CZ20011013A3 - Imunogenní liposomové prostředky - Google Patents

Description

Imunogenní liposomové prostředky

Oblast techniky

Tento vynález se týká imunogenních liposomových prostředků.

Dosavadní stav techniky

Použití vakcín poskytlo historicky bezpečný a účinný způsob ochrany široké populace proti široké řadě infekčních onemocnění. Imunizace proti virovým a jiným mikrobiálním organismům je všeobecně bezpečná a účinná, a je z většiny odpovědná za prodloužení délky života dosažené u jednotlivců z rozvinutých národů. Na druhou stranu se, v závislosti na podstatě vakcíny a specifickém antigenu, vyskytuje řada nežádoucích vedlejších účinků. Neadekvátní inaktivace intaktních virů vedla v minulosti po vakcinaci k nezamýšlené infekci, namísto zamýšlené postvakcinační ochrany (Tigertt, Military Med. 124, 342 (1959). Příležitostně může imunizace intaktním organismem, jako je chřipka, navodit vývoj autoimunitních onemocnění namířených proti normálním tkáním, jako je syndrom Guillain Barre (Langmuir a kol., J. Epidemiol. 119, 841 (1984)). V přidání k samotným účinným látkám mohou přítomnost látek v buňkách nebo komplexní média způsobit indukci prudkých alergických reakcí na cizí proteiny (Yamane a Uemura, Epidem. Inf. 100, 291 (1988)). Protože účinné způsoby očkování často vyžadují vícečetné imunizace, mohou tyto nežádoucí příhody snížit účinnost vakcíny a mohou snížit obecnou přijatelnost způsobů očkování. Moderní techniky molekulární biologie byly nedávno testovány při pokusu poskytnout zlepšenou bezpečnost a účinnost nových vakcinových prostředků. Možné strategie, které jsou právě předmětem výzkumu zahrnují vakcíny založené na rekombinantních DNA technikách (Conry a kol., Cancer Res. 54, 1164 (1994); Hu a kol., J. Virol. 62, 176 (1988)), generaci jednoduchých syntetických peptidů jako antigenů (Nardelli a kol., Vaccines _8, 1405 (1992); Watari a kol., J. Exp. Med. 165, 459 (1987)) a přímou injekci genetického materiálu do tkáni ke stimulaci ochranné odpovědi (Ulmer a kol., Science 259, 1745 (1993). Tématem mnoha studií je zejména použití jednoduchých syntetických peptidů k idukci specifických imunizačních odpovědí. Tato strategie je atraktivní, neboť má potenciál poskytnout imunologickou specificitu, dokonalejší kontrolu výrobních postupů a eliminaci většiny sekundárních zdrojů materiálů nebo kontaminujících látek provázejících produkci imunogenní látky.

Použití čištěných proteinů nebo peptidových fragmentů k očkování je ná druhou stranu závislé na dodání materiálu na místo imunizace pomocí účinného nosiče antigenů. Potenciálně jedním z nejbezpečnějšich nosičů jsou vakcinační komplexy na lipid/liposomovém základě. Liposomy jsou, dlouho známy jako komerčně vhodné technologie, protože jsou schopny snižovat toxicitu léků, prodlužovat cirkulaci v krevním řečišti a ovlivňovat biodistribuci a farmakokinetiku lékových molekul (Fujii, Vesicles, vyd. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, str. 491 (1996)). Podány in vivo ' cirkulují liposomy v krvi a jsou odstraňovány monocyto— makrofágovým fagocytickým systémem, zejména v játrech, slezině, lymfatických uzlinách a plicních tkáních (Claasen, Vesicles, vyd. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, str. 649 (1996)). Schopnost liposomů řídit vzorec antigenní distribuce naznačuje, že lipozomální imunogen by byl maximálně vystaven imunitnímu systému. K dnešnímu dni bylo testováno několik systémů založených na lidech, včetně peptidů konjugovaných s lipidy (Nardelli a kol., Vaccines 8_, 1405 (1992); Watari a kol., J. Exp. Med. 165, 459 (1987))., rekonstituce celých proteinových podjednotek v přítomnosti peptidů (Morein a Simons, Vaccines 4_, 166 (1985); Gregoriadis, Tibtech 13, 527 (1995)) a asociace proteinů s přeformovanými liposomy (Therien a Shahum, Immunol. Lett. 22, 253 (1989); Alving a kol., Vaccines 4_, 166 (1985)). Zatímco se tyto strategie ukázaliy být imunologicky aktivními, technické problémy spojené s produkcí proteinů a jejich lipidových nosičů ve velkém, stejně jako hledisko nákladů, je činí méně atraktivními, než komerční technologie. Proto je zapotřebí zlepšený systém nebo způsob přípravy proteinových antigenů, aby se při vývoji vakcin zvýhodnil potenciál poskytovaný liposomy.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje imunogenní liposomové prostředky obsahující lipidy tvořící měchýřky a antigenní konstrukt obsahující jeden nebo více antigenních determinantů a hydrofobni doménu. Výhodně je hydrofobni doména spojena s membránou liposomového prostředku. Hydrofobni doménou je výhodně peptid, skládající se ve výhodném provedení z asi 15 až asi 500 aminokyselinových zbytků, výhodněji z méně než asi 300 a nejvýhodněji z méně než asi 50 zbytků, kde nejméně jedna nebo více aminokyselin jsou vybrány ze souboru sestávajícího z alaninu'(Ala), asparaginu (Asn), cysteinu (Cys), glutaminu (Gin), glycinu (Gly), histidinu (His), isoleucinu (Ile), leucinu (Leu), methioninu (Met), fenylalaninu (Phe), prolinu (Pro), šeřinu (Ser), threoninu (Thr), triptofanu (Trp), tyrosinu (Tyr) a valinu (Val).

4 4 •	•	4 •	• 4 * 4 4 · >	4 4 « 4	4 4 4
•	•	4 ·	P· 4	4 ·	4
4		4 4 4 4 ·	• ·	4 » 4	4
•	•	9	• 9	• 4	4
• ·		«	• 4 · 4 4 4 4	W »	• · 4

V jednom provedeni tohoto vynálezu obsahuje imunogenní liposomový prostředek jedno nebo více adjuvans. Příklady vhodných adjuvans zahrnuji lipofilní molekuly jako je lipid A a jiné lipopolysacharidy, Quil A, QS21, MF59, P3CSS a MTP-PE,.stejně jako ve vodě rozpustné molekuly, včetně cytokinú. jako jsou IL-2, IL-4 a IL-12, interferonů a podobně. Jiné příklady cytokinú jsou poskytnuty níže v tabulce 1.

V jiném provedení vynálezu antigenní konstrukt dále obsahuje oblast můstku (linkeru) spojující antigenní determinantu(y) s hydrofobní doménou. Ve výhodném provedení je oblastí můstku (linkeru) protein obsahují od 1 do asi 200 aminokyselinových zbytků. Aminokyselinovými zbytky jsou výhodně přirozeně se vyskytující aminokyseliny, jako jsou alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), kyselina .asparagová (Asp), cystein (Cys), kyselina glutamová (Glu), glutamin (Gin), glycin (Gly), histidin (His), isoleucin (Ile), leucin (Leu), lysin (Lys), methionin (Met), fenylalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), threonin (Thr), triptofan (Trp), tyrosin (Tyr) a/nebo valin (Val).

Tento vynález dále poskytuje způsob indukování imunogenní odpovědi u hostitelských živočichů, zahrnující podávání imunogenně účinného množství liposomového prostředku popsaného výše. Ačkoliv hostitelem může být jakýkoliv živočich včetně drůbeže, výhodně je hostitelským živočichem savec, výhodněji člověk. V určitém výhodném provedení imunogenní liposomový prostředek dále obsahuje jedno nebo více vhodných adjuvans.

Tento vynález poskytuje dále DNA kasetu k inserci do vektoru zahrnující sekvence, které kódují imunogenní fúzni protein, kde fúzni protein obsahuje hydrofobni proteinovou doménu a jednu nebo více antigennich determinant.

Tento vynález poskytuje rovněž způsob tvorby imunogenního liposomového prostředku zahrnující expresi genu, který kóduje fúzni protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobni doménu; rozptýlení lipidů a fúzního proteinu ve vhodném organickém rozpouštědle; vytvořeni lipidového filmu odpařením organického rozpouštědla; hydrataci lipidového filmu; a rozptýlení hydratovaného lipidového filmu k vytvoření imunogenního liposomového prostředku.

Tento vynález poskytuje dále způsob tvorby imunogenního liposomového prostředku zahrnující expresi genu, který kóduje fúzni protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobni doménu; rozptýlení fúzního proteinu ve vodném pufru; hydrataci buď lipidových prášků nebo lipidových filmů pufrem obsahujícím fúzni protein.; a rozptýlení lipidových prášků nebo filmů k vytvoření imunogenního liposomového prostředku.

V jiném provedení tento vynález poskytuje způsob tvorby imunogenního liposomového prostředku zahrnující expresi genu, který kóduje fúzni protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobni doménu; rozpuštění fúzního proteinu ve vodném pufru; a přidání fúzního proteinu k přeformovaným liposomům k vytvoření imunogenního liposomového prostředku.

V jiném provedení tento vynález poskytuje způsob tvorby imunogenního lipidového emulzního prostředku zahrnujíc! expresi genu, který kóduje fúzni protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobní doménu; a přípravu imunogenního lipidového emulzního prostředku kterýmkoli z výše popsaných způsobů, za použití lipidové disperze (například z oleje, jako je sójový olej) namísto liposomů.

V ještě dalším provedení tento vynález poskytuje způsob tvorby imunogenního liposomového nebo lipidového emulzního prostředku zahrnující chemickou sytézu fuzního proteinnu obsahujícího antigenní determinantu a hydrofobní doménu; a přípravu imunogenního imunogenního liposomového nebo lipidového emulzního prostředku kterýmkoli z výše popsaných způsobů.

Pokud je zde použit pojem spojený s membránou znamená, že hydrofobní doména je alespoň částečně usazená v membráně liposomů a výhodně není kovalentně vázána na lipidy, které tvoří měchýřky. Hydrofobní doména muže být rovněž navázána na ocásek mastných kyselin lipidů, který je samotný usazen v membráně.'

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje účinnost liposomového prostředku podle tohoto vynálezu při ochraně proti HSV2.

Obrázek 2 ukazuje srovnání účinnosti liposomového prostředku podle tohoto vynálezu s jinými vakcínovými prostředky.

Obrázek 3 ukazuje křivku přežití u myší, demonstrující schopnost liposomálniho HSV2g(1-23)-HD vyvolat ochrannou imunitní odpověď.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález poskytuje systém dodávající antigen, který je uzpůsoben ke zlepšení účinnosti a bezpečnosti imunizace proti různým mikrobiálním činitelům a rakovině. Imunogen může být kódován genovou kazetou tvořenou hydrofobní’ doménou (HD) připojenou na specifickou antigenní sekvenci. Plazmid obsahující sekvence nukleových kyselin kódujících hydrofobní doménu se připraví a exprimuje se ve vhodném hostiteli, jako je například E. coli, P. pastoris, hmyzí buňky, buňky COS-1 nebo buňky CHO.(Genetic Engineering News, 18, 17 (1998)). Jakmile je protein exprimován a vyčištěn, formuluje se do liposomu. V přítomnosti membrány se protein spojí s lipidovou dvojvrstvou, čímž se vytvoří stabilní struktura s hydrofobní částí spojenou s membránou a antigenním epitopem orientovaným směrem k vodnému médiu. Plazmid může být sestrojen s restrikčními místy v klíčových lokalizacích tak, že mohou být různé antigenní epitopy snadno substituovány, což poskytuje 'schopnost využít různých antigenních epitopů k poskytnutí maximální ochrany po imunizaci. Jednou z výjimečných vlastností této, kazety je, že proteinová komponenta může být v hostitelském organismu produkována ve velkých množstvích, snadno čištěna a poté .začleněna do liposomu. To poskytuje maximální flexibilitu při určování nejvhodnějšího epitopu, který vyvolá ochranu proti mikrobiálním činitelům a proti rakovině, pří zachování bezpodmínečného cíle, jímž je příprava ve velkém a komerční distribuce vakcíny.

Takto tento vynález poskytuje několik výhod, jimiž jsou 1) epitopy mohou být snadno měněny, což poskytuje maximální flexibilitu designu vakcíny; 2) do molekuly nosiče mohou být vloženy mnohočetné epitopy; 3) pokud je to žádoucí, mohou

• ·. *· · ·»·· být zahrnuty velké antigenní sekvence (například proteiny pouzdra nebo receptorové domény) nebo podjednotky; a 4) exprimovaný nosičový protein je rozpustný ve vodě a může být snadno čištěn za použití standardních způsobů čištění proteinů. Syntéza antigenního konstruktu jako fúzniho produktu rozpustného ve vodě minimalizuje potenciální problémy produkce ve velkém, vyvolané hydrofobnimi oblastmi proteinů. Proto by byla velkou výhodou konstrukce proteinu s hydrofobní doménou k vložení do lipidové membrány a tedy stále rozpustného ve vodě. Za některých okolností může být během čistícího procesu použito malé množství činidla usnadňujícího rozpouštění, jako je guanidin, močovina, natrium dodekasulfat, oktylglukosid nebo kyselina deoxycholová. Tento vynález poskytuje rovněž konstrukt obsahující jeden nebo více antigenů. Takový konstrukt může být vyjádřen jako:

H2N - antigenní místo I - HD - antigenní místo II - COOH

Tento vynález rovněž zahrnuje použití přirozeně odvozených nebo syntetických transmembrsnových helixů nebo svazku kelixů (2-12). Antigenní místa se mohou nacházet na N- nebo C-konci nebo mohou být umístěny mezi dvěma smyčkami tvořenými jednotlivými vlákny svazku.

Pojem antigen jak je zde používán se vztahuje k jakékoliv látce (včetně proteinu nebo proteinpolysacharídu, lipopolysacharidu, mikrobiální podjednotky, celého patogenu, nebo nádorových markérů), která je cizí hostitelskému živočichu, a poté co získá přístup do tkáně takového živičicha, stimuluje makrofágy, buňky předkládající antigeny a tvorbu antigenně specifických protilátek a reaguje specificky in vivo nebo in vitro s takovými protilátkami. Antigen navíc stimuluje proliferaci a/nebo aktivaci T lymfocytů s receptory pro antigen a zkříženě reagující antigeny (například buňky přirozených zabíječů (NK), cytotoxické T buňky a T pomocné buňky) a může reagovat s lymfocyty, čímž vyvolá sérii odpovědí tvořících buňkami zprostředkovanou imunitu. V imunogenních prostředcích podle tohoto vynálezu je výhodně antigen přítomen v množství asi 0,1 až 20 mg/ml antigen-HD. Výhodněji je antigen přítomen v množství asi 0,5 až 5 mg/ml antigen-HD.

Antigenní detrminanta je ta část antigenu nebo antigenního konstruktu, která určuje imunologickou specificitu. Obvykle je antigenní determinantou, nebo haptenem, peptid, protein nebo polysacharid v přirozeně se vyskytujícím antigenu. U umělých antigenů to může být látka o nízké molekulové hmotnosti, jako je derivát kyseliny arsanilové. Antigenní determinanta bude specificky reagovat in vivo nebo in vitro s protilátkou nebo s T lymfocyty indukovanými antigenní formou antigenní determinanty (například antigenní determinanta připojená k imunogenní látce).

Antigenní determinanty, které mohou být použity při provádění tohoto vynálezu, mohou být odvozeny z těch, které jsou jen příkladem uvedeny níže:

» ♦« v · ·« « · · · · · « ·· • · «

Virové patogeny

Co
	cn	<43 .
	σ>	σ
	rH	σι
	•w*	rH
	Ι-			sr
	Ο	CO	r-	σ>
	CM	rH	σ	σ>
		Ol	σι	rH
	K		rH
	ool	K.	—
	tl	rHl		rH
		sr|	O	OJ
	•
		Cti	σι	K
		C	t-i	oil
		•H		Ol|
	44	0
	0)	H	ml	co
	>	XJ	rH |	rH
		CD		(ti
		s	Φ	υ
	1—1		a	•r4
	(ti	-rH	•rl	tn
	M	g	O	o
	+4	•H	0	1—1
	to	M	cti	0
	0	Φ	>	H
	<	40		CQ
		Φ
		>	•	·.
	G		r-H	N
	O	s	O	44
	44	•	44	Cti
	cti	H		W
		0	Cti
		44		cti
	(ti		Φ
		cti	44	cti
	t>1		Λ	cti
N	cti	N	O	g
trs	M	a	co	Φ
44	S-l	φ	3	Xí
Ό	3	μ	M	3
O	S	U|	CQ	i-q

o5.

