NO164134B

NO164134B - Apparat og fremgangsmaate for celleutvelgelse.

Info

Publication number: NO164134B
Application number: NO831637A
Authority: NO
Inventors: Arye Weinreb; Mordechai Deutsch
Original assignee: Univ Bar Ilan
Priority date: 1982-05-10
Filing date: 1983-05-09
Publication date: 1990-05-21
Also published as: MX163377B; RU1776352C; IL68507A0; HU195245B; ES522207A0; KR870001670B1; AU562301B2; DK190583A; JPH0234597B2; ATE29070T1; NO164134C; ZA833141B; ES8407592A1; KR840004780A; NZ204056A; CS322383A2; EP0094193B1; IN159538B; AU1401483A; IL68507A

Description

Foreliggende- oppfinnelse vedrører celleseleksjon

og mer spesielt apparat og fremgangsmåte for utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler og observasjon og/eller måling av minst en utvalgt egenskap hos de utvalgte biologiske cellene.

Det er kjent apparater og fremgangsmåter for utvelgelse og separarering av sub-populasjoner av biologiske celler, f.eks. de som inngår i blodet. Flere metoder som betraktes som viktige og representative for teknikkens stilling, er kort omtalt nedenfor.

Separasjon basert på celle-adhesjon. Fremgangsmåten

er ikke særlig effektiv og egner seg ikke for separasjon av forskjellige celler som har samme membran-karakteristika,

f .eks. av celler som kleber seg til glass.

Immunofluorescens-separasjon. Denne fremgangsmåte baserer seg på kjente bindings-karakteristika av sub-populasjoner av celler til bestemte antigener og/eller antilegemer. Deres binding til celler i en senere fase kan benyttes for å identifisere cellen. Denne fremgangsmåte er dog svært begrenset, fordi den ikke kan brukes for separasjon av celler, basert på målinger av deres biologiske aktiviteter eller respons på bindemidlet.

Elektroforese. Denne metode baserer seg på celle-separasjon etter cellens elektriske ladning. Den kan således ikke tas i bruk for å separere forskjellige celle-grupper med samme ladning eller masse.

Radioanalyse, inklusive radioimmunanalyse, radio-inkorporasjonsanalyse, radioenzymologisk analyse. Med denne fremgangsmåte kan man ikke separere grupper av celler fra hverandre, heller ikke sondre mellom en sub-gruppe innenfor gruppen, basert på dens aktivitet eller inaktivitet og respons.

Morfologi. Sondring mellom celler baserer seg på deres fysiske opptreden. Denne metode er rask, men er den groveste av dem alle.

Celle-separasjon ifølge spesifikk densitet (gradient-teknikk). Ved denne fremgangsmåte flyter celler på en isotonisk oppløsning av kjent densitet, osmolaritet og viskositet.

Det hele utsettes for akselerasjonskrefter ved sentri-fugering ved en gitt temperatur og akselerasjon. De celler som har større spesifikk vekt enn oppløsningen vil synke. De som har oppløsningens spesifikke densitet blir suspendert i den og de celler som har lavere spesifikk densitet enn oppløsningen vil flyte opp over den. Hovedproblemet med denne fremgangsmåte er cellenes oppdeling i seksjoner innenfor densitetsgradienten som påvirkes av omgivelsesforhold, som temperatur, osmolaritet akselerasjon, f.eks. avstanden av grenseflaten mellom blodet og gradienten fra den roterende akse.

I tillegg til de ovennevnte mangler ved de forskjellige kjente metoder, har de en felles ulempe, idet de separerte celler så å si alltid omfatter celler som hører til andre enn den gruppe eller sub-gruppe som er av interesse. Derfor vil enhver diagnose av cellene som er separert ved en av disse nevnte metoder nødvendigvis være grov, selv om alle operasjoner er gjennomført med den største nøyaktighet.

Eksempelvis L. Cereck et al beskriver en SCM-test (Structuredness of Cytoplastic Matrix) i Biophys. J., Juli 197 8 bd 23, No. 1, s 359 ff. I denne artikkel innrømmer forfatterne at celler som er separert ved hjelp av ovennevnte gradient-metode inneholdt ca. 50% uønskede celler til tross for at testen ble utført meget omhyggelig.

Det er derfor en hovedhensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte og apparat for utvelgelse av en cellegruppe fra andre celler og videre separere de valgte celler fra hverandre. Hver av de valgte celler, separert fra de øvrige, befinner seg på et nøyaktig kjent sted. Alle utvalgte celler kan utsettes for felles tester, likevel kan effekten på hver enkelt celle bestemmes, slik at en mer nøyaktig diagnose blir muliggjort. Testene og effektene på hver celle gjennomfø-res automatisk for reduksjons av test-tiden, en oppgave som kan gjennomføres av forholdsvis uskolert personale.

Det forhold at en bestemt cellegruppe ikke lar seg separere totalt fra alle andre, har stor betydning for nøyaktig-heten av en diagnose. Dessuten er det av stor betydning at celleseparasjon og de påfølgende tester som utføres på cellene,

ved de ovenfor omtalte metoder skjer på-makro- eller sats-basis

i stedet for på mikrobas-is, dvs. med de utvalgte celler separert fra hverandre og slik at hver celle kan testes og under-søkes for seg. Et system og en fremgangsmåte for å separere utvalgte celler av interesse fra andre celler og videre separere de utvalgte celler fra hverandre, slik at hver celle kan testes og/eller undersøkes for seg, ville få stor betydning ved diagnostisering av forskjellige biologiske tilstander og for andre formål. Testing og undersøkelse av utvalgte celler enkeltvis ville eliminere feil som for tiden forekommer i mange diagnoser, basert på unøyaktige statistiske kriterier.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et apparat for utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler og observasjon og/eller måling av minst en utvalgt egenskap hos de utvalgte biologiske cellene, hvilket apparat innbefatter: minst én vesentlig plan bærer av en fastsatt tykkelse og som definerer øvre og nedre overflater og omfatter en ordnet gruppering av hull derigjennom, hvor nevnte hull har en fastsatt konfigurasjon med fastlagte dimensjoner ved topp- og bunnflatene, definerbare som topp- og bunndimensjoner, respektivt, kjennetegnet ved at toppdimensjonen for hvert hull er større enn dens minste tverrsnittsdimensjon, at både bærerens tykkelse og topp-dimens j onene for hvert hull har størrelsesorden av de utvalgte cellers diametre, og at den minste indre tverrsnittsdimensjon for hvert hull er mindre enn tverrsnittsdimensjonen for de utvalgte celler og større enn enhver tverrsnittsdimensjon for de ikke-utvalgte celler som har en mindre tverrsnittsdimensjon en den for de utvalgte celler, idet når de biologiske cellene anbringes på nevnte toppflate, så blir bare utvalgte celler med en bestemt dimensjon beholdt med vesentlig én celle pr. hull; innretning for understøttelse av nevnte bærer hvorved hvert hull deri beliggende ved en kjent posisjon, som kan defineres som en adresse, i forhold til nevnte innretning; instrument for observasjon og/eller måling av minst en celleegenskap; styreorgan for styring av den relative bevegelse og operasjon av nevnte instrument i forhold til nevnte bærer.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en fremgangsmåte for utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler for å lette observasjonen og/eller målingen av minst én egenskap hos de utvalgte biologiske cellene, hvor nevnte utvelgelse, og enhver etterfølgende observasjon og/eller måling utføres ved bruk av det ovenfor angitte apparat ifølge oppfinnelsen, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at (1) den øvre overflaten av minst en vesentlig plan bærer i ovennevnte apparat vesentlig dekkes med celler innbefattende de utvalgte celler av interesse, (ii) nevnte øvre overflate til bæreren (bærerne) vaskes for å fjerne celler som ikke er understøttet i hullene, hvorved bare utvalgte celler med på forhånd bestemte dimensjoner beholdes med vesentlig én celle pr. hull, og (iii) elektromagnetiske midler og/eller midler for frembringelse av en trykkforskjell over minst én valgt del an nevnte bærer(e) anvendes for å trekke en aktuell celle tii et hull og for å fremme fastholdelsen av cellen i hullet, eller for å utstøte en annen celle fra hullet.

Foreliggende apparat omfatter således en cellebærer som har en rekke celleopptagende huller hvor beliggenheten i rekken eller adressen er fiksert cg kjent for hvert hull. Hullene forløper fra bærerens oppside tii en bunnside i avstand fra oversiden. Hullene har på forhånd valgte former, slik at bare på forhånd valgte celler, basert på deres par-tikkelstørrelse, vil tre inn og bli avstøttet i hullene når en sats av celler passerer over bæreren. Celler med mindre størrelse enn de utvalgte cellenes, vil passere gjennom hullene, mens mye større celler- ikke kan tre inn i hullene. Når bæreren er skylt, vil bare de utvalgte celler være beliggende i dens huller, en celle pr. hull på en fiksert adresse.

Cellene i," bærerhullene kan deretter utsettes for biologiske tester og spesielle egenskaper av dem blir målt på celle-for-celle-basis, for bestemmelse av hvilke celler som hører til en spesiell sub-gruppe, basert på deres spesielle egenskaper og målte parametre. Når en sub-gruppe av celler først er identifisert, vil adressene av alle sub-gruppe-celler være kjent, da hver celle har en kjent adresse. Dermed er det mulig å utsette alle celler for en eller flere tester, men bare undersøke egenskapene av hver celle i sub-gruppen ved å dirigere de spesielle måle- og/-el ler diagnocti seringsinst-

ruraentene til hver celles egen adresse.

