. De optimaliserte kjørebetingelsene er blitt direkte konvertert til en halvpreparativ skala for separasjon ved å følge instruksjonen til produsenten, bortsett fra RP18-kolonnetrinnet som ble opprett-holdt med BiaCore-teknikk for å minimalisere tap av renset materiale. Utvinning av renset protein fra det siste kromatografiske RP-trinn ble gjort ved hjelp av hurtigvakuumsentri-fugering. Prøver samlet opp fra det siste RP-trinnet, er blitt samlet opp og analysert ved hjelp av SDS-PAGE (figur 2). Etter-følgende prøver er blitt oppslemmet på nytt i PBS og brukt til å utføre analytiske så vel som funksjonelle tester. Vanligvis ble det utvunnet et utbytte på ca. 750^g/1 saratin fra ubearbeidet spytt.

Eksempel 3

Biokjemisk karakterisering

Rensing av saratin, som beskrevet i eksempel 1, førte til et i det vesentlige rent protein med en tilsynelatende molekylvekt på ca. 21 kDa vist under reduserende betingelser i SDS-PAGE (figur 2). Den fullstendige aminosyresekvens ble erholdt ved hjelp av direkte sekvensering av de første 48 aminosyrene i det rensede protein, og ble fullført ved hjelp av sekvenseringen av flere interne peptider frembrakt via enzymatisk nedbrytning. Den fullstendige proteinsekvens er beskrevet i SEQ ID NO: 2.

Proteinet er sammensatt av 103 aminosyrer med beregnet molekylvekt å 12067,9, og en faktisk molekylvekt på 12061,1 som utledet ved hjelp av ESI-massespektrometri. Denne forskjellen i teoretisk og målt molekylvekt indikerer at alle seks cysteinene identifisert i saratin er involvert i dannelsen av S-S-broer. Dette funn understøttes av observasjonen av en sterk endring i mobilitet for proteinet når det kromatograferes i SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser. Proteinet er dessuten rikt på sure aminosyrer, slik som Glu og Asp. Isoelektrisk fokusering under anvendelse av IEF-PAGE-teknikk (Immobiline) avslørte et isoelektrisk punkt på pH 3,7 ± 0,5. I en sammenlignende undersøkelse har vi brukt renset igleprotein som en referanse og sammenlignet det med de fysikalsk-kjemiske egen-skapene til rekombinant saratin utvunnet fra baculo-, gjær- og E. coli-ekspresjon. Alle tre proteinene viste seg å være identiske i sine egenskaper. Karakterisering av protein ved hjelp av SDS-PAGE visualisert ved hjelp av Coomassie (figur 2) eller sølvfarging og/eller Western blot-analyse avslørte at proteinet var homogent og i en ikke-glykosylert form.

Eksempel 4

itiRNA- f rems tilling og cDNA- syntese

RNA ble fremstilt fra den medisinske igle Hirudo medicinalis, ved å anvende guanidintiocyanatmetoden. mRNA ble renset fra total-RNA ved å anvende "01igotex"-mRNA-sett

(QIAGEN).

cDNA ble syntetisert ved å anvende "Marathon"-cDNA-amplifikasjonssett (CLONTECH). DNA-sekvensen som koder for saratin, ble først amplifisert ved å anvende PCR-oligonukleotid-primere i henholdt til instruksjonen fra leverandøren. Etter cDNA-syntese ble en universaladaptor ligert til begge endene av cDNA. Sekvensene til universaladaptoren og universalprimerne API eller AP2 ble valgt i henhold til instruksjonene fra leveran-dørene av settet.

Eksempel 5

Amplifikasjon og isolering av saratingenet ved hjelp av PCR

Degenererte primere er blitt syntetisert, basert på den nærmeste N-ende av den reverstranslaterte saratinaminosyre-sekvens.