O t—1 m LO

	________.	m
«·—H	m	σι					K
CM	σ>	σι			σι		CO ιΓι
σ>	σι	rH			σι		U ) |
σ>	rH	•-r		•S1	rH
rH			σι	σ>			0>
·—r		CM	σι	σ>
	Γ-	CM	5—1	rH	t—	σ'	ώ
O	ΟΟ	00	r—'	—r	m	σι
σ	co				σι	r—1	•
CM		K	σ>	σι'		‘—	Ό
m	s	Γ	r-	r-			Φ
	9·	m	CM	CM	cm)	00	3
*k	r~	rH			rH 1	co
ml	i—l			*»		00	•
m|		•	CM1	Ol 1	Φ		Λ
	•	rH	.rH |	rH 1	G	·.	0
•	co	O			•rl	SJ<	Μ
Γ—{	rl	G	Φ	Φ	O	00	Η
0	Q	3	G	G	0	CM
M		g	•rl	•rH	(ti		•
•rl	>	H	u	υ	>	•
>	<4H		o	o		rH
	c	•	cti	cti	<	0
•	Η1	0	>	>	X5		§
					rH	-rH
	•	s			3	>

cn ΟΊ t“4 r—I rH o •H >

!-0

	rH	rH	rH	0	*· r-J
Γ—1		0	0	0		•	o
ο	•	44	44	44	Cti	r~H	44
44	r—1					0
	Ο	(ti	(ti	cti	r—1	44	3
cti	44				fO
	a	cti	cti	a	(0	CO
Μ	<ΰ	0	U	0	0		G
Φ		CO	Φ	Φ	σ>	G	O
G	σ'	g	co	CO	3	Φ	g
σ'	G	0	c	G	3	Φ	g
φ	Iti	n	0	O	Φ	M	•r|
3	s	H	1X4	ti	>	0	ω

Ή

G M
a	3
φ	44
tn	44
•rl	3		co
4-1	M		m
G	44	OJ	a
	CO	W	tn

	g
		Pí	Φ
		CQ	•ro
		H	’3
		•K	M
		—'	a	co
				3
		co	'>1
		Φ	>	•rl
	44	a	0	>
	>Ί	M	μ	O
	N	Φ	rH	i—1
	(ti	Λ	>	cti
	•ΓΟ			0
		Ή	Ή	Φ
co	'>1	N	N	g
3		>Φ	>φ	O
		>	>	44
•rl	O	O	0	>1
>	S	32		0

Γco σ i—I

CO co ool

ΙΓ)|

Ol rH

g o g σ' fti o to Φ PÍ

4J Φ >

l3

H

O 44 cti

O

M tO PH

5Γ

0
						3
						a
	a					ί>1
	o					44
	44
	•r|			CM		(ti
	a			ω	PQ	X5
	φ		rH	3		•rH
	>1		ω	-S.	H	CO
	r—1	s	3	rH	(ti	a
Pí	O		\	ω	rQ	cti
0	cu	&4	Μ M	Z	O	44	ΪΧ4

Ή CO a <0

G •rl to CL *

N

44 Ό o co oo

σ>		*-*» ·
r-d		m	CD
	OJ	σι	σι
	σι	σι	σι	ID
	σ>	Z	Z	σι
m	Z	*—*		σι
Η				Z
		00	r»
	Γ-	ID	o
<£>	σι	σι		CO
			Z	LD
CM		*.		00
	*1	ool		00
•		Z |	^1
rH	.		Z 1	K
o	rH	Φ		oj!
14	O	a	Φ	σι|
•H	c	-H	c
>	5	O	Z	co
		O	U	<
*·		cti	0	Z
	H	>	(ti	Z
H			>
O	•			*·
44	£	•	·.	•
	Φ	t—|		Z
0	CO	0	Z	0
		44	0	44
0			44
0)	•	OJ		(ti
b	i—1		(ti
c	O	cti		(ti
cc	44	•rd	(ti	i—1
N		M	0	01
0	(ti	0)	Φ	>
φ	5	0	(ti
	CO	Cn	tn	c
c	co	rH	3	ol
0 o	Ή	M	Z
>	S	z	Z	Z

	00 σι σι	CD σι σι	U0 σ σ	CD σι σι	00	«r 00
			l—i	Z	Z	:—1		σι	σι
Z				*—				σ>	Ζ
00		CM						Z	'—
σι		σι	r-~	CO	CO	CD		—*
i—1		' σι	σ	CO	CD	CO			Ζ
		Z	OJ	CD	CD	CD		00	CD
		—·						Z
Z			..	K	>»	K		ΟΟ
LD		00	ID	CD	CD	CD
		CD	σι	O	O	O			ο~|
*.		sr	Z	O]	OJ	OJ		οο	00|
O		00
σι			•	•		•		04	•
04		K	Z	rH	Ή	Z			0
		σιΐ	0	0	O	O		•	0
Φ		co|	14	14	14	14		ι—1	§
0			Z	Z	Ή	Z		Ο	£
3		co	>	>	>	>		(4	Η
Z		<						•Η
Oi		Z	*·					>	•
Z		CM	•	•	•	•			Μ4
			H	Z	Z	Z			0
		K	0	0	O	O		•	Η
•		•	44	44	44	44		ι—1
r-H		f”d						0	»·.
o		0	(0	01	cti	01		44	•
44		Z							Ζ
			•ri	>	>	>		0	Ο
(ti		01	Z	O	O	O			44
			O	44	44	44		14
>1	0	3	(0	01	0		Φ	• 0
Γ-		Φ	Bl >	1 t>1 K*	1	0
Γ—		c	•r-	Ό	Ό	Z		Ζ	tn
Φ	•rd	C	3	0	0		Ο	0
44	Φ	01	Z	Z	Z		Φ	Ο
co	3	H					Ζ	Ζ

o tDZ •HZ

Z

CCL <0

Cn <

«ο 04	Ο
κ
Η			ο
			44	σι
	CĎ			<
ζ		rH	CQ	W
m		Cm		Λ
Μ	ID	>	<	Ζ

co

Z

	00	sr	ID
04	C0	co	co
Μ	Ζ	3	Z

Z

Ό m > Z o

01

0	0	H
		BQ	O
		1	z				X
		0	0				Φ
		-H	0	<	CQ	O	Z
		Φ					&
		Z	xrd	0	0	0	£
		0	0	Ό	Ί3	Ό	Z
		z	>Φ	Z	Z	•H	0
		M	0	Z	Z	z
			O	•rd	Z	Z	0
ω	0	0	0	z	Z	Z	Φ
0	. i—1	0	£	0	0	0	CL
14	0	0	Φ	CM	CL	CL	14
•rd	z	Z	0	Φ	Φ	Φ	Φ
>	M	>	O	Z	ffl	Z	Z

σι cr> σι rp

	sr
			CN	ΟΊ
	σ>		CN	σ>
	OD	-Sř		rP
		co	..
	r—í	σ>	σ>|
		r—1	’—1	'T
		—'		co
			Φ	σι
		r—1	P	CO
	CN	CD	(ti
		r-	O
	k.			aol
	cn		<—1	co|
	kD	r-l	(ti
	rH	CO|	e	•
			•rl	i-1
	•	«	q	O
	r—|	a		P
	0	3		•rl
				>
	•H	g	Λ
	>	H	cti	•
			PI
	*·	•
		<P	v
	r—1	q	N	•
	o	H	Φ	r—1
	44		<—1	O
			Φ	44
	<XJ	•	TS
		i—1	q	(ti
	P	0	ω
	a	44	3	q
	0			•i—1
	s	(ti	cti	•H
N	P			• Pí
<ti	Φ	tn	-P
44	Q	a	q	q
Ό	O	0	3	<e
O	3	a	w	>
C
0)
Cn
*rl
4->
a	m q		tP
<	0 0		M

	in
	σ	CN	CN	CN
	σ>	Ch	σι	σι
	rp	σ>	σι	σ.
	•—	i—1	rp	rP
Φ			·—·	'—·
ω	CO
rti	m	rp	rP	rP
Λ	ir>	r~	Γ-	Γ-
rti	rP	00	ΟΟ	ΟΟ
4->	rp	Γ—	Γ-	r-
(ti
Q				·.
	CN1	σ>)	σι|	σ>|
řp	σ|	co|	oo|	co|
CP
0	ω	co	co	CO
I—1	<		<
o	a	a	a	a
•H	fM	CP	CM	Pu
PQ
			K
P	•	•	•	•
Φ	r—1	r-|	rH	P
rp	0	0	0	0
3	44	44	44	44
υ
φ	<0	<0	Π3	(ti
rp
o	a	co	CO	CO
3	υ	co	CO	CO
	•Η	3	3	3
>	N	(ti	(ti	(ti
H	5	•P	P	a
33	CO	co	CO	co

9	• 9 9 4 9	• 9 9 ·	• 9 ·· 9 · ♦	9 9 9
	9 9	9	9	9 9	.«	9
	9 9	• · · 9	9	9 9 9	9	9
	9	9	9	• ·	•	•
	• ·	•	• ·3^9 · » 9 9 *	9 9 9
			co
			co
		on	σι
		cn	a
		cn	·
		rH
		·—«*	co
			o
			co
		rH	co
		Γ*
		.rH
	kO		i—1
	r*	4»	•^r
	cr>	on!	i—1
	rH	CN|		Γ—
	*—·		•	σι
		•	i—1	σ>
	r4	rH	o	t—1
	r-í	0	q
	LO	q	3
		3	g	co
		g	g	o
	Důl	g	IP	CN
	kD|	H
			•	K
	r-d	»	p>	cn
	O			co
	M			CN
	•H	•	•H
	>	P	3	•
		3	co	i“H
	K	a	cti	O
	P		>-<	P
	Φ	*·		•H
	a	•		>
	to	r-|
	X) .	0	(ti
	φ	44	Ό	•
	2		O	rH
		3	P	0
	b		3	44
	q	q	W
	(ti	0	1	rti
		q	cti
	P	•H	P	>	1
	φ	a	3	Φ
	>	P	£	>
	(ti	3	•r-	Φ
	a	3		a

C eu cu ® 2 a 0

41 Cti b
	•H a •H <—1	0
	3	0
	MP	£
	Φ	Φ
	υ	q
	q φ
	'3	44 CO
<ti	44	tn
44	CO	P
a	q	3
•H	0	43
>P	cx	P
a	<ti	ctí
u	p>	3

• · · » ·· » · ·· « · · ·« · « ·· • · ·

N Φ 44 73 O

n	CO
σ>	σι
σι	cn						m
rH	r-l						00
							rH
Γ**1	Η	CO	00				*
CTi	σι	σι	σ
00	σ>	σι	σι
		ι—1	rH	00			ΙΓ)
to.	κ	χ—·	·—·	Ch			. LO
rH 1	Γ“11			σι	kO	kO	rH
Γ 1	γΊ	LO	kO	τ—1	Ch	σ
		ι—I	rH	·—·	σι	σ>	to.
t	•	ιτ>	LO		ι—1	rH
rH	rH	CM	CM	ΙΟ	—	—	. mo|
0	0
•Ή	•Η		κ	CO	σ	σ>	•
PQ	ca	CMl	CMl	ι—1	<ο	co	rH
		Γ-Ι	>1				0
r-4	I—I			κ
r—|	<—1	•	•	CMl	κ		•H
CD	φ	ι—1	ι—1	0-1	1	«srl	>
O	ο	0	0		τ-11	rH |
		Μ	L	•			•
•		•Η	•Η	ι—1	φ	Φ	a
G	G	>	>	0	3	3	CD
2	3			Μ	Η	•Η	0
		•	«	•Η	υ	0
	gí		3)	>	υ	Ο	•
H	Η				φ	Φ	*Ό
				«	>	>
		<	>				to.
Φ	φ	>—1	>—1		to»	to.	•
G		ο	0	to.	•	•	rH
•rH	•Η	44	44	•	rH	rH	0
φ	Φ			Γ-4	0	ο	44
Π3	Μ	Φ	Φ	0	44	44
				44			Φ
n3	Φ	Ο	0		Φ	Φ
		co	co	(0			a
Φ	Φ	ο	0		řh	>1	H
r“Ί	rH	75	73	Η	75	75	Φ
>1	>1	Μ	Μ	Η	75	75	M
Ο	Ο	0	0	Φ	Φ	Φ	O
ffl	CQ	Ο	Ο	CQ	PÍ	Ρί	s

CM σι σι α> C

CM kOl '©I i—1 O M •rl >

o

O co •rl

ÍH

Eh

Φ w

Φ CL O hJ lO cn σ> rH ' CM CM

	co]
	k0
	σ		•
	σ	r-	>
x··^'	rH	σι	Φ
·=τ		Ch	Pí
co		rH
σι	V	*—·	•
rH	rH		H
·—	CM	to	0
	rH	CM	•r!
		LO	Λ
σι	L		0
rH		to.	M
r-	rH |	lO]	0
		rH|	•ri
K	Φ		s
rH 1	a	Φ
00|	•H	a
	U	•rH	a
CO	O	O	•H
<	Φ	u	rH
Z	>	Φ	O
Oj	to.	>	to.
to.	3	to.	• ·
•	co	•	rH
rH	I—1	rH	0
0	Φ	o	44
44	S	44	Φ
Φ	Φ	Φ	tn
5-4	>1	*—1	3
O	Φ	•rl	•rH
4->	CO	N	g
44	H	3	g
•rH	Φ	Φ	Φ
	Cm	3	tc

Φ 75 •r| CO CL Φ

g •H

Φ 44 4J O € φ

d

44

Φ

•n

Φ

4->

75

Q

0

O

•r|

44

z

M

CL

•P

z

CL

0

d

CQ

<

CL

kO

Z

O

IL

<3

0

«

3

LO

IL

z

IL

IL

a>

>N

Φ

φ

Λ

>N

-3

Ή

Φ

3

Λ

75

rH

»3

—'

'Φ

ÍH

0

•r|

75

0

4J

ε

X“to»

•H

φ

xr|

U

0

3

co

3

0

Φ

CL

>1

g

'Φ

N

—

CO

Φ

44

3

c

CO

Φ

co

'rH

>1

Φ

3

3

Φ

3

φ

44

rH

rH

3

>U

>

>0

44

+J

mh

•H

•H

Φ

o

-H

i—1

CO

3

>

rH

C4

co

44

C

Φ

Φ

•H

0

44

•r|

CO

qs

Φ

1—1

£

0

Φ

>

Φ

CL

3

M

ÍH

Φ

M

5

SH

D

4-1

CO

L

•H

Φ

CL

0

Φ

Φ

Φ

N

Φ

•rH

>

s

co

Z

Z

CL

IL

>

Pí

>

	4 4		4	♦ ♦·		• ·
•		4	4	44 · ♦	•	4 4
«		•	4 4	4 ·	' a	4
•		•	4 4 44 ·	• 4	• a	4
4		4	4	• ·.	a	♦
	4'4		4 €	4 · · · · · ·		4 · a

	> OD	03 O
								O	cn
						«*·«*		rH	rH	σ>
						LP		—	·	. cr>
			cn	Z-'*.		σ>				rH
			cn	LD		σ>		ID	CM
			rH	00		rH	LP	O	' CM
				σ^		—·	03	CO	rH	LO
				rH			σι	OJ		LO
			LO	·—-		σ^	rH-		k.	cn
		z—*	vH			OJ	—·	*».	CO
	«Ϊ1	O*		co		LD		LD	rH	K A · 1
	σι	cn	CM		LD		rH	CO
	σι	σι		csj	σι	K	σι	rH	•	«-< 1
Γ~·	rH	rH			σ>	Ol	in		rH
σ>		-	tni		!—1	1—11		•	0	Φ
cn			>1	CNl				<-H	•H	G
rH	LD	ID		rH |		•	r-|	0		•rH
	LO	ID			rH	P	lp|	G	M	O
	σ>	σ>	rH	xi	CO	Φ		0	co	O
CO	CO	co	0	X	LD	g	•	s	O	d
0			P	Φ		l5	H	5		>
cp	*»	K	•rH	3			0	H	•
	col	ool	>		<^r	•	P		dl
*.	kO|	lp|		•	rH		•H	•	O	Ό
idI			•	rH	CM		>			1—1
rH|	•		G	0					•	3
	rH	1—1	φ	P	•	co	»		Ll	O
Φ	0	0	0	•H	r—1	•rH	G	•	Li	0
c	M	LI		>	0	Q	Φ	rH	2
•rH	-H	rH			P		0	O	u	d
υ	>	>	Lj		•r|	•		34
0				1-3	' >	G	•		*»	rH
rO	«					•H		d	>Ί	d
>	H)	l-D				1—1			LI	a
			H	•	•	u		P	a>	0
			0	1—1	1—1		•	Φ	>	tP
			34	0	0	«	rH	tn «;·	3
rH	r—1	H		34	34	X	0	β		G
0	0	0	d			a	34	•r	• <	Φ
>4	^4	34		d	d	H		XI	t rs	>

N	d	d	d	0 i	1—1 Φ	P Φ	c	d Ό	0 CO Φ	LP σι σι	Φ >
CÚ	34	3	3	0	Ό	1—1	H	1—1	34	ι—I	Ό
	•rH	0	0	1—1	3	5	>	3	x:	·
Ό	d	XI	XI	rtí	P	0	LI	0	υ		Φ
O	J3	ISJ	to		Eh	U(	<	0	CO	o OJ ID	i—1 XI Φ >P dl

3
Φ tn •H X C		sr CL	Γ CL	LP CL .	rH	W
«3	Β	>	>	>	M	0

	to	>1
Q	•H	Li
34	Q	•rH >
00	«	•H
sr	Cn	>
	<	d H
rH	•	X
co	X
M g	G	rH
	H	G X
		O
	CO	Φ
	CO	>co
	d CL	> 3
	N	0
	-rH	co
	>	•r~i

Ό >ι

Φ Ρ

	Λ	rH	•H
					Φ	X	>
					υ	Φ
				P	•H	>P	0
	P	<u		d	G	d	X
	0	CO		a	E		•H
	£	3	>1	0	•H	0	ε
		P	34		N	P	>φ
	»r|	•H	G	'>1		ÍL	EH
CO	N	>	>Φ	>	'd
3	>Φ	d		0	X
P	>	X	P	co	3
•H	0	0	d	'd	rH	•	•
>		cd	tSJ	CL	>N	d

Pro přehled viz Adimora a kol., Inf. Clin. Dis. N. Amer. 8^, 859 (1994) • *9 « 9 9· • 999 • 9*9999 • 9· • 9 *·

99··

9 9' 99 * 9· *99«

9·.

*··*· 9**

Pro seznam HIV antigenů viz HIV Molecular Biology Database, publikovanou v Theoretical Biology a Biophysics, New Mexico 1995.

