CN1555254A

CN1555254A - 免疫原性脂质体组合物

Info

Publication number: CN1555254A
Application number: CNA99811216XA
Authority: CN
Inventors: G; G·福吉; ��Ĭ��; D·V·克拉默; W·A·埃恩斯特; -Ī��; J·阿德勒－莫雷; L·J·佩里
Original assignee: Molecular Express Inc
Current assignee: Molecular Express Inc
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2004-12-15
Also published as: BG105372A; CZ20011013A3; EA200100269A1; KR20010075261A; OA11657A; SK3222001A3; CA2344173A1; KR100592825B1; WO2000016746A2; WO2000016746A3; CA2344173C; SK287670B6; NZ528055A; GEP20053444B; EP1115382A2; DK1115382T3; NO330685B1; ZA200101829B; WO2000016746A9; AP2001002096A0

Abstract

本发明提供了一种含有形成小泡的脂类和一种抗原构建体的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体含有一个或多个抗原决定簇和一个疏水区。

Description

免疫原性脂质体组合物

发明背景

疫苗的应用历史上已经提供了一种保护大量人群抵抗多种感染性疾病的安全有效的方法。抗病毒和其它微生物的免疫通常是安全有效的，在发达国家内已经使得人的预期寿命大大增长。但是，可能会出现多种副作用，这取决于疫苗的性质和具体的免疫原。完整病毒的不充分灭活在过去已经导致免疫接种后力图避免的感染而不是保护(Tigertt，1959，Military Med.124：342)。偶尔，用流感病毒等完整有机体免疫接种会促使Guillain Barre综合征等针对正常组织的自身免疫疾病的病情发展(Langmuir et al.，1984，J.Epidemiol.119：841)。除了免疫原自身之外，在细胞或复合介质内存在的物质可能会引发对外源蛋白的严重过敏反应(Yamane和Uemura，1988，Epidem，Inf.100：291)。由于有效的免疫接种方式通常需要多次免疫，这些副作用会降低疫苗的效果，也会降低公众对这种免疫接种方式的接受程度。近来，人们已经试图借助现代分子生物学技术来提供安全性和有效性得到提高的新疫苗组合物。正在研究的可能的策略包括：基于重组DNA技术的疫苗(Conry et al.，1994，Cancer Res.54：1164；Hu et al.，1988，J.Virol.62：176)，制备简单的合成肽作为抗原(Nardelli et al.，1992，Vaccines8：1405；Watari et al.，1987，J.Exp.Med.165：459)，直接注射遗传物质至组织中引发保护性应答(Ulmer et al.，1993，Science 259：1745)。特别是，使用简单肽抗原引发特异性免疫应答是很多研究的焦点。这一策略的吸引力在于它可能提供免疫特异性，更严格地控制生产过程，消除免疫原制备过程中的大多数次要物质或污染物。

但是，应用纯化蛋白或肽片段免疫接种依赖于借助有效的抗原载体将免疫原运送到免疫部位。最安全的载体之一可能是基于脂类/脂质体的疫苗复合物。脂质体早已是商业上成熟的技术，因为它可以降低药物毒性，延长在血流中的循环时间，并改变药物分子的生物分布和药物动力学(Fujii，1996；Vesicles，ed.M.Rosoff，Marcel Dekker，NewYork NY，p.491)。当体内给药时，脂质体在血液中循环，通过单核细胞/巨噬细胞吞噬***清除，特别是肝、脾、***和肺组织中的吞噬***(Claasen，1996；Vesicles，ed.M.Rosoff，Marcel Dekker，New YorkNY，p.649)。脂质体导引抗原分布的能力揭示，脂质体免疫原可以最大程度地暴露于免疫***。迄今，已经试验了几种基于脂类的***，包括辍合于脂类的肽(Nardelli et al.，1992，Vaccines 8：1405；Watari et al.，1987，J Exp.Med.165：459)，脂类存在时全蛋白亚单位的重构(Moreinand Simons，1985，Vaccines 4：166；Gregoriadis，1995，Tibtech 13：527)，和蛋白与预先形成的脂质体的结合(Therien and Shahum，1989，Immunol.Lett.22：253；Alving et al.，1985，Vaccines 4：166)。尽管已经证实这些策略是免疫学活性的，大规模生产蛋白及其脂类载体的技术困难，以及费用制约，使得它们作为商用技术的吸引力降低。因此，需要制备蛋白抗原的改进***或方法，以在疫苗开发中利用脂质体的潜能。

发明概述

本发明提供了含有形成小泡的脂类和一种抗原构建体的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体含有一个或多个抗原决定簇和一个疏水区。优选疏水区与脂质体组合物的膜结合。优选疏水区是肽，在一个优选实施方案中，疏水区由约15到约500个氨基酸残基组成，更优选少于约300个残基，最优选少于约50个残基，其中至少一个或更多氨基酸选自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。

根据本发明的一个实施方案，免疫原性脂质体组合物还包括一种或多种佐剂。合适佐剂的实例包括Lipid A等亲脂分子和其它脂多糖、QuilA、QS21、MF59、P₃CSS、MTP-PE，以及水溶性分子，包括IL-2、IL-4、IL-12、干扰素等细胞因子。其它细胞因子的实例在后文表1中提供。

根据本发明的另一个实施方案，抗原构建体还包括连接抗原决定簇与疏水区的接头区。在优选实施方案中，接头区是肽，由1到约200个氨基酸残基组成。优选氨基酸残基是天然存在的氨基酸，如Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和/或Val。

本发明还提供了一种在宿主动物体内引发免疫应答的方法，包括给予免疫有效量的上述脂质体组合物。尽管可以是包括家禽的任何动物，优选宿主动物是哺乳动物，更优选是人。在某些优选实施方案中，免疫原性脂质体组合物还包括一种或多种合适的佐剂。

本发明还提供用于***一种载体的DNA盒，其包括编码免疫原性融合蛋白的序列，其中融合蛋白包括疏水蛋白区和一个或多个抗原决定簇。

本发明也提供一种制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：表达编码包括一个抗原决定簇和一个疏水区的融合蛋白的基因；在合适的有机溶剂或有机溶剂混合物中溶解脂类和融合蛋白；通过蒸发有机溶剂形成脂膜；使脂膜水化；将水化的脂膜分散形成免疫原性脂质体组合物。

本发明还提供一种制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：表达编码包括一个抗原决定簇和一个疏水区的融合蛋白的基因；在含水缓冲液中溶解融合蛋白；用含融合蛋白的缓冲液水化脂颗粒或脂膜；将脂颗粒或脂膜分散形成免疫原性脂质体组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：表达编码包括一个抗原决定簇和一个疏水区的融合蛋白的基因；在含水缓冲液中溶解融合蛋白；将融合蛋白加入预先形成的脂质体中以形成免疫原性脂质体组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种制备免疫原性脂乳剂组合物的方法，包括：表达编码包括一个抗原决定簇和一个疏水区的融合蛋白的基因；使用脂分散体(如大豆油等油的分散体)代替脂质体，通过上述任一种方法制备免疫原性脂乳剂组合物。

在再一个实施方案中，本发明提供一种制备免疫原性脂质体或脂乳剂组合物的方法，包括：化学合成包括一个抗原决定簇和一个疏水区的融合蛋白；通过上述任一种方法制备免疫原性脂质体或脂乳剂组合物。

在本文中，“与膜结合”是指疏水区至少部分包埋在脂质体膜内，优选与小泡形成脂类非共价相连。疏水区也可以与本身包埋在膜内的一种脂的脂肪酸“尾”键合。

附图简述

图1显示本发明的一种脂质体组合物在抵抗HSV2的保护作用中的效果。

图2显示本发明的脂质体组合物与其它疫苗组合物的效果比较。

图3显示小鼠存活曲线，证实脂质体HSV2g(1-23)-HD引发保护性免疫应答的能力。

发明详述

本发明提供旨在提高抗多种微生物和癌症的免疫接种的效果和安全性的抗原运送***。免疫原的编码基因盒由与特异性抗原序列融合的疏水区(HD)组成。含有编码HD的核酸序列和抗原表位的质粒在合适宿主中制备和表达，合适宿主如大肠杆菌、巴斯德毕赤酵母、昆虫细胞、COS-1细胞或CHO细胞(Genetic Engineering News，18：17(1998))。蛋白表达和纯化之后配制在脂质体中。在膜存在时，蛋白与脂双层结合，形成稳定结构，疏水区与膜结合，抗原表位朝向含水介质。质粒可以在关键位置用限制位点改造，使得不同的抗原表位可以方便地被取代，从而提供利用不同抗原表位的能力，以便在免疫接种后提供最大保护。这种盒的一个独特特征是蛋白成分可以在宿主细胞中大量制备，方便地纯化，然后结合于脂质体中。这为确定改善抗微生物或癌症的保护作用的最合适表位提供了最大程度的灵活性，同时兼顾了大量生产和商业销售疫苗的最终目标。

因此，本发明的优势在于：(1)表位可以方便地改变以给疫苗设计提供最大程度的灵活性；(2)多个表位可以***载体分子中；(3)必要时可以包括大抗原序列(即膜蛋白或受体区)或亚单位；以及(4)表达的载体蛋白是水溶性的，易于使用标准蛋白制备方法纯化。抗原构建体作为水溶性融合产物合成最大程度减少了大规模生产时由蛋白疏水区引起的问题。因此，具有供脂质体膜***的疏水区同时又是水溶性的蛋白的构建是主要的优势。在某些情况下，可以在纯化过程中使用少量增溶剂，如胍、脲、十二烷基硫酸钠、辛基葡糖苷或脱氧胆酸盐。本发明也提供含两个或更多抗原的构建体。这些构建体可以表示如下：

H₂N-抗原位点I-HD-抗原位点II-COOH

本发明也设想到使用天然衍生或合成的单个跨膜螺旋或螺旋束(2-12)。抗原位点可以位于N或C末端，或位于螺旋束的单股之间形成的环之间。

“抗原”在本文中是指以下的任何物质(包括蛋白或蛋白-多糖、脂多糖、微生物亚单位、全病原体或癌症标志)，它对宿主动物是外源的，进入这种动物的组织即刺激巨噬细胞、抗原呈递细胞和抗原特异性抗体的形成，并在体内或体外与这种抗体特异性反应。而且，抗原刺激具有该抗原和交叉反应抗原受体的T-淋巴细胞(如自然杀伤(NK)细胞、细胞毒T细胞和T辅助细胞)的增殖和/或活化，并能与淋巴细胞反应，引发称为细胞介导免疫的系列免疫应答。在本发明的免疫原性组合物中，优选存在的抗原量为约0.1到20毫克/毫升抗原-HD。更优选存在的抗原量为约0.5到5毫克/毫升抗原-HD。

