NO315703B1

NO315703B1 - Meta azasykliske aminobenzosyreforbindelser og derivater derav som er integrinatantagonister

Info

Publication number: NO315703B1
Application number: NO20004316A
Authority: NO
Inventors: Thomas E Rogers; Peter G Ruminski
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1998-03-04
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2003-10-13
Also published as: NO20004316L; JP2002505323A; TR200002542T2; EE200000506A; KR20010041584A; MY123908A; HUP0100865A2; NZ506598A; IS5582A; CN1214011C; SK13002000A3; AR018139A1; ID25591A; BG104740A; IL137653A0; WO1999044994A1; AU3294799A; HRP20000574A2; AU753230B2; GEP20033118B

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler farmasøytiske midler (forbindelser) som er anvendbare som OvPa integrine antagonister og som slik er anvendbare i farmasøytiske sammensetninger og i fremgangsmåter for å behandle tilstander formidlet ved OvP3 ved å inhibere eller antagonisere av|33 integriner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Integriner er en gruppe av celleoverflateglukoproteiner som formidler celleaddisjon og derfor er anvendbare formidlere av celleaddisjonsvekselvirkninger som opptrer i løpet av ulike biologiske prosesser. Integriner er heterodimere sam-mensatt av ikke-kovalent bundne a og p polypeptidunderenne-ter. For tiden har 11 ulike a underenheter blitt identifisert og 6 ulike p underenheter har blitt identifisert. De ulike a underenhetene kan kombinere med ulike p underenheter for å danne forskjellige integriner.

Integrinen identifisert som Ovp3 (også kjent som vitronec-trinreseptoren) har blitt identifisert som en integrin som spiller en rolle i ulike tilstander eller sykdomstilstander inkludert tumormetastase, hard tumorvekst (neoplasi), osteoporose, Pagefs sykdom, humoral hyperkalsemi av ma-lingnansi, angiogenese, inkludert tumor angiogenese, retinopati, inkludert makulær degenerasjon, arteritt, inkludert revmatoid arteritt, tannkjøttsykdom, psoriasis og glatte muskelcellemigrasjon (f.eks. restenose). I tillegg, har det blitt funnet at slike midler ville være anvendbare som antiviraler, antifungaler og antimikrobialer. Derfor, ville forbindelser som selektivt inhiberer eller antagoniserer 0^03 være fordelaktige for å behandle slike tilstander.

Det har blitt vist av avp3 integrinen og andre Oy inneholdende integriner bindes til et antall av Arg-Gly-Asp(RGD) inneholdende matrix makromolekyler. Forbindelser som inneholder RDG sekvensen etterligner ekstra cellulære matrixli-gander for å binde til celleoverflatereseptorer. Imidlertid er det også kjent av RGD peptider generelt er ikke-selektive for RGD avhengige integriner. Por eksempel, binder de fleste RGT peptidene som til Ovp3, binder til OvPsi ctvPi, og otiibP3. Antagonisme av blodplate anbp3 (også kjent som fibrinogen reseptoren) er kjent for å blokkere blodplateaggregering hos mennesker. For å unngå blødnings-bivirkninger ved behandling av tilstandene eller sykdoms-tilstandene forbundet med integrinen OvP3, ville det være fordelaktig å utvikle forbindelser som er selektive antagonister av otvp3 i motsetning til aiIbp3.

Kreftcelleinvasjon skjer ved en tretrinnsprosess: 1) kreft-cellebinding til ekstracellulær matrix; 2) proteolytisk

oppløsning av matrixen,- og 3) bevegelse av cellene gjennom den oppløste barrieren. Denne prosessen kan skje flere ganger og kan resultere i metastase ved steder fjernt fra den opprinnelige tumoren.

Seftor et. al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 89 (1992) 1557-1561) har vist at avp3 integrinen har en biologisk funksjon i melonom celleinvasjon. Montgomery et. al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 91 (1994) 8856-60) har vist at integrinen avp3 uttrykt på humane melonome celler fremmer et overleveIsessignal, og beskytter cellene mot apoptose. Formidling av kreftcellens metastatiske bane med veksel-virkning med Ovp3 integrinens celleaddisjonsreseptor for å forhindre tumormetastase ville være fordelaktig.

Brooks et. al., (Cell, Vol. 79 (1994) 1157-1164) har vist at antagonister av avp3 gir en terapeutisk tilnærming for behandling av neoplasi (inhibisjon av hard svulstvekst) siden systemisk administrasjon av ct^^ j antagonister forårsaker dramatisk tilbakegang av ulike histologiske forskjellige humane svulster.

Addisjonsreseptorintegrinen OvP3 ble identifisert som en merker for angiogene blodkar i kylling og mennesker og derfor spiller en slik reseptor en kritisk rolle i angiogenese eller neovakularisasjon. Angiogenese er karakterisert ved invasjonen, bevegelsen og proliferasjonen av glatte muskel og endotele celler. Antagonister av Ovp3 inhiberer denne prosessen ved å selektivt fremme apoptose av celler i neo-vaskulatur. Veksten av nye blodkar, eller angiogenese, bi-drar også til patologiske betingelser slik som diabetisk retinopati og makulær degenerasjon.(Adonis et. al., Amer. J. Opthal., Vol. 118 (1994) 445-450) og revmatoid artritt (Peacock et. al., J. Exp. Med., Vol. 175 (1992), 1135-1138) . Derfor, ville Ovp3 antagonister være anvendbare terapeutiske mål for å behandle slike tilstander forbundet med neovaskularisering (Brooks et. al., Science, Vol. 264,

(1994), 569-571).

Det er blitt rapportert at celleoverflatereseptoren OvP3 er hovedintegrinen for osteoklaster ansvarlig for binding til ben. Osteoklaster forårsaker benresorpsjon og når slik ben-resorberingsaktivitet overstiger bendannelsesaktiviteten resulterer det i osteoporose (et tap av bensubstans), som leder til et øket antall av benbrudd, arbeidsudyktighet og øket dødelighet. Antagonister av Ovp3 har blitt vist å være kraftige inhibitorer for osteoklastisk aktivitet både in vitro (Sato et. al., J. Cell. Biol., Vol. 111 (1990) 1713-1723) og in vivo (Fisher et. al., Endocrinology, Vol. 132

(1993) 1411-1413). Antagonister av Ovp3 fører til redusert benresorpsjon og gjendanner derfor en normal balanse av bendannelse og "resoround bottoming" aktivitet. Derfor ville det være fordelaktig å gi antagonister av osteoklast otvp3 som er effektive inhibitorer for benresorpsjon og derfor anvendbare i behandlingen eller forebyggelsen av osteoporose .

Rollen til OvP3 integrinen i glatt muskelcellemigrasjon la-ger også et terapeutisk mål for forebyggelse eller inhibisjon av neointimal hyperplasi som er en ledende årsak for restenose etter vaskulære prosedyrer (Choi et.al., J.Vasc. Surg. Vol. 19(1) (1994) 125-34). Forebyggelse eller inhibisjon av neointimal hyperplasi ved farmasøytiske midler for å forebygge eller inhibere restenose vil være fordelaktig.

White (Current Biology, Vol. 3{9) (1993) 596-599) har rapportert at adenovirus anvender Ovp3 for å komme inn i

vertsceller. Integrinen viser seg å være krevet for endocy-tose av viruspartikkelen og kan være krevet for penetrasjon av det virale genomet inn i vertscellens cytoplasma. Derfor vil forbindelser som inhiberer OvP3 finne anvendbarhet som

antivirale midler.

WO 97/08145 legger frem meta-guanidin-, urea-, tiourea- og azasyklisk aminobenzosyrederivater med formelen (I)

hvori A er

som er anvendbare som Ovps integrine antagonister.

J.Med.Chem. 40. 930 (1997), J.Med.Chem. 40. 920 (1997) og Antiv.Chem.Chemother. 8, 463 (1997) omhandler oppdagelsen av HIV-1 integraseinhibitorer med spesifikke farmakofore undersøkelser.

Exp.Opin.Ther. patenter 8, 633 (1998) har blitt publisert etter den foreliggende krevde prioriteten og omhandler ut-viklingen at integrine antagonister kunne anvendes for å inhibere metastase.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omhandler en forbindelse med føl-gende generelle formel

hvori X og Y er den samme eller ulik halogruppe og farma-søytisk akseptable salter derav.

Forbindelsene beskrevet over kan eksistere i ulike isomere former og alle slike isomere former er ment å være inkludert. Tautomere former er også inkludert i tillegg til far-masøytisk akseptable salter av slike isomere og tautomere.

Mer spesifikt, omhandler foreliggende oppfinnelse de føl-gende forbindelsene:

hvor R er H eller alkyl;

eller farmasøytisk akseptable salter derav.

Det er en annen hensikt av oppfinnelsen å gi farmasøytiske sammensetninger omfattende forbindelser beskrevet over. Slike forbindelser og sammensetninger er anvendbare i selektiv inhibisjon eller antagonisering av integrinen og derfor omhandler en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for selektiv inhibisjon eller antagonisering av Ovpa integrinen. Oppfinnelsen involverer videre anvendelse av forbindelsen for å fremstille et medikament for behandling eller inhibisjon av patologiske tilstander forbundet derved slik som osteoporose, humoral hyperkalsimi av malignansi, Pagefs sykdom, tumormetastaser, hard tumorvekst (neoplasi), angiogenese, inkludert tumorangiogenese, retinopati inkludert diabetes retionopati og makulær degenerasjon, arteritt, inkludert revmatoid artritt, tannkjøttsykdom, psoriasis, glatt muskelcellemigrasjon og restinose i pattedyr med behov for slik behandling. I tillegg, er slike farmasøytiske midler anvendbare som antivirale midler, og antimikrobial.

Detaljert beskrivelse

Foreliggende oppfinnelse omhandler en klasse av forbindelser representert ved formelene I-XVI, beskrevet over.

Foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse er forbindelser med følgende formler

Oppfinnelsen omhandler videre farmasøytiske sammensetninger inneholdende terapeutisk effektive mengder av forbindelsene beskrevet over.

Oppfinnelsen omhandler også anvendelse av forbindelsene for å fremstille medikamenter for selektiv inhibisjon eller antagonisering av Ovp3 integrinen, og mer spesifikt omhandler den anvendelse som over for å inhibere benresorpsjon, tannkjøttsykdom, osteoporose, humoral hyperkalsimi ved malignansi, Pagefs sykdom, tumormetastaser, hard tumorvekst (neoplasi), angiogenese, inkludert tumorangiogenese, retinopati inkludert diabetes retionopati og makulær degenerasjon, artritt, inkludert revmatoid artritt, glatt muskelcellemigrasjon og restenose ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse beskrevet over for å oppnå slik inhibisjon sammen med en farma-søytisk akseptabel bærer.

Følgende er en liste av definisjoner av ulike betegnelser anvendt heri: Som anvendt heri, refererer betegnelsen "alkyl" eller "la-vere alkyl" til en lineær eller forgrenet hydrokarbonkjede-radikal som har 1-10 karbonatomer, og mer foretrukket 1-6 karbonatomer. Eksempler på slike alkylradikaler er metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, t-butyl, pentyl, neopentyl, heksyl, isoheksyl, og lignende.

Som anvendt heri refererer betegnelsen "halo" eller "halo-gen" til brom, klor, eller jod.

Som anvendt heri refererer betegnelsen "haloalkyl" til al-kylgrupper som definert over substituert med en eller flere av den samme eller ulike halogrupper ved ett eller flere karbonatomer. Eksempler på haloalkylgrupper inkluderer trifluormetyl, dikloretyl, fluorpropyl, og lignende.

Betegnelsen "sammensetning" som anvendt heri betyr et produkt som resulterer fra blandingen eller kombinasjonen av flere enn ett element eller ingrediens.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabel bærer", som anvendt heri, betyr et farmasøytisk akseptabelt materiale, sammensetning eller vehikkel, slik som en flytende eller fast fyller, fortynner, eksipient, løsningsmiddel eller innkaps-ling smat er iale, involvert i bæring eller transport av et kjemisk middel.

Betegnelsen "terapeutisk effektiv mengde" skal bety mengden av legemiddel eller farmasøytisk middel som vil utløse den biologiske eller medisinske responsen i et vev, system eller dyr som blir søkt ved en forsker eller kliniker.

Følgende er en liste av forkortelser og tilsvarende betyd-ninger som anvendt om hverandre heri:

<L>H-NMR = proton nukleær magnetisk resonans

AcOH = eddiksyre

Ar = argon

CH3CN = acetonitril

CHN analyse = karbon/hydrogen/nitrogen elementanalyse CHNC1 analyse = karbon/hydrogen/nitrogen/klor elementanalyse

CHNS analyse = karbon/hydrogen/nitrogen/svovel elementanalyse

DI vann = avionisert vann

DMA = N. N dimetylacetamid

DMAP = 4-( N, N dimetylamino)pyridin

DMF = N, N dimetylformamid

EDC1 = 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydroklorid

EtOAc = etylacetat

EtOH = etanol

FAB MS = hurtig atombombardementmassespektroskopi

g = gram

HOBT = 1-hydroksybenzotriazolhydrat

HPLC = høy virkningsgrads væskekromatografi

IBCF = isobutylkloroformat

KSCN = kaliumtiocyanat

1 = liter

LiOH = litiumhydroksid

MEM = metoksyetoksyrnetyl

MEMC1 = metoksyetoksymetylklorid

MeOH = metanol

mg = milligram

MgS04 = magnesiumsulfat

ml = milliliter

MS = massespektroskopi

MTBE = metyl tert-butyleter

N2 = nitrogen

NaHC03 = natriumbikarbonat

NaOH = natriumhydroksid

NaaS04 = natriumsulfat

NMM = N-metylmorfolin

NMP = N-metylpyrrolidinon

NMR = nukleær magnetisk resonans

P205 = fosforpentoksid

PTSA = para-toluensulfonsyre

RPHPLC = omvendt fase høy virkningsgrads væskekromatografi RT = romtemperatur

TFA = trifluoreddiksyre

THF = tetrahydrofuran

TMS = trimetylsilyl

A = oppvarming av reaksjonsblandingen

I strukturene og formlene heri, kan en binding trukket på tvers av en binding eller en ring være til ethvert tilgjengelig atom på ringen.

Betegnelsen "farmasøytisk akseptabelt salt" refererer til et salt fremstilt ved å kontakte en forbindelse beskrevet over med en syre hvis anion generelt er betraktet som passende for humant konsum. Eksempler på farmakologisk akseptable salter inkluderer hydroklorid, hydrobromid, hydrojodid, sulfat, fosfat, acetat, propionat, laktat, maleat, malat, succinat, tartrat saltene og lignende. Alle de farmakologisk akseptable saltene kan fremstilles ved vanlige metoder. (Se Berge et. al., J. Pharm. Sei.,66(1), 1-19

(1977) for ytterligere eksempler på farmasøytisk akseptable salter.)

For den selektive inhibisjonen eller antagonismen av otvp3 integriner, kan forbindelser i foreliggende oppfinnelse ad-ministreres oralt, parenteralt, eller ved inhalasjonsspray, eller topiske enhetsdoseringsformuleringer inneholdende vanlige farmasøytisk akseptable bærer, hjelpestoffer og ve-hikler. Betegnelsen parenteral som anvendt heri inkluderer, for eksempel, subkutan, intravenøst, intramuskulært, in-trasternalt, infusjonsteknikker eller intraperitonealt.

Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse blir administrert på enhver passende måte i form av farmasøytiske sammensetninger tilpasset en slik måte, og i en dose effektiv for den tenkte behandlingen. Terapeutisk effektive doser av forbindelsene krevet for å forebygge eller bremse utviklin-gen av, eller behandle den medisinske tilstanden, er lett å skaffe kjennskap til for fagmannen ved å anvende prekli-niske og kliniske fremgangsmåter kjent innen de medisinske fagene.

I henhold til dette gir foreliggende oppfinnelse anvendelse av forbindelsene for fremstilling av et medikament for å behandle tilstander formidlet ved selektivt å inhibere eller antagonisere OvP3 celleoverflatereseptoren. Behandlingen omfatter administrering av en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse valgt fra klassen av forbindelser beskrevet over, hvori en eller flere forbindelser blir administrert sammen med en eller flere ikke-giftige, farmasøytisk akseptable bærere og/eller fortynnere og/eller hjelpestoffer (kollektivt referert til heri som "bærer" materialer) og hvis ønsket andre aktive ingredien-ser. Mer spesifikt hemmes OvP3 celleoverflatereseptoren. Mest foretrukket anvendes forbindelsene av oppfinnelsen for fremstilling av medikamenter for å inhibere benresorpsjon, behandle osteoporose, inhibere humoral hyperkalsemi ved malignansi, behandle Paget"s sykdom, inhibere tumormetastase, inhibere neoplasi {hard tumorvekst), inhibere angiogenese inkludert tumorangiogenese, behandle diabetisk retinopati og makulær degenerasjon, inhibere artritt, psoriasis og tannkjøttsykdommer (periodontal disease), og inhibere glatte muskelcellemigrasjon inkludert restinose.

Basert på standard laboratorieforsøksteknikker og fremgangsmåter velkjent og anerkjent av fagmannen, i tillegg til sammenligninger med forbindelser med kjent anvendbarhet, kan forbindelsene beskrevet over anvendes i behandlingen av pasienter som lider fra de ovennevnte patologiske tilstander. Fagmannen vil gjenkjenne at utvalget av den mest passende forbindelsen i oppfinnelsen er innen evnen til en med ordinær kjennskap i faget og vil avhenge av mange faktorer inkludert vurdering av resultater oppnådd i standard analyser og dyremodeller.

Behandling av en pasient plaget med en av de patologiske tilstandene omfatter administrasjon til en slik pasient av en mengde av forbindelse beskrevet over som er terapeutisk effektiv til å kontrollere tilstanden eller forlenge overlevelsen til pasienten ut over det forventet i fravær av slik behandling. Som anvendt heri, refererer betegnelsen "inhibisjon" av tilstanden til å forsinke, avbryte, bremse eller stoppe tilstanden og indikerer ikke nødvendigvis en total eliminasjon av tilstanden. Det antas at forlengelse av overlevelsen til en pasient, ut over å være en vesentlig fordelaktig effekt i og av seg selv, også indikerer at tilstanden blir fordelaktig kontrollert i noe utstrekning. Som uttalt tidligere, kan forbindelsene i oppfinnelsen anvendes i mange forskjellige biologiske profylaktiske eller terapeutiske områder. Det forventes at disse forbindelsene er anvendbare i forhindring eller behandling av enhver syk-domstilstand eller tilstand hvori OvP3 integrinen spiller en rolle.

Doseringsregimet for forbindelsene og/eller sammensetningene inneholdende forbindelsene er basert på flere faktorer, inkludert typen, alder, vekt, kjønn og medisinsk tilstand for pasienten; alvorligheten av tilstanden; administrasjonsmåten; og aktiviteten til den spesielle forbindelsen anvendt. Derfor kan doseringsregimet variere vidt. Dose-ringsnivåer i størrelsesorden fra 0,01 mg - 1000 mg per kg kroppsvekt per døgn er anvendbare i behandlingen av de oven indikerte tilstander, og mer foretrukket 0,01 mg - 100 mg per kg kroppsvekt per døgn.

Den aktive ingrediensen administrert ved injeksjon blir formulert som en sammensetning hvori, for eksempel, salt, dekstrose eller vann kan anvendes som en passende bærer. En passende daglig dose ville typisk være 0,01 - 10 mg/kg kroppsvekt injisert per døgn i multiple doser avhengig av faktorene listet over.

For administrasjon til pattedyr med behov for slik behandling, blir forbindelsene i en terapeutisk effektiv mengde vanligvis kombinert med ett eller flere hjelpestoffer passende til den indikerte administrasjonsmåten. Forbindelsen kan blandes sammen med laktose, sukrose, stivelsespulver, celluloseestere av alkansyrer, cellulosealkylestere, tal-kum, stearinsyre, magnesiumstearat, magnesiumoksid, natrium og kalsiumsalter av fosfor og svovelsyrer, gelatin, akasie, natriumalginat, polyvinylpyrrolidin, og/eller polyvinylal-kohol, og tabletterte eller innkapslede for bekvemmelig administrasjon. Alternativt, kan forbindelsene være løst i vann, polyetylenglukol, propylenglukol, etanol, maisolje, bomullsfrøolje, peanøttolje, sesamolje, benzylalkohol, natriumklorid, og/eller ulike buffere. Andre hjelpestoffer og måter for administrasjon er velkjent i det farmasøytiske faget.

De farmasøytiske sammensetningene anvendbare i foreliggende oppfinnelse kan utsettes for vanlige farmasøytiske opera-sjoner slik som sterilisering og/eller kan inneholdende vanlige farmasøytiske hjelpestoffer slik som konserverings-middel, stabilisatorer, fuktemidler, emulgatorer, buffere, etc.

De generelle syntetiske sekvensene for å fremstille forbindelsene anvendbare i foreliggende oppfinnelse blir illus-trert i figurene I - III. Både en forklaring og den fak-tiske fremgangsmåten for de ulike utførelsene av foreliggende oppfinnelse er beskrevet hvor passende. De følgende figurer og eksempler er tenkt å være utelukkende illustra-tive for foreliggende oppfinnelse, og ikke begrensende derav, verken i omfang eller ånd. De med kjennskap i faget . vil lett forstå at kjente variasjoner av tilstandene og fremgangsmåtene beskrevet i figurene og eksemplene kan anvendes for å syntetisere forbindelsen i foreliggende oppfinnelse .

Såfremt annet ikke er indikert var alle utgangsmaterialene og alt utstyret anvendt kommersielt tilgjengelig. Reaksjonsskjema l illustrerer metodikk anvendbar for å fremstille tetrahydropyrimidinbenzosyredelen av foreliggende oppfinnelse som kan kobles til en gly-p-aminosyreester. Kort, i reaksjonsskjerna I, blir 3,5-dihydroksybenzosyre omdannet til 3-amino-5-hydroksy-benzosyre ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i Austr. J. Chem., 34(6), 1319-24 (1981). Produktet reageres med ammoniumtiocyanat i varm, fortynnet saltsyre for å gi 3-tiourea-5-hydroksybenzosyre etter normal opparbeiding. Dette tiourea-mellomproduktet blir omdannet til S-metylderivater ved reaksjon med metyljodid i etanol ved refluks. 1,3-diamino-2-hydroksypropan blir reagert med dette resulterende mellomproduktet i varm DMA. Ved kjøling utfelles former og det zwitterioniske produktet blir isolert ved filtrering. HCl-saltet kan oppnås ved lyofilisering fra fortynnet saltsyre. Alternativt kan produktet isoleres fra den opprinnelige reaksjonsblandingen ved å fjerne flyktige stoffer og konsentrere. Det resulterende produktet blir først tatt opp i vann og pH justert til 5-7 hvor zwitterionprodukt feller ut og blir isolert ved filtrering. HCl-saltet kan oppnås som tidligere uttalt eller ganske enkelt ved oppløsning i fortynnet saltsyre og konsentrasjon til et faststoff og tørking.

Reaksjonsskjema IA illustrerer metodikk anvendbar for å fremstille tetrahydropyrimidinbenzosyredelen av foreliggende oppfinnelse som kan kobles til en gly-p-aminosyreester. Kort, i reaksjonsskjerna IA blir l,3-diamino-2-hyd-roksypropan reagert med karbondisulfid i et passende løs-ningsmiddel slik som etanol-vann, reflukset, kjølt, tilsatt saltsyre, reflukset igjen, kjølt, og produktet, 5-hydroksy-tetrahydropyrimidin-2-tion høstet ved filtrering og tørket. Dette sykliske tiourea-mellomproduktet blir omdannet til S-metylderivatet ved reaksjon av tion og metyljodid i etanol ved refluks. Det ønskede 2-metyltioeter-5-hydroksypyrimidin hydrojodid blir lett isolert ved å fjerne flyktige stoffer ved redusert trykk. Derfor blir, 2-metyltioeter-5-hydroksy-pyrimidinhydroid i metylenklorid: DMA (omkring 10:1) og en ekvivalent av trietylamin kjølt til omkring isbadtemperatur og ekvivalent av di-tert-butyldikarbonat (BOC anhydrid) tilsatt. Vanlig opparbeiding gir BOC-2-metyltioeter-5-hyd-roksypyrimidin som en olje.

3,5-dihydroksybenzosyre blir konvertert til 3-amino-5-hyd-roksybenzosyre med anvendelse av fremgangsmåten til Aust.J.Chem., 34(6), 1319-24 (1981).

Det ønskede sluttproduktet, 3-hydroksy-5-[(5-hydroksy-1,4,5,6-tetrahydro-2-pyrimidinyl)amino]benzosyre hydroklo-ridsalt blir fremstilt ved å reagere BOC-2-metyltioeter-5-hydroksypyrimidin i varm DMA. Ved kjøling dannes et bunnfall og zwitterionprodukt isoleres ved filtrering. HCl-saltet kan oppnås ved lyofilisering fra fortynnet saltsyre, for eksempel.

Y og X er halogrupper

Reaksjonsskjema II illustrerer en metodikk anvendbar for å fremstille etyl N-gly-amino-3-(3,5-dihalo-2-hydroksy)fenyl-propionat delen av foreliggende oppfinnelse som kan kobles med tetrahydropyrimidinobenzosyregruppen. Kort, kan 3,5-halosubstituerte salicylaldehyder fremstilles ved direkte halogenering som, for eksempel, ville være tilfellet hvor 5-bromsalicylaldehyd blir oppslemmet i eddiksyre og en ekvivalent eller flere av klor blir tilsatt for å gi 3-klor-5-brom-2-hydroksybenzaldehyd. Noen produkter faller ut og kan gjenvinnes ved filtrering. Resten kan gjenvinnes ved fortynning av filtratet med vann og isolering av bunnfallet. Kombinasjon av faststoffene og tørking gir 3-klor-5-brom-2-hydroksybenzaldehyd. 3-jod-5-klorsalisylaldehyd kan fremstilles ved å reagere 5-klorsalicylaldehyd med N-jodsuccinimid i DMF og utsette reaksjonsblandingen for vanlig opparbeidingsbetingelser. 3-jod-5-bromsalicylaldehyd kan fremstilles ved å reagere 5-bromsalisylaldehyd i acetonitril med kaliumjodid og kloramin T. Opparbeiding gir et material som når behandlet med heksan gir det ønskede 3-j od-5-klorsalicylaldehyd.

Kumariner blir lett fremstilt fra salicylaldehyder ved anvendelse av en modifisert Perkin reaksjon (e.g., Vogel^ s Textbook og Practical Organic Chemistry, 5th Ed., 1989, s. 1040) . De halosubstituerte kumarinene blir konvertert til 3-aminohydrokumariner (se J.G.Rico, Tett.Let., 1994, 35, 6599-6602) som lett åpnes i sur alkohol for å gi 3-amino-3-(3,5-halo-2-hydroksy)fenyl propansyreestere.

3-amino-3-(3,5-halo-2-hydroksy)fenyl propansyreestere blir konvertert til N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hydroksy)fenyl propansyreestere ved reaksjon av Boc-N-gly-N-hydroksy-suc-cinimid for å gi Boc-N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hydroksy)fenyl propansyreestere som blir konvertert til HX salter av N-gly-3-amino-3-(3,5-halo-2-hydroksy)fenyl propansyreestere (hvor X er en halogruppe) for eksempel, ved fjerning av den BOC-beskyttende gruppen anvendende HC1 i etanol.

Aminosyreforbindelsene anvendt for å fremstille forbindelsene i foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i henhold til fremgangsmåtene fremlagt heri og under og i henhold til metodikken beskrevet og krevet i svevende USSN Attorney . Docket 3076.

Y og X er halogrupper

Reaksjonsskjema III er illustrativt for metodikken anvendbar for å fremstille ulike forbindelser i foreliggende oppfinnelse. 3-hydroksy-5-[(1,4,5,6-tetrahydro-5-hydroksy-2-pyrimidinyl)amino]benzosyre blir aktivert for kopling ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Derfor, etter oppløs-ning i et passende løsningsmiddel slik som DMA blir en ekvivalent av NMM tilsatt. Reaksjonsblandingen blir kjølt til isbadtemperatur og IBCF blir tilsatt. Til det blandede anhydridproduktet blir intermediat gly-p-aminosyreester og NMM tilsatt. Ved fullførelse av reaksjonen blir produktet renset ved prep HPLC og estere hydrolysert til syren ved å behandle med en base slik som LiOH i et passende løsnings-middel (dioksan/vann eller acetonitril/vann). Alternativt kan en passende syre, slik som TFA, anvendes. Produktet blir isolert ved prep hplc eller ved isolering av zwitter-ionet ved pH 5-7 og omdanning til det ønskede saltet ved s t anda rd f remgang småt e r.

Eksempel A

Fremstilling av

Trinn 1 Fremstilling av

Til en 2 1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og kjøler ble 3,5-diklorsalicylaldehyd (200 g, 1,05 mol, 1 ekviv.) eddiksyreanhydrid (356 g, 3,49 mol) og trimetylamin (95,0 g, 0,94 mol, 0,90 ekviv.) tilsatt. Reaksjonsløsningen ble varmet ved refluks over natten. Den mørkebrune reak-sjonsblåndingen ble kjølt til 50°C og vann (1 1) ble tilsatt ved røring. Etter en time ble blandingen filtrert og filtratet kombinert med EtOH (1 1). Denne blandingen ble varmet til 45°C i en time, kjølt til romtemperatur, filtrert og faststoffet (fraksjon A) vasket med EtOH (0,5 1). De kombinerte EtOH-løsningene ble konsentrert ved rota-sjonsfordampning til en olje (fraksjon B). Faststoffet fra fraksjon A ble oppløst i metylenklorid (1,5 1) og den resulterende løsningen ført gjennom et sjikt av silikagel (1300 ml volum). Den resulterende mørkebrune løsningen ble konsentrert til en olje som ble triturert med heksaner (1,3 1) for å gi et faststoff som ble isolert ved filtrering og vasket (heksaner) for å gi i alt vesentlig ren 6,8-diklorkumarin (163 g). Ytterligere 31 g produkt ble oppnådd ved å behandle oljen, fraksjon B, på lignende måte; oljen ble oppløst i metylenklorid (0,5 1) ført gjennom en et silika-sjikt (0,5 1 volum) og triturert med heksaner. Det totale isolerte utbyttet var 194 g eller 86% utbytte av det brune faststoffet.

