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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion spezifischer Blutbestandteile. Außerdem betrifft die Erfindung einen Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
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Extraktionsverfahren für Probebestandteile sind bekannt, beispielsweise aus der
DE 10 2008 061 714 A1 und
DE 10 2008 029 356 A1 . Dabei sollen vorrangig Pathologie-Proben (formalin-fixiert) durch eine Schrittabfolge in ihre spezifischen Bestandteile zerlegt werden. Außerdem können die zu untersuchenden Proben-Bestandteile an magnetische Beads angelagert werden, welche auf diesem Wege aufgereinigt und weiteren Untersuchungsverfahren zugeführt werden können. Isoliert werden dabei Nukleinsäuren, welche anschließend für weitere Untersuchungen zur Verfügung stehen. Soll dieses Verfahren bei Vollblut zur Isolierung von RNA verwendet werden, sind entweder eine Vorbehandlung oder manuelle Zwischenschritte in der Schrittabfolge nötig, um eine genügende Ausbeute an RNA sicherzustellen. Eine vollständige Automatisierbarkeit ist allerdings nicht möglich.
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Die Aufgabe der Erfindung liegt daher darin, ein Verfahren zur Extraktion von Blutbestandteilen anzugeben, mit den Nukleinsäuren, insbesondere RNA, in einem für eine weitergehende Untersuchung geeigneten Umfang vollautomatisiert isoliert werden.
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Diese Aufgabe wird mit folgendem Verfahren erfindungsgemäß gelöst. Mit dem Verfahren findet eine Extraktion spezifischer Blutbestandteile aus gefrorenem und wieder aufgetautem oder flüssigem Vollblut statt, wobei folgende Schritte durchlaufen werden, die in der angegebenen Reihenfolge abgearbeitet werden. Die Vollblutprobe wird mit einem Puffer, einem Lyseenzym und einer Dispersion von Nukleinsäure bindenden magnetischen Beads gemischt. Die Nukleinsäuren der Vollblut-Probe werden durch Lyse freigesetzt und diese Nuleinsäuren zumindest zum größeren Teil an die Beads durch Inkubieren der Probe gebunden. Die Probe wird in einem Magnetfeld gehalten, wodurch die Beads räumlich fixiert werden. Die Vollblutprobe wird entfernt bis auf die an den Beads fixierten Nukleinsäuren, und zwar durch räumliche Trennung und anschließendes Spülen der Beads mit sauren Waschlösungen (ein Waschschritt oder mehrere Waschschritte). Dann findet eine Elution der fixierten Nukleinsäuren in einem basischen Elutionspuffer statt. Erfindungsgemäß wird bei dem Verfahren der Schritt der Lyse mit einem Lyseenzym unter chaotropen Bedingungen durchgeführt, indem als Puffer ein neutraler chaotroper Lyse-Puffer mit einem PH-Wert von mindestens 6 und höchstens 8 verwendet wird. Bevorzugt kann dieser Puffer in einem Verhältnis Vollblut: erster Puffer von mindestens 1:1 und höchstens 1:10, bevorzugt 0,24:1 gemischt werden. Die Verhältnisse, die im Rahmen dieser Anmeldung angegeben werden, stellen immer Verhältnisse der Volumina dar.
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Es hat sich nämlich gezeigt, dass die Verwendung von neutralen Lyse-Puffern mit einem pH-Wert von 6 bis 8 dazu geeignet ist, vorrangig RNA an die magnetischen Beads anzulagern. Daher wird es durch Verwendung des richtigen Lyse-Puffers möglich, die Vollblutprobe hinsichtlich der enthaltenen RNA zu untersuchen. Hierdurch können zusätzliche Untersuchungsergebnisse erzielt werden, die weitergehende Untersuchungsaussagen ermöglichen. Die weitergehende Untersuchung der isolierten RNA kann durch die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von Nukleinsäuren erfolgen. Das angegebene Verfahren hat zusätzlich den großen Vorteil, dass das Verfahren der Probenpräparation automatisiert stattfinden kann. Außerdem kann mit dem Verfahren sowohl frisches als auch gefrorenes Vollblut verarbeitet werden. Dies ermöglicht eine umfassendere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielsweise auf Proben, die zu Zwecken der Haltbarkeit eingefroren wurden. Der Umstand, dass auch gefrorenes Blut verwendet werden kann, liegt darin begründet, dass auf eine selektive Erythrozytenlyse und Abtrennung verzichtet werden kann. Diese beiden Schritte können nämlich nicht mit bereits gefrorenem Blut durchgeführt werden (Ein Prozess mit Erythrozytenlyse und Abtrennung bietet die Firma QIAGEN unter dem Namen QIAamp an, wobei es sich hier um einen sogenannten RNA Blood Mini Kit handelt). Genau diese nur manuell durchführbaren Schritte der Vorinkubation werden durch Zuhilfenahme der magnetischen Partikel vermieden. Andererseits kann durch die Möglichkeit einer Automatisierbarkeit des Verfahrens von dem eingangs angegebenen Stand der Technik (
DE 10 2008 029 356 A1 und
DE 10 2008 061 714 A1 ) profitiert werden, weil durch die Einstellung von neutralen chaotropen Bedingungen auch die vorrangige Isolierung von RNA möglich wird.
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Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung wird im Schritt b) als Lyseenzym eine Proteinase K-Lösung verwendet. Diese kann beispielsweise aus dem Siemens Reagenzienkit Versant SP1.0 entnommen werden (Reagenzienkit im Folgenden auch kurz als Kit bezeichnet). Diese wird in einem Verhältnis Probe inklusive Puffer:Versant SP1.0 Proteinase K-Lösung von 105:1 bis 23:1 bevorzugt 52,5:1 gemischt. Bei dem Versant SP1.0 Kit handelt es sich vorteilhaft um eine erprobte Reagenzien-Zusammenstellung, die einfach in der Anwendung ist. Allerdings ist es vorteilhaft, den Lyse-Puffer aus den SP1.0-Kit für die Aufarbeitung von Vollblut nicht zu verwenden. Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, dass sich die Ausbeute an RNA steigern läst, wenn stattdessen ein Lyse-Puffer mit einem pH-Wert zwischen 6 und 8 verwendet wird. Der pH-Wert des SP1.0-Lyse-Puffers liegt jedoch bei ca. 4.
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Genauso kann im Schritt c) zur Dispersion die Siemens Versant SP1.0 MagBeads-Lösung in einem Verhältnis Probe inklusive Puffer:Versant SP1.0 MagBeads-Lösung von 70:1 bis 6:1, bevorzugt 42:1 verwendet werden. Der Schritt kann vorteilhaft mit den Waschpuffern 1 bis 3 des Siemens Versant SP1.0 Reagenzienkits durchgeführt werden.
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Gemäß besonderen Ausführungen der Erfindung können für den Schritt a) als chaotropes Reagenz Guanidinium-Thiocyanat und/oder Harnstoff und/oder Phenol und/oder Bariumsalze und/oder Perchlorate mit einer Gesamtkonzentration von mindestens 1 und höchstens 10 Mol/Liter verwendet werden. Weiterhin ist es vorteilhaft möglich, dass im Schritt f) der Elutionspuffer des Siemens Versant SP1.0 Reagenzienkits verwendet wird. Vorteilhaft läuft das Verfahren automatisiert ab, so dass keine manuellen Schritte vorgenommen werden müssen. Dies führt dazu, dass Bedienungsfehler minimiert oder sogar ausgeschlossen werden können. Außerdem ist eine großtechnische Anwendung des Verfahrens vorteilhaft möglich, so dass auch die Wirtschaftlichkeit des Untersuchungsverfahrens verbessert wird.
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Gemäß einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung kann vorgesehen werden, dass zusätzlich im Anschluss an das bisher beschriebene Verfahren folgende Schritte durchgeführt werden. Es wird DNase zugesetzt und die Probe inkubiert. Anschließend wird die DNase durch Tiefkühlen inaktiviert. Hierdurch gelingt es vorteilhaft, DNA-Moleküle, welche zu einem gewissen Anteil auch an die magnetischen Beads gebunden wurden, zu zerstören.
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Besonders vorteilhaft können Beads verwendet werden, die mit Siliziumdioxid beschichtet sind. Diese sind vorteilhaft in besonderem Maße geeignet die zu isolierende RNA anzulagern. Die Herstellung der Partikel kann z. B. durch Beschichtung von Magnetpartikeln erfolgen. Derartige Produkte werden aber auch von der Firma Bayer AG unter dem Produktnamen Bayoxide E fertig angeboten. Weitere Angaben zur Beschichtung dieser Partikel können beispielsweise der
DE 10 2008 029 356 A1 entnommen werden.
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Zuletzt wird die eingangs angegebene Aufgabe auch durch einen Kit zur Durchführung des Verfahrens, wie es vorstehend beschrieben wurde, gelöst, wobei dieser Kit ein chaotropes Lyse-Puffersystem und magnetische Beads aufweist. Das Lyse-Puffersystem und die magnetischen Beads können in der oben angegebenen Weise zusammengestellt werden. Insbesondere liefert der Versant SP1.0 Reagenzienkit der Firma Siemens gut geeignete Ausgangsstoffe für die Erstellung eines solchen Kits. Allerdings ist die Erstellung des Kits nicht auf diese genannten Ausgangsstoffe beschränkt. Der Kit ermöglicht vorteilhaft die einfache Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, da die Reagenzien in der richtigen Menge und Zusammenstellung auf einfachem Wege beschafft werden können und man nicht auf eigene Versuche zur Anpassung der Erfindung angewiesen ist.
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Weitere Einzelheiten der Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnung beschrieben. Gleiche oder sich entsprechende Zeichnungselemente sind jeweils mit den gleichen Bezugszeichen versehen und werden nur insoweit mehrfach erläutert, wie sich Unterschiede zwischen den einzelnen Figuren ergeben. Es zeigen:
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1 bis 4 ausgewählte Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens als schematische Darstellung.
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Die Prozedur startet mit den Schritten gemäß 1. Zwecks einer besseren Übersichtlichkeit sind die im Folgenden aufgeführten Schritte allerdings stärker gegliedert.
- 1. Es wurde ein Sample Preparation Modul der Siemens Versant kPCR vorbereitet (nicht dargestellt).
- 2. Dessen Roboterplattform wurde manuell mit Puffern, Reagenzien, Probenröhrchen, Plastikware (Spitzen, Reaktionsplatten, soweit zur Bearbeitung notwendig) bestückt.
- 3. Dann wurde der Lauf manuell gestartet (Anwahl des entsprechenden Programms in der Software)
- 4. Während des Laufes wurden alle Komponenten (s.o.) automatisch eingezogen und durch Scannen auf korrekte Position überprüft; die Reagenzvolumina wurden ebenfalls automatisch überprüft.
- 5. Jede Probe wurde in einem eigenen Well 11 einer 96er-Deep-Well-Platte (im Folgenden kurz DWP) prozessiert, wobei das folgende Vorgehen bei jeder einzelnen Probe zur Anwendung kam.
- 6. 200 µl frisches oder vollständig aufgetautes humanes Vollblut B wurden in der Haupt-DWP 12 mit 20 µl Proteinase K PK aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit vereinigt.
- 7. In einer zweiten Hilfs-DWP 13 wurde eine Mischung aus einem neutralen chaotropem Lyse-Puffer LB enthaltend Guanidinium-Thiocyanat und/oder Harnstoff und/oder Phenol und/oder Bariumsalze und/oder Perchlorate und Siemens MagBead-Lösung MB aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit hergestellt.
- 8. Die Lysepuffer-Bead-Mischung wurde aus der Hilfs-DWP 13 abgesaugt und zur Blut/Proteinase K-Mischung in der Haupt-DWP 12 gegeben: Das resultierende Gemisch pro Well 11 bestand aus 200 µl Blut, 20 µl Proteinase K, 25 µl MagBead-Lösung und 850 µl Lyse-Puffer.
- 9. Es erfolgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf einen Heater/Shaker 14 (zum Heizen/Schütteln) und die Inkubation bei Raumtemperatur und 1100 rpm für 15 Min.
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In 2 werden folgende Schritte dargestellt.
- 10. Es erfolgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf einen Magneten 15 und eine vollständige Magnetisierung der Beads. Die Magnetisierungszeiten schwanken gewöhnlich zwischen 1 und 7 Minuten um eine vollständige Magnetisierung zu erhalten. Unter einer vollständigen Magnetisierung ist ein Magnetisierungsgrad zu verstehen, der ausreicht, damit die magnetischen Beads im Magnetfeld der Anlage fixiert werden können. Diese Angaben gelten auch für die folgenden Magnetisierungsschritte dieses Protokolls.
- 11. Es folgte ein Absaugen des Überstands 16 in ein Abfallbehältnis 17. Bei dem Überstand handelt es sich um die Blutbestandteile, die nicht von den Beads festgehalten werden und als Verunreinigungen der zu untersuchenden Probe aufzufassen sind.
- 12. Es folgte der Transfer der DWP auf eine Parkposition und Zugabe von 850 µl W1-Waschpuffer WB aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit.
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Die Schritte gemäß 2 wurden zur Verbesserung der Aufreinigung der Probe mehrfach wiederholt, und zwar im Einzelnen:
- 13. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf den Magneten und die vollständige Magnetisierung der Beads.
- 14. Es folgte ein Absaugen des Überstands 16 in das Abfallbehältnis 17.
- 15. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf eine Parkposition und Zugabe von 850 µl W2-Waschpuffer aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit.
- 16. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf Magneten und die vollständige Magnetisierung der Beads.
- 17. Es folgte ein Absaugen des Überstands 16 in das Abfallbehältnis 17.
- 18. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf eine Parkposition und Zugabe von 850 µl W3-Waschpuffer aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit.
- 19. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf Magneten und die vollständige Magnetisierung der Beads.
- 20. Es folgte ein Absaugen des Überstands 16 in das Abfallbehältnis 17 (die Schritte 18–20 können gegebenenfalls auch mehrmals wiederholt werden).
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Der weitere Verfahrensablauf ist in 3 dargestellt:
- 21. Es folgte die Zugabe des Elutionspuffers EB aus dem Siemens Versant SP1.0-Kit.
- 22. Es folgte der Transfer der Haupt-DWP 12 auf den Heater/Shaker und Inkubation bei 74 °C und 1400 rpm für 5 Min.
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In 4 ist folgender weiterer Verfahrensablauf dargestellt:
- 23. Es folgte der Tranfer der Haupt-DWP 12 auf den Magneten 15 und die vollständige Magnetisierung der Beads.
- 24. Es folgte der Transfer des Überstands 16 in ein sauberes Probengefäß 18 bzw. der Transfer eines Teils des Eluats in eine PCR-Platte 19.
- 25. (optional) Es folgte ein DNase-Verdau, d. h. die Zugabe einer DNase/Puffer-Lösung DNB zum Eluat und Inkubation bei 37 °C für 30 Min, ohne zu schütteln. Anders als in 4 dargestellt kann die DNase/Puffer-Lösung DNB auch dem Probengefäß 18 zugesetzt werden, was den Verfahrensablauf vorteilhaft vereinfacht.
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Nicht dargestellt ist der Abschluss der Prozedur:
- 26. Es folgte ein Ausfahren aller Komponenten auf die Roboterplattform.
- 27. Es folgte ein manuelles Entladen des Roboters, Lagern bzw. Weiterverarbeiten der Eluate. Die Lagerung erfolgt allgemein (auch zur Inaktivierung der DNase) durch Einfrieren der Proben bei –80 °C.
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Mit dem beschriebenen Protokoll konnte in ausreichender Menge RNA aus Vollblut isoliert werden. Die Eluate waren allerdings nicht glasklar. Allerdings haben die leichten Verunreinigungen die anschließend durchgeführte Detektionsmethode der PCR nicht beeinflusst. Abhilfe kann diesbezüglich ein stärkeres Mischen der Probe in den Schritten 12, 15 und 18 schaffen. Die Schritte 18 bis 20 könnten außerdem wiederholt werden um den Reinigungseffekt zu verstärken.
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Die Volumina der Waschpuffer wurden wie oben angegeben gewählt. Allerdings kann in den Schritten 12, 15 und 18 jeweils die Menge auf bis zu 450 µl reduziert werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 102008061714 A1 [0002, 0005]
- DE 102008029356 A1 [0002, 0005, 0010]
