NO177876B - Diagnostisk analyseelement - Google Patents
Diagnostisk analyseelement Download PDFInfo
- Publication number
- NO177876B NO177876B NO902951A NO902951A NO177876B NO 177876 B NO177876 B NO 177876B NO 902951 A NO902951 A NO 902951A NO 902951 A NO902951 A NO 902951A NO 177876 B NO177876 B NO 177876B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- layer
- glyoxylagarose
- agarose
- reagent
- element according
- Prior art date
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 57
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000010410 layer Substances 0.000 claims description 172
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 24
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 6
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 6
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 4
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 claims description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 21
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 abstract description 4
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000000463 material Substances 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 20
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 16
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 15
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 14
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 14
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 14
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 10
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 10
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- -1 such as an antibody Substances 0.000 description 8
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 6
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 150000007857 hydrazones Chemical class 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenylhydrazine Chemical compound NNC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 KMVPXBDOWDXXEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 125000003976 glyceryl group Chemical group [H]C([*])([H])C(O[H])([H])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100037762 Caenorhabditis elegans rnh-2 gene Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N Glycidol Chemical compound OCC1CO1 CTKINSOISVBQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000005882 aldol condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000008199 coating composition Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229920000578 graft copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L terephthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/525—Multi-layer analytical elements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Semiconductor Integrated Circuits (AREA)
- Alarm Systems (AREA)
- Selective Calling Equipment (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Radar Systems Or Details Thereof (AREA)
- Coils Or Transformers For Communication (AREA)
- Internal Circuitry In Semiconductor Integrated Circuit Devices (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Control Of Motors That Do Not Use Commutators (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)
- Testing Or Measuring Of Semiconductors Or The Like (AREA)
Abstract
Flerlags, diagnostisk analyseelement hvori glyoksylagarose, en aldehydgruppe-derlvatlsert agarose,. anvendes 1 et eller flere lag av elementet. I en foretrukket utførelse benyttes glyoksylagarose for & lmmoblllsere biologiske spesles så son et protein 1 et lag av elementet.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører flerlags, diagnostiske analyseelementer hvori det anvendes materialer som er egnede for immobilisering av biologiske spesies, så som proteiner, i et spesifikt lag av elementet.
Forskjellige typer diagnostiske analyseelementer for rask analyse av analytter eller metabolitter i et biologisk fluid har vært beskrevet. Generelt påføres en prøve av et biologisk fluid, f.eks. plasma, serum, osv., på analyseelementet og som et resultat av interaksjonen mellom en analytt eller metabolitt av interesse og reagensen(e) tilstede i analyselementet frembringes en detekterbar endring svarende til analytten eller metabolitten. Den detekterbare endringen kan være en fargeendring som kan bedømmes visuelt eller avleses spektrofotometrisk, så som med et densitometer. I en annen utførelse basert på nærværet av fluorescens-merkede biologiske spesies genereres et fluorescerende signal og avleses spektrofluorometrisk.
Tynnfilm, flerlagsanalyselementer som er egnede for utførelse av immunometriske analyser har vært beskrevet innenfor teknikken. Disse tynnfilm, flerlagselementene innbefatter typisk en bærer som bærer minst et reagenslag og et lysblokkerende lag for å tillate de signal-genererende spesies i et lag og avleses uten interferens fra materialer tilstede i et annet lag. Elementene kan også innbefatte andre lag for utførelse av forskjellige funksjoner som f.eks. et registre-ringslag for fastholdelse av et signal-genererende spesies i, eller frigjort fra, et annet lag.
I forskjellige av analysefremgangsmåtene er det påkrevet at et biologisk spesies, f.eks. et antigen eller et antistoff immobiliseres i et reagenslag og at slike spesies forblir i det spesielle laget gjennom analysen. Det er kjent å kovalent binde proteinholdige materialer, så som antigener eller antistoffer, til et matriksmateriale, så som agarose, for å danne et reagenslag i slike analyseelementer. Imidlertid er denne immobiliseringsteknikken ikke tilfredsstillende i alle tilfeller. Det er også kjent, i immunometriske analyser utført med klassisk våtkjemiske metoder, å utnytte proteiner som er immobilisert ved at de er bundet til polymere kulematerialer. I disse analysene blir de biologiske spesies, som ikke interagerer med de immobiliserte proteinene, typisk fjernet fra reaksjonssonen ved hjelp av et vasketrinn. Imidlertid anvendes et vasketrinn typisk ikke med tynnfilm, flerlags analyseelementer fordi det ikke er noen mulighet for fjernelse av vaskevæsken som ville innbefatte de uomsatte reagensene.
Det foreligger derfor et stadig behov for nye materialer som kan benyttes for å tilveiebringe forskjellige funksjoner i flerlags analyseelementer.
Det er derfor et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et nytt biologisk, diagnostisk analysesystem.
Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe flerlags, biologiske, diagnostiske analyselementer som innbefatter glyoksylagarose, en aldehydgruppe-derivatisert agarose, i et eller flere lag.
Et ytterligere formål er å tilveiebringe flerlags, diagnostiske analyseelementer for analytter som har en molekylvekt på ca. 5000 eller mindre.
Ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et flerlags, diagnostisk analyseelement for analyse av proteiner av biologisk opphav (som antigener, antistoffer osv.) innbefattende et stort antall adskilte lag hvorav minst et er et reagenslag, kjennetegnet ved at minst et av det store antallet lag er dannet av et matriksmateriale som Innbefatter glyoksylagarose, fortrinnsvis en blanding av glyoksylagarose og et annet polysakkarid, fortrinnsvis en 3:1 vektblanding av agarose og glyoksylagarose, hvorved matriksmaterialet innbefatter fra 0,04 mekv. til 0,20 mekv. aldehyd pr. gram matriksmateriale.