Foreliggende oppfinnelse vil fremgå klarere av nedenstående beskrivelse av flere utførelseseksempler av oppfinnelsen under henvisning til medfølgende tegning, hvor

Fig, 1A-1C er skjematiske illustrasjoner, delvis i snitt, av foretrukne celle-bærere ifølge oppfinnelsen;

fig. 2A-2D illustrerer et utførelseseksempel av en fler-cellebærer-holder for gjennomføring av målesykler på et flertall av cellebærere;

fig. 3A og 3B er snitt av holderen ifølge fig. 3 i større målestokk;

fig. 4 er en skjematisk gjengivelse av en optisk analyseenhet for individuell avsøkning av cellene i populasjonen som befinner seg i en cellebærer;

fig. 5 er en skjematisk gjengivelse av et andre utfø-relseseksempel av en optisk analyseenhet;

fig. 6 og 6A-6C viser modifiserte holdere for utfø-relsesformen som vist i fig. 3;

fig. 7A og 7B viser et utførelseseksempel av et strøm-ningskammer for bunnsiden av et analysesystem;

fig. 8 viser en modifisert versjon av strømningskam-ret ifølge fig. 7;

fig. 9 viser ytterligere et utførelseseksempel av en holder og et strømningskammer for et avansert analysesystem;

fig. 10 viser en separasjonsenhet, tilpasset for å oppta holderen ifølge fig. 6 for opprettelse av cellebærerne med celler;

fig. 11 er et snitt av deler av det utførelseseksem-pel som er vist i fig. 10;

fig. 12A og 12B viser en separasjonsenhet som er tilpasset for å oppta holderen ifølge fig. 9 for dannelse av cellebærerne med celler;

fig. 13A-13C er detaljer av- et blodtilførselselement som er tilpasset for bruk med separasjonsenheten ifølge fig. 12;

fig. 14 er et snitt av ytterligere et utførelseseksem-pel av et blodtilførselselement tilpasset for bruk med separasjonsenheten ifølge fig. 12;

fig. 15A og 15B viser et utførelseseksempel av et multi-bærersystem for klinisk bruk, hvor separasjons- og måle-trinnene er kombinert;

fig. 16 er en skjematisk helhetsillustrasjon av et optisk diagnostiseringssystem, og

fig. 17 illustrerer en cellebærer for selektiv tilstrekking eller frigivning av ønskede celler.

Oppfinnelsen skal først beskrives med henblikk på utvelgelse og analysering av en bestemt populasjon av celler av en gitt type, som foreligger i en biologisk væske fra andre celle-populasjoner. I tillegg kan ytterligere en seleksjon av en spesiell sub-populasjon separeres fra den spesielle utvalgte populasjon. Mer presist skal oppfinnelsen først beskrives i forbindelse med utvelgelse og analysering av en bestemt sub-populasjon av lymfocytter,

som foreligger i menneskeblod, ved at lymfocyttene først separeres fra andre celletyper, hvorpå lymfocyttene testes for identifikasjon av sub-populasjonen eller sub-gruppen innenfor lymfocytt-gruppen.

L. Cercek og B. Cercek har i artikler, publisert i European Journal of Cancer, bd 17, 1981, s. 167-171 og bd 13, 1977, s. 903-915, samt i Biophysical Journal, bd 23, 1978, s. 395-405 diskutert eksitasjons- og emisjcns-polariseringsspekt-ra av fluorescein i levende celler (artikkelen i Biophysical Journal) i relasjon til anvendelsen av fenomenet endringer i SCM (Structurdness of the Cytoplasmic Matrix) i diagnostiserin-gen av ondartede sykdommer. I korthet utfører L. og B. Cercek den s.k. SCM test etter først å ha forsøkt å separere en bestemt sub-gruppe av lymfocytter fra andre lymfocytter, likesom fra andre celletyper ved hjelp av tetthets-gradient-teknikken.

Denne teknikk er svært lite tilfredsstillende, som nevnt ovenfor. For det første er den svært tidkrevende, som de fagkyndige på området vil vite, og som det også fremgår klart av artiklene av L. og B. Cercek. For det annet tilhører de en-delig separerte celler ikke bare den sub-gruppe som er av interesse, men omfatter et stort antall, i størrelsesorden 50%, av andre lymfocytter, slik forfatterne Cercek også innrømmer. Dermed blir analysen av lymfocyttenes respons på stimulmering

av de separerte celler heller begrenset. For det tredje, og viktigst er at alle stimulerings- og responsmålinger, som blir gjennomført av forfatterne Cercek på de separerte celler, foretatt på alle celler i en sats, i stedet for på celle-for-celle-basis. Det er imidlertid åpenbart at en celle-for-celle analyse gir langt mer informasjon for forståelsen av biologiske impli-kasjoner av de fenomener som blir studert.

Foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å realisere slike analyser svært raskt og nøyaktig. I dette spesielle tilfelle er både raskhet og nøyaktighet svært viktige med tanke på det potensielle antall cancerdiagnosetester som ønskes gjennom-ført. Like viktig er at den nye oppfinnelse, både hva angår apparat og fremgangsmåte, tilveiebringer muligheter for å separere biologiske celler fra hverandre ved å anbringe hver separerte celle på en kjent adresse, som man kan vende tilbake til, for gjentatt celleobservasjon cg/eller gjentatt stimulering, fulgt av analyse.

Kort fortalt, blir et stort antall celler, f.eks. lymfocytter i blodet, som kan anses å representere en gruppe eller populasjon av celler, ifølge foreliggende oppfinnelse først separert fra alle andre celler, dvs fra forskjellige celle-grupper eller -populasjoner. Under separasjonsprosessen, blir de separerte lymfocytter både separert fra de øvrige celler og fra hverandre, og hver celle blir beliggende på et kjent sted, heretter også betegnet som en adresse. Alle separate lymfocytter blir deretter samtidig utsatt for utvalgte tester, og siden blir hver celle undersøkt separat, slik at det kan bestemmes om den viser en spesiell egenskap som følge av testen eller stimuleringen. Adressen av hver celle som viser en slik egenskap blir registrert. Etter at alle separate celler er blitt under-søkt, vil således adressene av alle celler som viste den spesielle egenskap være kjent. Disse celler representerer en bestemt sub-gruppe av lymfocytter innenfor hele den større lymfo-cyttgruppe. Når cellene i. sub-gruppen er identifisert, kan de utsettes for en eller flere ytterligere tester sammen med de øvrige lymfocytter. Når det gjelder undersøkelse av cellenes egenskaper som følge av disse ytterligere tester, kan den imidlertid begrenses til bare undergruppens celler. Hver celle i undergruppen blir undersøkt for seg ved at undersøkelsesinstru-mentet rettes mot cellens egne, kjente oppbevaringssted eller adresse. Når cellene i undergruppen er blitt identifisert, vil bare disse bli undersøkt senere, mens alle andre celler, som ikke hører til undergruppen, selv om de hører til samme hoved-gruppe, blir ignorert, i den forstand at de ikke blir utsatt for undersøkelse. Når undergruppen først er identifisert, er det således bare dens celler som blir undersøkt. Dermed begrenses undersøkelsestiden til undergruppens celler alene, som er av interesse. Ettersom undersøkelsen blir gjort på celle-for-celle-basis, kan det dessuten oppnås mer presise data for økt diagnostiseringsnøyaktighet. Andre fordeler ved at det er mulig å identifisere cellene i en undergruppe og undersøke hver av disse celler individuelt, vil bli nærmere omtalt nedenfor.

Som tidligere fremholdt, blir lymfocyttene i et første trinn separert fra de øvrige celler som foreligger i blodet. Separasjonen gjennomføres ved hjelp av en perforert cellebærer 1, som vist i fig. IA.

Cellebæreren 1 kan ha forskjellig form på åpninger eller huller 2 og på anordningsmåten av disse. I fig. IA antas de å være anordnet i rekker og kolonner langs akser X hhv Y. Hullene er vist med større åpninger .øverst enn ved bunnen, som det vil ses av fig. IB. I det nå omtalte utførelseseksempel er hullene dimensjonert slik at de passer for å oppta lymfocytter, av hvilke det foreligger to hovedstørrelser på ca. 7/Um og ca. 10-15/Um. Ved øvre overflate eller side lt av bæreren 1 har hullene en tverrsnittsdimensjon på ca. 10/um. Åpningene i bunnflaten eller side lb har tverrsnittsdimensjoner på ca. å^um. Hullenes sidevegger kan konvergere kontinuerlig eller trinnvis, som vist i fig. 1C, mot åpningen i bunnsiden lb av cellebæreren.

Generelt bør åpningen være utformet slik at den enten i bunnsiden eller ved et tverrsnitt mellom sidene lt og lb er mindre enn øverst, slik at en ønsket celle som trer inn i en åpning ikke vil passere gjennom den, men blir holdt igjen der. Det er også viktig å velge bærertykkelsen mellom sidene lt og

lb slik at åpningens størrelse har relasjon til størrelsen av de ønskede celler. Når en ønsket celle trer inn i en åpning, bør praktisk talt hele cellen befinne seg innenfor åpningen, slik at den ikke blir skylt ut under skylletrinnet, som vil bli nærmere omtalt.