“抗原决定簇”是抗原或抗原构建体的一部分，它决定抗原的免疫特异性。通常，在天然存在的抗原中抗原决定簇或半抗原是肽、蛋白或多糖。在人工抗原中，也可以是低分子量物质，如对氨苯基砷酸衍生物。抗原决定簇在体内或体外与抗原决定簇的抗原形式(如抗原决定簇辍合于免疫原性物质)诱导的抗体或T淋巴细胞特异性反应。

抗原决定簇可以用来实施本发明，它可以来源于例如以下抗原：

病毒抗原

病毒抗原 Reference

蓝舌病毒结构 Murray and Eaton，1996，Austral.Vet.J.73：207

牛疱疹病毒(IBR) Franz et al.，1996，Veterini Medicina 41：213

牛病毒性腹泻病毒 E2 Bruschke et al.，1997，Vaccine 15：1940

Ludeman and Katz，1994，Biologicals 22：21

巨细胞病毒 gp58 Wagner et al.，1992，J.Virol.66：5290

GB Wang et al.，1996，J.Inf.Dis.174：387

多表位 Ag Thomson et al.，1996，J.Immunol.157：822

PrM Fonseca et al.，1994，Vaccine 12：279

E Fonseca et al.，1994，Vaccine 12：279

E/NS1 Venugopal and Gould，1994，Vaccine 12：967

NS1/NS2 Green et al.，1997，Virol.234：383

被膜B Simmons et al.，1998，Am.J.Trop.Med.Hyg.58：655

4型衣壳 Gagnon et al.，1996，J.Virol.70：141

犬瘟病毒 F/H Pardo et al.，1997，Am.J.Vet.Res.58：833

埃博拉病毒 GP/NP Vanderzanden et al.，1998，Virol.246：134

EB病毒 EBNA 1，2，3，4，6 Moss et al.，1992，Sem.Immunol.4：97

***病毒 VP1 Filgueria et al.，1995，Vaccine 13：953

甲肝病毒 A/B结合Ag Bruguera et al.，1996，Vaccine 14：1407

乙肝病毒 HbsAg Thanavala et al.，1995，PNAS 92：3358

Skelly et al.，1981，Nature 290：51

丙肝病毒 E2/NS1 Weiner et al.，1992，PNAS 89：3468

Taniguchi et al.，1993，Virol.195：297

NS3 Khudyakov et al.，1995，Virol.206：666

NS4 Khudyakov et al.，1995，Virol.206：666

NS5 Khudyakov et al.，1995，Virol.206：666

E1 Lechner et al.，1998，Virol.243：313

单纯疱疹病毒I GD Long et al.，1984，Inf.Immun.37：761

单纯疱疹病毒II^c GB McDermott et al.，1989，Virol.169：244

GD Long et al.，1984，Inf.Immun.37：761

乙肝病毒 Hunt and Melendez，1969，Lab.Animal Care 19：221

猪瘟病毒 E1 van Rijn et al.，1994，J.Virol.68：3934

人类免疫缺损病毒^d HIV Molecular Immunology Database

人***状瘤病毒 L1 Suzich et al.，1995，PNAS 92：11553

Stauss et al.，1992，PNAS 89：7871

E6 Stauss et al.，1992，PNAS 89：7871

E7 Stauss et al.，1992，PNAS 89：7871

流感病毒 HA/N Laver and Webster，1976，Virol.69：511

NP Martinon et al.，1993，Eur.J.Immunol.23：1719

日本脑炎病毒^b E Kimura-Kuroda and Yasui，1988，J.Immunol.141：3606

马堡病毒 GP Hevey et al.，1997，Virol.239：206

禽疱疹病毒I型 GA Boyle and Heine，1993，Immun.Cell Biol.71：391

GB Boyle and Heine，1993，Immun.Cell Biol.71：391

麻疹病毒 HA Cordoso et al.，1998，J.Virol.72：2516

NP Cordoso et al.，1998，J.Virol.72：2516

诺沃克病毒 56kD衣壳 Ball et al.，1998，J.Virol.72：1345

禽新城疫病毒 F Reddy et al.，1996，Vaccine 14：469

HN Reddy et al.，1996，Vaccine 14：469

副流感病毒 F/HN Morein et al.，1983，J.Gen.Virol.64：1557

犬细小病毒 VP2 Lopez de Turiso et al.，1992，J.Virol.66：2748

狂犬病毒 G Wiktor et al.，1984，PNAS 81：7194

呼吸合胞体病毒 F蛋白 Falsey and Walsh，1996，Vaccine 14：1214

FG亚单位 Neuzil et al.，1997，Vaccine 15：525

Hemming et al.，1995，Clin.Microbiol.Rev.8：22

牛瘟病毒 H/F Naik et al.，1997，Vaccine 15：603

轮状病毒^e VP4 Zhou et al.，1994，J.Virol.68：3955

VP7 Zhou et al.，1994，J.Virol.68：3955

VP6 Palombo et al.，1994，J.Gen.Virol.75：2415

风疹病毒 E1 Trudel et al.，1985，J.Virol.Meth.12：243

人α疱疹病毒3型 GE Fowler et al.，1995，Virol.214：531

Arvin，1996，Inf.Clin.Dis.N.Amer.10：529

黄热病毒^b E Gould et al.，1986，J.Gen.Virol.67：591

NS1(48kD) Schleschinger et al.，1987，J.Immunol.135：2805

a.综述见Pass，1996，Inf.Ag.Dis.5：240；Avery，1998，Curr.Op.Cardiol.13：122.

b.这些病毒均为黄病毒，综述见Venugopal and Gould，1994，Vaccine 12：966.

c.综述见Adimora et al.，1994，Inf.Dis.Clin.N.Amer.8：859.

d.病毒抗原列表见HIV Molecular Immunology Database，publ.Theoretical Biology andBiophysics，New Mexico(1995).

e.轮状病毒列表见“Rotavirus Antigens”，Hoshino and Kapikian，1994，Curr.Top.Microbiol.Immunol.185：179.

细菌毒素^*

细菌毒素参考文献

炭疽芽孢杆菌炭疽 Leppla，1982，PNAS 79：852

百日咳博德特氏菌百日咳 Weiss and Hewlett，1986，Ann.Rev.Microbiol.40：

肉毒梭菌内毒 Simpson，1981，Pharmacol.Rev.33：155

艰难梭菌艰难 Knoop et al.，1993，Clin.Microbiol.Rev.6：251

破伤风梭菌破伤风 Eidels et al.，1983，Microbiol.Rev.47：596

白喉棒杆菌白喉 Pappenheimer，1977，Ann.Rev.Biochem.46：69

大肠杆菌肠毒素 Gill and Richardson，1980，J.Inf.Dis.141：64

金黄色葡萄球菌外毒素 A Iglewski and Kabat，1977，PNAS 72：2284

痢疾志贺氏菌志贺 Keusch and Jacewicz，1975，J.Inf.Dis.131：S33

霍乱弧菌霍乱 Finkelstein，1973，Crit.Rev.Microbiol.2：553

^* 综述见Middlebrook and Dorland，1984，p.199.

细菌病原体

细菌抗原参考文献

芽孢杆菌属种 PA/LF/EF Singh et al.，1998，Inf.Immun.66：3447

博德特氏菌属种 Pertactin/P.69 Anderson et al.，1996，Vaccine 14：1384

疏螺旋体属种 OspA/OspB Ma et al.，1996，Vaccine 14：1366

OspC Mathiesen et al.，1998，Inf.Immun，66：4073

布鲁氏菌属种 L7/L12 Bachrach et al.，1994，Inf.Immun.62：5361

Omp16 Tibor et al.，1994，Inf.Immun. 62：3633

弯曲杆菌属种 Omp18 Konkel et al.，1996，Inf.Imm

衣原体^f MOMP Sparling et al.，1994，PNAS 91：2456

埃利希氏体属种 Rikihisa，1991，Clin.Microbiol.Rev.4：286

埃希氏菌属种 PAL Chen and Henning，1987，Eur.J.Biochem.163：73

嗜血杆菌属种^f P1 Loeb，1987，Inf.Immun.55：2612

P2 Munson et al，1983，J.Clin.Invest.72：677

P4 Green et al.，1991，Inf.Immun.59：3191

P5 Munson and Granoff 1985，Inf.Immun.49：544

P6 Green et al.，1990，Inf.Immun.58：3272

蛋白 D Akkoyunlu et al.，1996，Inf.Immu

D15 Thomas et al.，1990，Inf.Immun.58：1909

Yang et al.，1998，Inf.Immun.66：3349

98kD 蛋白 Kimura et al.，1985，Inf.Immun.47：253

HtrA Loosmore et al.，1998，Inf.Immun.66：899

幽门螺杆菌脲酶 A Michetti et al.，1994，Gastroenterol.107：1002

脲酶 B Michetti et al.，1994，Gastroenterol.107：1002

Vac A Kleanthouset al.，1998，Brit.Med.Bull.54：229

触酶 Radcliff et al.，1997，Inf.Immun.65：4668

军团菌属种 PplA Ludwig et al.，1996，Inf.Immun.64：1659

钩端螺旋体属种 OMA Brown et al.，1991，Inf.Immun.59：1772

利斯特氏菌属种 LLO Harty and Bevan，1992，J.Exp.Med.175：1531

麻风分枝杆菌 35kD 蛋白 Triccas et al.，1996，Inf.Immun.64：5171

18kD Baumgart et al.，1996，Inf.Immun.64：2274

Ag85A Launois et al.，1994，Inf.Immun.62：3679

结核分枝杆菌 MPB59 Roche et al.，1994，Inf.Immun.62：5319

Ag85A Launois et al.，1994，Inf.Immun.62：3679

枝原体属 90kD Franzoso et al.，1993，Inf.Immun.61：1523

奈瑟氏球菌属种^f OMV Anderson et al.，1997，Vaccine 15：1225

Por Sparling et al.，1994，PNAS 91：2456

假单胞菌属种 OprF Hughes et al.，1992，Inf.Immun.60：3497

OprI Specht et al.，1996，Vaccine 14：1111

O-多糖 Hatano and Pier，1998，Inf.Immun.66：3719

沙门氏菌属种 OMP/Por Alurkar and Kanat，1997，Inf.Immun.65：2382

Vi Plotkin and Bouveret-LeCam，1995，Arch.Int.Med.

