NO169725B - Fremgangsmaate for fremstilling av et uglykosylert rekombinant humant immun-interferonprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedører en fremgangsmåte for fremstilling av et uglykosylert rekombinant humant immun-interf eronprotein ved hjelp av gen-teknikk.

Interferoner (heretter enkelte ganger forkortet til IF-er) er proteiner fremstilt av celler fra høyere dyr etter stimu-lering med viruser, nukleinsyrer, etc, og har blant annet antivirus- og antitumorvirkninger.

Idag klassifiseres interferoner generelt i tre forskjellige typer etter karakteristiske egenskaper, nemlig a-, p- og 7-typer, og a- og p-typene induseres med viruser eller nukleinsyrer, og T-typen med mitogener etc.

Det er gjort betydelige fremskritt i undersøkelser av type a-IF (heretter forkortet til IF-a) og type p-IF (heretter forkortet til IF-e) og mekanismene for fremstilling av disse er blitt klarlagt i en betydelig utstrekning. Videre er det på grunn av fremskritt innen gen-teknikken nå mulig å erholde IF-a, IF-3i og IF-ni som biologisk virksomme proteiner i store mengder ved å dyrke Escherichia coli (IF-a og IF-p^ ) og gjær (IF-ai) (Goeddel, D.V. et al., Nature, 287, 411 (1980); Yelverton, E. et al., Nucleic Acids Res., 9, 731 (1981); Goeddel, D.V. et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980); Hitzeman R. et al., Nature, 293, 717 (1981)). Videre er det i gang forsøk på produksjon i stor skala for det formål å utføre kliniske forsøk med dem.

Type "Y-IF (heretter enkelte ganger forkortet til IF-*y ) fremstilles fra immunologisk kompetente celler (immunocytter) under betingelser slik at lymfocytt-transformasJon (endring til blast-celler) eller lymfokin-produksjon finner sted, og følgelig kalles det også immun-interferon (heretter enkelte ganger forkortet til I-IF). I-IF skal ha høyere grad av anticelledannelse eller antitumorvirkning sammenlignet med IF-a og IF-e, og det forventes derfor mye av det ut fra et klinisk anvendelsessynspunkt. På grunn av forskjellige begrensninger, slik som krav til friske lymfocytter for fremstillingen av I-IF, er det ennå ikke etablert noe effektivt produksjonssystem. Det antas at forskjellige cellearter muligens kan produsere forskjellige molekylære typer I-IF i ulike eksprimentsystemer. Deres strukturer og egenskaper er forsatt ukjente i mange henseender.

På den annen side er IF-er svært art-spesifikke, og derfor må IF-er for anvendelse i mennesker være utvunnet fra mennesker. Ettersom imidlertid produksjon av humant immuninterferon i stor skala er vanskelig, er dets kliniske anvendelse for tiden umulig, det har derfor vært sett frem til utvikling av en teknologi hvorved svært rent human I-IF lett kan fremstilles i store mengder og til lave kostnader.

Man har i foreliggende sammenheng vært engasjert i forskning og utvilkling med sikte på utvikling av en teknikk for å erholde det ønskede humane I-IF-protein som omfatter å klone det humane I-IF-genet ved å utnytte genmanipuleringsteknikken og innføre det således erholdte rekombinante DNA-molekylet i en vert for ekspresjon av det humane I-IF-genet. Som et resultat har man fullført foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et ulgykosylert rekombinant human immuninterferonprotein fra et dyrket medium oppnådd ved dyrking av en transformert Escherichia coli som har DNA inneholdene en basesekvens som koder for humant immuninterferon for å produsere og akkumulere humant immuninterferon i transformantcellene, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at cellene lyseres og den resulterende oppløsning som inneholder humant interferon, underkastes rensing ved bruk av monoklonalt antistoff mot E-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OE, hvorved det oppnås et vesentlig rent, uglykosylert rekombinant humant immuninterferonprotein som har en spesifikk aktivitet på ikke mindre enn IO<7> U/mg.

Gray et al. rapporterte idet de trodde at de kunne ha klonet et av de humane I-IF-genene, aminosyresekvensen for et polypeptid utledet derav (Nature, 295, 503 (1982)). Deretter fulgte lignende rapporter fra Devos et al. (Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)) og Dernynck et al. (ibid., 10, 3605 (1892)). Hittil har imidlertid tilstedeværelsen av IF-lignende stoffer bare vært antatt på grunnlag av den påviste antivirus-virkningen. Ingen rapport nevner at et i det vesentlige rent, humant, immuninterferonprotein kan erholdes.

Den humane I-IF-kodende DNA-sekvens som brukes Ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis DNA-sekvensen:

hvor X er TÅA, TGA eller TAG.

Den ovenfor nevnte DNA-sekvens (I) kan i 5'-enden ha

DNA-sekvensen er fortrinnsvis tilknyttet nedstrøms for en promoter, slik som trypofan (trp)-promoter, laktose (lac)-promoter eller proteinkjedeforlengelsesfaktor Tu (tufB)-promoter, fortrinnsvis trp-promoter.

Når det gjelder formel (I), er oligonukleotidet X fortrinnsvis TAA.

I foreliggende sammenheng har de anvende symbolene den betydningen som er definert i tabell 1:

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan det fremstilles en dobbeltkjedet DNA som koder for humant I-IF, for eksempel ved dyrkning av humane I-IF-utskillende celler, slik som humane perifere blod-lymfocytter, isolering av en human I-IF-kodende mRNA fra dyrkingsvæsken, syntetisering av en enkjedet, komplementær DNA (cDNA) basert på denne, ved for eksempel å bruke en omvendt transkriptase, avledning av en dobbeltkjedet DNA fra denne, innføring av denne i et plasmid, transformering av for eksempel Escherichia coli med det resulterende plasmidet og isolering av et cDNA-holdig plasmid.

De humane perifere blod-lymfocyttene som skal brukes her, kan enten være ikke-sensitiviserte celler eller sensitiviserte celler.

Induksjonsmidlet for I-IF som brukes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse, kan være av et hvilket som helst slag under forutsetning av at det kan få humane lymfocytt-celler til å produsere I-IF. Følgelig kan det blant annet nevnte fytohemagglutinin (PHA), konkanacalin A (ConA), stafylococcus-enterotoksin A (SEA), neuraminidase-galaktose-oksidase (NAGO) og 12-0-tetradenkanoylforbol-13-acetat (TPA): Disse kan brukes enten alene eller i blanding.

Induksjonen av I-IF kan settes i verk ved å dyrke cellene i et i og for seg kjent medium, slik som RPMI-1640-medium eller MEM-medium, fortrinnsvis RPMI-1640-medium som inneholder kalvefosterserum. Dyrkingen utføres i temperaturområdet 35-39°C, fortrinnsvis 36-38°C, i en tidsperiode på 12-71 timer, fortrinnsvis 22-26 timer. Cellene samles opp ved den i og for seg kjente fremgangsmåten og, etter tilsetning av en RNAase inhibitor, slik som guanidintiocyanid, bentonitt, heparin, polyvinylsvovelsyre, gulltrikarboksylsyre, vanadium-kompleks, dietylpyrokarbonat (DPC) eller natriumdodecylsulfat (SDS), lyseres cellene ved å tilsette for eksempel N-lauroyl-sarkosin, "Tween 80" eller "Nonidet P-40". Deretter utføres RNA-ekstraksjon. Om nødvendig gjentas ekstråksjonsfremgangs-måten etter tilsetning av fenol, fenolkloroform eller lignende til det RNA-holdige ekstraktet. RNA-fraksjonen samles opp ved etanolutfelling. Ettersom det er kjent at det meste av mRNA-ene som er tilstede i cytoplasmaet fra eukaryote celler har en poly A-sekvens ved 3'-enden, samles poly(A<+>) RNA-er opp ved for eksempel å bruke oligo(dT)-cellulose eller ply(U)sefarose og fraksjoneres ved sukrose-densitetsgradient-sentrifugering. En aliquot av hver fraksjon injiseres i oocytter fra Xenopus laevis for translasjon (Gurdon, J.B. et al., Nature, 233, 177 (1971)). Det resulterende protein utprøves med hensyn på antiviral virkning. På denne måten kan det erholdes en 12-16S-f raks jon som inneholder mRNA for I-IF. mRNA-en kan også renses ved formamid-polykarylamid-gelelektroforese eller agarosegel-elektroforese under anvendelse av glykosal.

Ved å bruke den således erholdte mRNA som mal, syntetiseres en komplementær DNA (cDNA)-kjede, for eksempel ved den i og for seg kjente fremgangsmåten hvor det brukes en omvendt transkriptase, og cDNA-en omdannes til en dobbeltkjedet DNA (Maniatis, T. et al., Cell, 8, 163 (1976)).