Formen av hullene 2 gjør det mulig for cellene å bli effektivt holdt i bæreren ved hjelp av trykkdifferanse mellom øvre og nedre side av bæreren eller elektromagnetiske krefter e.l. For først å separere en bestemt cellegruppe fra celler i andre grupper, hvor cellene i hver gruppe har kjent størrelse som klart avviker fra dimensjonene for cellene i andre grupper, velges i korthet en bærer 1 med huller av slik størrelse at i realiteten de fleste, om ikke alle huller blir opptatt av celler av den aktuelle gruppe, med en celle pr. hull, når mate-rialet, f.eks. blod, som inneholder de forskjellige cellegrupper, blir anbrakt på bæreren.

Som tidligere nevnt, er hullene 2 i bæreren 1 jevnt anordnet i bæreren, f.eks. i rekker og kolonner, for at posi-sjonen av hvert enkelt hull 2 klart kan identifiseres, f.eks. ved hjelp av X og Y koordinater i bærerens plan. I det omtalte utførelseseksempel er hullene anordnet i rekker og kolonner, som forløper perpendikulært på hverandre, slik at det dannes en matrise-lignende anordning. Antallet huller velges i avhen-gighet av antallet celler som skal bæres. Med 100 huller i hver rekke og kolonne fås eksempelvis totalt 10 .000 huller som kan bære 10 000 celler i omtalte bærer, hvor hver celle har en egen posisjon i X og Y. Selve bæreren 1 kan ha sirkulær omkrets, som vist i fig. 6C. Som vist der, omfatter bæreren et antall ører 8 for riktig plassering av bæreren i en holder Ho som har et par fordypninger 9, som strekker seg fra en øvre fordypning hvor bæreren blir avstøttet. Et hull forløper ak-sialt rundt nevnte fordypning i holderen 40. Andre opprettings-organer, som stifter eller bærere med spesiell utformning, ligger også innenfor denne oppfinnelsens ramme.

Bæreren er fremstilt av et passende materiale, f.eks. metall, som kopper, gull, nikkel, sølv eller andre, eller av

plast, som kan utstyres med elektrisk ledende partier forløpen-de mellom hullene 2, som vist i fig. 17. På denne måten kan det elektriske potensial ved hvert hull som inneholder en celle påvirkes for interaksjon med cellens elektriske lading. Ved styring av potensialet ved forskjellige huller, kan cellene i dem bindes til bæreren og frigis fra den elektrisk.

For gjennomføring av fremgangsmåten blir noen få dråper av oppløsningen som. inneholder lyf ocyttene,, f. eks. blod, dryppet over cellebæreren. Væsken passerer gjennom hullene i bæreren. Men cellene forblir i bæreren. Ettersom størrelsen av hullene 2 er valgt utelukkende for opptagelse av lymocytter, vil de tre inn i hullene. Hvert hull opptar bare en celle. Overskytende lymfocytter og andre celler blir skylt av overflaten av bæreren. Dette gjelder celler som er så store at de ik-ke kan tre inn i et av hullene og/eller overskytende celler i forhold til antall huller. For at cellene i hullene skal hind-res fra å forlate bæreren,, kan de deretter fikseres til denne på forskjellige måter, f.eks. ved at bæreren dekkes med et klebende, kolloidalt materiale og blir elektrisk ladet, eller ved hjelp av elektriske og/eller magnetiske felter. En annen kombinert fremgangsmåte for å isolere nevnte populasjon og samtidig anbringe den på bæreren vil bli omtalt senere, i forbindelse med fig. 10,11, 12A og 12B.

Hver bærer som er forsynt med sin aktuelle cellegruppe, dvs med lymfocytter, anbringes i en bærer-holder for et strømningskamm.er, som en holder 10 (fig. 2D) , for opprettelse av det nødvendige miljø for test- eller målesyklene som vil bli omtalt senere.

I et første utførelseseksempel, vist i fig. 2A-2D, 3A og 3B, blir et flertall matriser eller cellebærere 1 anbrakt på holderen 10 (fig. 2D og 3A). Bare en orientering av bærerne er mulig, slik at perforeringene (hullene) i bærerne blir innrettet i forhold til bestemte akser, som en X og en Y akse (se fig. IA). Holderen 10, som er toppen av strømningskamret, er avtagbart montert på en sentral del 11 (fig. 2A) av strøm-ningskamret. Den sentrale del 11 begrenser et flertall kanaler 12, og hver kanal er i begge ender koplet til ett av et flertall rør 13 for tilførsel og tømming av en ønsket oppløsning. Den sentrale del er i bunnen fiksert av en nedre del lH (fig.

2B) av strømningskamret, som omfatter en gjennomsiktig vegg 15. Denne er nødvendig ved bruk av teknikker med innfallende og sendt lys for analysering av cellene i bæreren.

Som vist i fig. 3A, som gjengir et blikk på et parti, perpendikulært på kanalens 12 retning (oppløsningen vil dermed strømme "inn i arket"), sikrer en strømningsretter 16 at opp-løsningen kommer i kontakt med cellebæreren 1. I fig. 3B er et sideriss av denne anordning skjematisk illustrert.

På holderen 10 blir bærerne 1 for flere forskjellige individer (pasienter) anbrakt i en rekke som forløper langs kanalene, mens en kolonne av bærere fra samme person forløper perpendikulært på kanalene. Hver kanal 12 har relasjon til en test-type, slik at antallet tester som skal gjennomføres er bestemmende for antallet kanaler 12 i strømningskamret.

Enhver oppløsning som strømmer gjennom en av kanalene

vil derfor væte alle celler i bærerne ovenfor kanalen, celler som hører til hver sin pasient. Cellebærerne 1 kan dekkes med en glassplate 17, slik at det om nødvendig er mulig å bruke immersjonsvæske for det optiske avsøkningssystem.

I fig. 2A er et strømningskammer med sju kanaler 12

vist. I dette tilfelle blir cellene fra hver pasient båret av sju bærere, en for hver kanal, mens det langs hver kanal er avstøttet bærere med celler fra forskjellige pasienter, som vist i fig. 2D. En slik anordning gjør det mulig å stimulere celler fra forskjellige pasienter med forskjellige stimuli via hver kanal, enten samtidig eller etter tur, og deretter teste eller analysere hver celles respons på hver spesielle stimu-

lus. Andre utførelseseksempler som skal omtales, omfatter og-så et flertall kanaler, I hver fler-kanal utførelse vil antallet ce.llebærende bærere for hver pasient gjerne svare til antallet kanaler. Som det vil fremgå av nedenstående beskrivelse, er oppfinnelsen imidlertid ikke begrenset til fler-kanal-anordninger. Det har vist seg at celler som er blitt stimulert med visse stimuli og undersøkt, kan rengjøres og på denne måte tilbakeføres til deres tilstand før stimulering for deretter å bli stimulert med en annen stimulans. Om ønsket, kan det således benyttes en bærer med bare en celieavstøtting pr. pasient. Cellene i denne bærer kan stimuleres etter tur, cg etter hver stimulering og analyse, kan de rengjøres for neste stimulerings- og analysetrinn.

Før andre utførelseseksempler av strømningskamre beskrives, er det hensiktsmessig å gi en beskrivelse av en foretrukket fremgangsmåte og anordning for individuell analyse av cellene som er anordnet på bestemte steder i. bæreren og blir innført i strømningskamret. For dette formål vises igjen til SCM-tester., slik den er beskrevet av L. og Fi. Cercek et ai i de nevnte publikasjoner. Ifølge L. og B. Cercek fins det minst to karakteristiske egenskaper av en undergruppe av lymfocytter som er hensiktsmessige for SCM-testen. Responsen på det spesielle antigen får en lymfocytt til å gå over fra en hviletilstand til en stimulert tilstand. Mår fluoresceinmolekyler blir leiret i lymfocyttene ved bruk av et velkjent fenomen, kalt fiuorkromasi, resulterer omdannin-gen fra hvilefasen til den stimulerte fase i kritiske endringer i polariseringen av fluorescensen av flucresceinet i lymfocyttene. Lymfocyttene, hvor stimuleringsoperasjoner kan fremkalle slike kritiske endringer, avviker fra andre lymfocytter når det gjelder minst to karakteristiske egenskaper; den spesifikke tetthet og det forhold at det ved disse celler observeres en forholdsvis høy (kontroll)verdi av fluorescens-polarisering, bare for et svært smalt bånd av emisjonsspekt-ret rundt 510 nm.

