NO330685B1 - Immunogene liposompreparat samt fremgangsmate for fremstilling av dette - Google Patents
Immunogene liposompreparat samt fremgangsmate for fremstilling av dette Download PDFInfo
- Publication number
- NO330685B1 NO330685B1 NO20011406A NO20011406A NO330685B1 NO 330685 B1 NO330685 B1 NO 330685B1 NO 20011406 A NO20011406 A NO 20011406A NO 20011406 A NO20011406 A NO 20011406A NO 330685 B1 NO330685 B1 NO 330685B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- liposome preparation
- preparation according
- immunogenic liposome
- immunogenic
- antigenic
- Prior art date
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims description 108
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 56
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 86
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 77
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 76
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 56
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 54
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 44
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 27
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 20
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 17
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 7
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 6
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 5
- 230000036571 hydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 54
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 48
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 46
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 29
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 29
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 26
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 24
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 239000010408 film Substances 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 16
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 11
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 11
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 8
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 8
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 6
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 6
- CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 1,2-di-O-myristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC CITHEXJVPOWHKC-UUWRZZSWSA-N 0.000 description 5
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- -1 MF5 9 Chemical compound 0.000 description 5
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 229960003724 dimyristoylphosphatidylcholine Drugs 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 5
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 4
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 4
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 3
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 3
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 3
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 3
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 4-o-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 1-o-[2-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoyl]oxyethyl] butanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCC(=O)OCCOC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QLHLYJHNOCILIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150082674 E2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010437 HD domains Human genes 0.000 description 2
- 108050001906 HD domains Proteins 0.000 description 2
- 101000666856 Homo sapiens Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010046117 N-palmitoyl-5,6-dipalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine Proteins 0.000 description 2
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 240000001085 Trapa natans Species 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038388 Vasoactive intestinal polypeptide receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000033687 granuloma formation Effects 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- XVQKZSLOGHBCET-INVHGPFASA-N tripalmitoyl-S-glyceryl-cysteinyl-seryl-serine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CSCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC XVQKZSLOGHBCET-INVHGPFASA-N 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- XZJOLQXTBLAELX-UHFFFAOYSA-N 2-[[1-carboxy-1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)ethyl]disulfanyl]-2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)propanoic acid Chemical compound O=C1CCC(=O)N1C(C(O)=O)(C)SSC(C)(C(O)=O)N1C(=O)CCC1=O XZJOLQXTBLAELX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010082845 Bacteriorhodopsins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007605 Cytochromes b5 Human genes 0.000 description 1
- 108010007167 Cytochromes b5 Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 208000030453 Drug-Related Side Effects and Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710177917 Fimbrial protein Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001030705 Homo sapiens Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038562 Huntingtin Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 235000000072 L-ascorbyl-6-palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 206010046306 Upper respiratory tract infection Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010093857 Viral Hemagglutinins Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N acepromazine Chemical compound C1=C(C(C)=O)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 NOSIYYJFMPDDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005054 acepromazine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960000250 adipic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- XKNKHVGWJDPIRJ-UHFFFAOYSA-N arsanilic acid Chemical class NC1=CC=C([As](O)(O)=O)C=C1 XKNKHVGWJDPIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N dimyristoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005160 dimyristoylphosphatidylglycerol Drugs 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N ditetradecanoyl phosphatidylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC BPHQZTVXXXJVHI-AJQTZOPKSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003370 grooming effect Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 101150113725 hd gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 108010060845 lactose permease Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000003453 lung abscess Diseases 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000003257 protein preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005137 succinic acid Drugs 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oppfinnelsens bakgrunn
Foreliggende oppfinnelse omfatter immunogent liposompreparat samt fremgangsmåte for fremstilling av dette.
Anvendelse av vaksiner har historisk frembrakt en sikker og effektiv metode for å beskytte store populasjoner mot et bredt spekter av infeksjonssykdommer. Immunisering mot virus og andre mikroorganismer er vanligvis sikkert og effek-tivt, og har vært ansvarlig for mye av den forbedring i leve-tid som oppleves hos individer i de utviklede land. Et antall skadelige bivirkninger kan imidlertid oppstå, avhengig av egenskapene til vaksinen og det spesifikke immunogen. Inadekvat inaktivering av intakt virus har tidligere ført til utilsiktede infeksjoner i stedet for beskyttelse etter vaksinasjon (Tigertt, 1959, Military Med., 124:342). Av og til kan immunisering med intakte organismer, slik som influensa, på-skynde utvikling av autoimmune sykdommer rettet mot normalt vev, slik som Guillain Barre-syndromet (Langmuir et al., 1984, J. Epidemiol., 113:841). I tillegg til stoffene selv kan tilstedeværelse av substanser fra celler eller komplekse media muliggjøre induksjon av allergiske reaksjoner mot fremmede proteiner (Yamane og Uemura, 1988, Epidem. Inf., 100:291). Siden effektive vaksinasjonsprosedyrer ofte krever flere immuniseringer, kan disse skadelige reaksjoner redusere effektiviteten av vaksinen og kan redusere den alminnelige tole-ranse for vaksinasjonsprosedyren. Moderne molekylærbiologiske teknikker er nylig blitt testet i et forsøk på å frembringe forbedret sikkerhet og effektivitet ved nye vaksinepreparater. Mulige strategier som for tiden undersøkes, omfatter: vaksiner basert på rekombinante DNA-teknikker (Conry et al., 1994, Cancer Res., 54:1164; Hu et al., 1988, J. Virol., 52:176), dannelse av enkle syntetiske peptider som antigener (Nardelli et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 155:459) og direkte injeksjon av genetisk materiale til vev for å stimulere beskyttende responser (Ulmer et al., 1993, Science, 253:1745). I særdeleshet har anvendelse av enkle peptidantigener for å indusere spesifikk immuniseringsrespons vært det sentrale ved mange studier. Denne strategien er attraktiv fordi den har mulighet for å frembringe immunologisk spesifisitet, tettere kontroll av fremstillingsprosessene og eliminering av det meste av sekundære kildematerialer eller forurensende stoffer forbundet med produksjon av immunogenet.
WO 8702250 Al (Moiken) 1986.10.16 angår en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent kompleks bestående av antigener eller antigene determinanter med hydrofobe domener som blandes med en eller flere løsningsmidler og danner komplekser mellom aktuelle antigener og løsningsmidlet.
Anvendelse av rensede proteiner eller peptidfragmen-ter for vaksinasjon avhenger imidlertid av avleveringen av materialet til immuniseringsstedet ved hjelp av en effektiv antigenbærer. Potensielt har en av de sikreste bærerne vært lipid-/liposombaserte vaksinekomplekser. Liposomer har lenge vært etablert som kommersielt tilgjengelig teknologi fordi de kan redusere medikamenttoksisitet, forlenge sirkulasjonen i blodstrømmen og endre biodistribusjonen og farmakokinetikken til medikamentmolekylene (Fujii, 1996, Vesicles, red. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, s. 491). Når liposomer administreres in vivo, sirkulerer de i blodet og fjernes ved monocytt-/makrofagfagocytosesystemet, spesielt i lever, milt, lymfeknuter og lungevev (Claasen, 1996, Vesicles, red. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, s. 649). Liposomenes evne til å styre det antigene distribusjonsmønster antyder at et liposomalt immunogen ville bli maksimalt eksponert for immunsystemet. Frem til i dag er flere lipidbaserte systemer blitt testet, inkludert peptider konjugert til lipider (Nardelli et al., 1992, Vaccines, 8:1405; Watari et al., 1987, J. Exp. Med., 155:459), rekonstitusjon av hele protein-subenheter i nærvær av lipider (Morein og Simons, 1985, Vaccines, 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech, 13:527) og assosiering av proteiner med fordannede liposomer (Therien og Shahum, 1989, Immunol. Lett., 22:253; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166). Mens disse strategier er vist å være immunologisk aktive, gjør tekniske vanskeligheter forbundet med storskalaproduksjon av proteiner og deres lipidbærere, så vel som kostnadsrestriksjoner, dem mindre attraktive som kommersiell teknologi. Følgelig er det behov for et forbedret system eller en fremgangsmåte for å fremstille proteinantigener som gjør nytte av det potensialet som ligger i liposomer for vaksineutvikling.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse frembringer et immunogent liposompreparat, kjennetegnet ved at det omfatter:
vesikkeldannende lipider; og
et antigent proteinkonstrukt som er et vandig, løselig fusjonsprodukt omfattende én eller flere antigen determinanter og et hydrofobt domene, der det hydrofobe domenet er assosiert med membranen til liposompreparatet.
Foreliggende oppfinnelse frembringer også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat, kjennetegnet ved at den omfatter: uttrykking av et gen som koder for et vandig, løselig fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene, og (a) oppløsning av vesikkeldannende lipider og fusjonsproteinet i et egnet organisk løsningsmiddel; dannelse av en lipidfilm eller spraytørket pulver ved fordamping av det organiske løsningsmiddel; hydratisering av lipidfilmen eller pulveret; og dispergering av den hydratiserte lipidfilm eller -pulver for å danne et immunogent liposompreparat,
eller
(b) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer;
hydratisering av enten et lipidpulver eller en lipidfilm med bufferen inneholdende fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmen for å
danne et immunogent liposompreparat, eller
(c) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til på forhånd formede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.
Utfyllende informasjon
Fortrinnsvis er det hydrofobe domenet et peptid, og ifølge én foretrukket utførelsesform bestående av fra ca. 15 til ca. 500 aminosyrerester, mer foretrukket mindre enn 300, og helst mindre enn 50 rester, der minst én eller flere av aminosyrene er valgt fra gruppen bestående av Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.
Ifølge én utførelsesform omfatter det immunogene liposompreparat ytterligere ett eller flere hjelpestoffer. Eksempler på egnede hjelpestoffer omfatter lipofile molekyler, slik som lipid A og andre lipopolysakkarider, Quil A, QS21, MF5 9, P3CSS, MTP-PE, så vel som vannløselige molekyler, inkludert cytokiner, slik som IL-2, IL-4, IL-12, interferonene og lignende. Andre eksempler på cytokiner gis i tabell 1 nedenfor.
Ifølge en annen utførelsesform omfatter det antigene konstrukt ytterligere en linkerregion som forbinder de antigene determinanter med det hydrofobe domenet. I én foretrukket utførelsesform er linkerområdet et peptid bestående av fra 1 til ca. 200 aminosyrerester. Fortrinnsvis er aminosyrerestene naturlig forekommende aminosyrer, slik som Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og/eller Val.
Det beskrives også en fremgangsmåte for å indusere en immunogen respons i et vertsdyr omfattende administrering av en immunogent effektiv mengde av et liposompreparat beskrevet nedenfor. Selv om verten kan være ethvert dyr omfattende fjærkre, er vertsdyret fortrinnsvis et pattedyr, og helst et menneske. I særskilt foretrukne utførelsesformer utgjør det immunogene liposompreparat ett eller flere egnede hjelpestoffer.
Det beskrives videre en DNA-kassett for innføyelse i en vektor omfattende sekvenser som koder for et immunogent fusjonsprotein, der fusjonsproteinet omfatter et hydrofobt proteindomene og én eller flere antigene determinanter.
Det beskrives videre en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; hydratisering av enten lipidpulver eller lipidfilmer med bufferen som inneholder fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmene for å danne et immunogent liposompreparat.
Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til forformede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.
Det beskrives videre en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent lipidemulsjonspreparat omfattende: uttrykking av et gen som koder for et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; og fremstilling av et immunogent lipidemulsjonspreparat ved enhver fremgangsmåte beskrevet ovenfor ved hjelp av en lipid-dispersjon (f.eks. en olje, slik som soyabønneolje) i stedet for liposomer.
Det beskrives også en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposom- eller lipidemulsjonspreparat omfattende: kjemisk syntese av et fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene; og fremstilling av et immunogent liposom- eller lipidemulsjonspreparat ved enhver fremgangsmåte beskrevet ovenfor.