Disse primerne 01 og 02 er blitt utformet for å hybri-disere spesifikt til 5'-enden av saratin-cDNA. Primerutformingen var basert på den reverstranslaterte aminosyresekvens til de eksperimentelt bestemte 8 N-terminale aminosyrene i det rensede saratinprotein. De to primerne, primer 01 og primer 02, ble syntetisert for å holde degenerasjonen så lav som mulig, og for å gi primerne en strekning med 8 basepar med perfekt tilpasning til saratin-cDNA-sekvensen i den avgjørende 3'-ende for å sikre virkningsfull og spesifikk amplifikasjon av templat-cDNA. Ifølge DNA-degenerasjonsalfabetet (IUPAC-kode): R = A eller G; M = A eller C; Y = C eller T; og N = A eller G eller C eller T.

En 3'-RACE-PCR-reaksjon ble utført ved å anvende en blanding av primer 01 og primer 02, og én universalprimer API eller AP2. PCR-produkter ble klonet i TA-kloningsvektor pCR2.1 eller pCR-Script-SK(+)-vektor og sekvensert. Etter sekvensering av flere av de erholdte 3'-RACE-PCR-fragmenter ble saratingen-sekvensen erholdt, bortsett fra den 5'-utranslaterte region, signalpeptidsekvensen og sekvensen som koder for de første 8 aminosyrene fra N-enden av det fullt ferdige protein. For å oppnå denne manglende saratin-cDNA-sekvensinformasjon ble det utført et 5'-RACE-forsøk ved å anvende en genspesifikk primer fra midten av saratin-cDNA og én fra universalprimer API eller AP2. Etter sekvensering av flere av de resulterende 5'-RACE-PCR-fragmenter ble den fullstendige saratingensekvens oppnådd. Amplifisering av saratingenet ved hjelp av PCR under anvendelse av genspesifikke, ikke-degenererte primere fra både 3'-enden og 5'-enden av saratingenet ble det oppnådd en hel lengde saratin-gen.

DNA-sekvensering ble utført med mer enn 15 forskjellige PCR-kloner. Bare én signifikant endring som forårsaket amino-syresekvensendring i bare én klon, ble imidlertid funnet. Det er svært sannsynlig at denne endringen var forårsaket av PCR. Fem andre stille endringer som ikke forårsaker aminosyresekvens-endring, ble funnet. Det er således usannsynlig at disse endringene var forårsaket av PCR, ettersom de samme endringene ble funnet i forskjellige kloner.

Saratingen-ORF er 372 bp stort og inneholder en

21 aminosyrers signalsekvens og en 103 aminosyrers sekvens som koder for det fullt ferdige protein. Aminosyresekvensen utledet fra PCR-klonen ble funnet å være identisk med sekvensen som ble oppnådd ved sekvensering av det naturlige spyttutvunne protein.

Eksempel 6

Ekspresjon i COS- celler og påvisningen av det uttrykte protein

For å utrykke saratingen i pattedyrceller, slik som COS eller CHO, ble saratin-gen kuttet fra vektor pCR-Script-SK(+) under anvendelse av Xhol + Xbal og klonet i pattedyrcelleekspre-sjonsvektor pCl-neo (Promega). pCl-neo ble valgt fordi den inneholder T7- og T3-promoter for in vitro-ekspresjon og neomycin-resistent gen for G418-seleksjon, og kan anvendes i både COS- og CHO-celler.