Denne andre egenskap blir utnyttet for å peke ut eller identifisere de riktige lymfocyttene blant iymfocyttpo-pulasjonen i sin hethet og dermed unngå å måtte gjennomføre en fysisk separasjon. Det er således gruppen av lymfocytter som viser denne spesielle spektraladferd, som deretter blir undersøkt med henblikk på alle videre stimuleringseffekter, mans alle andre lymfocytter senere blir neglisjert av syste-mets evalueringsteknikk. Med andre ord blir bæreren ifølge oppfinnelsen først brukt til å separere lymfocyttene i en persons bloddråpe fra andre celletyper ved hjelp av størrelsen av hullene i bæreren. Hullene blir i det vesentlige fylt med lymfocytter, en celle pr. hull. Mindre celler passerer gjennom hullene og større celler blir skylt bort fra bærerens øvre flate. Deretter blir lymfocyttene på bæreren rengjort med FDA

+ PBS, som ved fluorkromasi blir omdannet til fluorescein i cellene. Deretter blir fluorescens-polariseringen innenfor et smalt bånd av emisjons-spektret rundt 510 nm fra hver celle målt og registrert. Bare lymfocyttceller som viser en forholdsvis høy fluorescens-polariseringsverdi, definert som P, blir betraktet som tilhørende den spesielle, aktuelle undergruppe. Ettersom adressene av hver celle i bærerhullrekken er kjent, er adressene av hver celle i undergruppen også kjent. Når cellene som hører til undergruppen er kjent, blir alle et-terfølgende målinger og/eller observasjoner som skal gjennom-føres, utført bare på cellene i undergruppen, mens alle øvrige lymfocytt-celler i bæreren, som ikke hører til undergruppen, kan ignoreres, slik at det verken gjennomføres målinger eller observasjoner av dem. Begrensningen av de etterfølgende målinger eller observasjoner til cellene i undergruppen alene, fører til sterkt redusert analysetid, og dette er av stor betydning. Ettersom adressene av hver celle er kjent, kan cellens enestående respons på hver stimulans registreres. Dermed oppnås en enestående informasjon, som hittil ikke har vært mulig å oppnå fordi målingene og observasjonene ble gjennomført på satser av celler eller ved bruk av strømningssystemer. Selv om en spesiell celle ble observert under mikroskop, kunne man ikke stimulere den med en annen stimulans senere og observere cellens respons på den. Dette skyldes det forhold at enkeltceller tidligere ikke ble anbrakt i en fast rekke, hvor adressen av hver celle var kjent, slik at målings- og/eller observasjons-instrumenter kunne dirigeres til samme celle gjentatte gjanger

for observasjon av samme celle.

Det kan fastsettes et hensiktsmessig kriterium for min-steforholdet av polariseringer målt ved to fluorescens-emi-sjonsbølgelengder, nemlig 510 nm og 5-15 nm. Som et første trinn, blir derfor cellene av den kritiske undergruppe av lymfocytter identifisert ved testing av nevnte kriterium for hver enkelt celle i bæreren. Etter omdanning til stimulert tilstand, vil polariseringsgraden av de stimulerte celler i nevnte undergruppe avta til en verdi på ca. 0,14 for nevnte emisjonsbølge-lengde på 510 nm. Denne.endring av polariseringsgraden blir bare undersøkt hos de identifiserte cellene i undergruppen.

Et system for gjennomføring av disse tester på hver celle i bæreren skal nå omtales under henvisning til fig. 4. Cellene i bæreren ;1 blir først skylt med en oppløsning av fos-fat-buffer-saltoppløsning (PES) og fluorescein-diacetat (PDA). På grunn av fluorkromasi-fenomenet, blir sistnevnte omdannet til.fluorescein i hver lymfocyttceile. Deretter blir fluores-ceinet eksitert ved bestråling med bølgelengde 470 nm, hvorpå det sender ut sitt karakteristiske em i sjons spektrum-. Bestem-melsen av hvilke av lymfocytt-cellene i bæreren som hører til den aktuelle undergruppe, blir gjennomført ved trinnvis avsøkning av hver enkelt celle i bæreren ved hjelp av den optiske analyseenhet 20, som er vist i fig. 4.

Den omfatter en zirkonlampe (eller laser) 21, som virker som lyskilde med spisser ved 470,1 nm og 4 68 nm, slik at man unngår behovet for et eksiteringsfilter for filtrering av eventuelt lys i det aktuelle område, dvs 510 nm og 515 nm. Lyset blir plan-polarisert perpendikulært på figurens (4)

plan av en polarisator 22, etter at det har passert gjennom en fokuseringslinse 21a. Plan-polariseringen er betegnet med små sirkler. Den plan-polariserte lysstråle treffer et speil 23, som virker som en stråledeler ved å sende lys på X> 500 nm og reflekterer lys under denne bølgelengde. Lyset fra kilden 21 blir således reflektert på bæreren 1 gjennom en linse 24.

Fluorescensen som blir sendt ut av hver celle i bæreren blir målt separat og registrert1. Fluorescensen fra en celle passerer gjennom speilet 23 og linsen 24a til en Glenn-Thompson polarisator 25. I prinsippet deler polarisatoren 25 fluorescensen i to deler': en polarisert parallelt med papirets plan (antydet ved strekene i fig. 4), som fortsetter i den opprinnelige innfallsretning, og den andre polarisert normalt på papirets plan (antydet ved sirklene i fig. 4), som blir avbøyd perpendikulært på innfallsretningen. Hver av de polariserte stråler blir delt i to like og perpendikulære stråler av en stråledeler (26, 27). Hver av disse fire nydannede stråler passerer gjennom et interferensfilter på 510 nm eller 515 nm (28, 29, 28', 29') og deres intensitet blir målt samtidig av fire elektron-multiplikatorer (30, 31).

Disse fire målte intensiteter blir lagret i et databe-handlingsanlegg, som det som er vist i fig. 16, og polariseringsgraden for hver bølgelengde, dvs X = 510 nm og X = 515 nm blir beregnet. Polariseringsgraden blir definert som

P = (IH " + 1±)

Etter beregning av P^10 og P515 blir forholdet mellom dem, dvs P^q/Pcj-^, som representerer kontrollverdien, beregnet i sann tid. Adressen til hver celle i form av dens X og Y koordinater er kjent og lagres sammen med kontrollveridien. Etter at alle celler er undersøkt og deres kontrollverdier er bestemt og lagret, er det meget enkelt å bestemme de celler som har en kon-trollverdi ikke mindre enn 1:3. Det er disse celler som hører til den undergruppe som er av interesse. Når denne bestemmelse er gjort, blir alle etterfølgende målinger eller observasjoner av cellenes respons på forskjellige stimuli utført bare på cellene i undergruppen, mens alle andre celler blir ignorert. For eksempel blir bare cellene i undergruppen undersøkt for å bestemme hvilke av dem som viser en endring i polariseringsgraden som er tilstrekkelig til å identifisere dem som aktive og således i stand til å identifisere et spesielt antigen.

Det vil være innlysende at den optiske analyseenhet 20 (fig. 4) må ha en optisk oppløsning i størrelsesorden en cel-lediameter for testing av hver enkelt celle for seg. Dette kan oppnås med et mikroskopobjektiv. Bæreren med cellene blir trinnvis forskjøvet under mikroskopet fra en perforering til nabo-perforeringen. Et presist mekanisk forskyvningssystem, som omtalt i forbindelse med fig. 16 er derfor nødvendig.

I et annet utførelseseksempel av den optiske analyseenhet har man unngått behovet for trinnvis forskyvning av cel-cebæreren ved bruk av en laser som eksiteringskilde. Dette ut-førelseseksempel er skjematisk illustrert i fig. 5. En laserstråle 131 med. passende bølgelengde passerer gjennom et styrt avbøyende optisk element, som f.eks. et roterende speil 130. Laserstrålen 131 bar et tverrsnitt som i det vesentlige svarer til størrelsen av en celle. Ved hjelp av avbøyningselementet 130 avsøker strålen 131 cellene i hullene etter tur og eksite-ter dermed hver celle, den ene etter den andre. På et gitt tidspunkt, blir bare en celle truffet av laserstrålen og bare denne celle emitterer derfor fluorescerende lys i nevnte øye-blikk. Den optiske analyseenhet 131X, som er anordnet på den andre siden av bæreren 1, har et visuelt felt som dekker hele bærerens 1 overflate. I mottagelsesøyeblikket av et emisjons-signal er intensiteten av dette signal korrelert med den av-søkende laserstråles 131 posisjon, og dermed blir hvert mot-tatt og; analysert lyssignal korrelert med beliggenheten av den respektive celle, fra hvilken det ble emittert. Som man vil se av fig. 5, blir eksiteringen dannet fra den store siden av hullene 2 i bæreren 1. For den optiske analyse derimot, blir emisjonslys som forlater hvert hull gjennom den smale enden med fordel brukt av grunner som vil bli forklart nedenfor.

Når noen foretrukne analysesysteiner nå er forklart, hvor foreliggende oppfinnelse blir tatt i bruk, vil det være

åpenbart at analoge systemer for måling av andre parametre kan tas i bruk, forutsatt at fokusering på hver enkelt celle i bæreren er mulig. Eksempler på målbare parametre omfatter lysin-tensitet, optisk tetthet, brytningsindeks, elektromagnetiske

egenskaper, absorpsjon og spredning. Avsøkningsoperasjonen er heller ikke begrenset til stråler av f.eks. synlig lys, ultra-fiolett eller infrarødt lys og optiske elektronsysterner, men kan også omfatte undersøkelse via fysisk kontakt ved hver celle. Andre eksempler på målbare eller observerbare egenskaper omfatter Kjernemagnetisk resonans [NMR), pH verdi, likesom morfologi og endringer av denne som respons på forskjellige stimuli. Man kan f.eks. rette utgangen fra et mikroskop som er rettet mot en celle mot en mønster-registreringsenhet for dannelse av en todimensional registrering av cellens mønster. Celletemperatur-målinger og/eller temperaturendringer kan

gjennomføres og registreres. Det kan med andre ord gjennomfø-res en eller flere målinger/observasjoner av egenskap(er) ved en celle på celle-for-celle basis. Ettersom adressene av hver celle er kjent, kan man alltid vende tilbake til samme celle for ytterligere målinger og/eller observasjoner. Alle målinger og observasjoner for hver celle kan registreres for oppnåelse av enestående informasjon for hver enkelt celle. Denne informasjon kan korreleres for å gi innsikt og diagnostisering som hittil ikke har vært mulig.