Glyoksylagarosen er nyttig for immobilisering av biologiske spesies i et spesielt lag og for å holde de biologiske spesies i laget under analyseprosessen. Materialet er også nyttig som et filtermateriale, dvs. det kan forhindre materialer så som proteiner, bl.a. de som har molekylvekt på ca. 10000 eller høyere, fra å diffundere inn i, eller ut av, laget samtidig som det tillater materialer med lavere molekylvekt, så som haptener eller haptener merket med et signal-genererende fargestoff, å diffundere inn, ut av eller gjennom laget. Glyoksylagarosen kan benyttes I mer enn et lag av det samme diagnostiske analyselementet. For eksempel kan glyoksylagarose anvendes i et reagenslag for å immobilisere reagensen(e) anbragt deri og også benyttes 1 et filterlag i det samme analyseelementet.
Glyoksylagarosen kan benyttes for seg selv som et matriksmateriale for en reagens eller filterlag eller den kan benyttes i forbindelse med andre polysakkarider, så som umodifisert agarose.
For å oppnå en bedre forståelse av oppfinnelsen så vel som andre formål og ytterligere trekk ved denne, skal det vises til den følgende detaljerte beskrivelsen av forskjellige foretrukne utførelser, sett i sammenheng med de medfølgende tegningene, hvor: Figur 1 er et delvis skjematisk tverrsnitt av et flerlags analyseelement ifølge oppfinnelsen; og Figur 2 er et delvis skjematisk tverrsnitt av et annet flerlags analyseelement ifølge oppfinnelsen.
Glyoksylagarose er beskrevet i US patent nr. 4 275 196 som også angir at materialet er nyttig for sonevis immobilisering av proteiner i elektroforetiske teknikker for separasjon av komplekse proteiner og etterfølgende analyse av de separerte proteinene. Patentet antyder ikke anvendelsen av glyoksylagarose I de tørre, tynnfilm, flerlags analyseelementene tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse.
Glyoksylagarose kan fremstilles ved en to-trinns prosess. Innledningsvis behandles en suspensjon av kommersiell 4# agarosegel med glycidol og en oppløsning av IN NaOH inneholdende NaBH4 som en antioksydant. Deretter spaltes den resulterende glycerylagarosen ved reaksjon med perjodat slik at man får glyoksylagarose og formaldehyd. Glyoksylagarosen kan ha opp til to aldehydgrupper pr. bioseenhet av agarose.
Den aldehyd-derivatiserte agarosen undergår en reversibel reaksjon med et primært amin for dannelse av en Schiff-base som illustrert ved
Agarose-0-CH2CH0 + RNH2 Agarose-0-CH2CH=NR + H20. Likevekten i denne reaksjonen forskyves til høyre med økende pH. Følgelig kan et protein, så som et antistoff, bli kovalent bundet til glyoksylagarosen ved reaksjon mellom amingrupper av proteinet og aldehydgruppene som illustrert tidligere.
Mengden aldehyd pr. vektenhet derivatisert agarose kan variere avhengig av fremgangsmåten som benyttes for å fremstille det derivatiserte materialet. Mengden av tilgjengelig aldehyd pr. gram derivatisert materiale kan beregnes ved å utnytte reaktiviteten av aldehydgruppene med p-nitrofenylhydrazin for dannelse av hydrazoner som illustrert ved
En sirkulær prøve (2,54 cm i diameter) av en tørket film av glyoksylagarosemateriale båret på en polymer bærer kan bli bragt til å flyte, med den belagte siden ned, på overflaten av 50 ml p-nitrofenylhydrazinreagens ved pH 4 i en lukket glassbeholder på et oscillerende brett slik at filmen rystes forsiktig. Etter 3 timer fjernes filmprøvene, vaskes godt med vann og får tørke ved værelsesbetingelser. Den optiske absorbansen av filmene ved 390 nm registreres og mekv. av tilgjengelig aldehyd pr. gram derivatisert agarose beregnes, idet det antas en 1 cm veiledende og ekstinksjonskoeffisient (c) for hydrazon på 30 000.
Et reagenslag av elementet Ifølge oppfinnelsen kan dannes ved innledningsvis å fremstille en vandig oppløsning av glyoksylagarose (ca. Vfo faste stoffer) ved oppvarming til koking. Deretter avkjøles oppløsningen til 50-55°C og en oppløsning av reagensen(e), f.eks. et proteinholdig materiale, så som et antistoff, og en buffer tilsettes. Reaksjonen for å binde antistoffet til glyoksylagarosen krever en relativt høy pH, ca. 8,5 eller høyere. Reaktivitetsområdet varierer med pH; forøket binding finner sted med økende pH. Den reelle mengden binding er avhengig av pH og aldehydinnholdet av glyoksylagarosen. Materialet belegges så snart som mulig for å unngå eventuell uønsket denaturering av antistoffene ved den forhøyede temperaturen. Laget tørkes etter belegging, hvorunder bindingslikevekten fremmes når konsentrasjonen av vann reduseres. Reaksjonsbetingelsene fremmer også tverrbin-dingsreaksjoner, f.eks. via aldol-kondensasjon, av glyoksylagarosen, hvilket tilveiebringer en tett matriksstruktur. Ved henstand fortsetter bindingen og tverrbindingsreaksjonene å finne sted under de høye pH-betingelsene.
