NO330520B1 - Reagenspreparat til isolering av nukleinsyrer fra en prove, samt anvendelse av dette for isolering av nukleinsyrer - Google Patents

Abstract

En fremgangsmåte for å utføre en enzymatisk reaksjon på nukleinsyrer blir tilveiebrakt, der nukleinsyrene fra en prøve som inneholder nukleinsyrene i en væske blir isolert ved adsorpsjon i en nativ form til magnetiske partikler med en glassoverflate og deretter benyttet som et substrat i en enzymatisk reaksjon. Et Reagenspreparat til isolering av nukleinsyrer fra en prøve blir også tilveiebrakt.

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter et reagenspreparat til isolering av nukleinsyrer fra en prøve, samt anvendelse av dette for isolering av nukleinsyrer.

Mange biologiske materialer, spesielt nukleinsyrer, stiller høye krav med hensyn til deres isolering fra det naturlige miljø. For det første foreligger de ofte i meget lave konsentrasjoner, og for det andre befinner de seg ofte i naboskap med andre faste og oppløste stoffer som har innflyt-else på deres isolering, hhv. bestemmelse.

I den senere tid har det derfor ikke manglet forslag på forsøk, fremgangsmåter og materialer for isolering av nukleinsyrer fra deres naturlige miljø. Proe. Nati. Acad. USA 76, 615-619 (1979) beskriver bindingen av nukleinsyrer i nærvær av natriumjodid, til oppmalt flintglass.

I Anal Biochem. 121, 382-287 (1982) beskrives rensing av plasmid-DNA fra bakterier på glasstøv i nærvær av natriumperklorat.

I DE-A 37 34 442 beskrives isolering av enkelttrådet M13 fag-DNA på glassfiberfiltere ved utfelling av fagpartiklene ved hjelp av eddiksyre og lyse av fagpartiklene med perklorat. Nukleinsyrene bundet til glassfiberfilteret elueres etter vask med en metanolholdig buffer i tris/EDTA-buffer.

I Anal. Biochem. 175, 196-201 (1988) beskrives en lignende fremgangsmåte for rensing av DNA fra lambda-fag.

De hittil nevnte fremgangsmåter i kjent teknikk har som fellestrekk den selektive binding av nukleinsyrer til glassoverflater i chaotropiske saltløsninger, hvorved nukleinsyrene separeres fra forurensninger som agarose, proteiner eller cellenedbrytningsprodukter. For separering av glasspar-tiklene fra forurensningene anvendes ifølge kjent teknikk enten sentrifugering av partikler eller sugefiltrering av væsker gjennom glassfiberfiltere. Ved dette handler det imidlertid om et begrensende trinn som sterkt hindrer bearbeidelse av store probeantall.

I Anal. Biochem. 201, 166-169 (1992), hhv. PCT GB91/00212 beskrives anvendelse av magnetpartikler for immobilisering av nukleinsyrer etter utfelling ved tilsetning av salt og etanol. Her foregår en agglutinering av nuklein syrene under inkludering av magnetpartiklene. Agglutinatet skilles fra det opprinnelige løsningsmiddel ved anleggelse av et magnetfelt, etterfulgt av vask. Etter ett vasketrinn oppløses nukleinsyrene i en tris-buffer. Denne fremgangsmåte har imidlertid den ulempe at utfellingen ikke er selektiv for nukleinsyrer, slik at et stort antall faste og oppløste stoffer agglutineres sammen med nukleinsyrene. Ved denne fremgangsmåte er det således ikke mulig å fjerne eventuelle til-stedeværende inhibitorer for bestemte enzymatiske reaksjoner i tilstrekkelig grad.

I US-A-4 233 169 er det beskrevet et porøst glass som inneholder innleirede magnetpartikler.

På markedet finnes også såkalt magnetisk, porøst glass som inneholder små magnetpartikler i en porøs, partikulær glassmatriks, og hvor overflaten er overtrukket med et streptavidinholdig sjikt. Dette produkt kan-anvendes for isolering av biologiske materialer, f.eks. proteiner eller nukleinsyrer, når det modifiseres i et passende preparerings-trinn på en slik måte at det blir bundet kovalent til biotin.

Målet for foreliggende oppfinnelse var å tilveie-bringe bedre materialer for immobilisering av biologiske materialer, og en enkel og egnet fremgangsmåte for rutine-diagnostikk for isolering av biologiske materialer, spesielt nukleinsyrer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter et reagenspreparat til isolering av nukleinsyrer fra en prøve, kjennetegnet ved at det omfatter: (a) magnetiske partikler med en ytre glassoverflate som er vesentlig porefri eller har porer med en diameter mindre enn 10 mm, der glasset inneholder boroksid,

(b) kaotropisk saltløsning til lysering av prøver,

(c) eventuelt en vaskeløsning og

(d) eventuelt en elueringsbuffer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et reagenspreparat ifølge oppfinnelsen for å isolere nukleinsyrer i en nativ form fra en prøve.

Foreliggende oppfinnelse angår magnetiske partikler med en ytre glassoverflate som i det alt vesentlige er pore fri, eller som oppviser porer med en diameter mindre enn 10 mm. Oppfinnelsen angår videre ferromagnetiske partikler med en glassoverflate, fremgangsmåter for isolering av biologiske materialer, spesielt nukleinsyrer, så vel som fremgangsmåter for fremstilling av magnetiske glasspartikler.