MS og NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av

Til en 3-halset 2 1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører ble 6,8-diklorkumarin (160 g, 0,74 mol) (fremstilt i trinn 1) og tørr THF (375 ml, Aldrich Sure Seal) tilsatt. Den resulterende blandingen ble kjølt til -40°C (tørris/ acetonbad) og litium bis(trimetylsilyl)amid (0,80 mol, 800 ml IM THF) ble tilsatt mens temperaturen ble opprettholdt under -40°C. Etter fullførelsen av tilsettingen ble kjøle-badet fjernet. Etter 0,5 time ble blandingen varmet til - 5°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av en løsning av HC1 (0,5 1 4M dioksan) i EtOH (1,25 1). Temperaturen ble opprettholdt under 0°C over natten. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til rundt halvparten av originalvolumet og delt mellom EtOAc (3 1) og vann (2 1). Den organiske fasen ble vasket med vandig HC1 {3 x 1 1 0,5 N HC1). pH i de kombinerte vandige sjiktene ble justert til ca. 7 ved tilsetting av 10 % vandig NaOH og ekstrahert med metylenklorid (3x2 1). De kombinerte organiske fasene ble tørket (MgSOj , filtrert og 4M HC1 i dioksan (210 ml) tilsatt ved røring. Ved fullførelse av utfellingen ble faststoffet fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert til et lite volum og metyl t-butyleter ble tilsatt. Faststoffet oppnådd ble kombinert med det opprinnelige dannede faststoffet og det kombinerte produktet ble vasket med metyl t-butyl, isolert ved filtrering og tørket (vakuumovn over en weekend) for å

oppnå det ønskede produktet (172 g, 74 % utbytte).

MS og NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av

Til en flammetørket rundkolbe (0,5 1) utstyrt med magnetisk rørestav ble tilsatt N-t-Boc-glycin N-hydroksysuccinimidester (Sigma 15,0 g, 0,055 mol), tørr DMF (Aldrich Sure Seal, 200 ml) og produktet fra trinn 2 (21,67 g, 0,055 mol) under en inert atmosfære (Ar). Reaksjonsblandingen ble kjølt til ca. 0°C (salt-isbad) og N-metylmorfolin (5,58 g, 0,056 mol) og en katalytisk mengde av DMAP ble tilsatt og reaksjonen tillatt å foregå over natten. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til en "slush", og delt mellom EtOAc (0,41) og vandig base (2 x 0,2 1, vandig mettet NaHC03) . Den organiske fasen ble vasket etterfølgende med vandig sitronsyre (2 x 0,2 1, 10% vekt/vol), igjen med vandig natriumbikarbonat (2 x 0,2 1), saltløsning og tørket (Na2S04) . Flyktige stoffer ble fjernet under vakuum ved 55°C for å gi en olje (22,5 g, 92% utbytte) som størknet ved stillstand.

MS og MNR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Fremstilling av

Produktet oppnådd i trinn 3 ble avbeskyttet for å gi amin-hydrokloridsaltet ved anvendelse av følgende fremgangsmåte. Til produktet fra trinn 3 (14,0 g, 0,032 mol) i en flamme-tørket rundkolbe (0,1 1) med rørestav ble tørr dioksan (40 ml) tilsatt. Til dette ble 4,0 N HC1 i dioksan (2 ekviv., 6,32 ml) tilsatt ved 0°C og reaksjonen tillatt å foregå inntil gassutviklingen opphørte og reaksjonen var fullført. Flyktige stoffer ble fjernet under vakuum og resten trituert med dietyleter (50'ml). Faststoff ble samlet ved filtrering og vasket med eter og tørket for å gi det ønskede produkt (12,5 g).

MS og MNR var konsistente med den ønskede struktur.

Eksempel B

Fremstilling av

Trinn 1 Fremstilling av

Til en suspensjon av 3-brom-5-klorsalicylaldehyd (175,0 g, 743,2 mmol) i eddiksyreanhydrid (280,5 ml, 3,0 mol) ble trietylamin (103,6 ml, 743,2 mmol) tilsatt. Reaksjonsløs-ningen ble blandet ved refluks i 4,5 timer. Løsningen ble avkjølt og konsentrert in vacuo. Absolutt etanol (73 0 ml) ble tilsatt til den brune resten. Blandingen ble lagret ved 0°C i 14 timer. Det brune faststoffet ble samlet ved filtrering og vasket med kald etanol. Faststoffet ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produkt (123,0 g, 64% utbytte).

<X>H NMR var konsistent med den foreslåtte strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av

Til en suspensjon av kumarinen (40,0 g, 154,1 mmol) i THF (400 ml) ved -76°C ble litium bis(trimetylsilyl)-amid (154,1 ml IM løsning i THF) tilsatt, dråpevis med røring. Tilsetningen ble fullført på 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble så rørt i 5 minutter, varmet opp til -20°C og rørt i 15 minutter. Til denne løsningen ble eddiksyre (9,25 g, 154,1 mmol) i THF (28 ml) tilsatt over 5 minutter. Blandingen ble varmet til romtemperatur og flyktige stoffer ble fjernet in vacuo. Resten ble oppløst i eter (850 ml), vasket med mettet vandig NaHC03 (2 x 100 ml) , saltløsning (2 x 4 0 ml), og tørket (MgSO«) . Eterløsningen ble konsentrert til ca. 160 ml og kjølt til 0°C. Til denne løsningen ble 4M HC1 i dioksan (56,3 ml, 225 mmol) tilsatt og blandingen ble rørt ved 0°C i 30 minutter. Suspensjonen ble filtrert og filterkaken vasket med eter. Faststoffet ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produkt som HCl-salt, dioksan-oppløsning, (45,0 g).

<*>H NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av

Til en suspensjon av laktonet (142,2 g, 354,5 mmol) i absolutt etanol (533 ml) ble 4M HC1 i dioksan (157,8 ml, 631,1 mmol) tilsatt i løpet av 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 2,5 timer. Flyktige komponen-ter ble fjernet in vacuo. Bunnfallet ble oppløst i etylacetat (450 ml) og løsningen holdt ved 0°C i 15 timer. Det lærfargede bunnfallet ble samlet ved filtrering og vasket med kald etylacetat. Faststoffet ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produktet som hydrokloridsaltet (100,4 g, 79% utbytte).

<X>H NMR var konsistent med den foreslåtte strukturen.

Trinn 4

Fremstilling av

Til en flammetørket rundkolbe (0,1 1) utstyrt med magnetisk rørestav ble N-t-Boc-glysin N-hydroksysuccinimidester (Sigma, 2,72 g, 0,010 mol), tørr THF (Aldrich Sure Seal, 50 ml) og produktet fra trinn 3 (3,10 g, 0,01 mol, vakuum-tørket over natten over P205) tilsatt linder en inert atmosfære (Ar). Reaksjonsblandingen ble kjølt til ca. 0°C (salt-isbad) og trietylamin (1,01 g, 0,010 mol) ble tilsatt. Reaksjonen ble tillatt å foregå over natten. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til et halvfast stoff og opparbeidet på en måte lignende til eksempel A, trinn 3. Flyktige stoffer ble fjernet fra den organiske fasen under vakuum ved 55°C for å gi en olje (4 g, 83 % utbytte), som størknet ved stillstand.

MS og MNR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Fremstilling av

Produktet oppnådd i trinn 4 ble avbeskyttet for å gi amin-hydrokloridsaltet ved anvendelse av følgende fremgangsmåte. Til produktet fra trinn 4 (4,0 g, 0,0084 mol) i en flamme-tørket rundkolbe (0,1 1) med rørestav ble tørr dioksan (20 ml) tilsatt. Til denne ble 4,0 N HCl i dioksan (20 ml) tilsatt og reaksjonen ble tillatt å foregå inntil gassutviklingen stanset og reaksjonen var fullstendig (ca. l time). Flyktige stoffer ble fjernet under vakuum og bunnfallet trituert med dietyleter (50 ml). Faststoff ble samlet ved filtrering og vasket med eter og tørket for å gi et lett brunt faststoff (2,7 g, 78% utbytte).

MS og NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel C

Fremstilling av

Trinn l

Til en suspensjon av 3,5-dibromsalisylaldehyd (100 g, 357 mmol) i eddiksyre (164,8 ml, 1,8 mol) ble trietylamin (45 ml, 375 mmol) tilsatt. Reaksjonsløsningen ble varmet over natten ved refluks under argon. Løsningen ble kjølt til romtemperatur og en fast masse dannet. Den mørkebrune reaksjonsblandingen ble vasket med varme heksaner (3 x 300 ml) og vandig, mettet bikarbonat. Det resulterende faststoffet ble oppløst i EtOAc (2 1) og vasket med vann. Den organiske fasen ble tørket (natriumsulfat) og konsentrert for å gi et brunt faststoff som ble samlet ved filtrering. Faststoffet ble tørket in vacuo for å gi i alt vesentlig ren 6,8-dibromkumarin (94,2 g, 87 utbytte).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Til 6,8-dibromkumarin (20,0 g, 0,066 mol)(fremstilt i trinn l) i THF (100 ml) ved -78°C ble litium bis (trimetyl-silyDamid (66 ml IM løsning i THF) tilsatt dråpevis ved røring. Tilsetningen ble fullført på 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble så rørt i fem minutter, varmet til 0°C og rørt i 15 minutter. Til denne løsningen ble eddiksyre

(3,95 g) tilsatt i løpet av 1 minutt. Blandingen ble varmet til romtemperatur og flyktige stoffer ble fjernet in vacuo. Bunnfallet ble oppløst i heksaner (500 ml), vasket med mettet, vandig NaHC03 (2 x 100 ml) og tørket (Na2S04) . Den organiske løsningen ble konsentrert til å gi en olje som umiddelbart ble tatt opp i etyleter (400 ml) og 4M HC1 i dioksan (30 ml) ble tilsatt ved røring ved 0°C i 30 minutter. Overskytende HCl ble fjernet in vacuo, suspensjonen filtrert og filterkaken vasket med eter. Faststoffet ble

tørket in vacuo for å gi det ønskede produktet som HCl saltet, dioksansolvat (19,9 g).

MS og AH NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Laktonet fremstilt i trinn 2 over (15 g) ble oppløst i absolutt etanol (400 ml) og vannfri HCl-gass ble ført gjennom i ett minutt. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 2,5 timer. RPHPLC viste fullstendig reaksjon. De flyktige stoffene ble fjernet in vacuo for å gi en mørk rest. Resten ble triturert med dietyleter (500 ml) og blandingen rørt over natten. Det lærfargede bunnfallet ble samlet ved filtrering og vasket med dietyleter. Faststoffet ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produktet som hydrokloridsaltet (15,2 g).

MS og ^ NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Til en flammetørket rundkolbe (0,2 1) utstyrt med magnetisk rørestav ble tilsatt N-t-Boc-glysin N-hydroksysuccinimidester (Sigma, 8,1 g, 0,030 mol), tørr DMF (Aldrich Sure Seal, 50 ml) og produktet fra trinn 3 (12 g, 0,03 mol, vakuumtørket over natten over P205)under en inert atmosfære

(Ar). Reaksjonsblandingen ble kjølt til ca. 0°C (salt-isbad) og N-metyl morfolin (3,03 g, 0,030 mol) og katalytisk DMAP ble tilsatt. Reaksjonen ble tillatt å foregå over natten oppvarmende til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert til et halv-fast stoff og opparbeidet på en måte lignende eksempel A, trinn 3. Flyktige stoffer ble fjernet fra den organiske fasen under vakuum ved 55°C for å gi en olje (15,7 g, 93% utbytte) som størknet ved stillstand.

MS og NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Produktet oppnådd i trinn 4 ble avbeskyttet for å gi amin-hydrokloridsaltet anvendende følgende fremgangsmåte. Til produktet fra trinn 4 (13,0 g, 0,0084 mol) i en flammetør-ket rundkolbe (0,1 1) med rørestav ble tilsatt tørr dioksan (4 0 ml). Til dette ble tilsatt 4,0 N HC1 i dioksan (30 ml) og reaksjonen tillatt å foregå inntil gassutviklingen stoppet og reaksjonen var fullført (ca. en time). De flyktige stoffene ble fjernet under vakuum og bunnfallet trituert med dietyleter (50 ml). Faststoff ble samlet ved filtrering og vasket med eter og tørket for å gi et faststoff (10,6 g, 93% utbytte).

MS og NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel D

Fremstilling av

Trinn l

Fremstilling av 3-klor-5-bromsalisylaldehyd

Til en 5 1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og gasstilførselsrør ble 5-bromsalisylaldehyd (495 g, 2,46 mol) og eddiksyre tilsatt ved romtemperatur for å danne en slurry. Til denne blandingen ble klorgass tilsatt ved en moderat hastighet inntil et lett molart overskudd av klor (183 g, 1,05 mol) var oppløst. Etter tilsettingen ble stoppet ble reaksjonen tillatt å foregå over natten. Det dannede faststoffet ble gjenvunnet ved filtrering og filtratet fortynnet i vann (2,5 1). Blandingen ble rørt kraftig i 20 minutter, produktet samlet ved filtrering og vasket med vann. De kombinerte faststoffene ble vakuumtørket for å gi det ønskede 3-klor-5-bromsalisylaldehyd (475 g, 82% utbytte) .

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av 6-brom-8-klorkumarin

Til en 5 1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og kjøler ble 3-klor-5-bromsalisylaldehyd {554,1 g, 2,35 mol, 1 ekviv.), eddiksyre {1203 g, 11,8 mol, 5 ekviv.) og trietylamin {237,4 g, 2,35 mol, 1 ekviv.) tilsatt Reaksjons-løsningen ble varmet ved refluks (131-141°C) over natten. Den mørkebrune reaksjonsblandingen ble kjølt til 50°C og is {2 1) tilsatt (isbadkjøling) ved røring. Etter en time ble blandingen filtrert og filtratet kombinert med EtOH {11). Til denne blandingen ble EtOH (300 ml) tilsatt og reaksjonsblandingen rørt i en time. Bunnfallet som ble dannet ble samlet ved filtrering og vasket med vann: EtOH (3 x 1,3 1), vakuum og tørket, så tørket på en svevesjikt-tørker. Det totale isolerte utbytte er 563 g eller 92%.

MS og <1>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av 3-amino-3-(2-hydroksy-3-klor-5-brom)fenylpropansyre-etylester

Til en 3-halset 5 1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører ble 6-brom-8-klorkumarin (300 g, 1,16 mol){fremstilt i trinn 2) og tørr THF (900 ml, Aldrich Sure Seal) tilsatt.