I tillegg til signalsekvensen og sekvensen for fullt ferdig protein inneholder innføyelsen en Koz-sekvens i 5'-enden for virkningsfull translasjon og His-tag-MRGS(H)6i 3'-enden (C-terminal) for påvisning av proteinekspresjon, -rensing og -konsentrering. Plasmidkonstruksjonen ble kalt pNC-31. pNC-31-plasmid-DNA ble brukt til transfeksjonen av COS-celler. COS-cellene som vokser ved log-fase, ble vasket to ganger med PBS og oppløst i PBS ved en konsentrasjon på 1 x 107/ml. Så ble 12^g plasmid-DNA (mindre enn 50^1 i H20 eller TE-buffer) tilsatt i 0,7-0,8 ml COS-cellesuspensjon og blandet i en elektroporasjonskyvette. Elektroporasjon ble utført ved 1,9 kv, 25 \ iFD i 10 minutter og overført til en 90 mm plate. Etter tilsetning av 8 ml DMEM-medium inneholdende 10 % FCS og antibiotika ble cellene dyrket i 3 dager. Supernatanten og cellene er blitt brukt for videre isolering av protein og påvisning. Det uttrykte protein ble påvist ved hjelp av Western blotting-metode under anvendelse av anti-MRGS (H)6-antistoff. Rensing ble utført ved å anvende slike chelatorer som NTA eller imidoeddiksyre immobilisert på en kolonnematriks og modifisert med metallioner, slik som Co, Ni eller Cu.

Eksempel 7

Konstruksjon av E . coli- ekspresjonsvektoren og ekspresjon

På grunn av den variable kodonbruk i forskjellige biologiske systemer anvendes noen kodoner svært sjeldent i E. coli. For å muliggjøre ekspresjon i optimalisert versjon i E. coli måtte genet omdannes til E. coli-kodonbruk i henhold til standardfremgangsmåter.

Ekspresjonen i E. coli ble utført ved å anvende en modifisert versjon av plasmidet pASK75 som bærer tet-promoter- regionen (Skerra, A. et al., Gene, 1994, 151, 131-135). I korte trekk: Modifikasjonen ble gjort ved å klone en ny linker mellom Xbal- og Hindlll-setene (figur 3). Den nye linkeren inneholder ompA-ledersekvensen, et annet multippelkloningssete og et 6xHis-merke i stedet for strep-merket.

For å konstruere ekspresjonsvektoren for saratin var det nødvendig å innføre 5'-ClaI- og 3'Eco47III-restriksjonssetene ved hjelp av PCR-metoden. 5'-primer 03 og 3'-primer 04 ble derfor brukt. PCR-produktet ble først klonet i PCRII-vektor-systemet (Invitrogen) og sekvensert. I et andre trinn ble saratingenet klonet i den modifiserte pASK75-vektor under anvendelse av restriksjonssetene 5'ClaI og Hindlll.

Etter å ha uttrykt og bevist aktiviteten til dette rekombinante seratin i en andre PCR-reaksjon, ble His-merket fjernet og startkodonet til saratingenet ble kondensert direkte til ompA-ledersekvensen. 5'-primer 05 og 3'-primer 06 for denne PCR-reaksjonen er gjengitt i sekvenslisten.

Som et eksempel på ekspresjonen i E. coli ble ekspresjonsvektoren pRG72 (figur 3) som inneholder strukturgenet til saratin kondensert til ompA-ledersekvensen, transformert i W3110-kompetente celler. Celler er blitt indusert etter at de er blitt dyrket til midt-log-fase. 1 time deretter kunne det rekombinante sarastatin klart påvises.