Som angitt tidligere, kan glyoksylagarosen også kombineres med andre polysakkarider så som uderivatisert agarose. I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen anvendes en ca. 3:1 vektblanding av uderivatisert agarose:glyoksylagarose i tynnfilm, flerlags analyseelementet. Blandingen er foretrukket p.g.a. den enkle håndteringen under f reinstill ingen og den etterfølgende bearbeidelsen. Blandingen kan fremstilles ved å blande en oppløsning av glyoksylagarose, typisk med mindre enn 5# faste stoffer, ved 50°C med en oppløsning av agarose under omrøring ved 50°C og fortsatt omrøring ved 50°C i flere minutter. Blandingen, som fortrinnsvis inneholder fra 0,04 mekv. til 0,20 mekv. av tilgjengelig aldehyd pr. gram totalblanding, kan benyttes i fremstilt tilstand eller kan tillates å gelere og oppvarmes ved et senere tidspunkt når det er ønskelig å inkorporere materialet i et tynnfilm, flerlags analyseelement.
Når et eller flere andre lag skal belegges over glyoksylagaroselaget eller glyoksylagaroselaget skal behandles videre på en slik måte som ved vasking for å redusere pH av det tørkede laget er det funnet at det innledningsvis dannede laget bør herde i et visst tidsrom, varierende fra få timer til en dag eller mer.
Forsøk har vist at resultatene som kan oppnås ved oppfinnelsen delvis avhenger av aldehydinnholdet av matriksmaterialet (glyoksylagarose eller en blanding av glyoksylagarose med andre polysakkarider) i reagens-, filter- eller annet lag. Mengden aldehyd pr. vektenhet matriksmateriale som vil tilveiebringe ønskede resultater i et gitt spesifikt analyseelement kan variere over et vidt område avhengig av variabler så som pH for beleggingsfluidet hvorfra laget dannes og den spesielle bufferen som benyttes i beleg-gingsf luidet . Som angitt ovenfor, er det foretrukket å anvende som matriksmateriale en ca. 3:1 blanding av uderivatisert agarose og glyoksylagarose. En egnet blanding som Inneholder fra 0,04 mekv. til 0,20 mekv. av tilgjengelig aldehyd pr. gram blanding kan fremstilles ved å blande 1 del glyoksylagarose inneholdende fra 0,16 mekv. til 0,8 mekv. av tilgjengelig aldehyd pr. gram med 3 deler agarose. Rutine-undersøkelser kan utføres for å fastslå det aldehydinnholdet som vil gi ønskede resultater i ethvert lag av et spesifikt flerlags analyseelement.
I flerlags analyseelement ifølge oppfinnelsen kan det være nødvendig å belegge et eller flere andre lag over glyoksylagaroselaget, og avhengig av funksjonen av laget (lagene) og de spesifikke materialene kan det til tider være nødvendig å belegge et eller flere av disse lagene ved en relativt lav pH, dvs. under nøytral pH. I disse tilfellene bør Schiff-baseproduktet undergå den reverse reaksjonen til det frie aminet (protein) og det polymere aldehydet. Imidlertid er det, selv i disse tilfellene, funnet at glyoksylagaroselaget fortsetter å binde proteinholdig materiale på effektiv måte. Denne egenskapen ved belagte glyoksylagaroselag er vist ved eksperimentelle resultater. Selv om man ikke ønsker å begrense oppfinnelsen til noen teoretiske mekanismer, antas det at glyoksylagarosematerialet danner en meget fast matriksstruktur som binder reagensen eller andre materialer meget effektivt under de typiske analysebetingelsene som generelt innbefatter nøytral pH.
Et hvilket som helst egnet, biologisk kompatibelt alkalisk buffermateriale som, når det får forbli i laget etter dannelsen derav, ikke interfererer med den spesielle analysen av interesse kan benyttes ved fremstillingen av glyoksylagarose lagene . Som angitt tidligere, kan pH for belegg-lngsfluidet hvorfra glyoksylagaroselaget belegges, påvirke likevekten for reaksjonen mellom glyoksylagarose og et primært amin for dannelse av en Schiff-base og også tverrbin-dingsreaksJoner for glyoksylagarosen. Typiske egnede buffere innbefatter bicin, bis-tris-propan, natriumkarbonat og natriumborat. Valget av buffer synes i noen grad å avhenge av graden av aldehydsubstitusjon for glyoksylagarosen. For eksempel synes det at det når aldehydsubstitusjonen for glyoksylagarosen er relativt lav, oppnås bedre resultater med buffere som har en relativt høy pKa eller med uorganiske buffere, så som natriumkarbonat. Generelt gjelder for det samme buffermaterialet at høyere pH gir bedre binding. Imidlertid kan forskjellige buffere ved den samme pH vise forskjeller i resultatene som oppnås.
