FI81832C - Foerfarande foer framstaellning av ytterst rent rekombinant humant immun-interferonprotein. - Google Patents

Description

81 832

Menetelmä erittäin puhtaan, ihmisen yhdistelmä immuuni-interferoniproteiinin valmistamiseksi Förfarande för framställning av ytterst rent rekombinant humant immun-interferonprotein

Keksintö koskee menetelmää ihmisen immuuni-interferoni -proteiinin valmistamiseksi geenitekniikkaa apuna käyttäen, sekä sen puhdistamiseksi.

Korkeammat eläinsolut tuottavat virusten, nukleiinihappojen, jne. aiheuttaman stimulaation tuloksena interferoneja (käytetään jäljempänä joskus lyhennettä IF), joilla on mm. virusten- ja kasvaintenvastaisia ominaisuuksia.

Nykyään interferonit luokitellaan ominaisuuksiensa mukaan kolmeen tyyppiin, nimittäin a-, 3- jay-tyyppi, joista a- ja 0-tyyppi ovat virusten tai nukleiinihappojen indusoimia j ay-tyyppi on mm. mitogeenien indusoima.

α-IF-tyypin (käytetään jäljempänä lyhennettä IF-α) ja 3-IF-tyypin (käytetään jäljempänä lyhennettä IF-3) tutkimukset ovat edenneet huomattavasti ja niiden tuotantomeka-nismeja on saatu selville melkoisessa määrin. Geeniteknii-: kan menetelmien kehittyminen on jopa tehnyt mahdolliseksi tuottaa IF-α: aa, IF-3i:tä ja IF-cu:tä biologisesti aktii-: : : visina proteiineina suuria määriä, kun viljellään

Escherichia colia (IF-α ja IF-3i) tai hiivoja (IF-ai) (Goeddel, D. V. et ai., Nature, 287, 411 ( 1980); Yelverton, E. et ai., Nucleic Acids Res., 9_, 731 (1981); Goeddel, D. V. et al., Nucleic Acids Res., j), 4057 (1980); Hitzeman, R. et al. , Nature, 293, 717 ( 1981)). Lisäksi tällä hetkellä on menossa kokeet suuren mittakaavan tuotantoa ajatellen tarkoituksena suorittaa tuotteilla kliinisiä kokeita.

Immunologi s es ti toimintakykyiset solut (immunosyytit) : tuottavaty-tyypin interferonia (käytetään jäljempänä joskus lyhennettä IF-y) sellaisissa olosuhteissa, joissa , ··. tapahtuu lymfosyyttitransformaatio (muuttuminen verisolu- "*. jen esiasteiksi (blast cell) ) tai lymfokiinin tuotanto, :.: · ja näin ollen sitä kutsutaan myös immuuni-interferoniksi (käytetään jäljempänä joskus lyhennettä I-IF). I-IF:llä on 2 81832 ilmoitettu olevan suurempi solujen lisääntymistä ja kasvainten kasvua estävä vaikutus kuin IF-α: 11a ja IF-0: 11a ja näin ollen siltä odotetaan paljon kliinisissä sovellutuksissa. Koska on olemassa erilaisia rajoittavia tekijöitä, kuten tuoreiden lymfosyyttien käyttö I-IF:n valmistamiseksi, ei tähän mennessä ole saatu aikaan yhtään tehokasta tuotantomenetelmää. On ehdotettu, että eri solulajit voivat eri koe-olosuhteissa mahdollisesti tuottaa eri I-IF-molekyylilaatuja. Kuitenkin niiden rakenteet ja ominaisuudet ovat edelleen tuntemattomia monessa suhteessa.

Toisaalta interferonit ovat hyvin lajispesifisiä ja näin ollen ihmisissä käytettäviksi tarkoitettujen interferonien pitää olla peräisin ihmisestä. Koska kuitenkin ihmisen immuuni-interferonin suurimittainen tuotanto on vaikeata, sen kliininen käyttö on mahdotonta tällä hetkellä, ja näin ollen odotetaan sellaisen tekniikan kehittymistä, jonka avulla voitaisiin tuottaa erittäin puhdasta ihmisen immuuni-interferonia suuria määriä pienin kustannuksin.

Nyt käsillä olevan keksinnön tekijät ovat syventyneet kehittämään tekniikkaa ihmisen I-IF-proteiinin tuottamiseksi, jossa menetelmässä kloonataan ihmisen I-IF-geeni yhdistelmägeenitekniikkaa hyväksikäyttäen ja näin saatu yhdistelmä-DNA-molekyyli siirretään isäntäsoluun ihmisen I-IF-geenin ilmentämistä varten. Työnsä tuloksena keksijät ovat saaneet aikaan tämän keksinnön.

Kuten oheisista patenttivaatimuksista tarkemmin ilmenee, keksintö tarjoaa menetelmän, jolla ihmisen yhdistel-mäimmuuni-interferoniproteiini saadaan käytännöllisesti katsoen puhtaassa, glykosyloimattomassa muodossa, ja menetelmässä viljellään Escherichia coli-transformanttia, jossa on ihmisen immuuni-interferonia koodittavan emäs-sekvenssin sisältävä DNA, ja näin saatu ihmisen immuuni-interferoniproteiinin sisältävä neste puhdistetaan käyttämällä sellaista monoklonaalista vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan ihmisen immuuni-interferoniin.

3 81832

Gray et ai., jotka uskoivat kloonanneensa yhden ihmisen I-IF-geeneistä, julkaisivat siitä johdetun po-lypeptidin aminohapposekvenssin (Nature, 295, 503 (1982)).

Sen jälkeen ilmestyi samanlaisia raportteja (Devos et ai.,

Nucleic Acids Research, JUD, 2487 (1982) ja Derynck et ai., ibid., 1J), 3605 (1982)). Kuitenkin tähän mennessä interferoninkaltaisten aineiden lsänäolo on vain oletettu havaitun virustenvastaisen aktiivisuuden perusteella. Missään raportissa ei ole mainittu, että on voitu saada aikaan ihmisen immuuni-interferonia käytännöllisesti katsoen puhtaassa muodossa.

Tämän keksinnön tekijät ovat saaneet aikaan käytännöllisesti katsoen puhtaassa muodossa olevan ihmisen iircnuuni-interfe-ronin ja sen valmistusmenetelmän ja näin ollen saaneet aikaan tämän keksinnön.

Ihmisen immuuni-interferonia koodittavana DNA:na voidaan tämän keksinnön mukaisesti käyttää esimerkiksi sellaista DNA:ta, joka sisältää kaavan (I) mukaisen emässekvenssin

. . (?) TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA

; GAA AAC CTT AAG AAA TAT'TTT AAT GCA GGT CAT TCA

GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT

TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA

ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT

TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG

V: AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG

TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC

GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT

GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG

ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG

CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA

;; gca tcc cag -x (?) (i) ·.. jossa X on TAA, TGA tai TAG.

Edellämainitussa DNA:ssa voi olla 5'-päässä 5' ATG AAA TAT ACA AGT TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC 3' (II) tai ATG (III).

4 81832 DNA (I) on edullista sijoittaa promoottorin alapuolelle, joita ovat esim. tryptofaanipromoottori (trp), laktoosi-praroottori (lac) tai proteiiniketjunpidennystekijä-Tu-pro-moottori (tufB) , mielellään trp-promoottori.

Kaavassa (I) on X:n edustama oligonukleotidi mielellään TAA.

Tässä selostuksessa, piirroksissa ja vaatimuksissa käytetyt lyhenteet on määritelty taulukossa 1.

Taulukko 1 DNA: deoksiribonukleiinihappo A: adeniini T: tyrniini G: guaniini C: sytosiini RNA: ribonukleiinihappo dATP: deoksiadenosiinitrifosfaatti dTTP: deoksitymidiinitrifosfaatti dGTP: deoksiguanisiinitrifosfaatti dCTP: deoksisytidiinitrifosfaatti ATP: adenosiinitrifosfaatti · EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo ’ : SDS: natriumdodekyylisulfaatti :: Gly: glysiini

Ala: alaniini • ·. Vai: väliini

Leu: leusiini

Ile: isoleusiini

Ser: seriini

Thr: treoniini

Cys: kysteiini

Met: metioniini ; Glu: glutamiinihappo

Asp: asparagiinihappo

Lys: lysiini

Arg: arginiini • · His: histidiini

Phe: fenyylialaniini 5 81832

Tyr: tyrosiini

Trp: tryptofaani

Pro: proliini

Asn: asparagiini

Gin: glutamiini Z: karbobentsoksi

Boc: tert.-butoksikarbonyyli

Mtr: 4-metoksi-2,3,6-trimetyylibentseenisulfonyyli

Pme: pentametyylibentseenisulfonyyli OBu: tert.-butyyliesteri ONB: N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imido esteri DCC: N ,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi DCU: NfN'-disykloheksyyliurea HONB: N-hydroksi-5-norborneeni-2,3-dikarboksi-imidi HOBt: N-hydroksibentsotriatsoli CHA: sykloheksyyliamiini DCHA: disykloheksyyliamiini TEA: trietyyliamiini TFA: trifluorietikkahappo MSA: metaanisulfonihappo :: : THF: tetrahydrofuraani DMF: dimetyyliformamidi .: i MeOH: metanoli

AcOEt: etyyliasetaatti ·*: Keksinnönmukaisesti voidaan ihmisen immuuni-interfero- nia koodittava kaksisäikeinen DNA valmistaa esim. viljelemällä ihmisen immuuni-interferonia erittäviä soluja, kuten ihmisen perifeerisiä veren lymfosyyttejä, eristämällä ihmisen immuuni-interferonia koodittava lähetti-RNA (mRNA) kasvuliemestä, syntetisoimalla siihen perustuva yksisäi-;;; keinen, komplementaarinen DNA (cDNA) käyttämällä esim.

" käänteiskopioijaentsyymiä, johtamalla tästä kaksisäikeinen DNA, liittämällä se plasmidiin, transformoimilla esim. Echerichia coli näin saadulla plasmidilla ,ja eristämällä cDNA:n sisältävä plasmidi.

ΐ 6 81832 Tässä käytetyt ihmisen perifeeriset veren lymfosyy- ' tit voivat olla joko herkistämättömiä tai herkistettyjä soluja.

Tämän keksinnön toteutuksessa käytetty I-IF:n indusoi ja voi olla mitä tahansa laatua edellyttäen, että se kykenee indusoimaan ihmisen lymfosyyttisolut tuottamaan immuuni-interferonia. Sopivista voidaan mainita mm. fyto-hemagglutiniini (PHA), konkavaliini A (ConA), stafylokok-kaalinen enterotoksiini A (SEA), neuraminidaasi-galaktoosi-oksidaasi (NAGO) ja 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaat-ti (TPA). Näitä voidaan käyttää joko yksin tai yhdistelminä .

I-IF:n indusoituminen voidaan saada aikaan viljelemällä soluja sinänsä tunnetussa väliaineessa, kuten RPMI-1640-alustassa tai MEM-alustassa, mielellään RPMI-1640-alustassa, jossa on vasikan sikiön seerumia. Viljely suoritetaan lämpötila-alueella 35-39°C, mielellään välillä 36-38°C, 12-72 tunnin ajan, mielellään 22-26 tuntia. Solut otetaan talteen sinänsä tunnetulla tavalla, lisätään RNAaasin inhibiittoria, kuten guanidiinitiosyanidia, ben-toniittia, hepariinia, polyvinyylirikkihappoa, auriinitri-· karboksyylihappoa, vanadiinikompleksia, dietyylipyrokarbo- ·. *: naattia (DPC) tai natriumdodekyylisulfaattia (SDS) , ja so- :.i * lut lysoidaan lisäämällä esim. N-lauroyyliSarkosiinia, : Tween 80 tai Nonidet P-40. Sitten suoritetaan RNA:n uutto.