Den resulterende blandingen ble kjølt til mindre enn -45°C (tørris/acetonbad) og litium bis(trimetylsilyl)amid (0,80 mol, 800 ml IM i THF og 0,6 1 i heksaner, 1,2 ekvivalenter) tilsatt mens opprettholdende en temperatur under -45°C i 0,5 time. I en separat 5 1 flaske ble EtOH (2,5 1) og HC1 (4 N HCl i dioksan, 1 1) kombinert ved -15°C. Kumarinreak-sjonen ble stoppet ved tilsetting av den kjølte HCl/EtOH løsningen. Etter 0,5 timer var den resulterende reaksjons-blandingstemperaturen -8,3°C. Reaksjonsblandingen ble opp-holdt ved 0°C over natten, konsentrert til ca. 2,5 1 og delt mellom EtOAc (3 1) og vann (4 1). Den organiske fasen ble vasket med vandig HCl (4 x 1,2 1, 0,5 N HCl). pH til de kombinerte vandige sjiktene ble justert til ca. 8 ved tilsetning av 10% vandig NaOH og ekstrahert med metylenklorid (1 x 7 1 og 3 x 2 1). De kombinerte organiske fasene ble tørket (MgS04, 900 g) , filtrert og 4M HCl i dioksan (400 ml) tilsatt ved røring. Ved fullførelse av utfellingen ble faststoffet fjernet ved filtrering. Blandingen ble konsentrert til 2,5 1, heksaner tilsatt (2,5 1) og bunnfallet isolert ved filtrering. Filterkaken ble vasket med metylenklorid/heksaner (1:2), sugetørket og vakuumovnstørket ved 40°C for å oppnå det ønskede produktet (251 g, 60% utbytte) .

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av grunnleggende den samme fremgangsmåte og relative mengder som spesifisert for dens isomere i eksempel B, trinn 4.

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 6

Fremstilling av

Denne forbindelsen ble fremstilt ved anvendelse av grunnleggende samme fremgangsmåte og relative mengder som spesifisert for dens isomer i eksempel B, trinn 5.

MS og ^ NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel E

Fremstilling av

Trinn 1

Fremstilling av 3-jod-5-klorsalisylaldehyd

N-jodsuccinimid {144,0 g, 0,641 mol) ble tilsatt til en løsning av 5-klorsalisylaldehyd (100 g, 0,638 mol) i dimetylformamid (400 ml). Reaksjonsblandingen ble rørt i to døgn ved romtemperatur. Ytterligere N-jodsuccinimid (20,0

g) ble tilsatt og røringen ble fortsatt i ytterligere to døgn. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat

(1 1) vasket med saltsyre {300 ml, 0,1 N) vann (300 ml), natriumtiosulfat (5%, 300 ml), saltløsning (300 ml), tørket (MgS04) og konsentrert til tørrhet for å gi det ønskede aldehyd (162 g, 90% utbytte) som et blekt gult faststoff.

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av 6-klor-8-jodkumarin

En blanding av 3-jod-5-klorsalicylaldehyd (100 g, 0,354 mol) eddiksyreanhydrid (300 ml)og trietylamin (54 ml) ble varmet til refluks i 18 timer. Ved kjøling, falt det ønskede kumarin ut som et mørkt brunt krystallinsk materiale. Det ble filtrert, vasket med heksan/etylacetat (4:1, 200 ml), og lufttørket. Utbytte: 60 g (55%).

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av (R,S)-4-amino-3,4-dihydro-6-klor-8-jodkuma-rinhydroklorid

Litium heksametyldisilazan {21,62 ml, IM, 21,62 mmol) ble tilsatt til en løsning av 6-klor-8-jodkumarin (6,63 g, 21,62 mmol) i tetrahydrofuran (100 ml) ved -78°C. Reaksjonsblandingen ble rørt ved denne temperaturen i 30 minutter, så ved 0°C i en time. Eddiksyre (1,3 g, 21,62 mmol) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble tømt i etylacetat (300 ml) og mettet natriumkarbonat (2 00 ml) løsning. De organiske fasene ble separert, vasket med saltløsning (200 ml) , tørket (MgS04) og ble konsentrert for å gi en rest. Resten ble tilsatt til vannfri eter (200 ml) fulgt av dioksin/HCl (4N, 30 ml) ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble rørt i en time ved romtemperatur, filtrert og ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produktet {4,6 g, 59% utbytte) som et pulver. (RPHPLC: Rf 6,8 minutter; Gradient 10% acetonitril -90% acetonitril over 15 minutter så til 100% acetonitril over de neste 6 minutter. Både vann og acetonitril inneholder 0,1% TFA. Vydac C18 proteinpeptidkolonnene, 2 ml/minutt strømningsrate, overvå-ket ved 254 nm).

MS og <l>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Fremstilling av (R,S)-etyl 3-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)fenylpropionat-hydroklorid.

Saltsyregass ble boblet inn i en løsning av 4-amino-3,4-di-hydro-6-klor-8-jodkumarinhydroklorid (22,0 g, 61,09 mmol) i etanol (250 ml) opprettholdende reaksjonsblandingen ved 0-10°C til metning. Etter 6 timer ved refluks, ble det meste av løsningsmiddelet fjernet ved destillasjon. Den avkjølte resten ble tilsatt til vannfri eter og ble rørt i to timer. Den opprinnelige gummien forandret seg til et krystallinsk materiale. Det krystallinske produktet ble filtrert og tørket for å gi det ønskede produktet (20 g, 81% utbytte) som et offwhite krystallinsk pulver. (Rf 7,52 minutter, betingelser som trinn 3).

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Fremstilling av (R,S)-etyl 3-(N-BOC-gly)amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)fenylpropionat.

En blanding av BOC-gly (2,16 g, 12,31 mmol), HOBT (1,67 g, 12,31 mmol), EDC1 (2,36 g, 12,31 mmol) og DMF (50 ml) ble rørt ved 0°C i 1 time. Etyl 3-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)propionathydroklorid (5,0 g, 12,31 mmol) ble tilsatt til reaksjonsblandingen fulgt av trietylamin (3,5 ml). Reaksjonsblandingen ble rørt i 18 timer ved romtemperatur. DMF ble fjernet in vacuo og resten ble delt mellom etylacetat {300 ml) og natriumbikarbonat (200 ml). Den organiske fasen ble vasket med saltsyre (1 N, 100 ml), saltløsning (200 ml) , tørket (MgS04) og konsentrert for å gi det ønskede produktet som et faststoff (6 g, 93% utbytte).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 6

Fremstilling av (R,S)-etyl 3-(N-gly)-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-j od)fenylpropionathydroklorid.

Dioksan/HCl (4N, 20 ml) ble tilsatt til etyl 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)propionat (6,0 g, 11,39 mmol) ved 0°C og ble rørt ved romtemperatur i tre timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og konsentrert en gang til etter tilsetning av toluen (100 ml). Den oppnådde resten ble suspendert i eter og filtrert og tørket for å gi det ønskede produktet som et krystallinsk pulver (5,0 g, 95% utbytte). (RPHPLC: Rf 8,3 minutter, betingelser som i trinn 3).

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel F

Fremstilling av

Trinn 1

Fremstilling av 3-jod-5-bromsalisylaldehyd.

Til en løsning av 5-bromsalisylaldehyd {20,0 g, 0,1 mol) og kaliumjodid {17 g, 0,1 mol) i acetonitril (150 ml) og vann (50 ml) i en 500 ml rundkolbe med magnetisk rører ble kloramin T (23 g, 0,1 mol) tilsatt. Blandingen ble tillatt å reagere i en time. Reaksjonsblandingen ble delt mellom saltsyre (10%, 2 00 ml) og etylacetat. Den organiske fasen ble tørket (Na2S04), filtrert og konsentrert in vacuo. Til resten ble heksaner tilsatt og reaksjonsblandingen varmet til 50°C i 15 minutter. Det uoppløste materialet ble fjernet ved filtrering. Filtratet ble konsentrert in vacuo for å etterlate kanarigul 3-jod-5-bromsalicylaldehyd (26 g).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av grunnleggende de samme fremgangsmåter som eksempel E, trin-nene 2-6 hvor i trinn 2, en ekvivalent mengde av produkt fra trinn 1, 3-jod-5-brom-salisylaldehyd, ble substituert med 3-jod-5-klorsalisylaldehyd.

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel H

Fremstilling av

Trinn 1

Etanol (375 ml) og deionisert vann (375 ml) ble tilsatt til en 2 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører, Claisen adapter, tilsetningstrakt, reflukskjøler og termokopling. 1,3-diamino-2-hydroksypropan (125,04 g, 1,39 mol) (Aldrich) ble tilsatt til reaksjonskolben og rørt for å løse opp. Karbondisulfid (84 ml, 1,39 mol) ble tilsatt på dråpevis måte via tilsetningstrakt ved 25-33°C over en 35 minutters periode for å gi en melkehvit blanding. Temperaturen ble opprettholdt med et isbad. Reaksjonsblandingen ble reflukset ved 73,4°C i to timer for å gi en gul løsning. Reaksjonsblandingen ble kjølt med et isbad til 25°C og konsentrert HCl (84 ml) ble tilsatt på dråpevis måte mens temperaturen ble opprettholdt ved 25-26°C. Reaksjonsblandingen ble reflukset i 21 timer ved 78,4°C. Reak-sjonsløsningen ble kjølt til 2°C og produktet samlet via vakuumfiltrering. Det hvite faststoffet ble vasket tre ganger med isbadkjølt etanol: vann (1:1)(50 ml) og tørket in vacuo ved 40°C for å gi 5-hydroksytetrahydropyrimidin-2-tion (63,75 g, 34,7% utbytte) som et hvitt faststoff.

MS og NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

5-hydroksytetrahydropyrimidin-2-tion (95 g, 0,72 mol) fremstilt i trinn 1, absolutt etanol (570 ml), og metyljodid (42 ml, 0,72 mol) ble tilsatt til en 2-1 rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og termokopling. Reaksjonsblandingen ble reflukset ved 78°C i fem timer og så kjølt til romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert in vacuo for å gi et hvitt faststoff (194,72 g). Det hvite faststoffet ble triturert tre ganger med etyleter (500 ml) og tør-ket in vacuo for å gi 2-metyltioeter-5-hydroksypyrimidin-hydrojodid (188,22 g, 95,4% utbytte) som et hvitt faststoff.

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

2- metyl tioeter-5-hydroksypyrimidin-hydrojodid (150,81 g, 0,55 mol) metylenklorid (530 ml), dimetylacetamid (53 ml) og trietylamin (76,7 ml, 0,55 mol) ble tilsatt til en 2 1 3- halset rundkolbe utstyrt med reflukskjøler, mekanisk rører og en statisk atmosfære av nitrogen. Blandingen ble kjølt med et isbad og di-tert-butyl dikarbonat (120,12 g, 0,55 mol) ble tilsatt ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble varmet ved 42,5°C i 18 timer for å gi en lett gul løsning. Reaksjonsløsningen ble overført til en 2 1 separasjonstrakt og vasket tre ganger méd DI-vann (200 ml), tørket med MgS04, filtrert og konsentrert in vacuo for å gi Boc-2-metyltioeter-5-hydroksypyrimidin (134,6 g, 99,35% utbytte) som en lett gul viskøs olje.

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Boc-2-metyltioeter-5-hydroksypyrimidin (50,3 g, 0,204 mol), 3-amino-5-hydroksybenzosyre (Aust. J. Chem. (1981)34(6), 1319-24) (25,0 g, 0,1625 mol) og 50 ml vannfri DMA ble varmet ved 100°C med røring i to døgn. Et slurrybunnfall resulterte. Reaksjonen ble kjølt til romtemperatur og bunnfallet ble filtrert, vasket med CH3CN, så etyleter og tør-ket. Denne løsningen ble oppslemmet i H20, gjort sur med konsentrert HCl resulterende i en løsning. Denne ble fros-set og lyofilisert for å gi det ønskede produktet som et hvitt faststoff (14,4 g).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel I

Fremstilling av

Trinn 1

Fremstilling av Reformatsky reagens

En 4 1 flaske utstyrt med en kjøler, temperaturmåler og mekanisk rører ble fylt med Zn-metali (180,0 g, 2,76 mol -30

-100 mesh) og THF (1,25 1). Under røring, ble 1,2-dibrom-etan (4,47 ml, 0,05 mol)[alternativt, kan TMS Cl (0,1 ekvivalent) ved romtemperatur i en time substitueres]. Etter inert gasskylling (3 N2/vakuumsykler) ble suspensjonen av sink i THF varmet til refluks (65°C) og opprettholdt ved denne temperaturen i en time. Blandingen ble kjølt til 50°C før påfylling av tert-butylbromacetat (488 g, 369 ml, 2,5 mol) via 50 ml sprøyte og sprøytepumpe (satt til å levere 4,1 ml/minutt) i løpet av 1,5 timer. Reaksjonstemperatur på

50°C +/-5°C ble opprettholdt gjennom tilsetningen. Reaksjonsblandingen ble tillatt å røres ved 50°C i en time etter at tilsetningen var komplett. Etterfølgende ble blandingen tillatt å kjøle til 25°C og det utfelte produktet tillatt å falle til bunnen. THF-moderluten ble dekantert over i en 2 1 rundkolbe ved anvendelse av en grovt frittet filterplate og delvis vakuumoverføring {20 mm Hg). Dette fjernet ca. 65% av THF fra blandingen, l-metyl-2-pyrrolidon (NMP, 800 ml) ble tilsatt og røring gjenopptatt i fem minutter. Reaksjonsblandingen kan bli filtrert for å fjerne alt gjenværende sink. Analyse indikerte en titervæske av ønsket Reformatsky reagens på 1,57 M med et molart utbytte på 94%. Alternativt, kan den faste reagensen isoleres ved filtrering fra den opprinnelige reaksjonsblandingen. Kaken kan vaskes med THF inntil et hvitt faststoff blir oppnådd og tørket under N2 for å oppnå det ønskede produktet som et mono THF-solvat som kan lagres ved 20°C (tørket) i lengre perioder. Typiske gjenvinningsgrader er 85-90%.

Trinn 2

2A: Fremstilling av

Kaliumkarbonat (pulver, ovnstørket ved 100°C under vakuum, 8,82 g, 60 mmol) ble tilsatt til en løsning av 3,5-diklor-salisyldehyd (11,46 g, 60 mol) i DMF (40 ml) ved romtemperatur i en klar gul slurry. MEMCl (rent, 7,64 g, 61 mmol) ble så tilsatt mens bad-temperaturen opprettholdes ved 20°C. Blandingen ble så rørt ved 22°C i 6 timer og MEMCl (0,3 g, 2,4 mmol) ble tilsatt. Blandingen ble rørt i enda 0,5 timer og reaksjonsblandingen tømt i kaldt vann (200 ml) for å felle ut produktet. Slurryen ble filtrert på et trykkfilter og kaken ble vasket med vann (2 x 50 ml) og ble tørket under N2/vakuum for å gi produktet (14,94 g, 89%) som et offwhite faststoff. <*>H NMR (CDC13 TMS) 3,37 (s, 3H) , 3,54 til 3,56 (m, 2H), 3,91 til 3,93 (m, 2H), 5,30 (s, 2H), 7,63 (d, 1H), 7,73 (d,lH), 7,73 (d, 1H), 10,30 (s, 1H);<13>C NMR (CDC13, TMS) d (ppm): 59,03, 70,11, 99,57, 126,60, 129,57, 130,81, 132,07, 135,36, 154,66, 188,30,. DSC: 48,24°C (endo 90,51 J/g);

Mikroanalytisk: beregnet for CnH12Cl204:

C:47,33%; H:4,33%; Cl:25,40%

funnet: C:47,15%, H:4,26%, Cl:25,16%

2B: Fremstilling av

Produktet fra trinn 2A (35,0 g, 0,125 mol) ble fylt i en

l 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og en tilførselstrakt fulgt av addisjon av THF (200 ml). Løsningen ble rørt ved 22°C og (S)-fenylglykinol (17,20 g, 0,125 mol) ble så tilsatt i en omgang. Etter 30 minutter ved 22°C ble MgS04 (20 g) tilsatt. Blandingen ble rørt i en time ved 22°C, og filtrert på et grovt frittet filter. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Ingen videre rensing ble utført og det ubearbeidede iminet ble anvendt direkte i koplingsreaksjonen, trinn 2, C.