Et utførelseseksempel av oppfinnelsen for praktisk, klinisk bruk skal nå forklares under henvisning til fig. 6A-6C som viser en modifisert holder 40 for et flertall cellebærere 1. Holderen 40 er korrugert for at dens trau 41 skal kunne senkes ned i oppløsningen som strømmer gjennom kanalene 12 på et høyere nivå. Cellebærerne som er montert på bunnen av trauene 41, kan vætes for skylling eller på annen måte stimulering av cellene både ovenfra og nedenfra. I dette utførelseseksempel er det derfor ikke behov . strømningsrettere, som tidligere omtalt i forbindelse med fig, 2A, 3B. Som beskrevet i forbindelse med fig. 2A-2D, hørt-r cellebærerne sem er anordnet i samme trau 41 til forskjellige pasienter. Til tross for dette er det ingen fare for en blandet lymfocytt-stimuleringseffekt, fordi det ikke er noen fysisk forbindelse mellom bærerne. Selv om en celle skulle løsne fra en bærer, er sjansene for at den skylles bort langt større enn at den blir avleiret på en annen bærer. I fig. 6A er det bare vist bærere i ett trau. I praksis vil det dog foreligge en bærer for hver pasient i hvert trau.

I fig. 6C ses at bæreren 1 er avtagbar fra holderen 40. For å definere hele bærerrekken i X og Y, omfatter den dog ører 8, som kan anbringes i fordypninger 9.

Ettersom cellebærerne 1 ifølge foreliggende oppfinnelse er nedsenket i oppløsningen som strømmer gjennom hver kanal 12, er mikroskopet i det optiske system for celleavsøkning utstyrt med en kvartshylse 42 (fig. 6B), anordnet på objektivsylinderen. Kanalene 12 og trauene 41 har slike dimensjoner at relative be-vegelser av objektivet og bærerne som er nødvendige for avsøkning av hele overflaten av hver bærer kan gjennomføres.

Som ovenfor antydet, blir kanalene for utvelgelse av den undergruppe av celler som baserer seg på ovenfor omtalte kontrollverdi, først forsynt med en PBS + PDA oppløsning under kontrollmåle-syklen for identifikasjon av de riktige celler på bæreren som hører til undergruppen. For så å bestemme de utvalgte cellers reaksjon på forskjellige stimulanser blir hver kanal deretter forsynt med et eget stimuleringsmiddel, f.eks. phytohemaglutinin (PHA), EF, CaBP, tumcrekstrakter eller andre ønskede mitogener eller antigener. Deretter blir responsene bare fra de utvalgte celler undersøkt og registrert.

For de ovennevnte stimulatorer ble det oppdaget at stimulering av cellene med en stimulator ikke påvirker eventuelle etterfølgende stimuleringer, hvis stimulatoren skylles og/eller nøytraliseres før neste stimuleringstest, slik at man hindrer eventuell direkte interaksjon eller rivaliserende effekter mellom dem. Det har videre vist seg at binding av cellene til bæreren ikke har noen virkning på deres aktivering. Følgelig kan stimuleringsprosessene gjentas på s'-.fi\me celle med samme beliggenhet i bæreren, og dette kan skje med forskjellige aktive-ringsagenser. Dermed kan man oppnå et nøyaktig profil av hver enkelt undergruppe-celies respons på aktivering som en funksjon av tid, og det er derfor nå mulig å vite det eksakte antall av responser av de aktiverte celler og deres beliggenhet på matrisen, som forblir den samme under og etter de ovenfor omtalte målesykler.

De fleste bærerholderanordninger som er omtalt ovenfor ble utformet for topp-avsøkning, dvs for analysering av det emitterte fluorescerende lys fra de store øvre sider av hullene i bæreren, hvilket tillater bruk av samme optiske system for optisk undersøkelse og analyse av cellene. I alternative utfø-relseseksempler, som skal omtales nedenfor, er den optiske analyseenhet anordnet for å motta emisjonslyset som passerer gjennom den smale side eller bunnen av hullene 2. Slik kan for-styrrende effekter, forårsaket av lysemisjon. av fluorescein, som lekker ut av cellene og foreligger i deres omgivelser, bli eliminert. Lyset som emitteres av det omgivende fluorescein, representerer en uønsket optisk bakgrunn. Ved at man ser på cellene fra de smale sidene eller bunnene av hullene, kan denne bakgrunn reduseres vesentlig, ettersom den avsmalnende konus virker som et skjold mot uønsket emisjonslys. Når det eksite-rende lys trer inn i hullene gjennom deres store sider eller øvre side, kan det videre dannes reflekser på de koniske veg-gene, slik at både innfallende lys og fluorescenslys blir reflektert tilbake. En annen fordelaktig effekt ved gjennomfø-ring av den optiske analyse på nevnte måte er at det på et-hvert sted på bæreren bare mottas emisjonslys fra cellen som er fanget inn i respektive hull, mens andre celler, som i eksepsjonelle tilfelle kan foreligge ved øvre overflate av bæreren ikke påvirker måle-resultatene. Enda en fordel ligger i det faktum at det som følge av den mindre størrelse av åpningene er langt enklere i praksis å analysere emisjonslyset fra hver celle for seg, uten fare for "krysstale" mellom nabo-cellene, hvis justeringemekanismen for det optiske system i forhold til hullene ikke er ekstremt presist.

I fig. 7A, 7B, 8 og 9 er forskjellige utførelsesek-sempler illustrert, ser. gjør det mulig å gjennomføre den optiske analyse som fork];'..:: ovenfor. I et første utf ørelsesek-sempel til bruk med en optisk mikroskop-analyseenhet (fig. 7A og 7B), omfatter bunnveggen 110 av strømningskamret elastiske (gummi) glassholdere 111, som hver bærer en glassplate 112, som er justert i forhold til en cellebærer 1 beliggende ovenfor. Den elastiske glassholder 111 danner en fluidumtett for-segling mellom glassplaten 112 og bunnveggen 110 av strøm-ningskamret og gjør det mulig å bevege et mikroskops objektiv 113 nær nok i forhold til cellebæreren 1 for avsøkning av bærerens individuelle steder eller huller nedenfra (fig. 7B). Hvis mikroskopets objektiv 113 er i sin nedre stilling, blir strømningskamrets kanal åpnet til sin opprinnelige bredde. I en modifikasjon (fig. 8) av dette utførelseseksempel er bunn-og sideveggene av strømningskamret fremstilt i ett stykke av gummi.

I et annet utførelseseksempel (fig. 9) blir den optiske analyse foretatt fra oppsiden. Men holderen 114 for cellebærerne 1 er anbrakt opp-ned på et bunnparti 115 av strøm-ningskamret etter å ha blitt forsynt med celler i en spesiell enhet (som vil bli omtalt i forbindelse med fig. 12A og 12B, slik at de koniske hullene i bærerne 1 konvergerer nedad. For at cellene skal holdes på plass og bli effektivt bundet til bæreren, opprettes en trykkdifferanse mellom bunnpartiet 115 (fig, 8) og et øvre parti 116 av strømningskamret, hvor fluidumet i bunnpartiet 115 har noe høyere trykk enn i øvre parti 116. Tettesteg 117 hindrer lekkasje fra de to partiene av strøm-ningskamret. I forbindelse med dette utførelseseksemplet kan den optiske analyseenhet ifølge fig. 4 benyttes for avsøkning av cellene på bærerne 1 uten at de ovennevnte fordeler går tapt.

Når det gjelder problemet med å forsyne cellebærerne med celler fra en bestemt, ønsket populasjon eller gruppe,

kan dette i prinsippet gjøres på en i alt. vesentlig konvensjo-nell måte, som beskrevet tidligere. Figurene 7 A og 7B illustrerer et system for samtidig separasjon av nevnte cellepopulasjon fra andre cellegrupper på en annen en de konvensjonelle, lite fordelaktige metoder for separasjon av celler. Det foreliggende utførelseseksempel er c%&& gitt i forbindelse med separasjon av lymfocytter fra de øvrige blodceller., til bruk ved ovennevnte SCM-tester.

Som man kan se av fig. 10 og II, hviler holderen 50, som kan innføres i strømningskamret ifølge fig. 6A, på en anordning av rør 51, som hvert er under-oppdelt i lengderetning i en øvre del 53 og en nedre del 52. Nedre del 52 danner en fluidumledning (luft eller væske) med lavere trykk for drene-ring av væsker og uegnede blodceller fra øvre del 53. øvre del omfatter broer 54, under hvilke det er dreneringshuller 55, og mellom hvilke det er sugehuller 56, på linje med bærerne 1 på holderen 50. I fig. 10 er det vist bærere som avstøtter celler fra bare en pasient. Øvre og nedre del 53 og 52 blir tilført et fluidum, f.eks. PBS-oppløsning. Som det vil ses fra snitt-tegningen i fig. 11, passerer fluidumet i øvre del under broen 54 og gjennom passende slisser 57 i holderen 50. Fluidumet i nedre del 52 tvinges av fremspring 58 til å strømme med større hastighet i områdene for dreneringshullene 55 og sugehullene 56, og danner dermed lokalt undertrykk i disse hullene. Derfor blir fluidumet som først strømmer gjennom øvre del 53 delvis trukket mot nedre del gjennom nevnte huller.

Et blodtilførselselement 60, som er avtagbart anordnet på holderen 50, er anordnet for å forsyne bærerne 1 med blod. Føtter 61 på forsyningselementet .60 hindrer fluidum fra å passere fra en rekke av slisser.57 i holderen 50 til en annen.