葡萄球菌属种 CP Fatton et al.，1996，Inf.Immun.64：1659

RAP(38kD) Balaban et al.，1998，Science 280：438

链球菌属种 M Beachey et al.，1988，Vaccine 6：192

苍白密螺旋体^f TROMP Sparling et al.，1994，PNAS 91：2456

耶尔森氏菌属种 F1/V Leary et al.，1997，Microbial Pathogen.23：167

f.综述见Adimora et al.，1994，Inf.Dis.Clin.N.Amer.8：859.

真菌病原体

有机体抗原参考文献

曲霉 Kurup and Kumar，1991，Clin.Microbiol.Rev.4：439

假丝酵母 Pra1 Setandreu et al.，1998，J.Bacteriol.180：282

球孢菌 48kD蛋白 Kirkland et al.，1998，Inf.Immun.66：424

CF Yang et al.，1997，Inf.Immun.65：4068

PRA Kirkland et al.，1998，Inf.Immun.66：35 19

隐球酵母 Mitchell and Perfect，1995，Clin.Microbiol.Rev.8：515

组织胞浆菌 Deepe，1997，Clin.Microbiol.Rev.10：585

Paracoccidioides brasiliensis Brummer et al.，1993，Clin.Microbiol.Rev.6：89

Pneumocystis carinii GpA Gigliotti et al.，1998，Inf.Immun.66：3179

寄生虫病原体

有机体抗原参考文献

Cryptosporidium Current and Garcia，1991，Clin.Microbiol.Rev.4：325

痢疾内变形虫 SREHP(K2) Stanley et al.，1990，PNAS 87：4976

Ariel Mai and Samuelson，1998，Inf.Immun.66：353

170kD Lotter et al.，1997，J.Exp.Med.185：1793

蓝氏贾第菌鞭毛虫 VSP Stager et al.，1997，Int.J.Parasitol.27：965

利什曼原虫属种 gp63 Kahl et al.，1990，Inf.Immun.58：3233

Nramp-1 1998，Inf.Immun.66：1910

TSA Webb et al.，1998，Inf.Immun.66：3279

疟原虫属种 27kD蛋白 Contreras et al.，1998，Inf.Immun.66：3579

AMA-1 Anderson et al.，1998，Vaccine 16：240

CS Nardin et al.，1998，Vaccine 16：590；

prot表位 1998，Inf.Immun.66：2895

195kD蛋白 Patarroyo et al.，1987，Nature 328：629

55kD蛋白 Patarroyo et al.，1987，Nature 328：629

35kD蛋白 Patarroyo et al.，1987，Nature 328：629

血吸虫属种 Sm28GST Ballone et al.，1987，Nature 326：149

锥体虫属种 56kD蛋白 Harth et al.，1994，Mol.Microbiol.11：261

癌症^**

癌症抗原参考文献

乳腺 MUC-1 Denton et al.，1993，Canc.Lett.70：143

结肠 CEA Conry et al.，1994，Canc.Res.54：1164

白血病 BCR/ABL Chen et al.，1992，PNAS 89：1468.

淋巴瘤 Self Ag Kwak et al.，1992，New Eng.J.Med.327：1209

黑素瘤 MART-1 Kawakami et al.，1994，PNAS 91：3515

MAGE-1 Traversari et al.，1992，J.Exp.Med.176：1453

p97 Hu et al.，1988，J.Virol.62：176

卵巢 MUC-1 Jerome et al.，1993，J.Immunol.151：1654

胰腺 MUC-1 Bashford et al.，1993，Int.J.Canc.54：778

^** 综述见Finn，1993，Curr.Op.Immunol.5：701.

可以使用的其它抗原和病原体的实例参见Milich，1989(Adv.Immunol.45：195)，Hishino和Kaplan，1994(Curr.Top.Microbiol.Immunol.185：179)或Venugopal和Gould，1994(Vaccine 12：966)。根据一个实施方案，使用人类免疫缺损病毒(HIV)的env基因的gp120亚单位和gag基因的p27。在另一个实施方案中，抗原决定簇可以来源于以下抗原：HSV gD或gB，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA，流感嗜血杆菌P5或P6，菌毛蛋白和蛋白D。

在本文中，“疏水区”(HD)是指任何具有表面积大于5002的疏水区域或结构的蛋白、肽、脂或分子。可能的HD的实例包括任何跨膜(TM)区段(如血型糖蛋白A；Tomita和Marchesi，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：2964)、细胞色素b5的疏水区(Taylor和Roseman，1995，BBAQ 1278：35)、白喉毒素T区(choe et al.，1992，Nature357：216)、假单胞菌外毒素A的II区(Allured et al.，1997，Mol.Microbiol.23：935)、青霉素感觉传导蛋白的4螺旋束(Hardt et al.，1997，Mol.Microbiol.23：935)、细菌视紫红质的7螺旋束(enderson和Unwin，1975，Nature 257：28)、lac通透酶的12螺旋束(Kabaek et al.，1997，Curr.Op.Struct.Biol.7：537)和大肠菌素的孔形成区(Parker et al.，1989，Nature 357：93)。

“载体”在本文中是指一种来自质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体或合成的核酸，其中***或克隆了核酸片段。为此目的，载体可以含有一个或多个单一限制位点，可以在限定的宿主或有机体中自主复制，使得克隆的序列被复制。载体分子可以赋予宿主有机体确定的表型，它们是可以选择的或容易检测的。载体的某些成分可以是含有负责转录、翻译、RNA稳定性和复制的调控元件或其它DNA序列。

“DNA盒”在本文中是指载体中的遗传序列，它可以表达本文所述的融合蛋白。核酸盒在载体内依次排列，使得盒内的核酸可以被转录成RNA，必要时翻译成融合蛋白产物。优选，该盒具有适于方便地***载体的3′和5′末端，例如它在每一末端具有限制性内切酶。

尽管抗原构建体优选使用重组技术制备，但应当理解，该构建体可以通过本领域已知的任何方式合成，例如化学方式。当使用非肽接头或疏水区包括非天然存在的氨基酸残基或模拟物时，这一点特别有用。因此，尽管优选实施方案利用重组方法制备抗原融合蛋白，本发明也提供了一种方法，包括：通过化学合成方式或组合重组和化学方式制备抗原构建体，如上制备免疫原性脂制剂。

除了优选的肽接头，其它本领域已知的接头也可以用来将抗原连接至疏水区。这种接头的实例包括但不限于聚乙二醇、多糖、聚唾液酸、琥珀酸、丁二酸、己二酸，和标准交联化学实体，例如SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-砒啶二硫代)-甲苯)、DSP(二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸))、EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸))、SMCC(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸)和SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-砒啶二硫代)-丙酸)(也可参见，Pierce目录，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.)

根据本发明，脂质体在抗原运送中起着关键性的作用，因为抗原-脂质体复合物直接呈递给免疫***，然后由免疫***细胞清除出循环。此外，免疫刺激途径的选择也可通过改变脂质体的脂类组分而改变。例如，不同的免疫刺激分子如Lipid A(Asano and Kleinerman，1993，J.Immunother.14：286)、P3CSS(Lex et al.，1986，J.Immunol.137：2676)、胞壁酰二肽或三肽-PE(Fidler et al.，1992，PNAS 78：1680；Alving et al.，1984，Vaccines 4：166)和阳离子脂(Walker et al.，1992，PNAS 89：7915)可以被配制到脂质体中，以刺激不同的免疫途径。MF59、Quil A、QS21或矾等其它佐剂可以与抗原-脂质体复合物联合使用。此外，可以加入细胞因子等免疫调节分子引发免疫应答。

用来实施本发明的脂质体可以由多种形成小泡的脂类制备，所述脂类包括磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇(PG)和磷脂酰胆碱等磷脂酰醚和酯；二油酰基甘油琥珀酸等甘油酯；脑苷脂、神经节苷脂、鞘磷脂；胆固醇等类固醇；其它脂类，以及其它赋形剂如维生素E或维生素C棕榈酸(也可参见美国专利4235871；4762720；4737323；4789633；4861597和4873089)。基于PC的脂类的实例包括但不限于(C-18)二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)；(C-16)二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)；(C-14)二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和(C-18，未饱和)二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。优选脂类在体温(约38到39℃)时是流体相。因此，Tm高于体温的脂类如DSPC和DPPC不是优选的(但仍可使用)。Tm低于体温的脂类如DMPC或DOPC更优选。此外，优选脂类制剂含有不超过约10％的胆固醇，约0-15％PG和约0-100％PC。在某些优选实施方案中，该组合物还可以含有约1-10％佐剂；优选，佐剂的量不超过约5％。

脂质体制剂在现有技术中是众所周知的。一般，脂质体通过多种不同的技术制备，所述技术包括乙醇注射(Batzri et al.，1973，Biochem.Biophys.Acta.298：1015)；醚注射(Deamer et al.，1976，Biochem.Biophys.Acta.443：629；Schieren et al.，1978，Biochem.Biophys.Acta.542：137)；表面活性剂去除(Razin，1972，Biochem.Biophys.Acta.265：241)；溶剂蒸发(Matsumato et al.，1977，J.Colloid Interface Sci.62：149)；由氯仿的水乳剂中蒸发除去有机溶剂(REV)(Szoka Jr.etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：4194)；通过核心聚碳酸酯膜挤出MLV或EUV(Olsen et al.，1979，Biochem.Biophys.Acta.557：9)；磷脂混合物的冻融(Pick，1981，Archives of Biochem and Biophysics，212：186)以及超声处理和匀浆。

习惯上，脂质体按照大小分类，三字母缩写用来表示讨论的脂质体类型。多层小泡通常称为“MLV”，小的单层小泡被称为“SUV”，大单层小泡称为“LUV”。这些名称有时在脂质体组合物中使用。关于命名和已知脂质体类型的讨论，可参见Storm et al.，1998，PSIT，1：19-31。

本发明考虑到使用具有适当佐剂的脂质体组合物。但是，本发明也考虑到使用不与脂质体联合而与合适的佐剂组合的抗原构建体。因此，疫苗或免疫原性组合物包括两种成分：连接于疏水区的抗原；和适当的佐剂***。可以使用的可能的可药用载体***实例包括但不限于脂质体、乳剂、福氏(完全或不完全)佐剂、矾、ISCOMS和被膜病毒。

本发明的方法将使用免疫有效量的脂质体组合物，即该用量的组合物与任何加入的赋形剂或载体联合可以在宿主中产生可检测的免疫应答。在该组合物用作疫苗组合物时，有效量是指与任何加入的赋形剂或佐剂联合时会使宿主产生足够的特异免疫应答，从而在随后宿主接触微生物(预防性免疫接种)时保护宿主，或保护患病宿主(治疗性免疫接种)。