Tarvittaessa uuttotoimenpide toistetaan, kun tähän RNA-pitoiseen .'· uutteeseen on ensin lisätty fenolia tai fenoli-kloroformi- seosta tms. RNA-jae otetaan talteen etanolisaostuksella.

Koska tiedetään, että suurin osa eukaryoottisten solujen sytoplasmasta peräisin olevista soluista sisältää poly-A-sekvenssin 3’-päässä, otetaan poly(A+)RNA:t talteen käyt-" tämällä esimerkiksi oligo(dT)selluloosaa tai poly(U)sefa- ·' ' roosia ja suoritetaan fraktiointi sakkaroositiheysgradien- tilla. Jokaisesta jakeesta injektoidaan näyte Xenopus laevis-sammakoiden varhaismunasoluihin luentaa varten (Gurdon, J.B. et ai., Nature, 233, 177 (1971)). Saatu li 7 81832 proteiini tutkitaan virustenvastaisen aktiivisuuden suhteen. Näin voidaan saada 12-16S-jae, joka sisältää immuuni-interferonin mRNArn. mRNA voidaan myös puhdistaa formamidi-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla tai aga-roosigeelielektroforeesilla käyttämällä glyoksaalia.

Kun näin saatua mRNA:ta käytetään templaattina, voidaan syntetisoida komplementaarinen DNA-ketju (cDNA) esim. sinänsä tunnetulla menetelmällä käyttämällä käänteiskopi-oijaentsyymiä, ja cDNA muunnetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi (Maniatis, T. et ai., Cell, 8^, 163 (1 976).

Tämä DNA liitetään esim. plasmidiin pBR322 sen

PstI- tai SphI-restriktioendonukleaasikatkaisukohtaan käyttämällä esim. dG-dC- tai dA-dT-homopolymeerihäntäme- netelmää (Nelson, T.S., Methods in Enzymology, 6jJ, 41 (1979),

Academic Press Inc., New York). Yhdistelmä-DNA siirretään esim. Escehrichia coli χ1776-kantaan transformointitarkoi- tuksessa. Transformantit voidaan valita tetrasykliiniin tai ampisilliiniin kohdistuvan vastustuskyvyn perusteella.

Sitten syntetisoidaan erikseen oligonukelotidi, jolla on . . sellainen emäsjärjestys, että se oletettavasti vastaa ·;· : I-IF-polypeptidin aminohapposekvenssiä, ja se mer- ·"· · 32 • '· kitään P:llä, jotta saadaan koetin, jolla saadut tetra- : sykliinin tai ampisilliinin suhteen vastustuskykyiset trans- ; formantit seulotaan toisen kerran esim. sinänsä tunnetulla : " pesäkehybridisaatiomenetelmällä haluttujen kloonien löytä- :V: miseksi (Grunstein, M. ja Hogness, D.S., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 72, 3961 (1975) ) .

Tässä pesäkehybridisaatiossa positiivisiksi osoittautuneiden kloonien emässekvenssit tutkitaan esim. Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (Maxam, A.M. & Gilbert , W.,

Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 7_4, 560 (1977)) tai dinukleo--* tidisynteesi-ketjunkatkaisumenetelmällä käyttämällä M13- fagia (Messing, J. et ai., Nucleic Acids Res., 9, 309 (1981), jotta I-IF-geenin läsnäolo saa<^aau varmistetuksi. Sitten I-IF-geeni leikataan saadusta kloonista irti täysin tai osaksi ja liitetään sopivan promoterin ja SD- 8 81832 sekvenssin (Shine and Dalgarno) alapuolelle sopivaan isäntä-soluun siirtämistä varten.

Sopivia promoottoreita ovat esim. edellämainitut. Edullisia isäntäsoluja ovat Escherichia coli-kannat (294, W3110, C600 jne.), joista 294 on erittäin edullinen.

Kanta 294 on ennestään tunnettu organismi (Backman, K. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, T3_, 41 74 ( 1 976)) ja sen on myös taltioitu Institute for Fermentation-koko-elmiin Osakaan, jossa sille on annettu kokoelmanumero IFO-14171.

Isäntäsolun transformointi tämän keksinnön mukaisella DNA:11a suoritetaan esim. jollakin tunnetulla menetelmällä (Cohen, S.N. et ai., Proc .Natl .Acad.Sei .USA, 6j), 211 0 (1972) ) .

Näin saatua transformanttia viljellään sinänsä tunnetussa kasvualustassa.

Kasvualusta voi olla esim. M9-alusta, joka sisältää glukoosia tai kasaminohappoa (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring Harbor Laboratory, . . New York, 1972). Jotta promoottori toimisi tehokkaasti, voi- ';·; daan tarvittaessa lisätä 3B-indolyyliakryylihappoa tms.

Viljely suoritetaan yleensä 15-43°C:ssa 3-24 tunnin · aikana. Tarvittaessa voidaan ilmastaa ja/tai sekoittaa.

: .· Viljelyn jälkeen solut otetaan talteen sinänsä tun netulla tavalla ja suspendoidaan puskuriin ja lysoidaan . : sen jälkeen esim. ultraäänikäsittelyllä, lysotsyymillä ja/tai jäädytys-sulatusmenetelmällä. Sitten emäsliuos sentrifugoidaan talteen. Solujen lysoiminen on edullista suorittaa jäädyttämällä ja sulattamalla ja sen jälkeen käsittelemällä lysotsyymillä.

Edelläolevan emäliuoksen sisältämä ihmisen I-IF on ' . edullista puhdistaa käyttämällä sellaista monoklonaalista vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan ihmisen immuuni-”· interferoniin, erityisesti sellaista monoklonaalista vas- ta-ainetta, joka kohdistuu seuraavan kaavan mukaiseen po-lypeptidiin: 9 81832 (N) (C) , , H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Fhe Arg Gly-Y-OH (IV) jossa X on sidos tai 1-16 aminohappoa sisältävä peptidi tai aminohappotähde, kun lasketaan seuraavassa esitetyn peptidiketjun C-päästä lähtien (N)

Ile Gin Vai Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala (C)

Ala Lys Thr Gly Lys Arg ja Y on 1 - 5 aminohappoa sisältävä peptidi tai aminohappotähde, kun lasketaan peptidiketjun N-päästä lähtien (N) (C)

Arg Arg Ala Ser Gin, joka on uusi polypeptidi.

Polypeptidin (IV) suhteen on edullista, jos Y on Arg Arg Ala Ser Gin ja/tai X on Lys Arg. Lisäksi on edullista, jos polypeptidi (IV) sisältää 15-25 aminohappotähdettä .

Mainittua monoklonaalista vasta-ainetta on edullista käyttää vasta-ainepylvään muodossa.

: Vasta-ainepylväs voidaan valmistaa esim. siten, että edellämainittu monokonaalinen vasta-aine liitetään ouh-: [ : taassa muodossa, joka on saatu hybridomalla siirroste- tusta askitesnesteestä, sopivaan kantoaineeseen seuraa-vassa kuvatulla tavalla.

Kantoaine voi olla mitä tahansa sellaista laatua, että yhteenliittymisreaktion jälkeen I-IF voi adsorboitua spesifisesti ja tehokkaasti, ja että se voidaan sen jälkeen elu-oida sopivalla tavalla. Esimerkiksi on edullista käyttää helmien muodossa olevaa agaroosigeeliä, joka on aktivoitu '·*·' siten, että proteiinin primäärinen aminoryhmä sitoutuu hel-

: posti, kuten AFFI-GEL 10 (Bio-Rad Lab., USA). AFFI-GEL

10:n reaktio vasta-aineen kanssa suoritetaan puskuriliuo-sessa, kuten 0,001 - 1 M, mielellään 0,1 M, bikarbonaatissa. ; · Sopivat reaktio-olosuhteet ovat 0-20°C, 10 minuuttia - 24

’ tuntia ja vaihteleva pH, erityisesti 4°C, 4 tuntia ja pH

·...· 3-10. Kvantitatiivinen suhde AFFI-GEL 10:n ja vasta-ai- ’» 81832 neen välillä voi olla korkeintaan noin 50 mg vasta-ainetta per ml AFFI-GEL:ä, koska tällä alueella AFFI-GEL:iin liittyvä vasta-ainemäärä kasvaa samalla kun vasta-aineen määrä kasvaa. Liittymisen tehokkuuden kannalta katsottuna vasta-ainetta on syytä käyttää korkeintaan 30 mg mainitulla perusteella. Näin saatu vasta-aineen ja kantoaineen muodostama liittymistuote pestään hyvin samalla puskuriliok-sella, jota käytettiin reaktiossa, ja sitten sen annetaan seisoa useita vuorokausia tai se käsitellään etanoli-amiinihydrokloridilla 1 tunti 4°C:ssa lopullisen väkevyyden ollessa 0,05 M tai jollakin muulla menetelmällä niin, että jäljellejääneet aktiiviset ryhmät saadaan salvatuiksi, ja sen jälkeen tuotteella pakataan pylväs niin, että saadaan vasta-ainepylväs.

Näin saadussa vasta-ainepylväässä tapahtuvaa puhdistusta varten ihmisen imuuni-interferoniproteiinia sisältävä liuos, kuten solujen lysoinnissa saatu emäliuos, liuotetaan lähes neutraaliin puskuriin, kuten fosfaattipuskuriin tai Tris.hydrokloridipuskuriin, ja adsorboidaan vasta-: ainepylvääseen. Pylväs pestään samalla puskurilla ja sen '· jälkeen I-IF eluoidaan. Sopivia eluentteja ovat mmi-hei- ; kosti happamat liuokset (esim. etikkahappoliuos), poly- .· etyleeniglykolipitoinen liuos, sellainen liuos, jonka si- *: sältämän peptidin affiniteetti vasta-aineeseen on suurem- V: pi kuin puhdistettavan proteiinin, väkevä suolaliuos. Edul lisimpia ovat sellaiset eluentit, jotka eivät edesauta ihmisen I-IF:n hajoamista merkittävässä määrin.

Pylväästä saatu eluaatti neutraloidaan puskurilla tavanomaisella menetelmällä. Tarpeen vaatiessa voidaan edelläkuvatussa vasta-ainepylväässä tapahtuva puhdistus \ j toistaa.

Näin saatu ihmisen I-IF-proteiiniliuos dialysoidaan ja tarpeen vaatiessa tehdään jauhemaiseksi suorittamalla lyofilisointi. Lyof ilisoinnin yhteydessä voidaan lisätä stabilointiainetta, kuten sorbitolia, mannitolia,

II

" 81832 dekstroosia, maltoosia tai glyserolia.

Näin saadun ihmisen immuuni-interferoniproteiinin ominaisaktiivisuus on vähintään 10^ U/mg, kun mitataan viruksenvastainen aktiivisuus kokeella, jossa arvioidaan ihmisen amnionista johdettujen WISH-solujen degeneroitumisen inhiboituminen, kun niihin kohdistuu rakkulastomatiitti-viruksen (VSV) vaikutus.

IF-aktiivisuus U/ml (yksikköä/ml) määritettiin seu-raavalla tavalla. Kansainvälinen standardi-IF-cx. jonka yksikkö on vahvistettu ja leukosyyttiperäinen, epäpuhdas IF-γ mitattiin kokeessa, jossa arvioitiin ihmisen amnionista johdetun FL-solulinjän degeneroitumisen inhiboituminen, kun siihen kohdistuu VSV:n vaikutus, ja lymfo-syyttiperäisen IF-y:n tiitteri määritettiin vertaamalla saatuja tiittereitä ja saatua IF-Y:aa käytettiin labora-toriostandardi-IF-γ:na. Kun jonkun materiaalin IF-γ-tiitteri laskettiin, tätä laboratoriostandardi-IF-γ:aa käytettiin aina rinnakkaisesti edellämainitussa määrityksessä WlSH-VSV-systeemissä ja tiitterin laskeminen perustui tiitterisuhteeseen.