Som teoretisk grunnlag for forståelse av cellesepara-sjonen ved hjelp av ovenfor omtalte enhet, understrekes føl-gende fakta: a) størrelsen av de responsgivende lymfocytter er~7u; b) størrelsen av makrofager og granulocytter er ^20u - 35u ;

c) størrelsen av erytrocytter kan nå 3u 5u

d) det fins store lymfocytter - 15u

e) størrelsen av blodplater - ubetydelig

f) celler kan briste når de blir liggende i destillert vann ; g) levetiden av en erytrocytt i destillert vann er langt kortere enn en-lymfocytts.

Cellebærer-holderen 50 anbringes først på røranordnin-gen, slik at bærerne rekke (perpendikulært på kanalene) blir plassert over hullene. Tilførselselementet 60 anbringes med føttene 61 på hver sin side av cellebærerne. Hele innretningen blir satt sammen, som vist i fig. 11. En sprøyte full med blod fra en pasient anbringes i en sprøyteholder 62.

I fig. 11 er to slike holdere vist for to forskjellige pasienter. Blodstrømningen i hvert av rørene styres ved opprettelse av et hensiktsmessig trykk mot sprøyten. Blod kommer til alle utløp av rørene Pl og P2 (fra 2 forskjellige pasienter) etter de første trykkpulser.

På et visst stadium vil en trykkpuls føre til at en bloddråpe faller på hver cellebærer. Størrelsen av hullene i bæreren vil ikke tillate blodet å passere fra en side av cellebærer en til den andre. For dette formål dannes et undertrykk i nedre halvdel av separasjonsrøret, som omtalt ovenfor, ved at PBS kjøres gjennom denne del av røret. Blodet blir umiddel-bart suget ned under bæreren.

De mindre celler vil passere gjennom bæreren og bli skylt bort med PBS strømningen. De celler som har en størrelse som ligner størrelsen av toppen av hullene i bæreren, f.eks. 7 yum,vil stoppe på bæreren og de største vil hvile over bæreren. For å hindre blokkering av bæreren, blir blodtilførselen stan-set, og PBS strømmer over øvre del av matrisen for å skylle bort de større celler. De fleste av dem blir suget inn i dreneringshullene 55 (fig- 11). En mindre del av cellene kommer til neste bærer (i strømningsretningen) og passerer ut. Som tidligere nevnt ,blir alle cellebærere, som er anbrakt perpendikulært på kanalforløpet, fylt med blod fra en donor. Derfor er det ikke aktuelt at blod kan blandes med blod fra andre donorer.

I en neste fase, stanses den øvre strømning, og enda

en bloddråpe blir dryppet, og syklen gjentas så ofte det er nødvendig.. Etter noen få dråper blod, blir en såkalt "øvre bristevask" gjennomført..Fremgangsmåten fortsettes, inntil bæreren er tilstrekkelig fylt. Det kar. gjøres en grov test på dette ved testing av den elektriske motstandsevne av bæreren etter hver dråpe. Destillert vann får strømme i en ønsket tids-periode og fører til av erytrocyttene brister. Det destillerte vann får cellene til å svulme opp, og derfor brister erytrocyttene, mens lymfocyttene styrker grep i bærerhullene.

På slutten av den ønskede periode, PBS innført. De substanser som er blitt frigjort fra de brustne erytrocytter, kan ikke påvirke lymfocyttene, ettersom det foregår en permanent strømning av oppløsning, som vasker bort disse substanser. Elektrisk lading eller gjenlading av matrisen eller opprettelse og opphevelse av elektromagnetiske felt er analog med vib-rasjon av matrisen med ultralyd- eller andre teknikker som og-så kan tas i bruk. Denne operasjon kan føyes til og korreleres med vaskefåsene. Det vil kreves mindre enn 1 cm' blod fra hver pasient P-^, P^ osv.

Denne separasjonsfase varer i høyden i 5 minutter. Det er ingen grense for antallet blodprøver, fra hvilke celler kan separeres på en gang. Holderen 50 blir deretter tatt ut av se-paras j onsanordningen og innført i strømningskamret ifølge fig.

4 for den optiske avsøkning som omtalt ovenfor.

Et lignende separasjonssystem, men tilpasset holderen 114 ifølge fig. 9 blir nå forklart under■henvisning til fig. 12A og 12B. En basisplate 120 er forsynt med kanaler 121 for fluidumstrømning, som oppretter det nødvendige undertrykk i området under bærerne 1 og dreneringshullene 55- For dette formål er det dannet fremspring 122 på bunnen av kanalene Holderen 114 blir avtagbart anordnet på basisplaten 120, slik at dens bærere 1 kommer på linje med fremspringene 122, slik det kan ses av fig. 12B, og slik at de koniske hullene åpner oppad, dvs mot et ovenfor liggende, avtagbart forsyningsele-ment 123, som har lik form og funksjon som forsyningselementet 60 i fig. 10. Forsyningselementet 123 kan forsyne cellebærerne med celler bare ved hjelp av trykk, som omtalt i forbindelse med fig. 10. Det er imidlertid mulig å øke effektivi-teten av blodtilførselen ved anordning av utstrykningselementer son blir forskjøvet i forhold til bærerne, som vist i fig. 13A, 13B, 13C og 14. I figurene 13A, 13B og 13C er det vist et ut-førelseseksempel med skyveplater 124, som strekker seg i til-førselselementet 123 på linje med kanalene 121.

Ved hvert utløp av en forsyningsledning, er et elas-tisk utstrykningselement 125 anordnet, som vist i fig. 13B og 13C. I fig. 13B ses et snitt av utstrykningselementet 125, perpendikulært på glideplatens 124 retning, mens fig. 13C viser et snitt langs forlengelsen av platen 124. Bredden av det elastiske utstrykningseleøient 125 svarer i det vesentlige til sidelengden av en bærer og det danner et lite utløp for lineær sveiping over bæreroverflaten, når glideplaten 124 blir beve-get, slik at hver bærer blir dekket med et tynt cellelag. Deretter gjennomføres de ovennevnte vasketrinn.

I fig. 14 ses et annet utførelseseksempel av utstrykningselementet i tverrsnitt, perpendikulært på en kanal 121.

I en svivelstang 126, forløpende langs hver kanal 121, dannes en blodledning 127, som for hver bærer 1 er utstyrt med et ut-løp med en fordelingsbørste 128. Når blod blir tilført bæreren, dreier svivelstangen 126 flere ganger og børster dermed cellene på bæreren 1.

Skjønt blodtilførsel og "grov"-separasjon i ovenståen-de utførelsesform blir gjennomført ved hjelp av en egen separasjonsenhet, hvorpå holderne 40, 50 hhv 114 må anbringes på et strømningskammer for optisk avsøkning, kan det i enkelte tilfelle være ønskelig å eliminere dette trinn. I enda et utfø-relseseksempel av oppfinnelsen som er vist i fig. 15A og 15B, er celle-separasjonen og den optiske avsøkning derfor kombinert i ett apparat.

Det er anordnet et støttesystem 70 med overflatekana-ler 71, 72, som forløper på tvers av hverandre, og indre ledninger 73, 7^, som likeledes forløper på tvers av hverandre. Ved hvert krysningspunkt er en bærer 1 anordnet på en dreibar holder 75» som er vist i snitt i fig. 15B. På holderens basis er det utformet et tannhjul 76, som samvirker med en respektive tannstang 77... som forløper gjennom støtteelementet 70. En tannstang 77 driver alle holdere 75 i vedkommende kolonne. Lineær bevegelse av denne tannstang 77 fører til dreining av holderne 75» Tilførselsretningen for blod for grovseparasjon, dvs for separasjon av lymfocytt-gruppen fra de øvrige blodcelle-grupper, skjer<:>perpendikulært på det plan, i hvilket cellebæreren blir avsøkt under mikroskopet. Etter separasjon av lymfocyttene fra andre blodceller, blir holderne således dreid 90° for avsøkning.

For å muliggjøre teknikken med "transmittert lys"

(måling av lys som trer ut av bunnenden av et hull) i ovenstå-ende utførelseseksempel, er den del av kanalen som krysser holderen 75 under cellebærerne et glassrør 78, som er delt på

langs. Dette rør er anordnet slik at dets åpne side rettes mot bæreren (se fig. 15B). På denne måte muliggjøres en horisontal væskestrømning gjennom holderen, samtidig som lys blir sendt i vertikal retning. Undertrykket i dette system opprettes ved at de indre ledninger 73," 7 4 gjøres lukket og tynnere, mens de øvre kanaler 71,72 er bredere og åpne. Samme effekt kan oppnås med andre teknikker, som økning av strømningshastigheten i de indre ledninger i forhold til de øvre.

Fremgangsmåten kan sammenfattes på følgende måte: Ved hjelp av en 0~90° styreenhet, blir holdernes 75 stilling bestemt. I et første trinn, mens "grovseparasjonen" blir gjennom-ført, er kanalene 71 og ledningene 73 i drift. Etter fullfø-ring av dette trinn, dreies holderne 75 90°. Dermed blir kanalene 71 og ledningene 73 blokkert eller lukket, og kanalene 72 og ledningene 7 4 blir åpnet.

I dette utførelseseksempel kan,et blod-drypphode festes til avsøkningshodet, f.eks. et mikroskop. Som respons på fjernsignaler fra en styreenhet, f.eks. en computer, blir separasjonen og' den optiske avsøkning deretter gjennomført automatisk og uten behov for en øvet operatør. Operatøren må bare anbringe sprøytene som vist i fig. 6 og skifte ut holderne 75 etter fullført' testing.