2C: Fremstilling av

En 1-1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører og en tilsetningstrakt ble fylt med den faste reagensen fremstilt i trinn 1 (91,3 g, 0,275 mol) og NMP (200 ml) under nitrogen. Løsningen ble så kjølt til -10°C og rørt ved 350 rpm. En løsning av imin (fremstilt i trinn 2B) i NMP ble fremstilt under nitrogen og så tilsatt over 20 minutter til den ovennevnte reaksjonsblandingen mens temperaturer ble opprettholdt ved -5°C (mantel temperatur -10°C) . Blandingen ble rørt i ytterligere 1,5 timer ved -8°C og l time ved -5°C etter at tilsetningen var fullstendig. Etter kjøling til -10°C ble en blanding av konsentrert HCl/mettet løsning av NH4CI (8,1 ml/200 ml) tilsatt i 10 minutter. MTBE (200 ml) ble tilsatt og blandingen ble rørt i 15 minutter ved 23°C og 200 rpm. Røring ble stoppet og sjiktene separerte. Den vandige fasen ble ekstrahert MTBE (100 ml). De to organiske fasene ble kombinert, vasket suksessivt med mettet løsning av NH4C1 (100 ml) vann (100 ml) og saltløsning (100 ml) . Løsningen ble tørket med MgS04 (30 g), filtrert og konsentrert for å gi en oransje olje (66,3 g) (størkner ved stillstand) inneholdende det ønskede produktet som en enkelt diastereoisomer (bekreftes ved proton og karbon NMR). En prøve ble renset for analyse ved omkrystallisering fra heptan for å gi produktet som var et offwhite faststoff.

Proton og karbon NMR og IR spektra var konsistente med den ønskede strukturen. [a]<D>25 = + 8,7° (c = 1.057, MeOH) . Mikroanalytisk: beregnet for C25H33C12N06: C: 58,77%, H: 6.74%, N: 2,72%, Cl: 13,78% funnet: C: 58,22%, H: 6,54%, N: 2,70%, Cl: 13,66%

Trinn 3

Fremstilling av

3A:

En løsning av den ubehandlede eteren fremstilt i trinn 2 [17,40 g, 0,033 mol (teori)], og EtOH (250 ml) ble fylt i en 1 1 3-halset mantlet reaktor. Løsningen ble kjølt til 0°C og Pb (OAc)4 (14,63 g, 0,033 mol) ble tilsatt i en omgang. Etter to timer ble en 15% løsning av NaOH (3 0 ml) tilsatt og etanol ble fjernet under redusert trykk. En annen del av 15% NaOH (100 ml) ble tilsatt og blandingen ekstrahert med MTBE (2 x 100 ml), vasket med H20 (2 x 100 ml) og saltløsning (50 ml), tørket med Na2S04, filtrert på celit og konsentrert under redusert trykk for å gi en oransje olje (12,46 g). Oljen var homogen ved tynnsjiktkromato-grafi (tic) og ble anvendt uten videre rensing.

3B:

Oljen fra 3A ble fortynnet med EtOH (30 ml) og paratoluen-sulfonsyre (1,3 ekviv., 0,043 mol, 8,18 g) ble tilsatt. Løsningen ble varmet til refluks i 8 timer, kjølt til omgi-velsestemperatur og konsentrert under redusert trykk. Resten ble behandlet med THF (20 ml) og varmet til refluks for å danne en løsning. Løsningen ble kjølt til romtemperatur og forbindelsen krystallisert. Heptan (30 ml) og THF (10 ml) ble tilsatt for å danne en væskeslurry som ble filtrert. Kaken ble vasket med THF/heptan (40 ml, l/l) og vakuumtørket i to timer i et trykkfilter under nitrogen for å gi et hvitt faststoff (7,40 g).

Proton og karbon NMR og IR spektra var konsistente med det ønskede produktet som i alt vesentlig av en enkelt enantio-

mer.

Mikroanalytisk: beregnet for Ci8H2iCl2N06S, 0,25 C4H80:

C: 48,73%, H: 4.95%, N: 2,99%, Cl: 15,14% funnet: C: 48,91%, H: 4,95%, N: 2,90%, Cl: 14,95%

Trinn 4

Fremstilling av:

Til en 500 ml rundkolbe utstyrt med en magnetisk rørestav og nitrogenbobler ble den frie basen av produktet dannet i trinn 3 (21,7 g, 0,065 mol), N-t-Boc-glysin N-hydroksysuccinimidester (17,7 g, 0,065 mol) og DMF (200 ml). Reaksjonsblandingen ble rørt under nitrogen ved romtemperatur i 3,25 timer og en blek oransje løsning dannet. Reaksjonsblandingen ble tømt i iskald etylacetat (1,2 1). Den organiske løsningen ble vasket med IM HCl (250 ml) og sammensetninger med saltløsning (500 ml), tørket (MgS04) og konsentrert under vakuum til nær tørrhet for å oppnå en olje som deretter ble tørket ved 50°C for å oppnå produktet som en fargeløs olje (28,12 g 99%). Rimkrystaller ble fremstilt fra etylacetat/heksaner. Produktet (ca 28 g) ble oppløst i etylacetat (35 ml) og heksaner (125 ml). Løsningen ble frøsatt med kimkrystallene og bunnfall dannet. Faststoffene ble filtrert og tørket over natten under vakuum ved 55°C for å gi et fargeløst faststoff (27,0 g, 95%).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Fremstilling av

Det Boe-beskyttede glysinamidet fremstilt i trinn 4 (27,0 g, 0,062 mol) ble tørket over natten over P205 og NaOH pel-lets. Faststoffet ble oppløst i dioksan (40 ml) og løsnin-gen kjølt til 0°C. Et ekvivalent volum av 4N HCl/dioksan (0,062 mol) ble tilsatt og reaksjonen ble kjølt i to timer. Ved dette punktet var omdannelsen 80% ved RPHPLC. Reaksjonsblandingen ble tillatt å varme til romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert ved 40°C til et skum som ble trituert med eter (200 ml). Det hvite faststoffet som ble dannet ble filtrert og tørket over P205 for å gi det ønskede glysin beta-aminosyreetylester forbindelsen som et HCl salt (20,4 g, 88,5% isolert utbytte).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel J

Fremstilling av

Trinn 1 Fremstilling av

MEM beskyttet 3-brom-5-klorsalisylaldehyd (129,42 g, 0,4 mol), fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel I, trinn 2A. En ekvivalent mengde av 3-brom-5-klorsalisylaldehyd ble substituert for 3,5-klorsalisylaldehyd som ble fylt i en 2 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører, fulgt av tilsetning av THF (640 ml) og (S)-fe-nylglykinol (54,86 g, 0,4 mol). Etter 30 minutter ved 22°C, ble MgS04 (80 g) tilsatt. Blandingen ble rørt i to timer ved 22°C, og filtrert på et grovt frittet filter. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi en blek gul olje (180,0 g) inneholdende det ønskede iminet. Ingen videre rensing ble utført og det ubearbeidede produktet ble anvendt direkte i koplingsreaksjonen, trinn 2.

Mikroanalytisk: beregnet for Ci9H2iBrClN04:

C:51,54%, H:4,78%, N:3,16%, Br:18,04%, Cl:8,00% funnet: C:50,22%, H:4,94%, N:2,93%, Br:17,15%, Cl:7,56%

Trinn 2

Fremstilling av

I en 5 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører, ble reagenset fra eksempel I, trinn 1 (332,0 g, 0,8 mol) tatt opp i NMP (660 ml) under nitrogen. Løsningen ble så avkjølt til -10°C. En løsning av iminet fra trinn 1 i NMP (320 ml) ble fremstilt under nitrogen og så tilsatt i løpet av 3 0 minutter til ovennevnte reaksjonsblanding mens temperaturen ble opprettholdt ved -5°C. Blandingen ble rørt i ytterligere en time ved -8°C og -5°C i to timer etter at tilsettingen var fullstendig og så kjølt til -10°C. En blanding av konsentrert HCl/mettet løsning av NH4C1 (30 ml/720 ml) ble tilsatt i løpet av 10 minutter. MTBE (760 ml) ble tilsatt og blandingen ble rørt i 30 minutter ved 23°C. Røring ble stoppet og sjiktene separerte. Den vandige fasen ble ekstrahert med MTBE (320 ml) de organiske fasene ble kombinert, vasket suksessivt med mettet vandig NH4C1 (32 0 ml), DI-vann (32 0 ml) og saltløsning (320 ml). Løsnin-gen ble tørket med MgS04 (60 g), filtrert og konsentrert for å gi en gul olje (221,0 g) inneholdende det ønskede produktet som en enkelt diastereoisomer som bestemt ved proton NMR.

DSC: 211,80°C (endo. 72,56 J/g) , 228,34°C (98,23 J/g) ;

Mikroanalytisk : beregnet for C25H33BrClN06:

C: 53,72%; H:5,95%; N:2,50%; Br:14,29%; Cl:6,33% funnet: C:52,ll%; H:6,09%; N:2,34%; Br: 12,84%; Cl:6,33%

Trinn 3

Fremstilling av

En løsning av ubearbeidet ester, fremstilt i trinn 2 (~111 g), i etanol (1500 ml) ble fylt under argon atmosfære i en 3 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører. Reaksjonsblandingen ble kjølt til 0°C og blytetraacetat {88,67 g, 0,2 mol) ble tilsatt i en omgang. Reaksjonsblandingen ble rørt i 3 timer ved 0°C og så ble 15% vandig NaOH (150 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen under 5°C. Metanol ble fjernet under redusert trykk på rotasjonsfordamper. Ytterligere 150 ml av 15% vandig NaOH ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat (3 x 300 ml) og vasket med DI-vann (2 x 100 ml) og saltløsning (2 x 100 ml) og tørket over vandig MgSO4(30 g) . Det ble så filtrert over celit og konsentrert under redusert trykk for å gi det ønskede produktet (103 g) som en rød olje.

Trinn 4

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten anvendt for eksempel I, trinn 4 og trinn 5 ved å substituere en ekvivalent mengde av produktet fra trinn 3 i eksempel I, trinn 4.

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel K

Alternativ fremstillin<g> av forbindelsen i eksempel J

Trinn 1

Fremstilling av

Til produktet fra eksempel B, trinn 3, (50,0 g, 139,2 mmol) og NaHC03(33,5 g, 398,3 mmol) ble CH2C12(500 ml) og vann (335 ml) tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 10 minutter. En løsning av benzylklorformat (38,0 g, 222,8 mmol) CH2C12 (380 ml) ble tilsatt i løpet av 20 minutter med hurtig røring. Etter 50 minutter ble reaksjonsblandingen tømt inn i en separasjonstrakt og den organiske fasen samlet. Den vandige fasen ble vasket med CH2C12(170 ml). De kombinerte organiske fasene ble tørket (MgS04) og konsentrert in vacuo. Det resulterende gummi faststoffet ble triturert med heksan og samlet ved filtrering. Det lærfargede faststoffet ble tørket in vacuo for å gi den ønskede rase-miske produktet(61,2 g, 96% utbytte). Dette materialet ble utsatt for omvendt fase HPLC ved anvendelse av en kiral kolonne for å gi hver rene enantiomer. Kolonnen anvendt var en Whelk-0 (R,R), 10 um partikkelstørrelse anvendende en 90:10 heptan:etanol mobil fase. Optisk renhet ble bestemt til å være større enn 98% ved anvendelse av analytisk HPLC anvendende lignende kolonne og løsningsmiddelbetingelser.

<X>H NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Til en løsning av forbindelsene oppnådd i trinn 1 (48,5 g, 106,2 mmol) i CH2C12(450 ml) ble trimetylsilyljodid tilsatt via en kanyle. Den oransje løsningen ble rørt ved romtemperatur i en time. Metanol (20,6 ml, 509,7 mmol) ble tilsatt dråpevis og løsningen rørt i 5 minutter. Reaksjonsløsningen ble konsentrert in vacuo for å gi en oransje olje. Resten ble oppløst i metyl-t-butyleter (500 ml) og ekstrahert med IN HCl (318 ml) og vann (1 x 200 ml, 1 x 100 ml). De vandige ekstraktene ble tilbakevasket med MTBE (100 ml). Til den vandige løsningen ble fast NaHC03 (40,1 g, 478 mmol) tilsatt i små porsjoner. Den basiske vandige blandingen ble ekstrahert med MTBE (lx 11, 2 x 200 ml). Den kombinerte organiske løsningen ble vasket med saltløsning og konsentrert in vacuo for å gi det ønskede produktet (23,3 g, 68% utbytte).

<X>H NMR var konsistent med den foreslåtte strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av

Til en løsning av produktet fra trinn 2 (23,3 g, 72,1 mmol) i DMF (200 ml) ble N-t-Boc-glysin N-hydroksysuccinimid ester (17,9 g, 65,9 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i 20 timer. Blandingen ble tømt i

etylacetat {1,2 1) og vasket med IM HCl (2 x 250 ml), mettet vandig NaHC03-løsning (2 x 250 ml) og saltløsning (2 x 250 ml) . Løsningen ble tørket (MgS04) og konsentrert for å gi det ønskede produktet {32,0 g, 100% utbytte).

Anal. beregnet for Ci8H24BrClN206:

C, 45,06; H, 5,04; N, 5,84.

Funnet: C, 45,17; H, 5,14; N, 6,12.

<*>H NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Til en løsning av produktet fra trinn 3 {31,9 g, 66,5 mmol), i absolutt etanol (205 ml) ble tilsatt en etanolisk HCl løsning (111 ml av en 3M løsning, 332,4 mmol). Reak-sjonsløsningen ble varmet ved 58°C i 30 minutter. Løsningen ble kjølt og konsentrert in vacuo resten ble oppløst i etylacetat (250 ml) og rørt ved 0°C i to timer. Et hvitt bunnfall ble samlet ved filtrering pg vasket med kald etylacetat. Løsningen ble tørket in vacuo for å gi det ønskede produktet (23,5 g, 85% utbytte).

Anal. beregnet for C13Hi6BrClN204 + 1,0 HCl:

C, 37,53; H, 4,12; N, 6,73.

Funnet: C, 37,29; H, 4,06; N, 6,68.