•	kO CO σι	oo cn cn rH
a		i—1		•—
o
				r4
				ID
•		Ol		CN
Li		ν'!
Ll			r4
3			OP	up|
u		I—1	σι
		o	r4	•
K		Ή		>
c		Λ		CD
to		O	140	Pí
g		Ll	LO
o		0	r—i	•
tr		•ri		i—1
•ri		s	K	0
4->			rol	•H
C	CM	•	roj	Λ
	OP			O
	σ>	Φ	•	n
CO	r4	Pí	>	0
			Φ	rl
LI		•	Pí	S
•ri	CN	a
í>	LD	c	•	•
cd	OP		H	a
4-4			O	-rl
0		p	O	i—1
PÍ	cnl	4->	rd	Ní
	r*l	-P	S
		CD	Li	·.
V	ω	r-i	ctí	•
a			Λ	H
ctí	3	CD	CL	0
Ή	CL	M		44
44
•ri	K.	ctí	a	nj
CL	cd		o
(0	N i—1	to	CO	CL
Ní	rd cl	to	CL	O
	44 CL	•H	E	O
ctí	Ό o	CD	H	C
	O tP	s	CD	Ní
0
c
Ή
Λ
co
0
M —
			C
N Ch			•r-i	'>1
•Η σ>		'>1	X	>
> r-i	>	>	0	O
	0	O	4-1	i—1
CO	X	co	0	•H
5 CT	G cd	P	i—I	O
Li r-	•r| M	4J	P	•ri
Ή rH	X 4-)	P	P	44
>	0 C	CD	0	•H
ttí	H Cd	CL	Λ	75
44 LT)
0 OP
Pí r-l

P
P	r“H
CD	0
tr	c					E
•H	p	*			co	P	Φ
4->					•ri	c	i—1
c		>1		CO	CO	rl	•r|
co	H	a		•r4	co	<—I	u
		•ri		0	P	P	•rl
E	•	X		ttí	4-)	-P	44
ctí	f—1	0		LI	Li	0	•rl
a	0	4J		Λ	Φ	Λ	75
N	Ή			4-)	CL
φ	Λ	»ri		fi		E	E
CO	0	c		cd	ctí	P	P
	Li	i—1			r-i	ri	•rl
0	0	OJ	Φ	co	<—1	75	75
D	•ri	•rl	r|	P	Φ	-rl	•rl
CL	s	Li	L|	r4	P	Li	LI
		Φ	Φ	i—1	Φ	P	-P
		•P	4J	•rl	73	m	CO
			44	u	LI	0	0
		Φ	co	ctí	0	i------1	i—1
CD		CQ	CQ	CQ	CQ	o	O

Clostridium tetani tetanový Eidels a kol., Microbiol. Rev. 47, 596 (1983)

44*

4«4 • 4 4· • 4 44444

44

444

4

Corynebacterium diphteriae difterický Pappenheimer, Ann. Rev. Biochem. 46, 69 (1977)

		CO
		LO		Γ
o		>		σ>
co		cn		rH
σ»		r—l		*—*
r—i		s—*
				CO
		co		LO
		co		ID
4D		cn
	r~
	r-	*»		CN|
t—1	cn	r~l
sr	vi	CO		•
rH		rH		rH
				o
	’Φ	«		-H
to	CO	CD		Λ
•H	CM	•H		O
Q	CM	Q		M
				O
•		•		•rl
<4-1	cm|	4-1		s
a	r-|	C
H		H		•
	CO			>
*	<	•		Φ
1-0				Pí
	P4
K				•
a	K	N		P	•
0	4->	0		Ή	σ>
U)	<ΰ	•H		M	Οϊ
Tf	Λ	3		O	rH
M	(ΰ	Φ
05	W	O			•
X!	o5		c
U	(β	iD		•H	-P
-H				Φ	to
PÍ	•Η	Φ		4->
				to	K
(0	to	4d		i—1	ŠO
	s	U		Φ	00
i—1	φ	to		44	σ>
i—1	ι—1	í3		a	i—1
•H	tr>	Φ		Ή
O	Η				Ό d
					Φ
				a	Ή
				-H	P
				X	O
				0	Q
d				-O
H	<				Π5
X			'>1
0	d			>	44
4J	•Η			0	O
0	X			í-l	O
	0	rt		Φ	M
Φ	4->	Cn	r*“l	Λ
+J	0	•r-		0	Φ
a	X	Λ		Λ	r—1
φ	φ	to	u	XJ
					•tí

•H s

N •H

1X5	>
	to
	0	Φ		T5
	c	rtí		Φ
	•H	•H		i—1
	tn	í-l		Λ
•H	2	Φ		Φ
i—1	í-l	+4	φ
O	Φ	d	05
u	05	Φ	í-l
		to	Φ	'>!
Φ	to	t>1	r-|	d
•H	05	t	O	o
4d	d		Λ	φ
0	o	o5	O	Λ
H	E	<—1		O
n	0	r—1	O
Φ	Ό	Φ	•H	0
4d	3	Cn	í-l	í-l
0	Φ	-H	Λ	ÍL
to	to	Λ	H
M	P4	cn	>	*

·· * ·«

Γ-

	co
										0Ϊ
				sr	__,				v—1	τΗ
				σ>					cn
				σ»	σ>				σ>
				t—1	σι				τ—1	CO
	co				τ—1					Γ*
	cn	<D				σ>
	o			m		σ			kO	K '
		ΟΊ		r-	t—1	rH			03	co
		r—1		o	kp	—·			CM	kO
					cn			σι		r4
					lo	CO		o	*»
		5f	X>			CO		rH	^1	f-
	sr	00	σ>	exil	κ	<X>				K
	co	CO	σ	kp|	OJ I	cn			•	Φ
		t—j	r-l		kP|		X>	X>	>	Xí
							σ>	CD	Φ	O
	<o 1			G	.	exil	σ>	3*	ffí	0
	<0|	1 -	<P	5	G	kP|	r”1	CN		•H
		H|	kP		G				•	Pti
			cn	g!	ρ	•		·.	Ή
	c	φ	r—1	H	g	G		rH I	O	•
		cti •řH	·.		H	P	1	σ>|	•H rQ	O
		0	<ΪΓ I	ή	•		Η	co	O	•
	H	ϋ	r—11	G	«Η	H			' M	M
		Π5		H	G		•	3	o	2
	•	>	ω		H	•	CH	Pu
	m		G			CH	G		3
	c		•rl	•		G	H
	H	•	0	i—1	•	H		*	•
		H	o	0	<—1		K	r-4	a
		o	ctí	14	O	·.	•	0	•H	C
		rM	>		či	•	I—1	14	Γ—1	•H
	r-|			ctí		r—i	0		O	G
	o	cti	K		ctí	O	14	(tí		Cti
	Λ4		•	G					K	Φ
		' G	rH	0)	X		Ctí .	Cn	(0	□ti
	ft	0	0	CO	O	ctí		G	CO
		CO	či	o	ctí		<—1	•rl	?rd	(ti
N	Xí			•r|	M	M	Φ	i—1	rG
fO	tn	φ	ctí	X	X	O	14	M	•H	g
	£	7ti		X	O	X	C	(tí		Φ
*Ú	•r—{	δ	<0	03	ctí	•rl	0	CL	•H	rC
O	ω	<	S	S	cq		w	CO	tí	Q

C

0) tn •rl 4->

G

Ui w

Uj

X dl

ΟΊ VP
Pu
a	CQ
•H	CL
X	co
14	O
(ti
41	<	o
M	.CL	CL
Φ	W	CO
CL	O	O

CX1	CP	00
rH	tH	rH
rti			CL
\	CL	CL	s
r-	E	E	o
X	O	O	S

1-4 < CL

Bakteriální patogeny

CL CD

								CL
		CL			M			CO
		CO			Φ		CL
			CL	X.	41		to	ctí
	CL	(ti	CO	to	O	w		•H
	CO	rH			(ti	<ti	ctí	X
Φ		rH	ti	(ti	Λ	H	•H	o
•H	co	φ	•r|	rH	O		XI	•H
	G	41	i—1	i—1	p-M	>1	0	Pl
Φ		φ	CD	Φ	>1	E	-H	Φ
4->	•H	Ό	H	O	2«	03	i—1	X
,Í4	O	H	M	5	E	r—1	M	0
Φ	(ti	O	O	M	(0	XI	X	co
PQ	CQ	CQ	CQ	CQ	•o	o	M	M

• · • · · · ···· • · ·· · ft · · · ·· • · · · · ······· ’ · · ·· · co

co	z—%.
		ΟΊ		LQ
		i—1		00
				CTí			O
			rH	rH	o		CTi		LT)
		r-	σ>	'—·	σι		cn	co	00
		r-	σι		σ>		rH	σι	σ
		co	rH		rH			σ>	rH
				Mi	—·			i—ι
				LT)		CO	Ol	—
		CNl	t—1 ·		CM	σ	O		cn
		r-|	σ	».	t—	σι	cn	σ>	LT)
	Γ-		rH	Oll	CM	rH	rH	'sr	CM
	ΟΟ	>	cn	šr|	co	'—		co
	σ>	4->					•w	co	-
	rH	m		»		•	ool		r~|
	—-	Φ	(Til	q	ool	q	ld|	·.
		>	ιβ|	β	LT)|	β		col
	CM	a		g		g	•	co|	•
	i—1	H	.	g	•	g	q		q
	CO		β	H	q	H	β	•	β
	CM	•	β		β		g	q	g
		β		>		•	§	β	g
		•rl	gi	24	gí	m	H	g	H
	tni	i—1	H	q	H	q		g
	in|	u		H		H	•	H	•
			*		•		24		24
			24		24		q	•	q
	q		β	24	a	«	H	44	H
	0		H	m	H	H		q
				0		o	k.	H
		>		q	<	44	•		•
	H	1—1	<	q	*		i—1	•k	1—1
		0	rH	M	H	05	0		O
	>	44	0	0	O		44	r-i	44
	24		44		44	β		0
	q	β		as		r—1	β	44	β
	H		β		as	q
		a		q		β	co	β	as
N		0	β	o	q	>1	as		2
β	Λ	CO	φ	to	CD	0	g	to	β
44	Φ	β	Φ	q	CD	44	0	a	g
Ό	O	β	M	β	2	44	Λ	β	Ή
O	21	S	0	3	0	<		>H

		OD
		q*	σι
	σι	σ>	σι
	σι	σι	rH
	rH	rH	—'
	—·			Γ~
00			σ>	σ
σ>	CM	CM	CM	OC	co'
σ	O	O	CM	rH	σ>	i—i
rH	O	O		—·	σ>	σι
·—·	rH	rH			.rH	σι
				ao		χ—I
σι	K·		m|	co
σ>	r-	Γ~		co	σι
co	o	o			2)	co
	t—1	rH	i—1		CD	r~
			β		rH	r-
col		<	m	U0|		rH
co|	i—1	rH		co |
	0	0	•			K
	2	2	τ>	•	co|	σι|
q	Φ	Φ	CD	q		LT)|
β	D	44	s	β	«
	q	q		g	q	•
g^	Φ	as	•	g	β	q
H	0	o	44	24	g	q
	2	2	•rH		g	g
	2	44		•	H	g
24	CO	CO	PQ	24		21
q	β	as		q	•
H	0	0		H	24
			«		a	24
		s	rH		H	q
•	«	•	0	»		H
1—1	rH	rH	44	r-H
o	o	O		o	•
44	44	44	as	44	r—1	•
					0	>—1
as	as	β	co	β	44	o
			β			44
CD	•r-	•r-	0	24	β
2	44	44	Λ	m		β
0	44	44	44	•rl	Cn
g	CD	cd q	i—1	•r4	q
CO	2	2	β	u		s
o	C	0 Φ	Ό	•o	0
O	•r	«r-	r-Η	β	β	2
21	Σ	Σ	Í2	c4	21	fQ

q

-rH

CD

44

<

Q

0

2

<

ffl

β

d

q

Id

CO

(1)

-H

β

β

β

tn

as

Q

co

CO

<

rH

<

•r|

44

44

<

β

β

β

-P

.0

cn

CD

CD

O

44

ι—1

c

rH

CM

LO

co

x—1

00

44

2

2

β

β

&

On

P4

řu

04

ft

Q

σι

β

β

>

44

Ρ4·

0

	•rl
		2
		0
		1—1
	ά m	>1 CL	CL	CL
		2	m	W
	CO’	Φ
	β	44	β	β
	I—1	U	Γ-1	21
ω	Η	β	ι—1	•γΗ
•Η	Λ	Λ	Φ	CL
21	Οι	0	q	β
φ	0	0	0	0
44	S	Η	•Η	44
44	φ	Η	Οι	CL
β	β	Φ	Φ	Φ
ω		EC	21	21

• · 9 • 99 • 9 99 • 9 · 9 · ··

99

999 • 99 999 •999 9 9·9 • 9 9 99

9 9 · 99

9 · 99 • 9 9 9 999 99999

Ν 05 44 τ5 ο

CM		CD			CO
03		CD	03			H	03
03		03	03	03		03	03
i—1		03	H	03		03	H
		Η .	·«*	H	03	H
				·—	03	—'
r—1					H		CO
CO		Η	Γ—	03	>—	03	CM
ιη		Γ-	<X1	r-		Γ—	D
r—1		Η	CM	co	03	MD	H
		ID		co	r—1	CO
κ					00		·»
ID		<	>>01	>	in	·.	H)
Γ-		sť I	C0|	cm|		CM 1	<O|
Η		co|		M£>|	>	CD|
			*		cm|		•
,		,	c	<	<D|	•	3
τ5		3	3	c		c	g
φ		3	g	3	•	g	ε
S		ε	g	g	3	ε	ε
		g	H	g	3	ε	Η
		H		H		Η
Od i>č		MM		H	«	MM
Μ		UM	a	MM		MM	a
		a	H	a	•	3	H
		H		H	Mm	H
ίο					a
		>	•	>	H		•
1»			rH			•	i—1
d		H	0	1----1	>	i—1	O
ctí	O	44	o	»	O	44
t>		44		44	H	44
φ		Φ		0		Φ
m	Φ		Φ	44	Φ
			44				O
Ctí	to	P	to	Φ	to	<0
		Φ	Φ	H		H	0
>1	U	tn	0	Φ	O	N
44	0	ε	3	3	3	a
Μ	•rH	3	3	0	3	Φ
Φ	P	Φ	Φ	O	Φ	P
iD		ff)	31	ní	31	Ui

03 σ> γΗ

	CN	0Ϊ rH
		ΟΊ		Γ-
1—				ΟΟ
σν		rH
03			CD	>
H			03	CDl
—	03	r-	03	CD]
	03		H
LD	H		·—	•
CM	-—'	co		c
CM			H	3
r—1	CD	K	H	ε
	LD	Ol	H	ε
	H	kO]	H	H
1D|	CM
Η 1		•	>	•
		a	>5J>I	MM
Φ	Hl		Η1	a
a	O3|	g		H
•H		§	Φ
0	co	H	3	•k
u	<		•rH	•
Φ	Z	•		r*4
>	04	MM	u	0
		3	Φ	44
	K	H	>
	«			Φ
rH	rH	>
0	O	•	•	P
44	44	H	rH	Φ
		0	0	H
Φ	Φ	44	44	CU
C	σ>	Φ	Φ	Φ
0	c
to	•H	to	44	0
M	rH	Φ	Λ	a
Φ	P	Λ	O	φ
Ό	Φ	tn	Φ	+4
C	CM	3	&.	Φ
<	CO		CO	Π3

Η

4-)

Ο Μ

Λ

0/

CH		Q	Q	<	03	<
*iH		44	44	ld	ID	ID	44
jJ	o			00	m	CO
rj	ní	ld	00	Cn	04	Cn	O
Ȥ	31	00	H		S		03

Ο

Ρ

Φ Λ φ •Η

Ρ φ 4-) 44

Φ (Ώ

	ε	ε
	3	3
o,	•H	rH
to	P	P
	Φ	Φ
φ	44	44
•H	U	υ
P	Φ	φ
Φ	Λ	Λ
44	O	0
to	0	O
•rH	>1	>1
31	s	S

Φ ε to Φ Η

CL ο υ

Λ φ •Η

Μ Φ to m Η

Φ 'Ζ α to tO φ c ο ε ο Ό

Φ

C0 ·· · · ·* ·· * ·« ·· · ·· • · · · · ·· • ······ · · ·· • · · · · · ·· 9 ♦ ········

	ίο
			σι
			σ
			rH
		Γ
		σ		<-s
		σι	Ό	LO
		rH	Φ	σ
		•s	S	σ
9				rH	00
		Ο)	•	—·	σ		·—.
		C0	Ρ		σι		co
		C0	α	σ	rH		σ
		ΟΙ	Η	LO	'—		σ
				LO			i—1
			.	r-1	00
		LOÍ	Π		σο
		co|	Ο	κ	•Φ		Ol
			Ρ	«ΦΙ			σ
		<		<ο|	-		τ—1
		C			ο
			·»	•	οο
			•	C	Ο!		<D|
			β	5
		Η	ctí	Ε	φ		Φ
			ο		ο		α
			φ	Η	C		•Η
		Μ	XI		φ		U
,		C	I	•	•Η		ϋ
		Η	+J	Μ	ο		Ctí
			φ	C	ω		>
		κ	Ρ	Η
		•Ρ	Φ				k.
		ctí	>	<	•		•
		C		•	1—1		rH
		ctí	0	Ή	0		0
			«	ο	44		44
				44
		ctí	ctí		ctí		(D
				Φ
		Ρ	C		C		>1
		ctí	-Η	α	cti	Φ
	Ν	44	44	0	£		X
	ctí	Ρ	Ρ	ρ	Ctí	Ο
ο CS	44	Ρ	0	Ρ	ι—1	cti
	Ό	r—1	I—1	Φ	ctí	Φ
	Ο	<	cl	h	PQ	Μ
					Q
-					44
	C	Μ			00
	φ	Ο			00
	tn	CL			'
-	Ή	\
	Ρ	Οι			CU
	C	S	•Η	Ď4	ř
		ο	>	υ	C	£	S

CL co CL co co

	CL	5	co
	CO	0	3
		O	u
	Cti	0	o
	<—1	U	0
φ	rH	O	0
Ή	φ	rH	o
ρ	c	>1	P
φ	0		CL
Ρ	e .	cl	Φ
44	I—1	cti	P
Cti	cti	P	P
ffl	CO	co	co

Γ- cn rH
	rLO rH
5Γ	rol
σ σ	<N|
i—1	•
'—'	fi Φ
<o	tn	4
LO	O
«Φ	X!
Ol	•P	σ
cti	σ>
	CL	rH
rH 1
σ|	<—1
cti	σ
co	•H	LO
<	Λ	00
	0
P-l	P	K
o	co
k,	•H
	s	·.
rH		P
0	.	Φ
44	rH
cti	O
	44	•
σ>
c	Cti
-H		•
<—1	>1	w
p	P	•rH
cti	Cti	Q
CL	Φ
co	xi	C
		•rH i—l O m c H *» H
CL		0
S	>	44
o
Pí	H	ctí
Έ-Ι	&H	ctí
		P O g •H Ό
		< N
		•rH
g p		>
		tí
•H		Φ
I—1		rH
r—1		Λ
Cti		Φ
CL	CL	>P
cti	CO	CL
g	cti	O
Φ	•H	P
C	c	CL
O	•rH
CL	CO
Φ	P
P	Φ	•
H	:>·<	M-4

r—í
	ch						LCD
	CH						rd
	r-í	CD					ID
	's	CH
		σ>
	CH	rH				OD	oo|
	co			co		σι
				σι		σ>	•
		C\J		σ»	—X	'—I	>
	k.	'00		rH	t~~		Φ
	^1	Cs]			Ob
					σ>	σι
		K		<»	rd	rd	•
	>	O		co		LO	l----1
	Φ	. CO		sr		co	0
	txí	• ·χΓ			OD		•rd
					m	κ	Λ
	«	•		<X>I	O	m|	O
	rH	rH		kD|	sr	m|	Id
	0	0					υ
	Ή	•Η		•		•	Ή.
	p	M		q	ml	G	s
	o	a)		3	m|	G
	(-1	+j		E		Ε	•
	0	0		g	•	E	G
	•rl	cti		H	G	H·	rd
	s	m			G	#	·—1 O
				M	fí	Ud
	c	. 1*3		a	f-d	G	*
	•rd			H		H	+J
	rH				•		o
	u	•			M		0)
		H	•	G	•	m
	K	0		ι—1	H	<—1	G
	í-l	Ač	0		O	a)
	cti			Ač	·.	Ač	Pj
	g	cti		•
				(ti	i—1	(ti	cd
	&	r·			O
		0)	XS	Ač	Ό	<—1
	(0	M	G		G	H
			cti	cti	cti	Φ
NJ.	ft	C		i—1		i—1	P
cti	0	(ti	Ač	t7>	Ač	O
Λ4	LI	+J	M	G	M	4J
	3	φ	•rd	cti	•rd	•H
O		co				3

• ·	• ·	·· ·· ·
	Φ ·	•		• ·	• · · ·	• ·
	• ·	•	•	•	• · ·	•
	• ·	·· ·· ·	•	» · · ·	9
	• ·		•	•	• · ·	•
	• ·		•	·· ·	• · · · · ·	• · ·
			co
			σι
			σι
			rd
					co
			σ		σι
	r*		00		σ.
	•CH				r~1
	CH		K
	rH				σ>
	*
			.		r~
	LD		>		rd
	00		Φ		CO
	LO		Pí		·.
	K		.		ml
	ol		1----1		m|
	r-H |		0
			•H		•
	•		Λ		a
			o		G
	0)		M		E
	tó		O		E
		•H		H
	.		3
	r—1				•
	O				4d
	•H		G		G
	Λ		•H		H
	O		<—1
	G '		O		·»
	O				•
	•H				H
			•		O
		<-1		Ač
	•		0
	a		Ač		cti
	rH
	rd		cti		•H
	O				+J
		G		+J
	K		Φ		O
LO	a)		E		•H
CH	13		g		i—1
CH	Φ		G		tn
v—{	Φ		G		Ή
	Q		CQ		0

a φ

•H g

•H (1)