I fig. 16 er et generelt system for celleseparasjon, avsøkning og analyse (diagnostisering) vist. Et strømningskam-mer 8l, som beskrevet ovenfor, er montert på et bord 82, som _ er bevegelig i tre akser X, Y, Z ved hjelp av respektive com-puterstyrte trinn-motorer 83, 84, 85. Det optiske system omfatter et mikroskop 86 med en optisk analyseenhet 87, som beskrevet i fig. 4. En eksitasjonslyskilde 88, f.eks. en zirkonlampe, benytter seg av samme optiske system i omvendt retning. I en oppløsningstank 89, er alle nødvendige oppløsninger for celleseparasjon og testing lagret. Tilførselen av de respektive oppløsninger styres av en styreenhet 90 for oppløsninger. For stabilisering av fluorescein-konsentrasjonen i cellene, som kan påvirke de absolutte polariseringsverdier, brukes en elektrisk-optisk mekanisk tilbakeførings-styreenhet, hvori intensiteten av fluorescens-emisjonslyset periodevis blir målt og sammenlignet med referanseverdi. Et eventuelt avvik av den målte verdi fra refeianseverdien kan benyttes for å forårsake en endring i konsentrasjonen av FDA i PBS oppløsnin-gen. Analyse av den målte verdi kan gjennomføres av et hvilket som helst, kjent computersystem. Et precomputer-grensesnitt 91 bidrar til å omdanne de målte verdier til computer-leselig informasjon, som gjerne er digital. I en computer 92 utføres de nødvendige beregninger og identifikasjonstrinn, og resultatene lagres i en lagringsenhet 93. En postcomputer-styreenhet 94 genererer styresignalene for trinn-motorene og styreenheten for oppløsning.

Driften av ovennevnte system kan i korthet beskrives slik: Etter grovsortering, blir strømningskamret fiksert på bordet 82. Mikroskopet justeres. Deretter forløper prosessen automatisk. En PBS + FDA oppløsning blir innført gjennom kanalene og ledningene. Deler av den trenger gjennom bærerne fra de øvre kanaler til de nedre ledninger og en del fortsetter å strømme gjennom de øvre kanaler og vasker bort cellene ovenfra. Etter en valgfri pause, f.eks. 20 minutter, begynner avsøkningen. Polariseringen av hver enkelt celle blir målt ved de ønskede bølgelengder. Det er ingen fare for at cellen blir for meget utsatt for eksiteringslyset, f.eks. 470 nm, fordi avsøkningen blir meget raskt gjennomført.

Etter at den optiske informasjon er omdannet til en elektrisk strømpuls, blir den matet til computeren, vurdert og lagret i lagringsenheten. Hver enkelt celle blir i lagringsenheten identifisert etter koordinatene, dvs adressen på bæreren. Fra dette trinn av, vil al informasjon om hver enkelt celle som oppnås, bli lagret i computeren med relasjon til denne adresse.

Datainnsamlingen, kan i korthet beskrives■slik:Kontrollverdiene av cellene fra alle pasienter, hvis bærere er innrettet i en kanal, blir først bestemt. Deretter blir avsøknings-hodet overført til neste kanal (ved at bordet senkes og beve-ges til siden) og blir brukt for å bestemme kontrollverdiene av alle celler på bærerne som er innrettet i andre kanal. Samtidig med datainnsamlingen fra andre kanal, blir en stimuleringsvæske innført i første kanal. Etter fullført datainnsamling fra andre kanal, blir avsøkningshodet overført til tredje kanal og en andre stimuleringsvæske blir innført i den andre kanal osv.

Etter datainnsamling fra alle bærerne, blir avsøknings-hodet ført tilbake til sin utgangsstilling. Deretter gjentas avsøkningen av de stimulerte celler. Denne gang blir datainnsamlingen selektiv, og bare celler som oppfyller det omtalte optiske kriterium, dvs de som hører til den spesielle undergruppe, vil bli avlest igjen. Derfor vil den informasjon som samles i computeren være celle-beliggenhet, kontrollverdier, polariseringsverdier etter stimulering med PHA, poleriserings-verdier etter stimulering med CaBP, SCM-responsforhold (se L. Cercek et al. i Europ. J. Cancer, bd 17, s. 167-171), po-lar iseringsverdier etter stimulering med spesifikke t urnor •-stimulatorer o.l.

Distinksjonen mellom cellebærerne fra forskjellige pasienter kan oppnås ved magnetisk eller optisk koding, som kan fikseres på holderne under grovseparasjonstrinnet. En magnetisk eller optisk avleser kan festes til det optiske avsøk-ningshodet og lese av pasientens kode og overføre den til computeren. All informasjon vedrørende hver pasient kan overføres til et på forhånd fastlagt sted i computerens lagringsenhet.

Ved hjelp av denne anordning kan det eksakte antall av aktiverte lymfocytter bestemmes for hver stimuleringsagens. For fagfolk på området vil foreliggende oppfinnelse tillate cancerdiagnose på et svært tidlig stadium. Skjønt foreliggende oppfinnelse primært er beskrevet i forbindelse med cancerdiagnose, er det innlysende at fremgangsmåten og apparatet ifølge oppfinnelsen ikke er begrenset til dette. De skaper generelt en fremgangsmåte og et apparat for rask gjennomføring av biologisk prøving som fører til ny klinisk diagnose og behandling, likesom til nye anvendelser innen bioteknologi og biotek-nikk.

Som nevnt ovenfor, blir den eksakte beliggenhet av hver aktiverte celle på en bærer bestemt og lagret. Det er derfor mulig å isolere en ønsket gruppe eller undergruppe av celler på bæreren ved selektivt å fjerne alle andre celler fra bæreren, slik at bare den ønskede undergruppe forblir på den, eller ved å frigi bare cexlene i undergruppen fra bæreren. For dette formål kan man nyttegjøre seg det kjente faktum at celler ikke er elektrisk nøytrale, men har elektriske overflateladnin-ger. Dette faktum kan brukes ved de ovenfor omtalte utførelses-eksempler for å binde eller på annen måte sikre cellene på bæreren. Samme effekt kan brukes for selektiv frigivning eller holding av ønskede celler. Det kan oppnås ved et modifisert ut-før elseseksempel av cellebæreren ifølge fig. IA, som nå skal beskrives nærmere i forbindelse med fig. 17. Den ytre form av bæreren 100 er den samme som vist i fig. 1. Men bæreren 100

er forsynt med elektriske ledere 101, som forløper mellom hullene 102 i en gitterlignende form og er elektrisk isolert fra hverandre. I bærerens omkrets er lederne på kjent måte (inte-grert koplingsteknikk) koplet til en computer-styrt omkoplings-anordning for selektiv påvirkning av det elektriske potensial av hver enkelt leder 101. For å sikre cellene i bæreren, kan alle ledere 101 holdes på samme potensial motsatt cellens la-dingspotensial, slik at det oppnås elektrisk tiltrekking av cellene. For frigivning av en ønsket celle, f.eks. i hullet som er betegnet A i fig. 17, kan nabolederne V^, vx-^,<Vy->^,<V>y2

innstilles på et passende potensial for å,forårsake utstøtning av cellen i hullet A fra bæreren.

Cellebæreren 100 kan fremstilles ved en fler-lags-teknikk som er kjent fra produksjonen av integrerte koplinger.

I tilfelle en ionisk oppløsning, som PBS, blir brukt, bør det tas forholdsregler for å unngå uønsket innflytelse på mulige overflateladinger på holderen. For dette formål kan den gis et isolerende belegg og forsynes med ledende elementer som ender i kanalen. Dette ville føre til at ioner tiltrekkes og nøytra-liseres og dermed hindre dannelse av et ion-dekke over holder-overflaten som kunne influere på bærerens potensial. En annen mulighet er å bruke ikke-ioniske, organiske oppløsninger, som lipider for å skylle over bæreren på dette trinn av fremgangsmåten.

Separasjonen av bestemte celler ifølge oppfinnelsen fra alle øvrige celler er enestående anvendelig på det klinis-ke behandlingsområde ved produksjon av kloner. Kloner kan pro-duseres fra bestemte celler, som er valgt ut fra andre celler ifølge foreliggende oppfinnelse, basert på en hvilken som helst valgt egenskap. Det er eksempelvis kjent at en persons legeme, som er belastet med visse sykdommer, f.eks. hudcancer, produ-serer identifiserbare celler for å bekjempe eller drepe sykdommen. For et godt resultat må det dog være et stort antall slike celler,•heretter kalt "killer"-celler,til stede i lege-met. Med foreliggende oppfinnelse, kan blod, lymfeknuter og forskjellig legemsvev som inneholder noen "killer"-celler, brukes som kilde til slike celler. Etter at de er separert, som beskrevet ovenfor, fra alle øvrige celler, kan "killer"-cellene formeres ved passende celledyrkingsteknikker, for så å føres tilbake til den pasient, som avga de opprinnelige cellene for bekjempelse av sykdommen. I et slikt tilfelle forventes ingen celle-avstøtning, ettersom cellene opprinnelig kom fra pasientens legeme. Foreliggende oppfinnelse kan således brukes til å forsyne en persons legeme med tilstrekkelig celler til å ned-kjempe personens egen sykdom.