M* : Tämän keksinnön mukainen ihmisen immuuni-interferoni- proteiini sisältää mielellään polypeptidin, jolla on kaavan !.· · (V) mukainen aminohapposekvenssi ; (N)H-Y-Z^ Tyr Gin Asp Pro Tyr Vai Lys Glu

Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Fhe Asn Ala Gly His

Ser Asp Vai Ala Asp Asn Gly Thr Leu Fhe Leu Gly

Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys

Ile Met Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys

Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin

Lys Ser Vai Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Vai

Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp

Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Vai Thr Asp Leu

Asn Vai Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin 12 81 832

Vai Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln-OH(C) (V) jossa Y on met tai kemiallinen sidos ja ja voivat kukin olla Cys tai 1/2 Cys. Tämän keksinnön mukainen I-IF-proteiini sisältää mainitun polypeptidin vähintään 90-prosenttisen puhtaana, erityisesti vähintään 95-pro-senttisen puhtaana, kuiva-aineen perusteella laskettuna.

Tämän keksinnön mukaisesti tuotetulla ihmisen immuuni-interferonilla on seuraavat ominaisuudet: 1) Sen molekyylipaino on 17 000 - 1000 SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla (17,5 %) määritettynä; 2) Se sisältää kysteiinin tai puolikysteiinin tai metio-niinin aminopään aminohappona; 3) Se liittyy yhteen sellaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka kohdistuu H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH:ta vastaan.

Tämän keksinnön mukaisesti saatua ihmisen interfe-roniproteiinia voidaan käyttää samoihin tarkoituksiin ja ; samalla tavalla kuin tavanomaisilla menetelmillä saatuja .'· I-IF-lajeja. Koska se sisältää pienemmän määrän proteii- niepäpuhtauksia ja pyrogeeniä, sitä voidaan käyttää ai-·'; kaisempaa turvallisemmin esim. ruiskeissa.

.*. Tämän keksinnön mukaisella I-IF-proteiinilla on ·.·. virustenvastaisia, kasvaintenvastaisia, solujen lisäänty mistä inhiboivia ja immuunisuutta vahvistavia ominaisuuksia. Tämän keksinnön mukaista ihmisen I-IF-pro-teiinia voidaan käyttää sellaisenaan tai steriloituun veteen, ihmisen seerumialbumiiniin (HSA), fysiologiseen suolaliuokseen ja/tai muihin ennestään tunnettuihin fy-•· siologisesti hyväksyttäviin kanto-aineisiin tai laimen- timiin sekoitettuna niin, että saadaan mainittua ihmisen immuuni-interferonia sisältävä farmaseuttinen seos, joka voidaan antaa parenteraalisesti tai oraalisesti. Se ' ’ voidaan antaa esim. intravenoosisesti tai intramuskulaa- risesti tai jotakin muuta kautta annoksena, jonka suuruus li 13 81832 aikuiselle vuorokaudessa annettuna on 100 000-1 000 000 000 yksikköä, mielellään 50 000 000-60 000 000 yksikköä.

Tämän keksinnön mukaista ihmisen I-IF-proteiinia sisältävät farmaseuttiset valmisteet voivat myös sisältää muita fysiologisesti hyväksyttäviä aineosia, kuten suolaa, laimenninta, apuainetta, muuta kantoainetta, puskuria, sideainetta, pinta-aktiivista ainetta ja säilöntäainetta. Parenteraalista antoa varten valmisteet ovat ampulleissa steriloituun vesiliuokseen tai fysiologisesti hyväksyttävään liuokseen tehtyinä suspensioina tai steriileinä jauheina (jotka yleensä saadaan lyofisi-soimalla I-IF-liuos),jotka laimennetaan ennen käyttöä.

Edellämainitut ihmisen immuuni-interferonia sisältävät valmisteet voivat lisäksi sisältää muita vaikuttavia aineita, kuten IF-a:aa tai IF-B:aa tai lymfoniikiä (esim. interleukiini 2) määränä, joka on 1-99 % tämän keksinnön mukaisen aineen perusteella laskettuna.

Piirrokset

Kuva 1 esittää esimerkissä 1 (vii) saadun plasmidin : pHIT3709 restriktioentsyymikarttaa, jossa W//////////IIi/fiIk ,·. ; tarkoittaa oletettua signaalipeptidiä koodittavaa aluet- ta ja l\\\\W\ItarVni I-IF-polypeptidiä kooditta- ;.'V vaa aluetta. Kuva 2 esittää esimerkissä 1 (vii) saadun ; plasmidin pHIT3709 liitännäisen primäärirakennetta (emäs- järjestystä) , kuva 3 on ptrp701:n ja ptrp771:n rakennus-kaavio, joita plasmideja on selostettu esimerkissä 2 (i) ja (ii) vastaavasti, kuva 4 on esimerkissä 2 (iii) kuvatun pHITtrpI101:n rakennuskaavio ja kuva 5 on esimerkissä 2 (iv) kuvatun pHITtrp2101:n rakennuskaavio, kuva 6 esittää esimerkin 6 {i) elektroforeesituloksia ja kuva 7 esittää esimerkin 6 (i) molekyylipainonmääritystuloksia.

• · Tätä keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seu- raavien esimerkkien avulla.

Seuraavissa vertailuesimerkeissä selostettu hiiren *·*· B hybridoma γ 2 -1.1.1 on taltioitu Pasteur-instituutin ··. C.N.C.M.-kokoelmiin Ranskaan, joissa sille on annettu 14 81 832 kokoelmanumero 1-242.

Esimerkki 1 (i) Ihmisen immuuni-interferonia koodattavan mRNArn eristäminen

Lymfosyyttejä, jotka oli valmistettu ihmisen perifeerisestä verestä, inkuboitiin 37°C:ssa RPMI-1640-alustassa (joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia), joka sisälsi 15 ng/ml 12-0-tetradekanoyyliforboli-13-asetaattia (TPA) ja 40 yg/ml konkanavaliini A:ta I-IF:n indusoimiseksi. 24 tunnin kuluttua näin indusoidut ih misen lymfosyytit (1 x 10**° solua) rikottiin Teflon-homogenoi jassa tioguanidiiniliuoksessa (5M guanidiinitio-syanaattia, 5% merkaptoetanolia, 50 mM Tris.HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA). Sitten lisättiin natrium-N-lauroyylisarko-sinaattia väkevyyteen 4% ja homogenoinnin jälkeen seos kerrostettiin 6 ml :11a 5,7 M keesiumkloridia (5,7 M keesiumkloridi, 0,1 M etyleenidiamiinitetra-asetaatti (EDTA)) ja sentrifugoitiin 15°C:ssa nopeudella 24 000 : 1/min 30 tuntia käyttämällä Beckman SW27-roottoria, jol- : loin saatiin RNA-sakka. Tämä RNA-sakka liuotettiin 0,25- prosenttiseen natrium-N-lauroyylisarkosinaattiin ja sen - · jälkeen seostettiin etanolilla, jolloin saatiin 8,3 mg .I RNA:ta. Tämän RNA:n annettiin väkevässä suolaliuok- . sessa (0,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS) absorboitua oligo(dT)selluloosapylvääseen ja poly(A):n sisältävä mRNA eluoitiin laimealla suolaliuoksella (10 mM Tris.HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,3% SDS), jolloin saatiin 700 yg mRNArta. Tämä mRNA saostettiin vielä etanolilla ja liuotettiin sen jälkeen 0,2 ml:aan liuosta, jossa oli 10 mM Tris.HCL, pH 7,6, 2 mM EDTA ja 0,3 % SDS, pidettiin 2 minuuttia 65°C:ssa ja fraktioitiin 10-35-prosenttisessa sakkaroositiheysgradientissa 20°C:ssa ;·* nopeudella 25 000 1/min 21 tuntia käyttämällä Beckman SW27- roottoria, jolloin saatiin 22 jaetta. Jokaisesta jakees- ϋ is 81832 ta injektoitiin näyte Xenopus laevis-sammakon varhais-munasoluihin ja syntetisoituneet proteiinit mitattiin interferoniaktiivisuuden suhteen (virustenvastainen vaikutus määritettiin sytopaattisen vaikutuksen esty-mismittauksena käyttämällä rakkulastomatiittivirusta, joka kohdistui ihmisen amnionista johdettuihin WISH-soluihin (Stewart, W.E., The Interferon System, Springer New York, 1979, s. 11)). Tällä tavalla voitiin havaita, että jakeella 12 (sedimentoitumivakio 12-14S) oli aktiivisuus 195 yksikköä per yg RNArta. Näin saadun jakeen 12 sisältämä mRNA painoi noin 20 Mg.

(ii) Yksisäikeisen DNA:n synteesi Käyttämällä ecalläsaatua mRNA:ta ja käänteiskopioija-entsyymiä 100 μΐ reaktioseosta (5 yg mRNA, 50 Mg oligo(dT), 100 yksikköä käänteikopioijaentsyymiä, dATP, dCTP, dGTP ja dTTP 1 mM kutakin, 8 mM MgCl2, 50 mM KC1, 10 mM di-tiotreitolia ja 50 mM Tris.HCl, pH 8,3) inkuboitiin 1 tunti 42°C:ssa ja sen jälkeen proteiini poistettiin lisää-: mällä fenolia ja käsiteltiin 0,1N natriumhydroksidilla 70°C:ssa 20 minuuttia, jotta RNA saatiin poistetuksi ha-. ‘ . jottamalla.

(iii) Kaksisäikeisen DNA:n synteesi Näin syntetisoitu yksisäikeinen komplementaarinen DNA saatettiin reagoimaan 50 Ml:ssa reaktioseosta (sama kuin edellä, mutta mRNA:ta ja oligo-dTrtä ei ollut läsnä) 2 tuntia 42°C:ssa, jolloin saatiin syntetisoiduksi kaksi-säikeinen DNA.

*. (iv) dC-häntien lisääminen : ; Kaksisäikeistä DNA:ta käsiteltiin S1-nukleaasilla 50 yl:ssa reaktioseosta (kaksisäikeinen DNA, 0,1M natrium-asetaatti, pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1,5 mM ZnSO^, 60 yksikköä ;*_ S1-nukelaasia) huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Reaktio-

-* : seoksesta poistettiin proteiini lisäämällä fenolia ja DNA

**: saostettiin etanolilla. Näin saatu DNA saatettiin reagoi- 16 81 832 maan terminaalisen transferaasin kanssa 50 ul:ssa reak-tioseosta (kaksisäikeinen DNA, 0,14 M kaliumkakodylaat-ti, 0,3 M tirs (emäs) (pH 7,6), 2 mM ditiotreitoli, 1 mM CoC^, 0,15 mM dCTP, 30 yksikköä terminaalista transfe-raasia) 3 minuuttia 37°C:ssa niin, että kaksisäikeinen DNA Piteni noin 20 deoksisytidiiniyksiköllä (noin 20) kustakin DNA:n 3'-päästä. Tällä rea'<tiosarjalla saatiin noin 300 ng deoksisytidiinihäntäistä, kaksisäikeistä DNA:ta.