Oppfinnelsen omfatter også et immunogent liposompreparat som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen .
Som anvendt her i dokumentet, betyr "assosiert med membranen" at det hydrofobe domenet i det minste delvis er innstøpt i liposommembranen, og fortrinnsvis ikke er kovalent bundet til de vesikkeldannende lipider. Det hydrofobe domenet kan også være bundet til en lipidfettsyre-"hale" som selv er innstøpt i membranen.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser effektiviteten til et liposompreparat ifølge foreliggende oppfinnelse til å beskytte mot HSV2. Figur 2 viser en sammenligning av effektiviteten til et liposompreparat ifølge oppfinnelsen med andre vaksinepreparater. Figur 3 viser overlevelseskurven for mus som demon-strerer evnen til det liposomale HSV2g(1-23)-HD til å lokke frem en beskyttende immunrespons.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse frembringer et antigen-avleveringssystem utformet for å forbedre effektiviteten og sikkerheten ved immunisering mot en mengde mikrobielle stoffer og cancere. Immunogenet kan kodes av en genkassett som består av et hydrofobt domene (HD) fusjonert med en spesifikk anti-gensekvens. Et plasmid som inneholder nukleinsyresekvensen som koder for HD og den antigene epitop, fremstilles og uttrykkes i en egnet vert, slik som f.eks. E. coli, P. pastoris, insekt-celler, COS-l-celler eller CHO-celler (Genetic Engineering News, 18:11 (1998)). Med en gang proteinet er blitt uttrykt og renset, formuleres det i et liposom. I nærvær av en membran assosierer proteinet med lipidbilaget og danner en stabil struktur med den hydrofobe delen assosiert med membranen og den antigene epitop orientert mot det vandige medium. Plasmidet kan konstrueres med restriksjonsseter på nøkkel-posisjoner slik at forskjellige antigene epitoper enkelt kan substitueres, følgelig frembringes evnen til å utnytte ulike antigene epitoper for å frembringe maksimal beskyttelse etter immunisering. Et av de unike trekk ved denne kassetten er at proteinkomponenten kan produseres i vertscellen i store mengder, renses enkelt og deretter inkorporeres i liposomer. Dette gir maksimal fleksibilitet for å bestemme den mest tilfredsstillende epitop som frembringer beskyttelse mot de mikrobielle stoffer eller fra cancere, samtidig som det virke-lige mål med storskalafremstilling og kommersiell distribu-ering av vaksinen opprettholdes.
Følgelig frembringer foreliggende oppfinnelse flere fordeler: (1) epitoper kan enkelt endres for å frembringe maksimal fleksibilitet ved vaksineutforming; (2) multiple epitoper kan innføyes i bærermolekylet; (3) store antigen-sekvenser (det vil si kappeproteiner eller reseptordomener) eller subenheter kan inkluderes hvis ønskelig; og (4) det uttrykte bærerprotein er vannløselig og kan enkelt renses ved standard proteinfremstillingsmetoder. Syntese av antigen- konstruktet som et vandig, løselig fusjonsprodukt minimali-serer potensielle storskalaproduksjonsproblemer forårsaket av den hydrofobe region til proteinet. Følgelig vil konstruksjon av et protein som har et hydrofobt domene for liposommembran-innføyelse og som fortsatt er vannløselig, være en hoved-fordel. I noen tilfeller kan en liten mengde løseliggjørende stoff, slik som guanidin, urea, natriumdodecylsulfat, oktyl-glukosid eller deoksycholat, anvendes under renseprosedyren. Foreliggende oppfinnelse frembringer også konstrukter som omfatter to eller flere antigener. Slike konstrukter kan betegnes som:
Oppfinnelsen vurderer også anvendelse av naturlig av-ledede eller syntetiske enkle transmembranhelikser, eller heliksbunter (2-12) . De antigene seter kan være lokalisert ved den N- eller C-terminale ende eller lokalisert mellom sløyfer dannet mellom de individuelle trådene i bunten.
Betegnelsen "antigen" anvendt her i dokumentet, hen-viser til enhver substans (inkludert et protein eller protein-polysakkarid, lipopolysakkarid, mikrobiell subenhet, helt patogen eller cancermarkører) som når den er fremmed for vertsdyret, og ved å få tilgang til vev hos et slikt dyr, stimulerer makrofager, antigenpresenterende celler og dannelse av antigenspesifikke antistoffer, og reagerer spesifikt in vivo eller in vitro med slike antistoffer. Videre stimulerer antigenet proliferasjonen og/eller aktiveringen av T-lymfocytter med reseptorer for antigenet og kryssreagerende antigener (f.eks. naturlige dreper(NK)celler, cytotoksiske T-celler og T-hjelperceller), og kan reagere med lymfocytter for å initiere serier av responser betegnet cellemediert immuni-tet. I de immunogene preparater ifølge foreliggende oppfinnelse er det foretrukket at antigenet er til stede i en mengde på ca. 0,1-20 mg/ml antigen-HD. Mer foretrukket er antigenet til stede i en mengde på ca. 0,5-5 mg/ml antigen-HD.
En "antigen determinant" er en del av et antigen eller et antigent konstrukt som bestemmer dens immunologiske spesifisitet. Vanligvis er en antigen determinant, eller et hapten, et peptid, protein eller polysakkarid i naturlig forekommende antigener. Syntetiske antigener kan være en substans med lav molekylvekt, slik som et arsanilinsyrederivat. En antigen determinant vil reagere spesifikt in vivo eller in vitro med et antistoff eller T-lymfocytter indusert av en antigen form av den antigene determinant (f.eks. den antigene determinant bundet til en immunogen substans).
Antigene determinanter som kan anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, kan være avledet f.eks. fra antigenene presentert nedenfor:
<a>For en oversikt, se Pass, 1996, Inf. Ag. Dis., 5:240; Avery, 1998, Curr. Op. Cardiol., 13:122<b>Disse virus er alle flavivirus - beskrevet av Venugopal og Gould, 1994, Vaccine, 12:966 °For en oversikt, se Adimora et al., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer., 8:859<d>For en opplisting av HIV-antigener, se HIV Molecular Immuno-logy Database, publ. Theoretical Biology and Biophysics, New Mexico (1995)<e>For en opplisting av rotavirusantigener, se "Rotavirus Antigens", Hoshino and Kapikian, 1994, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 185:179 <*>For en generell oversikt, se Middlebrook og Dorland, 1984, s. 199
Ytterligere eksempler på antigener og patogener som kan anvendes, finnes i Milich, 1989 (Adv. Immunol., 45:195), Hoshino og Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol., 185:179) eller Venugopal og Gould, 1994 (Vaccine, 12:966). Ifølge én utførelsesform anvendes gp 12 0-subenheten av env-genet og p27 av gag-genet fra humanimmundeficiensvirus (HIV). I en annen utførelsesform kan den antigene determinant være avledet fra et antigen utvalgt fra HSV-gD eller -gB, HIV-gpl20, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA, H. influenzae P5 eller P6, fimbrialt protein og protein D.
Som anvendt her i dokumentet, betyr betegnelsen "hydrofobt domene" (HD) ethvert protein, peptid, lipid eller molekyl med et hydrofobt område eller en struktur med et over-flateareal større enn 500Å. Eksempler på potensielle HD-er omfatter ethvert transmembrant (TM) segment (f.eks. glykoforin A; Tomita og Marchesi, 1975, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72:2964), det hydrofobe domenet til cytokrom b5(Taylor og Roseman, 1995, BBA, 1278:35), T-domenet til difteritoksin (Choe et al., 1992, Nature, 357:216), domene II til Pseudo-monas eksotoksin A (Allured et al., 1986, PNAS, 83:1320), 4-heliksbunten av penicillinsensorisk transduser (Hardt et al., 1997, Mol. Microbiol., 23:935), 7-heliksbunten av bakterio-rhodopsin (Henderson og Unwin, 1975, Nature, 257:28), 12-heliksbunten av lac-permease (Kaback et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:537) og det poredannende domenet til colicin (Parker et al., 1989, Nature, 357:93).
Betegnelsen "vektor" anvendt her i dokumentet, betegner en nukleinsyre (f.eks. DNA) avledet fra et plasmid, kosmid, fagmid eller en bakteriofag eller syntetisk avledet, hvori fragmenter av nukleinsyrer kan innføyes eller klones. Vektoren kan inneholde ett eller flere unike restriksjonsseter for denne hensikt, og kan være i stand til autonom replikasjon i en definert vert eller organisme, slik at den klonede sekvens reproduseres. Vektormolekylet kan meddele noen vel-definerte fenotyper hos vertsorganismen som enten er selekter-bare eller enkle å påvise. Noen komponenter av en vektor kan være et DNA-molekyl som inkorporerer reguleringselementer for transkripsjon, translasjon, RNA-stabilitet og -replikasjon og andre DNA-sekvenser.
Betegnelsen "DNA-kassett" anvendt her i dokumentet, betegner genetiske sekvenser i vektoren som kan uttrykke fusjonsproteinet beskrevet her i dokumentet. Nukleinsyre-kassetten er orientert posisjonelt og sekvensielt i vektoren, slik at nukleinsyren i kassetten kan transkriberes til RNA, og om nødvendig translateres til fusjonsproteinproduktet. Fortrinnsvis har kassetten sine 3' og 5<1>ender tilpasset for enkel innføyelse i en vektor, f.eks. har den restriksjonsendo-nukleaseseter ved hver ende.
Mens det er foretrukket at de antigene konstrukter produseres ved rekombinante teknikker, forstås det at konstruktene kan syntetiseres ved enhver kjent fremgangsmåte innen teknikken, slik som f.eks. kjemiske metoder. Dette kan være spesielt nyttig når en ikke-peptidlinker skal anvendes, eller der det hydrofobe domenet omfatter en ikke naturlig forekommende aminosyrerest eller -etterligning. Mens den foretrukne utførelsesform gjør bruk av rekombinante fremgangsmåter for å frembringe det antigene fusjonsprotein, frembringer også foreliggende oppfinnelse følgelig en fremgangsmåte omfattende: fremstilling av de antigene konstrukter ved kjemiske syntetiske metoder eller ved en kombinasjon av rekombinante og kjemiske fremgangsmåter og fremstilling av en immunogen lipid-formulering, som beskrevet ovenfor.
I tillegg til den foretrukne peptidlinker kan andre linkere kjent innen teknikken anvendes for å binde antigenet til det hydrofobe domenet. Eksempler på slike linkere inkluderer, men er ikke begrenset til, polyetylenglykoler, poly-sakkarider, polysialinsyrer, ravsyre, butandisyre, adipinsyre og standard kryssbindingskjemikalier, slik som SMPT (4-suksin-imidyloksykarbonyl-a-metyl-a-(2-pyridylditio)toluen), DSP (di-tiobis(suksinimidylpropionat)), EGS (etylenglykolbis(suksin-imidylsuksinat)) , SMCC (4-suksinimidyloksykarbonyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat) og SPDP (N-suksin-imidyl-3-(2-pyridylditio)propionat) (se også Pierce katalog, Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
Liposomet spiller en kritisk rolle ved antigenav-levering, siden antigen-liposomkomplekset presenteres direkte for immunsystemet etter fjerning fra sirkulasjonen av celler fra immunsystemet. I tillegg kan valget av immunstimulerende reaksjonsveier endres ved å gjøre endringer i lipidsammen-setningen av liposomet. For eksempel kan ulike immunstimulerende molekyler, slik som lipid A (Asano og Kleinerman, 1993, J. Immunother., 14:286), P3CSS (Lex et al., 1986, J. Immunol., 137:2676), muramyldi- og -tripeptid-PE (Fidler et al., 1981, PNAS, 78:1680; Alving et al., 1985, Vaccines, 4:166) og kationiske lipider (Walker et al., 1992, PNAS, 83:7915), formuleres i liposomene for å stimulere ulike immunologiske reaksjonsveier. Andre hjelpestoffer, slik som f.eks. MF59, Quil A, QS21 eller alum, kan anvendes sammen med antigen-liposomkomplekset. I tillegg kan immunregulerende molekyler, slik som cytokiner, tilsettes for å frembringe en immunrespons.