4-> O

M

CU

Q
rd	Ač
(ti
G	CO	íxi K
CU		O Ph

Cd

Fungálni patogeny

co	co Φ
to	G		Ό
G	r*H		•rd
E	r-}		O
co	•H	cti	-G
•ri	Cn	Ό	Ti
G	G	•H	•H
(ti	Φ	Ό	O
tn	Ol	G	0
G	co	cti	0
O	<	O	o

	•H
co		CO Φ Ό •rd O	CO	Ή G •rd M (ti Φ CO
G	cti	Ή	•H	•H
O	£	Ό	co	+J
O	co	•rH	G	co
O	cti	υ	Φ
u	r-|	0	•H	Φ
0	3	0	r—1	0
4J	O	o	•H	ě
Cd	d->'	cti	co	G
>1	CO	G	cti	Φ
M	-H	cti	M	G
U		Pd	3	Pt

• ·

Ol

N (0 X! Ό

O c Φ

Cn Ή 4-> β rσι

LQ fXl		σι r-l
cn			,—	Γ		'—
			00	σι
			σ>	σι		ιη
1			σ>	Η		co
			rH			σι
e
>				cn		κ
Φ			cn	σ>		r-l
tó		ο	LO	r-		CN|
		σι	cn	γΗ
		σι				•
I—1		rH		>-		ι-Η
o			CDl	IQ		0
•r|			C0|	C0		Ρ
X5		CO		r-í		-Η
0		Γ-	•			(0
u		σι	β	•		Φ
o		•šl1	β	η		Ρ
-rl			£	φ		Φ
s		κ	§	3		IX
		Η	Η
		οο|		•		•
β			•	ÍX	Φ>
-rl		ω	Μ
H		C	β	W		•
O		2	Η			4->
		Ρ4		•		β
			·.			Η
cd			β
Ή		•	Ο	*-
ύ		ι—1	C0			*
i-ι		ο	ι—1	ιΗ	ι—1
φ		XI	φ	0	0
w			3	X	X!
		Φ	£
φ			Φ	φ	Φ
		>1	CC
4-)	ζ—»	Φ		1-	1	Μ
β	γΗ	Η	φ	φ	Φ
Φ		β		4->	Cn
1-1	σϊ	Φ	•Η	4->	Φ
3	r—1	4->	Φ	C		4J
Ο		cn	S	Η	1	CQ

CN í£

Q • * · • ·· • · ·· • ······ • ·· ·· · *·

Parazitární patogeny

CO

CO •rl β Φ

Cn M O •r| Ό •r|

1-1 O fd

CO o 4->

&

M O σι σι r-l

__
ο		00
σι		σι	σι	00
σι		σι	Γ-	σι	χ—.
-χ—ι		r-l	LO	σι	00
		•-r	m	r-l	cn
					σι
cn		σι	·.		ι—1
cn		Γ—	col	Ο	'—
CN		CN	co |	5J1
cn		cn		CN	Ο
					σι
			β	κ.	ιη
col		col	3	vol
LOl	ca	co|	£	r-l ]	·.
	σ>		£		col
	σι	•	H	Φ	i-f|
β	x-4	β		β
3	—	3		Ή	Φ
			m	0	β
	O	|ί	β	Ο	•Η
H	r—1	Η	Η	Φ	υ
	σ>			>	0
•	r-l	•			φ
		<Η	•	k.	>
β	<	β	<—1	•
H	col	Η	0	γΗ
	co|		X	0	•
		κ		X	ι—I
•	.	•	Φ		0
1—í	β	γΗ		Φ	X
0	3	ο	C0
X		X	Φ	β	Φ
	§		14	0
Φ	Η	Φ	Φ	ω	β
			14	X	•Η
r—{	.	Λ	4->	φ	Ό
Λ	Ρ4	X!	β	Ό	Μ
Φ	β	Φ	0	β	Φ
	Η	S	ο		S

Οι	1—1	X
Μ	φ			cn
ω	•Η	Ο	(X	co
2	X	Γ-	ω	Cu
W		Τ~1	>	. Cn

β

Ή <U 4-> O

Úl

rH	CX
1 (X		Q r-l
£		XI 1
Φ	<	rt!
14	ω	r- S	tn
S		CN <	O

Φ •rl

1—1	íx co	ÍX co
Φ	Φ	£
<—1	Ή	3
	β	•Η
Φ	Φ	Ό
-rl	£	0
-p	η	S
x	co	(0
φ	•rl	φ
•rl	φ	ι—1
0	XI	X

prot epitopy Inf. Immun. 66, 2895 (1998)

195 kD protein Patarroyo a kol., Nátuře 328, 629 (1987)

·«	9 9	*·»	>·	•
t	•	•	99	9 <9	9 ·	··
•	•	• ·	9	0	9 «	•
•	•	···· ·	9	r	9 9 ·	•
•	9	•	9	•	• ·	•
	«1*	•			··	·««

			σ> σ> rH
Γ-	Γ-		—'
ΟΟ	ΟΟ	ζ-*«.
σ>	σ>	r-	rH
Η	rH	co	<0
		ΟΛ	O)
σι	. σ>	Μ	x
Ν	CN		dl
<ο	cjd	ΟΊ	h|
κ		sr r—1	.
00	00		r-4
CN	CM		0
C0	00	kO	rH
φ	φ	32	Λ O
Μ	1-1		14
	. G	φ	O
+J	Ap	Μ	•H
(d	Γΰ	2
Ζ	Ζ	4->
*	*>	rtJ Z	1—1
•	»		0
Η	Γ—		s
0	0	•
44	44	rH	s.

o cd cd 44 Η

0 Φ

	o μ	0 14	Φ G	φ
N	14	M	O	jd
cti	rd	nj	rH	4-»
	4->	4-)	r-4	14
TJ	rtí	(ti	(0	(0
O	PU	řu	m	Z

G

Ο Cn •Η

G	G	G
•H	•rH		-H
φ	Φ		Φ
4-)	4->		4-)
0	O		O
14	14		14
Λ		£4 ω	ft
Q	Q	0	Q
44	<44	OD CM	44
IT>	LT)	S	1£>
m	00	co	LO

CL to co

	(ti	rt!
cn	£	£
d	0	0
g	co	w
[/)	0	0
•rH	4->	G
a	co	<d
cti	•rH
tr		>1
M	O	14
O	ω	£4

<9 9

9 • · 'Λ · · · ·

CN o o rH

CO o o

VÍ

CN o O !—I

CO	_____	o
o			o
o	o		CN
r4	o		r-4
	r4
CO			Γ-
sf			CN
rH	Ψ	CN	CO
	r4	O
	rH	O	•
ol		rH	Ό
r— 1	b.	'—	Φ
	srí		S
	in.|	00
+j		O	•
4->	•	»5*
Φ	m	1—1
	φ		•
	pd	X.	1—1
		o|	cd
O	.	C0|	G
G	υ		a
(ti	G	co
O	cti		s
	O		φ
*»		P4	a

• rH o	K rH	K>
	44	0	l—1	r-H
		44	0	0
	(ti		44	44
		cti
	G		(0	ctí
N	0	><
(0	4->	M	a	44
	c	G	Φ	ctí
T5	Φ	O	x:	ζ
O	Q	O	ω

co m «s* rH

o	Ol	r-^
o	Γ—	00
rH	r-4 1	00
χ—-		o
	•	rH
iň	Ό	'—
rH	Φ
LD	S	O
CO		Γ-
		rH
..
t—11	X
o|	a	cnI kp|
ω	•
<		•
		H
Cu		O
	•	M
	rH	•H
•	0	>
rH	44
o		•
44	(ti
Ctí	rl
	M	•
-Η	(ti	rH
g	m	0
ctí	M	44
44	φ
cti	>	Ctí
5	ctí
cti	S4	2
W	Eh

CO o σ> r4

ΙΌ <—I

O cti

CD I-}

CO ΓΙ'' sr.i

LÍO| o G ctí O +J G H

H O X ctí

Ό

M

O

Λ w

cti ff)

m

tn <	rH 1	rH 1	r4
44	E-c	a		1
ι—1	tó	0	Ι-	O
Φ		rtj	Ο	P
CO	s	s	i	S

ctí >

φ

(0 G H	cti j>		0 n 'Φ	Φ •rH £	Ě	e 0
> 0 44 <ti Pí	4-> 0 > 0 3	3 ω S4 P4	+D ω 0 1—1 E4	'Φ 44 2 Φ a	0 44 £ >1 i-q	c ctí i—1 Φ S

Pro obecný přehled viz Finn, Curr. Op. Immunol. 5, 701 (1993) * -í<

• *	4 ·	44 44	•
• 4	«	4 4	♦ 4 4 4	• 4
4 ·	• «	4		4
4 4	4 4 4 4 4	4	4 t 4 1	4
4 ·	4	4	4 4 4	4
4 4				4 4 4

Další příklady antigenů a patogenů, které lze použít, se nacházejí v Mílích, Adv. Immunol. 45, 195 (1989), Hoshino a Kaplan, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 185, 185 (1994) nebo Venugopal a Gould, Vaccine 12, 966 (1994). V jednom provedení jsou použity podjednótky gpl20 genu p27 a p27 genu gag z viru lidské imunodeficience (HIV). V jiném provedení může být antigenní determinanta odvozena od antigenů vybraného z HSV gD nebo gB, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA nebo NA, H. influaenzae P5 nebo P6, fimbriálního proteinu a proteinu D.

Pokud je zde použit pojem hydrofobní doména (HD) znamená jakýkoliv protein, peptid, lipid nebo molekulu z hydrofobní oblasti nebo strukturu s oblasti povrchu větší než 500 ². Příklady hydrofobních domén zahrnují jakýkoliv trasmembránový (TM) segment (například glykoforin A; Tomita a Marchesi, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72, 2964 (1975)), hydrofobní doménu cytochromu bs (Taylor a Roseman, ΒΒΆ 1278, 35 (1995)), T doménu difterického toxinu (Choe a kol., Nátuře 357, 216 (1992)), doménu II pseudomonadového exotoxinu A (Allured a kol., PNAS 83, 1320 (1986)), svazek 4-helixu přenašeče citlivého na penicilín (Hardt a kol. , Mol. Microbiol. 23, 935 (1997)), svazek 7-helixu bakteriorodopsinu (Henderson a Unwin, Nátuře 257, 28 (1975) ) , svazek 12-helixu lac permeasy (Kaback a kol., Curr. Op. Struct. Biol. 7, 537 (1997))a kanál tvořící doménu kolicinu (Parker a kol., Nátuře 357, 93 (1989)).

Pojem vektor, jak je zde používán, se vztahuje k nukleové kyselině (například DNA) odvozené od plasmidu, kosmidu, fagmidu nebo bakteriofagu nebo synteticky odvozené, do které modou být vloženy nebo klonovány fragmenty nukleové kyseliny. Vektor může pro tento účel obsahovat jedno nebo více významných restrikčních míst a může být schopen autonomní replikace.v definovaném hostiteli nebo organismu, tak, že klonovaná sekvence se reprodukuje. Molekula vektoru může odpovídat nějakému dobře definovanému fenotypu hostitelského organismu, který je buď selektovatelný·nebo snadno detekovatelný. Některými částmi vektoru mohou být molekuly DNA, obsahující regulační prvky transkripce, translace,' stability RNA a replikace, a jiné sekvence DNA.

Pojem DNA kazeta, jak je zde používán se vztahuje ke genetické sekvenci uvnitř vektoru, která je schopna exprimovat zde popsaný fúzní protein. Kazeta nukleové kyseliny je pozičně a sekvenčně orientována uvnitř vektoru tak, že nukleová kyselina uvnitř kazety může být transkribována do RNA a pokud je to nutné přeložená (translatována) do produktu fúzního proteinu. Výhodně má kazeta svoje 3'- a 5'- konce upraveny pro snadné vložení do vektoru, například má na každém konci místo pro restrikční endonukleasu.

I když je výhodné, pokud mohou být antigenní konstrukty produkovány za použití technik rekombinace, rozumí se, že konstrukty mohou být syntetizovány jakýmkoliv způsoby známými v oboru, jako například chemickými způsoby. Ty mohou být zvláště výhodné, pokud má být použit nepeptidový můstek (linker) nebo, pokud hydrofobní doména obsahuje přirozeně se nevyskytující aminokyselinové zbytky nebo mimetika. Proto, i když výhodné provedení využívá rekombinantních způsobů k produkci antigenního fúzního proteinu, tento vynález poskytuje rovněž způsob zahrnující přípravu antigenních konstruktů způsoby chemické syntézy nebo kombinací rekombinantních a chemických způsobů a přípravu imunogenního lipidového prostředku jak byl popsán výše.

• * · « ·· ·« • · « «« · « «4« • · · · · ··· • ·····* · « « _{9 w}

Kromě výhodného peptidového můstku (linkeru) mohou být pro připojení antigenu k hydrofóbní doméně použity jiné můstky (linkery) známé v oboru. Příklady takových můstků (linkerů) zahrnují polyethylenglykoly, polysacharidy, kyselinu polykřemičitou, kyselinu jantarovou, kyselinu butandiovou, kyselinu adipovou a skříženě spojené chemické · látky jako jsou SMPT (4-sukcinimidyloxykarbonyl-cc-methyl-a(2-pyridyldithio)-toluen, DSP (dithiobis(sukcinimidylpropionat)), EGS (ethylenglykolbis(sukcinimidylsukcinat)), SMCC (4-sukcinimidyloxykarbonyl-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylat) a SPDP (N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) (viz rovněž Pierce catalog, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois).

V souladu s tímto vynálezem hrají liposomy významnou roli při dodávání antigenu, protože antigenliposomový komplex je po odstranění z cirkulace buňkami imunitního .systému přímo předkládán imunitnímu systému. Navíc výběr imunostimulačních drah může být ovlivněn změnou lipidového prostředku liposomu. Například různé imunostimulační molekuly, jako je lipid A (Asano a Kleinerman, J. Immunoťher. 14, 286 (1993)), P3CSS (Lex akol., J. Immunol. 137, 2676 (1986)), muramyldi- a tripeptid-PE (Fidler a kol., PNAS 78, 1680 (1981); Alving á kol., Vaccines £, 166 (1985)) a kationické lipidy (Walker a kol., PNAS 89, 7 915 (1992)), mohou být formulovány do liposomů ke stimulaci různých imunologických drah. Ve spojení s antigenliposcínovým komplexem mohou být použity jiné pomocné látky, například MF59, Quil A, QS21 nebo kamenec. Navíc mohou být k vyvolání imunitní odpovědi přidány imunoregulační molekuly, jako jsou cytokiny.

-. 28

Liposomy používané k přípravě tohoto vynálezu mohou být připraveny z široké řady lipidů, tvořících měchýřky, včetně fosfatidylesterů a esterů jako jsou fosfatidylethanolamin (PE), fosfatidylserin (PS), fosfatidylglycerol (PG) a fosfatidylcholin (PC); glyceridů, jako jsou dioleoglycerosukcinat; cerebrosidů; gangliosidů; sfingomyelinu; steroidů, jako je cholesterol; a jiných lipidů, stejně jako jiných exipiens., jako jsou vitamin E nebo vitamin C palmitát (viz rovněž patentové publikace US č. 4 235 871; 4 762 720;

737 323; 4 789 633; 4 861 597; a 4 873 089), na které však výčet není omezen. Příklady lipidů založených na fosfatidylcholinu (PC) zahrnují (C-18) distearoylfosfatidylcholin (DSPC); (C-16) dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC);

(C-14) dimyristoylfosfatidylcholin (DMPC); a (C-18, nenasycený) dioleylfosfatidylcholin (DOPC), na které však výčet není omezen. Je výhodné pokud jsou lipidy za tělesné teploty (přibližně 38 až 39 °C) v kapalné fázi. Proto lipidy s teplotou tání vyšší než tělesná teplota, jako jsou DSPC a DPPC, jsou méně výhodné (nicméně však mohou být vhodné) . Lipidy, které mají teplotu tání nižší než tělesná teplota, jako je DMPC nebo DOPC, jsou výhodnější, navíc je výhodné, pokud lipidový prostředek neobsahuje více než 10 % cholesterolu. Zvláště výhodné lipidové prostředky obsahuji asi 0 až 10 % cholesterolu, asi 0 až 15 % fosfatidylglycerolu (PG) a asi 0 až 100 % fosfatidylcholinu (PC)..

V určitých výhodných provedeních může prostředek navíc obsahovat asi 1 až 10 % pomocné(ých) látky(látek), výhodně je pomocná látka přítomna v množství menším než asi 5 %.

Příprava liposomu je dobře známa v dosavadním stavu oboru. Obecně se liposomy připravují řadou různých technik včetně ethanolových injekcí (Batzri a kol., Biochem.

Biophys. Acta. 298, 1015 (1973)); etherových infuzí (Deamer a kol., Biochem. Biophys. Acta. 443, 629 (1976); Schieren a kol., Biochem. Biophys. Acta. 542, 137 (1978));

odstraněním detengentu (Razin, Biochem. Biophys. Acta. 265, 241 (1972)); odpařením rozpouštědla (Matsumato a kol., J. Colloid Interface Sci. 62.,149 (1977)); odpařením organického rozpouštědla z chloroformu ve vodné emulzi (REV). (Szoka Jr. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 4194 (1978)); extruze MLV nebo EUV přes polykarbonátovou membránu s jadernými póry (Olson a kol., Biochem. Biophys. Acta. 557, 9 (1979)); zmrazením a vysušením fosfolipidových směsí (Piek, Archives of Biochem. and Biophysics 212, 186 (1981)), stejně jako sonikací a homogenizací.

Podle zvyklostí se liposomy rozdělují do kategorií podle velikostí á diskutuje se označování typů liposomu třípísmenným přídomkem. Multil-amelární měchýřky se obvykle označují MLV. Malé unilamelární měchýřky se označují SUV velké unilamelární měchýřky se označují LUV. Tato označení jsou někdy následována chemickým složením liposomu.

K diskuzi o nomenklatuře a pro přehled známých typů liposomů viz storm a kol., PSIT 1, 19 až 31 (1998).

Tento vynález předpokládá použití liposomových prostředků s vhodnou.pomocnou látkou (adjuvans). Přesto tento vynález předpokládá rovněž použití antigenního konstruktu, které nebude spojeno s liposomem, s vhodnou pomocnou látkou (adjuvans). Proto vakcína nebo imunogenní prostředek obsahuje dvě složky - antigen spojený s hydrofobní doménou; a vhodný adjuvantní systém. Příklady potenciálních farmaceuticky přijatelných nosičových systémů, které mohou být použity, zahrnují liposomy, emulse, Freudovo adjuvans (kompletní i inkompletní), kamenec, ISCOMS a obalené viry, na které však není výčet omezen.