(v) Escherichia coli-plasmidin katkaisu ja dG-häntien lisääminen

Erikseen käsiteltiin 10 yg Escherichia colin plasmi-din pBR322 DNA:ta restriktioentsyymillä PstI 50 yl:ssa reaktioseosta (10 yg DNA, 50 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,4), 6 mM MgCl2, 6 mM 2-merkaptoetanolia, 100 yg/mg naudan seerumialbumiinia, 20 yksikköä PstI) 3 tuntia 37 °C:ssa, jotta saatiin katkaistuksi plasmidin pBR322 DNA:n yksi PstI:n tunnistama kohta, sitten reaktioseoksesta poistettiin proteiini fenolilla ja DNA:lie suoritettiin vielä käsittely terminaalisella transferaasilla 50 yl:ssa ; reaktioseosta (10 yg DNA, 0,14 M kaliumkakodylaattia, 0,3 M Tris (emäsfpH 7,6, 2 mM ditiotreitolia, 1 mM CoC^/ : : 0,15 mM dGTP, 30 yksikköä terminaalista transferaasia) 3 minuuttia 37°C:ssa, jotta edellämainittu plasmidin ·.·. pBR322 DNA saatiin pidennetyksi noin 8 deoksiguanidiini- ·.·. yksiköllä kustakin 3 1 -päästään.

(vi) cDNA:n liittäminen ja Escherichia colin transfor-mointi

Liittäminen suoritettiin kuumentamalla 0,1 yg näin ··· saatua synteettistä, kaksisäikeistä DNA:ta ja 0,5 yg edelläsaatua plasmidia pBR322 liuoksessa, jossa oli 0,1 \ ; M NaCl, 50 mM Tris HC1 pH 7,6.ja 1 mM EDTA, 65°C:Ssa 2 minuuttia ja sen jälkeen 2 tuntia 45°C:ssa, ja sen jälkeen jäähdytettiin hitaasti. Escherichia coli χ1776:η transformointi suoritettiin Enea et al:n menetelmällä

II

17 81832 IJ. Mol. Biol., 96, 495 (1975)).

(vii) cDNA-pitoisen plasmidin eristäminen Näin eristettiin noin 8 500 tetrasykliinin suhteen vastustuskykyistä pesäkettä ja kunkin pesäkkeen DNA kiinnitettiin nitroselluloosasuotimeen (M. Grunstein and D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72.· 39i>1 (1975)).

Erikseen syntetisoitiin kemiallisesti triesterime-netelmällä (R. Crea et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 5765 (1978)) IF-y:n aminohapposekvenssiin perustuen, kuten D.V* Goeddel et ai. ovat raportoineet (Nature, 295, 503 (1982)), kaksi oligonukleotidia eli 5'TCCTGGCAGTAGC31 ja 51ACATTCATATCCTCCT3', jotka oletettavasti vastaavat aminohappoja no:t 1-5 (Cys Try Cys Gin Asp) ja aminohappoja no:t 77-82 (Lys Gin Asp Met Asn Vai) mainitussa I-IF-sek-venssissä vastaavasti. Nämä oligonukletotidit käsiteltiin T4-polynukleotidikinaasilla 50 yl:ssa reaktioseosta (0,2 yg oligonukleotidia, 50 mM Tris HC1 pH 8,0, 10 mM MgCl-, 32 Δ 10 mM merkaptoetanolia, 50 y Ciy- P ATP, 3 yksikköä T4- polynukleotidikinaasia) 1 tunti 37°C:ssa. Näitä oligo- 32 nukleotideja, jotka oli näin merkitty P:llä 5’-päästään, : käytettiin koettimina ja liitettiin edellämainituissa ·. *: nitroselluloosasuotimissa olevaan DNA:han menetelmällä :.· · Lawn et ai. (Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981)). Auto- radiografian avulla eristettiin neljä kantaa, jotka oli-vat reagoineet edellämainittujen kahden oligonukleotidi-’.· koettimen kanssa.

Kustakin näistä kannoista eristettiin plasmidi-DNA alkalimenetelmällä (H.C. Birnboim and J. Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979)). Näiden plasmidien sisältämät liitännäiset leikattiin irti Pstl-restriktioentsyy-millä. Eristetyistä plasmideista valittiin se, joka si-' sälsi pisimmäin liitännäisen, ja sille annettiin nimi "pHIT3709".

Plasmidiin pHIT3709 liitetyn cDNA-sekvenssin rakenne (emässekvenssi) määritettiin sen jälkeen dinukleotidi- 18 81 832 synteettisellä terminaatiomenetelmällä ja Maxam-Gilbert-menetelmällä. Mainittu primäärirakenne on esitetty kuvassa 2 (viitataan hakemukseen no. 830 984).

pHIT3790:n IF-y:aa koodattavan alueen emäsjärjestys (kodonit no. S1 - 146) oli identtinen sen kanssa, mikä on esitetty julkaisun Nucleic Acids Res., J[0, 2487 et seq. (1982) kuvassa 3.

Esimerkki 2 (1) Plasmidista ptrp601 (vektori oli pBR322), joka sisälsi Escherichia colissa tapahtuvaa synteesiä varten tarvittavan tryptofaanin synteesin promoottorin (promoottorin ja operonin sisältävä palanen, 276 emäsparia, G.N. Bennett et ai., J.Mol.Biol., 121, 113 (1978)) rakennettiin ilmen-tämisplasmidi.

Erikseen katkaistiin plasmidi pBR322 restriktioent- syymeillä EcoRI ja Aval. Näin saadun EcoRI-Aval-pala- sen, joka sisälsi tetrasykliinin suhteen vastustuskyvyn antavan geenin, lomittaiset päät täytettiin käyttämällä DNA-polymeraasin I suurta palasta. Näin saatu, irti lei- “ ! kattu palanen liitettiin ptrp601:n PvuII-kohtaan T4 DNA- ' ligaasia käyttämällä. Näin saatiin rakennetuksi ptrp701 ;· · (kuva 3) .

• » . ! (ii) Jotta saataisiin poistetuksi jompi kumpi ptrp701:ssä . olevista kahdesta restriktioentsyymin Clal katkaisukohdas- ·’·* ta, suoritettiin ptrp701:lle osittainen hajotuskäsittely

Clal:llä, jolloin saatiin aikaan ptrp701, jonka jompi kumpi Clal-katkaisukohta oli tullut leikatuksi. Kun lomittaiset päät oli täytetty DNA-polymeraasi I:n suurta palasta : apuna käyttäen, yhdistettiin näin saatu ptrp701 jälleen renkaaksi T4 DNA-ligaasin avulla ja saatiin ptrp771 (kuva 3) .

(iii) pHIT3709 katkaistiin restriktioentsyymillä PstI, ; · jolloin saatiin sellainen Pstl-palanen, joka sisälsi IF-yjn rakennegeenin. Tämä palanen hajotettiin vielä osittain

II

is 81832

restriktioentsyymillä BstNI, jolloin saatiin BstNI-Pstl-palanen, jossa katkaisu oli tapahtunut IF-y:n rakenne-geenissä sijaitsevassa BstNI-kohdassa. BstNI-katkaisu-kohdan lomittaiset päät täytettiin DNA-polymeraasi I:n suuren palasen avulla. Näin saatu palanen ja oligonukleoti-diadapteri CGATAATGTGTTAC TGCC

TATTACACAATGACGG

joka oli syntetisoitu kemiallisesti edellämainitulla tri-esterimenetelmällä ja sisältää proteiinisynteesin aloi-tuskodonin ATG, liitettiin yhteen T4 DNA-ligaasia apuna käyttäen.

T4 DNA-ligaasia apuna käyttäen liitettiin edellämainitun adapterin sisältävä IF-y-geeni tryptofaanipro-moterin alapuolelle plasmidivektorin ptrp771 Pstl-Clal-kohtaan. Näin saatiin IF-y:n ilmentämisplasmidi pHITtrp1101 (kuva 4).

(iv) pHITtrp2101 rakennettiin seuraavalla tavalla, jotta pHITtrp1101 saatiin paremmaksi: ptrp601 käsiteltiin ensin restriktioentsyymeillä Clal ja Hpall, jolloin saatiin 0,33 kb:n Clal-Hpall-palanen, : joka sisälsi trp-promoottorin. Tämä palanen liitettiin .*·* pHITtrp! 101 :een, joka oli leikattu Clal:llä ja käsitel- : : ty emäsfosfataasilla, käyttämällä liittämisessä apuna T4 "·*: DNA-ligaasia. Näin saatiin pHITtrp2101, joka sisälsi ·'. kaksi peräkkäistä trp-promoottoria (kuva 5) .

Kun Escherichia coli 294 transformoitiin plasmidilla pHIT.trp2101 käyttämällä Cohen et ai:n menetelmää (ks. edellä), saatiin E. coli-kanta 294/pHIT.trp2101

Esimerkki 3 ;* E. coli 294/pHITtrp2101-kantaa inkuboitiin 1 litran . . kolvissa 37°C:ssa 200 ml:ssa M9-alustaa, jossa oli 8 yg/ml tetrasykliiniä, 0,4 % kasaminohappoa ja 1% glukoosia. Kun bakteerin kasvu saavutti arvon KU220, lisättiin 36-indo-lyyliakryylihappoa (IAA) väkevyyteen 30 yg/ml ja seosta inkuboitiin vielä 4 tuntia.

20 81832

Esimerkki 4

Kerättiin yhteen 1,2 litraa esimerkin 3 mukaisesti saatua kasvustoa, sentrifugoitiin, solut otettiin talteen ja suspendoitiin 60 ml:aan 0,05 M Tris HC1 (pH 7,6), jossa oli 10% sakkaroosia. Tähän solususpensioon lisättiin 0,3 ml 0,2 M fenyylimetyylisulfonyylikloridia (PMSF), 24 ml 5M NaCl-liuosta, 2,4 ml 0,2 M etyleenidaimiini-tetra-asetaattia (EDTA), 2,4 ml 1 M spermidiiniä ja 2,4 ml lysotsyymiä (5 mg/ml). Saadun seoksen annettiin seisoa 0°C:ssa 1 tunti, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa ja hajotettiin vielä käsittelemällä 30 sekuntia 0°C:ssa ultraäänidisintegraattorilla ARTEK (USA).

Tätä lysaattiliuosta sentrifugoitiin 1 tunti nopeudella 105 000 x g ja otettiin talteen 66 ml emäliuosta.

Esimerkki 5 60 ml esimerkissä 4 saatua emäliuosta laimennettiin 150 ml:ksi käyttämällä liuosta, jossa oli 20 mM Tris HC1, 1 mM EDTA ja 0,15 M NaCl (pH 7,6) (TEN), ja saatu laimennettu liuos johdettiin IF-y.n vasta-ainetta sisältävään pylvääseen (9 mID valmistettu vertailuesimerkissä 10 ; kuvatulla menetelmällä. Pylväs pestiin hyvin TEN-liuok sella ; ja vielä TENrllä, jossa oli 0,01% Nonidet P-40 (Shell) ja 0,5M NaCl.

: Sitten IF-γ eluoitiin 0,1M etikkahapolla, jossa : oli 0,25 M NaCl. Saatu eluaatti neutraloitiin välit- tömästi 1M Tris HCl-liuoksella (pH 7,6). Saatua liuosta dialysoitiin tislattua vettä vastaan 16 tuntia 4°C:ssa, jäädytettiin asetoni-hiilihappojääseoksella ja lyofi-lisoitiin, jolloin saatiin jauhe.

Saadut tulokset on esitetty seuraavassa.

• · • · li 21 81832 proteiinia kokonais- ominais- saanto aktiivi- aktiivisuus suus (mg) (U) (U/mg) (%) ϊϊαοϊ“η emS" 250'8 4x1 °8 1.6X106 vasta-aine- _ pylväskäsit- 2,0 1,5x10° 7,5x10/ 37,5 telyn jälkeen Näin saadun lopullisen ihmisen immuuni-interferoni-tuotteen ominaisaktiivisuus (perustuu virusaktiivisuus-määritykseen suorittamalla sytopaattisen vaikutuksen estymisen mittaus käyttämällä VSV:tä ja WISH-soluja 7 (selostettu edellä)) oli 7,5 x 10 U/mg. Tämän proteiinin ominaisuudet on selostettu seuraavassa.