Fig. 1 viser et spesielt foretrukket analyselement ifølge oppfinnelsen. Analyseelementet 10 omfatter et transparent bærerlag 12 som bærer reagenslaget 14, lysblokkerende lag 16 og valgfritt lag 18 som kan være et reagenslag, et filterlag, f.eks. for proteiner, et anti-slitasjelag osv. I en utførelse omfatter reagenslag 14 et immunokompleks av et antistoff kompieksbundet til et fluorescens-merket antigen dispergert i en matriks av glyoksylagarose eller en blanding av glyoksylagarose med et annet matriksmateriale, så som agarose eller lignende. Reagenslaget 14 dannes som beskrevet tidligere; i dette tilfellet er de fluorescens-merkede antigenene inkorporert i beleggsammensetningen sammen med antistoffene. Lysblokkerende lag 16 omfatter et hvilket som helst egnet materiale, så som f.eks. jernoksyd, titandioksyd eller lignende dispergert i et bindemiddel, så som agarose. Lag 18 er frivillig og kan innbefatte et anti-abrasjonslag av et materiale så som agarose hvor reagenslaget 14 innbefatter immunokomplekset, eller det kan Innbefatte forskjellige materialer så som en buffer, blokkerende og/eller forskyvende elementer, osv. Lag 18 kan utelates når immunokomplekset er tilstede i reagenslaget 14. I en annen utførelse kan det f luorescens-merkede antigenet være dispergert gjennom lag 18 og lag 14 innbefatte det immobiliserte antistoffet. Analyseelementet 10 innbefatter et belagt lag eller en annen innretning (ikke vist) for fordeling av væskeprøven uniformt over overflaten av lag 18. En hvilken som helst væskefor-delingsteknikk kan benyttes, innbefattende f.eks. partikkel-formige lag, polymere lag, fiberformige lag, vevde stofflag og væsketransportsystemer som er beskrevet innen teknikken som egnede for dette formålet. Mange slike fordelingsmateria-ler for tilveiebringelse av en uniform fordeling av et prøvefluid over overflaten av et analyseelement er kjent innen teknikken og derfor skulle en omfattende diskusjon av slike materialer ikke være påkrevet her. Fordelingsinnretnin-gene, enten de utgjøres av et lag av fiberformig materiale osv. eller et væsketransportsystem bør være relativt tykke, sammenlignet med reagenslaget 14.
I praksis fordeles prøvefluid over analyseelementet 10 og fluidet diffunderer gjennom lagene 14, 16 og 18 såvel som fordelingslaget eller systemet, og en likevekt etableres. Når den er tilstede, vil en analytt, i dette illustrerende eksemplet et antigen (eller hapten) av interesse, konkurrere med det fluorescens-merkede antigenet (det samme antigenet som prøveantigenet eller en analog derav) om de tilgjengelige bindingssetene på antistoffene immobilisert i lag 14. I tilfellet hvor det fluorescens-merkede antigenet innledningsvis er kompleksbundet til antistoffet i lag 14 vil førstnevnte dissosieres derfra og bil erstattet av prøveanti-genet i et forhold tilnærmet lik de relative mengdene av prøveantigen og fluorescens-merket antigen. Når det fluorescens-merkede antigenet innledningsvis er tilstede i lag 18 vil det diffundere inn i lag 14 sammen med den flytende prøven og konkurrere med prøveantigenet om de bindende setene på det immobiliserte antistoffet. Følgelig vil i hver utførelse, avhengig av mengden antigen tilstede i prøven, en viss prosentdel av de fluorescens-merkede antigenene bindes til de immobiliserte antistoffene som ikke er bundet til prøveantigenene. Den resterende delen av de merkede antigenene vil være fordelt gjennom den gjenværende delen av analyseelementet. Mengden av merket antigen bundet til de immobiliserte antistoffene i reagenslaget 14 ved et hvert tidspunkt er omvendt proporsjonal med mengden av prøveanti-gen. En kvantitativ bestemmelse av prøveantigen oppnås ved bestråling av det immobiliserte antistofflaget gjennom det transparente bærerlaget 12 med egnet eksitasjonsenergi. Siden det immobiliserte antistofflaget 14 er meget tynt sammenlignet med den kombinerte tykkelsen av lagene 16 og 18 sammen med tykkelsen av fordelingslaget eller væsketransport-systemet, dvs. typisk i forhold på fra 1:20 til 1:100, og fordi lysblokkerende lag 16 forhindrer eksitasjonsenergien fra å tre inn i lag 18 eller noe lag over dette, vil det optiske avlesningssystemet måle mengden av merket antigen som er bundet til de immobiliserte antistoffene og en meget liten prosentandel av det frie. merkede antigenet som er fordelt gjennom den gjenværende delen av analyseelementet. Som angitt tidligere, er avlesningssignalet omvendt proporsjonalt med mengden av prøveantigen, dvs. signalet avtar når mengden av prøveantigen øker.
Det fremgår at glyoksylagaroselaget 14 bevarer antistoffene som er immobilisert deri under analysen, mens prøveantigenene og de fluorescens-merkede antigenene, som begge har mindre molekylvekt enn antistoffet, er i stand til å diffundere inn i og ut av reagenslaget 14 i overensstemmelse med likevekten som er etablert i elementet. Følgelig er analyseelementet vist i fig. 1 spesielt velegnet for analyse av relativt små molekyler. Det vil si, de som har en molekylvekt på opp til 1500. Spesielt foretrukne små molekyler er legemidler, så som teofyllin, fenytoin, karbamazepin, fenobarbital osv.
Fig. 2 illustrerer et annet foretrukket analyseelement ifølge oppfinnelsen som omfatter transparent bærer 20, reagenslag 22, filterlag 24, lysblokkerende lag 26 og eventuallag 28. I denne utførelsen kan reagenslaget 22 ha en matriks av et polysakkarid så som agarose hvori det er dispergert et immunokompleks fremstilt av et fluorescens-merket antigen eller en analog derav og et antistoff mot antigenet. Filterlag 24 omfatter glyoksylagarose eller en blanding derav som beskrevet tidligere. Lysblokkerende lag 26 og eventuallag 28 er som beskrevet i fig. 1 med hensyn på hhv. lagene 16 og 18. I tillegg vil, når den flytende prøven fordeles over analyseelementet og diffunderer gjennom elementet, antistoffene diffundere gjennom reagenslaget 22 og bli fanget av filterlag 24. Denne utførelsen tillater reagenslaget 22 å være belagt ved en lavere pH som kan være fordelaktig i tilfellet med spesielle reagenser.