Způsoby podle tohoto vynálezu budou využívat imunologicky účinné množství liposomového prostředku, to jest množství prostředku, které v kombinaci s kterýmkoli přidaným excipiens nebo nosičem vede k detekovatelné imunitní odpovědi u hostitele. Tam, kde bude prostředek použit jako očkovací prostředek, bude účinným množstvím, takové množství, které v kombinaci s kterýmkoli přidaným excipiens nebo nosičem, vyvolá u hostitele tvorbu specifické a dostatečné imunitní odpovědi, která propůjčí hostiteli ochranu před následnou exposicí mikrobu (profylaktické očkování), nebo propůjčí ochranu již nemocnému hostiteli (terapeutické očkování).

Stejný vynález, který byl nyní obecně popsán, se lépe pochopí s odkazu na následující podrobné příklady, které jsou poskytnuty pouze příkladem a nejsou zamýšleny, aby omezily vynález, není-lí uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

HSV2

Příprava HSV2gD(1-23)-TM

N-koncový aminokyselinový segment o 23 aminokyselinách z gD proteinu obalu HSV2 se připojí na transmembránový (TM) segment pomocí chemické syntézy na automatickém syntetizéru peptidů. Syntetizovaný peptid se štěpí pomocí standardních způsobů štěpení HF a čistí se preparativní HPLC za použití kolony Waters C18 a 100% mobilní fáze acetonitrilu s 0,1%

TFA. U peptidu se prokáže pomocí hmotové spektrometrie a kapilární elektroforézy nejméně 95% čistota.

Příprava liposomů

Liposomy se připraví sondovou sonikací podle dříve popsaných způsobů (Fujii a kol., Biochemistry 36, 4959 (1997)). Krátce shrnuto se lipidy (s proteinem nebo bez) rozptýlí v organickém rozpouštědle jako je chloroform / methanol. Pipetováním alikvótů lipidových roztoků do skleněných.zkumavek s kulatým dnem a odpařením rozpouštědla v proudu dusíku při 65 °C se vytvoří tenké lipidové filmy. Filmy s eumístí do vakua nejméně na osm hodin aby se odsranilo zbytkové organické rozpouštědlo. Příprava liposomů se dokončí hydratací lipidových filmů pomocí pufru a inkubací suspenze při 65 °C na 5 až 10 min s následnou sonikací. Poté se liposomy filtrují přes filr 0,22 m, aby se přípravek sterilizoval. Velikost liposomů se nastaví rozmělněním dinamickým světlem a tvorba agregátů probíhá nejméně čtyři týdny.

Zvláště výhodný liposomální HSV2gD(1-23)-TM přípravek má molární poměr DMPC : Chol : DMPG (dimyristoylfosfatidylcholin :'cholesterol : dimyristoylfosfatidylglycerol) 15 : 2 :3., s 2,5 % hmotnostními lipidu A.

Způsoby vakcinace a testování indukce imunitní odpovědi na virový antigen

Myším samičkám BALB/c nebo C57BL/6 (starým 6 až 8 týdnů) se subkutánně injikuje jedenkrát týdně po dobu dvou, tří nebo čtyř týdnů testovaný očkovací přípravek nebo pufr. Místa injekcí se sledují na nežádoucí reakce jako je -vývoj

granulomu a/nebo tvorba příškváru. Pokud se zvířata imunizují intranazální cestou, anestetizují se halotanem a prostředek (1 až 20 1) se podává do nozder k vdechnutí za použití sterilní špičky na mikropipetě (Gallichan a kol·, J. Inf. Dis. 168, 622 (1993)).

Imunitní odpověď myší se měří v pravidelných intervalech během očkovací procedury a po expozici viru. Test neutralizace virů protilátkami se provádí za použití klastrové plotny o 24 jamkách obsahujících 1 x 10⁵ buněk BHK, ke kterým se přidají různá ředění myšího séra smíchaná s virem. Po 48 až 72 hodinách inkubace při 37 °C v inkubátoru s CO2, se buněčná vrstva vyšetří na cytotoxicitu a stanoví se titr neutralizačních protilátek. Precipitační protilátky proti viru se měří inkubací různých ředění séra s 5 až 10 g virálního antigenu nebo 25 až 50 1 zásobního roztoku HSV2 (1 x 10⁵ PFU). Rovněž liposomy obsahující antigenní epitop se použijí jako cíle protilátek v testu ELISA, jak byl dříve popsán (Tuso a kol., Transplántation 55, 1375 (1993)). Výsledky posledně uvedeného testu, se použijí k měření hladiny vazeb a isotypové konfigurace protilátek.

Odpověď přecitlivělosti pozdního typu na virové antigeny se testuje za použití testu s. tlapkou. Očkovaná zvířata se anestezují halotanem a injikuje se jim 50 1 ultravioletí inaktivivaného HSV2 do jedné zadní tlapky a 50 1 lysovaných neinfikovaných buněk do druhé zadní tlapky. O 24, 48 a 72 hodin později se měří stupeň otoku myší tlapky za použití Vernierova kaliperu a srovná se se základními měřeními. Aktivita T buněk těchto zvířat se rovněž měří podle produkce cytokinú v odpověď na inkubaci slezinných T buněk s virovým antigenem. Slezina se z oočkovaných zvířat vyjme a homogenizáty sleziny se připraví jemným rozrušením sleziny sterilní plunžrem a protlačením buněk přes nylonové síto. Buněčné suspenze se promyjí a osadí se v hustotě 10 x 10⁶ buněk/jamku do mikrotitrové plotny o 96 jamkách. Po inkubaci buněk při 37 °C, po dobu 3 až 4 dnů, s různými množstvími virového antigenů se odebero z jamek buněčné supernatanty a testují se na přítomnost cytokinů. Komerčně dostupné cytokinové ELISA kity se použijí k definování profilu cytokinů (IL-2, IL-4, IL-6, IL- 10, IL-12, IFN-D, D-aktin a TNF-α od PharMingen, lne. (San Diego, Kalifornie)). Detekce cytokinového proteinu v supernatantech tkáňových.kultur pomocí sendvičové ELISA metody se provede za použití monoklonálních protilátek (mAb) specifických proti určitým cytokinům. Stručně vysvětleno, se plotny ELISA nechají přes noc potáhnout krysími monoklonálními protilátkami proti myšímu cytokinů. Plotny se blokuji 3% fetálním telecím sérem v PBS po 2 hodiny, poté se do každé jamky přidají alikvóty každého testovaného vzorku. Do každé jamky se přidají biotinylated (přesná citace) krysí monoklonální protilátky specifické proti myšímu cytokinů a následně avidinperoxidasa. Přidáním kolorimetrických substrátů se dosáhle barevné reakce. Plotny se odečtou ve spektrofotometru ELISA a koncentrace cytokinů se spočte ze standardní křivky získané z kontrolních rekombinantních cytokinů.

Model myší HSV2 encefalitidy pro testování liposomální ch očkovacích prostředků.

Očkované a neočkované (kontrolní) myší samičky BALB/c (10 až 12 týdnů staré) se intraperitoneálně vystaví letální dávce (1 x 10⁵ PFU) mozkové tkáně nakažené HSV2. Tyto myši vystavené intravaginálně vystaví letální dávce HSV2 se nejprve předem léčí subkutánně esťrogenem jeden týden před expozicí a jeden den (-1) před expozicí. Poté se anestetizují intraperitoneální injekcí acepromazinu nebo ketaminu. Poté se intravaginálně podá 10 až 30 1 HSV2 za použití sterilní špičky na mikrópipetě poté, co se předem zavede do vagíny suchý tampon Calgiswab (McDermott a kol., J. Virol. 51, 747 (1984)). Zvířata se monitorují 80 dní po expozici na přežití (denně), na úbytek hmotnosti (první dva týdny každý druhý den, a poté jedenkrát týdně), na výskyt povlaku a na neurologické symptomy (snížená hladina aktivity, vlečení nohou a paralýza končetin).

Antigenem indukovaná proliferace T buněk

Senzitizace hostitele na gD antigen se měří za použití analýzy antigenem indukované proliferace T buněk. Homogenizáty sleziny se připraví jemným rozrušením sleziny sterilní plunžrem a protlačením buněk přes nylonové síto. Buňky se suspendují v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního telecího séra (FCS), 10 mM pufru Hepes, 2 mM L-glutaminu, penicilín v koncentraci 25 mezinárodních jednotek na ml a 25 g/ml streptomycinu. Buňky se kultivují 4 dny, v atmosféře s 5% CO2, v plotnách se dnem ve tvaru písmene U o 96 jamkách, při koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml s nebo bez gD v koncentraci 5 až 20 g/ml. Kultury se na tři hodiny doplní 20 μΐ resazurinového barviva a poté se měří fluorescence na Cytofluoru II (Perseptive Biosystems, lne., Farmington, MA).

Cytokin specifická analýza mRNA

T-buňky z imunizovaných a neimunizovaných zvířat se vyšetří na hladiny cytokin specifické mRNA pro hlavní cytokiny, které mohou odrážet senzitizaci spojenou s imunizací, včetně IL-2, IFN-D, IL-4, IL-5, IL-β, a IL- 10. T buňky se získají ze slezin, jak bylo dříve popsáno. Všechny RNA se izolují za použití obměny (Cosenza a kol., Liver Transpl. Surg. 1, 16 (1995)) metody, kterou popsali Chomczynsky a Sacchi (Chomczynsky a kol., Analyt. Biochem. 162, 156 (1987)). Čerstvé nebo mražené buňky (2 x 10⁶) se rozruší·v 1 ml denaturačního roztoku (4 mM guanidinthiocyanatu, 25 mM natrium citrátu (pH 7,0), 0,5 % sarcosylu a 0,1 mM 2-merkaptoethanolu). RNA se vysráží přes noc, při teplotě -20 °C, inkubací s jedním objemovým množstvím isopropanolu. Celková koncentrace RNA se upraví na 260 nM a vzorky se až do analýzy skladují při -80 °C.

Analýza cytokinú se provede za použití obměny metody, kterou popsali Cosenza a kol. (Cosenza a kol., Liver Transpl. Surg. 1^, 16 (1995)). Jednoduché vlákno cDNA se připraví transkripcí 2 g celkové RNA ve 20 1 celkové reakční směsi za použití reverzní transkriptasy viru ptačí myeloblastosy (Boehringer Mannheim, Indianopolis, Indiana) . K aplifikaci DNA fragmentů předem určené velikosti z každého předmětného genu se použije sekvence specifických oligonukleotidových primerů pro myší cytokiny (tabulka 1) .

Oligonukleotidové primery použité pro semikvantitativní analýzu myších* cytokinů

Směs na PCR se skládá z 1 1 cDNA, 2,5 1 pufru PCR lOx,

1 každého z 5'a 3' primerů, 2,5 1 10 x dNTPs o koncentraci mmol/litr a 0,125 1.termostabilní DNA polymerázy z T. aquaticus (Boehringer Mannheim) o výsledném objemu 25 1. Specifické □-aktinové primery se použijí k amplifikaci 548 bp fragmentu jako vnitřní kontrola. Směs na PCR se překryje minerálním olejem a nechá se proběhnout aplifikace, následně inkubace směsi na 7 minut při 94 °C, 39 cyklů s 30s denaturací při 94 °C, ztužení primerů při 60 °C, 60s zvýšení na 72 °C a inkubace na 7 minut při 72 °C. Produkty PCR se oddělí na agarosovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu. Pásy se zviditelní pod ultrafialovým zářením, fotografují a densitometricky kvantifikují z fotografií za použití softwareového balíku Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond, Kalifornie).

Měření cytokinů pomocí ELISA

Cytokinové kity elisa dostupné na trhu se použijí k určení profilů cytokinů vylučovaných CD4⁺ T buňkami izolovanými z imunizovaných a neimunizovaných zvířat. Detekce cytokinového proteinu v supernatantech tkáňových kultur ze slezinných T buněk pomocí sendvičové metody ELISA se provede za použití monoklonálních protilátek (mAb) specifických proti určitým cytokinům. Stručně vysvětleno, se plotny ELISA nechají přes noc potáhnout krysími monoklonálními protilátkami proti myšímu cytokinů. Plotny se blokují 3% fetálním telecím sérem v PBS po 2 hodiny, poté se do každé jamky přidají alikv.óty každého testovaného vzorku. Do každé jamky se přidají biotinylated (přesná citace) krysí monoklonální protilátky specifické proti myšímu cytokinů a následně avidinperoxidasa. Přidáním kolorimetrických substrátů se dosáhle barevné reakce. Plotny se odečtou, ve spektrofotometru ELISA a koncentrace cytokinu se spočte ze standardní křivky získané z kontrolních rekombinantních cytokinů.

Anti-HSV2 CTL odpovědi

Po očkování se vyhodnotí přítomnost antigen specifických T lymfocytů (CTL) mezi slezinnými T buňkami. Slezinné lymfocyty se získají dříve popsaným způsobem.. Lymfocyty z každé léčené skupiny se shromáždí (n = 5), a poté se kultivují 3 dny bez antigenu při koncentraci 10⁷ buněk na jamku v kultivačních plotnách o 12 jamkách. EL-4 (H2^b) cílové buňky (ATTC) se inkubují s peptidem odpovídajícím epitopu HSV2 gB CTL umístěným mezi zbytky 495 až 505 (Hanke a kol., J. Virol. 65, 1177 (1991)) pro buňky s restrikcí H2^b a inkubují se 4 hodiny při 37 °C. Cílové buňky se promyjí a do každé jamky se přidají ΙΟΟμΙ titry obsahující 1 x 10⁴ buněk. Efektorové lymfocyty se promyjí, přidají se v různých koncentracích do jamek a kultivují se 4 hodiny při 37 °C. Procento specifických lýz se spočítá za použití kitu CytoTox 96 (Promega, Madison, Wisconsin) ze laktatdehydrogenasy (LDH) supernatantu ve standardním čítači ploten ELISA (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, Kalifornie) zaznamenáváním absorbance při 490 nm. Určení HSV2-antigen specifických lýz se provede podle standardního kriteria. Údaje se vyjádří v procentu specifických lýz = 100 x [(pokusné - spontánní efektorové cílové spontánní)/(cílové maximální - cílové spontánní)].

Výsledky

Křivka přežití zobrazená na obrázku 1 demonstruje účinnost komplexu liposom-peptid při ochraně myší proti systémové expozici letální dávce HSV2 stejně jako stanovení počtu očkování požadovaných k získání 100% ochrany. Obrázek 1 ukazuje počet dávek liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM vakcíny požadovaných k ochraně BALB/c myší před letální expozici HSV2. Skupiny po 7 myších prodělají 2, 3 nebo 4 imunizace před expozicí letální dávce HSV2. U čtyřech očkování nevykazuje žádné ze zvířat imunizovaných liposomální vakcínou neurologické komplikace spojené s infekci HSV2, během studie nejsou detekovány ani jiné známky infekce. Co je významnější, všechny myši přežijí letální expozici HSV2. U dvou nebo tří týdenních imunizací je chráněno méně než 100 %,myší. Naopak myši, které prodělaly čtyři očkování placebem (to jest pufrem) nejsou proti expozici HSV2 chráněny.

Liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM se testovaly rovněž na třech skupinách myší C57BL/6 a bylo zjištěno, že vyvolávají podobný ochranný účinek ve srovnání s výsledky dosaženými u myší BALB/c. Tyto výsledky shrnuje tabulka 2. Myší skupina 1 je očkována subkutánně v prvním a čtvrtém týdnu, myší skupina 2 je v prvním týdnu očkována subkutánně a ve čtvrtém týdnu intrarektálně a myší skupina 3 (kontrolní skupina) není očkována. Jeden týden po posledním očkování (ve čtvrtém týdnu) se myši intraperitoneálně exponují letální dávce HSV2 a monitorují se 3 týdny na morbiditu a mortalitu. Jako u myší BALB/C mají skupiny myší, které byly očkovány liposomálním HSV2gD(Tl-23)-TM signifikantní počty přeživších jedinců, pokud jsou očkovány buď subkutánní injekci neJoo pokud dostanou subkutánní priming (přesná citace) dávku následovanou slizniční upamatovací dávkou.

Tabulka 2

- 40 Přehled výsledků srovnávajících přežití myší C57BL/6 u různých očkovacích léčeb liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM

Skupina'	Očkovací léčba	přežití	(n = 7)
1	první týden - subkutánní čtvrtý týden - subkutánní	6/7	(86	%)
2	první týden - subkutánní čtvrtý týden - intrarektální	5/7	(71	.%)
3	kontrola - bez očkování	1/7	(14	%)

Obrázek 2 ukazuje porovnání liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM s jinými způsoby předkládání antigenů. Každá skupina sedmi myší prodělala před expozicí letální dávky HSV2 4 imunizace. Čtyři očkování liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM vedly opět ke 100% ochraně proti letální dávce HSV2.. Čtyři očkování neliposomální HSV2gD(Tl-23)-TM nebo liposomy bez HSV2gD(Tl-23)-TM nejsou schopny poskytnout signifikantní ochranu proti letální expozici HSV2. Toto jasně demonstruje, že k dosažení účinné imunitní odpovědi spolu musí být spojeny jak liposom, tak zkonstruovaná proteinová složka. Zvláštní význam má zjištění, že liposomální HSV2gD(Tl-23) -TM vakcína poskytuje mnohem lepší ochranu než očkováni teplem inaktivovanými viry, protože vakcíny založené va virech se obeně považují za dobře stimulující imunitní odpověď (Desrosiers, AIDS Res. Hum. Retrovir. 8, 1457 (1992)).

Na konci studie se myši usmrtí a sérum se odebere za účelem stanovení charakteru imunitní odpovědi v tu dobu. Zjistilo se, že sérum očkovaných myší obsahuje vysoké titry protilátek (1 : 100), které specificky rozpoznávají peptid použitý ke stimulaci imunitní odpovědi a dále, způsobují shlukování (precipitaci) aktivních virů, což naznačuje, že protilátky rozeznávají epitop na povrchu viru. Protilátky rovněž shlukují HSV2gD(Tl-23)-TM liposomy a nikoliv liposomy bez peptidu, což naznačuje, že specificky rozeznávají gD epitop HSV2.