Esimerkki 6

Ihmisen immuuni-interferonin ominaisuuksien määrittäminen .

(1) Molekyylipaino

Esimerkissä 5 saatu proteiini käsiteltiin 2-merkapto-. . etanolilla, suoritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektro- :: : foreesi (17,5%) (15 mV, 6 tuntia) ja värjättiin coomassie- ’ sinisellä. Proteiini voitiin identifioida yhtenä ainoana : kaistana (kuva 6) . Molekyylipainomerkkiaineille suori- : V tettiin elektroforeesi samanaikaisesti ja vertaamalla näi- * : den liikkumisetäisyyttä määritettävän proteiinin liikkumis- Y; etäisyyteen, voitiin arvioida mokekyylipainoksi 17 000 - 1 000 (kuva 7). Proteiinille, jota ei oltu käsitelty 2-merkaptoetanolilla, havaittiin lisäkaista, jonka asema vastasi molekyylipainoa 33 000 - 2 000. Tämä arvo on noin kaksi kertaa niin suuri kuin IF-y:n molekyylipaino, Y joka on 17 000 - 1000, josta päätellen kaista johtuu di- "Y meroituneesta IF-y:sta.

(ii) Aminohappoanalyysi

Erä esimerkissä 5 saatua proteiinia sijoitettiin la-Y; siputkeen hydrolyysiä varten ja lisättiin 200-kertainen mää- ***. rä (tilavuus/paino) vakioarvossa kiehuvaa suolahappoa, jossa 22 81 832 oli 4% tioglykolihappoa. Putki suljettiin tiiviisti alipaineessa ja hydrolysoitiin 110°C:ssa 24, 48 ja 72 tuntia. Jokaisen hydrolyysin jälkeen putki avattiin, suola happo poistettiin alipaineessa ja jäännös liuotettiin 0,02 N suolahappoon ja analysoitiin nopealla aminohappo-analysaattorilla (Hitachi Model 835).

Kystiinin ja kysteiinin määrittämistä varten proteiini hapetettiin permuurahaishapolla menetelmällä Hirs et ai. (Methods in Enzymology, 1_1_, 1 97 , (1 967)) ja hydrolysoitiin samoin kuin edellä 24 tuntia ja kysteiinihappo määritettiin kvantitatiivisesti aminohappoanalysaattoria käyttämällä. 24, 48 ja 72 tunnin hydrolyysin jälkeen saatujen kolmen arvon keskiarvoa käytettiin kunkin aminohapon arvona lukuunottamatta seriiniä, treoniinia, tyrosii-nia ja tryptofaania, joiden arvot arvioitiin ekstrapoloimalla hydrolyysi 0 tuntiin. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2 Löydetty aminohappo (mooli-%) Löydetty aminohappo (mooli-%) asparagiinihappo 13,4 metioniini 2,9 ; treoniini 3,6 isoleusiini 4,8 seriini 7,4 leusiini 6,8 glutamiinihappo 12,5 tyrosiini 3,4 ; proliini 1,4 fenyylialaniini 6,7 glysiini 3,8 lysiini 13,5 .·.* alaniini 5,3 histidiini 1,5 kysteiinihappo 1,3 arginiini 5,4 väliini 5,7 tryptofaani 0,9 (iii) Aminopään aminohappoanalyysi

Esimerkissä 3 saatu proteiini hapetettiin perrouura-haishapolla menetelmällä Hirs et ai. (Methods in Enzymology, JH, 197 (1967)) ja sen jälkeen suoritettiin amino-pään aminohappoanalyysi muunnetulla Edmanin hajotusmene-: telmällä, jota Iwanaga et ai. (Eur.J.Biochem.,8, 189 (1969)) » · ·

II

23 81 832 ovat selostaneet. Näin syntyneet fenyylitiohydantoiini-aminohapot (PTH-aminohapot) identifioitiin ja määritettiin kvantitatiivisesti Varian (USA) Model 5040-korkeapainenestekromatografilia käyttämällä Ultrasphere-ODS-pylvästä (Altex, USA, 4,6 x 250 mm, hiukkaskoko 5 ym menetelmällä Archer et ai., Altex Chromatogram, 3, 8 , (1980)). Näin havaittiin PTH-metioniinisulfoni ja PTH-kysteiinihappo.

Kuten edelläolevista esimerkeistä ilmenee, voidaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistaa käytännöllisesti katsoen puhtaita ihmisen immuuni-interfe-roniproteiineja, joiden ominaisaktiivisuus on vähintään 7,5 x 107 U/mg.

Esimerkki 7 Injektiovalmiste 5 mg tämän keksinnön mukaisesti valmistettua ihmisen I-IF-proteiinia (ominaisaktiivisuus 2 x 107 U/mg) liuotetaan 100 ml:aan 5% HSA:ta. Liuos suodatetaan käyttämällä kalvosuodinta (huokoskoko 0,2 ym) ja jaetaan 100 lää-. . kepulloon aseptisissa olosuhteissa. Lääkepulloissa oleva ; liuos lyofilisoidaan aseptisesti, jotta saadaan injektio- / : valmisteita paikan päällä käytettäviksi.

Valmiste liuotetaan 1 mlraan tislattua vettä ennen .· käyttöä.

Seuraavissa vertailuesimerkeissä suoritettiin ohut- kerroskromatografiset analyysit Merck 60F2^^-silikageeli- levyillä tai Funakoshi Yakuhin’in AVICEL SF-selluloosale- vyillä käyttämällä seuraavia kehitysliuoksia:

Rf1: kloroformi-metanoli-etikkahappo = 9:1:0,5 2

Rf : etyyliasetaatti-pyridiini-etikkahappo-vesi= \ 30:10:3:5 3

Rf : kloroformi-metanoli-vesi= 7:3:0,5 4

Rf : n-butanoli-pyridiini-etikkahappo-vesi = 30:20:6:24 .

• ‘ ‘ 5

Rf : etyyliasetaatti-n-butanoli-etikkahappo-vesi=1:1:1:1 24 81 832

Vertailuesimerkki 1 (i) Z-Ser-Gln-OBu^:n valmistus Z-Gln-OBut (10,1 g) liuotettiin 500 ml:aan metanolia ja katalyyttinen pelkistys suoritettiin vetykaasivirras-sa käyttämällä palladiummustaa katalyyttinä. Katalyytti suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Saatu jäännös ja 7,5 g Z-Ser-OH ja 6,8 g HONB liuotettiin 250 ml:aan DMF ja saatu liuos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCC:tä (7,15 g) ja seosta sekoitettiin jääjäähdytyksessä 4 tuntia 0°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Jäännös uutettiin 300 ml :11a AcOEt ja uute pestiin natriumvetykar-bonaatin 4% vesiliuoksella, 0,2 N suolahapolla ja vedellä tässä järjestyksessä ja kuivattiin vedettömällä natriumsul-faatilla. Sitten liuotin haihdutettiin pois ja saatu kiteinen sakka suodatettiin talteen ja uudelleenkiteytettiin CH3CN:stä. Saanto 6,5 g (51,2%), sp. 97-100°C, (a )p5-24,1° (c=0,40, metanoli) Rf1 0,64.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: ^20^29^7^31 ; Laskettu: 56.72; H, 6.90; N, 9.92 .·. : Saatu: c, 56.21; H, 6.72; N, 9.76 !.I (ii) Z-Ala-Ser-Gln-OBu*": n valmistaminen Z-Ser-Gln-OBut (4,23 g) liuotettiin 300 ml:aan metanolia ja katalyyttinen pelksitys suoritettiin vetykaasu-virrassa käyttämällä palladiummustaa katalyyttinä. Katalyytti suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Jäännös sekä 2,34 g Z-Ala-OH ja 2,27 g HONB liuotettiin sekaliuot-'···* timeen, jossa oli 200 ml AcOEt, 200 ml dioksaania ja 100 .* ‘ ml DMF, ja saatu liuos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCC:tä (2,38 g) ja seosta sekoitettiin jäähdytettyni 4 tuntia 0°C:ssa ja 12 tuntia huoneenlämpötilassa. DCU * · suodatettiin pöis ja liuotin haihdutettiin. Jäännökseen

II

25 81 832 lisättiin CH^CN:a ja eetteriä ja saatu kiteinen sakka suodatettiin talteen, kuivattiin ja uudelleenkiteytettiin CH3CN:stä.

Saanto 3,72 g (75,3%), sp. 165-170°C, (ct)^5-41,2°

1 U

(c = 0,50, metanoli) Rf 0,60.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste; ^23^34^8^4:

Laskettu: C, 35.06; H, 6.93; N, 11.33 Saatu: C, 55.58; H, 6.74; N, 11.12 (iii) Z-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut:n valmistus Z-Ala-Ser-Gln-OBu^ (3,46 g) liuotettiin 300 ml:aan metanolia ja katalyyttinen pelkistys suoritettiin vety-kaasuvirrassa käyttämällä katalyyttinä palladiummustaa. Katalyytti suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Jäännös ja Z-Arg(pme)-OH (valmistettu 4,54 g:sta Z-Arg(Pme)-OH.CHA) ja 1,9 g HOBt liuotettiin 150 ml:aan DMF:a ja liuos . . jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCC:tä (1,9 g) ja seosta ; sekoitettiin 4 tuntia o°C:ssa ja 15 tuntia huoneenlämpö- '* "· tilassa. DCU suodatettiin pois ja liuotin tislattiin.

·" * AcOEt:tä lisättiin jäännökseen ja saatu sakka suodatettiin : *.· talteen, kuivattiin ja saostettiin uudestaan metanolilla ;*V ja AcOEt: llä. Saanto 4,55 g (75,5 %) , sp. 130-1 34°C, ; : (α )^5-24,1° (c = 0,26, metanoli) Rf1 0,57.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: ^40%0®11^8®*^H20:

Laskettu: C, 55.22; H, 7.07; N, 12.88; S, 3.69 ·"; Saatu: C, 55.23; H, 6.93; N, 12.54; S, 3.48 (iv) Z-Arg (Pme) -Arg (Pme) -Ala-Ser-Gln-OBu*" :n valmistus ·*· Z-Arg (Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut (4,3 g) liuotettiin 400 ·' * ml:aan metanolia ja katalyyttinen pelkistys suoritettiin 26 81 832 vetykaasuvirrassa käyttämällä katalyyttina palladium-mustaa. Katalyytti suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Jäännös sekä Z-Arg(Pme)-OH (valmistettu 3,24 g:sta Z-Arg(Pme)-OH.CHA) ja 1,42 g HOBt liuotettiin 200 mitään DMFta ja saatu liuos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCCttä (1,41 g) ja saatua seosta sekoitettiin 4 tuntia 0°C:ssa ja 20 tuntia huoneenlämpötilassa. DCU suodatettiin pois ja liuotin tislattiin. Jäännökseen lisättiin AcOEt-.tä ja saatu sakka suodatettiin talteen, kuivattiin ja saostettiin uudestaan metanolista ja AcOEt:stä.