Det skal naturligvis understrekes at selv om spesielle tynnfilm, flerlagselementer vist 1 figurene 1 og 2 er foretrukne analyseelementer ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også andre slike analyseelementer. Generelt innbefatter tynnfilm, flerlagsanalyseelementene ifølge oppfinnelsen et eller flere reagenslag, et eventuelt lysblokkerende lag og et eventuelt filterlag hvor minst et reagenslag omfatter en reagens immobilisert i en matriks innbefattende glyoksylagarose og/eller et annet lag er dannet av et matriksmateriale innbefattende glyoksylagarose.
Tynnfilm, flerlagselementene ifølge oppfinnelsen har typisk en tykkelse på opp til 0,1 mm.
Som angitt tidligere beskriver US patent nr. 4 275 196 glyoksylagarose og beskriver videre at den er nyttig ved sonevis immobilisering av proteiner av biologisk opphav, så som antigener, antistoffer osv. Patentsøkerne beskriver materialet for anvendelser som separasjon av komplekse proteiner ved elektroforese og etterfølgende analyse av de isolerte biologiske spesiene. Imidlertid angis det at glyoksylagarosen må være redusert, f.eks. ved kontakt med et reduksjonsmiddel, f.eks. cyanoborhydridion, eller må være forskjøvet til en høy pH (< 10,0). Foreliggende oppfinnelse innbefatter et tørt, flerlags analyseelement som tilveiebringer permanent immobilisering, og derfor kan pH for laget deretter reduseres uten behov for å redusere glyoksylagarosen. Denne egenskapen ved reagenslagene dannet ifølge oppfinnelsen er illustrert ved forsøkene vist i eksempel II nedenfor.
Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i detalj med hensyn på spesifikke foretrukne utførelser ved hjelp av eksempler.
Eksempel I
Glyoksylagarose ble fremstilt via perjodatoksydasjon av glycerylagarose. Produktet ble dannet slik at det inneholdt 0,533 mekv. tilgjengelig aldehyd pr. gram derivatisert materiale analysert ved hydrazondannelsesprosedyren beskrevet ovenfor.
Et beleggingsfluid ble fremstilt ved 50'C ved å tilsette følgende bestanddeler til 0,10 g agarose oppløst i 9,48 g destillert vann: 300 pl 0,25 M natriumkarbonat pH 9,0 buffer, 20 pl 10* "Tween 20" (et overflateaktivt middel tilgjengelig fra Rohm og Haas), og 200 pl av en glukoseoksydase forråds-oppløsning som inneholdt 40 pl av 0,5 M HEPES pH 7,5 buffer, 7,5 ml glukoseoksydase og 7,5 mg bovint serumalbumin bragt til en totalvekt på 3,0 g med destillert vann. Beleggingsfluidet ble påført på et subbelagt polyetylentereftalatbasislag med en nedtrekkingsstav og deretter tørket ved romtemperatur. Det tørre laget hadde ca. 600 mg/m<2> agarose og ca. 3 mg/m<2> av glukoseoksydase.
En prøve på 4,82 cm<2> av elementet ble eluert med 5 ml pH 7,0 fosfatbuffer ved forsiktig røring I 30 minutter. En porsjon på 1 ml av bufferen ble fjernet og analysert med henblikk på glykoseoksydaseaktivitet ved å omsette den med glukose, pepperrotperoksydase og o-fenylendiamin ved pH 7,0 i 30 minutter. Absorbansen av det oksyderte o-fenylendiamin-substratet ved 492 nm ble registrert.
Glukoseoksydaselagene ble også dannet med glyoksylagarose og blandinger derav med agarose som matriksmateriale. Resultatene som ble oppnådd er vist i tabell I.
Resultatene viser at agarosematriksen tillot en større mengde av glukoseoksydasen å diffundere fra reagenslaget mens glyoksylagarosen, ved seg selv og i blandinger innbefattende 3:1 forholdet, ga meget effektiv immobilisering av glukoseoksydasen. Det fremgår også at 5:1 blandingen, selv om den ikke var så effektiv som glyoksylagaroselaget og lagene fremstilt fra de andre blandingene, ikke desto mindre var signifikant mer effektiv enn agaroselaget ved immobilisering av glukoseoksydase.
Eksempel II
Et kontrollbeleggingsfluid ble dannet innbefattende 1 vekt-* agarose, 10 mM pH 7,0 HEPES buffer og I125-merkede IgG antistoffer i vann. Beleggingsfluidet ble påført på et underbelagt polyetylentereftalatbasislag med en nedtrekkingsstav og antistofflaget ble deretter tørket ved romtemperatur. Det tørre laget hadde ca. 1000 mg/m<2> agarose og ca. 15 mg/m2 av I<125->merkede IgG antistoffer.
Beleggingsfluider ble også fremstilt med 1* av en 3:1 blanding av agarose og glyoksylagarose (0,092 mekv. av aldehyd pr. gram blanding) med hhv. pH 7,0 og 8,0 HEPES buffer (A og B), og også med pH 8,0 og 10,0 natriumkarbonat-buffer (hhv. C og D). De tørre lagene innbefattet ca. 1000 mg/m<2> agarose/glyoksylagaroseblandingen og ca. 15 mg/m<2> av de merkede antistoffene.
De belagte antistofflagene ble avlest innledningsvis av en "Microstat Gamma Counter" (Micromedic Systems, Inc. ) og deretter neddykket i 2 ml av pH 7,0 HEPES buffer i 30 minutter. Elementene ble avlest på gammatelleren etter 10 minutter neddykkingstid og etter 30 minutter. Resultatene er vist i tabell II.