Det skal bemerkes at selv om separasjonen mellom celler av interesse på bæreren, og andre celler kan oppnås ved utstøt-ning eller fjernelse av enten de celler som er av interesse fra bæreren, slik at bare de øvrige forblir på den, eller ved å fjerne de celler som ikke er av interesse og bare la de utvalgte cellene bli igjen på bæreren, kan slik separasjon om ønsket også oppnås ved ødeleggelse av de celler som ikke er av interesse, mens de befinner seg i bærerens huller, slik at ba-re de cellene som er av interesse forblir levende på bæreren. Ødeleggelse av celler i hullene, dvs in situ, kan oppnås ved at en laserstråle rettes mot hver celle på dennes kjente adresse, eller ved lignende eller analoge fremgangsmåter. En ødelagt celle, dvs. en død celle kan, selv om den befinner seg på bæreren, betraktes som separert eller fjernet derfra, ettersom den neglisjeres for alle praktiske formål, når den først er død. Uttrykket "utstøtning" av en celle skal i denne kon-tekst bety fjernelse av en celle fra bæreren eller ødeleggelse av den in situ.

Når det gjelder formeringen av celler av interesse, vil det således være klart at dette kan gjøres etter at

a) cellene som skulle formeres var fjernet fra bæreren, som bar levende celler som ikke var av interesse; b) fjernelse av cellene som ikke var av interesse fra bæreren, hvorpå cellene av interesse blir formert for dyrking; og c) ødeleggelse av de celler som ikke er av interesse, mens de fortsatt befinner seg i hullene og formering av de celler

som er av interesse in situ, dvs mens de befinner seg i bærerens huller.

Mange nye anvendelser i biologisk forskning, klinisk behandling og industriell produksjon er åpnet ved foreliggende oppfinnelse. Det er ventet og er fastslått i en tilfredsstillende grad, at det fins optiske parametre relatert til cellenes sykliske fase. Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse er det mulig å differensiere en cellepopulasjon etter cellenes alder, sykliske fase og iboende funksjon og å gjennomføre respektive undersøkelser. En klinisk anvendelse av oppfinnelsen ligger i tidlig oppdagelse av leukemi, som er karakterisert ved nær-vær av et stort antall unge celler av en viss type eller visse typer i blodet og i beinmargen.

En annen klinisk anvendelse ligger i gjennomføring av immunreaksjonstester for transplantasjoner av organer. For dette formål benyttes et preparat av transplantatet som stimuleringsagens ved gjennomføring av oppfinnelsen.

Et generelt hovedtrekk og en fordel ved foreliggende oppfinnelse er det forhold at den tid som kreves for biologiske eksperimenter og tester blir vesentlig redusert, idet celle-identifikasjon og testing blir gjennomført på vesentlig kortere tid enn ved konvensjonelle biologiske metoder, hvor • naturlige utviklinger ofte må reproduseres under kunstige forhold. Dette leder til usikre resultater, som krever omfattende statistiske evalueringer. Oppfinnelsen reduserer påvirkningen av omgivelsene og muliggjør numeriske analyser med et minimum av statistikk. Tidsbehovet for å gjennomføre målinger med foreliggende oppfinnelse er meget kort absolutt sett, sammenlignet med de kjente metoder. Dermed reduseres også effekten av endringer i omgivelsesbetingelsene, som temperatur, fuktighet m. v.

Claims

1. Apparat for utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler og observasjon og/eller måling av minst en utvalgt egenskap hos de utvalgte biologiske cellene, hvilket apparat innbefatter: minst én vesentlig plan bærer av en fastsatt tykkelse cg som definerer øvre og nedre overflater og omfatter en ordnet gruppering av hull derigjennom, hvor nevnte hull har en fastsatt konfigurasjon med fastlagte dimensjoner ved topp- og bunnflatene, definerbare som topp- og bunndimensjoner, respektivt, karakterisert ved at toppdimensjonen for hvert hull er større enn dens minste indre tverrsnittsdimensjon, at både bærerens tykkelse og toppdimensjonene for hvert hull har størrelsesorden av de utvalgte cellers diametre, og at den minste indre tverrsnittsdimensjon for hvert hull er mindre enn tverrsnittsdimensjonen for de utvalgte celler og større enn enhver tverrsnittsdimensjon for de ikke-utvalgte celler som har en mindre tverrsnittsdimensjon enn den for de utvalgte celler, idet når de biologiske cellene anbringes på nevnte toppflate, så blir bare utvalgte celler med en bestemt dimensjon beholdt med vesentlig én celle pr. hull; innretning for understøttelse av nevnte bærer hvorved hvert hull deri er beliggende ved en kjent posisjon, som kan defineres som en adresse, i forhold til nevnte innretning; instrument for observasjon og/eller måling av minst en celleegenskap; styreorgan for styring av den relative bevegelse og operasjon av nevnte instrument i forhold til nevnte bærer.

2. Apparat ifølge krav 1, karakterisert ved at hullene er dimensjonert til å holde lymfocytter som har en diameter på ca. 7^,um, en pr. hull, idet den minste indre tverrsnittsdimensjon for hvert hull er slik at celler av diameter 3-5^um kan passere gjennom, og idet toppdimensjonen for hvert hull er slik at celler som har en diameter større enn lO^um i det vesentlige ikke kan komme inn i hullene.

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den relative bevegelse og operasjon av nevnte instrument i forhold til bæreren kan styres slik at den nøyaktige beliggenhet av hvert hull kan identifiseres ved sin posisjon i forhold til koordinater på x- og y-aksene for bæreren (bærerne).

4. Apparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at hullene er anordnet i et gitterlignende mønster ved skjærings-punktene for serier av linjer som er parallelle med henholds-vis x- og y-aksen til bærerne.

5. Apparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at instrumentet innbefatter en optisk avsøkingsenhet for bestemmelse av optiske egenskaper til enhver av nevnte celler.

6. Apparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at-innretningen innbefatter en anordning for understøttelse av flere bærere.

7. Apparat ifølge krav 6, karakterisert ved at det også innbefatter en annen innretning som selektivt kan plasseres i forhold til den første innretningen for å muliggjøre at cellene på hver av disse i avstand fra hverandre beliggende bærere, samtidig kan stimuleres av et på forhånd valgt materiale, slik som ved fukting gjennom enten hullenes topp- eller bunnende.

8. Apparat ifølge krav 7, karakterisert ved at den andre innretning innbefatter anordninger for opptagelse av forskjellige stimulerende materialer deri, hvorved cellene i minst noen av hullene i de i avstand fra hverandre beliggende bærere kan stimuleres samtidig av de forskjellige stimulerende materialer.

9. Apparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at det også innbefatter organer for tiltrekking eller utstøting av hvilke som helst av nevnte celler til eller fra hullene, eller for adhesjon eller forøkelse av adhesjonen av celler i hullene.

10. Apparat ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte organ omfatter elektromagnetiske midler anordnet i et fastlagt mønster i forhold til nevnte hull.

11. Apparat ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at nevnte organ omfatter midler for frembringelse av en trykkforskjell over i det minste en utvalgt del av nevnte bærer(e).

12. Fremgangsmåte for utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler for å lette observasjonen og/eller målingen av minst én valgt egenskap hos de utvalgte biologiske cellene, hvor nevnte utvelgelse og enhver etter-følgende observasjon og/eller måling utføres ved bruk av apparatet ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, karakterisert ved at (i) den øvre overflaten av minst en vesentlig plan bærer i apparatet ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 vesentlig dekkes med celler innbefattende de utvalgte celler av interesse, (ii) nevnte øvre overflate til bæreren (bærerne) vaskes for å fjerne celler som ikke er understøttet i hullene, hvorved bare utvalgte celler med på forhånd bestemte dimensjoner beholdes med vesentlig én celle pr. hull, og (iii) elektromagnetiske midler og/eller midler for frembringelse av en trykkforskjell over minst en valgt del av nevnte bærer(e) anvendes for å trekke en aktuell celle til et hull, og for å fremme fastholdelsen av cellen i hullet eller for å utstøte en annen celle fra hullet.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert v e :d at minst ett stimulerende middel påføres på cellene i åpningene og resultatet av stimuleringen observeres og/eller måles, idet nevnte minst ene stimulerende middel er valgt fra fytohemaglutinin (PHA), concanavalin A (Con A), cancerbasisprotein (CaBP), encefalitogenisk faktor (EF), tumorekstrakter, tumorcellelinjeekstrakter, ekstrakter fra tumorcellelinjesekresjon og/eller andre mitogener og antigener.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakteri-ss e r t ved at stimulerte celler i hullene skylles og/eller nøytraliseres for å bringe dem tilbake til deres opprinnelige tilstand.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det på cellene som har blitt bragt tilbake til vesentlig deres forutgående tilstand, påføres et ytterligere og forskjellig stimulerende middel valgt fra gruppen angitt i krav 13, og at resultatet av nevnte ytterligere og forskjellige stimulering observeres eller registreres .

16. Fremgangsmåte ifølge krav 12-15, karakterisert ved at det anvendes kjente teknikker på utvalgte celler i hullene for å øke deres antall.

17. Fremgangsmåte for multiplikasjon av celler omfattende utvelgelse av spesielle biologiske celler fra andre celler ifølge krav 12, karakterisert ved at cellene, utstøtes fra dem som befinner seg i bærerhullene, og at det deretter anvendes kjente teknikker på disse cellene for å øke deres antall.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 12-17, karakterisert ved at celler utstøtes fra dem som befinner seg i bærerhulrommet, og at det deretter anvendes kjente teknikker på disse cellene for å øke deres antall.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at celleøkningsprosessen observeres i forhold til minst én celle som multipliseres in situ.