En fagperson betegner partikler som faste materialer med liten diameter. Slike partikler betegnes også ofte som pigmenter. Ved foreliggende oppfinnelse er slike partikler spesielt egnede som har en gjennomsnittlig kornstørrelse mindre enn 100 um. Spesielt foretrukket er en gjennomsnittlig kornstørrelse på mellom 10 og 60 um. Kornstørrelsesfordelingen er fortrinnsvis forholdsvis homogen, spesielt foreligger nesten ingen partikler < 10 um eller > 60 um.

Som magnetiske betegnes materialer som kan tiltrekkes av en magnet, dvs. f.eks. ferromagnetiske eller superparamagnetiske materialer. Som magnetiske skal det også forstås materialer som betegnes som svakt magnetiske materialer, f.eks. ferritt. Spesielt foretrukket ved foreliggende oppfinnelse er ferromagnetiske materialer, spesielt når de ikke er forhåndsmagnetisert. Under forhåndsmagnetisering skal det i denne sammenheng forstås at materialene bringes i kontakt med en magnet, hvorved remanensen forhøyes. Spesielt foretrukket er ferromagnetiske materialer, slik som f.eks. magnetitt (Fe304) eller Fe203.

Ved en ytre overflate av en partikkel skal det forstås en sammenhengende overflate, fra hvilken det kan dannes perpendikulærer i retning mot omgivelsene som ikke skjærer selve partikkelen én gang til.

Ved en pore forstås en fordypning i den ytre partikkeloverflate som når så langt inn i partikkelen at en tenkt dannet perpendikulær i fordypningen på overflaten i retning av den nærmeste partikkelomgivelse skjærer partikkelen minst én gang. Porer strekker seg dessuten dypere inn i partikkelen enn én poreradius.

Ved et glass skal det ved foreliggende oppfinnelse forstås et silisiumholdig amorft materiale. Glasset kan inneholde ytterligere materialer, f.eks.

I et mindre omfang på 0-5 % kan også mange andre oksider, slik som f. eks. Mn203, Ti02, AS2O3, Fe203, CuO, CoO osv., inneholdes. Overflater med en sammensetning av borsilikatglass, flintglass eller kisel har vist seg som spesielt effektive. Med hensyn til utbytte av nukleinsyrer har spesielt foretrukne borsilikatglass et boroksidinnhold på mer enn 25 %; som spesielt verdifullt anses et glass med sammensetningen Si02/B20370/30. Spesielt foretrukket ved foreliggende oppfinnelse er glass som dannes ved den såkalte gel-sol-prosess med etterfølgende tørking og sammenpressing av det dannede sjikt. Denne prosess er kjent i hovedtrekk og er f.eks. beskrevet i C. J. Brinker, G. W. Scherer "Sol Gel science - The physics and chemistry of Sol Gel Processing". Academic Press Inc. 1990 og Sol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, s. 450 ff., samt i DE-A-1941191, DE-A-3719339, DE-A-4117041 og DE-A-4217432. Den er riktignok ikke hittil beskrevet for magnetiske partikler. At det ved denne prosess kunne fremstilles magnetiske partikler som ved isolering av biologiske materialer, spesielt nukleinsyrer, har ganske overraskende egenskaper, kunne ikke forventes. I gel-sol-prosessen blir alkoksider av nettverksdannende komponenter, f.eks. Si02, B203, A1203, Ti02, Zr02, Ge02, sammen med oksider og salter av andre komponenter, f.eks. i alkoholisk løsning, anvendt og hydrolysert. I ligningen er fremstillingen av et natriumboraluminiumsilikat-glass oppført.

Ved tilsetning av vann igangsettes hydrolyseprosessen av utgangskomponentene. Reaksjonen forløper forholdsvis raskt, fordi alkaliionene innvirker katalytisk på hydrolysehastig-heten av kiselsyreesterne. Etter opphør av geldannelsen kan den dannede gel tørkes og fortettes til et glass ved hjelp av en termisk prosess.

Mengdeforholdet sol/pigment har en betydelig innflyt-else på det magnetiske pigment ifølge oppfinnelsen. Det gis her grenser ved at pigmentandelen må være så liten at det fremdeles dannes en pumpe- og sprøyteegnet masse. Ved for liten pigmentandel blir finandelen av f.eks. ikke-magnetisk materiale for stor og forstyrrende. Med henblikk på pigment-utbyttet er mengdeforhold på 10 til 25 g pigment/100 ml sol funnet hensiktsmessige.

For å danne et pulver sprøytes fortrinnsvis oppslemmingen gjennom en dyse og aerosolen tørkes på en fallstrek-ning. Dysen oppvarmes fortrinnsvis for å akselerere tørkingen av oppslemmingen. Avhengig av dysens geometri er dysetemperaturen fortrinnsvis fra ca. 120 til 200 °C. Et kompromiss blir funnet gjennom tilstrekkelig fordampingshastighet, imidlertid med unngåelse av sprut.

Med henblikk på utbyttet må kondensasjonstemperaturen velges høyest mulig. Dersom den imidlertid er for høy kleber partiklene seg sammen og det dannes agglomerater som må siles fra. Etterbehandlingen under luft fører ved for høye tempera-turer til et tap av de magnetiske egenskaper, og høye tempera-turer bør derfor unngås.

Ved en vesentlig porefri overflate forstås en overflate med mindre enn 5 %, fortrinnsvis mindre enn 2 % og spesielt foretrukket mindre enn 0,1 % porer av den ovennevnte definisjon. Dersom slike porer skal foreligge så har disse fortrinnsvis en diameter mindre enn 10, spesielt foretrukket 1 nm.