Disse dataene illustrerer virkningen av pH på immobilisering med de forskjellige bufferene. Det fremgår at tilnærmet alle av de 1^25~merke(ie antistoffene diffunderer ut av kontroll-laget etter 10 minutter. Antistofflagene som innbefattet glyoksylagarosen bevarte i det vesentlige alle de merkede antistoffene etter 10 minutter. Videre bevarte antistofflagene med natriumkarbonatbufferen i det vesentlige alle de merkede antistoffene selv etter 30 minutter ved pH 9,0 og alle antistoffene ved pH 10,0. Det fremgår også at glyoksylagaroselaget innbefattende HEPES bufferen bevarte i det vesentlige flere antistoffer ved pH 8,0 eller ved pH 7,0 etter 30 minutters neddykking.
Eksempel III
Et kontrollbeleggingsfluid ble fremstilt ved 50°C ved å tilsette følgende bestanddeler til 0,10 g agarose oppløst i 9,48 g destillert vann: 400 pl av 0,25 M bis-trispropan pH 11,3 buffer, 20 pl av 10* "Tween 20", og 200 pl av en glukoseoksydaseforrådsoppløsning som inneholdt 40 pl av 0,5 HEPES pH 7,5 buffer, 5,0 mg glukoseoksydase, og 5,0 mg bovint serumalbumin bragt til en totalvekt på 2,0 med destillert vann. Sammensetningen ble belagt på et underbelagt polyester-tereftalatbasislag med en nedtrekkingsstav og elementet ble tørket ved romtemperatur. Det tørre laget innbefattet ca. 1000 mg/m<2> av agarose og ca. 300 mg/m<2> buffer. Glukose-oksydaselaget ble arrangert i kontakt med 5 ml av en 0,1 M natriumfosfatbufferoppløsning (pH 7,0) og kombinasjonen arrangert på et ristebord med forsiktig risting. Porsjoner av bufferoppløsningen ble fjernet ved forskjellige intervaller og analysert med henblikk på GOD-innhold.
Forsøkslag ble også dannet med varierende blandinger av agarose/glyoksylagarose og varierende aldehydinnhold. Forsøkslagene ble også buffret ved tilsetning av 400 pl av 0,25 M natriumkarbonat pH 9,0 buffer i stedet for bis-trispropanbufferen omtalt ovenfor, dette resulterte i et lag inneholdende 90 mg/m<2> natriumkarbonat. De oppnådde data fremgår av tabell III.
Glukoseoksydaseaktiviteten for forsøkselementene er vist som relative verdier i forhold til kontrollverdien som ble normalisert til 1,00. Det fremgår også at glyoksylagarose-lagene fremstilt med natriumkarbonatbufferne var svært effektive ved å holde glukoseoksydasen immobllisert i reagenslaget. Det fremgår også at de to 3:1 blandingene med forskjellige aldehydinnhold er like effektive ved immobilisering av glukoseoksydasen. Det fremgår også at glyoksylaga-roselagene fremstilt med bis-tris-propanbufferen ble mer effektive etter som aldehydinnholdet for matriksmaterialet ble øket.
Eksempel IV
Et analyseelement ifølge oppfinnelsen ble fremstilt innbefattende et transparent underbelagt polyetylentereftalatbærerlag som trinnvis bar: 1. et reagenslag Innbefattende ca. 500 mg/m<2> av en 3:1 agarose/glyoksylagaroseblanding, ca. 21,5 mg/m<2> av natriumkarbonat (pH 9,1) og ca. 10 mg/m<2> av et kompleks av teofyl-linantistoffet og et fluorescens-merket teofyllinkonjugat representert ved formelen 2. et lysblokkerende lag innbefattende ca. 6000 mg/m<2 >jernoksyd og ca. 15,1 mg/m<2> av 2'-morfolinoetansulfonsyre (pH 5,7) i ca. 2000 mg/m<2> agarose; og 3. et toppbeleggingslag innbefattende ca. 2000 mg/m<2> agarose.
En analyseinnretnlng ble dannet ved å plassere toppbeleg-glngslaget av analyseelementet i kontakt med den grove overflaten av en prøvepåføringsenhet. Prøvepåføringsenheten, som er beskrevet i detalj 1 søkerens US patent nr. 4 906 431 Innbefattet også et f ilterelement i fluldkontakt med den grove overflaten. En prøve med en kjent mengde teofyllin ble påført på fllterelementet. Innretningen ble deretter inkubert ved 37°C i 30 minutter. Avlesninger ble foretatt hvert andre minutt ved bestråling av analyseelementet gjennom basislaget med 550 nm eksitasjonsenergi fra en xenon-lampe. Det fluorescente signalet ble avlest ved 580 nm. Konsentrasjonen (jjg/ml) av teofyllin i prøvene som ble undersøkt var: 0; 2,5; 5,0; 10,0; og 40,0.
Slgnallntensiteten for prøvene avtok med suksessivt økende teofyllinkonsentrasjon, hvilket viste at analyseelementene virket på den ønskede måten. Videre forble, for hver prøve, etter en innledende periode hvorunder likevekten ble etablert (2 minutter for kontrollprøven og 6 minutter for teofyl-linprøvene) spenningssignalet i det vesentlige det samme, hvilket viser at antistoffene forble immobilisert i reagenslaget i tidsrommet på 30 minutter.
En standard kurve basert på avlesningene fra prøvene etter 6 minutters inkuberingstid ble plottet.
Avlesningene var:
Standardkurven var lineær over analyseområdet (2,0-40 pg/ml) og hadde en relativt bratt stigning sentrert i analyseområdet .