Saanto: 4,4 g (71,7%), sp. 125-1 30°C, (a ) 35 -18,0° (c = 1 υ 0,40, metanoli) Rf 0,63.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: ^57^86^14^12^2*^2^

Laskettu: C, 5^.96; H, 7.12; N, 13.50; S, 5.15 Saatu: C, 5^.66; H, 6.92; N, 13.32; S, 5.34 (v) Z-Arg(Pme)-Gly-OBut:n valmistus Z-Gly-OBu*· (13,0 g) liuotettiin 500 ml:aan metanolia ja katalyyttinen pelkistys suoritettiin vetykaasivirrassa j : : käyttämällä katalyyttinä palladiummustaa. Katalyytti suo- datettiin pois ja suodos väkevöitiin alipaineessa. Jään-| nös liuotettiin 200 ml:aan DMF:ää ja Z-Arg (Pme)-OH (val- :·.·. mistettu 20,0 g:sta Z-Arg (Pme)-OH .CHA) ja 5,4 g HOBt lisättiin ja sen jälkeen jäähdytettiin jään avulla. Li-I sättiin DCC:tä (8,2 g) ja saatua seosta sekoitettiin 48 ' ‘ tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos vä kevöitiin. Jäännös liuotettiin 500 ml:aan AcOEt:tä ja AcOEt-liuos pestiin natriumvetykarbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon 10% vesiliuoksella, kuivattiin natrium-... sulfaatilla ja väkevöitiin. Lisättiin petrolieetteriä : : ja sakka suodatettiin talteen. Saanto 19,8 g (96,8%), sp. 71-73°C (a)33 +0,2° (c = 0,9, DMF) , Rf1 0,62. Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: C^H^O^S: li 27 81 832

Laskettu: C, 58.93; H, 7.18; N, 11.09; S, 5.08

Saatu: C, 59.42; H, 7.58; N, 10.95; S, 4.84 (vi) Z-Phe-Arg (Pme)-Gly-OBu*" :n valmistus Z-Arg (Pme)-Gly-OBu*· (10,0 g) liuotettiin 500 ml: aan metanolia ja suoritettiin katalyyttinen pelkistys. Sitten tuote liuotettiin 300 ml:aan DMF:ää. Lisättiin Z-Phe-OH (4,72 g) ja 2,35 g HOBt:tä ja saatu seos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCC:tä (3,59 g) ja koko seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin. Jäännös liuotettiin 400 ml:aan AcOEt:tä ja AcOEt-liuos pestiin natriumvety-karbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon 10 % vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja saatu kiteinen sakka suodatettiin talteen ja uudelleenkiteytettiin metanoli-eetteri-seoksesta. Saanto 10,5 g (85,3%), sp. 101-103°C (a)^ -8,3° (c = 0,9, DMF) Rf1 0,64.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: C^qH^OqI^S:

Laskettu: c, 61.67; H, 6.99; N, 10.79; S, 4.12 Saatu: C, 61.66; H, 6.56; N, 10.93; S, 4.14 .·. : (vii) Z-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBut:n valmistus : Z-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBut (5,5 g) pelkistettiin kata- lyyttisesti 300 ml:ssa metanolia ja liuotettiin sen jäl-keen 300 ml:aan DMF:ää. Z-Leu-OH (valmistettu 3,31 ·.·. g:sta Z-Leu-OH .DCHA) ja 1,47 g HONB:tä lisättiin ja seos jäähdytettiin jäällä. DCC (1,68 g) lisättiin ja saatua seosta sekoitettiin 48 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin. Jäännös liuotettiin 300 ml:aan AcOEt:tä ja AcOEt-liuos pestiin natriumvety-·· karbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon 10 % vesi- .* - liuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin.

• ·

Lisättiin eetteriä ja sakka suodatettiin talteen. Saanto 6,2 g (98,3 %), sp. 171-173°C, (a )-15,5° (c=0,9, DMF), '!*· Rf1 0,64.

* 28 81 832

Alkuaineanalyysi :

Yhdiste: :

Laskettu: C, 61.93; H, 7.34; N, 10.99; S> J.39 Saatu: C, 62.02; H, 7.37; N, 11.08; S, 3.39 (viii) Boc-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OBut:n valmistus Z-Leu-Phe-Arg (Pme)-Gly-OBu*" (6,0 g) pelkistettiin katalyyttisesti 200 ml:ssa metanolia ja liuotettiin sen jälkeen 150 ml:aan DMF:ää. Boc-Met-OH (valmistetu 3,0 g:sta Boc-Met-OH.DCHA) ja 1,39 g HONB:tä lisättiin ja seos jäähdytettiin jäällä. DCC (1,59 g) lisättiin ja saatua seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin. Jäännös liuotettiin n-BuOH-AcOEt-seokseen ja liuos pestiin sitruunahapon 10% vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja kiteet otettiin talteen suodattamalla. Saanto 6,2 g (93,1 %) , sp. 192-195°C, ( a)^ -19,7° (c = 1,0, DMF), Rf1 0,64.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: ^48^76^10^8^2* .* Laskettu: C, 58.27; H, 7.74; N, 11.33; S, C.48 :;V Saatu: C, 58.48; H, 7.79; N, 11.54; S, 5.98 *· ' (ix) Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH:n valmistus 5,5 g: aan Boc-Met-Leu-Phe-Arg (Pme)-Gly-OBu^:tä lisättiin 50 ml TFA:ta ja saatua seosta ravisteltiin huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja sen jälkeen väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja sakka suodatettiin talteen ja kuivattiin. Se liuotettiin 50 ml:aan DMF:ää ja liuos jääh-;·;* dvtettiin jään avulla ja sen jälkeen lisättiin 1,8 ml ·* TEA:ta. Lisättiin Boc-Gln-ONB (valmistettu *·.. 1,85 g:sta Boc-Gln-OH: ta, 1,49 g:sta HONB:tä ja 1,90 g: sta DCC:tä) ja saatua seosta sekoitettiin 15 tuntia ja väkevöitiin. Lisättiin ensin AcOH:ta ja sen jälkeen ·*/ AcOEt:tä ja saatu sakka suodatettiin talteen. Saanto

II

29 81 832 5,3 g (89,8 %), sp. 181-183°C (hajoaa), (a )£6-19,6° (c = 1,0, DMF), Rf1 0,30.

Alkuainananalyysi:

Yhdiste. ^49^76^12^10^2:

Laskettu: C, 55.45; H, 7.22; N, 15.20; S, 6.04 Saatu: C, 55.39; H, 7.17; N, 13.34; S, f .20 (x) Z-Ser-NHNH-Boc:n valmistus Z-Ser-OH (10,0 g) ja 6,2 g tert.-butyylikarbatsaat-tia liuotettiin 150 ml:aan DMF:ää ja liuos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin HONBrtä (8,0 g) ja 9,3 g DCC:tä ja saatua seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin ja suodos väkevöitiin. Jäännös uutettiin AcOEt: hen ja AcOEt-liuos pestiin natriumvetykarbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon 10 % vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja kiteet suodatettiin talteen. Saanto 7,3 g (50,4%), sp. 95-98°C, ( a)p6 -6,2° (c = 0,8, DMF) Rf1 0,62. Alkuaineanalyysi: : Yhdiste: ^16^23^6^3:

Laskettu: C, 54.38; H, 6.56; N, 11.89 Saatu: C, 54.77; H, 6.88; N, 12.29 [ (xi) Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc:n valmistus : Z-Ser-NHNH-Boc (3,9 g) pelkistettiin katalyyttises- .·.· ti 300 ml:ssa metanolia ja liuotettiin sen jälkeen 50 ml: aan DMF:ää. Lisättiin Z-Arg(Pme)-OH (valmistettu 6,2 g: sta Z-Arg(Pme)-OH.CHA:ta) ja 1,5 g HOBt:tä ja saatu seos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin DCC (2,3 g) ja koko seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois r. ja suodos väkevöitiin. Jäännös liuotettiin AcOEt:hen ja

AcOEt-liuos pestiin natriumvetykarbonaatin 4% vesiliuoksel-la ja sitruunahapon 10 % vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevötiin. Lisättiin eetteriä ja saa-tu sakka suodatettiin talteen. Saanto 7,45 g (93,7%), 30 81 832 sp. 100-101°C, (a)36-0,9 (c = 1,2, DMF) Rf1 0,51.

Alkuaineanalyysi

Yhdiste: C33H4909ntS:

Laskettu: C, 55.06; H, 6.86; N, 13.62; S, 4.46

Saatu: C, 55.49; H, 6.9^; N, 13.14; S, 3.*86 (xii) Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc:n valmistus Z-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3,9 g) liuotettiin 300 ml: aan metanolia ja pelkistettiin katalyyttisesti. Tuote liuotettiin 50 ml:aan DNF:ää ja lisättiin Z-Lys(Mtr)-OH (valmistettu 3,4 g:sta Z-Lys(Mtr)-OH.DCHA) ja 0,88 g HOBt:tä. Seos jäähdytettiin jäällä ja lisättiin 1,34 g DCC:tä Koko seosta sekoitettiin 20 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin. Lisättiin AcOEt:tä ja jauhemanen sakka suodatettiin talteen ja uudelleenkiteytettiin MeOH-AcOEt-seoksesta. Saanto 5,1 g (93,4%), sp. 103-105°C, (a)^6-7,2° (c = 0,8, DMF)

Rf1 0,57.

Alkuaineanalyysi

Yhdiste: C^gHr^O^NgSg*.

f: Laskettu: C, 55.50; H, 6.%; S, 11.89: S, C.05 saatu: c, 55.70; H, 7.15; N, 11.60; S, 5.6? : (xiii) Z-Arg (Pme)-Lys (Mtr)-Arg (Pme)-Ser-NHNH-Boc :n ; V valmistus Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (4,8 g) liuotettiin 300 ml:aan metanolia ja suoritettiin katalyyttinen pelkistys. Tuote liuotettiin 70 roi;aan DMF:ää ja lisättiin Z-Arg(Pme)-OH (valmistettu 2,8 g:sta Z-Arg(Pme)-OH.CHA) ja 0,74 g HOBt:tä. Seos jäähdytettiin jäällä ja lisättiin 1,12 g DCC:tä. Koko seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muo-'f. dostunut DCU suodatettiin pois ja suodos haihdutettiin.

/ · Jäännös liuotettiin AcOEt:hen ja AcOEt-liuos pestiin nat- riumvetykarbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon ..." 10% vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja vä- kevöitiin. Lisättiin eetteriä ja saatu sakka suodatettiin

II

31 81832 talteen ja saostettiin uudestaan MeOH-eetteriseoksesta. Saanto 5,8 g (89,8%), sp. 136-137°C, (a)p^ -6,6° (c = 1,0, DNF), Rf1 0,58.

Alkuaineanalyysi

Yhdiste: C66H99°16N13S3:

Laskettu: c, 55.56; H, 6.99; N, 12.76; S, 6.7*

Saatu: C, 55.34; H, 7.07; N, 12.50; S, 6.59 (xiv) Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc:n valmistus Z-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-NHNH-Boc (3,0 g) liuotettiin 150 ml:aan metanolia ja suoritettiin katalyyttinen pelkistys. Tuote liuotettiin 60 ml:aan DMF:ää ja lisättiin Z-Lys(Mtr)-OH (valmistettu 1,54 g:sta Z-Lys(Mtr)-OH.DCHA:ta) ja 0,31 g HOBt:tä. Seos jäähdytettiin jäällä ja lisättiin 0,57 g DCC:tä. Koko seosta sekoitettiin 15 tuntia. Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöitiin. Jäännös liuotettiin AcOEt:hen ja ja AcOEt-liuos pestiin natriumvetykarbonaatin 4% vesiliuoksella ja sitruunahapon 10 % vesiliuoksella, kuivattiin natriumsulfaatilla ja väkevöitiin. Lisfitiin eetteriä ja :.· * kiteinen sakka suodatettiin talteen ja uudelleenkitey- tettiin AcOEt:stä. Saanto 2,70 g (72,8%), sp. 123-125°C, • (a)^6-5,9° (c=1,1, DMF) , Rf1 0,57.