Spesielt foretrukket ved foreliggende oppfinnelse er partikler som inneholder en kjerne av glimmer belagt med TiC>2hvorpå det er immobilisert magnetittpartikler, hvorved det således dannede forbindelsesstoff er omsluttet av glassjiktet. Både kjernen og også magnetittpartiklene er krystallinske og ikke-porøse. Rommene på overflatene av glimmeret som ikke er opptatt av magnetittpartikler er overtrukket av et tykkere glassjikt enn toppene av magnetpartiklene, slik at det dannes en hovedsakelig ikke-porøs glassoverflate.

Ikke-porøsiteten av den magnetiske partikkel refererer kun til den ytre overflate, ikke det indre av partikkelen, slik at partikkelen kan være porøs i det indre, når overflaten kun er omsluttet av hovedsakelig porefritt glass, eller en glassoverflate med porer med en diameter mindre enn 10 nm.

De magnetiske partikler ifølge oppfinnelsen er overraskende spesielt fordelaktig egnede for isolering av biologiske materialer fra prober. Spesielt blir lange nukleinsyrer meget lite, eller overhode ikke, ødelagt, når de immobiliseres på partiklene. Materialet i kjernen er dessuten en naturlig ressurs og således lite betenkelig i økologisk henseende. Fremstillingen av partiklene ifølge oppfinnelsen er dessuten svært ukomplisert og kostnadsgunstig.

Foreliggende oppfinnelse angår dessuten ferromagnetiske partikler med en glassoverflate. Superparamagnetiske partikler er beskrevet i teknikken. Det har nå vist seg at ferromagnetiske partikler, når de er overtrukket med en glassoverflate, oppviser betydelige fordeler ved isolering av biologiske materialer. Så lenge de ferromagnetiske partikler fremdeles ikke har vært utsatt for noe magnetfelt, sedimen-terer de utelukkende under påvirkning av tyngdekraften. De kan ved omrøring lett og hurtig suspenderes på nytt. Atskillelsen uten magnetfeltinnflytelse forløper derved fortrinnsvis lang-sommere enn immobiliseringen av biologisk materiale på partik-lenes overflate. Dette gjelder spesielt for nukleinsyrer. De ferromagnetiske partikler kan på enkel måte, ved hjelp av en magnet, samles på et bestemt sted i probevæsken for å atskille væsken fra partiklene og følgelig de immobiliserte biologiske materialer.

Glassoverflåtene på de ferromagnetiske partikler ifølge oppfinnelsen kan være porefrie eller også inneholde porer. Ut fra de ovennevnte grunner for de magnetiske partikler ifølge oppfinnelsen, er det foretrukket at den ytre overflate av de ferromagnetiske partikler er vesentlig porefrie eller oppviser porer med en diameter mindre enn 10 nm. De ferromagnetiske partikler ifølge oppfinnelsen har også fortrinnsvis en kornstørrelse mellom 10 og 60 um, spesielt foretrukket mellom 20 og 50 um. Spesielt foretrukket er partikler hvor de eventuelle porer i overflaten har en diameter mindre enn 10 nm, spesielt foretrukket 1 nm. Ett eksempel på en ferromagnetisk partikkel ifølge oppfinnelsen er det ovennevnte sammensatte materiale av glimmer- og magnetittpartikler omsluttet av et glassjikt.

Det beskrives også likeledes en fremgangsmåte for isolering av et biologisk materiale, ved at - en probe som inneholder det biologiske materiale i en væske, bringes i kontakt med de magnetiske partikler ifølge oppfinnelsen, eller de ferromagnetiske partikler ifølge oppfinnelsen, under betingelser hvor det biologiske materiale bindes til partikkeloverflaten,

og

- det biologiske materiale atskilles fra væsken.

Under biologiske materialer skal det forstås materialer på partikulær eller molekylær basis. Til disse hører spesielt celler, f.eks. virus og bakterier, men også celler isolert fra mennesker og dyr, slik som leukocytter, så vel som immunologisk aktive lav- og høymolekylære kjemiske forbind- eiser som haptener, antigener, antistoffer og nukleinsyrer. Spesielt foretrukket er nukleinsyrer, f.eks. DNA eller RNA.

Prober ifølge oppfinnelsen er f.eks. kliniske prober som blod, serum, munnutskyllingsvæske, urin, cerebralvæske, spytt, avføring, punktater og benmargsprober. Probene kan også stamme fra områdene miljøanalyse, næringsmiddelanalyse eller den molekylærbiologiske forskning, f.eks. fra bakterie-kulturer, faglysater og produkter fra amplifikasjonsfremgangs-måter, f.eks. PCR.

Ifølge oppfinnelsen har de magnetiske partikler en indre kjerne som den ytre glassoverflate er anbrakt på. Kjernen kan bestå av et sammensatt materiale, men også av en enkel jernkjerne. Kjernen kan også bestå av en krystallinsk eller keramisk eller glassaktig struktur som jernoksidet er innesluttet i.

Ved hjelp av den beskrevne fremgangsmåte kan nativt eller modifisert biologisk materiale isoleres. Under nativt biologisk materiale skal det forstås materiale hvis struktur ikke er irreversibelt forandret i forhold til det naturlig forekommende biologiske materiale. Dette utelukker imidlertid ikke modifisering av andre bestanddeler av proben. Dersom f.eks. celler skal isoleres, så kan mediet som omgir cellene modifiseres, men ikke cellene som sådanne. Dersom nukleinsyrer skal isoleres, så bør også disse modifiseres i nativ form, dvs. ikke denaturert, spaltet eller ved tilkobling av reaktive grupper. Begrepet native biologiske materialer omfatter derfor spesielt ikke biotinylerte nukleinsyrer. Eksempler på native biologiske materialer er fag-DNA eller cellulære nukleinsyrer fra blod.