DNA-en innføres for eksempel i plasmidet pBR322 i spaltingsstedene for restriksjonsendonuklease Pstl eller SphI, for eksempel ved hjelp av dG-dC- eller dA-dT-homopolymer-påhengingsmetoden (Nelson, T.S., Methods In Enzymology, 68, 41 (1979), Academic Press Inc., New York). Den rekombinante DNA innføres for eksempel i Escherichia coli X1776 for transformasjon. Transformantutvelgelse kan gjøres basert på tetracyklin-resistens eller ampicillin-resistens. Adskilt syntetiseres den kjemisk et oligonukleotid med en basesekvens som forutsetningsvis svarer til aminosyresekvensen til I-IF-polypeptid, og merkes deretter med <32>p for å lage en sondeforbindelse, og ved å bruke denne sorteres deretter de tidligere erholdte tetracyklin- eller ampicillin-resistente transformantene etter de ønskede klonene, for eksempel ved den i og for seg kjente kolonihybridiseringsfremgangsmåten (Grunstein, M. og Hogness D.S., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)).

Klonene som er positive ved denne kolonihybridiseringen, undersøkes med hensyn på basesekvensen, for eksempel ved Maxam-Gilbert-fremgangsmåten (Maxam, A.M. & Gilbert, W., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 560 (1977)) eller ved dinukleotidsyntese-kjedeavslutningsfremgangsmåten ved å bruke

(fag M13 (Messing, J. et al., Nucleic Acids rec, 9, 309

(1981)) for bekreftelse av nærværet av I-IF-genet. Deretter skjæres I-IF-genet helt eller delvis ut av den erholdte klonen på den ovenfor nevnte måten og tilknyttes nedstrøms for en passende promoter og SD (Shine and Dalgarno)-sekvensen for-innføring i en passende vert.

Som eksempler på promoteren, kan de ovenfor angitte nevnes. Foretrukkede verter er Escherichia coli-stammer (294, W3110, C600, etc), hvorav stammen 294 er spesielt foretrukket.

Stammen 294 er en kjent organisme (Backman, K. et al., Proe. Nati. Acad. Sei- USA, 73, 4174 (1976)) og er også deponert ved Institute for Fermentation, Osaka under deponerings-betingelsen IFO-14171.

Transformeringen av en vert med DNA-en ifølge foreliggende oppfinnelse utføres for eksempel ved den kjente fremgangsmåten (Cohen, S.N. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110 (1972)).

Den således erholdte transformanten dyrkes i et i og for seg kjent medium.

Mediet er for eksempel M9-medium som inneholder glukose og kasaminosyre (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)). For å oppnå effektiv promoter-utløsning, kan 3p-indolylakrylsyre eller et lignende middel om nødvendig tilsettes.

Dyrkingen utføres vangllgvis ved 15-43°C i 3-24 timer. Om nødvendig kan det utføres lufting og/eller omrøring.

Etter dyrkingen høstes cellene på kjent måte og, for eksempel etter suspensjon i en buffer, lyseres cellene for eksempel ved hjelp av ultralydbehandling, lysozym og/eller fryse-tørking. Deretter samles supernatanten opp ved sentrifugering. For cellelysen er frysing og tørking etterfulgt av lysozymbehandling å foretrekke.

Humant I-IF i den ovenfor nevnte supternatanten renses ved å bruke et monoklonalt antistoff som er i stand til å bindes til - humant I-IF, nemlig et monoklonalt antistoff mot polypeptid med formelen: H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH, som er et nytt polypeptid.

Det monoklonale antistoffet kan fordelaktig brukes i form av en antistoffkolonne.

Antistoffkolonnen kan fremstilles for eksempel ved å kople det ovenfor nevnte monoklonale antistoffer i den rensede tilstanden slik det erholdes fra bukhulevæsken inokulert med hybridomaen sammen med en passende bærer på den måten som er nevnt nedenunder.

Bæreren kan være av et hvilket som helsts slag under forutsetning av at, etter sammenkopling, I-IF kan adsorberes spesifikt og effektivt og deretter kan elueres med et adekvat middel. Som et eksempel er det gunstig å bruke agarosegel i form av kuler som aktiveres for å lette bindingen av den primære aminogruppen i et protein, for eksempel "AFFI-GEL 10"

(Bio-Rad Lab., USA) på den følgende måte. Omsetningen av "AFFI-GEL 10" med antistoffet utføres i en bufferoppløsning, slik som 0,001-1 M, fortrinnsvis 0,1 M, bikarbonat. Anvend-bare reaksjonsbetingelser er 0°-20'C, 10 minutter til 24 timer og varierende pH, og foretrukkede betingelser er 4°C, 4 timer og pH 3-10. Det kvantitative forholdet mellom "AFFI-GEL 10" og antistoffet kan velges innenfor området opptil ca 50 mg antistoff pr ml "AFFI-GEL", ettersom mengden antistoff bundet til "AFFI-GEL" øker, når mengden antistoff øker innenfor dette området. Av hensyn til bindingseffektiviteten brukes antistoffet i en mengde som ikke er mer enn 30 mg på nevnte grunnlag. Det således fremstilte antistoffbærer-

koplingsproduktet vaskes godt med den samme bufferopp-løsningen som ble brukt ved omsetningen, og hensettes deretter i flere dager eller behandles med etanolamin-hydroklorid i en sluttkonsentrasjon på 0,05 M ved 4<*>C i 1 time eller ved en annen fremgangsmåte for å blokkere de gjenværende, ikke-omsatte aktive gruppene, og pakkes i en passende kolonne hvorved man får en antistoffkolonne.

For det formål å rense med den ovenfor nevnte antistoffkolonnen, oppløses for eksempel en human immun-interferon-proteinholdig oppløsning slik som supernatanten fra cellelysen, i en nesten nøytral buffer, slik som en fosfatbuffer eller tris-hydrokloridbuffer, og adsorberes på antistoffkolonnen. Kolonnen vaskes med den samme bufferen og deretter elueres I-IF. Brukbare elueringsmidler er blant annet en svakt sur oppløsning (for eksempel eddiksyreoppløsning), en polyetylenglykolholdig oppløsning, en oppløsning som inneholder et peptid med en høyere affinitet til antistoffet enn det aktuelle proteinet, saltoppløsning med høy konsentrasjon og en kombinasjon av disse. De elueringsmidler som ikke fremmer dekomponering av humant I-IF i en betydelig utstrekning foretrekkes.

Eluatet fra kolonnen nøytraliseres med en buffer ved den vanlig kjente fremgangsmåten. Om nødvendig kan rensingsfrem-gangsmåten under anvendelse av den ovenfor nevnte antistoffkolonnen gjentas.

Den således erholdte humant I-IF-proteinoppløsningen dialyseres og kan om nødvendig bringes på pulverform ved lyofilisering. Ved utførelsen av lyofiliseringen kan det tilsettes en stabilisator slik som sorbitol, mannitol, dekstrose, maltose eller glyserol.

Det således herholdte humane immun-interferonproteinet oppviser en spesifikk aktivitet på ikke mindre enn IO<7> U/mg når det analyseres med hensyn på antiviral virkning i en prøve for å undersøke virkningen av å inhibere degenereringen av humane WISH-celler utvunnet fra den innerste fosterhinnen ved hjelp av vesikulart stomatitis-virus (VSV).

1-IF-aktiviteten i U/ml (enheter/ml) ble bestemt på følgende måte-. Et internasjonalt standard IF-a, som enheten er fastsatt for, og leukocytt-utvunnet rått IF-7 ble analysert i prøven for å bestemme den inhiberende virkningen mot celledegenerering som forårsakes av VSV i en human FL-cellelinje utvunnet fra den innerste fosterhinnen, titeren for det lymfocytt-utvunne IF-"y ble bestemt ved sammenligning mellom de titere som ble funnet, og det nevnte IF-^ ble brukt som laboratoriestandard IF- y. Ved beregning av titeren for IF-*y i et materiale, ble dette laboratoriestandard IF-*y alltid brukt parallelt i den ovenfor nevnte analysen i WISE-VSV-systemet, og titerberegningen ble utført på grunnlag av titerforholdet.

Det humane immun-interferonproteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder fortrinnsvis et polypeptid som har aminosyresekvensen med formelen:

hvor Y er Met eller en kjemisk binding og og Z2 er Cys eller ¥1 Cys (det vil si halvt cystin = cystein). Det humane

I-IF-proteinet som fremstilles inneholder fortrinnsvis polypeptidet i en renhet på ikke mindre enn 90 %, særlig ikke mindre enn 95 %, på den tørkede basis.

Et humant immun-interferonprotein fremstilt ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har de følgende kjennetegn: 1) Det oppviser en molekylvekt på 17.000 ± 1.000 i SDS-polyakrylamidgel (17,5 %)-elektroforese; 2) Det inneholder cystein eller Vi cystein eller metionin som aminosyre i amino-enden; 3) Det bindes til et monoklonalt antistoff mot E-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH.

Det humane interferonproteinet fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse kan brukes til de samme formål på samme måten som 1-IF-typene erholdt ved de vanlig kjente fremgangsmåtene. På grunn av dets mindre innhold av foru-rensende proteiner og pyrogen, kan det brukes med større sikkerhet, for eksempel som et stoff til å fremstille injeksjoner.