Alkuaineanalyysi

Yhdiste; ^82^123^20^15^4* :V: Laskettu: C, 55.73; H, 7.02; N, 11.89; S„ 7.26

Saatu: C, 55.89; H, 7.30; N, 11.72; S, 7.08 (xv) Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBut:n valmistus Z-Arg(Pme)-Arg(Pme)-Ala-Ser-Gln-OBu^ (1,0 g) liuotet-:·. tiin 100 ml:aan metanolia ja suoritettiin katalyyttinen .· · pelxistys. Sitten tuote liuotettiin 20 ml:aan DMF:ää ja lisättiin 0,85 g Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-OH:ta ··.' ja 135 mg HOBt:tä. Seos jäähdytettiin jäällä ja lisät- tiin 210 mgDcC:tä. Koko seosta sekoitettiin 20 tuntia.

32 81 832

Muodostunut DCU suodatettiin pois ja suodos väkevöi-tiin. Lisättiin metanolia ja saatu sakka suodatettiin talteen. Saanto 1,50 g (87,4%), sp. 216-217°C (hajoaa), (a)p6 -11,8° (c = 1,0, DMF), Rf1 0,43.

Alkuaineanalyysi:

Yhdiste: ^98^154^23^22^4’

Laskettu: c, 55.09; H, 7.27; N, 14.42; S, 6.00

Saatu: C, 5^.81; H, 7.33; N, 14.23; S, 5.79 (xvi) H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH:n valmistus 1,0 g:aan Boc-Gln-Met-Leu-Phe-Arg(Pme)-Gly-Arg(Pme)-Arg (Pme) -Ala-Ser-Gln-OBu*": tä lisättiin 10 ml TFA:ta ja saatua seosta ravisteltiin huoneenlämpötilassa 50 minuuttia ja sen jälkeen väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja sakka suodatettiin talteen ja kuivattiin.

Erikseen lisättiin 10 ml TFA:ta 0,83 g:aan Z-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Lys(Mtr)-Arg(Pme)-Ser-Boc:ia ja saatua seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja sen jälkeen väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja sakka suodatettiin talteen ja kuivattiin. Se liuotettiin 10 ml:aan DMF:ää ja liuos jääh-! dytettiin hiilihappojää-asetoniseoksella ja sen jälkeen / / lisättiin 0,23 ml 6,2N HCl/AcOEt-seosta ja isoamyyli- : nitraattia (0,075 ml). Lämpötila pidettiin välillä -25 - -20°C 20 minuutin ajan (negatiivinen hydratsiini-kokeelle) ja reaktioseos jäähdytettiin hiilihappojää-asetoniseoksella ja sen jälkeen neutraloitiin 0,25 ml :11a TES:ta. Amiinikomponentti liuotettiin 40 ml:aan DMF:ää ja liuos jäähdytettiin jäällä. Lisättiin TEA:ta (0,16 ml) ja edelläsaatu atsidiliuos lisättiin. Koko seosta sekoitettiin 72 tuntia 4°C:ssa ja sen jälkeen se kaadet-• tiin laimennettuun etikkahappoon. Muodostunut sakka suo- . . datettiin talteen ja pestiin CH_CN:n vesiliuoksella. Saan-

1 J

to 1,40 g (81,5 %) , Rf 0,09. Osa tästä tuotteesta (400 ...· mg) liuotettiin 60 ml:aan TFA-tioanisoli-metyylisulfi- ·;·. diseosta (8:1:1), jossa oli 0,15 M MSA:ta ja liuosta ra il 33 81 832 visteltiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Lisättiin AcONH^rää (400 mg) ja seos väkevöitiin. Lisättiin eetteriä ja sakka suodatettiin talteen ja kuivattiin.

Se liuotettiin pieneen määrään 1 N AcOHrta ja liuos laskettiin Sephadex G-25-pylvään läpi (2,2 x 120 cm) käyttämällä eluenttina 1 N AcOHrta. Jakeet 160 mlrsta 260 mlraan yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Sitten lyofi-lisaatti laskettiin Amberlite IRA-410-pylvään (asetaat-timuoto) läpi ja lyofilisoitiin. Tämä lyofilisaatti puhdistettiin HPLCrllä käyttämällä TSK-LS 410-pylväs- tä (2,14 x 7,5 cm + 2,14 x 30 cm), jolloin saatiin edel- 24 o lä nimetty tuote. Saanto 45 mg, (a)D -45,9 (c = 0,7, 0,1 N AcOH) Rf^ (selluloosa) 0,20.

Aminohappoanalyysi: Lys 1,71, Arg 4,71, Ser 1,69,

Glu 2,12, Gly 1,00, Ala 1,03, Met 0,32, Leu 1,30, Phe 1,08 (keskimääräinen talteenottoaste 77 %).

Vertailuesimerkki 2

Kantoaineproteiini-polypeptidikompleksin synteesi

Vertailuesimerkissä 1 (xvi) saatu polypeptidi lii-: tettiin tyroglobuliiniin (myöhemmin TG) menetelmällä .1. ] Goodfriend et ai. (Science, 144, 1334 (1964)). 2,5 mg : .·, mainittua polypeptidiä sekoitettiin 3,75 mg:n kanssa ’1.1 TGrtä ja sen jälkeen lisättiin 2 ml 50 mM fosfaatti- . I puskuria ja seos sekoitettiin hyvin jäävedessä. Lisät- tiin hitaasti tipoittain liuos, jossa oli 30,4 mg karbo-di-imidihydroklordia 200 mlrssa tisalttua vettä. Sitten seosta sekoitettiin jäävedessä 3 tuntia. Reaktion tapahduttua suoritettiin dialyysi tislattua vettä vasten riittävässä määrin ja sen jälkeen lyofilisoitiin, : jolloin saatiin 4,7 mg proteiinikompleksia.

Vertailuesimerkki 3 • «

Entsyymiin sidotun antigeenin valmistus EIA-menetelmäl-lä tapahtuvaa vasta-aineen havaitsemista vasten 34 81 832

Entsyymiin sidottu antigeeni EIA-menetelmää varten valmistettiin Kitagawa et al:n menetelmällä (Journal of Biochemistry, 7_9, 233 (1976)).

(i) Maleiinihappoimidoryhmän liittäminen polypepti-diin

Vertailuesimerkissä 1 (xvi) saatu polypeptidi (350 nm) liuotettiin 1 ml:aan 100 mM fosfaattipuskuria (pH 6,8) ja saatu liuos lisättiin liuokseen, jossa oli 585 yg (1,75 ymoolia) N-(4-karboksisykloheksyylimetyyli)ma-leiinihappoimidin N-hydroksimeripihkahappoimidiesteriä 70 yltssa N,N-dimetyyliformamidia. Seosta sekoitettiin 30°C:ssa 30 minuuttia. Reaktion tapahtuduttua suoritettiin fraktiointi käyttämällä Sephadex G-25-pylvästä, jolloin saatiin 185 nmol polypeptidijaetta, johon oli liitetty maleiinihappoimidoryhmä.

(ii) Maleiinihappoimidoryhmän sisältävän polypeptidin liittäminen β-D-galaktosidaasiin

Varteiluesimerkissä 3(i) saatu maleiinihappoimidoryhmän sisältävä polypeptidi (16,5 nmol) sekoitettiin 3,3 nmoolin kanssa β-D-galaktosidaasia. 18 tunnin : reaktioajan (4°C) jälkeen lisättiin 412,5 nmol β-merkap- toetanolia reaktion pysäyttämiseksi. β-D-galaktosi- j.j | daasiin liitetty polypeptidi fraktoitiin Sepharose δει pylväässä ja käytettiin seuraavissa kokeissa.

.·. Vertailuesimerkki 4 EIA-menetelmä

Vasta-aineen havaitseminen seerumissa, joka oli saatu vertailuesimerkissä 2 saadulla proteiinikompleksil-. / la immunisoiduista hiiristä, tai hybridomaemäliuoksessa suoritettiin EIA-menetelmällä (Immunology, 3, (1978).

‘ Tätä varten seerumi tai hybridomaemäliuos laimennettiin puskurilla A (20 mM NajHPO^, 100 mM NaCl, 0,1% NaN^» 1 mM tfgCl2f pH 7,0) ja 100 yl:n erä laimennetusta liuok-: : sesta sekoitettiin 100 yltään esimerkissä 3 saatua po- ii 35 81 832 lypeptidijohdannaista ja reaktion annettiin edetä 24 tuntia 24°C:ssa. Sitten lisättiin 100 yl 3-prosent-tista liuosta, jossa oli selluloosaan liitettyä kanin antihiiri-IgG:tä, ja reaktion annettiin edetä 4 tuntia· 24°C:ssa. Reaktio tapahduttua selluloosa pestiin hyvin puskurilla A, jossa oli 0,5 % Tween 20, ja sen jälkeen lisättiin 500 μΐ liuosta, jossa oli 20yg/ml 4-metyyliumbelliferyyli-g-D-galaktosidaasia, ja 2 tunnin reaktioajan kuluttua 37°C:ssa lisättiin 3 ml 100 mM karbonaattipuskuria (pH 10,5) reaktion katkaisemiseksi. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin fluoro-metrillä (viritys:365 nm; emissio: 450 nm).

Vertailuesimerkki 5 Immunisointi

Kullekin kuudesta naaras BALB/C-hiirestä, joiden ikä oli 7-8 viikkoa, annettiin subkutaanisti 40 yg (proteiinin perusteella laskettuna) vertailuesimerkissä 2 saatua proteiinikompleksia (antigeeninä) sekoitettuna perusteellisesti Freundin täydelliseen apunaineeseen (primäärinen ’ | immunisointi). Kahden viikon kuluttua primäärisestä im munisoinnista laskettuna hiirille annettiin subkutaanisti ;V antigeeniä sama annos kuin edelläkin Freundin epätäydel liseen apuaineeseen sekoitettuna (sekundäärinen immunisointi) . Tästä kaksi viikkoa myöhemmin suoritettiin kolmas immunisointi samalla tavalla kuin oli tehty Sekundäärinen immunisointi. Kuuden vuorokaucjen kuluttua kolmannesta immunisoinnista lukien otettiin hiiristä verinäytteet ja seerumin vasta-ainetiitterit määritettiin edellä vertailuesimerkissä 4 kuvatulla EIA-mene-:* telmällä. Hiiri, jonka numero oli γ-2, antoi korkeim man vasta-ainetiitterin ja sille suoritettiin lopullinen immunisointi antamalla intravenoosisesti 120 yg antigeeniä liuotettuna 0,5 ml:aan natriumkloridin vesiliuosta. Kullekin hiirelle saatu vasta-ainetiitteri on esitetty 36 81 832 taulukossa 3.

Taulukko 3: Peptidin vasta-aineen tiitterit immunisoiduilla hiirillä _____B/T (%)__ . . Primäärinen im- Sekundäärinen Kolmas immu-

Hnn no. muniSointi 1) immunisointi 2) nisointi 3) Y-l - N.D 24.5 2 N.D 5) 19.3 35.3 3 - N.D 24.7 4 N.D i.3 1.7 5 N.D 1.8 3.0 6 - N.D 0.8 normaali „ _ „ _ hiiri 1 0.6 1 0.1 1 "·ΰ . . 1) Seerumin laimennussuhde: 1/1000 2) Seerumin laimennussuhde: 1/6300 ’* - 3) Seerumin laimennussuhde: 1/7800 '·- : 4) - Ei havaittavissa : 5) ND: Ei määritetty • '.· B/T: (sidottu enstyymiaktiivisuus/lisätyn entsyymin ko- : : : konaisaktiivisuus) x 100

Vertailuesimerkki 6 Solufuusio *··* Immunisointi suoritettiin vertailuesimerkissä 5 kuva- .· : tulla tavalla. Kolmen vuorokauden kuluttua lopullisesta immunisoinnista perna leikattiin γ-2-hiireltä, suodatet-*·*. tiin paineessa ruostumattoman teräsverkon läpi ja suspen- ·*· doitiin Eaglen nimimimäärän välttämättömiä ravinteita

II

37 81 832 sisältävään alustaan (MEM = minimum essential medium) niin, että saatiin pernasolususpensio. Solufuusiota varten käytettiin BALB/C-hiiristä johdettuja P3-x63.Ag8.