Níže uvedená tabulka 3 poskytuje přehled imunologických testů demonstrujících, že liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM podávaný subkutánně jednou týdně po dobu čtyř týdnů vyvolává silnější imunitní odpověď ve srovnání se standardním adjuvans. Očkování antigenem smíchaným s inkompletním Freudovým adjuvans nebo kamencem není schopno poskytnout myším ochranu proti expozici virem. Údaje získané z testu neutralizace a reakce pozdní přecitlivělosti jsou uvedeny vedle údajů o přežití u nejvyšších titrů protilátek (odpověď B-buněk) a nejvyšší míry otoku tlapek (odpověď T buněk) pozorovaných u skupiny liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM. Jinou významnou výhodou spojenou s léčbou liposomální HSV2gD (Tl23)-TM je, že na rozdíl od výsledků zjištěných u myší, kterým bylo podáváno inkompletní Freudovo adjuvans s. antigenem, nevyskytuje se u žádné z myší podráždění nebo zánět v místě injekce (17/17 zjištěných zarudnutí v místě injekce u inkompletního Freudova adjuvans oproti 0/17 u liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM). Pokud se použije kamenec vyvine se u 17/17 myší v místě injekce hmatatelný granulom. Naproti tomu liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM nezpůsobuje tvorbu granulomu u žádné z myší. V souhrnu tyto výsledky naznačují, že odpovědi B- a/nebo T buněk (jak se posoudí podle titrú neutralizačních protilátek a stupně otoku tlapek) přispívají u myší k ochranné imunitní odpovědi proti letální dávce HSV2, vyvolané liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM.

·· ·

J · · . ··. ♦ · · ·· • · · * · ··♦» ·*·«··« * *·«· · • · · · · · · · ** ♦ »·« ···· ·· »·· .

Přehled, výsledků porovnávající imunitní odpovědi liposomální HSV2gD(Tl-23)-TM, inkompletního

Freudova adjuvans smíchaného s HSV2gD(Tl-23)-TM, kamence smíchaného s HSV2gD(Tl-23)-TM a

CO

PQ eu £ a 4->

'>1 C Φ > O 44 •P •m

C Ή >1 g 'a.

w

Ή G H O P. P a o

Ή a φ <—i > o P

44	•Ρ
Φ	G
Λ	Ο
Φ	44
Η
4->	Φ
	44
3		>Φ
44	3	α
0	rG	•Η
4-)	Φ	(X
Ο	4J	3	ο\ο
	Ν	44
ο\ο	>	ω	00

o\o

O

0\0 o\0

O O

>υ	G
φ	Φ
Ν	Ρ
•Η
rp	>
Φ
Ρ	44
4-)	Φ
3	-Ρ	Φ
Φ	'Φ	Ο
G	ι—1	Η	00
	•Ρ	Ν		Γ	OJ
Ρ	-Ρ	Ο	kD	• rH	Ο
4->	0	CU	v“1	Γ*	rH
•Η	Ρ	>4	• ·	4 *	• ·
£4	Λ	Φ	γΡ	rH	rH

•P Φ >0 o Λ

Ή > •Η >Ν

Φ >Ρ CH >φ G •Η

Λ 3

Ο

Φ >

ΓLT)

Γ*· ο

rH

		0	£
	1	>	Φ
	Η	Ο	G		κ>
	2)	Ρ 3	Φ Cd	S	'>1	S	G Φ
		Φ	•Η	Η	G	£4	>
Φ	>	Ρ	44	1	Φ	I	0
Λ	co	&4	G		Λ		Ρ
>0	>Ρ		Φ	m	Ο	ΓΌ	44
'Φ	Ή	Ή		04	'Ρ	04	3
>—1	G	C	ω	I	£	1	Í1
	rp	4->		rH	ω	γΗ
'Ρ	'Φ	Φ	03	Η		£4	ε
υ	£	Η	3	•ν'	0		φ
φ	0	Λ	Φ	Q	Φ	Q	-Ρ
>	3	£		CD	C	CD	'φ
0	Ο	Ο	3	04	Φ	CM	Ιρ
44	α	44	•rn	>	Ε	>	m
>0	•rH	G	Ρ	ω	φ	ω	0
Ο	Ρ!	Η	Φ	πα		κ	Ρμ

fyziologický roztok

·* »

Přiklad 2

Příprava HSV2gD(1-23)-HD

Genový konstrukt kódující HSV2gD(1-23)-HD se generuje za použití přesahujících (overlapping - přesná citace) oligonukleotidů, kódujících epitop gD spojený s hydrofobní doménou (HD) o 45 aminokyselinách. Konstrukt se sestaví postupným prodlužováním (elongací) a amplifikací kódující oblasti genu. Poté se gen zapojí (liguje) do vektoru exprese pTrcHis a ověří sekvenční analýzou. Malé studie exprese se iniciují indukcí pomocí 1 mM IPTG a potvrzují Western blott analýzou za použiti myších protilátek vytvořených ve vakcinačních studiích s HSV2gD(1-23)-TM. Protein se rovněž analyzuje pomocí SDS-PAGE a je zjištěno, že pásy odpovídají očekávané molekulové hmotnosti (= 6 kD), jak se zjistí Coomassie barvivém. Poté, co se demonstruje, že očekávaný protein je exprimovaán v malém množství, provede se fermentace desetilitrové šarže E. coli obsahující konstrukt pTrchis/HSV2gD(1-23)-HD z které se získá přibližně 60 g puněčné pasty. Po indukci se exprese HSV2gD(1-23)-HD ověří Western blotovou analýzou v průběhu fermentace. Bakterie z přibližně 30 g buněčné pasty se lizují French Pressem v pufru obsahujícím 1 % kyseliny deoxycholové a 5 mM imidazolu. Po odstředění, kterým se buněčná drť zpeletuje, se HSV2gD(1-23)-HD nalézá především v supernatantu rozpustném ve vodě.

Vyčištění se dosáhne prohnáním supernatantu obsahujícího rozpustný protein HSV2gD(1-23)-HD přes niklem osazenou chelatační sefarozovou kolonu. Kolona se následně promyje roztoky obsahujícími 5 mM imidazolu, 200 mM imidazolu a poté 5 mM imidazolu s 1 % kyseliny deoxych.olové, čímž se odstraní všechny zbytkové proteiny. Protein HSV2gD(1-23)-HD se nakonec eluuje 200 mM imidazolu a 1% roztokem kyseliny deoxycholové. Píkové frakce se identifikují Coomassie barveném SDS-PAGE a Western blotovou analýzou. Všechny píkové frakce obsahující HSV2gD(1-23)-HD se shromáždí a koncentrují pomocí koncentračního zařízení Millipore Ultraprep. Výsledný koncentrát vykazuje obsah čistého HSV2gD(1-23)-HD, jak se ověří podle přítomnosti osamoceného pásu na Coomassie barveném gelu SDS-PAGE. Na poprvé se získá přibližně 2 až 3 mg HSV2gD(1-23)-HD pro liposomální přípravky a očkovací studie.

Liposomální prostředky a způsoby očkování, testování indukce imunitní odpovědi, myší model HSV2 encefalitidy, antigenem indukovaná proliferace T buněk, cytokin specifická analýza mRNA, ELISA měření cytokinů a odpovědi proti HSV2 CTL jsou vzásadě stejná, jak byla popsána v příkladu 1.

Výsledky

Křivka přežití vyobrazená na obrázku 3 ukazuje schopnost HSV2gD (1-23.)-HD vyvolat ochrannou imunitní odpověď. Bylo zjištěno, že % přežití je u tohoto určitého prostředku 40 %. Pro srovnání, kontrolní zvířata léčená pufrem nevykazují žádné přeživší jedince, zatímco kontrolní HSV2gD(1-23)-TM skupina má 100% přežití.

Příklad 3

Příprava HIV (gpl20-HD) a HIV (Δ gpl20-HD) u buněk COS-1

Pro konformační studii epitopů se získá sekvence gpl20 z plazmidu pHXB2-env obsahujícího gen gplSO (NIH AIDS

Research and Reagent Progarm, Rockville, MD) pomocí amplifikace plazmidové DNA prostřednictvím PCR a šubklonovánim produktu 1536-bp k sekvenování dideoxynukleotidovou· metodou. Za použití 5' (sense) primeru odpovídajícího prvním 21 párům baží (bp) genu HIVgpl20 ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT a 3'(antisense) primeru odpovídajícího nukleotidům 1515 až 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTCAC se eliminuje protein HIV gp41, segment gpl20 se klonuje a amplifikuje pomocí PCR. Produkt PCR se zapojí (liguje) do pcDNA4-His obsahujícího hydrofobní doménu (HD) jako plasmid genové · kazety (Invitrogen, lne., San Diego,· Kalifornie). Mutanty s delecí se vytvoří PCR amplifikací za použití příměrových párů 5' a 3', které vyloučí nukleotidy kódující' zbytky v proteinu gpl20, ty zahrnují Á136-151gpl20,

A128-194gpl20 a A123-203gpl20. Primery obsahující vhodné sekvence restrikčních enzymů umožní ligaci dvou genových produktů. Každá mutace se proto nahradí dvěma aminokyselinami kódovanými specifickými restrikčními místy, které jsou předmětem zájmu. Výsledné geny se ověří sekvenováním DNA za použití protokolu a reakčních činidel z kitu AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) a výsledky se zjistí sekvenovacím zařízením kitu ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) a analyzují se pomocí kitu AM software v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey). Plasmidy se přenesou (transfektují) do buněk COS-1 (ATTC, Rockville, MD) za použití reakčního činidla DEAE-dextranu. Stabilní transfektanty se selektují za použití Zeocinu ((Invitrogen, lne., San Diego, Kalifornie) a klonují se limitujícím ředěním. Proteiny gpl20-HD se čistí pomocí selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Klony, které produkují vysoké hladiny proteinu se vyhodnotí Westwrn blotovou analýzou a analýzou FACS. Histidinový můstek (linker) HIV(gpl20)-HD, HIVÁ136-151gpl20, HIVÁ128-194gpl20 a HIVA123-203gpl20, se odstraní pomocí štěpení enterokinasou poté, kdy je čištění ukončeno. Pokud je to nutné provede se chromatografie vylučující velikosti, ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobními interakcemi, k dalšímu čištění proteinů HIVgpl20-HD a HIVAgpl20-HD.

Příprava HIV-HD

Nukleotidové sekvence kombinující tři epitopy (CTL, T pomocných buněk a B buněk) se vybere ze sekvencí nalezených v různých proteinech HIV (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (sekv. id č. 19) a odvodí se od této proteinové sekvence za použiti preferencí kodonu E. coli (Looman a kol., EMBO J. 6, 2489 (1987)). Syntetický gen kódující HIV sekvencí se vytvoří syntézou, hybridízaci, PCR a ligací přesahujících . (overlapping - přesná citace) oligonukleotidů. Vytvořený gen o plné délce kódující fragmenty HIV se amplifikuje pomocí PCR a zapojí (liguje) se do plazmidu exprese. Výsledné geny se ověří· sekvenováním DNA.

HIV-HD obsahující plazmidy pTrcHis se transformují do E. coli. Bakterie se ihkubují v médiu LB s ampicilinem (50 g/ml) při 37 °C až do střední logaritmické fáze. V tu dobu se přidá IPTG k indukci hybridního promotoru trp/lac. Vyšetřuje se po hodinách, aby se určila optimální postindukční exprese proteinů HIV-HD. V čas optimální exprese se buňky odeberou odstředěním. Buněčné pelety se lyžují a odstředí. Lyzát se vyšetří na přítomnost proteinu. Proteiny HIV-HD se čistí pomoci selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Pokud je to nutné, provede se

47a 4444 4 4 · 4 · 4 4 4 • 4 4 4 · 4 4

4 4·4 4·4· 44 444 k dalšímu čištění proteinů HIV-HD chromatografie vylučující velikosti,··· ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobními interakcemi.

Příprava liposomů

Liposomy se připraví sondovou sonikací podle dříve popsaných způsobů (Fujii a kol., Biochemistry 36, 4959 (1997)). Krátce shrnuto se lipidy (s proteinem nebo bez) rozptýlí v organickém rozpouštědle jako je chloroform / methanol. Pipetováním alikvótů lipidových roztoků do skleněných zkumavek s kulatým dnem a odpařením rozpouštědla v proudu dusíku při 65 °C se vytvoří tenké lipidové filmy. Filmy se umístí do vakua nejméně na osm hodin, aby se odstranilo zbytkové organické rozpouštědlo. Příprava liposomů. se dokončí hydratací lipidových filmů pomocí pufru a inkubací suspenze při 65 °C na 5 až 10 min s následnou sondovovou sonikací. Poté se liposomy filtrují přes filr 0,22 m, aby se přípravek sterilizoval. Velikost liposomů se nastaví rozmělněním dynamickým světlem a tvorba agregátů probíhá nejméně čtyři týdny.

Způsoby vakcinace a testování indukce imunitní odpovědi na virový antigen

Myším samičkám BALB/c nebo C57BL/6 (starým 6 až 8 týdnů) se subkutánně očkuji první, čtvrtý ,a osmý týden testovaným očkovacím přípravkem nebo pufrem. Místa injekcí se sledují na nežádoucí reakce jako je vývoj granulomu a/nebo tvorba příškvaru. Pokud se zvířata imunizují intranazální cestou, anestetizují se halotanem a pros-tředek (10 až 20 1) se podává do nozder k vdechnutí za použit:! sterilní špičky na mikropipetě (Gallichan a kol., J. Inf.

- 47b -

• 4 4	« «4 4 4	4
1	•	•	4 4	4 9 4' 4	«4
•	•	• 4	4	• · ·	*
	•	4 4 4 4	4	♦ 4 · . «
• • 4	•	t	4	• 4 ♦	4 4««'

Dis. 168, 622 (1993)).

Měření protilátkové odpovědi pomocí ELISA

V pravidelných intervalech (například 1 x týdně) se během očkovací procedury měří imunitní odpověď myší na virový antigen. Liposomy obsahující antigenní epitop se použijí rovněž jako cíle protilátek v testu ELISA, jak byl dříve popsán (Tuso a kol., Transplantation 55, 1375 (1993)). Výsledky posledně uvedeného testu se použijí k měřeni hladiny vazeb a isotypové konfigurace protilátek.

Test přecitlivělosti pozdního typu (DHT)

Odpověď přecitlivělosti pozdního typu (DHT) na virové antigeny u. očkovaných myší se testuje za použití testu s tlapkou. Očkovaná zvířata se anestezují halotanem a injikuje se jim 50 1 buď liposomálního antigenu nebo-volného antigenu do jedné zadní tlapky a 50 1 pufru do druhé zadní tlapky. O 24, 48 a 72 hodin později se měří stupeň otoku myší tlapky za použití Vernierova kaliperu a .srovná se se základními měřeními.

Cytokin specifická analýza mRNA

T-buňky z imunizovaných a neimunizovaných zvířat se vyšetří na hladiny cytokin specifické mRNA pro hlavní cytokiny, které mohou odrážet senzitizaci spojenou s imunizací, včetně IL-2, IFN-D, IL-4, IL-5, IL-6, a IL- 10. Slezinné T buňky se izolují, jak bylo dříve popsáno v prvním a čtvrtém týdnu po iminizaci. Všechny RNA se izolují za použití obměny (Cosenza a kol., Liver Transpl. Surg. 1, 16 (1995)) metody, kterou popsali Chomczynsky a Sacchi (Chomczynsky a kol., Analyt. Biochem. 162, 156 (1987)) . Čerstvé nebo mražené buňky (2 x 10⁶)se rozruší v 1 ml denaturačního roztoku (4 mM guanidinthiocyanatu, 25 mM natrium citrátu (pH 7,0), 0,5 % sarooaylu a 0,1 mM 2-merkaptoethanolu). RNA se vysráží přes noc, při teplotě -20 °C, inkubací s jedním objemovým množstvím isopropanolu. Celková koncentrace RNA se upraví na 260 ríM a vzorky se až do analýzy skladují při -80 °C.

Analýza cytokinů se provede za použiti obměny metody, kterou popsali Cosenza a kol. (Cosenza a kol., Liver

Transpl. Surg. 1, 16 (19,95)). Jednoduché vlákno cDNA sepřipraví transkripcí 2 g celkové RNA ve 20 1 celkové reakční směsi za použití reverzní transkriptasy viru ptačí myéloblastosy (Boehringer Mannheim, Indianopolis, Indiana). K aplifikaci DNA fragmentů předem určené velikosti z každého předmětného genu se použije sekvence specifických oligonukleotidových primerů pro myší cytokiny (tabulka 1). Směs na PCR se skládá z 1 1 cDNA, 2,5 1 pufru PCR ΙΟχ, 1 1 každého z 5'a 3' primerů, 2,5 1 10 x dNTPs o koncentraci 2 mmol/litr a 0,125 1 termostabilní DNA polymerázy z T. aquaticus (Boehringer Mannheim) o výsledném objemu 25 1. Specifické □-aktinové primery se použijí k amplifikaci 548 bp fragmentu jako vnitřní kontrola. Směs na PCR se překryje minerálním olejem a nechá se proběhnout aplifikace, následně inkubace směsi na 7 minut při 94 °C, 39 cyklů s 30s denaturací při 94 °C, ztužení primerů při 60 °C, 60s zvýšení na 72 °C a inkubace na 7 minut při 72 °C. Produkty PCR se oddělí na agarosovém gelu v přítomnosti ethidium bromidu. Pásy se zviditelní pod ultrafialovým zářením, fotografují a densitometricky kvantifikují z fotografií za použití softwareového balíku Molecular Analyst (Βίο-Rad, Richmond, Kalifornie).

Měření cytokinú pomocí ELISA ve slezinných T buňkách

Aktivita T buněk těchto zvířat se rovněž měří podle produkce cytokinú v odpověď na inkubaci slezinných T buněk s virovým antigenem. Slezina se z oočkovaných zvířat vyjme a homogenizáty sleziny se připraví jemným rozrušením sleziny sterilní plunžrem a protlačením buněk přes nylonové síto. Buněčné suspenze se promyjí a osadí se v hustotě 10 x 10⁵ buněk/jamku do mikrotitrové plotny o 96 jamkách. Po inkubaci buněk při 37 °C, po dobu 3 až 4 dnů, s různými množstvími virového antigenu se odeberou z jamek buněčné supernatanty a testují se na přítomnost cytokinů. Cytokinové kity ELISA dostupné na trhu se použijí k určení profilů cytokinů. Detekce cytokinového proteinu v supernatantech tkáňových kultur pomocí sendvičové metody ELISA se provede za použití monoklonálních protilátek (mAb) specifických proti určitým cytokinům. Stručně vysvětleno, se plotny ELISA nechají přes noc potáhnout krysími monoklonálnímí protilátkami proti myšímu cytokinů. Plotny.se blokují 3% fetálním telecím sérem v PBS po 2 hodiny, poté se do každé jamky přidají alikvóty každého testovaného vzorku. Do každé jamky se přidají biotinylated (přesná citace) krysí monoklonální protilátky specifické proti myšímu cytokinů a následně avidinperoxidasa. Přidáním kolorimetrických substrátů se dosáhle barevné reakce. Plotny se odečtou ve spektrofotometru ELISA a koncentrace cytokinů se spočtou ze standardní křivky získané z kontrolních rekombinantních cytokinů. Všechny cytokinové kity ELISA (IL-2, IL-4, IL-6, IL- 10, IL-12, IFN-D a TNF-α) jsou koupeny od PharMingen, lne. (San Diego, Kalifornie).