Eksempel 8

Konstruksjon av baculodonorplasmidet og ekspresjon

For ekspresjon av saratin i baculovirusekspresjons-systemet ble "Bac-To-Bac"-baculovirusekspresjonssystemet fra Gibco Life Technologies brukt. For å få et seleksjonssystem ble honningbie-melitinsekvensen kondensert til saratingenet, og for å innføre restriksjonssetene 5'BamHI og 3'KpnI ble det utført en enkelt PCR-reaksjon ved å anvende 5'-primer 07 og 3'-primer 08. Det tilsvarende PCR-produkt ble klonet i PCRII-vektoren (Invitrogen) og sekvensert. Så ble melitin-saratinfusjonen klonet i pFastBac-vektoren under anvendelse av restriksjonssetene 5'BamHI og 3'KpnI, noe som resulterer i pTDl3 (figur 4). Generering av rekombinante baculovirus og saratinekspresjon ble utført med "Bac-To-Bac"-ekspresjonssystemet. Donorplasmidet pTD13 ble transformert i DHlOBac-kompetente celler som inne holder bakmidet, med et mini-attTn7-målsete og hjelperplasmidet. Mini-Tn7-elementet på donorplasmidet kan overflyttes til et mini-attTn7-målsete på bakmidet i nærvær av overføringsproteiner tilveiebrakt ved hjelp av hjelperplasmidet. Kolonier som inneholder rekombinante bakmider, ble identifisert ved oppbrytning av lacZ-genet. Miniprep-DNA med høy molekylvekt fremstilles fra utvalgte E. coli-kloner som inneholder det rekombinante bakmid, og dette DNA ble så brukt til å transfektere insektceller. Nærmere beskrivelser er inkludert i instruksjonshåndboken for ekspresjonssettet.

Eksempel 9

Blodplateadhesjon til kollagen under strømningsbetingelser

( dynamisk analyse)

I blodplateadhesjonsanalysen perfunderes helt menneske-blod gjennom et parallelt strømningskammer for å undersøke blodplaters adhesive aktivitet på et kollagenbelagt dekkglass under høy skjærstrømning (som simulerer arteriebetingelser in vivo) , som opprinnelig beskrevet av Sakariassen et al. (Meth. Enz., 1988, 169, 37-70). Humant livmorkollagen, type III (Sigma), opp-løseliggjort i 50 mmol/1 eddiksyre ble sprayet på rengjorte dekkglass (18 mm x 18 mm) med en retusjeringstrykkbørste. Dekkglass ble lagret i BPS ved 4 °C over natten.

Nyuttatt humant helblod (antikoagulert med heparin med lav molekylvekt, 20 U/ml) ble forvarmet ved 37 °C i 10 minutter før det ble brukt. Preparater av proteiner ifølge denne oppfinnelsen ble pipettert på dekkglass (30^1 pr. dekkglass) og inkubert i 10 minutter i et fuktkammer ved romtemperatur før de ble innsatt i perfusjonskammeret. Blodet fikk perfundere gjennom kammeret (ved 37 °C i 5 minutter ved en skjærhastighet på

1300 sekunder-1) .

Deretter ble dekkglassene fjernet, vasket i PBS og fiksert i 0,25 % glutaraldehyd i 30 minutter, og deretter farget med May-Grunwald Giemsa. Figur 9 viser et typisk eksempel. Omfattende dekning med fargede blodplater ses i den ubehandlede kontrolloverflaten. En sammenlignbar overflate forbehandlet med saratin viser dramatisk redusert (med 80 %) blodplatebinding. Blodplateadhesjon ble kvantifisert med et lysmikroskop, som vist i figur 5 (forstørrelse x 1000) koblet til et datamaskinstyrt bildeanalyseapparat (Leica). Resultater ble uttrykt som prosent-andelen av overflaten dekket med blodplater og blodplateaggre-gater.

Sammenligning av spyttinhibitoraktivitet er blitt gjort med renset protein, som vist i figur 6. Blodplateadhesjon på belagte dekkglass av kollagentype III med en skjærhastighet på 1300 sekunder<-1>med urenset spytt (nr. 616) ga en inhibering på ca. 48 % sammenlignet med kontroll. Renset protein (nr. 607, saratin) viste en reduksjon i blodplateavsetning på ca. 81 % ved standardiserte proteinkonsentrasjoner. Inhiberingen indusert ved hjelp av saratin øker på en doseavhengig måte med høyere konsen-trasjoner av renset protein, som vist i figur 7.