U1-myelomasoluja (P3U1) (Current Topics in Microbiology and Immunology, 8^, 1 (1978)). Solufuusio suoritettiin alkuperäisellä menetelmällä (Nature, 256, 495 (1975)). Tätä varten pernasolut ja P2U1-solut pestiin erikseen kolmeen kertaan seerumavapaalla MEMtllä ja sekoitettiin keskenään suhteessa 5:1 (solujen lukumäärä). Seosta sentri-fugoitiin 15 minuuttia nopeudella 800 1/min niin, että solut laskeutuivat. Kun emäliuos oli poistettu perusteellisesti, sedimentti sekoitettiin ja irroitettiin kevyesti, lisättiin 0,3 ml 45-prosenttista polyetyleeniglyko-lia (PEG) 6000 (Koch-Light) ja seoksen annettiin seisoa lämpimässä säiliössä 7 minuuttia 37°C:ssa solufuusion tapahtumiseksi. Sitten lisättiin MEM:iä nopeudella 2 ml/min. Kun MEM:iä oli lisätty kaikkiaan 12 ml, saatua seosta sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 600 1/min ja sitten emäliuos poistettiin. Solusedimentti suspendoi-tiin RPMI-1640-alustaan, johon oli lisätty 10% vasikan : 5 : sikiön seerumia (RPMI1640-10FCS) , väkevyyteen 2x10 P3Ul-solua/ml ja 144 koloon 24 koloa sisältävissä levyis-: : : sä (Linbro) laitettiin 1 ml suspensiota.

*·*: Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 37°C:ssa hiilidiok- sidi-inkubaattorissa, jossa oli 5 % hiilidioksidia. 24 *.·. tunnin kuluttua aloitettiin HAT:n suhteen selektiivinen viljely lisäämällä kuhunkin koloon 1 ml PRMI1640-10FCS- -4 alustaa, johon oli lisätty HAT:ia (1x10 M hypoksan-tiinia, 4 x 10 ^ M aminopteriiniä ja 1,6 x 10 tymi-diiniä) (HAT-alusta). HAT:n suhteen selektiivistä viljelyä jatkettiin siten, että 1 ml vanhaa alustaa kor-.* : vattiin 1 ml:11a tuoretta HAT-alustaa 3, 5 ja 7 vuoro kauden kuluttua viljelyn aloituksesta laskien. Hybrido-mien kasvu havaittiin 10-14 vuorokauden kuluttua solu-fuusiosta laskettuna. Kun kasvualusta muuttui keltai- 38 81 832 seksi (noin 1 x 10** solua/ml), emäliuos otettiin talteen ja vasta-aineen läsnäolo tutkittiin EIA-menetelmällä.

Tällä tavalla tutkittiin emäliuokset 141 kolosta, joissa oli havaittu hybridomakasvu. Kaksi koloa (γ2—11 ja γ2-100) antoivat voimakkaan vasta-aineaktiivisuuden ja kaksi koloa (y2—62 jay2-70) antoivat heikon vasta-aineaktiivisuuden .

Vertailuesimerkki 7 Kloonaus

Hybridomat 3 kolosta (γ2-11, 62 ja 100), joissa oli positiivinen vasta-aineaktiivisuus, kloonattiin rajoittavalla laimennusmenetelmällä. Tätä varten hybridomat suspendoitiin RPMI1640-20FCS-alustaan väkevyyteen 2 hybri-domaa/ml ja suspensio jaettiin 0,1 ml:n erissä 96 koloa sisältävän mikrolevyn (Nunc) kolojen kesken. Mainitussa jaossa lisättiin 5 x 10^ solua koloa kohti BALB/c-hiiren tymosyyttejä ruokkijasoluiksi. Tämän tuloksena havaittiin solujen lisääntyminen noin 2 viikon kuluessa.

• Sitten emäliuos otettiin talteen ja vasta-aineiden läsnä- - °1° tutkittiin EIA-menetelmällä, joka on kuvattu esimer- * kissä 4. Vasta-aineaktiivisuus havaittiin kahdeksassa ;·/ kaikkiaan 19 γ2-11-kloonista, kolmessa kaikkiaan 54 y2-62-kloonista ja viidessä kaikkiaan 47 γ2-100-kloonista.

Vertailuesimerkki 8

Askiteksen syntyminen monoklonaalista vasta-ainetta tuottavilla hybridomilla

Askites aikaansaatiin antamalla vatsaontelonsisäi-sesti BALB/c-hiirille, jotka oli vatsaontelonsisäisesti esikäsitelty 0,5 ml:11a mineraaliöljyä, 1 x 10** γ2-11.1-kloonisolua, jotka kykenivät tuottamaan vasta-aineita, joilla oli IFN-γ:aa sitova aktiivisuus. Kymmenen vuo-rokauden kuluttua hybridomien vatsaontelonsisäisestä anil 39 8 1 8 3 2 tamisesta otettiin vesivatsaneste ja vasta-aineaktiivisuus 7 tutkittiin 10 -kertaiseen laimennukseen asti. Vaikka vastaavan kloonisoluviljelraän vasta-aineaktiivisuus 4 havaittiin 10 -kertaiseen laimennukseen asti/ askitek-sen syntyminen (askitoituminen) johti noin 1000-kertai-seen vasta-aineaktiivisuuden kasvuun.

Vertailuesimerkki 9

Monoklonaalisen vasta-aineen puhdistaminen

Monoklonaalisen vasta-aineen puhdistus suoritettiin menetelmällä Staehelin et ai. (Journal of Biological Chemistry, 256, 9750, 1981)) käyttämällä 4 ml vesivat-sanestettä, joka oli saatu vertailuesimerkissä 8. Puhdistusta varten vesivatsanestettä sentrifugoitiin 15 minuuttia nppeudella 10 000 1/min fibriinin kaltaisten aineiden poistamiseksi ja sen jälkeen laimennettiin fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen (PBS: 8,1 mM NaH2PC>4, 1,5 mM KH2P04, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl; pH 7,2) väkevyyteen, jossa ultraviolettiabsorptio oli 280 nm (A^q) mainitulle laimennuksella välillä 12-14. Sitten lisättiin kyllästettyä ammoniumsulfaatin vesiliuosta lai-. - mennettuun näytteeseen niin, että sulfaatin väkevyydeksi '1' tuli 47 %. Seosta sekoitettiin 4°C:ssa 60 minuuttia suo- _ / loittumisen aikaansaamiseksi ja sen jälkeen sentrifugoi- : tiin (10 000 1/min, 15 minuuttia), jolloin saatiin sakka.

Sakka liuotettiin 20 mM Tris-puskuriin (pH 7,9), jossa V oli 50 mM NaCL, ja dialysoitiin samaa puskuria vasten (2 litraa). Kahden tunnin kuluttua dialysointiliuos korvattiin tuoreella 2 litran määrällä samaa liuosta ja dialyysiä jatkettiin vielä 15 tuntia. Sen jälkeen sakka poistettiin sentrifugoimalla 15 minuuttia nopeudel-la 10 000 1/min ja emäliuoksen väkevyys säädettiin sellaiseksi, että A2gg-arvoksi tuli 20-30. Tälle näytteelle suoritettiin fraktiointi DEAE-selluloosapylväässä (8 ml, Whatman DE^2), joka oli tasapainotettu riittäväl-. . lä määrällä Tris-puskuria, jossa oli 50 mM NaCl. Kun :·_ oli pesty perusteellisesti samalla puskurilla virtaus- 40 81 832 nopeudella 1,5 ml/min, NaCl-väkevyys nostettiin lineaarisesti 50 mM:sta 500 mM:iin. Näissä olosuhteissa vasta-aineaktiivisuus havaittiin pääasiassa effluentti-jakeissa.

Vertailuesimerkki 10 25 ml (65,3 mg) vertailuesimerkin 9 mukaisella menetelmällä puhdistettua, effluenttijakeista saatua mono-klonaalista vasta-ainetta dialysoitiin yön yli 0,1M NaHC03:a (pH 8,3) vasten. Erikseen 25 ml AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) pestiin perusteellisesti käyttämällä lasi-suodinta, suspendoitiin 0,1 M NaHCO^reen (pH 8,3) ja sekoitettiin edellämainitun vasta-aineen kanssa. Seosta sekoitettiin hitaasti 4 tuntia 4°C:ssa reaktion aikaansaamiseksi ja sen jälkeen annettiin seisoa yön yli. Saatu AFFI-GEL 10 pestiin hyvin 0,1 M NaHCO^illa (pH 8,3) käyttämällä lasisuodinta. Geeliin lisättiin 25 ml liuosta (pH 8,0), jossa oli 0,1 M etanoliamiinia ja 0,15 M NaCl. Seosta ravisteltiin 4°C:ssa 1 tunti niin, että ; mahdolliset reagoimatta jääneet aktiiviset ryhmät saa tiin salvatuiksi. Sitten geeli pestiin hyvin PBSillä ja suspendoitiin 25 ml:aan PBS:ää, jossa oli 0,1 % NaN^'.a. Suspensiota säilytettiin 4°C:ssa. Kun verrattiin toi-.I siinsa lisätyn vasta-aineen määrää ja suodoksesta saadun vasta-aineen määrää, havaittiin, että vasta-aine oli liittynyt geeliin suhteessa 2,35 mg/ml geeliä. Pylväs pakattiin näin saadulla reaktiotuotteella ja käytettiin vasta-ainepylväänä.

Il

Claims (4)

41 81832

1. Menetelmä käytännöllisesti katsoen puhtaan, glykolysoimat-toman ihmisen yhdistelmäimmuuni-interferoniproteiinin valmistamiseksi, joka proteiini on Escherichia colin tuottama,käyttäen yhdistelmä-DNA-tekniikkaa ihmisen interferonigeeniin, jolloin proteiini on puhdistettu niin, että sen ominaisaktii-visuus on vähintään 107 U/mg viljemällä Escherichia colin transformanttia, jossa on ihmisen immuuni-interferonia koodattavan emässekvenssin sisältävä DNA, niin, että ihmisen immuuni-interferonia valmistuu ja kertyy transformoituneisiin soluihin, lysoimalla solut ja puhdistamalla näin saatu ihmisen immuuni-interferonia sisältävä liuos, tunnettu siitä, että puhdistuksessa käytetään sellaista monoklonaalista vasta-ainetta, joka kykenee sitomaan ihmisen immuuni-interferonin ja joka monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu seuraavan kaavan mukaiseen polypeptidiin (N) (C) H-X-Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly-Y-OH jossa X on sidos tai 1-16 aminohappoa sisältävä peptidi tai aminohappotähde, kun lasketaan seuraavassa esitetyn peptidi-: ketjun C-päästä lähtien (N) Ile Gin Vai Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala (C) Ala Lys Thr Gly Lys Arg ja Y on 1-5 aminohappoa sisältävä peptidi tai aminohappotähde, kun lasketaan seuraavassa esitetyn peptidiketjun N-päästä lähtien (N) (C) / Arg Arg Ala Ser Gin 42 81 832

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen immuuni-interferonia koodattavan emäs-sekvenssin kaava on seuraava (5') TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG-X (3' ) jossa X on TAA, TGA tai TAG.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y on Arg Arg Ala Ser Gin.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on Lys Arg. Il 43 81 832