Det humane I-IF-proteinet fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har antivirale, antitumor, celleformerings-inhiberende og immunologisk forsterkende virkninger. Det humane I-IF-proteinet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan for medisinske formål brukes slik det er eller i en blanding med sterilisert vann, humant serumalbumin (ESA), fysiologisk akseptable bærerhjelpemidler eller fortynnere for å fremstille en farmasøytisk blanding som inneholder det humane I-IF, og det kan administreres intravenøst eller intramuskulært eller på enkelte andre måter i en dose på 100.000-100.000.000 enheter, fortrinnsvis 50.000 - 60.000.000 enheter, pr voksent menneske pr dag.

De farmasøytiske preparatene som inneholder det humane I-IF-proteinet kan også inneholde andre fysiologisk akseptable inerte bestanddeler slik som salt, fortynner, hjelpestoff, en annen bærer, buffer, bindingsmiddel, overflateaktivt middel og preserveringsmiddel. For parenteral administrering tilveiebringes preparatene i form av en suspensjon i en sterilisert vandig oppløsning eller et fysiologisk aksep-tabelt oppløsningsmiddel i ampuller eller i form av et sterilisert pulver (generelt oppnåelig ved lyofilisering av en I-IF-oppløsning) som skal fortynnes med et fortynnings-middel før bruk.

Videre kan de ovenfor nevnte, humane immun-interferonprotein-holdige preparatene også inneholde andre aktive bestanddeler slik som IF-cx eller IF-p eller et lymfokin (for eksempel interleukin 2) i en mengde på 1-99 % basert på forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Fig. 1 er restriksjonsenzymkartet for pla smidet pEIT3709

erholdt i eksempel 1 (vii) hvor delen W /// 0 ///

angir området som koder for et peptid som formod-entlig er signalpeptidet, og angir området som koder for 1-IF-polypeptidet. Fig. 2 illustrerer primærstrukturen (basesekvens) til innskuddet i plasmidet pYHI3709 erholdt i eksempel 1 (vii), Fig. 3 er konstruksjonsskjemaet for ptrp701 og ptrp771

beskrevet i heholdsvis eksempel 2 (i) og (ii),

Fig. 4 er konstruksjonsskjemaet for pHITtrpllOl beskrevet i

eksempel 2 (iii) og

Fig. 5 er konstruksjonsskjemaet for pEITtrp2101 beskrevet i

eksempel 2 (iv).

Fig. 6 viser resultatene av elektroforesen i eksempel 6 (i)

og

Fig. 7 resultatene fra en molekylvektbestemmelse i eksempel

6 (i).

Foreliggende oppfinnelse skal forklares ytterligere ved hjelp av de følgende utøvelses- og referanseeksempler.

Mus B hybridoma "y 2 - 11,1 åpenbart i referanseeksemplene nedenunder er blitt deponert ved C.N.C.M. ved Institut Pasteur, Paris, Frankrike under deponeringsbetegnelsen 1-242.

EKSEMPEL 1

(i) Isolering av mRNA som koder for humane I-IF-lymfocytter fremstilt fra det humane perifere blodet, ble inkubert ved 37°C i RPMI-1640-mediet (som inneholder 10 # kalvefosterserum) som inneholdt 15 ng/ml 12-0-tetradekanoylforbol-13-acetat (TPA) og 40 pg/ml konkanavalin A, for induksjon av I-IFN. Etter 24 timer ble de derved forårsakende humane lymfocyttende (1 x 10<*0> celler) ødelagt i en tioguanidin-oppløsning (5 M guanidintiocyanat) i en Teflon-homogenisator. Deretter ble natrium-N-lauroylsarkosinat tilsatt 1 en konsentrasjon på 4 # og blandingen ble etter homogenisering plassert i et sjikt over 6 ml 5,7 M cesiumklorid (5,7 M cesiumklorid, 0,1 M etylendiamintetraacetat (EDTA)) og sentrifugert ved 15°C og 2400 rmp i 30 timer ved å bruke en Beckman SW27 sentrifuge, hvorved man fikk et RNA-bunnfall. Dette RNA-bunnfallet ble oppløst i 0,25 # natrium-N-lauroyl-sakosinat og deretter utfelt med etanol, hvorved man fikk 8,3 mg RNA. Denne RNA fikk absorberes i en saltoppløsning med høy konsentrasjon (0,5 M NaCl, 10 mM tris HC1, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3 # SDS) på oligo (dT )cellulosekolonne og mRNA-holdig poly(A) ble eluert med en saltoppløsning med lav konsentrasjon (10 mM tris-ECl, pH 7,6, 1 mM ESTA, 0,3 % SDS) hvorved man fikk 700 jjg mRNA. Denne mRNA ble videre utfelt med etanol, deretter oppløst i 0,2 ml av en oppløsning (10 mM tris-HCl, pH 7,6 2 mM EDTA, 0,3 % SDS), behandlet ved 65°C i 2 minutter og fraksjonert med 10-35 % sukrosedensitets-gradient-sentrifugering ved 20°C og 25.000 rmp i 21 timer under anvendelse av en Beckman SW27-sentrifuge, hvorved man fikk 22 fraksjoner. Aliquoter av hver fraksjon ble injisert i Xenopus laevls oocytter og de syntetiserte proteinene ble analysert med hensyn på interferonaktivitet (antiviral virkning bestemt ved hjelp av analysen med inhibering av den cytopatiske virkning, under anvendelser av vesikulart stomatitis-virus på WISH-celler utvunnet fra den innerste fosterhinne hos mennesket (Stewart, W.E. The Interferon System, Springer New York, 1979, s. 11)). På denne måten ble det funnet at fraksjon 12 (sedimentasjonskonstantene var 12-14S> hadde en aktivitet på 195 enheter pr pg RNA. mRNA-en i den således erholdte fraksjon 12 veide ca 20 pg.

(ii) Syntese av enkjedet DNA.

Ved å bruke den ovenfor nevnte mRNA og en omvendt transkriptase, ble 100 pl av en reaksjonsblanding ( 5 pg mRNA, 50 pg oligo (dT), 100 enheter omvendt transkriptase, 1 mp av henholdsvis dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 8 mM MgCl2, 50 mM KC1, 10 mM ditiotreitol og 50 mM tris-HCl; pH 8,3) inkubert ved 42°C i 1 time, deretter avproteinisert ved å tilsette fenol og behandlet med 0,1 N NaOH ved 70 "C i 20 minutter for å fjerne RNA ved dekomponering.

(ili) Syntese av dobbeltkjedet DNA.

Den således fremstilte enkjedede komplementære DNA ble gjort til gjenstand for omsetning i 50 pl av en reaksjonsblanding (den samme blanding som ovenfor med unntak av at mRNA-en og oligo-dT ikke var tilstede) ved 42°C i 2 timer for å syntetisere den dobbeltkjedede DNA.

(iv) Tilføyelse av dC-ender.

Den dobbeltkjedede DNA ble behandlet med nuklease Sl i 50 pl av en reaksjonsblanding (dobbeltkjedet DNA, 0,1 M natrlum-acetat, pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1,5 mM ZnS04, 60 enheter Sl-nuklease) ved værelsestemperatur i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble avproteinisert ved å tilsette fenol og DNA ble utfelt med etanol. Den således erholdte DNA ble omsatt med ende-transferase i 50 pl av en reaksjonsblanding (dobbeltkjedet DNA, 0,14 M kaliumkakodylat, 0,3 M tris (base) (pH 7,6), 2 mM ditiotreitol, lmM CoCl2, 0,15 mM dCTP, 30 enheter ende-transferase) ved 37°C i 3 minutter for å forlengde den dobbeltkjedede DNA med ca 20 deoksycytidin-enheter i hver 3'-ende av DNA-en. Denne serien av omsetninger ga ca 300 ng dobbeltkjedet DNA med doksysytidin-ender.

(v) Spalting av Escherichia coli plasmid og tilføyelse av

dG-ender.

Adskilt ble 10 pg Escherichia coli pladmid pBR322 DNA behandlet med restriksjonsenzym Pstl i 50 pl av en reaksjonsblanding (10 pg DNA, 50 mM NaCl, 6 mM tris-HCl (pH 7,4), 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanol, 100 pg/mg okseserumalbumin, 20 enheter Pstl) ved 37 °C i 3 timer for spalting i det ene gjenkjenningsstedet for Pstl som finnes i pBR322DNA, reaksjonsblandingen ble deretter avproteinisert med fenol og DNA-en ble videre utsatt for ende-transferansebehandling i 50 pl av en reaksjonsblanding (10 pg DNA, 0,14 M kaliumkakodylat, 0,3 M tris (base), pH 7,6, 2 mM ditioreitol, 1 mM CoClg. 0,15 mM dGTP, 30 enheter endetransferase) ved 37°C i 3 minutter for å forlenge den ovnefor nevnte pBR322 plasmid-DNA med ca 8 deoksyguanidiner i hver 3'-ende.

(vi) Sammenføyning av cDNA og transformasjon av

Escherichia coil.