Eksempel 10

Immunisering og antistoffer

Med det første partiet av høyrenset naturlig protein som er tilgjengelig, er immunisering av dyr blitt startet med en gang. Immunsera ble frembrakt i kaniner, og reagenser ved høy titer var tilgjengelig for videre screening. Ytterligere anti-sera ble tilgjengelige når peptidsekvensen til det komplette protein var tilgjengelig, og tre syntetiske peptider er blitt syntetisert (aminosyresekvensene 83-103, 13-30 og 58-69) , koblet til KLH med en standard linkerfremgangsmåte og brukt til immunisering. Tre sera er rettet mot et N-terminalt peptidsegment og to sera som er spesifikke for C-terminale peptider, er blitt etablert. Med immunseraene med høy titer som er tilgjengelige, er det blitt mulig å etablere og bruke ELISA-teknikk for å over-våke og kvantifisere rensing av naturlig protein så vel som rekombinant protein. Tidsforbruket og arbeidsintensiv blodplate-inhiberingsanalyse kan således erstattes og ble anvendt bare for å bekrefte inhibitorpotensialet til sluttrenset protein.

Eksempel 11

Immunanalyser for beregning av saratinbinding

Surgjort hornkollagen (Nycomed) er blitt brukt til be-leggingen av 96-brønners mikrotiterplater (Nunc). 50^1 av kollagenoppløsningen (20^g/ml) er blitt brukt til å belegge plater over natten. Før testing er platene blitt vasket tre ganger med PBS og er blitt inkubert med en BSA-oppløsning (1 %) for å forhindre ikke-spesifikk adhesjon. 50^1 saratin er blitt i seriefortynning, og det er blitt inkubert i 1 time. Plater ble vasket tre ganger før applikasjon av antisaratinantistoff for påvisning. Etter ytterligere 1 times inkubasjonstrinn er over-flødig antistoff blitt fjernet, og et andre biotinmerket antistoff er blitt brukt for påvisning. Utlesning er blitt utført via streptavidin-POD-katalysert fargereaksjon med substrater, slik som ODB-tabletter (Dako), målt ved 490 nm.

Eksempel 12

Konkurranseanalyse for screening av inhibitorer

Rekombinant merket saratin (His-merke) fremstilt som beskrevet i eksempel 7 er blitt sammenlignet med naturlig forekommende, umerket saratin med hensyn til kollagenbinding. Blodplater belagt med surt hornkollagen (Nycomed) er blitt fremstilt som beskrevet i eksempel 11. Påvisning ble utført med kaninanti-saratinantistoffer. De merkede og umerkede saratiner viste identiske bindingsegenskaper. Alternativt er den umerkede saratin-versjon blitt modifisert ved hjelp av biotinylering (Pierce, biotinyleringssett) og sammenlignet med umodifisert saratin. Bindingsegenskaper til kollagen har vært identiske. Dessuten er det blitt utført forsøk ved å anvende det biotinylerte saratin for å krysskonkurrere med umodifisert saratin, peptider, spytt-utvunnet saratin, fullstendig spytt eller antistoffer rettet mot saratin. Binding av de forskjellige "konkurrenter" til kollagen er blitt testet ved å beregne bindingen av biotinylert saratin under anvendelse av et streptavidin-POD-konjugat og ODB-substratreaksjon for påvisning. Denne analysen som omfatter biotinylert saratin, ble vanligvis brukt til beregningen av saratinkonsentrasjon i spytt (750 \ ig/ l) , epitopkartlegging av saratinrettede antistoffer, evaluering av bioaktivt saratin, mutert saratin. For å undersøke potensialet til analysen er det blitt brukt både blokkerende og ikke-blokkerende antisaratin-antistof f er frembrakt med spesifikke saratinpeptider.

