NO320117B1 - Fremgangsmate for fremstilling av en arakidonsyreinneholdende olje, der oljen inneholder triglycerider, umodifisert sopptriglyceridolje og anvendelse derav. - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte for fremstilling av

en arakidonsyreinneholdende olje, der oljen inneholder triglycerider, umodifisert sopptriglyceridolje og anvendelse derav.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Arakidonsyre (ARA) er en langkjedet flerumettet fettsyre (PUFA) i omega-6-klassen (5, 8, 11, 14-eicosatetraen-syre, dvs. 20:4). ARA er den mest forekommende C20 PUFA i menneskekroppen. Den er svært alminnelig i organer som muskel og blodvev og spiller en hovedrolle som et strukturelt lipid hovedsakelig forbundet med fosfolipider i blod, lever, muskler og andre hovedorgansystemer. I tillegg til den primære rolle som et strukturelt lipid er også ARA den direkte forløper for flere sirkulerende eicosanoider, slik som prostaglandin E2(PGE2), prostasyklin I2 (PGI2) , tromboxan A2 (TXA2) og leuko-triener B4 (LTB4) og C4 (LTC4) . Disse eicosanoider har regula-toriske virkninger på lipoproteinmetabolisme, blodrheologi, vaskulær tonus, leucosyttfunksjon og blodplateaktivering.

Til tross for dens betydning for human metabolisme

kan ikke ARA syntetiseres de novo i mennesker. ARA syntetiseres ved elongering og avmetting av linolsyre (LOA), en essensiell fettsyre. Prosessen krever tilstedeværelse av enzymet A6-desaturase, et enzym som er tilstede i menneskekroppen i små mengder, Burre et al., Lipids, 25:354-356 (1990). På. grunn av dette må de fleste ARA tilføres gjennom kosten og dette er spesielt viktig under perioder med rask kroppsvekt, slik som i barndommen.

I løpet av de første leveår kan et barn doble eller tredoble sin vekt. Som følge av dette kreves forhøyede nivåer av ARA i den daglige kost. For å tilfredsstille dette økte behov inneholder human brystmelk store mengder ARA. Sanders et al., Am. J. Clin. Nutr., 31:805:813 (1987). ARA er den mest alminnelige C2o PUFA i brystmelk. Mange av de mødre som ammer sine barn, særlig vegetarianere, ville ha fordel av tilsetning av ARA i kosten. Mange mødre ammer imidlertid ikke sine barn, eller ammer ikke gjennom hele perioden med rask vekst av barnet, og velger isteden å benytte en morsmelkerstatning.

Ingen kommersielle morsmelkerstatninger som er kjent for søkeren inneholder ARA i triglyceridform. U.S. patent nr. 4670285 (Clandinin et al.), beskriver barns behov for fettsyrer deriblant ARA. For å tilveiebringe disse fettsyrer foreslår Clandinin et al. en blanding av eggeplomme, fiskeolje eller fosfolipider fra røde blodceller og vegetabilske oljer, som fettkomponenten i en foreslått morsmelkerstatning. Fiskeolje inneholder imidlertid store mengder av eicosapentansyre (EPA). Det er kjent at EPA senker ARA-syntese hos barn. Carlson, et al., INFORM, 1:306 (1990). Av denne grunn er det ønskelig at det var mulig å tilveiebringe ARA uten å samtidig tilføre ytterligere EPA. Dessuten inneholder eggeplommer en relativt lav konsentrasjon av ARA, slik at blandingen til Clandinin et al. ikke er økonomisk gj ennomførbar.

Ettersom ARA er til stede i animalske oljer, men ikke i vegetabilske oljer har fremstilling i kommersielle mengder forblitt et ønskelig, men vanskelig mål. Shinmen, et al., Microbiol. Biotech. 31:11-16 (1989) har beskrevet fremstillin-gen av ARA ved hjelp av en isolert sopp, Mortierella alpina, ved anvendelse av vanlig fermentering i kolbe med bevegelse.

(Se også japansk patent 1215245 til Shinmen et al.). Etter dyrking høstes organismene og tørkes og deres lipider ekstraheres fra soppbiomassen med et organisk løsningsmiddel og lipidene modifiseres kjemisk (kovalent). Lipidblandingen kan for eksempel hydrolyseres eller forandres til etylestere for så å kombineres med syklodekstrin før anvendelse som et kosttilskudd. Shinmen et al. hverken beskriver eller foreslår administrering av umodifiserte mikrobielle oljer.

Porphyridium cruentum, en rød mikroalge, kan dyrkes i dammer i store mengder og har et lipidinnhold som kan inneholde opp til 40 % ARA. Ahern, et al. Biotech. Bioeng. 25:1057-1070 (1983) . Dessverre er ARA i det vesentlige forbundet med galaktolipider, et sammensatt polart lipid som ikke er til stede i brystmelk. Dermed utgjør ikke bare den totale anvendbare ARA en fremstilt fraksjon på 1 % av biomassen, men ARA-formen er ikke egnet som en tilsetning i morsmelkerstatninger uten ytterligere modifisering.

US patent nr. 4870011 (Suzuki et al.) beskriver en fremgangsmåte for å erholde lipider, slik som Y~lin°lsyre fra soppslekten Mortierella. Y-lin°lsyren renses fra lipidblandingen i soppen.

DE 3603000A1 (Milupa) beskriver en meget flerumettet fettsyreblanding og anvendelse av denne som fettkomponenten i en morsmelkerstatning. Fettblandingen har et høyt innhold av henholdsvis ARA og docosaheksansyrer (DHA) i et forhold på 2,5:1, i tillegg til et stort innhold av kolesterol. Fettsyre-kildene er angitt å være visse typer av makroalger, fiskeoljer, organiske fettypen fra okse og gris eller høyrenset eggeplommeolje. En kilde til DHA og ARA er angitt å være makroalger av faecofytt og rhodofytt-typene. Det foreslås ikke å anvende noen mikrober som en oljekilde. Alge- og fiskeoljer omfatter også vanligvis EPA som hemmer ARA-syntese in vivo. Dessuten er ikke høyrenset eggeplommeolje en økonomisk ARA-kilde. Dessuten er det ikke gjort rede for et ARA-konsentrert additiv for supplementering til ferdig morsmelkerstatning.

WO-A 1-9213086 vedrører fremstilling av arakidonsyreinneholdende olje som i det vesentlige er fritt for EPA, imidlertid omfatter publikasjonen ikke dyrknings-manipulering av pH-betingelser for å øke ARA-innholdet i kulturen av ekstraherbar triglyceridolje.

Kyle, D. et al., "Ind. Appl. Singel Cell Oils", 1992, AOCS, Campaign, 111., s. 118-138, vedrører en triglyceridolje fra sopp inneholdende mer enn 4 0 % av en arakidonsyre og, avhengig av fermenteringstemperaturen, var EPA fraværende fra produktet. Publikasjonen beskriver imidlertid ikke anvendelse av Mortierella alpina stamme 1S-4 .

Følgelig er det et behov for en økonomisk, kommersielt gjennomførbar fremgangsmåte for fremstilling av ARA, fortrinnsvis uten samtidig fremstilling av EPA. Det er en målsetning med foreliggende oppfinnelse å tilfredsstille dette behov.

Det er også en målsetning med foreliggende oppfin-neise å tilveiebringe et additiv og en kilde for dette additiv, for anvendelse i en morsmelkerstatning slik at ARA-nivåene i formuleringen nærmer seg de samme nivåer som i human brystmelk.

En ytterligere målsetning med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en ARA-inneholdende soppolje for anvendelse i enterale, parenterale eller dermale produkter.

Oppsummering av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører fremgangsmåte for fremstilling av en arakidonsyreinneholdende olje, der oljen inneholder triglycerider hvori minst 25 % av fettsyrerestene er arakidonsyre (ARA) og mengden av eicosapentansyre (EPA)-restene i oljen ikke overskrider en femtedel av mengden av arakodonsyre (ARA)-restene, omfattende: (a) dyrking av Mortierella sp. i en fermentor med lufting, inneholdende kulturmedium; (b) opprettholdelse av pH mellom 5 og 6 i starten av dyrkingen; (c) opprettholdelse av pH mellom 7 og 7,5 i slutten av dyrkingen; og (d) innhøsting av biomasse fra fermentoren og utvin-ning av den arakidonsyreinneholdende olje fra biomassen.

Oppfinnelsen omfatter også umodifisert sopptriglyceridolje, betegnet ved at mer enn 50 % av fettsyrerestene er arakidonsyre (ARA)-rester til stede i triglyceridform, og hvori oljen ikke omfatter mer enn én tiendedel eidosapentansyre (EPA) i forhold til ARA. Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge oppfinnelsen for å tilveiebringe triglyceridinneholdende arakidonsyre (ARA) til en morsmelkerstatning, hvor den umodifiserte sopptriglyceridoljen tilsettes til morsmelkerstatningen i en mengde som er tilstrekkelig til å tilveiebringe et arakidonsyre(ARA)-innhold tilsvarende mengden av arakidon-syre (ARA) i human brystmelk. Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge oppfinnelsen for fremstilling av en morsmelkerstatning, som omfatter triglyceridinneholdende arakidonsyre (ARA) i en mengde som kan sammenlignes med mengden i human brystmelk, hvorved arakidon-syre (ARA) tilveiebringes ved tilføring til morsmelkerstatningen av en tilstrekkelig mengde av den umodifiserte sopp-triglyceridol jen.

Også omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et preparat for tilveiebringelse av supplerende arakidonsyre (ARA) til et menneske med dette behov, hvorved den umodifiserte sopptriglyceridoljen formuleres i en farmasøytisk akseptabel doseform for å tilveiebringe en mengde arakidonsyre (ARA) som er effektiv til å tilveiebringe supplerende arakidonsyre (ARA) til mennesket. Oppfinnelsen omfatter videre anvendelsen av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et kosmetisk preparat, hvorved preparatet oljen er til stede i preparatet i en mengde som er effektiv til å understøtte opprettholdelse av hudfarge, når preparatet anvendes topisk.

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Med henholdsvis "ARA" og "EPA", som anvendt heri menes rester av hennholdsvis arakidonsyre og eicosapentansyre der restene er esterifisert med glyserol som en del av et fettacyltriglycerid eller et fosfolipid. Et preparat "mangler i det vesentlige EPA", som anvendt heri, når den resterende mengde av EPA i preparatet er mindre enn mengden som hemmer ARA-syntese når preparatet anvendes som et næringstilskudd. Med foreliggende oppfinnelse har det lykkes å tilveiebringe en økonomisk arakidonsyre (ARA)-kilde.

Med "mangler i det vesentlige", som anvendt heri, menes at EPA er til stede i en mindre mengde enn ca. én femtedel av ARA-mengden i oljen. Denne olje, en enkeltcelleolje, kan administreres direkte i en umodifisert form. Med "umodifisert", som anvendt heri, menes at de kjemiske egenskaper til fettsyrene, eller oljene ikke er blitt kovalent forandret. Dette innebærer for eksempel at en midlertidig modifisering til ARASCO eller ARA som kan reverseres etter opptak av oljen er innen rammen av foreliggende oppfinnelse.

Umodifiserte soppoljer ifølge oppfinnelsen tilveiebringer triglycerider hvor en relativt stor andel av fettsyrerestene er ARA (fortrinnsvis minst 40 % av fettsyrerestene er ARA, mer foretrukket minst 50 % av restene er ARA), og forholdet mellom ARA-restene og EPA-restene er også høy (minst 5:1, fortrinnsvis minst 20:1, vekt/vekt). En slik olje fra naturlige kilder er ikke beskrevet forut for foreliggende oppfinnelse. Mens triglycerider med en slik sammensetning kan syntetiseres kjemisk (for eksempel ved esterifisering av frie fettsyreblandinger med mye ARA eller transesterifisering med etylestere av en slik fettsyreblanding), kan modifisering av fettsyreblanding (f.eks. rensing, esterifisering, etc.) intro-dusere uønskede biprodukter. I motsetning tilveiebringer fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen triglycerider med ønsket sammensetning ved hjelp av ekstråksjon fra naturlige kilder.

Av de sopparter der fettsyrene til disse tidligere er karakterisert, er det funnet at de fleste ikke danner ARA. Weete, J. D., Fungal Lipid Biochemistry, Plenum Press, N.Y.

(1974). Av de arter som produserer ARA produserer mange, deriblant alle tidligere karakteriserte Pythium arter, signifikante mengder av eicosapentansyre (EPA) i tillegg til ARA. I Tabell 1 vises fettsyreprofilen til P. insidiosum sammen med fettsyreprofilen til andre sopparter. Det er uventet funnet at P. insidiosum produserer ARA uten forurensende produksjon av EPA. Høye EPA-nivåer i kosttilskudd resulterer i likhet med fiskeoljer i en reduksjon i evnen til å danne ARA fra linolsyre i kosten (LOA). Mens de sopparter som produserer både ARA og EPA kan anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er det å foretrekke å anvende arter som ikke produserer signifikante mengder av EPA. Slike foretrukne arter omfatter Pythium insidiosum og Mortierella alpina. Begge arter er kommersielt tilgjengelige og er deponert i the American Type Culture Collective in Rockville, Maryland med respektivte aksesjonsnumre 28251 og 42430. P. insidiosum og M. alpina er anvendt som representative sopparter i denne beskrivelse. Selvfølgelig er også andre sopparter som produserer triglycerider inneholdende ARA og redusert EPA, som beskrevet heri er også omfattet av foreliggende oppfinnelse. Étt av de betydelige problemene som overvinnes med foreliggende oppfinnelse er reduksjonen i ARA-biosyntese hos barn forårsaket av tilstedeværelsen av forhøyede mengder EPA i kosten. Dette problem kan løses ved å tilføre ARA til morsmelkerstatninger i mengder som i det vesentlige er lik det som finnes i human brystmelk. I human brystmelk er vanligvis forholdet mellom henholdsvis ARA:EPA 20:1. Foreliggende oppfinnelse omfatter spesifikt enhver mikrobiell olje som tilveiebringer en tilstrekkelig mengde av ARA for å overvinne de negative virkninger av EPA i kosten. Anvendelsen av ARA-inneholdende olje vil resultere i et ARA:EPA-forhold på fortrinnsvis minst 5:1. Mer foretrukket ville et forhold på minst ca. 10:1 og mest foretrukket ville et forhold på minst ca. 20:1 være. Det kan se ut til at jo høyere mengde av ARA det er i det endelige produkt, med hensyn til mengde av EPA, jo bedre

blir resultatet.

Ved en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen dyrkes soppen under egnede dyrkingsbetingelser for produksjon av ARA-inneholdende olje. Generelt er teknikker for soppdyrking godt kjent for fagfolk på området og disse teknikker kan anvendes ved foreliggende fremgangsmåte. Dyrking av en inokulerende soppmengde kan for eksempel skje i kultur i vann i ristekol-ber. Kolbene tilveiebringes med et vekstmedium, inokuleres med soppmycelium og dyrkes på en frem- og tilbakegående rister i ca. tre til fire dager.

Sammensetningen av vekstmediet kan variere, men må alltid inneholde karbon- og nitrogenkilder. En foretrukket karbonkilde er glukose i mengder som kan variere fra ca. 10-100 gram glukose pr. liter vekstmedium. Vanligvis anvendes ca. 15 gram pr. liter ved ristekolbekultur. Mengden kan variere avhengig av ønsket tetthet i den endelige kultur. Andre karbonkilder som kan anvendes omfatter melasse, maissirup med mye fruktose, hydrolysert stivelse eller enhver annen vanlig karbonkilde til lav pris anvendt ved fermenteringsprosesser. Dessuten kan laktose tilveiebringes som en karbonkilde for P. insidiosum. Mysepermeat, som inneholder mye laktose og som er en meget billig karbonkilde, kan derved anvendes som et sub-strat. Egnede mengder av disse karbonkilder kan bestemmes med letthet for fagfolk på området. Vanligvis må ytterligere karbon tilsettes i løpet av dyrkningstiden. Dette fordi organismene forbruker så mye karbon at tilsetning av alt i en sats kunne være uhåndterlig.

Nitrogen tilveiebringes vanligvis i form av gjærekstrakt, i en konsentrasjon fra ca. 2 til ca. 15 gram ekstrakt pr. liter vekstmedium. Fortrinnsvis tilsettes ca. fire gram pr. liter. Andre nitrogenkilder kan anvendes, deriblant pepton, trypton, mais bløtgjort i væske, soyamel, hydrolysert vegetabilsk protein, etc. Tilsatt mengde av disse kilder kan med letthet bestemmes av fagfolk på området. Nitrogen kan tilsettes satsvis, dvs. alt på en gang forut for dyrkning.

Etter dyrking i 3-4 dager ved en egnet temperatur, vanligvis ca. 25-30 °C, er en tilstrekkelig mengde sopp vokst til å anvendes som et inokulum i en vanlig fermenteringstank ved bevegelse (STF). Slike fermentorer er kjent for fagfolk på området og er kommersielt tilgjengelige. Fermentering kan utføres i sats, sats med tilføring eller på kontinuerlige fermenteringsmåter. Fortrinnsvis bør STF være utstyrt med en marin impeller, selv om en Rushton-turbinimpeller også kan anvendes.

Fermentoren behandles ved å tilsette de ønskede karbon- og nitrogenkilder. En 1,5 liters fermentor kan for eksempel behandles ved å blande ca. 50 gram glukose og ca. 15 gram gjærekstrakt pr. liter kranvann. Som diskutert tidligere kan andre karbon- og nitrogenkilder eller blandinger derav anvendes.

Reaktoren inneholdende næringsløsningen bør sterili-seres, for eksempel ved oppvarming forut for inokulering. Etter avkjøling til ca. 30 °C kan inokulummet tilsettes og dyrking startes. Gassutveksling utføres ved luftspredning. Luftspredningsgraden kan variere, men bør fortrinnsvis justeres fra ca. 0,5 til ca. 4,0 WM (luftvolum pr. fermentorvolum pr. minutt). Nivået av oppløst oksygen holdes fortrinnsvis på fra ca. 10 % til ca. 50 % av luftmetningsverdien til oppløsningen. Følgelig kan justeringer i spredningsgraden være krevet under dyrkingen. Bevegelse er ønskelig. Bevegelsen tilveiebringes av impelleren. Bevegelsesperiferihastigheten settes fortrinnsvis innen et nivå fra ca. 50 cm/sek til 500 cm/sek, fortrinnsvis fra ca. 100 til 200 cm/sek.

Generelt kan inokulummengden variere. Vanligvis kan fra ca. 2 volum% til ca. 10 volum% inokulum anvendes. Fortrinnsvis kan ca. 5 volum% podestoff anvendes i et fermentorså-ingsspreder (seed train).

Næringsnivåene bør kontrolleres. Når glukosenivåene synker under 5 g/l bør ytterligere glukose tilsettes. Ved en vanlig dyrkningssyklus anvendes ca. 100 gram glukose og ca. 25 gram gjærekstrakt pr. liter. Det er vanlig å redusere nitro-genmengden i løpet av dyrkingen ettersom dette fremmer ol-jeproduksjonen fra soppen. Dette gjelder særlig når M. alpina anvendes som produksjonsorganisme.

I en særlig foretrukket utførelsesform kan Mortierella alpina med høyt oljeinnhold, i tillegg til høye nivåer av

ARA, dyrkes i en fermentor ved anvendelse av meget høye næringsnivåer. Det ble uventet oppdaget at nivåene av nitrogenin-neholdende næringsstoff i overskudd av det tilveiebragt ved 15 gram/liter gjærekstrakt kan tilsettes i starten av fermenteringen så lenge som den totale mengde av karboninneholdende næringsstoff tilsatt i løpet av fermenteringen er tilsvarende høy. Den totale mengde av karbonnæringsstoff, fortrinnsvis tilført kontinuerlig eller med avbrudd i løpet av de første 24-50 % av fermenteringstiden eller i aliquoter ved flere tidspunkter i løpet av samme tidsperiode, vil fortrinnsvis tilsvare 75-300 gram glukose pr. liter kulturmedium (C:N-forhold >5:1, uttrykt som vekt/vekt glukose:gjærekstrakt). Det er særlig foretrukket at nitrogennæringsmidlet er soyamel, tilsatt i en mengde på ca. 16 gram pr. liter medium og kar-bonnæringsstof f et er innledningsvis til stede i en mengde tilsvarende ca. 80 gram glukose eller mer. Ved anvendelse av store mengder karbon- og nitrogennæringsstoffer er det ønskelig å sterilisere løsninger inneholdende de to næringsmidde1-oppløsninger separat. Det er også oppdaget at biomasseutbyttet kan økes for fermenteringer inneholdende store mengder av karbonnæringsstoffer ved å holde tilbake en del av nitrogen-næringsstof f et og tilføre det resterende nitrogennæringsstoffet kontinuerlig eller i én eller flere aliquoter i løpet av fermenteringstiden.

Av og til produserer kulturen en overskuddsmengde av skum. Eventuelt kan et antiskummende middel, slik som de kjent for fagfolk på området, for eksempel Mazu 310 eller vegetabilsk olje tilsettes for å forebygge skum.

Temperaturen i kulturen kan variere. Sopp som produserer både ARA og EPA ser ut til å produsere mindre EPA og mer ARA når de dyrkes ved høyere temperaturer. Når for eksempel Mortierella alpina dyrkes under 18 °C begynner EPA å produ-seres. Av denne grunn er det ønskelig å holde temperaturen på et nivå som induserer foretrukket produksjon av ARA.' Egnede temperaturer er vanligvis fra ca. 25 °C til ca. 30 °C.

Dyrking fortsetter fortrinnsvis inntil en ønsket biomassetetthet oppnås. En ønskelig biomasse er ca. 25 g/l av organismen. En slik biomasse oppnås vanligvis innen 48-72 timer etter inokulering. På dette tidspunkt inneholder organismene vanligvis ca. 5-40 % komplekse lipider, dvs. olje, der ca. 10-40 % er ARA eller fortrinnsvis minst 40 % er ARA-rester i triglyceridfraksjonen, mer foretrukket minst 50 % ARA i triglyceridfraksjonen, som så kan innhøstes.

Soppfermentering for produksjon av ARA ifølge oppfinnelsen kan utføres i fermenteringsmedium med pH mellom ca. 5 og 8. Utbytter av biomasse, olje og ARA fra M. alpina-kulturer kan imidlertid økes ved profilering? av pH i mediet fremfor å tillate ukontrollert økning av pH. Utbytter kan også økes ved å ha høye oksygennivåer under fermenteringen. 'Disse modifika-sjoner i fermenteringsprosedyren er spesielt effektive ved anvendelse av høye næringsnivåer i fermentoren.

Når det innledningsvise nitrogennæringsmiddelnivået overskrider ekvivalenten på ca. 15 gram gjærekstrakt pr. liter og/eller karbonnæringsmiddelnivået overskrider ekvivalenten på ca. 150 gram glukose pr. liter kan soppveksten hemmes. Denne veksthemming kan overvinnes ved tilføringssatsfermentering, for eksempel ved å dele opp næringsmidlet ved fermenteringen inn i aliquoter som tilføres regelmessig til fermentoren når noe eller alt næringsstoffet, tilført ved den tidligere aliquot, er metabolisert. Fordelen med å overvinne vekstinhibering kan oppnås ved tilføring av kun karbonnæringsstoffet (se Shinmen et al.). Det har blitt oppdaget at denne fordel også kan erholdes ved oppdeling av det totale næringsstoff i aliquoter og tilføre aliquotene i løpet av fermenteringen, eller ved tilføring av næringsstoffløsningen kontinuerlig. Det har likeledes uventet blitt oppdaget av denne fordel kan oppnås ved tilføring av nitrogennæringsstoffet kun til fermentering er der karbonnæringsstoffet innledningsvis er til stede i et høyt nivå.

Det er også uventet oppdaget av vekstinhibering kan dempes ved pH-profilering av fermenteringen eller ved opprettholdelse av høyt oksygentrykk i fermentoren, eller begge deler. Det er oppdaget at fermentering av M. alpina i høyt næringsmiddelmedium ved lav pH (pH = 5-6) resulterer i øket biomassevekt (og også øket oljeutbytte). Oljen fremstilt under disse betingelser har imidlertid lavere mengder av ARA-rester i oljen. I motsetning resulterer fermentering ved høy pH (pH = 7-7,5) i økte nivåer av ARA i oljen men dårligere vekst. En foretrukket fremgangsmåte omfatter at fermenteringsfremgangs-måten ifølge oppfinnelsen involverer pH profilering der pH er lav i løpet av den tidlige fasen av fermenteringen og høy i løpet av de senere stadier. Tidligere stadier omfatter perioder med rask (eksponentiell) vekst samtidig med at nær-ingsstoffene raskt metaboliseres; sene stadier omfatter den stasjonære fase når celledeling har stoppet, vanligvis som følge av utilstrekkelige mengder av ett eller flere nærings-stoffer og produksjonen av ARA-rik olje har øket. Profilering kan utføres ved kontroll av pH i fermentoren til nivåer som justeres i to eller flere stadier spredt utover fermenterings-perioden.

Likeledes er det oppdaget at opprettholdelse av det oppløste oksygeninnhold i mediet (D.O.) på høye nivåer (f.eks.

>40 % av luftmetningsnivå) resulterer i reduksjon av vekstin-hiberingen som følge av høye næringsmiddelnivåer og/eller økning av frigjøringen av ARA-rester i oljen. D.O. kan opprettholdes på et høyt nivå ved økning av kartrykket (presse mer luft inn i fermentortopprommet), øke bevegelsen (f.eks. øke periferihastigheten til impelleren) og øke (dvs. øke mengden av luft som passerer gjennom fermentoren i løpet av en gitt tid, vanligvis uttrykt som økning i WM, luftvolum pr. fermentorvolum pr. minutt) og/eller ved å øke 02-innholdet i overluften (sparge gas). Det er funnet at fermentering under disse betingelser øker karbonforbruket, noe som resulterer i tørre endelig biomassekonsentrasjon og større produksjon av ARA-rik olje i fermentoren. Fermenteringer hvor én eller flere av de ovennevnte modifiseringer er innført resulterer særlig i produksjon av ekstraherbare triglyceridolje med minst 40 % ARA-rester og fortrinnsvis minst 50 % ARA-rester.

I en særlig ønsket utførelsesform inneholder fer-menteringsmediet karbonnæringsstoffer ekvivalent med > 80 g/L glukose og nitrogennæringsmiddel ekvivalent med > 16 g/l gjærekstrakt og mediet justeres til pH mellom 5 og 6 etter sterilisering. Etter inokulering kontrolleres pH i mediet på eller like over det innledende nivå. Etter at karbonnæringsmiddelnivået har sunket til < 60 gram glukose ekvivalent/liter (vanligvis ca. 48 timer), forandres innstilt pH-kontroll til ca. pH > 6. På eller omkring tidspunktet for når oksygenop-ptaksgraden (og/eller karbondioksidutviklingsgraden, CER) når sitt maksimum (vanligvis etter ca. 72 timer) heves innstilt verdi til pH mellom 6,5 og 7 (vanligvis økende, f.eks. i en grad på ca. 0,1 pH-enheter pr. time). pH kontrolleres så på et nivå under ca. pH = 7-7,5 i de siste stadier av fermenteringen .

I foreliggende utførelsesform opprettholdes nivået av oppløst oksygen på et minimum (D.O.) nær eller over 40 % av luftmetningsnivået, fortrinnsvis ved regelmessig økning av kartrykket til 11 psi, økning av rystingen til ekvivalenten på ca. 300 cm/sek impellerperiferihastighet, og økning av luftingen til ca. 0,5 volumenheter luft pr. fermentorvolum pr. minutt. Etter en periode med rask vekst og høyt 02-opptak av fermentorblandingen vil vekst (og 02-opptak) synke. Risting/lufting kan reduseres ved dette punkt, så lenge som D.O. opprettholdes på et høyt nivå, vanligvis over ca. 40 % luft-metting.

Ved optimalisering av fermenteringen av M. alpina som beskrevet heri er det mulig å erholde meget store utbytter av biomasse inneholdende 20-60 % olje i biomassen, der 25-70 . vekt% av oljen er ARA-rester i triglyceridform. Biomassen (og olje) kan innhøstes som beskrevet heri. Fortrinnsvis innhøstes biomassen fra fermentoren innen 48 timer etter at maksimal produktivitet er nådd, målt som gram ARA/L/dag.

Høsting kan utføres ved hjelp av enhver egnet fremgangsmåte, f.eks. slik som filtrering, sentrifugering eller spraytørking. På grunn av lavere kostnad kan filtrering være foretrukket.

Etter innhøsting kan mycelmassen ekstraheres. Mycelmassen refererer seg til oppsamlingen av biomasse som er resultatet etter innhøsting. Massen kan være løs eller pres-set, smuldrete eller ikke-smuldrete. Restvann kan eventuelt fjernes fra massen ved vakuumtørking, fluidumsengtørking, spraytørking eller lyofilisering, før ekstraksjon. Dersom dette velges er det ønskelig å anvende upolare løsningsmidler for å ekstrahere den ARA-inneholdende olje. Ethvert upolart ekstrakt er egnet, men heksan er foretrukket.

I en foretrukken utførelsesform ekstraheres olje fra den tørkede biomasse ved hjelp av våtmaling eller filtrering med ren heksan. Løsningsmidlet tilsettes vanligvis i et forhold mellom løsningsmiddel og biomasse på ca. 5:1 (vekt/vekt). Etter våtmaling separeres de faste stoffer fra ekstraktet ved hjelp av dekantering eller sentrifugering. Det er fordelaktig å holde det løsningsmiddelinneholdende ekstrakt (miscella) anaerobt for å unngå oksidering av de umettede fettsyrerester i oljen. Løsningsmidlet fjernes fra miscella for å danne en uren soppolje.

Urent oljeekstrakt fra soppbiomasse med upolar løsningsmiddel kan være grumset, særlig når biomassen er malt, fordi maling kan frigjøre fine partikler slik som celleveg-gfragmenter og oppløselige polysakkarider. Klaring av slik grumset olje kan utføres ved oppløsning av uren olje i mer polare oppløsningsmidler, slik som aceton eller alkohol. I en foretrukket utførelsesform klares urent oljeekstrakt av soppmycelium ytterligere ved hjelp av acetonekstraksjon/presipitering. En acetonmiscelle forenes ved tilføring av aceton til grumset urent oljeekstrakt (fortrinnsvis til et nivå på ca. 20 % olje; dvs. ca. 4 volumer aceton pr. volum uren olje), blandes godt og blandingen hensettes for en periode tilstrekkelig for presipitering av de fine partikler (vanligvis ca. 1 time ved romtemperatur). Den oljeinneholdende acetonmiscelle klares ved sentrifugering og/eller filtrering og fjerning av løsningsmiddel for så å danne acetonklaret soppolje. Acetonklaret soppolje er foretrukket for ytterligere bearbeidelse

(for eksempel degummiering, bleking og luktfjerning ved hjelp av vanlige teknikker) ettersom de fine partikler (fines) fremstilt i løpet av ekstraksjon av soppbiomassen vil interferere med forbedringsprosesser dersom de ikke fjernes i acetontrin-net.

En annen foretrukken utførelsesform omfatter mot-strømsekstraksjon av tørr biomasse, noe som kan utføres ved kommersielt tilgjengelige ekstraksjonsenheter, for eksempel de produsert av Crown Ironworks (Crown Mark IV) eller French, Inc., som ikke generelt anvendes for å ekstrahere vegetabilske oljer, men som er laget for å ekstrahere skitt og jord. Selv om ekstraksjonseffektiviteten ikke er så høy uten ny maling av biomassen har motstrømsekstraksjonsprosedyren fordelen av å danne færre "småpartikler" ("fines") for derved å redusere den tekniske vanskelighet med å gjenvinne en klar, renset olje.

Alternativt kan den våte masse (som vanligvis inneholder ca. 30-50% faste stoffer) smuldres og ekstraheres direkte ved anvendelse av polare løsningsmidler, slik som etanol eller isopropylalkohol, eller overkritisk væskeekstrak-sjon med løsningsmidler slik som CO2 eller NO. Fortrinnsvis oppsmuldres massene forut for ékstraksjon. Fordelen er at foreliggende oppfinnelse tillater økonomisk anvendelse av overkritisk væskeekstraksjonsteknikker. McHugh, et al., Super-critical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Slike teknikker er kjent for fagfolk på området og omfatter de tidligere anvendt, for eksempel for å fjerne koffein fra kaffebønner.

En foretrukket fremgangsmåte for vandig ékstraksjon omfatter blanding av mycelbiomassen med det polare løsnings-midlet av isopropylalkohol i en egnet reaksjonskjele. Slike kjeler er kjent. Anvendelsen av tre til seks deler av løs-ningsmiddel pr. del biomasse er ønskelig. Det er mest ønskelig at blandingen utføres under nitrogen eller ved tilstedeværelse av antioksidanter for å forebygge oksidering av ARA i lipidekstraktet. "Lipidekstrakt", "olje", "lipidkompleks" og "soppolje", som anvendt heri, er anvendt om hverandre.

Etter ékstraksjon kan blandingen filtreres for å fjerne biomassen fra løsningsmidlet inneholdende lipidekstraktet. På dette punkt kan biomassen gjenvinnes og anvendes som kosttilskudd. Med "kosttilskudd", som anvendt heri menes føde eller et additiv som kan blandes med vanlig føde, slik som korn, etc. som kan gis til dyr.

Løsningsmidlet separeres fra lipidekstraktet og kan også gjenvinnes for gjenanvendelse, ved fordampning til en egnet oppsamler, for å få det som er kalt "uren olje". Anvendelse av isopropylalkohol som løsningsmiddel fører til fjerning av alt restvann fra den urene olje ettersom fordampning fjerner vann/isopropylalkoholazeotropen som er dannet spon-

tant.

Ettersom den urene olje kan anvendes uten ytterligere behandling kan den også renses ytterligere. Fremgangsmåter, slik som de anvendt ved behandlingen av lecitin fra vegetabilske produkter og kjent for fagfolk på området, kan anvendes i dette ytterligere rensingstrinn. Slike prosesser modifiserer ikke kjemisk eller kovalent de ARA-inneholdende lipider eller ARA i seg selv.

Utbytter varierer, men er vanligvis ca. 5 gram ARA-inneholdende fosfolipid pr. 100 gram tørket mycelium. Når det gjelder Af. alpina kan ytterligere 10-50 gram triglycerid pr. 100 gram tørr mycelium erholdes. Enten kan den urene olje eller det rensede produkt anvendes for administrering til mennesker. Begge skal omfattes av definisjonen av ARASCO som anvendt heri.

En mest foretrukket målsetning ifølge oppfinnelsen er å tilveiebringe et additiv for anvendelse i humane morsmelkerstatninger, slik at konsentrasjonen av ARA i slike formuler-inger kommer nær opp til konsentrasjonen av ARA i human brystmelk. Tabell 2 sammenligner sammensetningen av fettsyrer i ARASCO med innholdet av disse i brystmelk og morsmelkerstatninger som mangler og inneholder ARASCO.

Det går frem at mengden av ARA til stede i morsmelkerstatningen tilsatt ARASCO ligger nær opp til ARA-nivåene i human brystmelk. Den totale fettsyresammensetning i morsmelkerstatningen er dessuten ikke signifikant forandret som følge av tilsetning av ARASCO. Mellom ca. 50 til ca. 1000 mg ARASCO pr. liter morsmelkerstatning kan anvendes. Spesifikk mengde av ARASCO som er krevet avhenger av ARA-innholdet. Dette kan variere fra ca. 10 til 70 % av fettsyrene i oljen. Vanligvis er imidlertid ARA-innholdet ca. 30-50 %. Oljen anvendt for supplering av morsmelkerstatninger inneholder minst 40 % av fettsyrerestene i form av ARA, mer foretrukket minst 50 % i form av ARA-rester. Når ARA-innholdet er ca. 30 % er en supplementeringsgrad på ca. 600 til 700 mg av ARASCO pr. liter morsmelkerstatning særlig foretrukket. En slik grad fortynner de allerede tilstedeværende fettkomponenter i barneformulerin-gen, slik som Similac® (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) med bare én del ARASCO til femti deler av formuleringens oljer. Likeledes kan fortynningsgrader beregnes for oljer med høyere ARA-innhold. Fortrinnsvis bør ARASCO i det vesentlige være fritt for EPA.

Når Pythium insidiosum anvendes i den beskrevne prosess er den ekstraherte ARA-inneholdende olje i det vesentlige fosfolipid. Det er imidlertid oppdaget av en signifikant mengde av triglycerid med mye ARA-rester også kan utvinnes fra P. insidiosum, dyrket som beskrevet heri. Når Mortierella alpina anvendes i prosessen utgjør den ARA-inneholdende olje i det vesentlige triglycerid. Begge former av ARASCO kan anvendes som additiver til morsmelkerstatning. Den første tilveiebringer ikke bare formularen med ARA, men også med en emul-gator, dvs. fosfatidylkolin, som vanligvis tilsettes til kommersielle formularer. Oljen fra M. alpina er sannsynligvis mer økonomisk å produsere.

Den ARA-inneholdende olje ifølge oppfinnelsen kan anvendes på mange måter i tillegg til anvendelse som et additiv i morsmelkerstatning. Som kjent for fagfolk på området finnes det mange sykdomstilstander forbundet med ARA-mangel, slik som marasmus (Vajreswari, et al., Metabolism 39:799-782

(1990), atopisk sykdom (Melnik, B., Monatsschr. Kinderheilta, 138:162:166 (1990), leversykdommer, fenylketonuri, schizofreni, tardivdyskinesi eller ulike peroksisomale forstyrrel-ser. I én utførelsesform av oppfinnelsen behandles disse sykdomstilstander ved administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av oljen ifølge foreliggende oppfinnelse. Vanligvis er den farmasøytisk effektive mengde den mengde som er krevet for å normalisere serumnivået av ARA hos pasienten. Særlig foretrukket for supplementering for behandling av slike sykdomstilstander er høy-ARA-oljene beskrevet ovenfor, særlig oljer med minst 40 % ARA eller mer foretrukket 50 % ARA-rester. Oljen kan administreres enteralt, topisk, parenteralt, dette ut fra helsepersonellets vurdering.

Innkapsling er, som kjent av fagfolk på området, en effektiv fremgangsmåte for enteral administrering. Kapsler inneholdende soppoljen kan administreres til personer som har behov for eller ønsker kosttilskudd av ARA. En slik fremgangsmåte er særlig effektiv ved administrering av ARA til gravide eller ammende kvinner.

Der for eksempel ARASCO administreres for å bekjempe ARA-svikt forbundet med sykdomstilstander, bør en farmasøytisk effektiv mengde administreres. Denne mengde kan bestemmes av fagfolk på området uten unødig eksperimentering. Vanligvis er denne mengde 0,5-2,O/dag, noe som vanligvis vil normalisere serumnivået av ARA.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen omfatter anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge oppfinnelse for fremstilling av kosmetiske preparater inneholdende ARASCO, slik som høy-ARA-oljene beskrevet heri. Kosmetiske preparater refererer seg til de forbindelser anvendt som kosmetikk. Et foretrukket eksempel på et slikt preparat er en rynkekrem. Slike kosmetiske preparater tilveiebringer en effektiv måte for topisk påføring av ARA til huden for å bistå i å opprettholde hudfarge.

Eksempel 1

Fremstilling av P. insidiosum-lipid og tilsetning til morsmelkerstatning

I en 80 liters (totalt volum) fermentor ble 51 liter kranvann, 1,2 kg glukose, 240 gram gjærekstrakt og 15 ml MAZU 210S antiskum blandet. Fermentoren ble sterilisert ved 121 °C i 45 minutter. Ytterligere 5 liter kondensvann ble tilsatt i løpet av steriliseringsprosessen. pH ble justert til 6,2 og ca. 1 liter inokulum (ved en celletetthet på 5-10 g/l) fra Phytium insidiosum (ATCC #28251) ble så tillatt. Ristehas-tigheten ble justert til 125 RPM (250 cm/sek periferihastighet) og luftingsgraden ble satt til 1 SCFM (standard kubik-kfot pr. minutt). Etter 24 timer ble luftingsgraden øket til 3 SCFM. Ved 28 timer ble ytterligere 2 liter 50 % glukosesirup (1 kg glukose) tilsatt. Ved 50 timer ble fermentoren høstet, noe som resulterte i et utbytte på ca. 2,2 kg våtvekt (ca. 15 g tørrvekt) pr. liter. Innhøstet biomasse ble trykket til en meget fast masse (50 % faststoff) på et sugefilter forut for frysetørking. Den tørkede biomasse ble malt med en morter og pistill og ekstrahert med 1 liter heksan pr. 200 gram tørr biomasse ved romtemperatur under kontinuerlig bevegelse i 2 timer. Blandingen ble så filtrert og filtratet dampet for å gi ca. 5-6 gram uren olje pr. 100 gram tørr biomasse. Biomassen ble så ekstrahert på ny med 1 liter etanol pr. 20 gram tørr biomasse i 1 time ved romtemperatur, filtrert og løsningen ble fordampet noe som ga ytterligere 22 gram uren olje pr. 100 g tørr biomasse. Den andre fraksjon var i det vesentlige fosfolipider hvor den første fraksjon inneholdt en blanding av fosfolipider og triglycerider. De kombinerte fraksjoner produ-serte en olje inneholdende ca. 30-35 % arakidonsyre og ikke påviselige EPA. Denne olje ble tilsatt dråpevis til den kommersielle morsmelkerstatning Similac (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) i en supplementeringsgrad på 60 mg pr. liter fremstilt medium.

Eksempel 2 Fremstilling av M. alpina-lipid og tilsetning

til morsmelkerstatning

Mortierella alpina (ATCC #42430) ble dyrket i en 2 liters ristekolbe inneholdende 1 liter kranvann og 20 gram potetdekstrosemedium. Kolben ble holdt i konstant orbital ' risting ved 25 °C i syv dager. Etter innhøsting ved hjelp av sentrifugering ble biomassen-frysetørket og ga ca. 8 gram lipidrik mycelium. Mycelium ekstrahert ved anvendelse av heksan som i Eksempel 1, noe som ga ca. 2,4 gram uren olje. Oljen inneholdt ca. 23 % arakidonsyre og ble tilsatt til den kommersielle formuleringen Similac dråpevis i konsentrasjoner på 1000 mg pr. liter.

Eksempel 3 Produksjon av arakidonsyre fra M. alpina

i stor skala

Inokuleringsfermentor inneholdende GYE-medium (50 g/l dekstrose og 6 g/L Tastone 154) ble inokulert med M. alpina. Fermenteringstemperatur ble satt til 28 °C, innledende risting ved 130-160 cm/sek, innledningsvis kartrykk på 6 psi og innledningsvis ristingsgrad på 0,25 WM. pH ble justert til 5,0 forut for sterilisering og innledningsvis fermenterings-pH ble satt til 5,5 etter sterilisering. Mediet ble holdt ved pH >

5,5 med 8N NaOH. Oksygennivå ble holdt ved D.O. > 40 % ved justering av risting/lufting på følgende måte: kartrykket ble øket til 11 psi; ristingen ble økt til 175 cm/sek impellerperiferihastighet; og luftingen ble økt til 0,5 VVM. Skum ble kontrollert ved tilsetning av Dow 1520-US antiskum etter behov. (Ca. 0,1 ml/L av antiskummet bør tilsettes til mediet forut for sterilisering for å hindre skumming.)

Inokulum ble overføret fra frøfermentor til hovedfer-mentor innen 12 timer etter at pH ble hevet til over 6,0.

Hovedfermentoren inneholdt GYE-medium (50 g/L dekstrose og 6 g/L Tastone 154); glukose ble sterilisert separat og tilsatt hovedfermentoren etter sterilisering. Fermentortemperaturen ble satt til 28 °C. Innledende risting til 160 cm/sek, innledende kartrykk til 6 psi og innledende luftingsgrad til 0,15 VVM. Innledende pH ble satt til 5,5 etter sterilisering og opprettholdt ved pH > 5,5 med 8N NaOH. pH ble tillatt å stige i løpet av metningsfasen (startet ca. 24 timer etter inokulering), men ble opprettholdt under pH 6,8 med H2S04-tilsetning. Oksygennivået ble opprettholdet ved D.O. > 40 % ved sekvensiell økning av kartrykket til 11 psi, økning av risting til 175 cm/sek periferihastighet og økning av luftingen til 0,5 VVM. Skumming ble kontrollert ved tilsetning av antiskum Dow 1530-US etter behov. (Ca. 0,1 ml/L av antiskummet bør tilsettes til mediet før sterilisering for å forebygge skumming).

Kulturen ble oppsamlet hver 12 time for analyse av biomasse og fettsyre, og innhøsting startet 3-4 dager etter at pH er hevet til 6,5. Tettheten av tørr biomasse bør være > 8,5 g/L. Glukosekonsentrasjonen i buljongen bør ha sunket fra 50 g/L til < 25 g/L. Ved innhøsting bør hele kulturbuljongen føres gjennom en kurvesentrifuge for å separere mycelium fra brukt medium, og biomassen tørkes.

Eksempel 4 Forbedret utbytte av biomasse fra M. alpina -

første runde

M. Alpina ble dyrket i 20 L fermenteringstanker med bevegelse, inokulert fra ristekolbekultur, ifølge fremgangsmåten i Eksempel 3. M. alpina ble dyrket i 65 g/L glukose (Staelydex) og 6 g/L i gjærekstrakt (Tastone 154), noe som førte til produksjon av 12 g/L biomasse. Tilsetningen av ytterligere 6 g/L Tastone 154 ved 16 timer resulterte i produksjon av 18 g/L biomasse.

Eksempel 5 Forbedret utbytte av biomasse fra M. alpina-

andre runde

Forsøk ble utført i et forsøk på å øke biomassen ytterligere ved ytterligere tilsetninger av Tastone 154. Disse forsøk besto av 2 X 20 L fermenteringer med en oppholdstid på 168 timer. Ved begge disse fermenteringer var den innledende glukosekonsentrasjon på 100 g/L (til sammenligning, 65 g/L i Eksempel 4). Én fermentor mottok 3X6 g/L tilføringer av Tastone 154 og til den andre ble det tilført 4X6 g/L til-føringer. Gjærekstraktet ble laget som en konsentrert oppløs-ning, autoklavert og tilført til fermentoren til ulike tidspunkter etter sterilisering.

For å forberede inokulumet ble virksomme dyrkninger (1 ml bløtlagt mycelium) inokulert i 2 kolber, hver inneholdende 50 ml GYE-medium (100 g/L Staleydex, 6 g/L Tastone 154), og dyrket i 4 dager ved 28 °C og 150 rpm. Etter 4 dager med vekst inneholdt buljongen sammenpresset biomasse; pelletene var 2-5 mm i diameter. Veksten i disse kolber var langsommere enn forventet, antakelig som følge av den høyere konsentrasjon av glukose. Biomassen ble bløtlagt i 2 X 3 sek (sees) i en Waring-blander og 25 ml av den bløtlagte masse ble anvendt for å inokulere hver på 2 X 2,8 L Fernbach inokulumkolber, i 800 ml nettovolum. (I tidligere forsøk ble 10 ml bløtgjort masse anvendt. Mengden inokulum ble øket, på grunn av den reduserte biomassetetthet i dyrkingskolben og ettersom det var forventet at veksten kunne være langsommere i Fernbachs, som følge av høyere glukosekonsentrasjon.) Mediet i Frenbachkolbene var dekstrose (Staleydex) 100 g/L og gjærekstrakt (Tastone 154), 8 g/L. Dekstrosen og gjærekstraktet ble autoklavert separat i 40 minutter. Fermenteringsdyrkingstemperaturen ble opprettholdt ved 28 °C og risting ved fra 100 til 150 rpm.

Etter 44 timers dyrking i Fernbach-kolbene ble inokulumet overført til 2 X 20 L fermentorer. Inokulumet var i form av meget løse hyfale? aggregater og tettheten til biomassen var. ca. 5,2 g/L.

Fermentorer ved stasjonene 14 og 15, inneholdende 1,6 kg (10 %) dekstrose (Staleydex), og Mazu 204 antiskum (1,6 g, oppløst i 12,5 L R.O. H20), ble sterilisert i 45 minutter ved 122 °C. 800 ml inokulum (5%) ble så tilsatt til hver fermentor (ved 0 time). Fermentoroperasjonsparametrene var:

temperatur: 28 °C.

pH: kontrollert ved 5,5 med 2 N NaOH og 2N H2S04, lufting: 0,5 VVM,

mottrykk: 0,2 bar,

risting (innledningsvis): 80 cm/sek, og D.O.: kontrollert over 40 %.

Stasjon 14: 3X5 g/L Tastone 154

Gjærekstrakt (Tastone 154) ble oppløst til en konsentrasjon på 96 g/L og autoklavert i 1 time. Gjærekstrakttil-førsler i 3 X 1 L mengder (1,8 %) ble gjort ved 1,20 og 26 timer.

Ved 15 timer sank DO til under 40 % og risting ble øket gradvis til 175 cm/sek fra 15 til 22 timer. DO ble så kontrollert ved å endre luftstrømmen med oksygen; oksygen ble tilsatt luftstrømmen fra 23 til 72 timer. Ristingen ble ytterligere øket, start ved 36 timer for å sikre passende blanding. Ved 48 timer var ristingen øket til 200 cm/sek; ved 72 timer til 250 cm/sek; og ved 80 timer til 280 cm/sek. Ved 120 timer ble ristingen øket til 290 cm/sek for å fremme tilstrekkelig temperaturkontroll. Ved 144 timer ble ristingen redusert til 280 cm/sek.

Stasjon 15 4X6 g/L Tastone 154

Gjærekstrakt (Tastone 154) 384 g ble løst i 96 g/L og autoklavert i 1 time. Tilsetninger av gjærekstrakt i 4 X 1 L-mengder (2,4 %) ble gjort ved 0,20, 26 og 32 timer.

Ved 16 timer sank DO under 40 % og ristingen ble øket gradvis til 175 cm/sek ved 23 timer. DO ble så kontrollert å være over 4 0 % ved å forandre luftstrømmen med oksygen; oksygen ble tilsatt luftstrømmen fra 23 til 72 timer. Ristingen ble ytterligere øket, startet ved 36 timer, for å sikre tilstrekkelig blanding. Ved 48 timer hadde ristingen blitt øket til 210 cm/sek; ved 72 timer, til 260 cm/sek; og ved 80 timer til 290 cm/sek. Ved 90 timer ble ristingen redusert til 280 cm/sek og ved 144 timer ble den redusert til 260 cm/sek.

Observasjoner:

Ved inokulering var biomassen i begge fermentorene meget løse, lette, hyfeaggregater. Ved 24 timer begynte pelleter å dannes. Pelletene var små (1-3 mm), med små sentrale kjerner og store og løse i periferien. Ved 48 timer var pelletene større og klarere definert. Ved 72 timer var periferiene smalere, og tilstedeværelsen av mange løse hyfale fragmenter indikerte at pelletene var fragmenterte. Ved 168 timer var pelletkjernene 0,5 til 2 mm i diameter, periferiene var redusert der hyfene var aggregert til tykke tråder og det var mange kondenserte hyfeaggregater.

Det ble kun dannet litt skum i fermentorene i de første 24 timer. Skummengden økte så og ble kontrollert ved manuell tilsetning av antiskum når skumtoppen var større enn 2-4 cm. Skummet sank noe ved 48 timer, selv om det var sporadiske utbrudd. Begge fermentorene skummet inn i utgangs-filtrene én gang i løpet av fermenteringene. Fermenteringene krevde ca. 150 ml antiskum.

Begge fermentorer akkumulerte en betydelig mengde av dannet biomasse i topprommet. Dette er ikke et uvanlig problem ved myceliumfermentering i små fermentorer med stort over-flateområde/volumforhold. Mengden av dannet biomasse i Stasjon 15 så ut til å øke i løpet av de siste 24 timer, idet det reduserte volumnivå resulterte i betydelig spruting (væske-nivået nådde toppimpelleren). Det endelige volum i fermentorene etter 168 timer var ca. 13 L.

Mikroskopisk undersøkelse viste at det ved 72 timer var mye etterlatenskaper til stede i kulturbuljongen og at det var noe tilstedeværelse av ødelagte og atropiske soppspisser. Tilstedeværelsen av oljedråper i cytoplasma ble vist ved nilrød farging ved 168 timer. Oljedråpene var meget små og mange, i motsetning til de store oljedråper som kunne obser-veres enkelte ganger. Biomasse og oljeutbytte, sammen med karbon og nitrogenforbruk er vist i Tabell 3.

Eksempel 6 Forbedret biomasseutbytte fra M. alpina -

Tredje runde

I dette forsøk ble det forsøkt å øke mengden av erholdt produkt ytterligere ved å øke mengdene av fosfat og mineraler. Fremgangsmåten var i det vesentlige lik den i Eksempel 5, bortsett fra at dekstrose og Mazu 204 antiskum ble oppløst i 11,5 L R.O. H20, fremfor 12,5 L, for å gi plass til saltløsningene som ble tilsatt ved 30 timer. Stasjon 14 mottok ytterligere Fe, Zn og Cu; Stasjon 15 mottok ytterligere fosfat, i tillegg til Fe, Zn og Cu.

Stasjon 14: 3 X 6/L Tastone 154

Gjærekstrakt ble løst i 96 g/L, i 3 X 1 L mengder og autoklavert i 1 time. Én-liter aliquoter av gjærekstraktløs-ningen ble tilsatt ved 0,22 og 28 timer. Ved 22 og 28 timer var karbondioksidutviklingsgraden (CER, en indikasjon på den metabolske grad i fermentoren) eksponentielt økende, og fermenteringen hadde akkurat begynt å kreve base).

Salttilskuddet inneholdt:

480 mg FeCl36H20

240 mg ZnS047H20

16 mg CuS045H20

FeCl3 ble løst i 1 L 5 g/L sitronsyre. De resterende salter ble tilsatt og pH justert med NaOH til 4,5. Løsningen ble autoklavert i 1 time. Tilføringen av salter ble gjort i løpet av 30 timer.

Den innledningsvise ristingsgrad i fermentoren var 50 cm/sek, istedenfor 80 cm/sek, som opprinnelig planlagt, ettersom det innledningsvise væskenivå i fermentoren (13 L) resulterte i at toppimpelleren så vidt var nedsenket og høyere bevegeslsesgrad resulterte i signifikant mer spruting. Ved 16 timer sank D.O. under 40 % og ristingen ble gradvis øket til

175 cm/sek ved 28 timer. D.O. ble kontrollert til å være over 40 % ved å forandre luftstrømmen med oksygen. Ved 4 6 timer ble ristingen øket til 190 cm/sek for å tillate blanding. Risting ble ytterligere øket til 200 cm/sek ved 48 timer, til 220 cm/sek ved 51 timer, til 235 cm/sek ved 53 timer, til 250 cm/sek ved 56 timer, til 260 cm/sek ved 57 timer og til 280 cm/sek ved 70 timer. Selv ved denne ristingsgrad (250 rpm) var blandingen dårlig. Mens et minimumskriterium på "noe bevegelse" ble opprettholdt var omsetningen av biomassen meget langsom og enkelte områder nådde stagnasjon. Tilsetningen av noen små dråper antiskum reduserte skumtoppen og fjernet stagnerte lommer. Ved 11 timer ble ristingen redusert til 265 cm/sek og ved 120 timer ble den ytterligere redusert til 250

cm/sek.

Fermenteringen begynte å skumme omtrent ved 18 timer. Skumming ble kontrollert ved hjelp av manuell tilsetning av antiskum. Antiskum ble først tilsatt ved 20 timer. Ved 24 timer var skummingen i fermenteringen signifikant og krevde regelmessig tilsetning av antiskum. Ved 72 timer hadde skummet for det meste sunket ned. Fermenteringen krevde imidlertid tidvis tilsetning av antiskum.

Ved 24 timer hadde biomassen form av meget løse pelleter. (1-2 mm) og løse hyfeaggregater. Det var en betydelig mengde av celleetterlatenskaper. Ved 48 timer hadde biomassen form av meget løse hyfeaggregater, meget små pelleter (1-2 mm) med meget små kjerner og løse periferier og små kompakte pelleter (1-3) uten løse periferier. Ved 96 timer hadde biomassen form av kompakte, runde pelleter (1-2 mm), nålformede pelleter (mindre enn 0,5 mm) og løse hyfeaggregater. Nilrød farging ved 144 timer viste tilstedeværelse av mange, meget små oljedråper i myceliumet.

Stasjon 15: 3X6 g/L Tastone 154

Gjærekstrakt ble oppløst i 96 g/L, og autoklavert i 1 time. Gjærekstraktløsningen ble tilsatt 3 X 1 L mengder ved 0,22 og 26 timer. Ved 22 og 26 timer økte CER eksponentielt og fermenteringen begynte akkurat å kreve tilsettning av base.

En salttilføring ble laget inneholdende:

FeCl3 ble oppløst i 500 ml 5 g/L sitronsyre. De resterende salter ble tillatt og pH justert med NaOH til 4,5. KH2PO4 ble oppløst i 500 ml R.O. vann. Begge løsninger ble autoklavert i 1 time og avkjølt til 23 °C før de ble blandet og tilsatt fermentoren ved 30 timer.

Innledningsristingsgraden i fermentoren var 50 cm/sek, til forskjell fra 80 cm/sek som opprinnelig planlagt, dette på grunn av at innledningsnivået av væske i fermentoren (13 L) resulterte i at toppimpelleren bare delvis var nedsenket, og den høyere ristingsgrad resulterte i signifikant mer spruting. Ved 16 timer sank D.O. til under 40 % og ristingen ble gradvis øket til 175 cm/sek ved 27 timer. D.O. ble så kontrollert til å være over 40 % ved endring av luftstrømmen med oksygen. Ved 41 timer ble ristingen øket til 200 cm/sek, for å tillate i det minste, en minimal grad av blanding. Risting ble ytterligere øket til 220 cm/sek ved 42 timer, til 230 cm/sek ved 46 timer, til 235 cm/sek ved 51 timer og til 240 cm/sekund ved 70 timer. Ved denne ristingsgrad (410 rpm) var blandingen kun dårlig til ganske god. Et minimalt nivå av biomassebevegelser ble opprettholdt. Ved 80 timer var ristingen redusert til 205 cm/sek.

Fermenteringen begynte å skumme ved ca. 18 timer. Skummingen ble kontrollert ved manuell tilsetning av antiskum. Antiskum ble først tilsatt ved 17 timer. Ved 20 timer skummet fermenteringen betydelig og krevet regelmessig tilsetning av antiskum. Skummingen sank betydelig ved 72 timer. Fermenteringen krevet imidlertid fortsatt tidvis tilsetning av antiskum.

Ved 24 timer hadde biomassen form av meget løse pelleter (1.2 mm) og løse hyfeaggregater. Det var en betydelig mengde av cellerester. Ved 48 timer hadde biomassen form av meget løse hyfeaggregater, meget små pelleter (1-2 mm) med meget små kjerner og løse periferier, og små kompakte pelleter (1-3) uten løse periferier. Ved 96 timer hadde biomassen form av runde pelleter, 1-2 mm i diameter, mange med løse, hårete periferier og mange løse hyfefragmenter. Nilrød farging ved ved 144 timer viste tilstedeværelse av mange meget små oljedråper i enkelte mycelium og også tilstedeværelse av mange store oljedråper i andre mycelium.

Stasjon 15 var kun forskjellig fra Stasjon 14 på grunn av tilføring av fosfat, denne viste •bedre.blanding i løpet av fermenteringen ved generelt lave ristingsgrader. Stasjon 15 fremviste også en "løsere" biomassemorfologi. Biomasse og oljeutbytte i tillegg til karbonforbruk er vist i Tabell 4. Høyere glukoseforbruk (82 g/L for Stasjon 15 sammen-lignet med 64 g/L for Stasjon 14), større biomasseakkumulering og tilstedeværelse av store oljedråper i deler av mycelet viste at fermentoren inneholdt mer fosfat.

Eksempel 7 Produksjon av M. alpina biomasse inneholdende arakidonsyre i stor målestokk

En dyrkingsfermentor inneholdende GYE-medium (50 g/L dekstrose og 6 g/L Tastone 154) ble inokulert fra en fermen-teringsdyrking. En temperatur på 28 °C ble opprettholdt og innledningsvis risting ble satt til 130-160 cm/sek (ca. 43 rpm). Innledningsvis kartrykk var 6 psi og innledningsvis luftingsgrad var satt til 0,25 VVM. pH ble justert til 5,0 før sterilisering, innledningsvis pH i fermenteringen ble satt til 5,5 etter sterilisering. Oksygennivået i mediet ble opprettholdt ved D.O. > 40 % i følgende hendelsesforløp: (i)

økning av kartrykk til 11 psi, (ii) økning av risting fra 156 til 175 cm/sek impellerperiferihastighet og (iii) økning av luftingen til 0,5 VVM. Skumming ble kontrollert ved tilsetning av antiskum Dow 1520-US, ved behov. (Ca. 0,1 ml/L av antiskummet burde tilsettes til mediet forut for sterilisering for å hindre skumming). Etter inokuleringen ble dyrkingen opprettholdt ved pH > 5,5 med 8N NaOH.

Innen 12 timer etter pH økte til over 6,0 ble innholdet i dyrkingsfermentoren overført til hovedfermentoren. Hovedfermentormediet inneholdt

80 g/L dekstrose (ADM)

16 g/L soyamel med næringssoya

30 mg/L FeCl3-6H20 (Sigma/Aldrich)

1,5 mg/L ZnS04-7H20 (Sigma/Aldrich)

0,1 mg/L CuS04-5H20 (Sigma/Aldrich)

1 mg/L biotin (Sigma/Aldrich)

2 mg/L tiamin-HCl (Sigma/Aldrich)

2 mg/L pantotemisk syre (hemikalsiumsalt)

(Sigma/Aldrich) (Justert til pH 4,8-5,0 før-sterilisering)

Hovedfermentoren ble inokulert med dyrkingsfermentoren (11,8 %). Fermentortemperaturen ble holdt ved 28 °C. Innledningsvis risting ble satt til 162 cm/sek (ca. 23 rpm), innledningsvis kartrykk var 6 psi og innledningsvis luftingsgrad var 0,15 WM (ca. 300 sefh) .

Oksygennivået i mediet ble opprettholdt ved D.O. > 40 % ved i) økning av kartrykk til 11 psi, ii) økning av risting til 300 cm/sek impellertopphastighet (med økninger på ca. 30 cm/sek) og iii) økning av lufting til 0,5 VVM.

pH ble målt i henhold til følgende pH-kontrollskjema: Innledende pH ble satt til 5,5 før sterilisering. pH ble opprettholdt ved > 15,5 med 8N NaOH.

Ved 24-36 timer etter inokulering ble følgende tilsatt:

2 g/L KH2P04 (110 kg i ca. 700 L H20) .

Ved 48 timer ble pH forandret og satt til > 6,1 dersom konsentrasjonen av dekstrose var < 60 g/L.

Ved 72 timer ble pH sakte øket og satt til > 6,6 i en grad på ca. 0,1 pH-enheter pr. time.

pH ble opprettholdt under 7,3 H2S04-tilsetning dersom dette var nødvendig.

Det ble tatt prøver av fermenteringen hver 12 time for biomasse- og fettsyreanalyse, og innhøstet i starten av ca. 3 dager etter at pH var øket til > 6,6 (ca. 6 dager etter inokulering). Tettheten av tørr biomasse bør være > 24 g/l. Dekstrosekonsentrasjonen i buljongen bør ha falt fra 80 g/L til < 14 g/L.

Innhøstingen utføres ved å føre hele kulturbuljongen gjennom et roterende vakuumfilter for å separere mycelium fra bruktmedium.

Resultatene av to vanlige fermenteringsrunder i henhold til fremgangsmåten i dette eksempel er vist i Tabel-lene 5 og 6.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en arakidonsyreinneholdende olje, der oljen inneholder triglycerider hvori minst 25 % av fettsyrerestene er arakidonsyre (ARA) og mengden av eicosapentansyre (EPA)-restene i oljen ikke overskrider en femtedel av mengden av arakodonsyre (ARA)-restene, omfattende: (a) dyrking av Mortierella sp. i en fermentor med lufting, inneholdende kulturmedium; (b) opprettholdelse av pH mellom 5 og 6 i starten av dyrkingen; (c) opprettholdelse av pH mellom 7 og 7,5 i slutten av dyrkingen; og (d) innhøsting av biomasse fra fermentoren og utvin-ning av den arakidonsyreinneholdende olje fra biomassen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en karbonkilde i en mengde ekvivalent med minst 80 g/L glukose og en nitrogenkilde i en mengde ekvivalent med minst 15 g/L gjærekstrakt, tilsettes til kulturmediet i løpet av fermenteringen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nivået av oppløst oksygen i kulturmediet i det minste er 35 % av luftmetningsnivået.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at nitrogenkilden deles i to eller flere aliquoter som tilføres til fermentoren til ulike tider, idet minst én aliquot tilføres til fermentoren på et tidspunkt som er forskjellig fra tidspunktet for tilføring av karbonkilden inn i fermentoren.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at Mortierella sp. er M. alpina.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at uren arakidonsyreinneholdende olje utvinnes fra biomassen ved ékstraksjon med et upolart løsningsmiddel og den urene olje klares ved ékstraksjon med et polart organisk løsningsmiddel.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det upolare løsnings-middel er heksan.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at det polare løsningsmid-del utvelges fra gruppen bestående av aceton, ethanol og isopropylalkohol.

9. Umodifisert sopptriglyceridolje, karakterisert ved at mer enn 50 % av fettsyrerestene er arakidonsyre (ARA)-rester til stede i triglyceridform og hvori oljen ikke omfatter mer enn én tiendedel eidosapentansyre (EPA) i forhold til ARA.

10. Umodifisert sopptriglyceridolje ifølge krav 9, karakterisert ved at oljen minst omfatter 50 % arakidonsyre (ARA) i triglyceridet og i det vesentlige ikke noe eicosapentansyre (EPA).

11. Anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge krav 9 eller 10 for å tilveiebringe triglyceridinneholdende arakidonsyre (ARA) til en morsmelkerstatning, hvor den umodifiserte sopptriglyceridoljen tilsettes til morsmelkerstatningen i en mengde som er tilstrekkelig til å tilveiebringe et arakidonsyre(ARA)-innhold tilsvarende mengden av arakidonsyre (ARA) i human brystmelk.

12. Anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge krav 9 eller 10 for fremstilling av en morsmelkerstatning, som omfatter triglyceridinneholdende arakidonsyre (ARA) i en mengde som kan sammenlignes med mengden i human brystmelk hvorved arakidonsyre (ARA) tilveiebringes ved tilføring til morsmelkerstatningen av en tilstrekkelig mengde av den umodifiserte sopptriglyceridoljen.

13. Anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge krav 9 eller 10 for fremstilling av et preparat for tilveiebringelse av supplerende arakidonsyre (ARA) til et menneske med dette behov, hvorved den umodifiserte sopptriglyceridoljen formuleres i en farmasøytisk akseptabel doseform for å tilveiebringe en mengde arakidonsyre (ARA) som er effektiv til å tilveiebringe supplerende arakidonsyre (ARA) til mennesket.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvorved preparatet formuleres for å tilveiebringe 0,2-0,8 g arakidonsyre (ARA)/dag.

15. Anvendelse ifølge krav 13 eller 14, hvorved preparatet er farmakologisk akseptabelt for enteral administrering.

16. Anvendelse ifølge krav 13 eller 14, hvorved preparatet er farmakologisk akseptabelt for parenteral administrering.

17. Anvendelse ifølge krav 13 eller 14, hvorved preparatet er farmakologisk akseptabelt for topisk administrering.

18. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 13-17, hvorved mennesket er en gravid eller ammende kvinne.

19. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 13-17, hvorved mennesket med behov for supplerende arakidonsyre (ARA) lider av en nevrologisk forstyrrelse.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvorved den nevrologiske forstyrrelse er tardivdyskinesi, schizofreni eller en peroxi-somal forstyrrelse.

21. Anvendelse ifølge krav 13 eller 14, hvorved mennesket med behov for supplerende arakidonsyre (ARA) lider av en sykdomstilstand forbundet med reduserte arakidonsyre (ARA)-serumnivåer.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvorved sykdommen er en leversykdom, fenylketonuri eller systisk fibrose.

23. Anvendelse av en umodifisert sopptriglyceridolje ifølge krav 9 eller 10 for fremstilling av et kosmetisk preparat, hvorved preparatet oljen er til stede i preparatet i en mengde som er effektiv til å understøtte opprettholdelse av hudfarge når preparatet anvendes topisk.