Sammenføyningene ble utført ved å varme opp 0,1 pg av den således erholdte syntetiske dobbeltkjedede DNA og 0,5 pg av det ovenfor nevnte pBR322 plasmid i en oppløsning som inneholdt 0,1 M NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA ved 65°C 1 2 minutter og deretter ved 45"C i 2 timer, etterfulgt av gradvis nedkjøling. Transformasjonen av Escherichia coli X1776 ble utført ved fremgangsmåten til Enea et al., (J- Mol. Biol., 96, 495 (1975)).

(vii) Isolering av cDNA-holdig plasmid.

Ca 8.500 tetracyklin-resistente kolonier ble deretter isolert og DNA-en fra hver koloni ble fiksert på nltrocellulosefilter (M. Grunstein og D.S. Hogness, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)).

Hver for seg ble, basert på aminosyresekvensen til IF-^ som rapportert av D.V. Goeddel et al., (Nature, 295, 503 (1982)), to oligonukleotider med formlene 5'TCCTGGCAGTAGC3' og 5'ACATTCATATCCTCCT3 * antagelig svarende til henholdsvis aminosyrene nr. 1-5 (Cys. Try. Cys. Gin. Asp) og aminosyrene nr. -77-82 (Lys. Gin. Asp. Met. Asn. Val) i I-IFN-sekvensen, syntetisert kjemisk ved hjelp av triesterfremgangsmåten (R. Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)). Disse oligonukleotidene ble behandlet med T4-polynukleotid, 50 mM tris-HCl, pH, 8,0, 10 mM MgCl2» 10 mM merkaptoetanol, 50 p C1-y-<32>P ATP, 3 enheter T4-polynukleotidkinase) ved 37°C i 1 time. Disse oligopeptidene som på denne måten var merket med <32>P i 5<*->enden, ble brukt som sondeforbindelser og sammenføyd med DNA-en på det ovenfor nevnte nitrocellulose-filteret ved hjelp av fremgangsmåten til Lawn et al. (Nucleic Acids Res., 9, 6102 81981).

Ved hjelp av autoradiografi ble det isolert fire stammer som var reaktive overfor de ovenfor nevnte to oligonukleotid-sondene.

Det ble isolert plasmid-DNA-er fra de bakterielle cellene til hver av disse stammene ved hjelp av alkalifremgangsmåten (H.C. Birnboim og J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513

(1979)), Innskuddene 1 plasmid-DNA-ene ble skåret ut med Pstl-restriksjonsenzymet. Blant de isolerte plasmidene ble det som inneholdt det lengste innskuddet valgt ut og kalt "pHIT3709".

Strukturen (basesekvens) til cDNA-sekvensen innskutt i pHIT-3709-plasmidet ble deretter bestemt ved hjelp av den dinukleotid-syntetiske kjedeavslutningsmetoden og ved hjelp av Maxam-Gilbert-fremgangsmåten. Den primære strukturen var slik som vist I fig. 2 (se søknad nr. 831041).

Basesekvensen til det IF-t kodede område (kodon nr Sl til nr 146) i pHIT3709 var Identisk med det som er vist i fig. 3 i Nucleic Acids Res., 10, 2487 et seq. (1982).

EKSEMPEL 2

(i) - Plasmid ptrp601 (vektor var pBR322) som inneholdt promoterdelen for tryptofansyntese i Escherichia coli (promoter og operatorholdig DNA-fragment, 276 basepar, G.N. Bennett et al., J. Mol. Biol., 121, 113 (1978) ble konstruert som ekspresjonsplasmid.

Adskilt ble plasmid pBR322 kuttet med restriksjonsenzymene EcoRI og Aval. De således erholdte "sticky"-endene til Ecorl-og Aval-fragment som inneholdt tetracyklin-resistent gen, ble fylt igjen med DNA-polymerase I stort fragment. Dette fragmentet fikk konjugeres med PvuII-spaltingsstedet til ptrp601 ved å bruke T4DNA-ligase, ptrp701 ble på denne måte konstruert (fig. 3). (ii) For det formål å fjerne begge de to restriksjonsenzym.

Clal-spaltingsstedene som er tilstede i ptrp701, ble ptrp701 utsatt for delvis dekomponeringsbehandling med Clal hvorved man fikk ptrp701 hvor begge de to Clal-spaltingsstedene var blitt kuttet, Etter igjenfylling av de "sticky"-endene med DNA-polymerase I stort fragment, ble det således erholdte ptrp701 på nytt konjugert ved å bruke T4DNA-llgase hvorved man fikk ptrp771 (fig. 3).

(ili) pHIT3709 ble kuttet med restriksjonsenzymet Pstl hvorved man fikk Pstl-fragmentet som inneholder det strukturelle genet for IF-7. Dette fragmentet ble videre ustatt for den delvise nedbrytningen med restriksjonsenzymet BstNIto hvorved man fikk PstNI-Pstl-fragmentet, som ble kuttet 1 BestNI-stedet som finnes i det strukturelle genet for IF--Y. De "sticky"-endene til BstNI-spaltnlngsstedet ble igjenfylt

med DNA-polymerase I stort fragment. Det således erholdte fragmentet og oligonukleotid-mellomstykket

som var syntetisk kjemisk ved den ovenfor nevnte triesterfremgangsmåten og inneholder start-kodonet ATG for protein-syntesen, ble ligert ved å bruke T3DNA-ligase.

Adskilt ble IF-7-genet som var ligert med det ovenfor nevnte mellomstykket, innført i Pstl-Clal-stedet til plasmidvektor ptrp771 nedstrøms for tryptofanpromoteren ved å bruke T4DNA-ligase. Et IF--y ekspresjonsplasmid pHITtrpllOl ble på denne måten konstruert (fig. 4). (iv) pHITtrp2101 ble konstruert ved ytterligere for-bedringer av pHITtrpllOl på følgende måte.

ptrp601 ble først behandlet med restriksjonsenzymene Clal og Hpall hvorved man fikk 0,33 kB av Clal-HpalI-fragmentet som Inneholdt trp-promoteren. Dette fragmentet ble ligert med pHITtrpllOl som var kuttet med Clal og behandlet med alkalisk fosfatase, ved å bruke T4DNA-ligase. pHITtrp2101 som inneholdt de to etter hverandre følgende trp-promoterne, ble derved erholdt (flg. 5).

En stamme E. coli 294/pHIT'trp2101 ble erholdt ved å transformere Escherichia coli 294 med plasmid pHIT*trp2101 ved hjelp av fremgangsmåten til Cohen et al. (anført ovenfor).

EKSEMPEL 3

E. coli 294/pHIT'trp2101 ble inkubert i 200 ml M9-medium som inneholdt 8 jjg/ml tetracyklin, 0,4 <f> kasaminosyre og 1 % glukose I en 1-liters kolbe ved 37°C. Idet veksten av bakterien nådde KU220 (Klett-verdi 220) ble 3e-indolylakrylsyre (IAA) tilsatt ved en konsentrasjon på 30 pg/ml og blandingen ble inkubert videre i 4 timer.

EKSEMPEL 4

Etter at 1,2 liter av kulturoppløsningen erholdt i eksempel 3 var blitt sentrifugert, ble cellene samlet opp og suspendert i 60 ml 0,05 M tris-HCl (pH 7,6) som inneholdt 10 $ > sukrose. Til denne cellesuspensjonen ble det tilsatt 0,3 ml 0,2 M fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF), 24 ml 5M NaCl-oppløsning, 2,4 ml 0,2 M etylendiamintetraacetat (EDTA), 2,4 ml 1 M spermidin og 2,4 ml lysozym (5 mg/ml). Blandingen fikk stå ved 0°C i 1 time, ble inkubert ved 37"C i 5 minutter og deretter ble cellene brutt opp ved 0°C i 30 sekunder ved å bruke en "ARTEK"® (USA)-ultralyd-disintegrator.

Denne lysatoppløsningen ble sentrifugert ved 105.000 x g i 1 time, hvorved det ble samlet opp 66 ml av supernatanten.

EKSEMPEL 5

60 ml av supernatanten erholdt i eksempel 4 ble fortynnet med 20 mM tris-HCl som inneholdt 1 mM EDTA og 0,15 M NaCl (pH 7,6) (TEN) til 150 ml og fortynningen ble bragt over på en anti-IF-nr antistof f kolonne (9 ml) fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge referanseeksempel 10. Kolonnen ble vasket godt med TEN og videre med TEN som inneholdt 0,01 % Nonidet P-40® og 0,5 M NaCl. Deretter ble IF--y eluert med 0,1 M eddiksyre som Inneholdt 0,25 M NaCl. Eluatet ble øye-blikkelig nøytralisert med 1 M tris-HCl (pH 7,6). Den resulterende oppløsning ble dlalysert mot destillert vann ved 4°C i 16 timer og etter nedfrysing med aceton-tørris, lyofilisert hvorved man fikk et pulver.

De erholdte resultatene er vist nedenunder.

Den spesifikke aktiviteten til det således erholdte slutt-produktet av humant immun-interferonprotein (basert på bestemmelsen av viral aktivitet ved hjelp av Inhiberings-analysen for cytoplastisk virkning under anvendelse av VSV-og WISH-celler (beskrevet ovenfor)) var 7,5 x IO<7> U/mg. Karakteriseringen av dette proteinet er nevnt nedenunder.