Antigenem indukovaná proliferace T buněk

Senzitizace hostitele na HIV antigeny se měří za použití analýzy antigenem indukované proliferace T buněk. .Homogenizáty sleziny se připraví, jak bylo popsáno dříve. Buňky se suspendují v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního telecího séra (FCS), 10 mM pufru Hepes, 2 mM L-glutaminu, penicilín v koncentraci 25 mezinárodních jednotek na ml, 25 g/ml streptomycinu a 80 g/ml gentamycinu. Buňky se kultivují 3 až 4 dny, v atmosféře s 5% C02, v plotnách se dnem ve tvaru písmene U o 96 jamkách, při koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml s nebo bez peptidu HIV-HD v koncentraci 5 g/ml. Kultury se na tři hodiny doplní 20 1 resazurinového barviva a poté se měří fluorescence na Cytofluoru II (Perseptive Biosystems, lne., Farmington, MA) .

Anti-HIV CTL odpovědi

Po očkování se vyhodnotí přítomnost antigen specifických T lymfocytů (CTL) mezí slezinnými T buňkami. Slezinné lymfocyty se získají dříve popsaným způsobem.. Lymfocyty z každé léčené skupiny se shromáždí (n = 5)_f a poté se kultivují 3 dny bez antigenu při koncentraci 10⁷ buněk na jamku v kultivačních plotnách o 12 jamkách. Lymfomové L5198Y (H2^d) cílové buňky (ATTC) se inkubují s peptidem odpovídajícím epitopu HIV CTL pro buňky s restrikcí H2^b a inkubují se 4 hodiny při 37 °C. Cílové buňky se promyjí a do každé jamky se přidají ΙΟΟμΙ titry obsahující 1 x 10⁴ buněk. Efektorové lymfocyty se promyjí, přidají se v různých koncentracích do jamek a kultivuji se 4 hodiny při 37 °C. Procento specifických lýz se spočítá za použití kitu CytoTox 96 (Promega, Madison, Wisconsin) ze laktatdehydrogenasy (LDH) supernatantu ve standardním čítači ploten ELISA (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, Kalifornie) zaznamenáváním absorbance při 490 nm. Určení HSV2-antigen specifických lýz se provede podle standardního kriteria. Údaje se vyjádří v procentu specifických lýz = 100 x [(pokusné - spontánní efektorové - cílové spontánní) / (cílové maximální - cílové spontánní)].

Příklad 4

Příprava INFV-HD

Nukleotidová sekvence vybraných epitopů se odvodí od proteinové sekvence za použití preferencí kodonu E. coli (looman a kol., EMBO J. 6, 2489). Antigenní sekvence vložená(é) do genové kazety odpovídají epitopům z NP (147-161, TYQRTRALVVRTGMDP; 55-69 (sekv. id. č. 20), RLIQNSLTIERMVLS (sekv. id. č. 21)) a HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (sekv. id. č. 22)). Může být konstruována vakcína s kombinovanými epitopy obsahující T-B epitop, jak ji popsali Brumeanu a kol. v roce 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (sekv. id. č. 23), (Brumeanu a kol., J. Virol. 71, 5473 (1997)). Jakmile se získá(ají) příslušné sekvence, vytvoří se syntetický gen kódující INFV-HD syntézou, hybridizací, PCR a ligací přesahujících (overlapping - přesná citace) oligonukleotidů. Vytvořený gen oplné délce kódující fragment INFV se amplifikuje pomocí PCR a zapojí (liguje)se do plazmidu exprese. Výsledné geny se ověří sekvenováním DNA.

Plazmidy obsahující INFV-HD se transformují do E. coli. Bakterie se inkubují v médiu LB s ampicilinem (50 g/ml) při 37 °C až do střední logaritmické fáze. V tu dobu se přidá IPTG k indukci hybridního promotoru trp/lac. Vyšetřuje se po hodinách, aby se určila optimální postindukční exprese proteinů INFV-HD. V čas optimální exprese se buňky odeberou odstředěním. Buněčné pelety se lyžují a odstředí. Lyzát se vyšetří na přítomnost proteinu. Proteiny INFV-HD se čistí pomocí selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Pokud je to nutné provede se k dalšímu čištění proteinů INFV-HD chromatografie vylučující velikosti, ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobními interakcemi.

Virální model infekce

Kmen INFV použitý k demonstrování účinnosti vakcíny je reasortant viru A/PR/8/34 zvaného PR8. Virus se kultivuje v 10 až 12 dní starých kuřecí vejcích s embryem naočkováním do žloudkového vaku, poté se inkubuje při 37 °C v kývačce po dobu 40 až 48 hodin a 20 až 24 hodin při 4 °C, a poté se zhíská ze žloudkové tekutiny. V mikrotitračních plotnách o 96 jamkách se provede test virové hamaglutinace pomocí 0,5% kuřecích červených krvinek k určení hemaglutinační jednotky (HAU/ml) virálního zásobního roztoku.

Na modelu myší BALB/c se ukázalo, že 1200 HAU kmene PR8, podaných intranasálně sterilním hrotem mikropipety myším anest.ezovaným metofanem (20 1) , způsobuje výrazné symptomy infekce go čtvrtého dne, včetně snížené pohyblivosti, nedostatku péče o čistotu, , 20 % úbytku tělesné hmotnosti a smrti během dvou týdnů. Za použití cytolytického testu MDCK provedeného v mikrotitračních plotnách o 96 jamkách s 50% výstupy, byl nalezen vysoký titr infekčního viru přítomný v homogenátech připravených 4 dny po infekci.

Způsoby vakcinace a testování indukce imunitní odpovědi na virový antigen

Myším samičkám BALB/c (starým 6 až 8 týdnů) se subkutánně injikuje v prvním, čtvrtém a 8 týdnu očkovací přípravek nebo pufr. Místa injekcí se sledují na nežádoucí reakce jako je vývoj granulomů. Pokud se zvířata imunizují intranazální cestou, anestetizují se metofanem a testovaná látka (1 až 20 1) se podává do nozder k vdechnutí za použití sterilního hrotu na mikropipetě (Gallichan a kol., J. Inf. Dis. 168, 622 (1993)) .

RT-PCR detekce INFV RNA v plicní tkáni

R.T-PCR detekce INFV RNA se provádí na plicích pokusných zvířat odebraných čtyři dny po expozici viru za účelem stanovení účinnost imunizace pro prevenci virové infekce. Plicní vzorky odebrané myším se prudce zmrazí, rozemelou a zmrazený prášek se skladuje při -70 °C, nežli je zpracován na vyhodnocení. Izolace celkové RNA a RT-PCR analýza virové RNA se provedou za použití obměny dříve popsaných technik (Chomczynsky a kol., Analyt. Biochem. 162, 156 (1987); Shirwan a kol., J. Immunol. 151, 5228 (1993); Lakeman a Whitley, J. Inf. Dis 171, 857 (1995)). Primery, které mají být použity.jsou specifické pro gen matrix (segment 7) viru chřipky A (Atmar a kol., J. Clin. Microbiol. 34, 2604 (1996)). Test RT-PCR se provede za použití reakčních činidel a protokolu z Titan One Tube RT-PCR Systém (Boehringer Mannheim, Indianopolis, Indiana). Stručně vysvětleno se 1 pg až 1 g celkové struktury RNA inkubuje za přítomnosti 0,2 mM dNTP, 0,4 M antisense primeru FAM1 (5^Z-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3') (sekv, id. č. 24), 0,4 M sense primeru FAM2 (5'-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3'(sekv. id. č. 25), 5 Mm DTT, 5 U inhibitoru RNasy, 1,5 mM chloridu horečnatého a enzymů. AMV/Expand Hi fidelity za následujících podmínek: jeden cyklus při 60 °C po dobu 30 min; při 94 °C po dobu 2 min; deset cyklů při 94 °C po dobu 30 s, při 55 °C po dobu 3 0 s, při 68 °C po dobu 45 s; dvacet pět cyklů při 94 °C po dobu 30 s, při 55 °C po dobu 30 s, při 68 °C po dobu 45 s za zvyšující se extenze pěti sekund každý cyklus; následováno jedním cyklem při 68 °C po dobu 7 min. Pozitivní výsledek je založen na viditelném pásu o 212 bp v 1,5% NuSieve-agarosovém gelu (FMC Bioproducts, Rockland, ME) barveném ethidium bromidem a fotografovaném na transluminátoru ultrafialového zářeni (BioRad Gel Doc 1000). Tento způsob se ukázal být citlivým a specifickým pro měřeni přítomnosti virové DNA (Lakeman a Whitley, J. Inf. Dis 171, 857 (1995)) .

Sekvence domény HA1

Sekvence domény HA1 (segment 4) mohou být ozřejměny ampíifikací domény HA1 z virové RNA v reakci RT-PCR, poté se produkt o 1100 bp subklonuje na sekvenování a sekvenuje za použití dideoxynukleotidové terminační metody. Test RT-PCR se provede za použití Titan One Tube RT-PCR Systému, jak bylo uvedeno výše, z těmito rozdíly. Amplifikačními primery jsou cDNA primer (5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3' (sekv. id. Č. 26)) a PCR primer (5'-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3' (sekv. id. č. 27)) (Pyhala a kol.', J. Gen. Virol. 76, 205 (1995)), podmínky budou jeden cyklus při 60 °C po dobu 30 min; při 94 °C po dobu 2 min; deset cyklů při 94 °C po dobu 30 s, při 60 °C po dobu 30 s, při 68 °C po dobu 45 s; dvacet pět cyklů pří 94 °C po dobu 30 s, při 60 °C po dobu 30 s, při 68 °C po dobu 45 s za zvyšující se extenze pěti sekund každý cyklus; následováno jedním cyklem při 68 °C po dobu 7 min. Produkt o 1100 bp se subklonuje do klonovacího vektoru TA PCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornie) pro následné sekvenování. Sekvenování se provádí za použití protokolu a reakčních činidel z kitu AutoCýcle (Amersham Pharmacia Biotech, .Piscataway, New Jersey) a výsledky se zjisti sekvenovacím zařízením kitu ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) a analyzují se pomocí kitu AM software v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey).

Měření protilátkové odpovědi pomocí ELISA

V pravidelných intervalech se během očkovací procedury měří imunitní odpověď myší na virový antigen. Liposomy obsahující antigenní epitop se rovněž použijí jako cíle protilátek v testu ELISA, jak byl dříve popsán (Tuso a kol., Transplantation 55, 1375 (1993)). Výsledky posledně uvedeného testu se použijí· k měření hladiny vazeb a isotypové konfigurace protilátek.

Antigenem indukovaná proliferace T buněk

Senzitizace hostitele na INFV antigeny se měří za použití antigenem indukované proliferace T buněk. Homogenizáty sleziny se připraví jemným rozrušením sleziny sterilní plunžrem a protlačením buněk přes nylonové síto. Buňky se suspendují v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního telecího séra (FCS), 10 mM pufru Hepes, 2 mM L-glutaminu, penicilín v koncentraci 25 mezinárodních jednotek na ml, 25 g/ml streptomycinu a 80 g/ml gentamycinu. Buňky se kultivují 3 až 4 dny,'v atmosféře s 5% CO2, v plotnách se dnem ve tvaru písmene U o 96 jamkách, při koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml s nebo bez chemicky syntetizovaných peptidu odpovídajících antigenům v koncentraci 5 g/ml. Kultury se na tři hodiny doplní 20 1 resazurinového barviva a poté se měří fluorescence.na Cytofluoru II (Perseptive Biosystems, lne., Farmington, MA) .

Anti-INFV CTL odpovědi

Po očkování se vyhodnotí přítomnost antigen specifických T lymfocytů (CTL) mezi slezinnými T buňkami. Slezinné lymfocyty se získají dříve popsaným způsobem. . Lymfocyty z každé léčené skupiny se shromáždí (n = 5)_r a • · poté se kultivuji 3 dny be.z antigenu při koncentraci 10⁷ buněk na jamku v kultivačních plotnách o 12 jamkách. Lymfomové L5198Y (H2^d) cílové buňky (ATTC) se ínkubují s peptidem odpovídajícím epitopu INFV NP CTL (aminokyseliny 147-158) pro buňky s restrikcí H2^b a inkubují se 4 hodiny při 37 °C. Cílové buňky se promyjí a do každé jamky se přidají ΙΟΟμΙ titry obsahující 1 x 10⁴ buněk. Efektorové lymfocyty se promyji,.přidáji se v různých koncentracích do jamek a kultivují se 4 hodiny při 37 °C. Procento specifických lýz se spočítá za použití kitu CytoTox 96 (Promega, Madison, Wisconsin) ze laktatdehydrogenasy (LDH) supernatantu ve standardním čítači ploten ELISA (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, Kalifornie) zaznamenáváním absorbance při 490 nm. Určení HSV2-antigen specifických lýz se provede podle standardního kriteria. Údaje se vyjádří v procentu specifických lýz = 100 x [(pokusné - spontánní efektorové - cílové spontánní) / (cílové maximální - cílové spontánní)].

Příklad 5

Netypický H. influenzae (NTHi) a H. influenzae typ b (Hib)

Klonování proteinů NTHi

Genová sekvence kódující P6 o plné délce se získá z kmene NTHi pomocí RT-PCR amplifikace P6 mRNA (Deich a kol., J. Bacteriol. 170, 489 (1988); Nelson a kol., Inf. Immun. 56, 128 (1988); Looman a kol., EMBO J. _6, 24 89 (1987)). Amplifikace se provede za použití reakčních činidel a protokolu systému Titan One Tube RT-PCR (Boehringer Mannheim, Indianipolis, Indiana). Stručně vysvětleno se bakterie inkubují v přítomnosti 0,2 mM dNTP, 0,4 M antisense

- 58 primeru H-InvfP6AS (5'-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3'(sekv. id. č. 28), 0,4 M sense primeru H-InvfP6S (5'-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA3'(sekv. id. č. 29), 5 Mm DTT, 5 U inhibitoru RNasy, 1,5 mM chloridu horečnatého a enzymů AMV/Expand Hi fidelity za následujících podmínek: jeden cyklus při 60 °C po dobu 30 min; při 94 °C po dobu 2 min; deset cyklů při 94 °C po dobu 30 s, při 55 °C po dobu 30 s, při 68 °C po dobu 45 s; dvacet pět cyklů při 94 °C po dobu 30 s, při 55 °C po dobu 30 s, při 68 °C po dobu 45 s za zvyšující se extenze pěti sekund každý cyklus; následováno jedním cyklem při 68 °C po dobu 7 min. Pozitivní výsledek je založen na viditelném pásu o 867 bp v 1,0% NuSieve-agarosovém gelu (FMC Bioproducts, Rockland, ME) barveném ethidium bromidem a fotografovaném za použití digitálního zobrazovacího systému (BioRad, Gel Doc 2000). Produkt PCR se subklonuje za účelem sekvenování do vektoru TA 2.1 Vector za použití protokolu a reakčních činidel z kitu TA Cloning kit (Invitrogen, Cárlsbad, Kalifornie). Příprava plazmidu v malém množství se provede za použití standardní metody alkalické lýzy (Maniatis v Sambrook, Fritsch, Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 1989, str. 125). Inzerce produktu PCR se sekvenuje za použití běžné dideoxy terminační metody za použití protokolu a reakčních činidel z kitu AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) a výsledky se zjistí sekvenovacím zařízením kitu ALFExpress (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey) a analyzují se pomocí kitu počítačového programu AlfWin Sekvence Analyser v.2.0 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey).

Příprava NTHi(P6)-HD

Jakmile sé získá gen kódující P6, vytvoří se syntetický gen kódující NTHi(P6)-HD syntézou, hybridizací, PCR a ligací přesahujících (overlapping - přesná citace) oligonukleotidú. HD segment se připojí buď na N- nebo C-konec proteinu přez můstek složený z glycinu a šeřinu. To umožní testovat účinek umístění HD na zpracování antigenu imunitním systémem. Vytvořený gen o plné délce, kódující fragment NTHi(P6)-HD se amplifikuje pomocí PCR a zapojí (liguje) se do plazmidu exprese. Výsledné geny se ověří sekvenováním DNA.

NTHi(P6)-HD se transformuje do E. coli

Bakterie se inkubují v LB médiu s 50 g/ml ampicilinu při 37 °C až do střední logaritmické fáze. V tu dobu se přidá IPTG k indukci hybridního promotoru trp/lac. Vyšetřuje se po hodinách, aby se určila optimální postindukční exprese proteinů NTHi(P6)-HD. V čas optimální exprese se buňky odeberou odstředěním. Buněčné pelety se lyžují a odstředí. Lyzát a buněčné pelety se vyšetří na přítomnost proteinu. K extrakci proteinu NTHi(P6)-HD z lyžovaných buněčných pelet se použije 1 až 2% natrium deoxycholat. Poté se NTHi(P6)-HD čistí pomocí selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Pokud je to nutné provede se k dalšímu čištění NTHi(P6)-HD chromatografie vylučující velikosti, ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobními interakcemi.

Příprava liposomů

Existují tři obecné způsoby přípravy stabilních liposomů NTHi(P6)-HD. Při prvním se liposomy formulují tak, že se protein a lipidy společně rozptýlí v organickém rozpouštědle (chloroform/methanol) a vysuší se do tenkého · 9 ···· • · · 9 · · · · ··

9 9 9 9 9 99

999999 9 9 999

9 9 9 9 99

9 9 999 9999 9 99 filmu. Po resuspenzaci ve vodném pufru vytvoří lipidy a protein dvojvrstevné (bilayer - přesná citace) struktury. Poté se suspenze sonikuje až se vytvoří malé unilamelární měchýřky (SUV). Pro designy malých proteinů funguje tento způsob dobře. Pro účely pokusu však může být nežádoucí, vzhledem k možné denaturaci proteinu, vystavit protein tvrdým podmínkám rozpouštědla. Za účelem vyhnutí se nežádoucím změnám konformace se proto může použít druhý způsob zahrnující před hydratací lipidového filmu rozptýlení NTHí(P6)-HD v resuspendačním pufru. Po hydratací lipidů se proteiny samovolně spojí s nově vytvořenou membránou a inkorporují se během sonikace do dvojvrstvy (bilayeru) SUV. Třetí způsob zahrnuuje přípravu liposomů bez proteinu NTHi(P6)-HD, a poté jeho přidáni k již vytvořeným SUV, což umožní integraci hydrofobní domény (HD) do lipidové dvojvrstvy. Liposomy se připraví sondovou sonikací podle dříve popsaných způsobů (Fujii a kol., Biochemistry 36, 4959 (1997)). Krátce shrnuto se lipidy (s proteinem nebo bez) rozptýlí v organickém rozpouštědle jako je chloroform/ methanol. Pipetováním alikvótů lipidových roztoků do skleněných zkumavek s kulatým dnem a odpařením rozpouštědla v proudu plyného dusíku při 65 °C se vytvoří tenké lipidové filmy. Filmy se umístí do vakua nejméně na osm hodin, aby se odstranilo zbytkové organické rozpouštědlo. Popřípadě mohou být technikou, jako je lyofilizace, připraveny lipidové prášky požadovaného prostředku, a poté použity namísto lipidových filmů. Příprava liposomů se dokonči hydratací lipidových filmů nebo prášků v pufru a inkubací suspenze při 65 °C na 5 až 10 min a následnou sonikací. Poté se liposomy filtrují přes filr 0,22 m, aby se přípravek sterilizoval. Velikost liposomů se nastaví rozmělněním dinamickým světlem a tvorba agregátů probíhá nejméně následující čtyři týdny. Je možné, že bude zapotřebí konformaci proteinu NTHi(P6)-HD konzervovat. Ačkolif existují tři způsoby, které je možné použít k přípravě liposomů, předpokládá se, že výhodnými způsoby mohou být buď přidání proteinu jako složky hydratačního roztoku, nebo přidání k již vytvořeným liposomům.