Modifiserte biologiske materialer omfatter materialer som ikke forekommer i naturen, f.eks. nukleinsyrer som er modifisert ved tilkobling av reaktive, påvisbare grupper,eller grupper egnede til immobilisering, f.eks. biotinylerte nukleinsyrer.

I bestemte tilfeller kan proben anvendes uten forhåndsbehandling ved isoleringsfremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I mange tilfeller bør imidlertid proben dekomponeres ved hjelp av en egnet metode og det inneholdte biologiske materiale i proben frigjøres. Fremgangsmåte for dekomponering av prober er kjent for fagfolk og kan være kjemiske, enzymatiske eller fysikalske. Også en kombinasjon av disse fremgangsmåter er mulig. Lyse ved hjelp av ultralyd, høyt trykk eller høy skjærkraft, ved hjelp av alkali, detergenter eller chaotropiske saltløsninger, eller ved innvirkning av proteinaser eller lipaser, skal spesielt nevnes. Spesielt med henblikk på dekomponeringsfremgangsmåtene for isolering av nukleinsyrer skal det refereres til Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY og Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Viley and Sons, NY.

Foruten det biologiske materiale som skal isoleres kan proben inneholde ytterligere bestanddeler, f.eks. celle-nedbrytningsmateriale, proteiner, salt og ytterligere stoffer som ikke skal isoleres, i en væske. Denne proben, som fortrinnsvis inneholder det biologiske materiale i nativ form, blir under betingelser ved hvilke det ønskede biologiske materiale bindes til partikkeloverflaten, brakt i kontakt med partiklene. Disse betingelser avhenger av beskaffenheten av det biologiske materiale, men er imidlertid prinsipielt kjente. De avhenger også av typen av binding som det biologiske materiale er bundet til overflaten med. Dersom immunolog-iske vekselvirkninger f.eks. skal utnyttes for bindingen, så må det utvelges slike betingelser som er egnede for dannelse av immunkomplekser. For nukleinsyrer er det i tilfelle med modifiserte nukleinsyrer mulig med en binding over gruppene på nukleinsyrene som representerer modifiseringen, f.eks. biotin over bindingen til overflater overtrukket med streptavidin. Spesielt med nukleinsyrer foretrekkes imidlertid den direkte binding av nukleinsyrer til glass, blant annet fordi en modifisering av nukleinsyrene er unødvendig og kun native nukleinsyrer kan bindes. Bindingen av native nukleinsyrer til glasspartikler kan utføres analogt med fremgangsmåter ifølge kjent teknikk. Fortrinnsvis utføres bindingen i nærvær av chaotropiske salter, hvorved konsentrasjonen av disse salter er mellom 2 og 8 mol/l, fortrinnsvis fra 4 til 6 mol/l. Ved chaotropiske salter handler det blant annet om natriumjoditt, natriumperklorat, guanidintiocyanat, guanidinisotiocyanat eller guanidinhydrokloritt, men saltene er imidlertid ikke begrenset til disse forbindelser.

For å bringe proben i kontakt med partiklene blandes proben med partiklene og inkuberes i en tilstrekkelig tid for binding. Inkubasjonstiden er som regel kjent for en fagperson ut fra behandlingen med ikke-magnetiske partikler, og en opti-malisering er mulig ved gjennomføring av en bestemmelse av mengden av immobilisert biologisk materiale på overflaten til forskjellige tidspunkter. For nukleinsyrer kan inkubasjons-tider mellom 10 sekunder og 30 minutter være formålstjenlige.

Alt etter størrelsen og beskaffenheten av den magnetiske partikkel foregår det allerede under inkubasjonstiden en separasjon av partikkelen fra væsken, eller suspensjonen opprettholdes over lengre tid. Når partiklene oppviser en meget liten kornstørrelse og er superparamagnetiske, opprettholdes suspensjonen over et lengre tidsrom. Dersom det handler om partikler med en større kornstørrelse, inntreffer det allerede under inkubasjonen en langsom separasjon av partiklene fra væsken. Spesielt når det handler om ferromagnetiske partikler danner det seg slike aggregater. I det foretrukne tilfelle at de ferromagnetiske partikler ikke er magnetisert på forhånd, sikres en spesielt skånsom separasjon.

Immobiliseringen finner fortrinnsvis ikke sted ved utfelling gjennom reduksjon av løseligheten av materialene som skal immobiliseres. Immobiliseringen er i steden avhengig av biospesifikke vekselvirkninger (innfangelsesmolekyler) eller adsorpsjon. Ved dette unngås i stor grad inkorporeringer av forurensninger.

Etter inkubasjonen følger atskillelse av det biologiske materiale fra væsken. Dette oppnås vanligvis ved separasjon av materialet bundet til de magnetiske partikler ved hjelp av et magnetfelt. Magnetpartiklene kan f.eks. trekkes til veggen i beholderen som inkubasjonen ble utført i. Væsken med innholdsstoffene i proben som ikke er blitt bundet til de magnetiske partikler kan deretter fjernes. Denne fjerning avhenger av typen av beholder som inkubasjonen ble utført i. Egnede fremgangsmåtetrinn er avpipettering eller avsuging av

væsken.

De magnetiske partikler kan deretter, om ønskelig, renses én eller flere ganger med en vaskeløsning. Vaske-løsningen utvelges slik at det biologiske materiale i størst mulig grad ikke løsner fra partikkeloverflaten, imidlertid mens forurensninger som ikke skal isoleres, vaskes bort i høyest mulig grad. Disse vasketrinn utføres fortrinnsvis ved inkubasjon av vaskeløsningen med partiklene, idet det fortrinnsvis utføres en resuspensjon av partiklene, f.eks. ved omrøring eller pålegging av et magnetfelt som ikke er identisk med det første magnetfelt. Den forurensede vaskeløsning fjernes fortrinnsvis nøyaktig på samme måte som proben under det ovenfor beskrevne trinn for binding av det biologiske materiale.