EKSEMPEL 6

Karakterisering av humant immun-interferonprotein.

(i) Molekylvekt.

Proteinet erholdt i eksempel 5 ble behandlet med 2-merkaptoetanol, utsatt for SDS-polyakrylamidgel (17,5 ^-elektroforese (15 mV, 6 timer) og farget med "Coomassie blue". Proteinet kunne identifiseres som et enkelt bånd (fig. 6). Ut fra forholdet mellom forflytningsstrekningen for molekylvekt-markørene som samtidig ble utsatt for elektroforese, og forflytningsstrekninger for proteinet, ble molekylvekten for proteinet beregnet til 17.000 ± 1.000 (fig. 7). For proteinet som ikke var blitt behandlet med 2-merkaptoetanol, ble det påvist et ytterligere bånd i en posisjon som svarte til en molekylvekt på 33.000 ± 2.000. Denne verdien er ca to ganger molkeylvekten til IF-7, nemlig 17.000 ± 1.000, noe som tyder på at båndet skyldes dimerisert IF-7

(ii) Aminosyreanalyse.

En aliqout av proteinet erholdt i eksempel 5 ble plassert i et glassrør for hydrolyse og det ble tilsatt en 200 ganger større (volum/vekt) mengde av saltsyre med konstant kokepunkt som inneholdt 4 £ tioglykolsyre. Røret ble lukket under redusert trykk og hydrolyse ble utført ved 110°C i 24, 48 og 72 timer. Etter hver hydrolyse ble røret åpnet, saltsyren ble fjernet under redusert trykk og resten ble oppløst i 0,02 N saltsyre og analysert ved å bruke et "Hitachi Model 835"-hurtig-aminosyre-analyseapparat.

For bestemmelse av cystin og cystein, ble det ovenfor nevnte protein oksydert med permaursyre ifølge Hirs et al. (Methods in Enzymology, 11, 197, (1967)) og hydrolysert på samme måte som ovenfor i 24 timer, og cesteinsyre ble bestemt kvanti-tativt ved å bruke aminosyre-analyseapparatet. Gjennomsnittet av tre verdier erholdt etter 24, 48 og 72 timer med hydrolyse ble anvendt som den funne verdi for hver aminosyre med unntak av tilfellene med serin, treonin, tyrosin og tryptofan, hvor verdiene ble beregnet ved ekstrapolering av hydrolyseperioden til 0 timer. Resultatene er vist i tabell 2.

(iii) Analyse av aminosyre i aminoenden.

Proteinet erholdt i eksempel 13 ble oksydert med permaursyre ifølge Hirs et al. (Methods in Enzymology, 11, 197, (1967)) og deretter gjort til gjenstand for analyse av aminosyre i aminoenden ved hjelp av den modifiserte Edman-nedbrytnings-fremgangsmåten ifølge Iwanaga et al. (Eur. J. Biochem., 8, 189, (1969)). De resulterende fenyltiohydantion-aminosyrene

(PHT-aminosyrer) ble identifisert og bestemt kvanitativt på en "Varien (USA) Model 5040"-væskekromatograf med høy yteevne under anvendelse av en "Ultrasphere-ODS"-kolonne ("Altex"®, USA 4, 6 x 250 mm, partikkelstørrelse 5 pm) ved fremgangsmåten til Archer et al. (Altex Chromotogram, 3, 8, (1980)). Derved ble PTH-metioninsulfon og PHT-cysteinsyre bestemt.

Som det er bevist ved de ovenfor nevnte eksempler, kan praktisk talt rene, humane immun-interferonproteiner med en spesifikk aktivitet på Ikke mindre enn 7,5 x IO<7> U/mg fremstilles ved hjelp av foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 7

Inj i serbart preparat.

5 mg humant I-IF-protein ifølge foreliggende oppfinnelse (spesifikk aktivitet på 2 x IO<7> U/mg) oppløses i 100 ml 5 % HSA. Oppløsningen filtreres ved å bruke membranfilter (porestørrelse: 0,2 pm) og fordeles på 100 ampuller under aseptiske betingelser. Oppløsningen i ampullene lyofiliseres aseptisk hvorved man får injiserbare preparater som er klare til bruk.

Preparatene oppløses i 1 ml destillert vann før bruk.

I de etterfølgende referanseeksemplene ble tynnsjiktkromato-grafi utført ved å bruke "Merck 6OF254" silisiumdioksydgel-plater eller "Funakoshi Yakuhin's AVICEL SF"-celluloseplater, sammen med de nedenfor nevnte oppløsningsmidler for frem-kalling:

Rf<*>: Kloroform-metanol-eddiksyre = 9:1:0,5

Rf<2>: Etylacetat-pyridin-eddiksyre-vann = 30:10:3:5

Rf<3>: Kloroform-metanol-vann = 7:3:0,5

Rf<4>: n-butanol-pyridin-eddiksyre-vann = 30:30:6:24

Rf<5>: Etylacetat-n-butanol-eddiksyre-vann = 1:1:1:1

Referanseeksempel 1

(i) Fremstilling av Z-Ser-Gln-OBu<*>.

Z-Gln-OBu<*> (10,1 g) ble oppløst i 500 ml metanol og det ble utført katalytisk reduksjon i en hydrogengass-strøm ved å bruke palladium-sort som katalysator. Katalysatoren ble filtrert fra og oppløsningsmidlet destillert av. Resten ble oppløst sammen med 7,5 g Z-Ser-OH og 6,8 g HONB i 250 ml DMF og oppløsningen ble avkjølt med is. DCC (7,15 g) ble tilsatt ved isnedkjøling og blandingen ble omrørt ved 0'C i 4 timer og ved værelses temperatur i 12 timer. Den dannede DCU ble filtrert fra og oppløsningsmidlet ble destillert av. Resten ble ekstrahert med 300 ml AcOEt og ekstraktet ble vasket med 4 % vandig NaHCOs, 0,2 N saltsyre og vann i nevnte rekkefølge og tørket over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet ble deretter destillert av og det resulterende krystallinske bunnfallet ble samlet opp ved filtrering, tørket og rekrystallisert fra CH3CN.

Utbytte 6,5 g (51,2 %) , smeltepunkt 97-100"C,

[a]D25 - 24,1° (c = 0,40, metanol) Rf<1>0,64

Elementæranalyse:

Beregnet for C20<H>29<O>7N3: C 56,72, H 6,90, N 9,92 Funnet: C 56,21 H 6,72 N 9,72

(ii) Fremstilling av Z-Ala-Ser-Gln-OBu<*>.

Z-Ser-Gln-OBu<*> (4,23 g) ble oppløst i 300 ml metanol og det ble utført katalytisk reduksjon i en hydrogengass-strøm ved å bruke palladium-sort som katalysator. Katalysatoren ble filtrert fra og oppløsningsmidlet ble destillert av. Resten ble oppløst sammen med 2,23 g Z-Ala-OH og 2,27 g HONB i et blandet oppløsningsmiddel satt sammen av 200 ml AcOEt, 200 ml dioksan og 100 ml DMF, og oppløsningen ble nedkjølt med is. DCC (2,238 g) ble tilsatt under avkjøling og blandingen ble omrørt ved 0°C i 4 timer og ved værelsestemperatur i 12 timer. DCU ble filteret fra og oppløsningsmidlet ble avdestillert. CH3CN og eter ble tilsatt til resten og den resulterende krystallinske utfelling tile samlet opp ved filtrering, tørket og rekrystallisert fra CE3CN.

Utbytte 3,71 g (75,3 %), smeltepunkt 165-170°C,

[oc]D<25> -24,1° (c = 0,26 metanol) Rf<1> 0,57.

Elementæranalyse:

(ili) Fremstilling av Z-Arg(PmeJ-Ala-Ser-Gln-OBu<*>.

Z-Ala-Ser-Gln-OBu<t> (3,46 g) ble oppløst i 300 ml metanol og det ble utført katalytisk reduksjon i en hydrogengass-strøm ved å bruke palladium-sort som katalystor. Katalysatoren ble frafUtrert og oppløsningsmidlet ble avdestillert. Resten ble oppløst i 150 ml DMF sammen med Z-Arg(Pme)-0H (fremstilt fra 4,54 g Z-Arg(Pme )-0H.CHA) og 1,9 g HOBt og oppløsningen ble avkjølt med is. DCC (1,9 g) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved 0°C i 4 timer og ved vaerelsestemperatur i 15 timer. DCU ble filtrert fra og oppløsningsmidlet ble avdestillert. AcOEt ble tilsatt til resten og den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering, tørket og på nytt utfelt fra metanol og AcOEt.

Utbytte 4,55 g (75,5 %) , smeltepunkt 130-134°C,

[a]D2<5> -23,1° (c = 0,26, metanol) Rf<1> 0,57.