Eksempel 13

Gjærekspresjonsvektor og ekspresjon

Pichia-multikopiekspresjonssystemet (Invitrogen) er blitt brukt som et typisk eksempel på gjærekspresjon. Konstruk- jonen av gjærekspresjonsvektoren er vist i figur 8. For frem-ringelse av ekspresjonsvektoren for saratin er PCR-amplifika-jonsmetoden blitt brukt for å generere restriksjonsender (5'EcoRI, 3'Noti) som er kompatible med ligeringen i den passende vektor (pPIC9K). Den følgende 5'-primer 09 og 3'-primer 10.

Før transformering av Pichia-sfæroplastene er ekspresjonsvektoren blitt linearisert med Sali. Kolonier er blitt screenet med hensyn til His<+>Mut<+->positive mutanter for å sikre integrasjon av saratingenet. Typiske dyrkningsbetingelser har vært: 28-30 °C, opp til en optisk tetthet på OD 2-6. Induksjon av ekspresjon ble utført etter nyoppslemming av sentrifugerte celler i medium og tilsetning av metanol opp til en sluttkonsen-trasjon på 0,5 %, og ved å opprettholde denne tilstanden i et lengre tidsrom som vanligvis vil være 24 timer. Etter en vanlig fermentasjonsperiode på 6 dager ble produktet utvunnet fra supernatanten og analysert ved hjelp av SDS-PAGE og ELISA.

Claims (19)

1. Polypeptid isolert fra H. medicinalis,karakterisert vedat det har en molekylvekt på ca. 12000 D + 1 kD med biologisk aktivitet til en inhibitor for kollagenavhengig blodplateadhesjon, som er minst 80 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEQ ID NO: 2 over sin hele lengde.

2. Polypeptid ifølge krav l,hvor det har et isoelektrisk punkt på pH 3,7 + 0,5.

3. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2,hvor det har seks cysteinmolekyler som er i stand til å danne -S-S-broer.

4. Polypeptid ifølge krav 1-3, hvor det omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 2.

5. Isolert polynukleotid, karakterisert vedat det koder for et polypeptid ifølge kravene 1-4, som består av en DNA-sekvens ifølge SEQ ID NO: 1, eller en DNA-sekvens som er komplementær til DNA-sekvensen.

6. Ekspresjonsvektor, karakterisert vedat den omfatter en DNA-sekvens ifølge kravene 5.

7. Vertscelle, karakterisert vedat den omfatter ekspresjonsvektoren ifølge krav 6.

8. Ekspresjonssystem, karakterisert vedat det omfatter en vertscelle ifølge krav 7.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge kravene 1-4, karakterisert vedat den omfatter at en vert ifølge krav 8 dyrkes under betingelser som er tilstrekkelige for fremstillingen av polypeptidet, og polypeptidet utvinnes fra kultursupernatanten eller celleresten.

10. Antistoff, karakterisert vedat det er immunologisk spesifikt for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 2.

11. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter et polypeptid ifølge kravene 1-4 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens for dette.

12. Farmasøytisk aktivt middel ifølge krav 11, for behandling av tromboemboliske prosesser.

13. Farmasøytisk preparat ifølge krav 11 eller 12,karakterisert vedat det omfatter ytterligere legemidler, hvor det ytterligere legemiddel er valgt fra aspirin, heparin eller streptokinase, eller en kombinasjon derav.

14. Anvendelse av et polypeptid ifølge kravene 1-4 til fremstilling av et medikament for behandling av tromboemboliske sykdommer.

15. Anvendelse ifølge krav 14, til belegging av kunstige overflater ex vivo.

16. Anvendelse ifølge krav 14, til modifisering av intraokulare linser ex vivo for å minske trombogenisiteten til linsematerialet.

17. Anvendelse ifølge krav 14, til kontakt med linse-overflaten ex vivo.

18. Anvendelse ifølge kravene 16 eller 17, for kovalent kryssbinding ex vivo for å modifisere linsematerialet.

19. Anvendelse av antistoffer ifølge krav 11 og polypeptid ifølge kravene 1-5 for å måle ex vivo polypeptidet avledet fra krav 10 eller et behandlet individ.