Eksempel V
Et analyseelement ifølge oppfinnelsen ble fremstilt innbefattende et transparent underbelagt polyetylentereftalatbærerlag som i rekkefølge bar: 1. et reagenslag innbefattende ca. 15 mg/m<2> av et kompleks av fenytoinantistoffer og et fluorescens-merket fenytoinkonjugat fremstilt av et rodaminfargestoff vist i teofyllinkonjugatet illustrert i eksempel IV bundet til fenytoin, og ca. 84 mg/m<2 >av natriumkarbonat (pH 9,0) dispergert i ca. 1000 mg/m<2> av en 3:1 blanding av agarose/glyoksylagarose; 2. et lysblokkerende lag innbefattende ca. 6000 mg/m<2 >jernoksyd og ca. 212 mg/m<2> av 2'-[N-morfolino]etansulfonsyre (pH 5,75) i ca. 2000 mg/m<2> agarose; og 3. et toppbelegglag innbefattende ca. 4000 mg/m<2> av en podet kopolymer av agarose og polyakrylamid.
Ca. 40 pl av plasmaprøver innbefattende kjente mengder fenytoin (0, 2,0 og 50,6 pg/ml) ble påført på skiver (3,5 cm diameter) av analyseelementet ved først å påføre prøven på et underbelagt polyetylentereftalatlag og deretter plassere analyseelementet, med toppbelegglag ned, på den flytende prøven. Ånalyseinnretningene som derved ble dannet ble plassert i et laboratorieinstrument ved 37 'C og fluorescenssignalet avlest med 2 minutters intervaller ved bestråling av analyseelementet gjennom basislaget med 550 nm eksitasjonsenergi fra en xenon-lampe og kolleksjon av fluorescenssignalet ved 580 nm. Det oppnådde signalet fra analyseelementet hvorpå kontrollen (0 pg/ml fenytoin) var påført, forble i det vesentlige det samme over et tidsrom på 30 minutter, hvilket indikerer at antistoffene ikke dif-funderte fra reagenslaget. Videre avtok signalet suksessivt ettersom fenytoinkonsentrasjonen øket, dette viser at analyseelementet virker som planlagt.
Eksempel VI
Det ble fremstilt et analyseelement ifølge oppfinnelsen innbefattende et underbelagt polyetylentereftalatbasislag som i rekkefølge bar: 1. et reagenslag innbefattende ca. 10 mg/m<2> av komplekset av teofyllinantistoffer og fluorescens-merket teofyllinkonjugat beskrevet i eksempel IV i ca. 500 mg/m<2> agarose; og 2. et filterlag innbefattende 1000 mg/m<2> av en 3:1 blanding av agarose/glyoksylagarose.
Analyseelementer med denne strukturen ble også fremstilt hvor filterlaget var dannet fra oppløsninger buffret ved forskjellige pE-nivåer. Et kontrollanalyseelement ble fremstilt hvor filterlaget omfattet ca. 1000 mg/m<2> agarose i steden for agarose/glyoksylagaroseblandingen.
Et stykke på 3,3 cm<2> av hvert analyseelement ble flottert i 30 minutter, med filterlaget ned, i ca. 2 ml av en pH 7,0 fosfatbuffer. Deretter ble analyseelementene tørket og fluorescensemmisjonssignalet ble målt. Tilsvarende forsøk ble utført med pH 7,0 fosfatbuffer som inneholdt 10~<3> M teofyllin. De oppnådde dataene er gjengitt i tabell IV:
Dataene oppnådd fra analyseelementene flottert i bufferen som Ikke inneholdt noe teofyllin viser at filterlaget bestående av agarose ikke forhindrer konjugatet fra å diffundere ut av reagenslaget mens filterlagene som hadde 3:1 agarose/glyok-sylagaroseblandingen, spesielt de som var buffret ved pH 8,0 og 10,0, var effektive ved å forhindre teofyllinantistoffer fra å diffundere. Når analyseelementene ble bragt i kontakt med oppløsningene inneholdende IO"<3> M teofyllin, fant den kompetitlve reaksjonen sted og meget lave signaler ble oppnådd. IO-<3> M teofyllinkonsentrasjonen ble beregnet å være tilstrekkelig til å erstatte i det vesentlige alt det merkede teofyllinkonjugatet som opprinnelig var tilstede i lagene.
Claims (10)
1.
Flerlags, diagnostisk analyseelement for analyse av proteiner av biologisk opphav (som antigener, antistoffer osv.) innbefattende et stort antall adskilte lag hvorav minst et er et reagenslag, karakterisert ved at minst ett av det store antallet lag er dannet av et matriksmateriale som innbefatter glyoksylagarose, fortrinnsvis en blanding av glyoksylagarose og et annet polysakkarid, fortrinnsvis en 3:1 vektblanding av agarose og glyoksylagarose, hvorved matriksmaterialet innbefatter fra 0,04 mekv. til 0,20 mekv. aldehyd pr. gram matriksmateriale.
2.
Diagnostisk element ifølge krav 1, karakterisert ved at reagenslaget er dannet av nevnte matriksmateriale.
3.
Diagnostisk element ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at reagenslaget innbefatter et protein.
4.
Diagnostisk element ifølge krav 3, karakterisert ved at proteinet er et antistoff eller et antistoffragment.
5.
Diagnostisk analyseelement ifølge krav 4, karakterisert ved at antistoffet eller antistoffrag-mentet er spesifikt for en analytt som har en molekylvekt på opp til 5000.
6.
Flerlags, diagnostisk analyseelement ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det innbefatter et baererlag og et lysblokkerende lag, hvor reagensen er immobilisert i nevnte matriksmateriale.
7.
Diagnostisk analyseelement ifølge krav 6, karakterisert ved at det videre innbefatter et toppbelegglag.
8.