Elementæranalyse:

(iv) Fremstilling av Z-Arg(Pme)-Arg(PmeJ-Ala-Ser-Gln-OBu<*. >Z-ArgfPmeJ-Ala-Ser-Gln-OBu<*> (4,3 g) ble oppløst i 400 ml metanol og det ble utført katalytisk reduksjon i en hydrogen-gass-strøm ved å bruke palladium-sort som katalysator. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsningsmidlet avdestillert. Resten ble oppløst i 200 ml DMF sammen med Z-Arg(Pme-0H (fremstilt fra 3,24 g Z-Arg(Pme)-0H* CHA) og 1,42 g

HOBt og oppløsningsmidlet ble avkjølt med is. DCC (1,41 g) ble tilsatt og blandingen ble omrørt ved 0'C i 4 timer og ved værelsetemperatur i 20 timer. DCU ble frafUtrert og oppløsningsmidlet ble avdestillert. AcOEt ble tilsatt til resten og den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering, tørket og på nytt utfelt fra metanol og AcOEt.

Utbytte 4,4 g (71,7 %), smeltepunkt 125-130°C,

[a]D25 -18,0° (c = 0,40, metanol) Rf<1> 0,63.

Elementæranalyse:

(v) Fremstilling av Z-Arg(PmeJ-Gly-OBu<*>.

Z-Gly-OBu<*> (13,0 g) ble oppløst i 500 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon i en hydrogengass-strøm ved å bruke palladium-sort som katalysator. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble oppløst i 200 ml DMF og Z-Arg(Pme)-0H (fremstilt fra 20,0 g Z-Arg(Pme)-OH*CHA) og 5,4 g HOBt ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 48 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble oppløst i 500 ml AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NaHCOs og 10 % vandig sitronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Petroleumeter ble tilsatt og utfellingen ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 19,8 g (96,8 #), smeltepunkt 71-73°C,

[a]D<23> + 0,2° (c - 0,9, DMF), Rf<1>0,62.

Elementæranalyse:

(vi) Fremstilling av Z-Phe-Arg(PmeJ-Glu-OB<*>. Z-Arg(Pme)-Gly-OBt<u> (10,0 g) ble oppløst i 500 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon. Produktet ble deretter oppløst i 300 ml DMF. Z-Phe-0H (4,72 g) og 2,35 g HOBt ble tilsatt og blandingen ble avkjølt med is. DCC (3,59 g) ble tilsatt og hele blandingen omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble oppløst i 400 ml AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NSLHCO3 og 10 # vandig sintronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og den resulterende krystallinske utfelling ble samlet opp ved filtrering og rekrystallisert fra MeOH-eter.

Utbytte 10,5 g (85,3 %), smeltepunkt 101-103°C

[a]D<26> -8,3° (c = 0,9, DMF), Rf<1>0,64

Elementæranalyse

(vii) Fremstilling av Z-Leu-Phe-ArgfPmeJ-Gly-OBu<*>. Z-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBu<t> (5,5 g) ble redusert katalytisk i 300 ml MeOH og deretter oppløst i 300 ml DMF. Z-Leu-0H (fremstilt fra 3,31 g Z-Leu-0H*DCHA) og 1,47 g HONB ble tilsatt og blandingen ble avkjølt med ls. DCC (1,68 g) ble tilsatt og hele blandingen ble omrørt i 48 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble oppløst i 300 ml AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NaHC03 og 10 % sitronsyre, tørket over Na£S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og utfellingen ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 6,2 g (98,3 <* >), smeltepunkt 171-173"C,

[a]D<26> -15,5° (c = 0,9, DMF), Rf<1>0,64.

Elementæranalyse:

(vill) Fremstilling av Boe.Met-Leu-Phe.Arg(PmeJ-Gly-OBu<*>. Boc.Met-Leu-Phe.ArgtPmeJ-Gly-OBu<*> (0,6 g) ble redusert katalytisk i 200 ml MeOH og deretter oppløst I 150 ml DMF. Boc-Met-OH (fremstilt fra 3,0 g Boc-Met-OH*DCHA) og 1,39 g HONB ble tilsatt og blandingen ble avkjølt med is. DCC (1,59 g) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert.

Resten ble oppløst 1 n-Bu0H-Ac0Et og oppløsningen ble vasket med 10 1o vandig sitronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Eter ble tilsatt og krystallene ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 6,2 g (93,1 %), smeltepunkt 192-195<*>C,

[oc]D<26> -19,7° (c = 1,0, DMF), Rf<1>0,64.

Elementæranalyse:

(ix) Fremstilling av Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-0H. Til 5,5 g Boc-Met-Leu-Phe-ArgtPmei-Gly-OBu"1 ble det tilsatt 50 ml TFA og blandingen ble rystet ved værelsestemperatur i 10 minutter og deretter oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og utfellingen ble samlet opp ved filtrering og tørket. Den ble oppløst i 50 ml DMF og oppløsningen ble avkjølt med is, etterfulgt av tilsetning av 1,8 ml TEA. Boc-Gln-ONB (fremstilt fra 1,85 g Boc-Gln-OH, 1,49 g HONB og 1,90 g DCC) ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 15 timer og oppkonsentrert. AcOH og deretter AcOEt ble tilsatt og den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte: 5,3 g (89,8 %), smeltepunkt 181-183°C

(dekomponering)

[a]D<26> -19,6° (c = 1,0, DMF), Rf<1>0,30

Elementæranalyse:

(x) Fremstilling av Z-Ser-NHNH-Boc.

Z-Ser-OH (10,0 g) og 6,2 g t-butylkarbazat ble oppløst i 150 ml DMF og oppløsningen ble isavkjølt. HONH (8,0 g) og 9,3 g DCC ble tilsatt og blandingen ble omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble ekstrahert over AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NaHCOs og 10 % vandig sitronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og krystallene ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 7,3 g (50,4 <t>), smeltepunkt 95-98°C,

[a]D<26> -6,2° (c = 0,8, DMF), Rf<1>0,62.

Elementæranalyse:

(xi) Fremstilling av Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc.

Z-Ser-NHNH-Boc (3,9 g) ble redusert katalytisk i 300 ml MeOH og deretter oppløst i 50 ml DMF. Z-Arg(Pme)-0H (fremstilt fra 6,2 g Z-Arg(Pme)-OH-CHA) og 1,5 g HOBt ble tilsatt og hele blandingen ble Isavkjølt. DCC (2,3 g) ble tilsatt og hele blandingen ble omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble oppløst i AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NaHC03 og 10 % vandig sitronsyre, tørket over Na£S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 7,45 g (93,7 *), smeltepunkt 100-101oC, [a]D<26> -0,9° (c = 1,2, DMF), Rf<1>0,51.

Elementæranalyse:

(xii) Fremstilling av Z-Lys(Mtr )-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc.

Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3,9 g) ble oppløst i 300 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon. Produktet ble oppløst i 50 ml DMF og Z-Lys(Mtr )-0H (fremstilt fra 3,4 g Z-Lys(Mtr)-OH-DCHA) og 0,88 g HOBt ble tilsatt. Blandingen ble isavkjølt og 1,34 g DCC ble tilsatt. Hele blandingen ble omrørt i 20 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. AcOEt ble tilsatt og den pulverformige utfellingen ble samlet opp ved filtrering og rekrystallisert fra MeOH-AcOEt.

Utbytte 5,1 g (93,4 %), smeltepunkt 103-1050C,

[oc]D<26> -7,2° (c = 0,8, DMF), Rf<1> 0,57.

Elementæranalyse:

(xiii) Fremstilling av Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc.

Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-SerNHNH-Boc (4,8 g) ble oppløst i 300 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon. Produktet ble oppløst i 70 ml DMF og Z-Arg(Pme)-0H (fremstilt fra 2,8 g Z-Arg(Pme)-OH-CHA) og 0,74 g HOBt ble tilsatt. Blandingen ble isavkjølt og 1,12 g DCC ble tilsatt. Hele blandingen ble omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. Resten ble oppløst i AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vånding NaHCOs og 10 H> vandig sitronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering og på nytt utfelt fra MeOH-eter.

Utbytte 5,8 g (89,8 56), smeltepunkt 136-137°C

[oc]D26 - 6,6° (c = 1,0, DMF), Rf<1>0,58

Elementæranalyse:

(xiv) Fremstilling av Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc.

Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3,0 g) ble oppløst i 150 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon. Produktet ble oppløst i 60 ml DMF og Z-Lys(Mtr)-0H (fremstilt fra 1,54 g Z-Lys(Mtr-OH.DCHA) og 0,31 g HOBt ble tilsatt. Blandingen ble isavkjølt og 0,57 g DCC ble tilsatt. Hele blandingen ble omrørt i 15 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet ble oppkonsentrert. Resten ble oppløst i AcOEt og AcOEt-oppløsningen ble vasket med 4 % vandig NaHCOs og 10 % vandig sitronsyre, tørket over Na2S04 og oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og den krystallinske utfellingen ble samlet opp ved filtrering og rekrystallisert fra AcOEt.

Utbytte 2,70 g (72,8 #), smeltepunkt 123-125°C

[oc]D<26> - 5,9° (c = 1,1, DMF), Rf<1>0,57

Elementæranalyse

(xv) Fremstilling av Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg(Pme i-Ala-Ser-Gln-OBu*.