<X>H NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Eksempel L

Fremstilling av

Trinn 1 Fremstilling av

Kaliumkarbonat (pulver, ovnstørket ved 100°C under vakuum, 22,1 g, 0,16 mol) ble tilsatt til en løsning av 3-klor-5-bromsalisylaldehyd (35,0 g, 0,15 mol) i DMF (175 ml) ved romtemperatur for å gi en klar gul slurry. MEMCl (rent, 25,0 g, 0,2 mol) ble så tilsatt mens bad-temperaturen opprettholdes på 20°C. Blandingen ble så rørt ved 22°C i 6 timer og ble tømt i DI vann (1200 ml) for å felle ut produktet. Slurryen ble filtrert på et trykkfilter og kaken ble vasket med DI vann (2 x 400 ml) og så tørket under N2/vakuum for å gi produktet (46,0 g, 95% utbytte) som et offwhite faststoff. <X>H NMR (CDC13, TMS) 3,35 (s,3H), 3,54 til 3,56 (m, 2H), 3,91 til 3,93(m, 2H), 5,30 (s,2H), 7,77 (d, 1H) , 7,85 (d, 1H) , 10,30 (s,lH); 13 C NMR (CDC13, TMS)(ppm): 59,05, 70,11, 71,49, 99,50, 117,93, 129,69, 129,78, 132,37, 138,14, 155,12 188,22. DSC: 48,24°C (endo 90,51 J/g);

Mikroanalytisk : beregnet for CuHuBrClNO*:

C: 40,82%; H:3,74%; Cl:10,95% Br:24,69%; funnet: C:40,64%; H:3,48%; Cl:10,99% Br:24,67%. Trinn 2 Fremstilling av

Produktet fra trinn 1 (32,35 g, 0,1 mol) ble fylt i en 500 ml 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører, fulgt av tilsetning av THF(190 ml) og (S)-fenylglykinol (13,71 g, 0,1 mol) . Etter 30 minutter ved 22°C ble MgSO4(20 g) tilsatt. Blandingen ble rørt i en time ved 22°C og filtrert på et grovt frittet filter. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk for å gi en blek-gul olje (48,0 g) inneholdende det ønskede iminet. Ingen videre rensing ble utført og det ubearbeidede produktet ble anvendt direkte i det neste reaksjonstrinnet.

Mikroanalytisk : beregnet for Ci9H2iBrClN04:

C: 51,54%; H:4,78%; N:3,16%; Br:18,04%; Cl:8,00% funnet: C:51,52%; H:5,02%; N:2,82%; Br:16,31%; Cl:7,61%.

Trinn 3

Fremstilling av

I en 5 1 3-halset rundkolbe utstyrt med en mekanisk rører, ble reagens fra eksempel I, trinn 1, (332 g, 0,8 mol) tatt opp i NMP (660 ml) under nitrogen. Løsningen ble så kjølt til -10 °C. En løsning av imin fremstilt i trinn 2, i NMP (320 ml) ble fremstilt under nitrogen og så tilsatt i løpet av 30 minutter til den ovennevnte reaksjonsblandingen mens temperaturen ble opprettholdt ved -5 °C. Blandingen ble rørt i ytterligere 1 time etter tilsetningen var fullstendig og kjølt til -10 °C. En blanding av konsentrert HCl/ mettet løsning av NH4C1(30 ml/720 ml) ble tilsatt i løpet av 10 minutter. MTBE(760 ml) ble tilsatt og blandingen ble rørt i l time ved 23°C. Røring ble stoppet og fasene ble separert. Den vandige fasen ble ekstrahert med MTBE (320 ml) . De to organiske fasene ble kombinert, vasket suksessivt med en mettet løsning av NH4C1 (320 ml), DI-vann (320 ml) og saltløsning (320 ml). Løsningen ble tørket med MgSO4{60 g), filtrert og konsentrert for å gi en gul olje (228 g) inneholdende det ønskede produktet som en enkelt diastereoisomer. DSC:227,54°C (endo.61,63 J/g) ;

Mikroanalytisk : beregnet for C25H33BrClN06:

C: 53,72%; H:5,95%; N:2,50%; Br:14,29%; Cl:6,33% funnet: C:53,80%; H:6,45%; N:2,23%; Br: 12,85%; Cl:6,12%.

Trinn 4

Fremstilling av

En løsning av ubearbeidet ester, fremstilt i trinn 3 (~111

g), i etanol (1500 ml) ble fylt under nitrogen atmosfære til en 3 1 3-halset rundbunnflaske utstyrt med en mekanisk

rører. Reaksjonsblandingen ble kjølt til 0°C og bly tetra-acetat (88,67 g, 0,2 mol) ble tilsatt i en omgang. Reaksjonsblandingen ble rørt i 3 timer ved 0°C og så ble 15%

vandig NaOH (150 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen under 5°C. Etanolen ble fjernet under redusert trykk på rotasjonsfordamper. Ytterligere 600 ml av 15% vandig NaOH ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble ekstrahert med etylacetat (2 x 300 ml), MTBE (2 x 200 ml) og etylacetat (2 x 200 ml). De organiske fasene ble kombinert og vasket med DI vann (2 x 200 ml) og saltløsning (2 x 100 ml) og tørket over vannfri MgS04 (30 g) . Løsningen ble så filtrert over celit og konsentrert under redusert trykk for å gi produktet som en oransje olje (96 g) som ble anvendt i neste trinn uten videre rensing.

DSC:233,60°C (endo. 67,85 Jg);

Mikroanalytisk : beregnet for C24H29BrClN05:

C:54,71%; H:5,54%; N:2,65%; Br:15,16%; Cl:6,72% funnet: C:52,12%; H:5,40%; N:2,47%; Br:14,77%; Cl:6,48%.

Trinn 5

Fremstilling av

Det ubearbeidede produktet fra trinn 4 (~94 g) ble tatt opp i absolutt etanol (180 ml) og para-toluensulfonsyre-monohydrat (50,0 g, 0,26 mol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble så varmet til refluks i 8 timer etter dette ble løs-ningsmidlet fjernet under redusert trykk. Restfaststoffet ble tatt opp i THF (100 ml) og THF ble så strippet av under redusert trykk. Resten ble oppløst i etylacetat (500 ml) og kjølt til -5°C. Faststoffet ble filtrert og vasket med heptan (2 x 50 ml) for å gi et hvitt faststoff. Faststoffet ble så lufttørket for å gi det ønskede produktet som et hvitt faststoff (38 g) som en enkelt isomer.Hl NMR (DMSO, TMS)(ppm)1,12 (t,3H), 2,29(s,3H), 3,0 (m,2H), 4,05 (q,2H),

4,88 (t,lH), 7,11 (d,2H), 7,48 (d,2H), 7,55 (D,1H), 7,68 (lH,d), 8,35 (br.s,3); <13>C NMR (DMSO, TMS) (ppm) : 13,82, 20,75, 37,13, 45,59, 60,59, 110,63, 122,47, 125,44, 127,87, 128,06, 129,51, 131,95, 137,77, 145,33, 150,14, 168,98;

DSC: 69,86°C (end.,406,5 J/g), 165,72°C (end. 62,27 J/g), 211,24°C (ekso.20,56 j/g) [a] D25= + 4,2° (c=0,960,MeOH) ; IR (MIR) {cm-D 2922, 1726, 1621, 1591, 1494, 1471, 1413, 1376, 1324, 1286, 1237, 1207;

Mikroanalytisk: beregnet for CiBH21BrClN06S:

C:43,69%; H:4,27%; N:2,83%; Br:16,15%; Cl:7,16%; S:6,48% funnet: C:43,40%; H:4,27%; N:2,73%; Br.-16,40%; Cl:7,20%; S:6, 54%

Trinn 6

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til fremgangsmåtene fremlagt i eksempel I, trinn 4 og trinn 5 hvor en ekvivalent mengde av mellomproduktet fremstilt i trinn 5 som den frie basen blir substituert.i eksempel I, trinn 4.

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel M

Fremstilling av

Trinn 1

Fremstilling av 3-jod-5-klorsalisylaldehyd.

N-jodsuccinimid (144,0 g, 0,641 mol) ble tilsatt til en løsning av 5-klorsalisylaldehyd (100 g, 0,638 mol) i dimetylformamid (400 ml). Reaksjonsblandingen ble rørt i to døgn ved romtemperatur. Ytterligere N-jodsuccinimid (20,0 g) ble tilsatt og røring fortsatte i ytterligere to døgn. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (1 1), vasket med saltsyre (300 ml, 0,1N), vann (300 ml), natriumtiosulfat (5%, 300 ml), saltløsning (300 ml), tørket (MgS04) og konsentrert til tørrhet for å gi det ønskede aldehydet som et blek-gult faststoff (162 g, 90% utbytte).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av 2-0-(MEM)-3-jod-5-klorsalisylaldehyd.

Kaliumkarbonat (41,4 g, 0,30 mol) ble tilsatt til en løs-ning av 3-jod-5-klorsalisylaldehyd (84,74 g, 0,30 mol) i DMF (200 ml) ved 20°C. Dette resulterte i en gul slurry og MEM-C1 (38,2 g, 0,305 moi) ble tilsatt mens reaksjonstempe-raturen opprettholdes. Etter to timer, ble ytterligere MEMCl (1,5 g) tilsatt. Etter røring i en time, ble reaksjonsblandingen tømt i en is-vann blanding og rørt. Bunnfallet som ble dannet, filtrert og tørket in vacuo for å gi det ønskede beskyttede aldehydet. Utbytte: 95 g (85%).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av

(S)-fenylglysinol {15,37 g, 0,112 mol) ble tilsatt til en løsning av 2-0-(MEM)-3-jod-5-klorsalisylaldehyd (41,5 g, 0,112 mol) i THF (200 ml) ved romtemperatur. Etter en time med røring ble MgS04 (16 g) tilsatt og røringen fortsatte i to timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert og filtratet ble konsentrert og ble tørket in vacuo i to timer for å gi det ønskede mellomproduktiminet. En 2-halset rundkolbe ble fylt med Reformatsky-reagenset fra eksempel I, trinn 1, (81,1 g, 0,2464 mol), og rørt ved -lO^C. En løsning av iminet i N-metylpyrrolidon (100 ml) ble sakte tilsatt mens temperaturen opprettholdes ved -10°C. Blandingen ble opprettholdt ved denne temperaturen i to timer og i en time ved -5°C. Etter kjøling av reaksjonsblandingen til -10°C, ble en løsning av konsentrert HCl i mettet ammoniumklorid (16 ml/200 ml) tilsatt. Etyleter (500 ml) ble tilsatt og rørt i to timer ved romtemperatur. Eterfasen ble separert og den vandige fasen ble videre ekstrahert med eter (300 nil) . De kombinerte eterfåsene ble vasket med mettet ammoniumklorid (200 ml), vann (200 ml), saltløsning {200 ml) tør-ket (MgS04) og konsentrert for å gi en olje (61,0 g, 90% utbytte). Hl NMR indikerte at den ønskede strukturen i alt vesentlig var en diastereomer og MS var samsvarende med den ønskede strukturen. Trinn 4 Fremstilling av

En løsning av den ubearbeidede esteren fremstilt i trinn 3 (48,85 g, 80,61 mol) ble oppløst i etanol (500 ml) og ble kjølt til 0°C. Bly (35,71 g, 80,61 mmol) ble tilsatt. Etter 3 timer ble 15% løsning av NaOH (73 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen. Det meste av etanolen ble fjernet under redusert trykk. Til resten ble en 15% løsning av NaOH (200 ml) tilsatt og denne ble så ekstrahert med eter (400 ml). Eterfasen ble vasket med vann (100 ml), saltløsning (100 ml), tørket og konsentrert for å gi en oransje olje. Oljen ble løst opp i etanol (100 ml) og para-toluensulfonsyre (19,9 g) ble tilsatt. Løsningen ble varmet ved refluks i 8 timer og konsentrert under redusert trykk. Resten ble fortynnet med THF (60 ml) og varmet ved refluks og kjølt. Bunnfallet ble filtrert, vasket med heksan (300 ml, 1:1) og tørket for å gi det ønskede produktet.

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

S-Etyl 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)fenylpropionat

Til en blanding av BOC-gly-OSu(9,4 g, 34,51 mmol), etyl 3-(S)-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)propionat-PTSA-salt (17,0 g, 31,38 mol) i DMF (200 ml) ble trietylen (4,8 ml) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt i 18 timer ved romtemperatur. DMS ble fjernet in vacuo og resten ble delt mellom etylacetat (600 ml) og fortynnet saltsyre (100 ml). Den organiske fasen ble vasket med natriumbikarbonat (200 ml) , salt løsning (200 ml) , tørket (MgS04) og ble konsentrert for å gi det ønskede produktet som et faststoff

(14,2 g, 86% utbytte).

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 6

S-etyl 3-(N-gly)-amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)fenylpropionat-hydroklorid.

Dioksan/HCl (4N, 70 ml) ble tilsatt til etyl 3-(S)-(N-BOC-gly) -amino-3-(5-klor-2-hydroksy-3-jod)fenylpropionat (37,20 g, 70,62 mmol) ved 0°C og rørt ved romtemperatur i tre timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og konsentrert en gang til etter tilsetting av toluen (100 ml). Resten oppnådd ble suspendert i eter, filtrert og tørket for å gi det ønskede produktet som et krystallinsk pulver (32,0 g, 98% utbytte).

MS og <X>R NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel N

Fremstilling av

Trinn 1 Fremstilling av Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til eksempel I, trinn 2A, substituerende en ekvivalent mengde av 2-hydroksy-3,5-dibrombenzaldehyd for 3,5-diklorsalisylaldehyd. Utbytte: 88%; blekt gult faststoff; smp. 46-47°C; Rf = 0,6 (EtOAc/heksan 1:1 v/v); Hl-NMR (CDC13) d 3,37 (s, 3H) , 3,56 (m, 2H), 3,92 (m, 2H), 5,29 (s, 2H), 7,91 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,94 {d, 1H, J = 2,4 Hz), 10,27 <S, 1H); FAB-MS m/ z 367 (M<*>)

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten for eksempel I, trinn 2B og trinn 2C, substituerende en ekvivalent mengde av forbindelsen i trinn 1 i eksempel I, trinn 2B.

Utbytte 90%; gult faststoff; smp.57-59°C; Rf = 0,46 (EtOAc/ heksan 1:1 v/v); <*>H-NMR {CDC13) d 1,45 (s, 9H) ; 2,1 {br, 1H utbyttbar), 2,51 {d, 1H, Jj. = 9,9 Hz, J2 = 15,3 Hz), 2,66

(d, 1H, Ji = 4,2 Hz, J2 = 15,3 Hz), 3,02 {br, 1H, utbyttbar), 3,39 {s, 3H), 3,58-3,62 (m, 4H), 3,81 (m, 1H), 3,93 (m, 2H), 4,63 {dd, 1H, J = 4,2 Hz), 5,15 (s, 2H), 7,17-7,25 (m, 6H), 7,49 {d, 1H); FAB-MS m/ z 602 ((M + H)

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse {p-toluensulfonatsalt) ble fremstilt i henhold til eksempel I, trinn 3 ved å substituere en ekvivalent mengde av produktet fremstilt i trinn 2 i eksempel I, trinn 3A. Utbytte 62%; hvitt faststoff; <*>H-NMR (DMSO-de) d 1,09 (t, 3H, J = 7,2 Hz) , 2,27 (s, 3H) , 2,97 (dd, 2H, Ji = 3,0 Hz, J2 = 7,2 Hz), 4,02 {q, 2H, J = 7,2 Hz), 4,87 (t, 1H, J = 7,2 Hz), 7,08 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 7,45 {m, 3H), 7,57 {d, 1H, J = 2,4 Hz), 8,2 (br, 3H); FAB-MS m/ z 365 (M + H)

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 4

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten til eksempel I, trinn 4 substituerende forbindelsen fremstilt i trinn 3. Det resulterende BOC-beskyttede mellomproduktet, ble omdannet til den ønskede forbindelsen ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel I, trinn 5.