Flerlags, diagnostisk analyseelement ifølge krav 1, karakterisert ved at det innbefatter: et baererlag, et reagenslag, et reagens-diffusjonsforhindrende lag som er dannet av et matriksmateriale som innbefatter glyoksylagarose; og et lysblokkerende lag.
9.
Diagnostisk analyseelement ifølge krav 8, karakterisert ved at det videre innbefatter et andre reagenslag.
10.
Diagnostisk analyseelement ifølge krav 8, karakterisert ved at det innbefatter minst et av trekkene ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US27535188A | 1988-11-23 | 1988-11-23 | |
PCT/US1989/003300 WO1990005914A1 (en) | 1988-11-23 | 1989-07-31 | Biological diagnostic assay system |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO902951L NO902951L (no) | 1990-07-02 |
NO902951D0 NO902951D0 (no) | 1990-07-02 |
NO177876B true NO177876B (no) | 1995-08-28 |
NO177876C NO177876C (no) | 1995-12-06 |
Family
ID=23051920
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO902951A NO177876C (no) | 1988-11-23 | 1990-07-02 | Diagnostisk analyseelement |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0370417B1 (no) |
JP (1) | JP2573381B2 (no) |
AT (1) | ATE102356T1 (no) |
AU (1) | AU621935B2 (no) |
CA (1) | CA1337174C (no) |
DE (1) | DE68913440T2 (no) |
DK (1) | DK173990A (no) |
ES (1) | ES2051963T3 (no) |
FI (1) | FI97425C (no) |
NO (1) | NO177876C (no) |
NZ (1) | NZ230473A (no) |
WO (1) | WO1990005914A1 (no) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5166079A (en) * | 1989-07-19 | 1992-11-24 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Analytical assay method |
JPH06222057A (ja) * | 1993-01-27 | 1994-08-12 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | 分析組成物 |
US5601997A (en) | 1995-02-03 | 1997-02-11 | Tchao; Ruy | Chemotaxis assay procedure |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4275196A (en) * | 1979-03-23 | 1981-06-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Glyoxal agarose |
US4459358A (en) * | 1982-12-29 | 1984-07-10 | Polaroid Corporation | Multilayer element for analysis |
-
1989
- 1989-07-31 AU AU41967/89A patent/AU621935B2/en not_active Ceased
- 1989-07-31 JP JP1509233A patent/JP2573381B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-31 WO PCT/US1989/003300 patent/WO1990005914A1/en active IP Right Grant
- 1989-08-29 NZ NZ230473A patent/NZ230473A/xx unknown
- 1989-08-29 CA CA000609640A patent/CA1337174C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-11-18 EP EP89121393A patent/EP0370417B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-18 AT AT89121393T patent/ATE102356T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-11-18 ES ES89121393T patent/ES2051963T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-18 DE DE68913440T patent/DE68913440T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-07-02 NO NO902951A patent/NO177876C/no unknown
- 1990-07-12 FI FI903540A patent/FI97425C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-07-20 DK DK173990A patent/DK173990A/da active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU4196789A (en) | 1990-06-12 |
DK173990D0 (da) | 1990-07-20 |
NO902951L (no) | 1990-07-02 |
FI903540A0 (fi) | 1990-07-12 |
DE68913440D1 (de) | 1994-04-07 |
EP0370417B1 (en) | 1994-03-02 |
WO1990005914A1 (en) | 1990-05-31 |
CA1337174C (en) | 1995-10-03 |
JPH03502370A (ja) | 1991-05-30 |
ES2051963T3 (es) | 1994-07-01 |
NO177876C (no) | 1995-12-06 |
FI97425B (fi) | 1996-08-30 |
AU621935B2 (en) | 1992-03-26 |
DK173990A (da) | 1990-07-20 |
DE68913440T2 (de) | 1994-06-16 |
FI97425C (fi) | 1996-12-10 |
NO902951D0 (no) | 1990-07-02 |
EP0370417A1 (en) | 1990-05-30 |
ATE102356T1 (de) | 1994-03-15 |
JP2573381B2 (ja) | 1997-01-22 |
NZ230473A (en) | 1991-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5541069A (en) | Assay having improved dose response curve | |
US5013669A (en) | Mass producible biologically active solid phase devices | |
AU616782B2 (en) | Carrier matrix with dissolvably impregnated reagent | |
US5188939A (en) | Displacement immunoassay utilizing an oligavalent labelled antibody | |
US5405752A (en) | Enzyme conjugate prepared with insoluble nonoparticle | |
US5166079A (en) | Analytical assay method | |
JPH02110374A (ja) | 定性酵素アッセイの視覚的識別 | |
US4317810A (en) | Waffle-like matrix for immunoassay and preparation thereof | |
JPH0235261B2 (no) | ||
US5250443A (en) | Biological diagnostic assay system | |
US5328852A (en) | Analytical assay | |
NO177876B (no) | Diagnostisk analyseelement | |
WO1990015328A1 (en) | Improved immunoassay | |
JP2001272405A (ja) | 検査キット | |
JPH04128655A (ja) | 免疫分析要素および免疫分析方法 | |
DE68921184T2 (de) | Enzym-Quantifizierungstest auf einem Docht. | |
JPH10282103A (ja) | 免疫分析要素および免疫分析方法 | |
WO1994010574A1 (en) | SUSPENSION OF PARTICLES WITH A DIAMETER OF LESS THAN 1 νM WITH IMMOBILIZED ENZYME AND PROTEIN | |
JPS60127462A (ja) | 酵素免疫測定法 | |
JPS62247258A (ja) | 分析素子 | |
JPS62247257A (ja) | 分析素子 | |
JPH10300751A (ja) | 免疫分析要素 | |
JPS58150860A (ja) | 分析素子 |