Liposomene som ble anvendt ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, kan tilberedes fra et bredt spekter av vesikkeldannende lipider inkludert fosfatidyletere og -estere, slik som fosfatidyletanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidylglyserol (PG) og fosfatidylcholin (PC); glyserider, slik som dioleoylglyserosuksinat; cerebrosider; gangliosider; sfingomyelin; steroider, slik som kolesterol; og andre lipider så vel som andre eksipienser, slik som vitamin E- eller vitamin C-palmitat (se også US-patenter nr. 4 235 871, 4 762 720, 4 737 323, 4 789 633, 4 861 597 og 4 873 089). Eksempler på PC-baserte lipider inkluderer, men er ikke begrenset til, (C-18)distearoylfosfatidylcholin (DSPC); (C-16)dipalmitoyl-fosfatidylcholin (DPPC); (C-14)dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC) og (C-18, umettet)dioleylfosfatidylcholin (DOPC). Det foretrekkes at lipidene er i væskefase ved kroppstemperatur (ca. 38-39 °C) . Derfor er lipider med en Tm over kroppstemperatur, slik som DSPC og DPPC, mindre foretrukket (men kan allikevel fortsatt være nyttige). Lipider med en Tm under kroppstemperatur, slik som DMPC eller DOPC, er mer foretrukket. I tillegg er det foretrukket at lipidformuleringen ikke inneholder mer enn ca. 10 % kolesterol. Spesielt foretrukne lipidblandinger omfatter ca. 0-10 % kolesterol, ca. 0- 15 % PG og ca. 0-100 % PC. I spesielt foretrukne utførelses-former kan blandingen i tillegg omfatte ca. 1-10 % hjelpestoffer; fortrinnsvis er et hjelpestoff til stede i en mengde mindre enn ca. 5 %.
Fremstilling av liposomer er vel kjent innen teknikken. Generelt er liposomer blitt laget ved flere forskjellige teknikker, inkludert etanolinjeksjon (Batzri et al., 1973, Biochem. Biophys. Acta, 238:1015); eterinfusjon (Deamer et al., 1976, Biochem. Biophys. Acta, 443:629; Schieren et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta, 542:137); detergentfjerning (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta, 255:241); løsnings-middel fordamping (Matsumato et al., 1977, J. Colloid Interface Sei., 52:149); fordamping av organiske løsningsmidler fra kloroform i vannemulsjoner (REV) (Szoka jr. et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:4194); ekstrudering av MLV eller EUV gjennom en nukleoporpolykarbonatmembran (Olson et al., 1979, Biochem. Biophys. Acta, 557:9; frysing og tining av fosofolipidblandinger (Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186), så vel som sonikering og homogenisering.
Ved konvensjon kategoriseres liposomer etter størrel-se, og et 3-bokstavakronym anvendes for å betegne typen liposom som diskuteres. Multilamellære vesikler betegnes vanligvis "MLW". Små unilamellære vesikler betegnes "SUV", og store unilamellære vesikler betegnes "LUV". Disse betegnelser etter-følges noen ganger av den kjemiske blandingen av liposomet. For en diskusjon av nomenklatur og en oppsummering av kjente typer av liposomer, se Storm et al., 1998, PSIT, 1:19-31.
Foreliggende oppfinnelse betrakter anvendelse av liposomblandinger med et egnet hjelpestoff. Imidlertid vurderer også foreliggende oppfinnelse anvendelse av det antigene konstrukt, som ikke er assosiert med et liposom, i kombinasjon med et egnet hjelpestoff. Følgelig omfatter vaksinen eller det immunogene preparat to komponenter: et antigen bundet til et hydrofobt domene; og et egnet hjelpestoffsystem. Eksempler på potensielle farmasøytisk akseptable bærersystemer som kan anvendes, inkluderer, men er ikke begrenset til, liposomer, emulsjoner, Freunds adjuvans (fullstendig eller ufullstendig) , alum, ISCOMS og kappevirus.
Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen vil anvende en immunogent effektiv mengde av liposompreparatet, det vil si en mengde av preparatet som i kombinasjon med enhver tilført eksipiens eller bærer vil resultere i en påvisbar immunogen respons hos verten. Der preparatet vil anvendes som et vaksinepreparat, vil den effektive mengde være den mengde som i kombinasjon med enhver tilført eksipiens eller bærer vil forårsake at verten produserer en spesifikk og tilstrekkelig immunologisk respons, slik at den tilfører beskyttelse av verten for senere eksponering for en mikrobe (profylaktisk vaksinasjon), eller meddeler beskyttelse av den allerede syke verten (terapeutisk vaksinasjon).
Oppfinnelsen er nå blitt generelt beskrevet, det samme vil bli bedre forstått ved henvisning til de følgende detaljerte eksempler.
Eksempler
Eksempel I
HSV2
Fremstilling av HSV2gD( 1- 23)- TM
Det N-terminale 23. aminosyresegment fra gD-kappe-proteinet til HSV2 ble koblet til et transmembrant (TM) segment ved kjemisk syntese på en automatisert peptidsyntese-maskin. Det syntetiserte peptid ble spaltet ved standard HF-spaltemetoder og renset ved preparativ HPLC ved anvendelse av en "Waters C18"-kolonne og 100 % acetonitrilmobilfase med 0,1 % TFA. Peptidet ble vist å være minst 95 % rent ved masse-spektrometri og kapillærelektroforese.
Liposomfremstilling
Liposomene fremstilles ved probesonikering ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåter (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 35:4959). Kortfattet oppløses lipidene (med eller uten protein) i et organisk løsningsmiddel, slik som kloroform/metanol. Tynne lipidfilmer dannes ved å pipettere aliquoter av lipidløsningen i rundbunnede glassrør og fordampe løsningsmidlet ved 65 °C under en strøm av nitrogengass. Filmene plasseres under vakuum i minst 8 timer for å fjerne rester av organisk løsningsmiddel. Fremstilling av liposomer fullføres ved hydratisering av lipidfilmene med buffer og inkubering av suspensjonen ved 65 °C i 5-10 minutter før probesonikering. Liposomene filtreres deretter gjennom et 0,22 um filter for å sterilisere preparatet. Liposomene størrelses-bestemmes ved dynamisk lysspredning, og dannelsen av aggregater følges i minst 4 uker.
En særskilt foretrukket liposomal HSV2gD(1-23)-TM-formulering har et molart forhold på 15:2:3 av DMPC:Chol:DMPG (dimyristoylfosfatidylcholin:kolesterol:dimyristoylfosfatidyl-glyserol) , med 2,5 vekt% lipid A.
Vaksinasionsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons mot virusantigen
BALB/c- eller C57BL/6-hunnmus (6-8 uker gamle) injiseres subkutant én gang pr. uke il, 2, 3 eller 4 uker med testvaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer og/eller skorpedannelse. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med halotan, og preparatet (10-20 u.1) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622).
Ved regelmessige intervaller under vaksinasjonsprosedyren og etter virusutformingen måles immunresponsen hos musen overfor virusantigenet. Den virusnøytraliserende antistofftest utføres ved anvendelse av 24-brønners plater inneholdende 1 x 10<5>BHK-celler der det er blitt tilsatt ulike fortynninger av museserum blandet med virus. Etter 48-72 timers inkubering ved 37 °C i en C02-inkubator undersøkes cellemonolagene for cytotoksisitet, og titeren av nøytraliserende antistoff analyseres. Presipiterende antistoffer med viruset måles ved å inkubere ulike fortynninger av serum med 5-10 u.g virusantigen eller 25-50 u.1 HSV2-løsning (1 x 10<5>PFU) . Liposomer inneholdende den antigene epitop anvendes også som mål for en antistoff-ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analysen anvendes for å måle nivået av binding og isotypekonfigurasjon til antistoffene.
En forsinket type hypersensitivitetsrespons overfor virusantigenet hos vaksinerte mus undersøkes ved anvendelse av en fotbladanalyse. Vaksinerte dyr anesteseres med halotan og injiseres med 50 u.1 HSV2 inaktivert ved ultrafiolett stråling i én bakfot og 50 u.1 lyserte uinfiserte celler i den andre bak-foten. 24, 48 og 72 timer senere måles graden av svelling i fotbladet hos musen ved anvendelse av et skyvelær og sammenlignes med utgangsmålingene. T-celleaktiviteten hos disse dyrene måles også ved produksjon av cytokiner som respons på inkubering av milt-T-celler med virusantigen. Miltene fjernes fra de vaksinerte dyrene, og milthomogenater fremstilles ved forsiktig oppbrytning av miltene med en steril nål og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellesuspensjonene skylles og sås ut ved 1 x 10<6>celler/brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. Etter inkubering av cellene ved 37 °C i 3-4 dager med ulike mengder virusantigen ble supernatantene fra brønnene høstet og testet for tilstedeværelse av cytokiner. Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y, p-aktin og TNF-a fra PharMingen, Inc. (San Diego, CA)). Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatantene ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved bruk av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % føtalt kalveserum i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver testprøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes ut fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontrollcytokiner.
HSV2- museencefalittmodell for testing av liposomale vaksine-preprater
Vaksinerte eller uvaksinerte (kontroll) BALB/c-hunnmus (10-12 uker gamle) utfordres intraperitonealt med en letal dose (1 x 10<5>PFU) av HSV2 som passerer til hjernen. De musene som utfordres intravaginalt med en letal dose av HSV2, er først forbehandlet med subkutant østrogen 1 uke før utfordringen og dag (-1) før utfordringen. De anesteseres deretter med en intraperitoneal injeksjon av acepromazin og ketamin. HSV2 (10-30 u.1) administreres deretter intravaginalt ved anvendelse av en steril tipp på en mikropipette etter først å ha vasket vagina med en tørr "Calgiswab" (McDermott et al., 1984, J. Virol., 51:747). Dyrene følges i 80 dager etter utfordringen med hensyn til overlevelse (daglig), vekttap (annenhver dag de første 2 ukene og deretter én gang pr. uke), pels-utseende og neurologiske symptomer (redusert aktivitetsnivå, trekking på lemmene eller paralyser).
Antigenindusert T- celleproliferasjon
Sensibilisering av verten for gD-antigenet måles ved anvendelse av en antigenindusert T-celleproliferasjonsanalyse. Milthomogenater fremstilles ved forsiktig å bryte opp miltene med en steril nål og presse cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % føtalt kalveserum (FCS), 10 mM Hepes-buffer, L-glutamin (2 mM) , penicillin (25 IU/ml) og streptomycin (25 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten gD (5-20 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 2 0 u.1 resazurinf arge-stoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Cytokinspesifikke mRNA- analyser
T-celler fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr undersøkes for cytokinspesifikke mRNA-nivåer av hovedcyto-kinene som kan gjenspeile sensibilisering forbundet med immunisering, inkludert IL-2, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10. T-cellene oppnås fra miltene, som beskrevet tidligere. Total-RNA isoleres ved modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en metode beskrevet av Chomczynski og Sacchi (Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156). Ferske eller fryste celler (2 x IO<6>) sprenges i 1 ml denatu-rer ingsløsning (4 mM guanidintiocyanat, 2 5 mM natriumsitrat (pH 7,0), 0,5 % sarkosyl og 0,1 mM 2-merkaptoetanol). RNA presipiteres ved inkubering med 1 volum isopropanol over natten ved -20 °C. Konsentrasjonen av total-RNA justeres til 260 nM, og prøvene lagres ved -80 °C inntil de analyseres.