以上已经一般性介绍了本发明，参照以下实施例将更好地理解本发明，若非特别注明，提供这些实施例仅仅为了说明本发明，而不是要限定本发明。

实施例

实施例I-HSV2

HSV2gD(1-23)-TM的制备。HSV2被膜蛋白gD的N末端23个氨基酸区段在自动肽合成仪上通过化学合成偶联于跨膜(TM)区段。合成的肽通过标准HF切割法切割，使用Waters C18柱和含有0.1％TFA的100％乙腈通过制备性HPLC纯化。通过质谱和毛细管电泳证实肽的纯度至少为95％。

脂质体制备。脂质体按照已知方法(Fujii et al.，1997，Biochemistry36：4959)通过探头超声处理制备。简而言之，脂类(有或没有蛋白)溶解在氯仿/甲醇等有机溶剂中。薄的脂膜通过以下方法形成：移取等分量的脂溶液进入宽底玻璃试管，65℃在氮气流下蒸发溶剂。膜置于真空下至少8小时除去残留有机溶剂。用缓冲液水化脂膜，在65℃温育悬液5-10分钟，再用探头超声处理，从而完成脂质体制备。脂质体然后通过0.22m的滤器使制备物除菌。脂质体通过动态光散射筛分，然后是至少4周的聚集体形成。

特别优选的脂质体HSV2gD(1-23)-TM制剂的摩尔比是15∶2∶3DMPG∶Chol∶DMPG(二豆蔻酰磷脂酰胆碱∶胆固醇∶二豆蔻酰磷脂酰甘油)，Lipid A的重量为2.5％。

免疫接种程序和对病毒抗原免疫应答诱导的测定。BALB/c或C57BL/6雌性小鼠(6-8周龄)用试验疫苗制备物或缓冲液皮下注射，每周一次，共2、3或4周。监测注射部位的副反应，如形成肉芽肿和/或结痂。当动物用疫苗通过鼻内途径免疫接种时，用氟烷麻醉之，使用微量移液器的无菌吸头将组合物(10-20l)加到鼻孔内使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168：622)。

在免疫接种过程中和病毒攻击后，定期测定小鼠对病毒抗原的免疫应答。病毒中和抗体试验使用含1×10⁵ BHK细胞的24孔板进行，细胞中加有与病毒混合的不同稀释度小鼠血清。37℃下在二氧化碳培养箱中温育48-72小时后，观察细胞单层的细胞毒性，测定中和抗体的滴度。沉淀病毒的抗体通过用5-10g病毒抗原或25-50l HSV2原种(1×10⁵ PFU)温育不同稀释度的血清来测定。含有抗原表位的脂质体也可用作已知的抗体/ELISA试验(Tuso et al.，1993，Transplantation55：1375)的靶。后一试验的结果将用来测定结合水平和抗体的同种型构造。

在免疫小鼠中对病毒抗原的迟发型超敏反应使用爪垫试验测定。免疫接种动物用氟烷麻醉，在一只后爪垫注射50l紫外灭活的HSV2，在另一只后爪垫注射50l裂解的未感染细胞。24、48和72小时后，小鼠爪垫肿胀程度使用Vernier卡尺测定，并与基线水平比较。这些动物的T细胞活性也通过在用病毒抗原温育脾T细胞时的细胞因子产生来测定。从免疫接种动物取出脾，用无菌活塞温和地打碎脾并挤压细胞通过尼龙筛网来制备脾匀浆。洗涤细胞悬液，在96孔微量板上以1×10⁶细胞/孔铺板。细胞在37℃用不等量的病毒抗原温育3到4天后，收获各孔上清，测定细胞因子的存在。商用细胞因子ELISA试剂盒用来确定细胞因子谱(来自PharMingen，Inc.San Diego，CA的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12，IFN-□、□-肌动蛋白和TNF-α)。组织培养物上清中的细胞因子蛋白通过夹心ELISA测定，使用特定细胞因子特异性的单克隆抗体(mAb)。简而言之，ELISA板用大鼠抗小鼠细胞因子单克隆抗体包被过夜。用PBS中的3％胎牛血清封闭培养板2小时，然后等分量的每一测试样品加入每一孔中。向每一孔中加入细胞因子特异性的生物素化大鼠抗小鼠单克隆抗体，然后是抗生物素蛋白过氧化物酶。通过加入比色底物得到有色反应。在ELISA分光光度计上读取培养板，根据对照重组细胞因子获得的标准曲线计算细胞因子浓度。

测定脂质体疫苗制备物的HSV2小鼠脑炎模型。免疫接种或未接种(对照)BALB/c雌性小鼠(10-12周龄)用致死剂量(1×10⁵ PFU)大脑传代的HSV2腹膜内攻击。用致死剂量HSV2***内攻击的小鼠攻击前一周和攻击前-1天首先用***皮下预处理。然后用腹膜内注射乙酰丙嗪和***麻醉。然后用干Calgiswab搽拭***，再使用微量移液器的无菌吸头***内给予HSV2(10-30l)(McDermott et al.，1984，J.Virol.51：747)。攻击后监测动物80天，监测存活(每日)、体重损失(头两周每两天一次，然后每周一次)、皮毛外观和神经学症状(活动水平下降、四肢行动迟缓或麻木)。

抗原诱导的T细胞增殖。宿主对gD抗原的致敏通过抗原诱导的T细胞增殖试验测定。用无菌活塞温和地打碎脾并挤压细胞通过尼龙筛网来制备脾匀浆。细胞悬浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mM Hepes缓冲液、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(25IU/ml)、和链霉素(25g/ml)的RPMI 1640培养基中。在96孔U形底培养板中，5％二氧化碳下，细胞在存在或不存在gD(5-20g/ml)时于1×10⁶细胞/ml浓度培养。培养物用20μl刃天青染料脉冲处理3小时，然后在Cytofluor II(Perspective Biosystems，Inc.，Farmington，MA)上测定荧光。

细胞因子特异性mRNA分析。测定免疫和未免疫动物的T细胞的主要细胞因子的细胞因子特异性mRNA水平，该水平可能反映了与免疫相关的致敏，包括IL-2、IFN-□、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。由脾获得T细胞如前所述。总RNA使用Chomczynsky和Sacchi(Chomczynsky et al.，1987，Analyt.Biochem，162：156)所述的方法的改进方法(Cosenza et al.，1994，Liver Transpl.Surg.1：16)分离。新鲜或冰冻细胞(2×10⁶)在1毫升变性液(4mM异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠(pH7.0)、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1mM 2-巯基乙醇)中裂解。用1倍体积的异丙醇在-20℃温育沉淀RNA。总RNA的浓度调整为260nM，样品储存在-80℃待用。

细胞因子分析使用Cosenza et al.(Cosenza et al，1994，LiverTranspl.Surg.1：16)等所述方法的改进法进行。单链cDNA通过在20l总反应体积中使用禽成髓细胞血症病毒逆转录酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)转录2g总RNA来制备。鼠细胞因子序列特异性寡核苷酸引物(表1)用来扩增每一目标细胞因子基因预定大小的DNA片段。

表1 小鼠细胞因子半定量分析使用的寡核苷酸引物

寡核苷酸核酸序列预期目标大小

IL-2 5’ TGATGGGACCTACAGGAGCTCCTGAG(SEQ ID NO.1) 167bp3’ GAGTCAAATCCAGAACATGCCGCAG(SEQ ID NO.2)IL-4 5’ CGAAGAACACCACAGAGAGTGAGCT(SEQ ID NO.3) 180bp3’ GACTCATTCATGGTGCAGCTTATCG(SEQ ID NO.4)IL-5 5’ ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC(SEQ ID NO.5) 242bp3’ CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG(SEQ ID NO.6)IL-6 5’ TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG(SEQ ID NO.7) 154bp3’ TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC(SEQ ID NO.8)IL-10 5’ TCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGC(SEQ ID NO.9) 426bp3’ CTGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA(SEQ ID NO.10)IL-12 5’ TCGCAGCAAAGCAAGATGTG(SEQ ID NO.11) 315bp3’ GAGCAGCAGATGTGAGTGGC(SEQ ID NO.12)IFN 5’ AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGTAG(SEQ ID NO.13) 843bp3’ GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG(SEQIDNO.14)TNF-α 5’ GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC(SEQ ID NO.15) 307bp3’ ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG(SEQ ID NO.16)□-肌动蛋白 5’ TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC(SEQ ID NO.17) 348bp3’ TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG(SEQ ID NO.18)

PCR混合物由1l cDNA，2.5l PCR 10×缓冲液，1l 5′和3′引物，2.5l 10×dNTPs(2mmol/L)和0.125l水生栖热菌热稳定性DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)组成，总体积为25l。特异性□-肌动蛋白引物用来扩增548bp片段作为内部对照。PCR混合物用矿物油覆盖，94℃温育混合物7分钟后，扩增38个循环，条件为94℃变性30秒，60℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，再72℃温育7分钟。在溴化乙锭存在下在琼脂糖凝胶上分离PCR产物。UV光下显示条带，照相，使用Molecular Analyst软件包(Bio-Rad，Richmond CA)由相片进行光密度定量。

通过ELISA进行的细胞因子测定。商用细胞因子ELISA试剂盒被用于确定由免疫和未免疫动物分离的脾CD4⁺T细胞分泌的细胞因子谱。脾T细胞组织培养物上清中细胞因子蛋白的夹心ELISA测定使用特定细胞因子特异性单克隆抗体进行。简而言之，ELISA培养板用大鼠抗小鼠细胞因子单克隆抗体包被过夜。培养板用PBS中的3％FCS封闭2小时，然后向每孔中加入等分量的每一样品。再向每孔加入细胞因子特异性生物素化大鼠抗小鼠单克隆抗体，随后加入抗生物素蛋白过氧化物酶。通过加入比色底物得到有色反应。在ELISA分光光度计上读取培养板，根据对照重组细胞因子获得的标准曲线计算细胞因子浓度。