MS og ^ NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel P

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten til eksempel I ved å substituere en ekvivalent mengde av 3-jod-5-bromsalisylaldehyd fremstilt i eksempel F, trinn 1 med 3,5-diklorsalisylaldehyd i eksempel I, trinn 2A.

Eksempel 1

( ±) 3- brom- 5- klor- 2- hvdroksv- p- r\ 2 - f fr3- hydroksv- 5 r( 1. 4, 5, 6-tetrahvdro- 5- hydoksypyrimidin- 2- yl) amino] fenvl] karbonyl] amino]- acetyl] amino] benzenpropansyre. trifluoracetatsalt Fremstilling av

Til produktet fra eksempel H (0,4 g, 0,0014 mol), ble produktet fra eksempel B (0,58 g, 0,0014 mol), trietylamin (0,142 g, 0,0014 mol), DMAP (17 mg), og vannfri DMA (4 ml) tilsatt EDC1 (0,268 g, 0,0014 mol) ved isbadtemperatur. Reaksjonen ble rørt over natten ved romtemperatur. Det resulterende estermellomproduktet ble isolert ved omvendt fase preparativ HPLC. Til denne esteren i H20 (10 ml) og CH3CN

(5 ml) ble LiOH (580 mg, 0,0138 mol) tilsatt. Etter røring ved romtemperatur i en time ble pH senket til 2 med TFA og produktet ble renset ved omvendt fase preparativ HPLC for å gi (etter lyofilisering) det ønskede produktet som et hvitt faststoff (230 mg).

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 2

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til metodikken i eksempel 1, ved å bytte en ekvivalent mengde av produktet fra eksempel A med produktet fra eksempel B. Utbyttet etter lyofilisering var 320 mg som et hvitt faststoff .

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 3

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til metodikken i eksempel 1, ved å bytte en ekvivalent mengde av produktet fra eksempel F med produktet fra eksempel B. Utbyttet (etter lyofilisering) var 180 mg som et hvitt faststoff.

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 4

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til metodikken i eksempel 1, ved å bytte en ekvivalent mengde av produktet fra eksempel D med produktet fra eksempel B. Utbyttet {etter lyofilisering) var 180 mg som et hvitt faststoff.

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 5

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til metodikken i eksempel 1, ved å bytte en ekvivalent mengde av produktet fra eksempel E med produktet fra eksempel B. Utbyttet (etter lyofilisering) var 250 mg som et hvitt faststoff.

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 6

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt i henhold til metodikken i eksempel l, ved å bytte en ekvivalent mengde av produktet fra eksempel C med produktet fra eksempel B. Utbyttet (etter lyofilisering) var 220 mg som et hvitt faststoff.

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 7

Fremstilling av

Til produktet fra eksempel H (7,8 g, 0,027 mol) oppløst i vannfri DMA (50 ml) i en flammetørket kolbe under N2 og ved isbadtemperatur ble isobutylklorformat (3,7 g, 0,027 mol) sakte tilsatt fulgt av N-metylmorfolin (2,73 g, 0,027 mol). Løsningen ble rørt ved isbadtemperatur i 15 minutter. Til reaksjonsblandingen ble så produktet fra eksempel 1 (10,0 g, 0,024 mol) tilsatt ved isbadtemperatur fulgt av N-metylmorfolin (2,43 g, 0,024 mol). Reaksjonen ble så rørt ved romtemperatur over natten. Det resulterende ester mellomproduktet ble isolert ved omvendt fase preparativ HPLC. Til estere i H20 (60 ml) og CH3CN (30 ml) ble LiOH (10 g, 0,238 mol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i en time. pH ble så senket til 2 med TFA. Produktet ble renset ved omvendt fase preparativ HPLC for å gi (etter lyofilisering) det ønskede produktet som et hvitt faststoff (9,7 g).

MS og <X>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 8

( S) 3, 5- diklor- 2- hvdroksv-( 3- Tf2- [ [ r3- hvdroksv- 5- [( 1. 4. 5. 6-tetrahvdro- 5- hydoksypvrimidin- 2- vi) amino] fenyl] karbo-nyl] amino] acetyl] amino]- benzenpropansyre, monohvdroklorid monohydrat

Fremstilling av

Trinn A

Til produktet fra eksempel H (9,92 g, 0,0345 mol) oppløst i vannfri DME (200 ml) blir N-metylmorfolin (4,0 ml, 0,0362 mol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kjølt til -5°C (salt-isbad). isobutylkloroformat, IBCF (4,48 ml, 4,713 g, 0,0345 mol) ble tilsatt over ett minutt og reaksjonsblandingen rørt ved isbadtemperatur i 12 minutter. Til reaksjonsblandingen ble så produktet fra eksempel I (11,15 g, 0,030 mol) tilsatt ved isbadtemperatur fulgt av N-metylmorfolin (4,0 ml, 0,0362 mol). Reaksjonsblandingen ble tillatt å varme til romtemperatur og gå til fullstendighet, så konsentrert under vakuum ved 50°C for å gi en mørk rest. Resten ble oppløst i acetonitril: H20 (ca. 50 ml) . pH ble gjort sur ved tilsetning av små mengder TFA. Resten ble plassert på en 10 x 500 cm C-18 (50 um partikkelstørrelse) kolonne og estere av det ønskede produktet isolert. (Løsningsmid-delprogram: 100% H20 + 0,05% TFA til 30:70 H20 + 0,05% TFA: acetonitril + 0,05% TFA over 1 time ved 100 ml/minutt: løs-ningsmiddelprogrammet ble initiert etter at løsningsmiddel-fronten elueres) Preparativ RPHPLC rensing resulterte i et hvitt faststoff (10,5 g) etter lyofilisering (50%).

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn B

Produktet fremstilt i trinn A {ca. 11 g) ble oppløst i di-oksanrvann og pH til løsningen justert til ca. 11,5 (pH me-ter) ved tilsetning av 2,5 N NaOH. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur. Periodisk, ble pH re-justert til

>11 ved videre tilsetting av base. Etter 2-3 timer ble omdannelsen av ester til syre antatt å være fullstendig ved RPHPLC. pH til reaksjonsblandingen ble justert til omkring 6 og en viskøs olje falt ut fra løsningen. Oljen ble isolert ved dekantering og vasket med varmt vann (200 ml). Den resulterende vandige blandingen ble tillatt å kjøle og faststoffet ble samlet ved filtrering for å gi den ovennevnte forbindelsen (2,6 g etter lyofilisering fra HCl løsning). Resten, som var en mørk viskøs olje ble behandlet med varmt vann for ved kjøling å gi et lærfarget pulver (4,12 g etter lyofilisering fra HCl løsning).

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 9

( S) 3- brom- 5- klor- 2- hydroksy- p-[\ 2 -\ f[ 3- hydroksv- 5[( 1, 4, 5, 6-tetrahvdro- 5- hydoksypyrimidin- 2- vi) amino] fenyl] karbonyl] amino] acetyl] amino]- benzenpropansyre, trifluoracetatsalt Trinn 1

Fremstilling av

Til en suspensjon av produktet fra eksempel J (1,0 g, 2,4 mmol), ble produktet fra eksempel H (0,75 g, 2,6 mmol) og 4-dietylaminopyridin (40 mg) i N,N-dimetylacetamid (10 ml) tilsatt trietylamin (0,24 g, 2,4 mmol). Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 15 minutter og 1-(3-dimetylaminpropyl)-3-etylkarbodiimid hydroklorid (0,60 g, 3,1 mmol) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur over natten. Blandingen ble konsentrert in vacuo og renset ved omvendt fase HPLC (utgangsgradient 90:10 H20/TFA:MeCN, oppholdstid 22 minutter) for å gi det ønskede produktet, (1,6 g, 52% utbytte).

Hl NMR var konsistent med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Til en løsning av estere fremstilt i trinn 1 (800 mg, 1,2 mmol) i en 1:4 MeCN:H20 løsning (7 ml) ble litiumhydroksid (148 mg, 6,2 mmol) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i to timer. TFA (0,71 ml, 9,2 mmol) ble tilsatt og blandingen renset ved omvendt fase HPLC (utgangsgradient 95:5 H20/TFA:MeCN, oppholdstid 20 minutter) for å gi det ønskede produktet (860 mg, 83% utbytte).

Analytisk beregnet for C22H23BrClN507 + 1,7 TFA:

C, 39,18; H: 3,20; N, 8,99

funnet C, 39,11; H: 3,17; N, 9,07

MS og Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 3

Fremstilling av hydrokloridsaltet

Produktet fra trinn 2 ble oppløst i et passende løsnings-middel (acetonitril:vann) og løsningen ble sakte ført gjen-norner Bio-Rad AG2-8X (kloridform, 200-400 mesh, >5 ekvivalenter) ionebyttekolonne . Lyofilisering gir det ønskede produktet som et HCl salt.

Eksempel 10

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten i eksempel 8 ved å bytte produktet fra eksempel N med produktet fra eksempel I i eksempel 8, trinn A. Produktet ble isolert ved preparativ RPHPLC og lyofilisert for å gi det ønskede produktet som et TFA salt.

MS og <*>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 11

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av grunnleggende de samme fremgangsmåter som eksempel 8 og ved å bytte produktet fra eksempel M med produktet fra eksempel I i eksempel 8, trinn A. Produktet ble isolert ved preparativ RPHPLC og lyofilisert for å gi det ønskede produktet som et TFA-salt.

MS og <1>H NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Eksempel 12

Fremstilling av

Ovennevnte forbindelse ble fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåtene i eksempel 8 og ved å bytte produktet fra eksempel P med produktet fra eksempel I i eksempel 8, trinn A. Produktet blir isolert ved preparativ RPHPLC og lyofilisert for å gi det ønskede produktet som et TFA-salt.

Eksempel 13

Fremstilling av

Fremstilling av 2-0-(MEM)-3,5-dijodsalisylaldehyd

Kaliumkarbonat (18,5 g, 0,134 mol) ble tilsatt til en løs-ning av 3,5 dijodsalisylaldehyd (50,0 g, 0,134 mol) i DMF (150 ml) ved 20°C. Dette resulterte i en gul slurry og MEMCl (15,8 ml, 0,134 mol) ble tilsatt mens reaksjonstempera-turen opprettholdes. Etter to timer, ble ytterligere MEM-C1 (1,5 g) tilsatt. Etter røring i ytterligere en time, ble reaksjonsblandingen tømt over i isvann og rørt. Bunnfallet som ble dannet, ble filtrert, og tørket in vacuo for å gi det ønskede beskyttede aldehydet (61 g, 99% utbytte).

Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 2

Fremstilling av

(S)-fenyl glycinol (17,9 g, 0,13 mol) ble tilsatt en løs-ning av 2-0-MEM-3,5-dijodsalicylaldehyd (41,5 g, 0,112 mol) i THF (150 ml) ved romtemperatur. Etter en time røring ble MgS04 (20,7 g) tilsatt og røringen ble fortsatt i to timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert og filtratet ble konsentrert og tørket in vacuo i to timer. En 2-halset rundkolbe ble fylt med Refomatsky-reagenset (96 g, 0,289 mol) og N-metylpyrrilidon (250 ml) og ble rørt ved -10°C. En løsning av iminet i N-metylpyrrilidon (100 ml) ble sakte tilsatt

opprettholdende temperaturen ved -10°C. Blandingen ble opprettholdt ved denne temperaturen i to timer og en time ved -5°C. Etter kjøling av reaksjonsblandingen til -10°C, ble en løsning av konsentrert HCl i mettet ammoniumklorid (16 ml/200 ml) tilsatt. Etyleter (500 ml) ble tilsatt og blandingen ble rørt i to timer ved romtemperatur. Eterfasen ble separert, og den vandige fasen videre ekstrahert med eter (3 00 ml). De kombinerte eterfåsene ble vasket med mettet ammoniumklorid (200 ml), vann (200 ml), saltløsning (200 ml) , tørket (MgS04) og konsentrert for å gi en olje (90,0 g, 99% utbytte).

NMR indikerte det ønskede produktet og en diastereomer.

Trinn 3

Fremstilling av

En løsning av den ubearbeidede esteren fra trinn 2 (14,0 g, 20,1 mmol) ble løst opp i etanol (100 ml) og kjølt til 0°C. Blytetraacetat (9,20 g, 20,75 mmol) ble tilsatt i en omgang. Etter tre timer, ble 15% løsning av NaOH (73 ml) tilsatt til reaksjonsblandingen. Det meste av etanolen ble fjernet under redusert trykk. Resten ble tilsatt til en 15% løsning av NaOH (200 ml) som ble ekstrahert med eter (400 ml). Eterfasen ble vasket med vann (100 ml), saltløsning (100 ml), tørket og konsentrert for å gi en oransje olje. Denne ble oppløst i etanol (100 ml) og para-toluensulfonsyre (6,08 g) ble tilsatt. Løsningen ble varmet ved refluks i 8 timer og konsentrert under redusert trykk. Resten ble fortynnet med THF (60 ml), varmet ved refluks og avkjølt. Ved lagring ble ikke noe bunnfall dannet. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og renset ved preparativ HPLC for å gi aminosyren som dens PTSA-salt. Faststoffet oppnådd ble oppløst i etanol og ble mettet med HCl-gass. Reaksjonsblandingen ble varmet ved refluks i 6 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert for å gi PTSA-saltet av den ønskede aminosyren (12,47 g).

Trinn 4

Fremstilling av etyl 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(3,5-dijod-2-hydroksyfenyl)propionat

Til blandingen av BOC-gly-OSu (7,48 g, 27,04 mmol), etyl 3-(S)-amino-3-(3,5-dijod-2-hydroksyfenyl)propionat-PTSA-salt (12,47 g, 27,04 mmol) i DMF (100 ml) ble trietylamin (3,8 ml) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble rørt i 18 timer ved romtemperatur. DMS ble fjernet in vacuo og resten delt mellom etylacetat (500 ml) og fortynnet saltsyre (100 ml). Den organiske fasen ble vasket med natriumbikarbonat (200 ml), saltløsning (200 ml), tørket (MgS04) og konsentrert for å gi det ønskede produktet som et faststoff (17,0 g, 96% utbytte) .

Hl NMR var konsistente med den ønskede strukturen.

Trinn 5

Fremstilling av etyl 3-(N-gly)-amino-3-(3,5-dijod-2-hydrok-syf enyl) -propionat-hydroklorid

Til dioksan/HCl (4N, 40 ml) ble etyl 3-(N-BOC-gly)-amino-3-(S)-(3,5-dijod-2-hydroksyfenyl)propionat (17,0 g, 25,97 mmol) tilsatt ved 0°C og reaksjonsblandingen ble rørt ved romtemperatur i tre timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert, og konsentrert en gang til etter tilsetning av toluen (100 ml). Resten oppnådd ble tørket for å gi det ønskede produktet som et krystallinsk pulver (8,0 g, 56% utbytte) .