Cytokinanalysen utføres ved modifisering av en fremgangsmåte beskrevet av Cosenza et al. (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16). Enkelttrådet cDNA fremstilles ved transkripsjon av 2 u.g total-RNA i 2 0 u.1 total reaksjonsblanding ved anvendelse av fjærkremyeloblastosevirus-reverstranskriptase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvensspesifikke oligonukleotidprimere for murine cytokiner (tabell 1) anvendes for å amplifisere DNA-fragmentene av på forhånd bestemt størrelse for hvert av cytokingenene av interesse.
PCR-blandingen består av 1 u.1 cDNA, 2,5 u.1 10 x PCR-buffer, 1 u.1 av både 5'- og 3'-primere, 2,5 u.1 av 10 x dNTP
(2 mmol/1) og 0,125 u.1 T. aquaticus termostabil DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i et sluttvolum på 25 u.1. Spesifikke |3-aktinprimere anvendes for å amplifisere et 548 bp fragment som en intern kontroll. PCR-blandingen dekkes med en mineralolje, og amplifiseringen utføres etter inkubering av blandingen i 7 minutter ved 94 °C, 3 8 sykluser med 3 0 sekunders denaturering ved 94 °C, 4 5 sekunders primerannealing ved 6 0 °C, 6 0 sekunders forlengelse ved 72 °C og en 7 minutters inkubering ved 72 °C. PCR-produktene separeres på agarosegel i nærvær av etidiumbromid. Båndene visualiseres under UV-lys, fotograferes og kvantifiseres densitometrisk fra fotografiet ved anvendelse av databehandlingsprogrammet "Molecular Analyst" (Bio-Rad, Richmond, CA).
Cvtokinmåling ved hjelp av ELISA
Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen sekrert av milt-CD4<+->T-celler isolert fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr. Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatanter fra milt-T-celler ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved anvendelse av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % FCS i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver prøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontroilcytokiner.
Ant i- HSV2- CTL- responser
Etter vaksinasjon ble tilstedeværelse av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler undersøkt. Miltlymfocytter ble oppnådd som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved IO<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. EL-4 (H2b)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende HSV2-gB-CTL-epitopen lokalisert mellom restene 495-505 (Hanke et al., 1991, J. Virol., 55:1177) for H2<b->begrensede celler og inkubert i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 4 90 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].
Resultater
Overlevelseskurven presentert i figur 1 viser effektiviteten av det liposomale peptid til å beskytte mus mot systemisk utfordring med en letal dose av HSV2, så vel som etablering av antall inokulasjoner nødvendig for å oppnå 100 % beskyttelse. Figur 1 viser antall doser med liposomal HSV2gD-(1-23)-TM-vaksine nødvendig for å beskytte BALB/c-mus fra en letal utfordring med HSV2. Gruppen på 7 mus ble gitt to, tre eller fire immuniseringer før utfordring med en letal dose av HSV2. Med fire vaksinasjoner hadde ingen av dyrene immunisert med den liposomale vaksine neurologiske komplikasjoner forbundet med infeksjon av HSV2, det var heller ingen andre tegn på infeksjon påvist under studien. Det viktigste var at alle mus overlevde den letale utfordring med HSV2. Med to eller tre ukentlige immuniseringer ble mindre enn 100 % av musene beskyttet. I motsetning til dette ble ikke mus som fikk fire vaksinasjoner med et placebo (det vil si buffer), beskyttet mot HSV2-utfordringen.
Liposomalt HSV2gD(1-23)-TM ble også testet i tre grupper av C57BL/6-mus og observert å utøve tilsvarende beskyttende effekter sammenlignet med resultatene oppnådd med BALB/c-mus. Tabell 2 oppsummerer disse resultater. Gruppe 1-mus ble vaksinert subkutant i ukene 1 og 4; gruppe 2-mus ble vaksinert subkutant i uke 1 og intrarektalt i uke 4; og gruppe 3-mus (kontrollgruppen) mottok ingen vaksinasjoner. 1 uke etter den siste vaksinasjonen (uke 4) ble musene utfordret intraperitonealt med en letal dose av HSV2, og ble observert i 3 uker for morbiditet og mortalitet. Som for BALB/c-musene hadde gruppen mus som mottok vaksinasjoner med liposomalt HSV2gD(1-23)-TM, et betydelig antall overlevere når de ble vaksinert enten ved subkutan injeksjon eller gitt en subkutan startdose etterfulgt av mukosale tilleggsdoser.
Figur 2 viser en sammenligning av liposomal HSV2gD-(1-23)-TM med andre fremgangsmåter for antigenpresentasjon. Hver gruppe på 7 mus fikk fire immuniseringer før utfordringen med en letal dose av HSV2. Igjen resulterte fire inokuleringer med liposomal HSV2gD(1-23)-TM-vaksine i 100 % beskyttelse av musene fra en letal dose av HSV2. Fire immuniseringer med ikke-liposomalt HSV2gD(1-23)-TM, eller liposomer uten HSV2gD-(1-23)-TM, var ikke i stand til å frembringe betydelig beskyttelse mot den letale HSV2-utfordring. Dette viser tydelig at både liposomet og de konstruerte proteinkomponenter må være assosiert med hverandre for å oppnå en effektiv immunrespons. Av særlig betydning er det funn at den liposomale HSV2gD-(1-23)-TM-vaksine frembringer mye bedre beskyttelse enn immunisering med varmeinaktiverte virus, fordi virusbaserte vaksiner vanligvis antas å frembringe en god stimulus for en immunrespons (Desrosiers, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovir., 8:1457).
Ved slutten av studien ble musene avlivet, og serum ble samlet for å karakterisere egenskapene til immunresponsen ved dette tidspunkt. Serum fra de vaksinerte mus ble funnet å inneholde høye titere av antistoffer (1:100) som spesifikt gjenkjenner peptidet anvendt for å stimulere immunresponsen, og videre medførte presipitering av aktivt virus, hvilket antyder at antistoffene gjenkjenner en epitop på overflaten av viruset. Antistoffene presipiterer også HSV2gD(1-23)-TM-liposomene og ikke liposomene uten peptid, hvilket antyder at de gjenkjenner spesifikt gD-epitopen til HSV2.
Tabell 3 nedenfor gir en oppsummering av den immunologiske analysen som viser at liposomalt HSV2gD(1-23)-TM gitt subkutant én gang i uken i 4 uker frembringer en sterkere immunrespons sammenlignet med standardadjuvanser. Vaksinasjon med antigen blandet med ufullstendig Freunds adjuvans eller alum var ikke i stand til å frembringe mus med beskyttelse for virusutfordringen. Data oppnådd fra den nøytraliserende antistofftest og den forsinkede hypersensitivitetsrespons tilsvarte overlevelsesdataene med den høyeste antistofftiter (B-cellerespons) og den største grad av fotsålesvelling (T-celle-respons) observert for den liposomale HSV2gD(1-23)-TM-gruppen. En annen viktig fordel forbundet med den liposomale HSV2gD-(1-23)-TM-behandlingen var at til forskjell fra resultatene fra mus som fikk Freunds ufullstendige adjuvans med antigenet, var det ingen irritasjon eller inflammasjon på injeksjonsstedet hos noen mus (17/17 opplevde rødhet ved injeksjonsstedet med Freunds ufullstendige adjuvans versus 0/17 for det liposomale HSV2gD(1-23)-TM). Når alum ble anvendt, utviklet 17/17-musene palperbare granulomer ved injeksjonsstedet. I motsetning til dette forårsaket ikke liposomalt HSV2gD(1-23)-TM dannelse av granulomer hos noen mus. Oppsummert antyder disse resultater at B- og/eller T-celleresponsene (vurdert ved nøytraliserende antistofftiter og grad av fotbladsvelling) bidrar til den beskyttende immunrespons frembrakt av liposomalt HSV2gD(1-23)-TM hos mus mot en letal dose av HSV2.
Eksempel II
HSV2
Fremstilling av HSV2gD( 1- 23)- HD
Et genkonstrukt som koder for HSV2gD(1-23)-HD, ble dannet ved hjelp av overlappende oligonukleotider som koder for gD-epitopen bundet til et 45 aminosyrers hydrofobt domene (HD). Konstruktet ble dannet ved gradvis forlengelse og amplifisering av den kodende region av genet. Genet ble deretter ligert til pTrcHis-ekspresjonsvektoren og verifisert ved sekvensanalyse. En småskalaekspresjonsstudie ble startet ved induksjon med 1 mM IPTG og bekreftet ved western blot-analyse ved bruk av museantistoffene dannet i vaksinasjonsstudiene med liposomalt HSV2gD(1-23)-TM. Proteinet ble også analysert ved hjelp av SDS-PAGE, og et bånd ble funnet som tilsvarte den forventede molekylvekt (=6 kD), som vurdert ved Coomassie-farging. Når det var vist at det forventede protein ble uttrykt i en liten skala, ble en 10 liters fermenteringsporsjon av E. coli inneholdende pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD-konstruktet fullført, som ga omtrent 60 g cellemasse. Etter induksjon ble ekspresjon av HSV2gD(1-23)-HD verifisert ved hjelp av et western blot av fermenteringstidsforløpet. Bakterier fra ca. 30 g cellemasse ble lysert ved hjelp av "French Press" i en buffer inneholdende 1 % deoksycholat og 5 mM imidazol. Etter sentrifugering for å bunnfelle cellerestene ble HSV2gD(1-23)-HD i hovedsak funnet i den vannløselige supernatant.
Rensing ble oppnådd ved passere supernatanten inneholdende det løselige HSV2gD(1-23)-HD-protein over en nikkel-ladet, chelaterende Sepharose-kolonne. Kolonnen ble vasket suksessivt med løsninger inneholdende 5 mM imidazol, 200 mM imidazol og deretter 5 mM imidazol med 1 % deoksycholat for å fjerne alle proteinrester. HSV2gD(1-23)-HD-proteinet ble til slutt eluert med en løsning av 200 mM imidazol og 1 % deoksycholat. Toppfraksjonene ble identifisert ved Coomassie-farget SDS-PAGE og ved western blot. Alle toppfraksjoner inneholdende HSV2gD(1-23)-HD ble samlet og konsentrert ved hjelp av en Millipore Ultraprep-konsentrator. Sluttkonsentrasjonen ble vist å inneholde rent HSV2gD(1-23)-HD, vurdert ved tilstedeværelsen av ett enkelt bånd på en Coomassie-farget SDS-PAGE-gel. Ut fra denne første runde ble omtrent 2-3 mg HSV2gD-(1-23)-HD oppnådd for liposomformulering og vaksinasjons-studier.
Liposompreparatet og vaksinasjonsprosedyrene, immun-responsinduksjonstestingen, HSV2-museencefalittmodellen, antigenindusert T-celleproliferasjon, cytokinspesifikk mRNA-analyse, ELISA-cytokinmålinger og anti-HSV2-CTL-respons var i hovedsak som beskrevet i eksempel 1.
Resultater
Overlevelseskurven vist i figur 3 viser evnen hos HSV2gD(1-23)-HD til å frembringe en beskyttende immunrespons. Prosent overlevelse med denne spesielle formuleringen ble observert til å være 40 %. Til sammenligning viste buffer- behanlede kontrolldyr ingen overlevere, mens HSV2gD(1-23)-TM-kontrollgruppen hadde 100 % overlevelse.