抗HSV2 CTL应答。免疫接种后，评估脾T细胞中的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的存在。如前所述获得脾淋巴细胞。来自各处理组的淋巴细胞合并(n＝5)，然后在12孔培养板中以10⁷细胞/孔在抗原不存在时培养3天。EL-4(H2⁺)靶细胞(ATTC)与相应于H2⁺限制细胞的残基495到505之间的HSV2 gB CTL表位的肽温育(Hanke et al.，1991，J.Virol.65：1177)，37℃下温育4小时。洗涤靶标，向各孔中加入含1×10⁴细胞的100μl滴定液。洗涤效应淋巴细胞，以不同浓度加入各孔中，37℃温育4小时。使用Cyto Tox 96试剂盒(Promega，Madison WI)，用标准ELISA培养板读数仪(HTS 7000+BioAssay Reader，Perkin Elmer，San Jose，CA)通过记录490纳米吸收测定上清乳酸脱氢酶，由此计算特异性裂解百分比。根据常规标准确定HSV2抗原特异性裂解。数据表示为特异性裂解百分比＝100×[(试验值-效应细胞自发值-靶标自发值)/(靶标最大值-靶标自发值)]。

结果

图1所示存活曲线证实脂质体-肽保护小鼠抵抗致死剂量HSV2的***攻击的效果，并确定获得100％保护所需的接种数。图1显示保护BALB/c小鼠抵抗HSV2的致死攻击所需的脂质体HSV2gD(1-23)-TM疫苗剂数。7只小鼠组在致死剂量HSV2攻击之前给予2、3或4次免疫接种。4次免疫接种时，用脂质体疫苗免疫接种的动物没有显示与HSV2感染相关的神经学症状，在研究中也未观察到任何其它感染迹象。最重要的是，所有小鼠均在HSV2致死攻击后存活。2或3次每周接种，不到100％的小鼠得到保护。相形之下，4次接种安慰剂(即缓冲液)的小鼠不能在HSV2攻击时得到保护。

脂质体HSV2gD(1-23)-TM也在3组C57BL/6小鼠中试验，发现其引发与BALB/c小鼠中获得的结果相当的类似保护效应。表2总结了这些结果。第1组小鼠在1和4周皮下接种；第2组在第1周皮下接种，第4周直肠内接种；第3组(对照组)不接种。最后一次接种(第4周)后一周，小鼠用致死剂量的HSV2腹膜内攻击，监测发病率和死亡率3周。同BALB/c小鼠的结果一样，接受脂质体HSV2gD(1-23)-TM免疫接种组小鼠在皮下注射免疫接种或皮下初次免疫然后粘膜途径加强免疫时，也有相当数量存活。

表2 用脂质体HSV2gD(1-23)-TM进行各种免疫接种处理的C57BL/6

小鼠存活比较结果总结

组别免疫接种处理存活(n＝7)

1 第1周-皮下 6/7(86％)

第4周-皮下

2 第1周-皮下 5/7(71％)

第4周-直肠内

3 对照(未接种) 1/7(14％)

表2显示脂质体HSV2gD(1-23)-TM与其它抗原呈递方法的比较。每组7只小鼠在致死剂量HSV2攻击之前给予4次免疫接种。同样，用脂质体HSV2gD(1-23)-TM疫苗免疫接种4次100％保护小鼠抵抗致死剂量的HSV2。非脂质体HSV2gD(1-23)-TM或无HSV2gD(1-23)-TM的脂质体免疫接种4次不能提供明显的对致死HSV2攻击的保护。这清楚地证实，脂质体和工程改造的蛋白成分必需彼此联合才能获得有效的免疫应答。特别有意义的是，发现脂质体HSV2gD(1-23)-TM疫苗提供了较热灭活病毒免疫接种更好的保护，因为基于病毒的疫苗通常被认为提供了免疫应答的良好刺激(Desrosiers，1992，AIDS Res.Hum.Retrovir.8：1457)。

研究结束时，小鼠被处死，收集血清以鉴定此时免疫应答的性质。免疫接种小鼠的血清被发现含有高滴度(1∶100)特异性识别用来刺激免疫应答的肽的抗体，并且这些抗体引起活病毒的沉淀，表明该抗体识别病毒表面的表位。该抗体也沉淀HSV2gD(1-23)-TM脂质体，但不沉淀没有肽的脂质体，表明其特异性识别HSV2的gD表位。

下表3提供的免疫实验结果总结证实，每周一次皮下给予脂质体HSV2gD(1-23)-TM达4周产生较标准佐剂更强的免疫应答。用与不完全弗氏佐剂或矾混合的抗原免疫接种不能保护小鼠抵抗病毒攻击。中和抗体实验和迟发型超敏反应获得的数据类似于脂质体HSV2gD(1-23)-TM组中观察到的最高抗体滴度(B细胞应答)和最大爪垫肿胀(T细胞应答)的存活数据。与给予不完全弗氏佐剂和抗原的小鼠中的结果不同，脂质体HSV2gD(1-23)-TM处理的另一个重要优点是，在任何小鼠的注射部位都没有刺激或炎症(注射部位红肿，不完全弗氏佐剂17/17，脂质体HSV2gD(1-23)-TM 0/17)。当使用矾时，17/17小鼠在注射部位形成可触知的肉芽肿。相形之下，脂质体HSV2gD(1-23)-TM在任何小鼠中未引起肉芽肿形成。总之，这些结果显示，B和/或T细胞应答(通过中和抗体滴度和爪垫肿胀程度判断)有助于小鼠中HSV2脂质体HSV2gD(1-23)-TM引发的抵抗致死剂量HSV2的保护性免疫应答。

表3 比较接受脂质体HSV2gD(1-23)-TM、不完全弗氏佐剂与

HSV2gD(1-23)-TM混合物、矾与HSV2gD(1-23)-TM混合物和仅

注射PBS的对照组的免疫应答结果总结

疫苗处理组内存活小攻击日中和抗相对对照小鼠的爪

鼠数体滴度垫肿胀百分比

脂质体HSV2gD(1-23)-TM 5/7 1∶1638 8％

HSV2gD(1-23)-TM抗原与 0/7 1∶717 3％

不完全弗氏佐剂的混合物

矾与HSV2gD(1-23)-TM的 0/7 1∶1024 5％

混合物

磷酸缓冲盐水 0/7 1∶486 0％

实施例II-HSV2

HSV2gD(1-23)-HD的制备。编码HSV2gD(1-23)-HD的基因构建体使用编码连接于45个氨基酸的疏水区(HD)的gD表位的重叠寡核苷酸来制备。构建体通过基因编码区的依次延伸和扩增构建。基因然后连接于pTrcHis表达载体，通过序列分析确证。用1mM IPTG诱导起始小规模表达研究，使用以脂质体HSV2gD(1-23)-TM免疫接种的小鼠产生的抗体通过蛋白质印迹确证。蛋白也通过SDS-PAGE分析，通过考马斯兰染色发现了相应于预期分子量(约6kD)的条带。证实预期蛋白的小规模表达之后，进行含有pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD构建体的大肠杆菌的10升分批发酵，获得了约60克细胞沉淀。诱导后，HSV2gD(1-23)-HD的表达通过发酵时间过程的蛋白质印迹确证。来自约30克细胞沉淀的细菌在含1％脱氧胆酸和5mM咪唑的缓冲液中通过弗氏破碎器裂解。离心沉淀细胞碎片后，发现在水溶性上清中主要是HSV2gD(1-23)-HD。

将含可溶性HSV2gD(1-23)-HD蛋白的上清通过荷镍螯合Sepharose柱完成纯化。用含有5mM咪唑、200mM咪唑和5mM咪唑与1％脱氧胆酸的溶液依次洗柱。最后用200mM咪唑、1％脱氧胆酸溶液洗脱HSV2gD(1-23)-HD蛋白。峰值级分通过考马斯兰染色的SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定。含有HSV2gD(1-23)-HD的所有峰值级分合并，使用Millipore Ultraprep浓缩器浓缩。通过在考马斯染色SDS-PAGE凝胶上存在单一条带判断，最终浓缩物中含有纯HSV2gD(1-23)-HD。从第一次电泳中，获得了2-3毫克HSV2gD(1-23)-HD用于脂质体制剂配制和免疫接种研究。

脂质体制备和免疫接种程序、免疫应答诱导试验、HSV2小鼠脑炎模型、抗原诱导的T细胞增殖、细胞因子特异性mRNA分析、ELISA细胞因子测定和抗KSV2 CTL应答基本上如实施例I所述。

结果。图3显示的存活曲线证实了HSV2gD(1-23)-HD引发保护性免疫应答的能力。观察到的该制剂的存活百分比为40％。相形之下，缓冲液处理的对照动物无存活者，而HSV2gD(1-23)-TM对照组100％存活。

实施例III-HIV

在COS-1细胞中制备HIV(gp120-HD)和HIV(Δgp120-HD)。为进行构象表位研究，由含有gp160基因的pHXB2-env质粒(NIH AIDSResearch and Reagent Program，Rockville，MD)获得gp120序列，方法如下：通过PCR扩增该质粒DNA，亚克隆1536bp产物用于双脱氧核苷酸法测序。使用相当于HIVgp120基因的前21bp的5′(有义)引物ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT和相当于核苷酸1515到1536的3′(反义)引物TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC，消除HIV gp41蛋白，克隆gp120区段并通过PCR扩增。此外，每种引物的旁侧是方便的限制酶位点，以配合pcDNA4-His表达载体的多克隆位点。PCR产物连接到含有HD区作为基因盒质粒的pcDNA4-His(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)。缺失突变体通过PCR扩增制备，使用两个5′和3′引物对，它们排除了编码gp120蛋白中残基的核苷酸；突变体包括Δ136-151gp120、Δ128-194gp120和Δ123-203gp120。引物含有方便的限制酶序列允许两个基因产物的连接。因此每一突变由特异目标限制位点的两个氨基酸置换。最终的基因通过DNA测序证实，使用AutoCycle试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和试剂，结果在ALFExpress试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)测序装置上电泳，用AM软件v.3.02kit(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)分析。质粒使用DEAE-葡聚糖试剂转染进COS-1细胞(ATCC，Rockville，MD)。稳定的转染子使用Zeocin(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)选择，通过有限稀释法克隆。Gp120-HD蛋白通过结合至固体载体上的镍选择性亲和纯化。产生高水平蛋白的克隆通过蛋白质印迹分析或FACS分析评估。纯化完成后，HIV(gp120)-HD、HIVΔ136-151gp120、HIVΔ128-194gp120和HIVΔ123-203gp120的组氨酸接头通过肠激酶切割除去。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换或疏水相互作用色谱以进一步纯化HIVgp120-HD和HIVΔ120-HD蛋白。

HIV-HD的制备。合并3个表位(CTL、T辅助细胞和B细胞)的核苷酸序列选自不同HIV蛋白中发现的序列(KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFTTK(SEQID NO.19)，根据大肠杆菌密码子偏嗜由该蛋白序列衍生(Looman etal.，1987，EMBO J.6：2489)。合成的编码HIV序列的基因通过合成、杂交、PCR和重叠寡核苷酸的连接来组装。组装的编码HIV片段的全长基因通过PCR扩增，然后连接至表达质粒。最终基因通过DNA测序证实。