Z-Arg)Pme )-Arg(PmeJ-Ala-Ser-Gln-OBu1 (1,0 g) ble oppløst i 100 ml MeOH og det ble utført katalytisk reduksjon. Produktet ble så oppløst i 20 ml DMF og 0,85 g Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH og 135 mg HOBt ble tilsatt. Blandingen ble Isavkjølt og 210 mg DCC ble tilsatt. Hele blandingen ble omrørt i 20 timer. Den dannede DCU ble frafiltrert og filtratet oppkonsentrert. MeOH ble tilsatt og den resulterende utfellingen ble samlet opp ved filtrering.

Utbytte 1,50 g (87,4 4>), smeltepunkt 216-217°C

(dekomponering)

[a]D<26> -11,8° (c = 1,0, DMF), Rf<1>0,43.

Elementæranalyse:

(xvi) Fremstilling av H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Ala-Ser-Gln-OH.

Til 1,0 g Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu<*> ble det tilsatt 10 ml TFA og blandingen ble rystet ved værelsestemperatur 1 50 minutter og deretter oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og utfellingen ble samlet opp ved filtrering og tørket.

Adskilt ble 10 ml TFA tilsatt til 0,83 g Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc og blandingen ble rystet ved værelsestemperatur i 10 minutter og deretter oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og utfellingen ble samlet opp ved filtrering og tørket. Det ble oppløst 1 10 ml DMF og oppløsningen ble avkjølt med tørris-aceton, etterfulgt av tisetning av 0,23 ml 6,2N HCl/AcOEt og isoamylnitrit (0,075 ml). Temperaturen ble holdt ved -25°C til -20"C i 20 minutter (negativ ved hydrazin-prøven) og reaksjonsblandingen ble avkjølt på nytt med tørris-aceton og deretter nøytralisert med 0,25 ml TEA. Aminbestanddelen ble oppløst i 40 ml DMF og oppløsningen ble isavkjølt. TEA (0,16 ml) ble tilsatt og den ovenfor nevnte azidoppløsningen ble tilsatt. Hele blandingen ble omrørt ved 4°C i 72 timer og helt over i fortynnet eddiksyre. Den dannede utfellingen ble samet opp ved filtrering og vasket med vandig CH3CN.

Utbytte 1,40 g (81,5 %), Rf<1>0,09.

En del (400 mg) av dette produktet ble oppløst 1 60 ml TFA-tioanisol-metylsulfid (8:1:1) som inneholdt 0,15 M MSA og oppløsningen ble rystet ved vaerelsestemperatur i 2 timer. ACONH4 (400 mg) ble tilsatt og blandingen ble oppkonsentrert. Det ble tilsatt eter og utfellingen ble samlet opp ved filtrering og tørket. Den ble oppløst i en liten mengde IN AcOH og oppløsningen ble sendt gjennom en "Sephadex G-25"-kolonne (2,2 x 120 cm) under anvendelse av IN AcOH som elueringsmiddel. Fraksjoner fra 160 ml til 260 ml ble slått sammen og lyofilisert. Lyofilisatet ble deretter sendt gjennom en kolonne av "Amberlite IRA-410" (acetat-form) og lyofilisert. Dette lyofilisatet ble renset ved hjelp av HPLC under anvendelse av en "TSK-LS-410"-kolonne (2,14 x 7,5 cm + 2,14 x 30 cm) hvorved man fikk den ovenfor identifiserte forbindelse.

Utbytte 45 mg [a]D<24> -45° (c = 0,7, OnlN AcOH),

Rf<4> (cellulose) 0,20.

Aminosyre-analyse:

Lys 1,71, Arg 4,71, Ser 1,69, Glu 2,12, Gly 1,00, Ala 1,03, Met 0,32, Leu 1,0, Phe 1,08 (gjennomsnittlig utvinnings-forhold 77 %).

Referanseeksempel 2

Syntese av bærerprotein-polypeptid-kompleks.

Polypeptidet erholdt i referanseeksempel 1 (xvi) ble sammenkoplet med tyroglubulin (heretter betegnet TG) ifølge Goodfriend et al. (Science, 144, 1334 (1964)). 2,5 mg av polypeptidet ble således blandet med 3,75 mg TG og, etter tilsetning av 2 ml 50 mM f osf atbuf f er, ble blandingen godt omrørt i isvann. Til denne ble det gradvis tilsatt dråpe for dråpe en oppløsning av 30,4 mg kabodiimidhydroklorid i 200 ml destillert vann. Deretter ble blandingen omrørt i isvann i 3 timer. Etter omsetningen ble det utført dialyse mot destillert vann i en tilstrekkelig utstrekning, etterfulgt av lyofilisering hvorved man fikk 4,7 mg av et proteinkompleks.

Referanseeksempel 3

Fremstilling av enzym-bundet antigen for antistoffpåvisning ved EIA.

Det enzymbundne antigen for EIA ble fremstilt ifølge Kitagawa et al., (Journal of Biochemistry, 79, 233 (1976)). (i) Innføring av en maleimidogruppe i polypeptidet. Polypeptidet (350 nmol) erholdt i referanseeksempel 1 (xvi) ble oppløst i 1 ml 100 mM fosfatbuffer (pH 6,8) og opp-løsningen ble tilsatt til en oppløsning av 585 pg (1,75 pmol) N-(4-karboksycykloheksylmetyl)maleimid-N-hydroksysuccinimid-ester i 70 pl N,N-dimetylformamid. Blandingen ble omrørt ved 30 'C i 30 minutter. Etter omsetningen ble det utført fraksjonering ved å bruke en "Sephadex G-25"-kolonne hvorved man fikk 185 nmol av en polypeptidfraksjon hvori maleimido-gruppen var innført.

(ii) Sammenkopling mellom det maleimido-gruppe-holdige

polypeptidet og 3-D-galaktosidase.

Det maleimido-holdige polypeptidet (16,5 nmol) erholdt i referanseeksempel 3 (i) ble behandlet med 3,3 nmol p-D-galaktosidase. Etter 18 timers omsetning ved 4°C, ble 412,5 nmol 3-merkaptoetanol tilsatt for å stanse reaksjonen. Det e-D-galaktosidase-koplede polypeptidet ble fraksjonert på en "Sepharose 6B"-kolonne og brukt ved de derpå følgende eksemprimentene.

Referanseeksempel 4

EIA-fremgangsmåten.

Bestemmelsen av antistoffaktivitet i serumet til mus immunisert med proteinkomplekset erholdt i referanseeksempel 2 eller i hybridoma-supernatanten ble utført ved hjelp av EIA-fremgangsmåten (Immunology, 1, 3, (1978)). Serumet eller hybridoma-supernatanten ble således fortynnet med buffer A

(20 mM Na2EP04, 100 mM NaCl, 0,1 56 NaN3, ImM MgCl2, pH 7,0)

en 100 pl stor porsjon av fortynningen ble blandet med 100 pl av polypeptidderivatet erholdt i referanseeksempel 3, og reaksjonen fikk fortsette ved 24°C i 24 timer. Deretter ble 100 pl 3 56 cellulose bundet til kanin antimus IgG tilsatt og omsetningen fikk fortsette ved 24'C i 4 timer. Etter omsetningen ble cellulosen vasket godt med buffer A som inneholdt 0,5 % "Tween 20", deretter ble 500 pl 20 pg/ml 4-metylumbelliferyl-p<->D-galaktosid tilsatt og etter 2 timer med omsetning ved 37°C, ble 3 ml 100 mM karbonatbuffer (pH 10,5) tilsatt for å stanse reaksjonen. Fluorescens-styrken ble målt med et fluormeter (eksitasjon: 365 nm, emisjon: 450 nm).

Referanseeksempel 5

Immunisering.

Ever enkelt av 6 BALB/C-hunnmus 1 alderen 7-8 uker ble inokulert subkutant med 40 pg (på proteinbasis) av proteinkomplekset erholdt i referanseeksempel 2 (som antigen) i grundig blanding med Freunds fullstendig hjelpestoff (første immunisering). To uker etter den første immuniseringen ble musene inokulert subkutant med antigenet i den samme dose som ovenfor I grundig blanding med Freunds fullstendige hjelpestoff (andre immunisering). Ytterligere to uker senere ble en tredje immunisering gjort på samme måte som i den andre immuniseringen. Seks dager etter den tredje immuniseringen ble det tatt blodprøver av musene og antistoff-titerne i serumet ble bestemt ved hjelp av EIA-fremgangsmåten beskrevet i referanseeksempel 4. Musen nummerert *y—2 ga den høyeste antistofftiteren og ble utsatt for sluttimmuni-seringen ved intravenøs inokulering med 120 pg av antigenet oppløst i 0,5 ml vandig natriumklorid. Dataene for antistofftiteren for hver mus er vist i tabell 3.

Referanseeksempel 6

Cellefusjon.