I forbindelse med det siste vasketrinn kan et utføres et kort tørketrinn for de magnetiske partikler i vakuum, eller ved avdamping av væsken, hvorved også en forhåndsbehandling med aceton er mulig.

Det således rensede biologiske materiale kan, hvis ønsket, fjernes fra de magnetiske partikler. Også dette trinn retter seg etter typen av bindingen av det biologiske materiale til de magnetiske partikler. Når de biologiske materialer er native nukleinsyrer og de magnetiske partikler er glass-belagte partikler, kan nukleinsyrene fjernes fra partiklene ifølge oppfinnelsen ved hjelp av en elueringsbuffer med lavt saltinnhold. Slike buffere er kjent fra DE 3724442 og Analytic Biochemistry 175, 196-201 (1988). Som elueringsbuffer med lavt saltinnhold anvendes spesielt en buffer med et saltinnhold mindre enn 0,2 mol/l. I en spesielt foretrukket utførelsesform inneholder elueringsbufferen tris. I en annen spesiell ut-førelsesform er elueringsbufferen avmineralisert vann.

I en ytterligere utførelsesform kan den beskrevne rensings- og isoleringsfremgangsmåte utføres i forbindelse med en immunmagnetisk separasjon av celler (f.eks. viruspartikler eller prokaryote, hhv. eukaryote celler) fra en kroppsvæske eller et vev. Ved denne fremgangsmåte inkuberes proben med magnetiske partikler på hvilket et antistoff mot et antigen på celle er immobilisert, f.eks. under omrøring. Slike partikler kan være partikler ifølge oppfinnelsen, men også kommersielt tilgjengelige (f.eks. MACS Microbeads fra firma Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, BRD). Etter påleggelse av et magnetfelt utføres ett eller flere vasketrinn med en saltholdig vaskeløsning. Det erholdes partikler til hvilke de ønskede celler er bundet. Til slutt resuspenderes de bundne celler i en saltholdig buffer. I en foretrukket utførelsesform er den saltholdige buffer en chaotropisk saltløsning, slik at nukleinsyrene i cellene frigjøres fra cellene.

Ved hjelp av kombinasjon av den ovenfor beskrevne isomering av celler med den likeledes beskrevne isolering av nukleinsyrer, fortrinnsvis i deres native form, på de magnetiske partikler ifølge foreliggende oppfinnelse, tilveiebringes en spesielt fordelaktig fremgangsmåte for isolering av nukleinsyrer fra celleinneholdende prober. Fordeler med denne utførelsesform er at den er enkel (enkelbeholdermetode), har høy sensitivitet (spesielt viktig i den medisinske mikro-biologi og onkologi) og lett kan automatiseres.

De biologiske materialer isolert ved fremgangsmåten beskrevet heri kan anvendes videre på enhver ønsket måte. De kan f.eks. anvendes som substrat for forskjellige enzymatiske reaksjoner. For nukleinsyrer kan det f.eks. nevnes sekvensering, radioaktiv eller ikke-radioaktiv merking, amplifikasjon av én eller flere sekvenser inneholdt i nukleinsyrene, transkripsjon, hybridisering med merkede sondenuklein-syrer, translasjon eller ligering. En fordel med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at atskillelsen av det biologiske materiale fra væsken er meget enkel. Ifølge kjent teknikk ville det for separasjon av glasspartikler fra forurensninger enten anvendes et sentrifugeringstrinn, eller i tilfellet med binding av det biologiske materiale til glassfiberfilter, ville væsken suges gjennom dette filter. Med dette handler det om et begrensende trinn som hindrer bearbeidelse av store probeantall.

Ved hjelp av partiklene ifølge oppfinnelsen mulig-gjøres en effektiv atskillelse av det biologiske materiale fra forurensninger. Inhibitorer av bestemte enzymatiske reaksjoner kan fjernes i spesielt høy grad ved hjelp av foreliggende opp finnelse. Utbytter av biologisk materiale er forholdsvis høyt. En fraksjonering av lengre nukleinsyrer ble ikke observert. Partiklene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis hurtig magneti-serbare. Figur 1 viser skjematisk isolering av nukleinsyrer fra en celleholdig probe. Figur 2 viser atskillelse av nukleinsyrer isolert ifølge oppfinnelsen på en agarosegel. Figur 3 viser atskillelse av reaksjonsprodukter etter isolering ifølge oppfinnelsen og PCR-amplifikasjon. Figur 4 viser en gel med resultatene fra eksempel 4. Figur 1 viser skjematisk isolering av nukleinsyrer fra en celleholdig probe. Proben (prøve), som inneholder celler, forhåndsbehandles probespesifikt slik at cellene, hvori nukleinsyrene skal påvises, foreligger i en egnet form. Til dette hører, f.eks. for prober som er uttatt fra kropps-væsker, tilsetning av reagenser for f.eks. oppløsning av viskøse prober, f.eks. spyttprober. Den således bearbeidede probe tilsettes i en beholder til et antistoff bundet til en fast fase, fortrinnsvis til en perle (Bead), som kan gjen-kjenne og binde cellen. Antigener på celleoverflater har spesielt vist seg som egnede partnere for antistoffene. Anti-stoffenes spesifisitet kan justeres etter spesifisiteten av analyseoppgaven som skal løses. Når den faste fase er veggen i beholderen, blir cellene bundet direkte til veggen. Når den faste fase er en perle, separeres denne fra væsken ved hjelp av egnede separasjonsmetoder. Dette kan f.eks. utføres ved filtrering. I tilfelle med magnetiske perler er en atskillelse ved påleggelse av et magnetfelt på den ytre vegg av beholderen mulig. De separerte celler vaskes med en væske for å fjerne forurensninger som vil forstyrre påvisningen, sammen med mediet som omgir cellene. Fortrinnsvis anvendes betingelser ved hvilke cellene verken løses fra den faste fase eller ned-brytes. Nedbrytning av cellene utføres deretter, den såkalte lyse. En mulighet er behandling av cellene med chaotropiske salter. Andre muligheter er anvendelse av proteinaser og detergenter.