Eksempel III
HIV
Fremstilling av HIV( gp! 20- HD) og HIV( Agpl20- HD) i COS- l- celler
For konformasjonsepitopstudien frembringes gpl2 0-sekvensen fra pHXB2-env-plasmidet inneholdende gpl60-genet (NIH AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD) ved amplifisering av plasmid-DNA ved PCR og subkloning av 1536 bp-produktet for sekvensering ved dideoksynukleotidmetoden. Ved anvendelse av en 51 -(sense)primer tilsvarende de første 21 bp av HIVgpl2 0-genet, ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT, og en 3'-(antisense)primer tilsvarende nukleotidene 1515-1536, TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC, ved eliminering av HIVgp41-proteinet klones gpl20-segmentet og amplifiseres ved PCR. I tillegg flankeres hver primer med hensiktsmessige restriksjonsenzym-seter for å tilpasses de multiple kloningsseter til pcDNA4-His-ekspresjonsvektoren. PCR-produktet ligeres til pcDNA4-His inneholdende HD-domenet som et genkassettplasmid (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Delesjonsmutantene fremstilles ved PCR-amplifisering ved anvendelse av to 5'- og 3<1->primerpar som ekskluderer nukleotider som koder for restene i gpl2 0-proteinet; disse inkluderer A136-151gpl20, Al28-194gpl20 og A123-203gpl20. Primerne inneholder hensiktsmessige restrik-sjonsenzymsekvenser som muliggjør ligering av de to genproduk-tene. Hver mutasjon erstattes derfor med to aminosyrer som blir kodet av det spesielle restriksjonssetet av interesse. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA ved anvendelse av protokollen og reagenser fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultatene analyseres på et "ALFExpress"-sett-sekvenseringsapparat (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og analyseres med AM-programvare, v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Plasmidene transfekteres inn i COS-l-celler (ATCC, Rockville, MD) ved anvendelse av DEAE-dekstranreagenset. Stabile transfektanter utvelges ved anvendelse av Zeocin (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) og klones ved begrensende fortynning. gpl20-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Kloner som produserer høye nivåer av protein, analyseres ved western blot-analyse eller FACS-analyse. Histidinlinkeren til HIV-(gpl20)-HD, HIVA136-I51gpl20, HIVAl28-194gpl20 og HIVA123-203gpl20 fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av HIVgpl20-HD- og HIVAgpl20-HD-proteiner.
Fremstilling av HIV- HD
Nukleotidsekvensen som kombinerer tre epitoper (CTL, T-hjelpercelle og B-celle) utvelges fra sekvensene funnet i ulike HIV-proteiner (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (sekvens nr 19)) og er avledet fra denne proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Det syntetiske gen som koder for HIV-sekvensen, settes sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. Sammensetningen av fullengdegenet som koder for HIV-fragmentene, amplifiseres ved PCR og ligeres deretter inn i et ekspresjonsplasmid. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA.
HIV-HD som inneholder pTrcHis-plasmider, transformeres inn i E. coli. Bakterier inkuberes i LB-medium med ampicillin (50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av HIV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. HIV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere å rense HIV-HD.
Liposomfremstilling
Liposomene fremstilles ved probesonikering ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåter (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 35:4959). Kortfattet oppløses lipidene (med eller uten protein) i et organisk løsningsmiddel, slik som kloroform/metanol. Tynne lipidfilmer dannes ved å pipettere aliquoter av lipidløsningen i rundbunnede glassrør og fordampe løsningsmidlet ved 65 °C under en strøm av nitrogengass. Filmene plasseres under vakuum i minst 8 timer for å fjerne rester av organisk løsningsmiddel. Fremstilling av liposomer fullføres ved hydratisering av lipidfilmene med buffer og inkubering av suspensjonen ved 65 °C i 5-10 minutter før probesonikering. Liposomene filtreres deretter gjennom et 0,22 um filter for å sterilisere preparatet. Liposomene størrelses-bestemmes ved dynamisk lysspredning, og dannelsen av aggregater følges i minst 4 uker.
Vaksinasjonsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons overfor virusantigen
BALB/c-hunnmus (6-8 uker gamle) vaksineres subkutant i ukene 1, 4 og 8 med testvaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer og/eller skorpedannelse. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med halotan, og testsubstansen (10-20 ul) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 168:622).
Måling av antistoffrespons ved ELISA
Ved regelmessige intervaller under vaksinasjonsprosedyren (f.eks. 1 x pr. uke) måles musens immunrespons mot virusantigenet. Liposomer som inneholder den antigene epitop, anvendes også som mål for en antistoff-/ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analysen anvendes for å måle nivået av binding og isotypekonfigurasjon til antistoffene .
Forsinket type hypersensitivitets( DTH) analyse
EN DTH-respons mot virusantigenet hos vaksinerte mus undersøkes ved anvendelse av en fotbladanalyse. Vaksinerte dyr anesteseres med halotan og injiseres med 50 u.1 av enten lipo somalt antigen eller fritt antigen i et bakre fotblad og 50 u.1 buffer i det andre bakre fotblad. 24, 48 og 72 timer senere måles graden av fotbladsvelling hos musene ved anvendelse av et skyvelær og sammenlignes med utgangsmålingene.
Cytokinspesifikk mRNA- analyse
T-celler fra immuniserte og ikke-immuniserte dyr undersøkes for cytokinspesifikke mRNA-nivåer av hovedcyto-kinene, som kan gjenspeile sensibilisering forbundet med immunisering, inkludert IL-2, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-6 og IL-10. Milt-T-celler isoleres som beskrevet tidligere ved 1 og 4 uker etter immunisering. Total-RNA isoleres ved en modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en metode beskrevet av Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156. Ferske eller fryste celler (2 x IO<6>) øde-legges i 1 ml denatureringsløsning (4 mM guanidintiocyanat,
25 mM natriumsitrat (pH 7,0), 0,5 % sarkosyl og 0,1 mM 2-merkaptoetanol). RNA presipiteres ved inkubering med 1 volum isopropanol over natten ved -20 °C. Konsentrasjonen av total-RNA justeres til 260 nM, og prøvene lagres ved -80 °C inntil de analyseres. Cytokinanalysen utføres ved modifisering (Cosenza et al., 1995, Liver Transpl. Surg., 1:16) av en fremgangsmåte beskrevet av Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156. Enkelttrådet cDNA fremstilles ved transkripsjon av 2 u.g total-RNA i 20 ul total reaksjonsblanding ved anvendelse av fjærkremyeloblastosevirus-reverstranskriptase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Sekvensspesifikke oligonukleotidprimere for murine cytokiner (tabell 1) anvendes for å amplifisere DNA-fragmentene av på forhånd bestemt størrelse for hvert av cytokingenene av interesse. PCR-blandingen består av 1 ul cDNA, 2,5 ul 10 x PCR-buffer, 1 ul av både 5'- og 3'-primere, 2,5 ul av 10 x dNTP (2 mmol/1) og 0,125 ul T. aquaticus termostabil DNA-polymerase (Boehringer Mannheim) i et sluttvolum på 25 ul. Spesifikke P~aktinprimere anvendes for å amplifisere et 548 bp fragment som en intern kontroll. PCR-blandingen dekkes med mineralolje, og amplifiseringen utføres etter inkubering av blandingen i 7 minutter ved 94 °C, 38 sykluser med 30 sekunders denaturering ved 94 °C, 45 sekun ders primerannealing ved 6 0 °C, 6 0 sekunders forlengelse ved 72 °C og en 7 minutters inkubering ved 72 °C. PCR-produktene separeres på agarosegel i nærvær av etidiumbromid. Båndene visualiseres under UV-lys, fotograferes og kvantifiseres densitometrisk fra fotografiet ved anvendelse av "Molecular Analyst"-programvarepakken (Bio-Rad, Richmond, CA).
Cvtokinmåling ved hjelp av ELISA i milt- T- celler
T-celleaktiviteten hos disse dyr måles også ved produksjon av cytokiner som respons på inkubering av milt-T-celler med virusantigen. Miltene fjernes fra vaksinerte dyr, og milthomogenater fremstilles ved forsiktig ødeleggelse av miltene med en steril spiss og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellesuspensjonene skylles og sås ut ved 1 x 10<5>celler/brønn i en 96-brønners mikrotiterplate. Etter inkubering av cellene ved 37 °C i 3-4 dager med ulike mengder virusantigen høstes supernatantene fra brønnene og undersøkes for tilstedeværelse av cytokiner. Kommersielt tilgjengelige cytokin-ELISA-sett anvendes for å bestemme cytokinprofilen. Deteksjon av cytokinproteinet i vevskultursupernatanter ved hjelp av sandwich-ELISA utføres ved bruk av monoklonale antistoffer (mAb-er) spesifikke for de særskilte cytokiner. Kortfattet belegges ELISA-plater over natten med et rotte-antimusecytokin-mAb. Platene blokkeres med 3 % føtalt kalveserum i PBS i 2 timer, deretter tilsettes aliquoter av hver testprøve til hver brønn. Cytokinspesifikt, biotinylert rotte-antimuse-mAb tilsettes hver brønn, etterfulgt av avidinperoksidase. En fargereaksjon oppnås ved tilsetning av kolorimetriske substrater. Platene avleses i et ELISA-spektrofotometer, og cytokinkonsentrasjonene beregnes ut fra en standardkurve oppnådd fra rekombinante kontrollcytokiner. Alle cytokin-ELISA-sett (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y og TNF-a) er inn-kjøpt fra PharMingen, Inc. (San Diego, CA).
Antigenindusert T- celleproliferasjon
Sensibilisering av verten mot HIV-antigener måles ved anvendelse av antigenindusert T-celleproliferasjon. Milthomogenater isoleres som beskrevet tidligere. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % FCS, 10 mM Hepes-buffer,
L-glutamin (2 mM), penicillin (25 IU/ml), streptomycin
(25 u.g/ml) og gentamycin (80 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten HIV-HD-peptidet (5 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 3-4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 2 0 u.1 resazurinf arge-stoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Ant i- HIV- CTL- responser
Etter vaksinasjon undersøkes tilstedeværelsen av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler. Miltlymfocytter frembringes som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved 10<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. L5198Y-lymfom (H2d)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende HIV-CTL-epitopen for H2<d->begrensede celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 490 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].
Eksempel IV
Influensavirus ( INFV)
Fremstilling av INFV- HD
Nukleotidsekvensen til de valgte epitoper er avledet fra proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Antigensekvensene innføyd i genkassetten tilsvarer epitopene fra NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-6 9 (sekvens nr 2 0) , RLIQNSLTIERMVLS (sekvens nr 21)) og HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (sekvens nr
22)). En kombinasjonsepitopvaksine kan konstrueres, bestående av en T-B-epitop, som rapportert av Brumeanu et al., 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (sekvens nr 23))
(Brumeanu et al., 1997, J. Virol., 71:5473). Med en gang den passende sekvens er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for INFV-HD sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. Det sammensatte fullengdegenet som koder for INFV-fragmentene, amplifiseres ved PCR og ligeres inn i et ekspresjonsplasmid. De endelige gener verifiseres ved sekvensering av DNA.
INFV-HD inneholdende plasmider transformeres til
E. coli. Bakterien inkuberes i LB-medium med ampicillin
(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme optimal postinduksjonsekspresjon av INFV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. INFV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av
INFV-HD.
Virusinfeksjonsmodell
INFV-stammen anvendt for å demonstrere effektiviteten til vaksinen, er en type av A/PR/8/34-viruset kalt PR8. Viruset dyrkes i 10-12 dager gamle befruktede kyllingegg ved allantoin-inokulering, etterfulgt av inkubering ved 3 7 °C i en vuggeinnretning i 40-48 timer og 20-24 timer ved 4 °C, og deretter gjenvunnet fra allantoinvæsken. En virushemagglutinin-analyse med 0,5 % røde blodceller fra kylling vil bli utført i 96-brønners mikrotiterskåler for å besteme hemagglutinerings-enheter(HAU)/ml av virusstammen.
I BALB/c-musemodellen er det vist at 1200 HAU av PR8-stammen administrert intranasalt med en steril tipp på en mikropipette til metofananesteserte mus (20 u.1) , utviklet ut-talte symptomer på infeksjon ved dag 4, inkludert redusert bevegelighet, mangel på stell, et 20 % tap i kroppsvekt og død innen 2 uker. Ved anvendelse av MDCK-cytolyseanalysen utført i 96-brønners mikrotiterskåler med et 50 % endepunkt ble en høy titer av infeksjonsvirus funnet å være til stede i lungehomo-genater fremstilt 4 dager etter infeksjon.