■""H NMR var konsistent med det ønskede produktet.

Trinn 6

En løsning av ml-(5-hydroksypyrimidin)hippursyre (3,74 g, 12,98 mmol) i dimetylacetamid (25 ml) ble varmet til alt materialet var oppløst. Det ble så kjølt til 0°C og isobutylkloroformat (1,68 ml) ble tilsatt i en porsjon fulgt av N-metylmorfolin (1,45 ml). Etter 10 minutter, ble etyl 3-(N-gly)-amino-3-(3,5-dijod-2-hydroksyfenyl)-propionat hydroklorid (6,0 g, 10,82 mmol) tilsatt i en porsjon fulgt av N-metylmorfolin (1,45 ml). Reaksjonsblandingen ble rørt i 18 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert, resten oppløst i tetrahydrofuran/vann (1:1, 20 ml), og ble kromatografert (omvendt fase, 95:5 vann:acetonitril over 60 minutter til 30:70 vann:acetonitril inneholdende 0,1% TFA). De kombinerte fraksjonene ble konsentrert. Resten ble oppløst i acetonitril, vann og litiumhydroksid ble tilsatt inntil basisk løsning. Løsningen ble rørt i to timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og ble renset som over ved HPLC for å gi den ønskede syren som TFA saltet. TFA saltet ble konvertert til det korresponderende hydrokloridsaltet ved å føre igjennom en ionebyttekolonne fulgt av lyofilisering.

<X>H NMR var konsistent med det ønskede produktet.

Eksempler 14- 18

Forbindelsene med formel VII, VIII, IX, XIII og XIV og isomerer derav, kan fremstilles i henhold til metodikken fremlagt heri ved å bytte det passende utgangsmaterialet og reagensene som ville være åpenbare for fagmannen.

Aktiviteten til forbindelsen i foreliggende oppfinnelse ble testet i følgende analyser. Resultatene av undersøkelsene i analysene er vist i tabell 1.

VITRONEKTIN- ADHESJONANALYSE

MATERIALER

Human vitronektinreseptor (avp3) ble renset fra human pla-senta som tidligere beskrevet [Pytela et al., Methods in Enzymology. 144: 475-489 (1987)]. Human vitronektin ble renset fra fersk frossen plasma som tidligere beskrevet [Yatogho et al., Cell Structure and Function. 13: 281-292

(1988)]. Biotinylert human vitronektin ble fremstilt ved å koble NHS-biotin fra Pierce Chemical Company (Rockford, IL) med renset vitronektin som tidligere beskrevet [Charo et al., J. Biol. Chem.. 266(3): 1415-1421 (1991)]. Analysebuffer, OPD substrat-tabletter, og RIA grad BSA ble oppnådd fra Sigma (St.Louis, MO). Anti-biotin antistoff ble oppnådd fra Calbiochem (La Jolla, CA). Linbro mikrotiterplater ble oppnådd fra Flow Labs (McLean, VA). ADP reagens ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO).

FREMGANGSMÅTER

Fastfasereseptoranalyser

Denne analysen var grunnleggende den samme som tidligere rapportert [Niiya et al., Blood, 70:475-483 (1987)]. Den rensede humane vitronektinreseptoren (Ovp^) ble fortynnet fra brukalløsninger til 1,0 g/ml i tris-bufret saltløsning inneholdende 1,0 mM Ca<++>, Mg<++> og Mn<++>, pH 7,4 (TBS+++) . Den fortynnede reseptoren ble umiddelbart overført til Linbro mikrotiter plater ved 100 ul/brønn (100 ng reseptor/brønn). Platene ble forseglet og inkubert over natten ved 4°C for å tillate reseptoren til å binde til brønnene. Alle ytterligere trinn var ved romtemperatur. Analyseplatene ble tømt og 200 ul av 1% RIA grad BSA i TBS<+++> (TBS<+++>/BSA) ble tilsatt for å blokkere eksponerte plastoverflater. Etter to timer inkubasjon, ble analyseplatene vasket med TBS<+*+> ved anvendelse av en 96 brønnplatevasker. Logaritmisk seriefortynning av testforbindelsen og kontrollen ble gjort startende ved en brukskonsentrasjon og 2 nM og anvendende 2 nM biotinylert vitronektin i TBS<+++>/BSA som fortynneren. Denne forblandingen av merket ligand med test (eller kontroll) ligand, og etterfølgende overføring av 50 ul alikvoter til analyseplaten ble utført med en CETUS Propette robot; sluttkonsentrasjonen til den merkede liganden var 1 nM og den høyeste konsentrasjonen av testforbindelsen var 1,0 x IO"<4> M. Konkurransen skjedde over to timer etter dette ble alle brønnene vasket med en platevasker som tidligere. Affinitetsrenset pepperrotperroksi-dase merket gjeteanti-biotin antistoff ble fortynnet 1:3000 i TBS<+++>/BSA og 125 1 ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutter, ble platene vasket og inkubert med 0PD/H20 og substrat i 100 mM/1 Citratbuffer, pH 5,0. Platen ble lest med en mikrotitterplateleser med en bølgelengde på 450 nm og når maksimal-bindingskontrollbrønnene nådde en absorbanse-bunn på omkring 1,0, ble den siste A450 registrert for analyse. Dataene ble analysert ved anvendelse av en makro skrevet for anvendelse med EXCEL regne-arkprogrammet. Middelverdien, standardavviket, og %CV ble bestemt for duplikate konsentrasjoner. Middelverdien for A450 verdiene ble normalisert til middelverdien for fire maksimum-bindingskontroller (ingen konkurrent tilsatt)(B-MAX). De normaliserte verdiene ble utsatt for en fire parameter kurvetilpasningsallegoritme [Rodbard et al., Int. Atomic Energy A<g>ency. Vienna, pp 469 (1977)], plottet på en semi-logaritmisk skala, og den beregnede konsentrasjonen tilsvarende inhibisjon av 50% av den maksimale bindingen av biotinylert vitronectin (IC50) og korresponderende R<2> ble rapportert for de forbindelsene som viste mer enn 50% inhibisjon ved den høyeste konsentrasjonen testet; ellers blir IC50 rapportert som å være større enn den høyeste konsentrasjonen testet. 0-[[2-[[5-£(aminoiminometyl)-amino]-1-oksopentyl]amino]-1-oksoetyl]amino]-3-pyri-dinpropansyre[USSN 08/375,338, eksempel 1] som er en sterk OvP3 antagonist (IC50 i området 3-10 nM) ble inkludert på hver plate som en positiv kontroll.

RENSET Ilb/ Illa RESEPTORANALYSE

MATERIALER

Human fibrinogenreseptor (ctnbPs) ble renset fra utdaterte blodplater. (Pytela, R., Pierschbacher, M.D., Argraves, S., Suzuki, S., og Rouslahti, E. "Arginine-Glycine-Aspartic acid adhesion receptors", Methods in Enzvmolocrv 144(1987):475-489). Human vitronektin ble renset fra fersk frossen plasma som beskrevet i Yåtohgo, T., Izumi, M., Kashiwagi, H. og Hyashi, M., "Novel purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatograp-hy," Cell Structure and Function 13(1988):281-292. Biotinylert human vitronektin ble fremstilt ved å koble NHS-boitin fra Pierce Chemical Company (Rockford, IL) med renset vitronectin som beskrevet tidligere. (Charo, I.F., Nan-nizzi, 1., Phillips, D.R., Hsu, M.A., Scaround bottomo-rough, R.M., "Inhibition of fibrinogen binding to GP Hb/Illa by a GP Illa peptide", J. Biol. Chem. 266(3)(1991):1415-1421). Analysebuffer, OPD substrattablet-ter, og RIA grad BSA ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). Anti-biotin antistoff ble oppnådd fra Calbiochem (La Jolla, CA). Linbro mikrotiterplater ble oppnådd fra Plow Labs (McLean, VA). ADP reagens ble oppnådd fra Sigma (St. Louis,

MO) .

FREMGANGSMÅTER

Fastfase- reseptoranalyse

Denne analysen er grunnleggende det samme som rapportert i Niiya, K., Hodson, E-, Bader, R., Byers-Ward, V.Koziol, J.A., Plow, E.F. og Ruggeri, Z.M., "Incrased surface ex-pression of the membrane glycoprotein Ilb/IIIa complex in-duced by platelet activation: Relationship to the binding of fibronogen and platelet aggregation" Blood 70(1987):475-48. Den rensede humane fibrinogenreseptoren (ctnbpa) ble fortynnet fra bruksløsningen til 1,0 ug/mL i Tris-buffret saltoppløsning inneholdende 1,0 mM Ca<*+>, Mg<++>, og Mn<++>, pH 7,4 (TBS+++) . Den f or tynnede reseptoren ble umiddelbart overført til Linbro mikrotiterplater ved 100 ul/brønn (100 ng reseptor/brønn). Platene ble forseglet og inkubert over natten ved 4°C for å tillate reseptoren å binde til brønne-ne. Alle resterende trinn var ved romtemperatur. Analyseplatene ble tømt og 200 ul av en 1% RIA grad BSA i TBS<+++>

(TBS<+++>/BSA) ble tilsatt for å blokkere eksponerte plastoverflater. Følgende en to timers inkubasjon, ble analyseplatene vasket med TBS<+++> ved anvendelse av en 96 brønn platevasker. Logaritmisk seriefortynning av testforbindelsen og kontroller ble gjort startede ved en brukskonsentrasjon på 2 mM og anvendende 2 nM biotinylert vitronektin i TBS<+++>/BSA som fortynneren. Denne forblandingen av merket ligand med test (eller kontroll) ligand, og etterfølgende overføring av 50 (il alikvoter til analyseplaten ble utført med en CETUS Propette robot; sluttkonsentrasjonen av den merkede liganden var nM og den høyeste konsentrasjonen av testforbindelsen var 1,0 x IO"<4> M. Konkurransen skjedde i to timer deretter ble alle brønnene vasket med en platevasker som før. Affinitetsrenset pepperrot peroxidase merket gjeteanti-biotin antistoff ble fortynnet 1:3000 i TBS<+++>/BSA og

125 ul ble tilsatt til hver brønn. Etter 30 minutter, ble platene vasket og inkubert med 0DD/H202 substrat i 100 mM/1 sitratbuffer, pH 5,0. Platen ble lest med mikrotiterplate-leser med en bølgelengde på 450 nm og når maksimum bin-dingskontrollbrønnene nådde en absorbanse bunn på omkring 1,0, ble den siste A450 registrert for analyse. Dataene ble analysert ved anvendelse av en makro skrevet for anvendelse med EXCEL™ regnearkprogram. Gjennomsnittet av standardavviket, og %CV ble bestemt for duplikate konsentrasjoner.

Gjennomsnittlig A450 verdier ble normalisert til gjennomsnittet av fire maksimum-bindingskontroller {ingen konkurrent tilsatt)(B-MAX). De normaliserte verdiene ble utsatt for en fire parameter kurvetilpasningsallegoritme, [Robard et al., Int. Atomic Energy Agency. Vienna. pp 469(1977)], plottet på en semilogaritmisk skala, og den beregnede konsentrasjonen tilsvarende inhibisjon av 50% av den maksimale bindingen av biotinylert vitronektin {IC50) og korresponderende R<2> ble rapportert for de forbindelsene som viste større enn 50% inhibisjon ved den høyeste konsentrasjon testet; eller blir IC50 rapportert som å være større enn den høyeste konsentrasjonen testet. |3- [ [2- [ [5- [ (aminoimino-metyl)-amino]-1-oksopentyl]amino]-1-oxetyl]amino]-3-pyri-dinpropansyre[USSN 08/375,338, eksempel l] som er en kraftig Ovp3 antagonist (IC50) i området 3-10 nM) ble inkludert på hver plate som en positiv kontroll.

Human blodplate rik plasma analyse

Friske aspirinfrie donorer ble valgt fra et forråd av fri-villige. Festingen av blodplaterik plasma og etterfølgende ADP indusert blodplateaggregeringsanalyser ble utført som beskrevet i Zucker, M.B., "Platelet Aggregation Measured by the Phtometric Method", Methods in Enzymology 169(1989):117-133. Standard venepunkturteknikker anvendende en butterfly tillot uttrekking av 45 ml av helt blod til en 60 ml sprøyte inneholdende 5 ml 3,8% trinatriumsitrat. Etterfølgende grundig blanding i sprøyten, ble det antikoa-gulerte hele blodet overført til en 50 ml konisk polyetylen tube. Blodet ble sentrifugert ved romtemperatur i 12 minutter ved 200 mg for å sendimentere ikke-blodplateceller. Blodplaterik plasma ble fjernet til en polyetylentube og lagret ved romtemperatur inntil anvendt. Blodplatefattig plasma ble oppnådd fra en andre sentrifugering av det gjenværende blodet ved 2000 xg i 15 minutter. Blodplatetall er typisk 300.000 - 500.000 per mikroliter. Blodplaterik plasma (0,45 ml) ble alikvotet til silikoniserte kyvetter og rørt (1100 rpm) ved 37°C i ett minutt før tilsetting av 50 ul av prefortynnet testforbindelse. Etter ett minutt med blanding, ble agglomerering initiert ved tilsetningen av 50 Hl av 200 u(Ml) ADP. Aggreggering ble registrert i tre minutter i en Payton dobbelkanal aggrometer (Payton Scientific, Buffalo, NY). Prosent inhibisjon av maksimal respons (saltløsning kontroll) for en serie av testforbin-delsesfortynninger ble anvendt for å bestemme en dose re-sponskurve. Alle forbindelsene ble testet i duplikat og konsentrasjonen av halv-maksimal inhibisjon (IC50) ble beregnet grafisk fra doseresponskurven for de sammensetningene som viste 50% eller større inhibisjon ved høyeste konsentrasjon testet; ellers, blir IC50 rapportert som å være høyere enn den høyeste testede konsentrasjonen.

Claims

1. Forbindelse med formel hvori X og Y er den samme eller ulik halo gruppe; R er H eller Ci-Cio-alkyl; og farmasøytisk akseptable salter derav.

2. Forbindelse i følge krav 1 valgt fra gruppen bestående av: hvori R er H eller alkyl; eller farmasøytisk akseptable salter derav.

3. Forbindelse i følge krav 1 valgt fra gruppen bestående av

4. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge krav 1 og en far-masøytisk akseptabel bærer.

5. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge krav 2 og en far-masøytisk akseptabel bærer.

6. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse i følge krav 3 og en far-masøytisk akseptabel bærer.

7. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle tilstander formidlet ved Ovp3 integrinen i et pattedyr med behov for slik behandling.

8. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle tumor metastase .

9. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle hard tumorvekst.

10. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle angiogenese.

11. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle osteoporose.

12. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle humoral hyperkalsemi av malignansi.

13. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav l, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle glatt mus-kelcellemigrasj on.

14. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle revmatoid artritt.

15. Anvendelse av forbindelsen ifølge krav 1, 2 eller 3 for å fremstille et medikament for å behandle makulær degenerasj on.