含HIV-HD的pTrcHis质粒转化进大肠杆菌。细菌在含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中37℃温育直至中对数期。此时，IPTG被加入以诱导trp/lac杂合启动子。每小时检查以确定HIV-HD蛋白诱导后的最佳表达。最佳表达时，细胞通过离心收获。细胞沉淀裂解并离心。分析裂解物中的蛋白。HIV-HD蛋白通过结合至固体载体上的镍选择性亲和纯化。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换或疏水相互作用色谱以进一步纯化HIV-HD。

免疫接种程序和对病毒抗原免疫应答诱导的测定。第1、4和8周，BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)用试验疫苗制备物或缓冲液皮下注射。监测注射部位的副反应，如形成肉芽肿和/或结痂。当动物用疫苗通过鼻内途径免疫接种时，用氟烷麻醉之，使用微量移液器的无菌吸头将组合物(10-20l)加到鼻孔内使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168：622)。

通过ELISA测定抗体应答。在免疫接种过程中，定期(如每周一次)测定小鼠对病毒抗原的免疫应答。含有抗原表位的脂质体也可用作已知的抗体/ELISA试验(Tuso et al.，1993，Transplantation 55：1375)的靶。后一试验的结果将用来测定结合水平和抗体的同种型构造。

迟发型超敏反应(DTH)试验。在免疫小鼠中对病毒抗原的迟发型超敏反应使用爪垫试验测定。免疫接种动物用氟烷麻醉，在一只后爪垫注射50l脂质体抗原或游离抗原，在另一只后爪垫注射50l缓冲液。24、48和72小时后，小鼠爪垫肿胀程度使用Vernier卡尺测定，并与基线水平比较。

细胞因子特异性mRNA分析。测定免疫和未免疫动物T细胞的主要细胞因子的细胞因子特异性mRNA水平，该水平可能反映了与免疫相关的致敏，包括IL-2、IFN-□、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。免疫后1和4周时如前所述由脾获得T细胞。总RNA使用Chomczynskyet al.，1987，Analyt.Biochem，162：156所述方法的改进方法(Cosenza etal.，1994，Liver Transpl.Surg.1：16)分离。新鲜或冰冻细胞(2×10⁶)在1毫升变性液(4mM异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠(pH7.0)、0.5％十二烷基肌氨酸钠和0.1mM 2-巯基乙醇)中裂解。用1倍体积的异丙醇在-20℃温育沉淀RNA。总RNA的浓度调整为260nM，样品储存在-80℃待用。

细胞因子分析使用Chomczynsky et al.，1987，Analyt.Biochem，162：156所述方法的改进方法(Cosenza et al.，1994，Liver Transpl.Surg.1：16)进行。单链cDNA通过在20l总反应体积中使用禽成髓细胞血症病毒逆转录酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)转录2g总RNA来制备。鼠细胞因子序列特异性寡核苷酸引物(表1)用来扩增每一目标细胞因子基因预定大小的DNA片段。PCR混合物由1l cDNA，2.5lPCR 10×缓冲液，1l 5′和3′引物，2.5l 10×dNTPs(2mmol/L)和0.125l水生栖热菌热稳定性DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)组成，总体积为25l。特异性□-肌动蛋白引物用来扩增548bp片段作为内部对照。PCR混合物用矿物油覆盖，94℃温育混合物7分钟后，扩增38个循环，条件为94℃变性30秒，60℃引物退火45秒，72℃延伸60秒，再72℃温育7分钟。在溴化乙锭存在下在琼脂糖凝胶上分离PCR产物。UV光下显示条带，照相，使用Molecular Analyst软件包(Bio-Rad，Richmond CA)由相片进行光密度定量。

通过ELISA进行的脾T细胞细胞因子测定。这些动物的T细胞活性也通过在用病毒抗原温育脾T细胞时的细胞因子产生来测定。从免疫接种动物取出脾，用无菌活塞温和地打碎脾并挤压细胞通过尼龙筛网来制备脾匀浆。洗涤细胞悬液，在96孔微量板上以1×10⁵细胞/孔铺板。细胞在37℃用不等量的病毒抗原温育3到4天后，收获各孔上清，测定细胞因子的存在。商用细胞因子ELISA试剂盒用来确定细胞因子谱。组织培养物上清中的细胞因子蛋白通过夹心ELISA测定，使用特定细胞因子特异性的单克隆抗体(mAb)。简而言之，ELISA板用大鼠抗小鼠细胞因子单克隆抗体包被过夜。用PBS中的3％胎牛血清封闭培养板2小时，然后等分量的每一测试样品加入每一孔中。向每一孔中加入细胞因子特异性的生物素化大鼠抗小鼠单克隆抗体，然后是抗生物素蛋白过氧化物酶。通过加入比色底物得到有色反应。在ELISA分光光度计上读取培养板，根据对照重组细胞因子获得的标准曲线计算细胞因子浓度。所有细胞因子ELISA试剂盒(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12，IFN-□和TNF-α)购自PharMingen，Inc.(SanDiego，CA)。

抗原诱导的T细胞增殖。宿主对HIV抗原的致敏通过抗原诱导的T细胞增殖试验测定。脾匀浆物的分离如前所述。细胞悬浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mM Hepes缓冲液、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(25IU/ml)、链霉素(25g/ml)和庆大霉素(80g/ml)的RPMI1640培养基中。在96孔U形底培养板中，5％二氧化碳下，细胞在存在或不存在HIV-HD肽(5g/ml)时于1×10⁶细胞/ml浓度培养。培养物用20μl刃天青染料脉冲处理3小时，然后在Cytofluor II(PerspectiveBiosystems，Inc.，Farmington，MA)上测定荧光。

抗HIV CTL应答。免疫接种后，评估脾T细胞中的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的存在。如前所述获得脾淋巴细胞。来自各处理组的淋巴细胞合并(n＝5)，然后在12孔培养板中以10⁷细胞/孔在抗原不存在时培养3天。L5198Y淋巴瘤(H2⁺)靶细胞(ATTC)与相应于H2⁺限制细胞的HIV CTL表位的肽温育(Hanke et al.，1991，J.Virol.65：1177)，37℃下温育4小时。洗涤靶标，向各孔中加入含1×10⁴细胞的100μl滴定液。洗涤效应淋巴细胞，以不同浓度加入各孔中，37℃温育4小时。使用Cyto Tox 96试剂盒(Promega，Madison WI)，用标准ELISA培养板读数仪(HTS 7000+BioAssay Reader，PerkinElmer，San Jose，CA)通过记录490纳米吸收测定上清乳酸脱氢酶，由此计算特异性裂解百分比。根据常规标准确定HSV2抗原特异性裂解。数据表示为特异性裂解百分比＝100×[(试验值-效应细胞自发值-靶标自发值)/(靶标最大值-靶标自发值)]。

实施例IV-流感病毒(INFV)

INFV-HD的制备。选定表位的核苷酸序列根据大肠杆菌密码子偏嗜由该蛋白序列衍生(Looman et al.，1987，EMBO J.6：2489)。***基因盒的抗原序列相当于NP(147-161，TYQRTRALVRTGMDP；55-69(SEQ ID NO.20)，RLIQNSLTIERMVLS(SEQ ID NO.21))和HA(91-108，SKAFSNCYPYDVPDYASL(SEQ ID NO.22))。组合表位疫苗可以构建成由T-B表位组成，如Brumeanu et al.，1997等报导(HA 110-120/HA 150-159，SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP(SEQID NO.23))(Brumeanu et al.，1997，J.Virol.71：5473)。一旦获得了合适的序列，编码INFV-HD的合成基因通过合成、杂交、PCR和重叠寡核苷酸的连接来组装。组装的编码INFV片段的全长基因通过PCR扩增，然后连接至表达质粒。最终基因通过DNA测序证实。

含INFV-HD的质粒转化进大肠杆菌。细菌在含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中37℃温育直至中对数期。此时，IPTG被加入以诱导trp/lac杂合启动子。每小时检查以确定INFV-HD蛋白诱导后的最佳表达。最佳表达时，细胞通过离心收获。细胞沉淀裂解并离心。分析裂解物中的蛋白。HIV-HD蛋白通过结合至固体载体上的镍选择性亲和纯化。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换或疏水相互作用色谱以进一步纯化INFV-HD。

病毒感染模型。用来证实疫苗功效的INFV毒株是称为PR8的重配A/PR/8/34病毒。病毒通过卵黄囊接种在10到12日龄含胚鸡卵上培养，然后在摇床上37℃温育40-48小时，4℃温育20-24小时，然后由卵黄囊液回收病毒。在96孔微量板上用0.5％鸡红细胞进行病毒血凝试验，以确定每毫升病毒原种血凝单位数(HAU)。

在BALB/c小鼠模型中，用微量移液器的无菌吸头鼻内给予metofane麻醉小鼠(20l)的1200 HAU PR8毒株4天后产生了明显的感染症状，包括运动性降低、不梳理皮毛(grooming)、体重减少20％，并且2周内死亡。以50％终点在96孔微量板上进行的MDCK细胞裂解试验，发现感染后4天制备的肺匀浆物中存在高滴度感染性病毒。

免疫接种程序和对病毒抗原免疫应答诱导的测定。第1、4和8周，BALB/c雌性小鼠(6-8周龄)用试验疫苗制备物或缓冲液皮下注射。监测注射部位的副反应，如形成肉芽肿和/或结痂。当动物用疫苗通过鼻内途径免疫接种时，用metofane麻醉之，使用微量移液器的无菌吸头将试验材料(10-20l)加到鼻孔内使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168：622)。

肺组织中INFV RNA的RT-PCR检测。病毒攻击后4天，在试验动物的肺上进行INFV RNA的RT-PCR检测，以确定免疫接种防止病毒感染的效果。取自小鼠的肺样品骤冻、碾碎，冰冻粉末储存在-70℃待用。使用已知技术的改进法(Chomczynsky et al.，1976，Analyt.Biochem.162：156；Shirwan et al.，1993，J.Immunol.151：5228；Lakemanand Whitley，1995，J.Inf.Dis.171：857)进行总RNA分离和病毒RNA的RT-PCR分析。使用的引物是流感病毒A基体基因(区段7)特异性的(Atmar et al.，1996，J.Clin.Microbiol.34：2604)。RT-PCR分析使用Titan One Tube RT-PCR***(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)试剂和方法进行。简而言之，1pg到1g总RNA模板在0.2mMdNTP、0.4M反义引物FAM1(5′-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3′(SEQ ID NO.24))、0.4M有义引物FAM2(5′-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3′(SEQ ID NO.25))、5mM DTT、5U Rnase抑制物、1.5mM氯化镁和AMV/Expand高保真酶存在下温育，条件是：1个循环60℃ 30分钟；94℃ 2分钟；10个循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒；25个循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃45秒，每一循环增加延伸5秒；然后是1个循环68℃ 7分钟。溴化乙锭染色的1.5％NuSieve琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，ME)中的212bp可见条带表示阳性结果，用UV照射仪(BioRad Gel Doc1000)照相。该方法对测定病毒DNA的存在是敏感的和高特异性的(Lakeman and Whitley，1995，J.Inf.Dis.171：857)。