Vaksinasjonsprosedyrer og testing for induksjon av immunrespons mot virusantigen
BALB/c-hunnmus (6-8 uker gamle) injiseres subkutant i ukene 1, 4 og 8 med vaksinepreparatet eller buffer. Injeksjonsstedet kontrolleres for skadelige reaksjoner, slik som utvikling av granulomer. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med metofan, og testsubstansen (10-20 u.1) administreres til neseborene for inspirasjon ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622).
RT- PCR- deteksjon av INFV- RNA i lungevev
RT-PCR-deteksjon av INFV-RNA utføres på lungene fra forsøksdyr tatt 4 dager etter virusstimulering for å stadfeste effektiviteten av immunisering for å forhindre virusinfeksjon. Lungeprøver tatt fra musene ble raskt fryst, knust og det frosne pulver lagret ved -70 °C inntil det ble bearbeidet for evaluering. Isolering av total-RNA og RT-PCR-analyse for virus-RNA utføres ved en modifisering av tidligere beskrevne teknikker (Chomczynski et al., 1987, Analyt. Biochem., 152:156; Shirwan et al., 1993, J. Immunol., 151:5228; Lakeman og Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857). Primerne som anvendes, er spesifikke for matriksgenet (segment 7) av influensavirus A (Atmar et al., 1996, J. Clin. Microbiol., 34:2604). RT-PCR-analysen utføres ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "Titan One Tube RT-PCR"-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) . Kortfattet inkuberes 1 pg til 1 u.g total-RNA-templat i nærvær av 0,2 mM dNTP, 0,4 u.M antisenseprimer FAMI (5<1->CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3<1>(sekvens nr 24)), 0,4 U.M senseprimer F AM 2 (5 1-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3 1 (sekvens nr 25)), 5 mM DTT, 5 U RNase-inhibitor, 1,5 mM MgCl2og "AMV/Expand High Fidelity"-enzymer under de følgende betingelser: 1 syklus på 6 0 °C i 3 0 minutter; 94 °C i 2 minutter;
10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 4 5 sekunder; 2 5 sykluser på 94 °C i 3 0 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med
5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 6 8 °C i
7 minutter. Et positivt resultat baseres på et synlig bånd av 212 bp i 1,5 % NuSieve-agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) farget med etidiumbromid og fotografert med UV-trans-illuminator (BioRad Gel Doc 1000) . Denne fremgangsmåten er vist å være sensitiv og svært spesifikk for måling av tilstedeværelse av virus-DNA (Lakeman og Whitley, 1995, J. Inf. Dis., 171:857).
Sekvensen til HAI- domenet
HAI-domene(segment 4)sekvensen kan utredes ved amplifisering av HAl-domenet fra virus-RNA i en RT-PCR-reaksjon, deretter subklones det 1100 bp-produktet for sekvensering, og sekvensering ved dideoksy-nukleotidtermineringsmetoden. RT-PCR-analysen utføres ved "Titan One Tube RT-PCR"-systemet med de følgende forskjeller som bemerket ovenfor; amplifiserings-primerne er cDNA-primeren (5<1->AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3<1>(sekvens nr 26)) og PCR-primeren (5<1->CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3<1>(sekvens nr 27)) (Pyhala et al., 1995, J. Gen. Virol., 75:205), betingelsene vil være 1 syklus på 60 °C i 30 minutter; 94 °C i 2 minutter; 10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i
30 sekunder, 68 °C i 4 5 sekunder; 2 5 sykluser på 94 °C i
30 sekunder, 60 °C i 3 0 sekunder, 6 8 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med 5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 68 °C i 7 minutter. 1100 bp-produktet subklones i TA-PCR2.1-kloningsvektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA) for etterfølgende sekvensering. Sekvensering utføres ved protokollen og reagensene fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultater kjørt på "ALFExpress"-sett-apparatet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) analyseres med AM-programvare, v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Måling av antistoffresponser ved ELISA
Ved regelmessige intervaller under vaksinasjons - prosedyren måles immunresponsen hos musene mot virusantigen. Liposomer inneholdende antigenepitopen anvendes også som mål for en antistoff-/ELISA-analyse, som beskrevet tidligere (Tuso et al., 1993, Transplantation, 55:1375). Resultatene fra den sistnevnte analyse anvendes for å måle bindingsnivået og iso-typekonfigurasjonen av antistoffene.
Antigenindusert T- celleproliferasion
Sensibilisering av verten mot INFV-antigener måles ved anvendelse av antigenindusert T-celleproliferasjon. Milter fjernes fra vaksinerte mus, og homogenater fremstilles ved forsiktig ødeleggelse av milten med en steril spiss og pressing av cellene gjennom et nylonmaskenett. Cellene suspenderes i RPMI 1640-medium inneholdende 10 % FCS, 10 mM Hepes-buffer, L-glutamin (2 mM), penicillin (25 IU/ml), streptomycin (25 u.g/ml) og gentamycin (80 u.g/ml) . Cellene dyrkes ved en konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml med eller uten kjemisk syntetiserte peptider tilsvarende antigenene (5 u.g/ml) i 96-brønners, rundbunnede plater i 3-4 dager i 5 % C02. Kulturene tilsettes 20 ul resazurinfargestoff i 3 timer, og deretter måles fluorescensen på Cytofluor II (Perseptive Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Anti- INFV- CTL- responser
Etter vaksinasjon undersøkes tilstedeværelsen av antigenspesifikke, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) i milt-T-celler. Miltlymfocytter frembringes som tidligere beskrevet. Lymfocytter fra hver behandlingsgruppe samles (n = 5) og dyrkes deretter i 3 dager uten antigen ved 10<7>celler/brønn i 12-brønners kulturplater. P815-mastocytommålceller eller L5178-lymf om (H2d)-målceller (ATTC) inkuberes med et peptid tilsvarende INFV-NP-CTL-epitopen (aminosyrene 147-158) for H2<d->begrensede celler og inkuberes i 4 timer ved 37 °C. Målene vaskes, og 100 u.1 titere inneholdende 1 x 10" celler tilsettes hver brønn. Effektorlymfocytter vaskes, tilsettes brønnene ved ulike konsentrasjoner og dyrkes i 4 timer ved 37 °C. Ved anvendelse av "CytoTox 96"-settet (Promega, Madison, WI) beregnes prosent spesifikk lyse fra laktatdehydrogenase (LDH) i supernatanten målt i en standard ELISA-plateavleser (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Eimer, San Jose, CA) ved registrering av absorbansen ved 490 nm. Bestemmelsen av HSV2-antigenspesifikk lyse utføres ifølge standardkriterier. Data er uttrykt som prosent spesifikk lyse = 100 x [(eksperimentell - spontan effektor - spontan målsøkt)/(målsøkt maksimum - målsøkt spontan)].
Eksempel V
Ikke- typebestembare H . influenzae ( NTHi) og H . influenzae type b ( Hib)
Kloning av NTHi- proteiner
Fullengdegensekvensen som koder for P6, oppnås fra en stamme av NTHi ved RT-PCR-ampiifisering av P6-mRNA (Deich et al., 1988, J. Bacteriol., 170:489; Nelson et al., 1988, Inf. Immun., 56:128, Looman et al., 1987, EMBO J., 5:2489). Amplifiseringen utføres ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "Titan One Tube RT-PCR"-systemet (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Kortfattet inkuberes bakterier i nærvær av 0,2 mM dNTP, 0,4 u.M antisenseprimer H-InvfP6AS (5<1->GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3<1>(sekvens nr 28)), 0,4 u.M senseprimer H-invfP6S (5<1->AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3<1>(sekvens nr 29)), 5 mM DTT, 5 U RNase-inhibitor, 1,5 mM MgCl2og "AMV/Expand High Fidelity"-enzymer under de følgende betingelser: 1 syklus på 60 °C i 3 0 minutter; 94 °C i 2 minutter; 10 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 3 0 sekunder, 6 8 °C i 4 5 sekunder; 25 sykluser på 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder, 68 °C i 45 sekunder og økning av forlengelsen med 5 sekunder for hver syklus; etterfulgt av 1 syklus på 68 °C i 7 minutter. Et positivt resultat baseres på et synlig bånd av 867 bp i 1,0 % NuSieve-agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) farget med etidiumbromid og fotografert med et digitalt avbildingssystem (BioRad Gel Doc 2000). PCR-produktet subklones for sekvenser-ingsformål i TA-2.1-vektoren ved anvendelse av reagenser og protokoll fra "TA Cloning"-settet (Invitrogen, Carlsbad, CA). En fremstilling av plasmid i liten skala utføres ved standard alkalisk lysemetode (Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, s. 125). PCR-produktet innføyes i sekvensen ved den konvensjonelle dideoksyterminer-ingsmetoden ved anvendelse av protokollen og reagenser fra "AutoCycle"-settet (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), og resultatene analyseres på et "ALFExpress II"-sekven-seringsapparat (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og analyseres med "AlfWin" sekvensanalysatorprogramvare, v. 2.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Fremstilling av NTHi( P6)- HD
Når genet som koder for P6 er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for NTHi(P6)-HD sammen ved syntese, hybridisering, PCR og ligering av overlappende oligonukleotider. HD-segmentet tilføres enten den N- eller C-terminale ende av proteinet via en linker sammensatt av glysin og serin. Dette muliggjør å teste effekten som den relative plassering av HD med hensyn til antigenet har på prosessering av immunsystemet. Det sammensatte fullengdegenet som koder for NTHi-(P6)-HD-fragmentet, amplifiseres ved PCR og ligeres i et ekspresjonsplasmid. Det endelige gen verifiseres ved å sekvensere DNA.
NTHi( P6)- HD- inneholdende plasmid transformeres i E . coli
Bakterier inkuberes i LB-medium med ampicillin
(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av NTHi(P6)-HD-protein. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet og cellepelleten analyseres for nærvær av protein. En 1-2 % løsning av natriumdeoksycholat anvendes for å ekstrahere NTHi-(P6)-HD-proteinet fra den lyserte cellepellet. NTHi(P6)-HD renses deretter ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Om nødvendig utføres størrelses-eksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromato-graf i for ytterligere å rense NTHi(P6)-HD.
Liposomfremstilling
Det er tre generelle metoder for å fremstille stabile NTHi(P6)-HD-liposomer. I den første formuleres liposomene slik at proteinet og lipider oppløses sammen i et organisk løsningsmiddel (kloroform/metanol) og deretter tørkes til en tynn film. Ved resuspendering i vandig buffer settes lipidene og proteinet sammen til store bilagstrukturer. Suspensjonen sonikeres deretter for å lage små unilamellære vesikler (SUV). For små proteiner fungerer denne fremgangsmåten godt. Imidlertid kan det for disse eksperimenter være ønskelig ikke å eksponere proteinet for harde løsningsmiddelbetingelser på grunn av muligheten for å denaturere proteinet. For å unngå uønskede konformasjonsendringer kan derfor en annen fremgangsmåte anvendes som involverer løseliggjøring av NTHi(P6)-HD i resuspensjonsbufferen før hydratisering av lipidfilmen. Ved hydratisering med lipidene assosierer proteinet spontant med den nylig dannede membran og blir inkorporert i bilaget til SUV under sonikering. Den tredje fremgangsmåten involverer fremstilling av liposomene uten NTHi(P6)-HD-protein, og deretter tilsette det til de allerede dannede SUV, hvilket mulig-gjør at HD integrerer i lipidbilaget. Liposomene fremstilles ved probesonikering ifølge tidligere beskrevne fremgangsmåter (Fujii et al., 1997, Biochemistry, 35:4959). Kortfattet opp-løses lipidene (med eller uten protein) i et organisk løsningsmiddel, slik som kloroform/metanol. Tynne lipidfilmer dannes ved å pipettere aliquoter av lipidløsningen i rundbunnede glassrør og fordampe løsningsmidlet ved 6 5 °C under en strøm av nitrogengass. Filmene plasseres under vakuum i minst 8 timer for å fjerne rester av organisk løsningsmiddel. Alter-nativt kan lipidpulver av den ønskede blanding fremstilles ved en teknikk som spraytørking, og deretter anvendes i stedet for lipidfilmer. Fremstilling av liposomer fullføres ved hydratisering av lipidfilmene eller -pulverne i buffer og inkubering av suspensjonen ved 6 5 °C i 5-10 minutter før probesonikering. Liposomene filtreres deretter gjennom et 0,22 u.m filter for å sterilisere preparatet. Liposomene størrelsesbestemmes ved dynamisk lysspredning, og dannelsen av aggregater følges i minst 4 uker. Det er mulig at konformasjonen av NTHi(P6)-HD-proteinet kan trenges å konserveres. Av de tre fremgangsmåtene som kan anvendes ved fremstilling av liposomer, foreslås derfor at enten tilsetning av proteinet som en bestanddel av hydratiseringsløsningen eller tilsetning til liposomene etter at de allerede er dannet kan være foretrukket.