I den foretrukne utførelsesform tilsettes partiklene ifølge oppfinnelsen til lyseblandingen. Etter en egnet virke-tid, som kan optimaliseres ved hjelp av belastningen av overflaten med nukleinsyrer, atskilles partiklene fra den omgiv-ende væske som inneholder ytterligere cellebestanddeler som ikke skal påvises. Dette utføres på nytt fortrinnsvis ved anleggelse av et magnetisk felt ved hjelp av en magnet på beholderveggen.

For å fjerne ytterligere forurensninger blir beholderen fortrinnsvis vasket med en væske som er utvalgt slik at nukleinsyrene som skal bestemmes ikke løser seg fra glassoverflaten. For å fjerne nukleinsyrene fra glassoverflaten tilsettes en såkalt elueringsbuffer med reagensbetingelser som medfører at nukleinsyrene løser seg fra glassoverflaten. Disse reagensbetingelser er spesielt lave saltinnhold. Alt etter tilsiktet viderebehandling av nukleinsyrene kan væsken nå atskilles fra partiklene og bearbeides videre. Det er foretrukket at denne atskillelse utføres med det pålagte magnetfelt, slik at partiklene forblir separert.

De følgende eksempler gir en nærmere beskrivelse av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Fremstilling av de magnetiske partikler ifølge oppfinnelsen

Det ble anvendt 6 forskjellige soler. Fremstillingen av solen ble utført etter de følgende skjemaer:

Sol 1 ( Si02:B2Q3 = 7:3):

Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

86,6 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 14,1 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 37,8 ml trimetylborat.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tilsatt 14,1 ml 0,15 M HC1.

Sol 2 ( Si02:B203 = 4:1): Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

100,5 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 16,3 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 25,6 ml trimetylborat.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tilsatt 16,3 ml 0,15 M HC1.

Sol 3 ( SiQ2:B203 = 85:15) : Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

107,8 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 17,5 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 19,4 ml trimetylborat.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tilsatt 17,5 ml 0,15 M HC1.

Sol 4 ( Si02:B203 = 4:1, 2 mol% P205) : Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

100,5 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 16,3 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 25,6 ml trimetylborat.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tilsatt 16,3 ml 0,15 M HC1 + 1,63 g P205. Sol 5 ( Si02:B203 = 4:1, mol% A1203) : Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

100,5 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 16,3 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 25,6 ml trimetylborat.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tildryppet 16,3 ml 0,15 M HC1 + 3,06 g Al203.

Sol 6 ( Si02:B2Q3 = 4:1, mol% ZrQ2) :

Syntesen ble utført i en 250 ml rundkolbe under kontinuerlig omrøring.

100,5 ml tetraetylortosilikat

+7 ml vannfri, udenaturert etanol

+ 16,3 ml 0,15 M HC1.

Det ble dannet en tofaset blanding som ble omrørt ved romtemperatur i så lang tid at den ble enfaset. Deretter ble det dråpevis tilsatt 25,6 ml trimetylborat + 5,15 ml zircon(IV)-proylat, 70 vekt% Lsg i 1-propanol.

Deretter ble solen oppbevart i 2 timer ved 50 °C. Deretter ble det tilsatt 16,3 ml 0,15 M HC1.

Etter ytterligere 2 timer ved 50 °C ble det i 150 ml av solen innrørt 22,5 g iriodin 600 (svart mika), og beleggingen ble deretter utført med en sprøytetørker (Buchi 190, Mini Spay Dryer). Dysetemperaturen i sprøytetørkeren var

134 °C.

Det dannede pulver ved sprøytetørkeprosessen ble deretter underkastet en temperaturbehandling under nitrogenatmos-fære (90 liter/time). Oppvarmingshastigheten var 1 °k/minutt og oppholdstiden var 2 timer ved kondensasjonstemperaturen. Denne temperatur var ved beleggingen med sol 1 750 °C, ved beleggingen med sol 2 860 °C og ved de øvrige belegginger

800 °C. Etter sintreringsprosessen ble ovnen skrudd av og pulveret ble avkjølt til romtemperatur. Eventuelt dannet agglomerat ble avsilt med en 50 um sil.

Eksempel 2

Fremstilling av GMP1, GMP2, GMP3 og GMP4

GMP1, GMP2, GMP3 og GMP4 er pigmenter fra forskjellige fremstillingsladninger som ble fremstilt fra sol 1 fra eksempel 1 i en prosess ifølge eksempel 1, under de følgende betingelser:

Eksempel 3

Preparering av PCR- prober fra humant helt blod med magnetiske glasspartikler

Isolering av nukleinsyren

Fra tre glassmagnetpartikkelladninger (GMP2-4) ble det uttatt ca. 10 mg som ble tilsatt til eppendorf-reaksjons-kolber. Den nøyaktige innveiing er angitt i tabell 1, det ble utført tre parallelle bestemmelser.