HA1区的测序。通过在PR-PCR反应中由病毒RNA扩增HA1区，然后亚克隆1100bp产物供测序用，使用双脱氧核苷酸终止法测序，来获得HA1区(区段4)序列。基本如上所述使用Tian One TubeRT-PCR***进行RT-PCR分析，不同之处在于：扩增引物是cDNA引物(5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC(SEQ ID NO.26))和PCR引物(5′-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3′(SEQ IDNO.27))(Pyhala et al.，1995 J.Gen.Virol.76：205)，条件是：1个循环60℃ 30分钟；94℃ 2分钟；10个循环94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃45秒；25个循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒，每一循环增加延伸5秒；然后是1个循环68℃ 7分钟。1100bp产物亚克隆进TAPCR2.1克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)供测序用。测序使用AutoCycle试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和试剂进行，结果在ALFExpress试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)测序装置上电泳，用AM软件v.3.02kit(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分析。

通过ELISA测定抗体应答。在免疫接种过程中，定期测定小鼠对病毒抗原的免疫应答。含有抗原表位的脂质体也可用作已知的抗体/ELISA试验(Tuso et al.，1993，Transplantation55：1375)的靶。后一试验的结果将用来测定结合水平和抗体的同种型构造。

抗原诱导的T细胞增殖。宿主对INFV抗原的致敏通过抗原诱导的T细胞增殖试验测定。用无菌活塞温和地打碎脾并挤压细胞通过尼龙筛网来制备脾匀浆。细胞悬浮在含有10％胎牛血清(FCS)、10mMHepes缓冲液、L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(25IU/ml)、链霉素(25g/ml)和庆大霉素(80g/ml)的RPMI 1640培养基中。在96孔U形底培养板中，5％二氧化碳下，细胞在存在或不存在相当于抗原的化学合成肽(5g/ml)时于1×10⁶细胞/ml浓度培养。培养物用20l刃天青染料脉冲处理3小时，然后在Cytofluor II(Perspective Biosystems，Inc.，Farmington，MA)上测定荧光。

抗INFV CTL应答。免疫接种后，评估脾T细胞中的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的存在。如前所述获得脾淋巴细胞。来自各处理组的淋巴细胞合并(n＝5)，然后在12孔培养板中以10⁷细胞/孔在抗原不存在时培养3天。P815肥大细胞瘤(H2⁺)靶细胞(ATTC)与相应于H2⁺限制细胞的INFV NP CTL表位(氨基酸147-158)的肽温育，37℃下温育4小时。洗涤靶标，向各孔中加入含1×10⁴细胞的100μl滴定液。洗涤效应淋巴细胞，以不同浓度加入各孔中，37℃温育4小时。使用Cyto Tox 96试剂盒(Promega，Madison WI)，用标准ELISA培养板读数仪(HTS 7000+BioAssay Reader，Perkin Elmer，SanJose，CA)通过记录490纳米吸收测定上清乳酸脱氢酶，由此计算特异性裂解百分比。根据常规标准确定INFV抗原特异性裂解。数据表示为特异性裂解百分比＝100×[(试验值-效应细胞自发值-靶标自发值)/(靶标最大值-靶标自发值)]。

实施例V-未分型流感嗜血杆菌(NTHi)和b型流感嗜血杆菌(Hib)

NIHi蛋白的克隆。编码P6全长基因的序列通过P6 mRNA的RT-PCR扩增获自NTHi菌株(Deich et al.，1988，J.Bacteriol.170：489；Nelson et al.，1988，Inf.Immun.56：128；Looman et al.，1987，EMBO J.6：2489)。扩增使用Titan One Tube RT-PCR***(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)试剂和方法进行。简而言之，细菌与0.2mM dNTP、0.4M反义引物H-InvfP6AS(5′-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC-3′(SEQ ID NO.28))、0.4M有义引物H-InvfP6S(5′-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA-3′(SEQ IDNO.29))、5mM DTT、5U Rnase抑制物、1.5mM氯化镁和AMV/Expand高保真酶一起温育，条件是：1个循环60℃ 30分钟；94℃ 2分钟；10个循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒；25个循环94℃ 30秒，55℃ 30秒，68℃ 45秒，每一循环增加延伸5秒；然后是1个循环68℃7分钟。溴化乙锭染色的1.0％NuSieve琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，ME)中的867bp可见条带表示阳性结果，用数字成象***(BioRad Gel Doc 1000)照相。PCR产物使用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂和方法亚克隆至TA 2.1载体。小规模质粒制备使用标准碱裂解法(Maniatis，1989 Molecular Cloning：Alaboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook，Fritsch，Maniatis，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY，p.125)进行。***的PCR产物的测序使用AutoCycle试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)的方法和试剂通过常规双脱氧终止法进行，结果在ALFExpressII试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)测序装置上电泳，用AlfWin序列分析软件v.2.0(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)分析。

NTHi(P6)-HD的制备。一旦获得了编码P6的基因，编码NTHi(P6)-HD的合成基因通过合成、杂交、PCR和重叠寡核苷酸的连接来组装。HD区段通过由甘氨酸和丝氨酸组成的接头加入蛋白的N或C末端。这使得我们可以测试HD相对抗原的位置对免疫***加工的影响。组装的编码NTHi(P6)-HD片段的全长基因通过PCR扩增，然后连接至表达质粒。最终基因通过DNA测序证实。

含NTHi(P6)-HD的质粒转化进大肠杆菌。细菌在含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中37℃温育直至中对数期。此时，IPTG被加入以诱导trp/lac杂合启动子。每小时检查以确定NTHI(P6)-HD蛋白诱导后的最佳表达。最佳表达时，细胞通过离心收获。细胞沉淀裂解并离心。分析裂解物和细胞沉淀中的蛋白。1-2％的脱氧胆酸钠溶液用来从裂解的细胞沉淀中提取NTHi(P6)-HD蛋白。NTHi(P6)-HD蛋白通过结合至固体载体上的镍选择性亲和纯化。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换或疏水相互作用色谱以进一步纯化NTHi(P6)-HD。

脂质体制备。通常有三种方法可以制备稳定的NTHi(P6)-HD脂质体。第一种方法是，将蛋白和脂一起溶解在有机溶剂中(氯仿/甲醇)，然后干燥成一薄膜，从而制成脂质体。在重悬于含水缓冲液时，脂和蛋白组装形成大的双层结构。悬液然后超声处理制备单层小泡(SUV)。对较小的蛋白，该方法效果较好。但是，在这些试验中，蛋白暴露于严酷的溶剂条件不太好，因为可能使蛋白变性。因此，为了避免不必要的构象改变，可以使用第二种方法，该方法包括在水化脂膜前，在重悬缓冲液中溶解NTHi(P6)-HD。在对脂进行水化时，蛋白自发与新形成的膜结合，在超声处理时整合进SUV脂双层。第三种方法包括在无NTHi(P6)-HD蛋白时制备脂质体，然后加入已形成的SUV，使HD结合进脂双层。脂质体通过探头超声处理按照已知方法(Fujii et al.，1997，Biochemistry 36：4959)制备。简而言之，脂类(有或没有蛋白)溶解在氯仿/甲醇等有机溶剂中。薄的脂膜通过以下方法形成：移取等分量的脂溶液进入宽底玻璃试管，65℃在氮气流下蒸发溶剂。膜置于真空下至少8小时除去残留有机溶剂。或者，所需组合物的脂粉末通过喷雾干燥等技术制备，然后用来代替脂膜。用缓冲液水化脂膜或粉末，在65℃温育悬液5-10分钟，再用探头超声处理，从而完成脂质体制备。脂质体然后通过0.22m的滤器使制备物除菌。脂质体通过动态光散射筛分，然后是至少4周的聚集体形成。可能NTHi(P6)-HD蛋白的构象需要保持。因此，在这三种可以用来制备脂质体的方法中，我们预期优选的是加入蛋白作为水化溶液的一种成分或在脂质体形成之后加入至脂质体的方法。

细菌菌株。NTHi菌株9333(脊髓液分离物)、35056(上呼吸道感染分离物)、43095(中耳炎分离物)、48766(肺脓肿分离物，抗微生物易感性试验参考菌株)(ATCC)和Hib菌株51654(ATCC)用来在细菌感染模型中证明效果。使用之前，有机体的冰冻原种在补加有NAD(2g/ml)和血红素(10g/ml)的新鲜脑心浸出液中传代培养，37℃ 10％二氧化碳下温育24小时。每种有机体的标准曲线由菌落形成单位对480纳米浊度组成，其用来调整细菌试验或腹膜内攻击剂量所需的细菌接种物。

免疫接种程序和对细菌抗原免疫应答诱导的测定。出生后第5、12、19和26天或第5和26天用疫苗制备物或缓冲液免疫各组幼鼠(每组n＝6)。大鼠的***免疫接种通过皮下注射脂质体疫苗完成。动物用疫苗通过鼻内途径免疫接种时，用metofane使之麻醉，使用微量移液器的无菌吸头将组合物(20l)加到鼻孔内使之吸入(Gallichan et al.，1993，J.Inf.Dis.168：622)。幼鼠与雌性亲鼠一起圈养，监测对免疫接种程序的副反应，如接种部位形成肉芽肿、红肿或瘙痒。最后一次免疫接种后一周，幼鼠用氟烷麻醉，通过心脏穿刺收集血液，用盐水灌洗粘膜通道收集粘膜分泌物。动物用二氧化碳行安乐死。血清和粘膜液的细菌抗体滴度如下所述测定。