Bakteriestammer
NTHi-stammene 9333 (spinalvæskeisolat), 35056 (øvre luftveisinfeksjonsisolat), 43095 (otittvæskeisolat), 49766 (lungeabscessisolat, referansestamme ved antimikrobiell susceptibilitetstesting) (ATCC) og Hib-stammen 51654 (ATCC) ble anvendt for å demonstrere effektiviteten i bakterie-infeksjonsmodellen. Før anvendelse subdyrkes en fryst popu-lasjon av organismen i frisk hjerne-hjerteinfusjonsmedium tilsatt NAD (2 u.g/ml) og hem (10 u.g/ml) , og inkuberes i 24 timer ved 3 7 °C med 10 % karbondioksid. En standardkurve for hver organisme bestående av kolonidannende enheter versus turbi-ditet ved 480 nm anvendes for å tilpasse det inokulum av bakterier som er nødvendig for enten de bakteriedrepende analyser eller intraperitonealstimuleringsdosen.
Vaksinasjonsprosedyrer og testing av induksjon av immunrespons mot bakterieantigen
Grupper av nyfødte rotter (n = 6 pr. gruppe) immuniseres på dagene 5, 12, 19 og 26 eller på dagene 5 og 26 etter fødsel med testvaksinepreparatet eller buffer. Systemisk vaksinasjon av rottene utføres ved subkutan injeksjon av liposomvaksinene. Når dyrene immuniseres med vaksinen via den intranasale rute, anesteseres de med metofan, og testsubstansen (20 u.1) administreres ved hjelp av en steril tipp på en mikropipette (Gallichan et al., 1993, J. Inf. Dis., 158:622). De nyfødte rottene oppstalles sammen med sine mødre og observeres for skadelige reaksjoner forbundet med vaksinasjonsprosedyren, slik som dannelse av granulom, rødhet og skorper ved injeksjonsstedet. 1 uke etter den siste vaksinasjonen anesteseres de nyfødte rottene med halotan, og blod samles ved hjertepunksjon, og slimhinnene skylles med saltvann for å samle mukosasekret. Dyrene avlives med karbondioksid. Den bakteriedrepende antistofftiter i serum og mukosavæske måles som beskrevet nedenfor.
Ved den intraperitoneale stimuleringsstudien stimu-leres nyfødte rotter (26 dager gamle) med bakterier, og deres blod og CSF analyseres for mengden bakterier sammenlignet med uvaksinerte rotter. Blodprøvetaking og prøvetaking av CSF for bakterier 2 dager etter stimulering antyder at det er en be tydelig bakteriemengde i dyrene (det vil si 1 x IO<4>CFU/ml blod; 1 x 10" CFU/ml CSF) . Serum fra de vaksinerte 2 6 dager gamle rottene som inneholdt høye titere av bakteriedrepende antistoffer, administreres intravenøst til 6 dager gamle rotter. Neste dag fikk nyfødte rotter (n = 10) en intraperitoneal dose av NTHi, som beskrevet nedenfor. De nyfødte rottene observeres deretter for morbiditet og mortalitet, overlevere avlives etter 2 6 dager, og blod og CSF samles og dyrkes for tilstedeværelse av NTHi.
Intraperitoneal stimulering med NTHi
En 24 timer gammel kultur av in vivo passert NTHi justeres til 5 x 10<7->5 x IO<9>CFU/ml, og 100 u.1 av denne kulturen injiseres intraperitonealt til 5-10 dager gamle rotter (Smith et al., 1973, Inf. Immun., 8:278). Stimulerte nyfødte rotter forblir hos sine diende mødre etter inokulering. Innen 18-96 timer etter stimulering døde minst 90 % av de nyfødte rottene ved denne dosen av passerte bakterier.
Måling av antigenspesifikk antistoffrespons ved ELISA
Serum- og slimprøver fra hver rotte testes for IgG-og IgA-antistoffer spesifikke for P6-antigenet. Enten det klonede native P6 eller NTHi(P6)-HD-proteinet tilsettes til hensiktsmessig behandlede, 96-brønners plater for inkubering over natten ved romtemperatur. Plater blokkeres med 1 % bovint serumalbumin i bikarbonatbuffer, pH 9,6, i 30 minutter ved 37 °C. Platene skylles deretter med 0,05 % Tween 2 0/PBS. Fortynninger av hver serum- eller slimprøve tilsettes de antigen-belagte platene, etterfulgt av inkubering i 2 timer ved 37 °C og skylling med Tween-/PBS-buffer ved slutten av inkuberingen. Alkalisk fosfatase-bundne, monoklonale antistoffer spesifikke for rotte-IgG eller -IgA tilsettes brønnene i 1 time ved 37 °C. Brønnene skylles deretter med Tween-/PBS-buffer, og PNPP-substrat i dietanolaminbuffer, pH 9,5, tilsettes brønnene for å starte fargereaksjonen. Reaksjonene stoppes med 0,7 5 N natriumhydroksid og avleses ved 405 nm i en "Spectramax" ELISA-plateavleser. Rotte-IgG- og -IgA-konsentrasjonene beregnes fra en standardkurve oppnådd fra kontrollprøver med kjente konsentrasjoner av Rotte-IgG eller -IgA belagt på 96-brønners plater og behandlet som beskrevet ovenfor.
Analyse av bakteriedrepende antistoff
Serumprøver som skal testes for tilstedeværelse av bakteriedrepende antistoffer, inkuberes ved 56 °C i 30 minutter for å inaktivere komplement. Testsera fortynnes deretter serielt i fosfatbufret saltvann (PBS). En 24 timers bakterie-kultur justeres til 5 x 10<4>CFU/ml i steril PCM-buffer sammensatt av PBS og 0,15 mM CaCl2og 1 mM MgCl2inneholdende bovint serumalbumin (BSA). Sera fra uvaksinerte nyfødte rotter anvendes som komplementkilde. Disse sera samles, porsjoneres og lagres ved -70 °C frem til anvendelse. Bakterier (20 u.1) , seriefortynnet serum (20 u.1) , komplement (20 ul) og 4 0 u.1 av 1 % BSA i PCM-buffer tilsettes hver brønn på en 96-brønners plate. For å bestemme den initielle bakteriekonsentrasjon sås 10 u.1 aliquoter av en prøveblanding ut ved tid 0 på friske BHI-agarplater inneholdende næringsagar og tilsatt NAD og hem. Etter inkubering av reaksjonsblandingen ved 3 7 °C med 10 % karbondioksid i 1 time med risting sås 10 u.1 fra hver brønn ut i duplikater og inkuberes over natten ved 3 7 °C i nærvær av 10 % karbondioksid for å bestemme CFU/brønn. Kontroller omfatter en brønn uten serum for å sikre at komplement alene ikke dreper bakterier, og en brønn med testserum, men uten komplement, for å sikre at serumkomplementet i testprøven er fullstendig inaktivert. Alle analyser utføres i triplikat, og de fortynninger som frembringer 50 % dreping av bakteriene, anvendes for å sammenligne aktiviteten mellom ulike sera.
Eksempel VI
Hepatitt C- virus
Fremstilling av HCV( E2/ NS1)- HD og HCV( E2/ NS1AHVR1)- HD i CHO-celler
Nukleotidsekvensen til HCV-E2/NSl-proteinet er avledet fra PCR-amplifiseringen til en stamme av HCV oppnådd som beskrevet nedenfor. Ved anvendelse av en 5<1->primer tilsvarende de første 21 bp av E2/NS1-genet CAAACCATGATCGCCCACGGA og en 3<1->primer tilsvarende restene 622-628, GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA, elimineres det transmembrane domenet (Cocquerel, L. et al., 1998, J. Virol., 72(3) :2183-91) . I tillegg flankeres hver primer med hensiktsmessige restriksjonsseter. PCR-produktet ligeres i pcDNA3.1-His inneholdende HD-domenet som et genkassettplasmid (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). HCV(E2/NS1-AHVR1)-HD konstrueres ved å fjerne HVR1 i E2/NSl-genet tilsvarende de første 27 aminosyrene fra resten 384 til resten 410. Delesjonsmutanten fremstilles ved PCR-amplifisering ved anvendelse av en 5'-primer, CAACTCATCAACACCAATGGC, og den samme 3<1->primer anvendes for villtypekontrollen. De endelige gener verifiseres ved å sekvensere DNA. Plasmidene transfekteres til CHO-celler (Deen, K.C. et al., 1988, Nature, 331:82) (ATCC, Rockville, MD) ved hjelp av lipofeksjons-reagenset (Lipofectamine, Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) etter produsentens anbefalte protokoll. Stabile transfektanter selekteres ved anvendelse av G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) og klones ved begrenset fortynning. Identifisering av klonene som produserer høye nivåer av protein, vurderes ved western blot-analyse. HCV(E2/NS1)-HD- og HCV(E2/NS1AHVR1)-HD)-proteiner renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støttemateriale. Denne histidinlinkeren fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob interaksjonskromatografi for ytterligere rensing av HCV(E2/NS1)-HD- og HCV(E2/NS1AHVR1)-HD)-proteinene.
Fremstilling av HCV( HVR1)- HD- og HCV( C)- HD- proteiner i E . coli
Nukleotidsekvensene til de valgte epitoper er avledet fra proteinsekvensen ved anvendelse av E. coli-kodonpreferanser (Looman et al., 1987, EMBO J. , 5:2489). Antigensekvensene som skal innføyes i genkassetten, tilsvarer epitopene fra NP (14 7-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69, RLIQNSLTIERMVLS) og
HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL). Etter at de tilfredsstillende sekvenser er oppnådd, settes et syntetisk gen som koder for HCV-HD, flankert av hensiktsmessige restriksjonsseter, sammen ved syntese, hybridisering og ligering av overlappende oligonukleotider. Kortfattet oppnås sammensetning av fragmentene ved oppvarming til 65 °C og annealing av oligonukleotidene når de vender tilbake til romtemperatur. Etter inkubering i 2 minutter på is ligeres fragmentene med DNA-ligase. Det sammensatte fullengdegenet som koder for HCV-fragmentene, amplifiseres ved PCR, spaltes av restriksjonsenzymer og isoleres ved gelelektroforese. HCV-genet ligeres deretter til et tilsvarende spaltet ekspresjonsplasmid inneholdende HD-genet (f.eks. pTrcHis eller pQE3 0). De endelige gener verifiseres ved å sekvensere DNA.