Bakteriální kmeny

K demonstrování účinnosti na bakteriálním modelu infekce se použiji kmeny NTHi 9333 (izolát z míšního moku), 35056 (izolát z infekce horních cest dýchacích), 43095 . (izolát ze zánětu středního ucha), 49766 (izolát z plicniho abscesu, referenční kmen pro testováni antimikrobiální vnímavosti) (ATCC) a kmen Hib (51654) (ATCC). Před použitím se zásobní kultura mikroorganismu subkultivuje v čerstvém bujónu infuze mozku a srdcí (Brain Heard Infusion broth) obohaceného NAD (2 g/ml) a krví (10 g/ml) a inkubuje se 24 hodin při 37 °C v atmosféře s 10 % oxidu uhličitého.

K nastaveni inokula bakterií pro bu'd baktericidní testy nebo pro dávky intraperitoneální expozice se u každého organismu použije standardní křivka sestávající z kolonie tvořích jednotek versus zákal při 480 nm.

Způsoby vakcinace a testování indukce imunitní odpovědi na bakteriální antigen

Skupiny krysích mláďat (n=6 na skupinu) se 5., 12.,

19. a 26. den po narození nebo 5. a 26. den po narození imunizují testovaným očkovacím přípravkem nebo pufrem. Systémové očkování se provádí subkutánními injekcemi liposomální vakcíny. Pokud se zvířata imunizují vakcínou intranazální cestou, anestetizují se metofanem a testovaná látka (20 1) se podává za použiti sterilní špičky na mikropipetě. (Gallichan a kol., J. Inf. Dis. 168, 622 (1993)). Krysi mláďata se umístí se svými kojícími matkami a sledují se na nežádoucí reakce po očkování, jako je vývoj granulomu, zarudnutí nebo svědění místa očkování. Jeden týden po posledním očkování se anestetizují halotanem, kardiální punkcí se odebere krev a provede se laváž lizničních cest fyziologickým roztokem k získání slizničních tekutin. Zvířata se usmrtí oxidem uhličitým. Jak je popsáno níže, měří se titry bakteriálních protilátek v séru a ve slizničních tekutinách.

Pro studie intraperitoneální expozice se krysí mláďata (stará 26 dní) vystaví bakteriím a jejich krev a mozkomíšní mok se monitorují na bakteriální zánět v porovnání s neočkovanými zvířaty. Vzorky krve a mozkomíšní mok vyšetřené na bakterie dva dny po expozici naznačují, že' u zvířat je signifikantní bakteriální zánět (to jest 1 x 10⁴ CFU/ml krve; 1 x 10⁴ CFU/ml mozkomíšního moku).

Sérum očkovaných 26 dní starých krysích mláďat obsahující vysoké titry antibakteriálních protilátek se intravenózně podává 6 dní starým krysám. Následující den obdrží krysí mláďata (n=10) intraperitoneální dávku NTHi, jak je níže popsáno. Poté se u krysích mláďat sleduje morbidita a mortalita, jedinci, kteří přežijí se po 26 dnech usmrtí a krev a mozkomíšní mok se dodeberou a kultivují na přítomnost NTHi.

Intraperitoneální expozice NTHi hodin stará kultura NTHi pěstovaná in vivo se -upraví na koncentraci 5 x 10⁷ až 5 x 10⁹ CFU/ml a 100 μΐ této kultury se injikuje intraperitoneálně krysám starým 5 až 10 dní (Smith a kol., Inf. Immun. 8., 278 (1973)). Exponovaná krysí mláďata zůstanou po očkování u kojících matek. Během 18 až 96 hodin po expozici zemře nejméně 90·% krysích mláďat, která obdržela tuto dávku vykultivovaných bakterií.

Měření protilátkových antigen specifických odpovědí pomocí metody ELISA

Sérum a slizniční vzorky každé krysy se testují na protilátky IgG a IgA specifické proti antigenu P6. Do správně připravených poten o 96 jamkách se přidá klonovaný buď přírodní P6 nebo NTHi(P6)-HD protein a inkubuje se přes noc při teplotě místnosti. Plotny se blokují 30 minut 1% roztokem albuminu bovinního séra v bikarbonátovém pufru o pH 9,6, při 37 °C. Poté se plotny propláchnou 0,05% roztokem Tweenu 20 v PBS. Ředění každého séra nebo slizničního vzorku se přidá k plotnám potaženým antigenem, následně se inkubuje 2 hodiny při 37 °C a na konci inkubace se propláchne roztokem Tweenu v pufru PBS. Na jednu hodinu se při 37 °C přidají do jamek monoklonálni protilátky specifické proti krysím IgG nebo IgA s připojenou alkalickou fosfatasou. Poté se jamky propláchnou roztokem Tweenu v pufru PBS a substrátem PNPP v diethanolaminovém pufru o pH 9,5, které se přidají do jamek k zahájení kolorimetrické reakce. Reakce se zastaví 0,75N roztokem hydroxidu sodného a odečtou se na čítači ploten ELISA Spectramax. Koncentrace krysích IgG a IgA se zpočtou ze standardní křivky získané z kontrolních vzorků o známých koncentrací krysích krysích IgG nebo IgA potaženýchna plotnách o 96 jamkách, s nimiž se nakládá, jak « bylo popsáno výše.

Test bakteriálních protilátek

Vzorky séra, které mají být testovány na přítomnost

ΦΦ Φ . · φ «V φ ΦΦΦ φ φ ΦΦΦΦ φ ♦ φ φ *

9Φ Φ • ΦΦ ΦΦ

ΦΦ Φ Φ φ φ

Φ Φ · '»

Φ ΦΦΦΦ

9 Φ Φ

ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ baktericidních protilátek se inkubují 30 min při 56 °C, za účelem inaktivace komplementu. Testovaná séra se poté sériově naředí ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). 24 hodin stará bakteriální kultura se upraví na koncentraci 5 x 10⁴ CFU/ml ve' sterilním pufru PCM, složeném z PBS s 0,15 mM chloridu vápenatého a 1 mM chloridu horečnatého obsahujícího albumin bovinního séra (BSA). Séra neočkovaných krysích mláďat se použijí jako zdroj komplementu. Tato séra se shromáždí, alikvotují a skTádují při -70 °C. Bakterie (20 1), sériově ředěné sérum (20 1), komplement (20 l)a 40 1 1% BSA v pufru PCM se naočkuje do každé jamky klastrové plotny o 98 jamkách. K určení počáteční bakteriální koncentrace se 10 1 alikvotů vzorkové směsi naočkuje v časovém okamžiku nula na čerstvé plotny agaru BHI obsahujícího živný agar a obohaceného NAD a krví. Následuje jednohodinová inkubace reakčních směsí při 37 °C za přítomnosti atmosféry s 10 % oxidu uhličitého za třepání, 10 1 z každé jamky se naočkuje jako duplikát a inkubuje se přes noc při 37 °C v atmosféře s 10 % oxidu uhličitého k určení CFU na jamku. Kontroly zahrnují jamku bez sére za účelem ujištění se, že že samotný komplement nesmrtí bakterie a jamku s testovaným sérem, ale bez komplementu, za účelem ujištění se, že sérový komplement v testovanýctí vzorcích byl úspěšně inaktivován. Všechny testy se provádí trojitě a ředění, která smrtí bakterie v 50 % se použijí pro srovnání aktivit mezi různými séry.

Příklad 6

Virus hepatitidy C

Příprava HCV(E2/NS1)-HD a HCV(E2/NS1ÁHVR1)-HD v buňkách CHO

Nukleotidová sekvence proteinu HCV E2/NS1 se odvodí od PCR amplifikace vlákna HCV získaného, jak je níže uvedeno. Za použití 5' primeru odpovídajícího prvním 21 párům baží (bp) genu E2/NS1 CAAACCATGATCGCCCACGGA a 3' primeru odpovídajícího zbytkům 622 až 628 GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA se eliminuje transmembránová doména (L., Cocquerela kol., J. Virol. 72(3), 2183-až 2191 (1998)). Navíc je každý primer osazen vhodnými restrikčními místy. Produkt PCR se zapojí (liguje) do pcDNA3.1His obsahujícího' hydrofobní doménu jako plasmid genové kazety (Invitrogen, lne., San Diego, Kalifornie). HCV(E2/NS1ÁHVR1)-HD se konstruuje delecí HVR1 z genu E2/NS1 odpovídajícího prvním 27 aminokyselinám od zbytku 384 do zbytku 410. Mutanty s delecí se vytvoří PCR amplifikací za použití 5'primeru CAACTCATCAACACCAATGGC a stejného 3'-primeru použitého pro kontrolu divokého typu. Výsledné geny se ověří sekvenováním DNA. Plasmidy se přenesou (transfektují) do buněk CHO (K.C., Deen a kol., Nátuře 331, 82 (1988)) (ATTC, Rockville, MD) za použití lipofekčního reakčního činidla (Lipofectamin, Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) podle protokolu doporučeného výrobcem. Stabilní transfektanty se selektují za použití G418 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) a klonují se limitujícím ředěním. Klony, které produkují vysoké hladiny proteinu se vyhodnotí Western blotovou analýzou. Proteiny HCV(E2/NS1) -HD a HCV(E2/NS1AHVR1)-HD se čistí pomocí selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Histidinový můstek (linker) se odstraní pomocí štěpení enterokinasou poté, kdy je čištění ukončeno. Pokud je to nutné provede se k dalšímu čištění proteinů HCV(E2/NS1)-HD a HCV(E2/NS1ÁHVR1)-HD chromatografie vylučující velikosti, ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobnimi interakcemi.

- 66 • *

Příprava proteinů HCV(HVR1)-HD a HCV(C)-HD v E. coli,

Nukleotidová sekvence vybraných epitopů se odvodí od proteinové sekvence za použití preferencí kodonu E. coli (looman a kol., EMBO J. 6, 2489). Antigenní sekvence, která(é) má(ají) být vložena(é) do genové kazety odpovídají epitopům z NP (147-161, TYQRTRALWRTGMDP; 55-69 RLIQNSLTIERMVLS) a HA (91-108, SKAFSNCYPY-DVPDYASL). Jakmile se získá(aji) příslušné sekvence, vytvoří se syntetický gen kódující HCV-HD vybavený restrikčními místy, syntézou, hybridizací a ligací přesahujících (overlapping - přesná citace) oligonukleotidů. Stručně vysvětleno se vytvoření fragmentů dosáhne zahřátím na 65 °C a ochlazením oligonukleotidů, až dosáhnou teploty místnosti.

Po 2~minutové inkubaci na ledu se fragmenty ligují pomocí . DNA ligasy. Vytvořený gen o plné délce kódující fragment HCV se amplifikuje pomocí PCR, štěpí se restrikčními enzymy a izoluje se gelovou elektroforézou. Gen HCV se poté zapojí (liguje) se do podobně štěpeného plazmidu exprese obsahujícího gen hydrofobní domény (HD) (například pTrchis nebo pQE30). Výsledné geny se ověří sekvenováním DNA.

Plazmidy obsahující HCV-HD se transformují do E. coli.

Bakterie se inkubují v médiu LB s ampicilinem (50 gg/ml) při 37 °C až do střední logaritmické fáze. V tu dobu se přidá IPTG k indukci hybridního promotoru trp/lac. Vyšetřuje se po hodinách, aby se určila optimální postindukční exprese , proteinů INFV-HD. V čas optimální exprese se buňky odeberou odstředěním. Buněčné pelety se lyžují a odstředí. Lyzát se vyšetří na přítomnost proteinu. Proteiny HCV-HD se čistí pomocí selektivní afinity k niklu vázanému na pevný podklad. Po ukončení čištění se histidinový můstek (linker) odstraní

- 67 odštěpením enterokinasou. Pokud je to nutné provede se k dalšímu.čištěni proteinů HCV-HD chromatografie vylučující velikosti, ionto měničová chromatografie nebo chromatografie s hydrofobními interakcemi.

Příprava liposomů, způsoby vakcínace, testování indukce imunitní odpovědi, měření protilátkové odpovědi pomocí ELISA, test DTH, cytokin specifická analýza mRNA, měření cytokinů pomocí ELISA, antigenem indukovaná proliferace T-buněk a odpovědi proti HIV CTL se provedou v zásadě, jak byly popsány v příkladu III.

Claims (36)

1. Imunogenní liposomový prostředek, vyznačující se t i m, že obsahuje:

lipidy tvořící měchýřky; a antigenní konstrukt obsahující jednu nebo vice antigenních determinant a hydrofobní doménu, kde hydrofobní doména je spojena s membránou uvedeného liposomového prostředku.

2. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tim, že dále obsahuje jedno nebo více adjuvans.

3. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tim, že antigenní konstrukt je chemicky syntetizován.

4. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že hydrofobní doménou je peptid.

5. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že hydrofobní doména sestává z od asi 15 do asi 500 aminokyselinových zbytků.

6. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 5, vyznačující se tím, že hydrofobní doména obsahuje jednu nebo více aminokyselin vybraných ze souboru sestávajícího slaninu, asparaginu, cysteinu, glutaminu, glycinu, histidinu, isoleucinu, leucinu, methioninu, fenylalaninu, prolinu, šeřinu, threoninu, triptofanu, tyrosinu a valinu.

7. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigenní determinanta je odvozena od antigenu vybraného ze souboru sestávajícího z HSV gB nebo gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA nebo NA a H. influenzae P6.

8. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigenní konstrukt dále obsahuje oblast můstku spojující antigenní determinantu s hydrofobní doménou.

9. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že oblast můstku je peptidem,

10. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že oblast můstku se skládá z 1 až asi 200 aminokyselinových zbytků.

11. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze souboru sestávajícího z alaninu, argininu, asparaginu, kyseliny asparagové, cysteinu, kyseliny glutamové, glutaminu, glycinu, histidinu, isoleucinu, leucinu, lysinu, methioninu, fenylalaninu, prolinu, šeřinu, threoninu, triptofanu, tyrosinu a valinu.

12. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že antigenní konstrukt je fúzním proteinem.

13. Imunogenní liposomový prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že antigenní konstrukt je fúzním proteinem.

14. Způsob indukce imunogenní odpovědi u hostitelského živočicha, vyznačující se tím, že se podává imunogenně účinné množství prostředku podle nároku 1.

15. Způsob indukce imunogenní odpovědi u hostitelského živočicha, vyznačující se tím, že se podává imunogenně účinné množství prostředku podle nároku 2.

16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že hostitelským živočichem je savec.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že savcem je člověk.

18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že živočichem je pták.

19. Způsob podle nároku 17,vyznačující se tím, že antigenní determinanta je vybrána ze souboru sestávajícího z HSV gB nebo gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA nebo NA a H. influenzae P6.

20. Očkovací prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství prostředku podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.

20. Očkovací prostředek podle nároku 20, vyzná č ující se tím, že dále obsahuje jedno nebo vícs adjuvans.

22. DNA kazeta pro inserci do vektoru exprese obsahující sekvence, které kódují imunogenní fúzní protein, kde uvedený protein obsahuje hydrofobní proteinovou doménu a jednu nebo více antigenních determinant.

23. DNA kazeta podle nároku 22, ve které antigenní determinanta je vybrána ze souboru sestávajícího z HSV gB nebo gD, HIV gpl20, CMV gB, HCV E2, INFV HA nebo NA a H. influenzae P6.

24. DNA kazeta podle nároku 22, ve které hydrofobní doména je peptid sestávající z asi od 15 do asi 500 aminokyselin.

25. DNA kazeta podle nároku 24, ve které peptid obsahuje jednu nebo více aminokyselin vybraných ze souboru sestávajícího alaninu, asparaginu, cysteinu, glutaminu, glycinu, histidinu, isoleucinu, leucinu, methioninu, fenylalaninu, prolinu, šeřinu, threoninu, triptofanu, tyrosinu a valinu.

26. DNA kazeta podle nároku 22, ve které fúzní protein dále obsahuje oblast můstku spojující antigenní determinantu, a hydrofobní doménu.

27. DNA kazeta podle nároku 26, ve které oblast můstku oblast můstku se skládá z 1 až asi z 200 aminokyselinových zbytků.

28. DNA kazeta podle nároku 27, ve které aminokyselinové zbytky jsou vybrány ze souboru sestávajícího z alaninu, argininu, asparaginu, kyseliny asparagové, cysteinu, kyseliny glutamové, glutaminu, glycinu, histidinu, isoleucinu, leucinu, lysinu, methioninu, fenylalaninu, prolinu, šeřinu, threoninu, triptofanu, tyrosinu a valinu.

29. Vektor obsahující DNA kazetu podle nároku 22.

30. Způsob přípravy imunogenního liposomového prostředku, vyznačující se tím, žezahrnuje:

expresi genu kódujícího fúzní protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobní doménu;

rozptýlení lipidů tvořících měchýřky a fúzního proteinu ve vhodném organickém rozpouštědle;

vytvoření lipidového filmu nebo lyofilizovaného prášku odpařením organického rozpouštědla;

hydrataci lipidového filmu nebo prášku; a disperzi hydratovaného lipidového filmu nebo prášku, k vytvoření imunogenního liposomového prostředku.

31. .Způsob přípravy imunogenního liposomového prostředku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

expresi genu kódujícího fúzní protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobní doménu;

rozptýlení fúzního proteinu ve vodném pufru, hydrataci buď lipidových prášků nebo lipidových filmů v pufru obsahujícím • · fúzní protein; a disperzi lipidových prášků nebo filmů k vytvořeni imunogenního liposomového prostředku.

32. Způsob přípravy imunogenního liposomového prostředku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

expresi genu kódujícího fúzní protein obsahující antigenní determinantu a hydrofobní doménu;

rozptýlení fúzního proteinu ve vodném pufru; a přidání fúzního proteinu k přeformovaným liposomům k vytvoření imunogenního liposomového prostředku.

33. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje antigenní konstrukt obsahující jednu nebo více antigenních determinant a hydrofobní doménu; a farmaceuticky přijatelný nosič.

34. Imunogenní prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že antigenní konstrukt dále obsahuje oblast můstku spojující antigenní determinantu s hydrofobní doménou.

35. Imunogenní prostředek podle nároku 33, vyznačující se tím, že dále obsahuje jedno nebo více adjuvans.

36. Imunogenní emulzní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

lipidy tvořící měchýřky; a n antigenní konstrukt obsahující jednu nebo více antigenních determinant a hydrofobni doménu.

37. Prostředek podle nároku 36, v y z n a č u- * jící se tím, že antigenní konstrukt je fúzním proteinem.