Til 200 ul opptinet helt blod ble det pipettert 40 ul proteinase K (20 mg/ml, fremstilt fra lyofilisat) og umiddel- bart blandet. Deretter ble prøvene tilsatt 200 ul bindings-buffer (6 M guanidin-HCl, 10 mM tris-HCl, 10 mM urea, 30 % triton X-100, pH 4,4), blandet og inkubert i 10 minutter ved 70 °C. Etter tilsetning av 200 ul i-propanol ble prøvene blandet i 10 sekunder på en Vortex-blander, probene ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur og blandet på nytt i 10 sekunder. Magnetseparasjonen ble utført i minst 30 sekunder i en magnetpartikkelseparator fra Boehringer Mannheim (id. nr. 1 641 794). Supernatantene ble fjernet og analysert som beskrevet nedenfor. Magnetpartiklene ble blandet med 500 ul vaskebuffer (20 mM NaCl, 10 mM tris-HCl, pH 7,5 (25 °C) , 80 % etanol) i 10 sekunder, inkubert i 1 minutt ved romtemperatur og vasket i 10 sekunder, og trukket til beholderveggen ved hjelp av magnetpartikkelseparatoren. Supernatanten ble fjernet og kastet. Vaskeprosedyren ble gjentatt inntil vaskesupernatanten var fargeløs (samlet fire vaskinger). Nukleinsyrene ble deretter blandet tre ganger i 10 sekunder med 200 ul eluerings-buf fer (10 mM tris-HCl, pH 8,5) som var forhåndsoppvarmet til 70 °C, inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og blandings-eluert i 10 minutter.

Opparbeidelse av supernatant

Supernatanten etter den første binding til de magnetiske glasspartikler ble testet på innhold av nukleinsyrer på følgende måte: Supernatanten ble tilsatt til et filterrør (Boehringer Mannheim, id. nr. 1744003, f.eks. inneholdt i High Pure PCR Product Purification Kit) og sentrifugert i 1 minutt ved 8 000 rpm i en eppendorf-bordsentrifuge. Gjennomløpet ble kastet og filterrøret ble vasket to ganger med 500 pl vaskebuffer (sentrifugering som ovenfor). Filterrøret ble kort tørrsentrifugert og deretter eluert med 2 x 200 ul 1 x elueringsbuffer forhåndsoppvarmet til 70 °C ved en ny sentrifugering .

Analyse av eluatet og probesupernatanten

50 ul av eluatet, hhv. supernatanten opparbeidet i filterrøret, ble deretter tilsatt 10 ul probebuffer, og av denne ble 45 ul separert elektroforetisk ved 120 V i

90 minutter i en 0,8 % agarosegel.

Forskjellige fortynninger av eluatet, hhv. de opp-arbeidede supernatanter, ble målt spektroskopisk ved 260 og 280 nm i en Uvikon 710 (Kontron).

To 5 ul aliquoter av eluatet ble testet som dobbelt-bestemmelse ved hjelp av "Expand" Long Template PCR (Boehringer Mannheim, id. nr. 1681834) med spesifikke primere, for det menneskelige tPA-gen (ventet produktlengde 15 kb).

Blanding I ble tilsatt til et tynnvegget PCR-rør og tilsatt 5 )il eluat og blanding II. Porsjonen ble kort blandet og overlagt med 30 ul mineralolje. Porsjonene ble amplifisert i et Perkin-Elmer-termosykliseringsapparat 9600 med det følg-ende program:

50 ul PCR-porsjonene ble tilsatt 10 ul probebuffer og 45 ul av denne blanding ble separert elektroforetisk ved 120 V i 90 minutter i en 0,8 % agarosegel.

Det første eluat var fremdeles lett gulfarget og del-vis kontaminert med fine magnetpartikler.

Analysen av eluatet fra agarosegelen (figur 2) viser en god reproduserbarhet med hensyn til utbytte. Magnetpartiklene GMP/2-4 viser ingen signifikante forskjeller. I eluatene 1 (ovenfor) og 2 (nedenfor) forefinnes ca. den samme nukleinsyrekonsentrasjon (vurdert fra gelen). Eluat 3 viser kun en liten nukleinsyrekonsentrasjon. I supernatantene kan det likeledes kun observeres en liten nukleinsyrekonsentrasjon.

"Expand" PCR gir med alle prober, med unntak av mindre avvik (tabell 2), gjennomgående gode og spesifikke amplifikasjonsprodukter. Med de magnetiske glassperler kan nukleinsyrer isoleres fra humane blodprøver, hvilke i en etterfølgende PCR tilveiebringer spesifikk amplifikasjonsprodukter.

Figur 3 viser en gel med reaksjonsproduktene etter PCR-amplifikasjon. MWM III er en molekylvektmarkør (eluat 1, øverst; eluat 2, nederst).

Eksempel 4

Binding av DNA- lengdestandard til magnetiske glasspartikler

1. Preparering av de magnetiske glasspartikler

Fra glassmagnetladningen GMP4 ble 12 mg tilsatt til Eppendorf-reaksj onskolber.

2. Lyse og binding

I en 1,5 ml Eppendorf-kolbe med 12 mg magnetiske glasspartikler ble det tilsatt 900 ul lyse-buffer (4,6 M GuSCN, 45 mM tris, 20 mM EDTA, pH 7,3) og 100 ul DNA-probe av DNA-lengdestandard III-modellen fra Boehringer Mannheim (katalog nr. 528552), og materialer ble blandet i 2 til 10 sekunder inntil det var dannet en homogen suspensjon. Suspensjonen ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur, hvorav 5 minutter under omrøring.

Magnetseparasjonen ble utført i minst 15 sekunder i en magnetpartikkelseparator. Supernatanten ble avpipettert.

3. Vask og tørking

De magnetiske glasspartikler ble vasket to ganger med vaskebuffer (5,2 M GuSCN, 50 mM tris, pH 6,5), to ganger med 70 % forhåndsavkjølt etanol og én gang med aceton, hvorved magnetfeltet var fjernet, 800 ul løsning ble utpipettert, blandet i 2 sekunder, inkubert i 1 minutt ved romtemperatur, magnetfeltet ble pålagt og supernatanten ble til slutt avpipettert .

Etter fjerning av acetonet ble partiklene tørket i 10 minutter ved 56 °C på et varmeelement.

4. Eluering av DNA

DNA ble éluert med 4 x 50 ul elueringsbuffer (10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) idet løsningen ble inkubert ved 56 °C med gjentatte omrøringer, og den DNA-inneholdende supernatant ble til slutt overført til en ny Eppendorf-kolbe.

5. Analyse av eluatet

En femtedel av eluatvolumet ble tilsatt probebuffer og DNA ble atskilt på en 1 % agarosegel ved 90 V. For bestemmelse av resultatet ble en fortynningsrekke av DNA-lengdestandard III applisert på den samme gel i mengder som var til-svarende de forventede DNA-mengder i proben.

Den kvantitative evaluering ble utført ved skanning av et polaroidfoto av agarosegelen. Ved dette ble fortynnings-rekken av standarden anvendt som kalibrator.

Utbyttet av DNA med magnetiske glasspartikler er vist i tabell 1.

Agarosegelen som tjente som grunnlag for den kvantitative bestemmelse er vist i figur 4. Det handler om en 1 % etidiumbromidfarget agarosegel. Felt 1 til 10 tilsvarer en fortynningsrekke av DNA-lengdestandard III. 1: 1 ug DNA, 2: 200 ng DNA, 3: 175 ng DNA, 4: 150 ng DNA, 5: 125 ng DNA, 6: 100 ng DNA, 7: 75 ng DNA, 8: 50 ng DNA, 9: 25 ng DNA, 10:

10 ng DNA.

Felt 11 og 12 tilsvarer det eluerte DNA fra de magnetiske glasspartikler ved tilsetning av 200 ng DNA-lengdestandard.

Claims (17)

1. Reagenspreparat til isolering av nukleinsyrer fra en prøve, karakterisert vedat det omfatter: (a) magnetiske partikler med en ytre glassoverflate som er vesentlig porefri eller har porer med en diameter mindre enn 10 mm, der glasset inneholder boroksid, (b) kaotropisk saltløsning til lysering av prøver, (c) eventuelt en vaskeløsning og (d) eventuelt en elueringsbuffer.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat de magnetiske partiklene har en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på mindre enn 100 um.

3. Preparat ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat de magnetiske partiklene inneholder en indre kjerne av for eksempel et komposittmateriale eller en jernkjerne på hvilken den ytre glassoverflaten er pålagt.

4. Preparat ifølge krav 3, karakterisert vedat kjernen er sammensatt av en krystallinsk eller keramisk eller glasslignende struktur der jernoksid er inkorporert.

5. Preparat ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat kjernen består av magnetitt (Fe3C>4) eller Fe203.

6. Preparat ifølge et av kravene 1 til 5,karakterisert vedat de magnetiske partiklene er ferromagnetiske.

7. Preparat ifølge et av kravene 1 til 6,karakterisert vedat konsentrasjonen av kaotropiske salter i den kaotropiske saltløsningen er 2-8 mol/l, fortrinnsvis 4-6 mol/l.

8. Preparat ifølge et av kravene 1 til 7,karakterisert vedat de kaotropiske saltene er valgt fra natriumjodid, natriumperklorat, guanidinium-tiocyanat, guanidiniumisotiocyanat og guanidiniumhydroklorid.

9. Preparat ifølge et av kravene 1 til 8,karakterisert vedat elueringsbufferen har et lavt saltinnhold, fortrinnsvis et saltinnhold på mindre enn 0,2 mol/l.

10. Preparat ifølge et av kravene 1 til 9,karakterisert vedat elueringsbufferen inneholder tris eller er demineralisert vann.

11. Anvendelse av et reagenspreparat ifølge et av kravene 1 til 10 for å isolere nukleinsyrer i en nativ form fra en prøve.

12. Anvendelse ifølge krav 11, der prøven er en klinisk prøve.

13. Anvendelse ifølge krav 11 eller 12, der prøven er valgt fra blod, serum, munnskylling, urin, cerebral væske, spytt, avføring, biopsiprøver og benmargsprøver.

14. Anvendelse ifølge krav 11, der prøven er en prøve fra fagområdet for miljøanalyse, matvareanalyse eller molekylær-biologisk forskning og er fortrinnsvis en prøve fra bakterie-kulturer, bakteriofaglysater eller produkter av amplifiser-ingsfremgangsmåter, for eksempel PCR.

15. Anvendelse ifølge et av kravene 1 til 14, der nukleinsyrene blir benyttet som et substrat for en enzymatisk reaksj on.

16. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 11 til 15, der nukleinsyrene blir benyttet som et substrat til sekvensering, radioaktiv eller ikke-radioaktiv merking, amplifisering av én eller flere sekvenser, transkripsjon, hybridisering med merkede probenukleinsyrer, translasjon eller ligering.

17. Anvendelse ifølge krav 16, der nukleinsyrene blir benyttet som et substrat for sekvensering, radioaktiv eller ikke-radioaktiv merking, amplifisering av én eller flere sekvenser, transkripsjon, hybridisering med merkede probenukleinsyrer, translasjon eller ligering.