HCV-HD-inneholdende plasmider transformeres til
E. coli. Bakteriene inkuberes i LB-medium med ampicillin
(50 u.g/ml) ved 37 °C frem til midtre logfase. Ved dette tidspunkt tilsettes IPTG for å indusere trp/Iac-hybridpromoteren. Undersøkelser utføres hver time for å bestemme den optimale postinduksjonsekspresjon av HCV-HD-proteiner. Ved tidspunktet for optimal ekspresjon høstes cellene ved sentrifugering. Cellepelleten lyseres og sentrifugeres. Lysatet undersøkes for tilstedeværelse av protein. HCV-HD-proteinene renses ved selektiv affinitet til nikkel bundet til et fast støtte-materiale. Histidinlinkeren fjernes ved enterokinasespalting etter at rensingen er fullstendig. Om nødvendig utføres størrelseseksklusjons-, ionebytter- eller hydrofob inter-aks j onskromatograf i for ytterligere å rense HCV-HD.
Liposompreparatet og vaksinasjonsprosedyrene, testing av immunresponsinduksjonen, målinger av ELISA-antistoffrespon-sen, DTH-analysen, den cytokinspesifikke mRNA-analysen, ELISA-cytokinmålinger, antigenindusert T-celleproliferasjon og anti-HIV-CTL-reponser er i hovedsak som beskrevet i eksempel III
ovenfor.
Claims (23)
1. Immunogent liposompreparat,karakterisert vedat det omfatter: vesikkeldannende lipider; og et antigent proteinkonstrukt som er et vandig, løselig fusjonsprodukt omfattende én eller flere antigen determinanter og et hydrofobt domene, der det hydrofobe domenet er assosiert med membranen til liposompreparatet.
2. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det ytterligere omfatter ett eller flere hjelpestoffer.
3. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det antigene konstrukt er syntetisert kjemisk.
4. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det hydrofobe domenet er et peptid.
5. Immunogent liposompreparat ifølge krav 4,karakterisert vedat det hydrofobe domenet består av fra ca. 15 til ca. 500 aminosyrerester.
6. Immunogent liposompreparat ifølge krav 5,karakterisert vedat det hydrofobe domenet omfatter én eller flere aminosyrer utvalgt fra gruppen bestående av Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.
7. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat den antigene determinant er avledet fra et antigen utvalgt fra gruppen bestående av HSV-gB eller -gD, HIV-gpl20, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA, og H. influenzae P6.
8. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det antigene konstrukt ytterligere omfatter en linkerregion som forbinder det ene eller flere antigene determinanter med det hydrofobe domenet.
9. Immunogent liposompreparat ifølge krav 8,karakterisert vedat linkerområdet er et peptid.
10. Immunogent liposompreparat ifølge krav 9,karakterisert vedat linkerområdet består av fra 1 til ca. 200 aminosyrerester.
11. Immunogent liposompreparat ifølge krav 10,karakterisert vedat aminosyrerestene utvelges fra gruppen bestående av Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gin, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr og Val.
12. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det omfatter et antigent konstrukt omfattende én eller flere antigendeterminanter og et hydrofobt domene; og en farmasøytisk akseptabel bærer.
13. Immunogent liposompreparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det antigene konstrukt ytterligere omfatter en linkerregion som forbinder det ene eller flere antigendeterminanter med det hydrofobe domenet.
14. Immunogent liposompreparat ifølge krav 12,karakterisert vedat det ytterligere omfatter ett eller flere hjelpestoffer.
15. Immunogent liposompreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat en eller flere av antigendeterminantene er en antigendeterminant fra et bakterielt patogen eller toksin, fra et viralt patogen, fra et patogen fra sopp, eller fra et patogen fra en parasitt.
16. Immunogent liposompreparat ifølge ethvert av de foregående krav, for anvendelse i en fremgangsmåte for immunisering av et vertsdyr.
17. Immunogent liposompreparat ifølge ethvert av de foregående krav, for anvendelse i en fremgangsmåte for indusering av en immunrespons hos et vertsdyr.
18. Immunogent liposompreparat ifølge krav 16 eller 17,karakterisert vedat vertsdyret er et pattedyr.
19. Immunogent liposompreparat ifølge krav 18,karakterisert vedat pattedyret er et menneske.
20. Immunogent liposompreparat ifølge krav 19,karakterisert vedat antigendeterminanten er utvalgt fra gruppen bestående av HSV-gB eller gD, HIV-gpl2 0, CMV-gB, HCV-E2, INFV-HA eller -NA og H.influensae p6.
21. Immunogent liposompreparat ifølge krav 16 eller 17,karakterisert vedat dyret er en fugl.
22. Fremgangsmåte for å fremstille et immunogent liposompreparat ,
karakterisert vedat den omfatter: uttrykking av et gen som koder for et vandig, løselig fusjonsprotein omfattende en antigen determinant og et hydrofobt domene, og (a) oppløsning av vesikkeldannende lipider og fusjonsproteinet i et egnet organisk løsningsmiddel; dannelse av en lipidfilm eller spraytørket pulver ved fordamping av det organiske løsningsmiddel; hydratisering av lipidfilmen eller pulveret; og dispergering av den hydratiserte lipidfilm eller -pulver for å danne et immunogent liposompreparat, eller (b) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; hydratisering av enten et lipidpulver eller en lipidfilm med bufferen inneholdende fusjonsproteinet; og dispergering av lipidpulveret eller -filmen for å danne et immunogent liposompreparat, eller (c) oppløsning av fusjonsproteinet i en vandig buffer; og tilsetning av fusjonsproteinet til på forhånd formede liposomer for å danne et immunogent liposompreparat.
23. Immunogent liposompreparat som kan erholdes ved en fremgangsmåte ifølge krav 22.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US10135198P | 1998-09-22 | 1998-09-22 | |
US40072399A | 1999-09-21 | 1999-09-21 | |
PCT/US1999/020880 WO2000016746A2 (en) | 1998-09-22 | 1999-09-22 | Immunogenic liposome compositions |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20011406D0 NO20011406D0 (no) | 2001-03-20 |
NO20011406L NO20011406L (no) | 2001-04-24 |
NO330685B1 true NO330685B1 (no) | 2011-06-06 |
Family
ID=26798150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20011406A NO330685B1 (no) | 1998-09-22 | 2001-03-20 | Immunogene liposompreparat samt fremgangsmate for fremstilling av dette |
Country Status (31)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1115382B1 (no) |
JP (1) | JP2002526436A (no) |
KR (1) | KR100592825B1 (no) |
CN (1) | CN1555254A (no) |
AP (1) | AP2010A (no) |
AT (1) | ATE468108T1 (no) |
AU (1) | AU766772B2 (no) |
BG (1) | BG65675B1 (no) |
BR (1) | BR9914004A (no) |
CA (1) | CA2344173C (no) |
CY (1) | CY1110718T1 (no) |
CZ (1) | CZ20011013A3 (no) |
DE (1) | DE69942393D1 (no) |
DK (1) | DK1115382T3 (no) |
EA (1) | EA004797B1 (no) |
EE (1) | EE200100168A (no) |
ES (1) | ES2345695T3 (no) |
GE (1) | GEP20053444B (no) |
HK (1) | HK1039064A1 (no) |
HU (1) | HUP0105391A3 (no) |
ID (1) | ID29082A (no) |
IL (2) | IL141675A0 (no) |
MX (1) | MXPA01002973A (no) |
NO (1) | NO330685B1 (no) |
NZ (2) | NZ528055A (no) |
OA (1) | OA11657A (no) |
PL (1) | PL206260B1 (no) |
SK (1) | SK287670B6 (no) |
UA (1) | UA75327C2 (no) |
WO (1) | WO2000016746A2 (no) |
ZA (1) | ZA200101829B (no) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1868651A4 (en) | 2005-04-12 | 2010-10-06 | Univ Duke | METHOD FOR INDUCING ANTIBODIES THAT NEUTRALIZE THE HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS |
EP2438926B1 (en) | 2009-06-04 | 2016-03-23 | M Bio Technology Inc. | Vaccine for mycoplasma infection |
EA034702B1 (ru) * | 2011-04-26 | 2020-03-10 | Молекулар Экспресс, Инк. | Липосомные композиции |
WO2015048635A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Duke University | Mper-liposome conjugates and uses thereof |
US20200054741A1 (en) * | 2017-04-04 | 2020-02-20 | Avidea Technologies, Inc. | Peptide-based vaccines, methods of manufacturing, and uses thereof for inducing an immune response |
KR20240033309A (ko) * | 2022-09-05 | 2024-03-12 | 주식회사 차백신연구소 | 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8405493D0 (sv) * | 1984-11-01 | 1984-11-01 | Bror Morein | Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel |
US5374548A (en) * | 1986-05-02 | 1994-12-20 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor |
SE462375B (sv) * | 1985-10-15 | 1990-06-18 | Morgaardshammar Ab Centro | Traadblock |
DE3776966D1 (de) * | 1986-05-20 | 1992-04-09 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Funktionelle gruppen tragende liposome und verfahren zu deren herstellung. |
FR2754543B1 (fr) * | 1996-10-11 | 1998-12-31 | Pasteur Institut | Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires |
-
1999
- 1999-09-02 ID IDW20010900A patent/ID29082A/id unknown
- 1999-09-22 CA CA2344173A patent/CA2344173C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-22 BR BR9914004-7A patent/BR9914004A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 GE GE4350A patent/GEP20053444B/en unknown
- 1999-09-22 MX MXPA01002973A patent/MXPA01002973A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 NZ NZ528055A patent/NZ528055A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 CZ CZ20011013A patent/CZ20011013A3/cs unknown
- 1999-09-22 AP APAP/P/2001/002096A patent/AP2010A/en active
- 1999-09-22 EE EEP200100168A patent/EE200100168A/xx unknown
- 1999-09-22 KR KR1020017003621A patent/KR100592825B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 AU AU60351/99A patent/AU766772B2/en not_active Ceased
- 1999-09-22 PL PL348604A patent/PL206260B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 DK DK99969329.4T patent/DK1115382T3/da active
- 1999-09-22 HU HU0105391A patent/HUP0105391A3/hu unknown
- 1999-09-22 ES ES99969329T patent/ES2345695T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-22 AT AT99969329T patent/ATE468108T1/de active
- 1999-09-22 JP JP2000573707A patent/JP2002526436A/ja active Pending
- 1999-09-22 OA OA1200100075A patent/OA11657A/en unknown
- 1999-09-22 UA UA2001031606A patent/UA75327C2/uk unknown
- 1999-09-22 SK SK322-2001A patent/SK287670B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 IL IL14167599A patent/IL141675A0/xx active IP Right Revival
- 1999-09-22 DE DE69942393T patent/DE69942393D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-22 EA EA200100269A patent/EA004797B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-09-22 EP EP99969329A patent/EP1115382B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-22 CN CNA99811216XA patent/CN1555254A/zh active Pending
- 1999-09-22 WO PCT/US1999/020880 patent/WO2000016746A2/en active IP Right Grant
- 1999-09-22 NZ NZ510442A patent/NZ510442A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-27 IL IL141675A patent/IL141675A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-03-05 ZA ZA200101829A patent/ZA200101829B/en unknown
- 2001-03-20 NO NO20011406A patent/NO330685B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-03-22 BG BG105372A patent/BG65675B1/bg unknown
-
2002
- 2002-01-17 HK HK02100385.1A patent/HK1039064A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-07-30 CY CY20101100715T patent/CY1110718T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0689551B1 (en) | Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments | |
KR102399854B1 (ko) | 면역원성 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (ΜERS-CoV) 조성물 및 방법 | |
CZ302878B6 (cs) | Proteinová vakcína | |
NO330685B1 (no) | Immunogene liposompreparat samt fremgangsmate for fremstilling av dette | |
JPH07505412A (ja) | Ctl応答の誘導 | |
AU2010210073B2 (en) | Splitting gp41 | |
AU4148999A (en) | Hiv virus mimotopes | |
US20110311615A1 (en) | Novel gp41 antigens | |
WO2022174156A1 (en) | Prophylactic broad spectrum vaccine for sars-cov-2 | |
JPH09504273A (ja) | Hivに対して使用するための多分岐ペプチド構築物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |