CN113321730A

CN113321730A - Cldn18.2抗体及其应用

Info

Publication number: CN113321730A
Application number: CN202110031542.5A
Authority: CN
Inventors: 董坚; 孙亚如; 杨圣; 李文荣; 聂紫
Original assignee: Shanghai Life Medical Science & Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Life Medical Science & Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-11
Filing date: 2021-01-11
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-01-11
Also published as: CN113321730B

Abstract

本发明提供了一种CLDN18.2抗体及其应用。具体地，本发明还描述了编码所述抗体的核酸、包含所述抗体的组合物、制备所述抗体的方法以及使用所述抗体治疗或预防疾病，例如癌症和/或炎性疾病的方法。

Description

CLDN18.2抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种CLDN18.2抗体及其应用。

背景技术

胃肠道和胰腺肿瘤对于人类生命是很大的威胁，虽然手术治疗、放化疗、介入治疗等治疗手段对于该类肿瘤有一定疗效，但患者生存率仍无显著改善。

细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达CAR后进行扩增培养，将其回输至人体。CAR由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内信号域依次连接组成，表达CAR的免疫细胞能够特异性识别并结合靶细胞，通过释放特异的免疫因子对其进行杀伤。

胃癌是世界上最常见的癌症之一，在中国，胃癌是第二大常见恶性肿瘤,被认为是全世界最难治愈的癌症之一。尽管近年来在治疗选择方面取得了进步，但是胃癌复发难以避免，晚期胃癌患者的五年生存率约为5–20％，中位总体生存期约为10个月。随着胃癌发生、发展分子机制研究的深入，靶向治疗成为一种有效的晚期癌症的治疗方案，靶点主要包括EGFR、HER-2、VEGF、VEGFR等。CLDN18.2作为一个高度特异性表达的细胞表面分子，在正常的组织中仅表达在分化的胃粘膜上皮细胞上，因此需要开发具有效果更好、毒性更低、不良反应更少的针对CLDN18.2的治疗性抗体。

综上所述，本领域急需开发一种新的CLDN18.2抗体及其应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的CLDN18.2抗体及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的CDR1，

SEQ ID NO:3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:4所示的CDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述的重链恒定区具有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1’，

SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。

在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；如本发明第二方面所述的重链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗CLDN18.2蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗CLDN18.2蛋白。

在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:9、10、11、12所示的序列。

在本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或本发明第六方面所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备***的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌。

在本发明的第十二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中CLDN18.2蛋白；

所述药剂用于治疗或预防表达CLDN18.2蛋白的肿瘤。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：胃癌、食道癌、胆管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌。

在另一优选例中，所述肿瘤选自：胃癌和胰腺癌。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

在本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中CLDN18.2蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在CLDN18.2蛋白。

在本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是如本发明第五方面所述的抗体或如本发明第六方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的杂交瘤方法体系。

图2显示了hCLDN18.2阳性杂交瘤汇总。

图3显示了亚克隆的杂交瘤上清交叉反应FACS检测。其中，横坐标为荧光强度，检测抗体和CLDN18.2的结合强度；纵坐标SSC为细胞的偏向色散，检测细胞的复杂程度。

图4显示了亚克隆的效价检测。

图5显示了C18-16-1H1-1E1重组抗体表达鉴定结果的流式检测图。其中，FL1-H为荧光强度，检测抗体和CLDN18.2的结合强度；SSC-H subset为细胞的偏向色散，检测细胞的复杂程度。

图6显示了重链的表达载体构建图谱。

图7显示了轻链的表达载体构建图谱。

图8显示了抗体与18.2-K562的FACS结合的鉴定结果图，其中IgG1为阴性对照。MFI为平均荧光强度。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，意外发现一种抗CLDN18.2单克隆抗体。实验结果表明，本发明的抗CLDN18.2单克隆抗体特异性高，亲和力强，能够特异性结合CLDN18.2，不结合CLDN18.1。在此基础上完成了本发明。

CLDN18.2

CLDN 18.2是一种广谱性肿瘤标志物，可在多种肿瘤中表达。

Claudin是一个蛋白质家族，其作用是维持控制细胞间分子交换的紧密连接。广泛分布于胃、胰腺和肺组织，可用于诊断和治疗。Claudin(CLDN)具有4个跨膜结构域，参与机体生理过程如细胞旁通透性和电导的调节。其家族包含至少24个成员，CLDN18是Claudin蛋白家族成员，在人体内由CLDN18基因编码。人CLDN18基因具有两个不同的1号外显子，经过转录后可变剪接生成两个蛋白亚型：CLDN18.1和CLDN18.2，这两个亚型均由261个氨基酸组成，只在N端胞外区存在8个氨基酸的差别。

CLDN18.2亚型是一种胃特异性亚型，正常生理状态下，Claudin 18.2(CLDN18.2)仅在人胃黏膜上皮短寿细胞表面表达；但在胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌等多种肿瘤中高表达，比如在50％-80％的胃癌患者存在该靶点的表达。CLDN18.2通常埋藏在胃粘膜中，正常组织中的单克隆抗体基本上接触不到，恶性肿瘤的发生会导致紧密连接的破坏，使肿瘤细胞表面的CLDN18.2表位暴露出来，成为特定的靶点。因此，CLDN18.2赋予靶向治疗的特异性。最近发现在胰腺癌(50％)、食管癌和肺癌中的表达也显示了诊断和治疗其他肿瘤的潜力。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗CLDN18.2蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗CLDN18.2蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗CLDN18.2蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗CLDN18.2蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

CDR1，其氨基酸序列为GYTFTDYYMN(SEQ ID NO:2)，其编码核苷酸序列为，tggatacacgttcactgactactacatgaac(SEQ ID NO:13)；

CDR2，其氨基酸序列为HINPKNGGTN(SEQ ID NO:3)，其编码核苷酸序列为，catattaatcctaaaaatggtggtactaac(SEQ ID NO:14)；

CDR3，其氨基酸序列为IYYGNSFVY(SEQ ID NO:4)，其编码核苷酸序列为，atctactatggtaattcctttgtttac(SEQ ID NO:15)。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：

MGWSWIFLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCQASGYTFTDYYMNWVKQSHVKSLEWIGHINPKNGGTNYNQNFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARIYYGNSFVYWGQGTLVTVSA(SEQ IDNO.:1)；

其编码核苷酸序列为：

atgggatggagctggatctttctctttctcctgtcaggaactgcaggtgtcctctcagaggtccagctgcaacaatctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgtcaggcttctggatacacgttcactgactactacatgaactgggtgaagcagagccatgtaaagagccttgagtggattggacatattaatcctaaaaatggtggtactaactacaaccagaacttcaaggacaaggccacattgactgtagacaagtcctccagtacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgcagtctattattgtgcaagaatctactatggtaattcctttgtttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(SEQ ID NO.:9)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

在另一优选例中，所述编码重链恒定区(mIgG2b)的核苷酸序列为(SEQ ID No:11)：

GCCAAAACAACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCTGGGTGTGGAGATACAACTGGTTCCTCTGTGACTCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCCTGAGTCAGTGACTGTGACTTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCAGTGTGCACACCTTCCCAGCTCTCCTGCAGTCTGGACTCTACACTATGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCAAGTCAGACCGTCACCTGCAGCGTTGCTCACCCAGCCAGCAGCACCACGGTGGACAAAAAACTTGAGCCCAGCGGGCCCATTTCAACAATCAACCCCTGTCCTCCATGCAAGGAGTGTCACAAATGCCCAGCTCCTAACCTCGAGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAATATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGACACCCAAGGTCACGTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGACGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTATCCGGGTGGTCAGCACCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCATCACCCATCGAGAGAACCATCTCAAAAATTAAAGGGCTAGTCAGAGCTCCACAAGTATACATCTTGCCGCCACCAGCAGAGCAGTTGTCCAGGAAAGATGTCAGTCTCACTTGCCTGGTCGTGGGCTTCAACCCTGGAGACATCAGTGTGGAGTGGACCAGCAATGGGCATACAGAGGAGAACTACAAGGACACCGCACCAGTCCTGGACTCTGACGGTTCTTACTTCATATATAGCAAGCTCAATATGAAAACAAGCAAGTGGGAGAAAACAGATTCCTTCTCATGCAACGTGAGACACGAGGGTCTGAAAAATTACTACCTGAAGAAGACCATCTCCCGGTCTCCGGGTAAATAG

其编码氨基酸序列为(SEQ ID No:19)：

AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

CDR1’，其氨基酸序列为KSSQSLLNSGNQKSYLT(SEQ ID NO:6)，其编码核苷酸序列为，aagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagagctacttgacc(SEQ ID NO.:16)；

CDR2’，其氨基酸序列为WASTRES(SEQ ID NO:7)，其编码核苷酸序列为，tgggcatccactagggaatct(SEQ ID NO.:17)

CDR3’，其氨基酸序列为QNNYFYPVT(SEQ ID NO:8)，其编码核苷酸序列为，cagaataattatttttatccggtcacg(SEQ ID NO.:18)

在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：

MESQTQVLLSLLFWVSGTCGDIVMTQSPSFLTVTAGEKVTLNCKSSQSLLNSGNQKSYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNNYFYPVTFGAGTKLELK(SEQ ID NO.:5)，

其编码核苷酸序列为：

atggaatcacagactcaggtcctcttgtccctgctgttctgggtatctggtacctgtggggacattgtgatgacacagtctccatccttcctgactgtgacagcaggagagaaggtcactttgaactgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagagctacttgacctggtaccaacagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaataattatttttatccggtcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO.:10)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。

在另一优选例中，所述编码轻链恒定区(IgK)的核苷酸序列为(SEQ ID No:12)：

CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG

其编码氨基酸序列为(SEQ ID No:20)：

RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合CLDN18.2蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:1的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:5的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗CLDN18.2蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有CLDN18.2蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:9、10、11、12、13、14、15、16、17、18所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:1和/或SEQ ID NO.:5所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合CLDN18.2蛋白分子，因而可用于预防和***。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

杂交瘤细胞株

本发明还提供了可生产本发明针对CLDN18.2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对CLDN18.2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在获得生产本发明的CLDN18.2蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明提供了一种针对CLDN18.2蛋白的单克隆抗体，特别是针对CLDN18.2蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

标记的免疫球蛋白

在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，CLDN18.2蛋白的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的CLDN18.2蛋白单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

方法和样本

本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测肿瘤的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中CLDN18.2蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测CLDN18.2水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别CLDN18.2蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明的主要优点包括

(1)本发明的抗体特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。

(2)本抗体的用途，可以用于特异性靶向CLDN18.2阳性肿瘤细胞的靶向性药物，抗体药物偶联物或多功能抗体；或用于制备诊断肿瘤的试剂；或用于制备嵌合抗原受体免疫细胞。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明的实验体系

本发明采用杂交瘤方法体系，通过DNA和细胞免疫，流式筛选获得阳性杂交瘤细胞，筛选体系稳定。

杂交瘤方法体系如图1所示。

E1抗体相关序列

表2.E1抗体相关序列

注：下划线部分为Leader序列。其中，VL为轻链可变区，CL为轻链恒定区，CH为重链恒定区，VH为重链可变区。

实施例1CLDN18.2抗体的制备

1.免疫小鼠

2.血清检测

3.融合

4.融合后筛选

5.亚克隆建株

6.抗体序列分析

7.抗体序列的表达验证

8.抗体的亲和力检测

实施例2hCLDN18.2阳性杂交瘤

如图2所示，本发明中的hCLDN18.2阳性杂交瘤汇总。

实施例3杂交瘤上清交叉反应检测

CHO-hCLDN18.1+杂交瘤上清+羊抗鼠IgGFc-FITC

分装适量的CHO-hCLDN18.1细胞于1.5ml EP管内，离心后重悬于50μl PBS，加入50μl由PBS 1:500稀释的羊抗鼠IgG Fc-FITC，4℃静置15分钟，离心置换上清之后重悬于200μl PBS，进行FACS流式分析。

如图3所示，使用CHO-hCLDN18.1稳转细胞(Cell Pool)通过流式方法检测与18.1的交叉反应，抗体E1(C18-23-3G5-1E1)为CLDN18.2特异性抗体，不与CLDN18.1反应。

实施例4杂交瘤上清效价检测

10倍倍比稀释：

CHO-hCLDN18.2+杂交瘤上清(10倍倍比稀释)+羊抗鼠IgGFc-FITC

分装适量的CHO-hCLDN18.2细胞于1.5ml EP管内，离心后重悬于50μl PBS，加入50μl由PBS 1:500稀释的羊抗鼠IgG Fc-FITC，4℃静置15分钟，离心置换上清之后重悬于200μl PBS，进行FACS流式分析。

其中23号小鼠阳性克隆的杂交瘤上清效价检测如图4所示。选择C18-23-3G-1E1(E1)进行抗体序列的表达验证。

E1抗体相关信息如下：

细胞株C18-23-3G5-1E1

来源SP2/0细胞与C57小鼠B细胞融合

亚型IgG2b,kappa。

实施例5抗体序列的表达验证

将各10μg轻重链表达载体(如图6和7所示)使用磷酸钙方法共转进入10厘米培养皿中的293T细胞，三天后收集上清在CHO-hCLDN18.2细胞中进行FACS验证。

流式检测实验结果如图5所示。

结果表明：293T上清中C18-23-3G-1E1重组抗体活性较好，序列正确。

实施例6E1抗体的活性相关数据

6.1.细胞铺板：将18.2-K562、18.1-K562、K562制成细胞悬液，将密度调整为1×10⁶/mL。取3块96孔圆底板，标记为plate1、plate2、plate3。采用100μL的移液排枪在plate1、plate2、plate3中分别加入100μL的18.2-K562、18.1-K562、K562的悬液。在离心机中采用300g的转速离心5min。甩去上清。

6.2.加抗体稀释液：将抗体用FACS Buffer稀释成20μg/mL、6.667μg/mL、2.222μg/mL、0.741μg/mL、0.247μg/mL、0.082μg/mL、0.027μg/mL、0.002μg/mL等8个浓度梯度的稀释液。采用100μL的移液排枪将抗体稀释液分别加到18.2-K562、18.1-K562、K562中，每孔100μL，4℃孵育60min。洗板：FACS Buffer洗板2次。

6.3.加二抗：采用FACS Buffer 1：150稀释二抗Anti-Human IgG FITC，100μL/孔加入到各孔中，4℃孵育30min。洗板：FACS buffer洗板3次。

6.4.上机：流式细胞仪上进行样品检测。

实验结果如图8所示，显示了抗体与18.2-K562的FACS结合的鉴定结果图。结果显示抗体亲和力为：0.6963μg/ml。hIgG1为阴性对照。抗体与18.1-K562以及抗体与K562的FACS结合的鉴定结果都显示抗体与18.1-K562无结合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海莱馥医疗科技有限公司

<120> CLDN18.2抗体及其应用

<130> P2020-1722

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Asn Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Ile Asn Pro Lys Asn Gly Gly Thr Asn

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ile Tyr Tyr Gly Asn Ser Phe Val Tyr

1 5

<210> 5

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Leu Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Thr

20 25 30

Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Leu Lys

130

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu

1 5 10 15

Thr

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Asn Asn Tyr Phe Tyr Pro Val Thr

1 5

<210> 9

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggatgga gctggatctt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt cctctcagag 60

gtccagctgc aacaatctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc 120

tgtcaggctt ctggatacac gttcactgac tactacatga actgggtgaa gcagagccat 180

gtaaagagcc ttgagtggat tggacatatt aatcctaaaa atggtggtac taactacaac 240

cagaacttca aggacaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagtac agcctacatg 300

gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt attgtgcaag aatctactat 360

ggtaattcct ttgtttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 411

<210> 10

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggaatcac agactcaggt cctcttgtcc ctgctgttct gggtatctgg tacctgtggg 60

gacattgtga tgacacagtc tccatccttc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 120

ttgaactgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagag ctacttgacc 180

tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 240

gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 300

atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaataa ttatttttat 360

ccggtcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 399

<210> 11

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60

tcctctgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 120

tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180

ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 240

acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300

gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360

cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420

atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480

gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540

catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 600

gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 660

atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 720

ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780

ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840

aaggacaccg caccagtcct ggactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 900

atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960

ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaata g 1011

<210> 12

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cttcttgaac aacttctacc ccaaagacat caatgtcaag 120

tggaagattg atggcagtga acgacaaaat ggcgtcctga acagttggac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacctacag catgagcagc accctcacgt tgaccaagga cgagtatgaa 240

cgacataaca gctatacctg tgaggccact cacaagacat caacttcacc cattgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggatacacg ttcactgact actacatgaa c 31

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catattaatc ctaaaaatgg tggtactaac 30

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atctactatg gtaattcctt tgtttac 27

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aagtccagtc agagtctgtt aaacagtgga aatcaaaaga gctacttgac c 51

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgggcatcca ctagggaatc t 21

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagaataatt atttttatcc ggtcacg 27

<210> 19

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

85 90 95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

130 135 140

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

165 170 175

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

180 185 190

Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

195 200 205

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

210 215 220

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys

245 250 255

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser

260 265 270

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser

290 295 300

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly

305 310 315 320

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg

35 40 45

Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser

85 90 95

Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

Claims

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:2所示的CDR1，

SEQ ID NO:3所示的CDR2，和

SEQ ID NO:4所示的CDR3。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO:6所示的CDR1’，

SEQ ID NO:7所示的CDR2’，和

SEQ ID NO:8所示的CDR3’。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或

(2)如权利要求6所述的重组蛋白。

8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。

10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、如权利要求5所述的抗体、或权利要求6所述的重组蛋白；和