进行腹膜内攻击研究时，幼鼠(26日龄)用细菌攻击，监测血液和CSF的细菌负荷并与未接种动物比较。攻击后2天对血液和CSF样品的细菌分析显示，在动物中有明显的细菌负荷(即血液1×10⁴CFU/ml；1×10⁴ CFU/ml CSF)。含有高滴度细菌抗体的接种的26日龄大鼠血清静脉给予6日龄大鼠。次日，幼鼠如下所述(n＝10)接受NTHi的腹膜内给药。然后监测幼鼠发病率和死亡率，存活者26日后无痛处死，收集血液和CSF，并进行培养证实NTHi的存在。

NTHi的腹膜内攻击。24小时体内传代NTHi培养物调整为5×10⁷到5×10⁹ CFU/ml，100μl该培养物腹膜内注射进5日龄大鼠(Smith etal.，1973，Inf.Immun.8：278)。接种后攻击幼鼠仍与雌性亲鼠一起圈养。攻击后18到96小时内，使用该剂量传代细菌的大鼠至少90％死亡。

通过ELISA测定抗原特异性抗体应答。检测来自各大鼠的血清和粘膜样品的P6抗原特异性IgA抗体。克隆的天然P6或NTHi(P6)-HD蛋白加入适当处理的96孔板，室温温育过夜。培养板在pH9.6的碳酸氢钠缓冲液中用1％牛血清白蛋白37℃封闭30分钟。培养板用0.05％Tween 20/PBS洗涤。每种血清和粘膜样品的稀释液加入至抗原包被的培养板，37℃温育2小时，温育结束后用Tween/PBS缓冲液洗涤。特异性针对大鼠IgG或IgA并偶联有碱性磷酸酶的单克隆抗体被加入至孔中，37℃ 1小时。然后用Tween/PBS缓冲液洗涤各孔，在pH9.5的二乙醇胺缓冲液中的PNPP底物加入孔中以起始有色反应。反应用0.75N氢氧化钠终止，在Spectramax ELISA读板仪上读出405纳米吸收。大鼠IgG和IgA浓度根据标准曲线计算，标准曲线是用包被在96孔板上并同上处理的已知浓度的大鼠IgG或IgA对照样品获得的。

细菌抗体测定。待测定细菌抗体的血清样品56℃温育30分钟以灭活补体。待测血清在磷酸缓冲盐水(PBS)中系列稀释。24小时细菌培养物用无菌PCM缓冲液调整为5×10⁴ CFU/ml，缓冲液组成为含牛血清白蛋白(BSA)及0.15mM CaCl₂和1mM MgCl₂的PBS。来自未接种幼鼠的血清用作补体来源。合并该血清，等分并储存于-70℃待用。细菌(20l)、系列稀释的血清(20l)、补体(20l)和40l PCM缓冲液中的1％BSA加入到96孔板的各孔中。为了确定起始细菌浓度，10l样品混合物的等分试样在0时涂布于含加富琼脂和NAD及血红素的新鲜BHI琼脂平板上。37℃ 10％二氧化碳下振荡温育反应混合物1小时，从各孔中取出10l重复铺板，37℃在10％二氧化碳下温育过夜，以确定CFU/孔。对照包括一个无血清的孔，以确保补体本身不会杀死细菌，一个有试验血清但无补体的孔，以确保试样中的血清补体已被灭活。所有试验以三个重复进行，杀死50％细菌的稀释度用来比较不同血清的活性。

实施例VI-丙肝病毒

HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD在CHO细胞中的制备。HCV E2/NS1蛋白的核苷酸序列由如下所述获得的HCV菌株的PCR扩增。使用相当于E2/NS1基因的头21bp的5′引物CAAACCATGATCGCCCACGGA和相当于残基622到628的3′引物GAAGTTGACAGTACAGGGTA，除去跨膜区(Cocquerel，L.et al.，1998，J.Virol.72(3)：2183-91)。此外，每种引物的旁侧是方便的限制位点。PCR产物被连接至含HD区作为基因盒质粒的pcDNA3.1His(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)。通过缺失相当于从384到410的头27个氨基酸的E2/NS1基因的HVR1构建HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD。使用5′引物CAACTCATCAACACCAATGGC和野生型对照所用的相同3′引物通过PCR扩增制备缺失突变体。最终基因通过DNA测序证实。质粒使用脂感染试剂(脂感染胺，Gibco/BRL Gaithersbrug，MD)按照厂商推荐的方法转染进CHO细胞(Deen，K.C.et al.，1988，Nature 331：82)(ATCC，Rockville，MD)。使用G418选择稳定的转染子(Gibco/BRL，Gaithersbrug，MD)，通过有限稀释法克隆。产生高水平蛋白的克隆通过蛋白质印迹分析评估。HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD蛋白通过结合于固体载体上的镍选择性亲和纯化。纯化完成后组氨酸接头通过肠激酶切割除去。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换和/或疏水相互作用色谱以进一步纯化HCV(E2/NS1)-HD和HCV(E2/NS1ΔHVR1)-HD蛋白。

在大肠杆菌中制备HCV(HVR1)-HD和HCV(C)-HD蛋白。选定表位的核苷酸序列根据大肠杆菌密码子偏嗜衍生自蛋白序列(Looman etal.，1987，EMBO J.6：2489)。待***基因盒的抗原序列相应于NP( 147 -161，TYQRTRALVRTGMDP；55-69，RLIQNSLTIERMVLS)和 (91-108，SKAFSNCYPYDVPDYASL)表位。一旦获得了合适的序列，编码HCV-HD的合成基因(其旁侧是方便的限制酶位点)通过合成、杂交、PCR和重叠寡核苷酸的连接来组装。简而言之，通过加热到65℃并在其回复至室温时使寡核苷酸退火来完成片段的组装。在冰上温育2分钟，片段用DNA连接酶连接。组装的编码HCV片段的全长基因通过PCR扩增，限制酶切割，然后通过凝胶电泳分离。HCV基因然后连接至类似切割过的含HD基因的表达质粒(如pTrcHis或pQE30)。最终基因通过DNA测序证实。

含HIV-HD的质粒转化进大肠杆菌。细菌在含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中37℃温育直至中对数期。此时，IPTG被加入以诱导trp/lac杂合启动子。每小时检查以确定HCV-HD蛋白诱导后的最佳表达。最佳表达时，细胞通过离心收获。细胞沉淀裂解并离心。分析裂解物中的蛋白。HCV-HD蛋白通过结合至固体载体上的镍选择性亲和纯化。纯化完成后，组氨酸接头通过肠激酶切割除去。如果必要的话，进行大小排阻、离子交换或疏水相互作用色谱以进一步纯化HCV-HD。

脂质体制备和免疫接种程序、免疫应答诱导试验、ELISA抗体应答测定、DTH试验、细胞因子特异性mRNA分析、ELISA细胞因子测定、抗原诱导的T细胞增殖和抗HIV CTL应答基本上如实施例III所述。

Claims

1.一种免疫原性脂质体组合物，包括：

形成小泡的脂类；和

含有一个或多个抗原决定簇和一个疏水区的抗原构建体，其中疏水区与所述脂质体组合物的膜结合。

2.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，还包括一种或多种佐剂。

3.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体是化学合成的。

4.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，其中疏水区是肽。

5.权利要求4的免疫原性脂质体组合物，其中疏水区由约15到约500个氨基酸残基组成。

6.权利要求5的免疫原性脂质体组合物，其中疏水区包括一个或多个选自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的氨基酸。

7.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，其中抗原决定簇来源于选自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血杆菌P6的抗原。

8.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体还包括连接抗原决定簇和疏水区的接头区。

9.权利要求8的免疫原性脂质体组合物，其中接头区是肽。

10.权利要求9的免疫原性脂质体组合物，其中接头区由1到约200个氨基酸残基组成。

11.权利要求10的免疫原性脂质体组合物，其中氨基酸残基选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。

12.权利要求1的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体是融合蛋白。

13.权利要求9的免疫原性脂质体组合物，其中抗原构建体是融合蛋白。

14.在宿主动物中诱导免疫应答的方法，包括给予免疫有效量的权利要求1的组合物。

15.在宿主动物中诱导免疫应答的方法，包括给予免疫有效量的权利要求2的组合物。

16.权利要求14的方法，其中宿主动物是哺乳动物。

17.权利要求16的方法，其中哺乳动物是人。

18.权利要求14的方法，其中动物是禽。

19.权利要求17的方法，其中抗原决定簇选自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血杆菌P6。

20.含有有效量的权利要求1组合物和可药用载体的疫苗组合物。

21.权利要求20的疫苗组合物，还包括一种或多种佐剂。

22.待***表达载体的DNA盒，包括编码免疫原性融合蛋白的序列，所述蛋白包括：

疏水蛋白区，和一个或多个抗原决定簇。

23.权利要求22的DNA盒，其中抗原决定簇来源于选自HSV gB或gD，HIV gp120，CMV gB，HCV E2，INFV HA或NA和流感嗜血杆菌P6的抗原。

24.权利要求22的DNA盒，其中疏水区是由约15到约500个氨基酸残基组成的肽。

25.权利要求24的DNA盒，其中肽包括一个或多个选自Ala，Asn，Cys，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的氨基酸。

26.权利要求22的DNA盒，其中融合蛋白还包括连接抗原决定簇和疏水区的接头区。

27.权利要求26的DNA盒，其中接头区由1到约200个氨基酸残基组成。

28.权利要求27的DNA盒，其中氨基酸残基选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。

29.含有权利要求22的DNA盒的载体。

30.制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：

表达一种编码融合蛋白的基因，所述融合蛋白含有抗原决定簇和疏水区；

在一种合适的有机溶剂中溶解形成小泡的脂类和融合蛋白；

通过蒸发有机溶剂形成脂膜或喷雾干燥粉末；

水化脂膜或粉末；并

分散水化的脂膜或粉末形成免疫原性脂质体组合物。

31.制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：

在含水缓冲液中溶解融合蛋白；用含有融合蛋白的缓冲液水化脂粉末或脂膜；并

分散脂粉末或膜形成免疫原性脂质体组合物。

32.制备免疫原性脂质体组合物的方法，包括：

在含水缓冲液中溶解融合蛋白；并

将融合蛋白加入至预先形成的脂质体中形成免疫原性脂质体组合物。

33.一种含有抗原构建体和可药用载体的免疫原性组合物，所述抗原构建体包括一个或多个抗原决定簇和一个疏水区。

34.权利要求33的免疫原性组合物，其中抗原构建体还包括连接抗原决定簇和疏水区的的接头区。

35.权利要求33的免疫原性组合物，还包括一种或多种佐剂。

36.一种免疫原性乳剂组合物，包括

形成小泡的脂类；和

包括一个或多个抗原决定簇和一个疏水区的抗原构建体。

37.权利要求36的组合物，其中抗原构建体是融合蛋白。