Immunisering ble utført ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet 1 referanseeksempel 5. Tre dager etter slutt-immuniseringen ble milten fjernet fra -y-2-musen, filtrert under trykk gjennom en plettfri sikt og suspendert i "Eagles minimum essential medium" (MEM) hvorved man fikk en miltcelle-suspensjon. Til cellefusjon ble det brukt BALB/C P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) myelomaceller utvunnet fra mus (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1, (1978)). Cellefusjonene ble utført ved hjelp av den opprinnelige fremgangsmåten (Nature, 256, 495, (1975)). Således ble miltceller og P3Ul-celler vasket hver for seg tre ganger med serumfritt MEM og blandet i et forhold på 5:1 (i antall celler). Blandingen ble sentrifugert ved 800 rpm i 15 minutter, hvorved cellene ble bunnfelt. Etter grundig fjerning av supernatanten, ble sedimentet lett løsnet, 0,3 ml 45 # polyetylenglykol (PEG) 6000 (Kock-Light) ble tilsatt og blandingen fikk stå i en varm vanntank holdt ved 37"C i 7 minutter for å bevirke cellefusjon. Deretter ble MEM tilsatt i en hastighet på 2 ml pr minutt. Etter tilsetning av I alt 12 ml MEM, ble den resulterende blanding sentrifugert ved 600 rpm i 15 minutter, etterfulgt av fjerning av supernatanten. Cellesedimentet ble suspendert i RPMI-1640-medium supplert med 10 1o kalvefosterserum (RPMI1640-10FCS) i en konsentrasjon på 2 x IO<5> P3U1 celler/ml og hver av 144 brønner på 24-brønners multiplater (Linbro) ble tilført 1 ml av suspensjonen. Etter tilsetningen ble cellene inkubert ved 37"C i en 5 % karbondioksydgass-inkubator. Etter 24 timer, ble HAT-selektiv dyrking startet opp ved å tilsette PRMI1640-10FCS-medium supplert med HAT (1 x 10~<4> M hypoxantin, 4 x 10"<7> M aminopterin, 1,6 x 10~<5> M tymidin) (HAT-medium) i en mengde på 1 ml pr brønn. Den HAT-selektive dyrkingen ble fortsatt, mens 1 ml av det gamle mediet ble erstattet med 1 ml frisk HAT-medium 3, 5 og 7 dager etter oppstartingen av dyrkingen. Veksten av hybridomaer ble registrert 10-14 dager etter cellefusjon. Når kulturvæsken ble gul (ca 1 x 10^ celler/ml), ble supernatanten samlet opp og undersøkt med hensyn til på nærværet av antistoff ved hjelp av EIA-fremgangsmåten. På denne måten ble supernatanter fra 141 brønner, hvori hybridomavekst var blitt registrert, undersøkt. To brønner (-Y2-11 og 72-100) ga sterk antistof f aktivitet og to andre brønner (^2-62 og ^2-70) oppviste svak antistoffaktivitet.

Referanseeksempel 7

Kloning.

Hybridomer fra 3 brønner (^2-11, 62 og 100) som var positive med hensyn til antistoffaktivitet, ble klonet ved hjelp av den begrensede fortynningsfremgangsmåten. Hybridomer ble således suspendert i RPMI1640-20FCS i en konsentrasjon på 2 hybridomer/ml og suspensjonen ble fordelt i 0,1 ml store porsjoner i brønnene på en 96 brønners mikroplate (Nunc). Ved denne fordelingen ble 5 x IO<5> BALB/c-musetymocytter pr brønn tilsatt som tilførselsceller. Som et resultat, ble celleformering observert etter ca 2 uker. Supernatanten ble deretter samlet opp og undersøkt med hensyn på nærvær av antistoffer ved hjelp av EIA-fremgangsmåten slik som beskrevet i eksempel 4. Antistoffaktivitet ble registrert i 8 av 19 kloner fra ^2-11, i 3 av 54 kloner fra -y2-62 og i 5 av 47 kloner fra 72-100.

Referanseeksempel 8

Askitesdannelse ved hjelp av hybridomer som produserer monoklonalt antistoff.

Askitesdannelse ble forårsaket ved intraperitoneal inokulering av BALB/c-mus som var forbehandlet intraperitonealt med 0,5 ml mineralolje, med 1 x 10^ 72-11.1 kloneceller som var i stand til å produsere antistoffer med IFN-7-bindende virkning. Ti dager etter intraperitoneal administrering av hybridomer, ble askites-væsken tatt ut og undersøkt med hensyn på antistoffaktivitet opptil 10<7->gangers fortynning. Mens antistoffaktiviteten til den tilsvarende kultur-supernatanten fra klon-cellene ble bestemt opptil 10<4->gangers fortynning, første dannelsen av askites (askitisering) til en ca 1000 gangers økning av antistoffaktivitet.

Referanseeksempel 9

Rensing av monoklonalt antistoff.

Ved å bruke 4 ml av askitesvæsken erholdt i referanseeksempel 8 som utgangsmateriale, ble rensing av monoklonalt antistoff utført ved hjelp av fremgangsmåten til Staehelin et al.

(Journal of Biological Chemistry, 256, 9750, (1981)). Askitesvæsken ble således først sentrifugert ved 10.000 rpm 1 15 minutter for å fjerne fibrinlignende stoffer fra den og deretter fortynnet med fosfatbuffer-saltvannsoppløsning (PBS: 8,1 mM NaH2P04, 1,5 mM KH2P04, 2,7 mM KC1, 137 mM NaCl, pH 7,2) inntil en konsentrasjon hvor den ultrafiolette absorb-sjonen ved 280 nm (A23ø) for fortynningen lå i området fra 12-14. Deretter ble mettet vandig ammoniunsulfat tilsatt til den fortynnede prøven inntil en konsentrasjon på 47 % med hensyn på sulfatet. Blandingen ble omrørt ved 4°C i 60 minutter for å bevirke utsalting og deretter sentrifugert (10.000 rpm, 15 minutter) hvorved man fikk et bunnfall. Bunnfallet ble oppløst i 20 mM tris-buffer (pH 7,9) som inneholdt 50 mM NaCl, og dialysert mot 2 liter av den samme buffer. To timer senere ble dialyseringsoppløsningen erstattet med en frisk 2 liters porsjon av den samme oppløsning og dialysen ble fortsatt i ytterligere 15 timer. Deretter ble utfellingen fjernet ved sentrifugering ved 10.000 rpm i 15 minutter og supernatanten ble justert til en konsentrasjon slik at A2gø-verdien ble 20-30. Denne prøven ble gjort til gjenstand for fraksjonering på en DEAE-cellulose-kolonne (8 ml, Whatman DE52) som var ekvilibrert med en tilstrekkelig mengde Tris-buffer som inneholdt 50 mM NaCl. Etter grundig vasking med den samme buffer ved en strømningshastighet på 1,5 ml/minutt, ble NaCl-konsentra-sjonen økt lineært fra 50 mM til 500 mM. Under disse betingelsene ble antistoffaktiviteten hovedsakelig påvist i avløpsfraksj oner.

Referanseeksempel 10

25 ml (65,3 mg) av det monoklonale antistoffet fra avløps-fraksjonene renset ved hjelp av fremgangsmåten ifølge referanseeksempel 9 ble dialysert over natten mot 0,1M MaHC03 (pH 8,3). Separatet ble 25 ml AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) vasket grundig med vann ved å bruke et glassfilter, suspendert i 0,1M NaHC03 (pH 8,3) og blandet med det ovenfor nevnte antistoff. Blandingen ble forsiktig omrørt ved 4°C i 4 timer for å fremme reaksjonen og deretter fikk den stå ved 4°C over natten. Den resulterende AFFI-GEL 10 ble vasket godt med 0,1M NaHC03 (pH 8,3), ved bruk av et glassfilter. Til gelen ble det tilsatt 25 ml av en oppløsning (pH 8,0) som inneholdt 0,1M etanolamin og 0.15M NaCl. Blandingen ble rystet ved 4°C i en time for å blokkere mulige gjenværende ikke-omsatte aktive grupper. Deretter ble gelen vasket godt med PBS og suspendert i 25 ml 0,1 1o NaN3-holdig PBS. Suspensjonen ble lagret ved 4°C. Basert på mengden tilsatt antistoff og mengden av antistoffet i det utvunne filtratet, ble det funnet at antistoffet var konjugert til gelen i et forhold på 2,35 mg/ml gel. En kolonne ble pakket med det på denne måten erholdte reaksjonsproduktet og brukt som en antistoffkolonne.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et uglykosylert rekombinant human immuninterferonprotein fra et dyrket medium oppnådd ved dyrking av en transformert Escherichia coli som har DNA inneholdene en basesekvens som koder for humant immuninterferon for å produsere og akkumulere humant immuninterferon i transformantcellene, karakterisert ved at cellene lyseres og den resulterende oppløsning som inneholder humant interferon, underkastes rensing ved bruk av monoklonalt antistoff mot H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH, hvorved det oppnås et vesentlig rent, uglykosylert rekombinant humant immuninterferonprotein som har en spesifikk aktivitet på ikke mindre enn IO<7> U/mg.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for humant immuninterferon er: hvor X er TAA, TGA eller TAG.